Kryerja e analizës PCR (diagnostikimi PCR) fillon me mbledhjen e materialit për ekzaminim nga një gjinekolog, urolog ose dermatovenerolog. Cilësia dhe besueshmëria e rezultateve të marra më pas sigurohet nga kualifikimet më të larta dhe përvoja e gjerë e mjekëve të Qendrës Mjekësore Euromedprestige, të cilët respektojnë të gjitha rregullat e nevojshme. kryerja e PCR-analiza: sterilitet i plotë, përdorimi vetëm i materialeve të disponueshme.

Materiali i mbledhur nga furça vendoset në një enë me tretësirë ​​të kripur. Pas grumbullimit, mostrat duhet të dorëzohen në laboratorin e PCR sa më shpejt të jetë e mundur.

Analiza PCR kryhet në laborator në tre faza:

1. Ekstraktimi i ADN-së
2. Amplifikimi i fragmenteve të ADN-së
3. Zbulimi i produkteve të amplifikimit të ADN-së

Nxjerrja e ADN-së është faza fillestare e diagnostikimit të PCR, thelbi i së cilës është si më poshtë: mjeku merr materialin për hulumtim nga pacienti dhe ia nënshtron përpunimit të veçantë. Gjatë përpunimit, spiralja e dyfishtë e ADN-së ndahet në fije individuale. Materialit të pacientit i shtohet një lëng i veçantë, i cili shpërndan substanca organike që ndërhyjnë në "pastërtinë" e reaksionit. Kjo largon lipidet, aminoacidet, peptidet, karbohidratet, proteinat dhe polisaharidet. Si rezultat, formohet ADN ose ARN.

Parimi i metodës PCR është "ndërtimi" i infeksioneve të reja të ADN-së ose ARN-së. Kjo nuk mund të bëhet pa hequr materialin qelizor.

Sasia e kohës së shpenzuar për nxjerrjen e ADN-së varet nga agjenti shkaktar i infeksionit dhe nga lloji i materialit të përdorur për hulumtimin PCR. Për shembull, duhen 1,5-2 orë për të përgatitur gjakun për fazën tjetër.

0 Array ( => Analizon) Array ( => 2) Array ( =>.html) 2

Amplifikimi i ADN-së

Për të kryer fazën tjetër të diagnostikimit të ADN-së - amplifikimin e ADN-së - mjekët përdorin të ashtuquajturat matrica të ADN-së - molekulat e ADN-së të infeksioneve, mbi të cilat do të ndodhë më pas "klonimi" i ADN-së. Tashmë është përmendur se prania e ADN-së së plotë të infeksionit nuk është e nevojshme; për të kryer këtë fazë mjafton një pjesë e vogël e molekulës së ADN-së, e cila është karakteristike vetëm për një mikrob të caktuar (infeksion).

Baza e amplifikimit të ADN-së dhe, në përputhje me rrethanat, baza e të gjithë parimit të reagimit PCR është procesi natyror i përfundimit të ADN-së për të gjitha gjallesat - riprodhimi i ADN-së, i cili kryhet duke dyfishuar një zinxhir të vetëm të ADN-së.

Duke filluar me një fragment të vetëm të ADN-së, mjeku laboratorik e kopjon atë dhe rrit numrin e kopjeve në një reaksion zinxhir: pas ciklit të parë tashmë keni 2 fragmente, pas ciklit të dytë - 4, pas të tretit - 8, pas e katërta - 16, pastaj 32, 64, 128, 256... Me çdo cikël numri i kopjeve dyfishohet, dhe pas njëzet ciklesh numërimi tashmë shkon në miliona, dhe pas tridhjetë - në miliarda. Cikli zgjat disa minuta dhe zbret në një ndryshim të caktuar të temperaturës në një reaktor kimik shumë të vogël. Këtu, në tretësirë, të gjithë përbërësit e nevojshëm të sintezës janë të pranishëm në sasi të mjaftueshme, para së gjithash, nukleotidet A, G, T dhe C, dhe gjithashtu kryhen operacione kimike përgatitore delikate në mënyrë që të merret menjëherë një kopje e saktë nga secili. segmenti i përfunduar i ADN-së, pastaj nga kjo kopje - përsëri një kopje, ky është reaksioni i zinxhirit të degëzuar.

Duke bashkangjitur abetare në zinxhirin e ADN-së - "copë" të sintetizuara artificialisht të ADN-së (çifte nukleotide) të ngjashme me ADN-në e mikrobeve (infeksionet) - formohen dy spirale të shkurtra të përbëra nga dy vargje seksionesh të ADN-së, të cilat janë të nevojshme për sintezën e së ardhmes. ADN.

Sinteza e një zinxhiri të ri ndodh duke plotësuar secilën nga dy vargjet e ADN-së. Procesi i amplifikimit ndodh me ndihmën e një rajoni specifik - ADN polimeraza, e cila i jep emrin metodës laboratorike. Polimeraza vepron si një katalizator për reaksionin dhe monitoron lidhjen sekuenciale të bazave nukleotide në vargun e ri të ADN-së në rritje.

Kështu, amplifikimi i ADN-së është një rritje e shumëfishtë në numrin e kopjeve të ADN-së që janë specifike, d.m.th., të qenësishme vetëm në një organizëm të caktuar. Nuk ka nevojë të plotësohet i gjithë zinxhiri i ADN-së për të parë agjentin infektiv. Nevojitet vetëm zona që është karakteristikë e një bakteri të caktuar si individ.

5360 fshij. Kostoja e një programi gjithëpërfshirës me një gastroenterolog

ZBRITJE 25% NË TANIMIN ME KARDIologun

- 25%fillore
Vizita e mjekut
terapist në fundjavë

5160 rubla në vend të 5,420 fshij. Ekzaminimi i meshkujve për infeksione urologjike

ALERGOLOGJIA 5120 rubla në vend të 5,590 fshij.

Të gjithë hapat shumë të përsëritur të amplifikimit ndodhin në temperatura të ndryshme. Për të kryer analizën PCR, përdoren pajisje të programueshme posaçërisht - PCR - termostat ose amplifikues, i cili ndryshon automatikisht temperaturat. Amplifikimi kryhet sipas një programi të caktuar që korrespondon me llojin e infeksionit që zbulohet. Në varësi të programit dhe llojit të infeksionit që zbulohet, procesi i automatizuar i PCR zgjat nga 2 deri në 3 orë.

Kualifikimet e mjekut të laboratorit që kryen analizën luajnë një rol të rëndësishëm në diagnostikimin e PCR, cilësimet e sakta të pajisjes PCR dhe interpretimi i rezultateve varen nga ai. Mjekët në Qendrën Mjekësore Euromedprestige kanë përvojë të gjerë në kryerjen e diagnostikimit të ADN-së, e cila siguron besueshmërinë e rezultateve të hulumtimit dhe garanton sukses pozitiv në trajtim sëmundjet infektive. Për t'u testuar duke përdorur metodën dhe sjelljen PCR diagnostifikimi i plotë dhe trajtimin e sëmundjeve infektive në tonë qendër mjekësore"Euromedprestige".

Gjatë zbulimit të produkteve të amplifikimit, përzierja që rezulton e produkteve të amplifikimit ndahet. Përzierjes i shtohen tretësira speciale, të cilat i japin fragmenteve të ADN-së aftësinë për të fluoreshkuar - të pasqyruara në vija të ndritshme portokalli-të kuqe. Shkëlqimi që rezulton tregon praninë e ADN-së së viruseve, mikrobeve ose baktereve në materialin e marrë nga pacienti për analizë PCR.

GOU VPO "Akademia Mjekësore Shtetërore Krasnoyarsk"

emëruar pas Agjencisë Federale të Shëndetit dhe Zhvillimit Social Yasenetsky »

Departamenti i Gjenetikës Mjekësore dhe Neurofiziologjisë Klinike IPO

PARIMET THEMELORE TË METODËS

REAKSIONI I ZINXHIRIT POLIMERAZË

Pako e veglave për studentë 3-4 vjeç

në specialitetet e mjekësisë së përgjithshme (060101) dhe

Krasnoyarsk - 2007

Schneider, N. A., Butyanov, R. A. Parimet themelore të metodës së reaksionit zinxhir polimerazë. Manual metodologjik për punën jashtëshkollore të studentëve 3-4 vjeç në specialitetet e mjekësisë së përgjithshme (060101) dhe pediatrisë (060103). – Krasnoyarsk: Shtëpia botuese e Institucionit Arsimor Shtetëror të Arsimit të Lartë Profesional KrasSMA, 2007. – 42 f.

Manuali metodologjik përputhet plotësisht me kërkesat e Standardit Shtetëror (2000) dhe pasqyron aspektet kryesore metodë moderne diagnostifikimit sëmundjet trashëgimore Metoda e reaksionit zinxhir human-polimerazë, material edukativ i përshtatur për teknologjive arsimore duke marrë parasysh specifikat e formimit në fakultetet 3-4 vjeçare të mjekësisë dhe pediatrisë.

Rishikuesit: Shef i Departamentit të Gjenetikës Mjekësore, Institucioni Arsimor Shtetëror i Arsimit të Lartë Profesional

"Universiteti Mjekësor Shtetëror i Novosibirsk i Agjencisë Federale të Shëndetësisë dhe zhvillim social“, Doktor i Shkencave Mjekësore, Profesor;

Replikimi i ADN-së

Objekti i studimit të kësaj metode është acidi deoksiribonukleik (ADN). ADN-ja është bartësi universal i informacionit gjenetik në të gjithë organizmat që ekzistojnë në Tokë (me përjashtim të mikroorganizmave që përmbajnë ARN). ADN-ja është një fije e dyfishtë e përdredhur në një spirale. Çdo varg përbëhet nga nukleotide të lidhura në sekuencë. Fijet e ADN-së kanë drejtime të kundërta: fundi 5" i njërës vargje korrespondon me skajin 3" të vargut të dytë. Pronë unike ADN-ja është aftësia e saj për të dyfishuar vetveten. Ky proces quhet përsëritje. Replikimi i molekulës së ADN-së ndodh gjatë periudhës sintetike të interfazës. Secili nga dy zinxhirët e molekulës "nënë" shërben si shabllon për "bijën". Pas replikimit, molekula e saposintetizuar e ADN-së përmban një fije "nënë" dhe e dyta është një varg "vajza" e saposintetizuar (metodë gjysmë konservatore). Për sinteza e matricës Në mënyrë që të formohet një molekulë e re e ADN-së, molekula e vjetër duhet të zbërthehet dhe të shtrihet. Replikimi fillon në disa vende në molekulën e ADN-së. Seksioni i një molekule të ADN-së nga pika fillestare e një replikimi deri në pikën fillestare të një tjetri quhet replikon.

Fillimi i replikimit është aktivizuar abetare(primera) të përbërë nga 100-200 çifte nukleotide. Enzima helikaza e ADN-së zbërthen dhe ndan spiralen e ADN-së amë në dy vargje, mbi të cilat, sipas parimit të komplementaritetit, me pjesëmarrjen e enzimës së ADN polimerazës, mblidhen vargjet e ADN-së “bijë”. Në mënyrë që enzima të fillojë punën e saj, kërkohet prania e një blloku fillestar - një fragment i vogël fillestar me dy fije. Blloku fillestar formohet nga ndërveprimi i primerit me rajonin plotësues të vargut përkatës të ADN-së mëmë. Në çdo replikon, ADN polimeraza mund të lëvizë përgjatë vargut "nënë" vetëm në një drejtim (5`=>3`).

Në fijen kryesore, ndërsa replikon zbërthehet, një fije "bijë" rritet gradualisht vazhdimisht. Në vargun e mbetur, fillesa e bijës gjithashtu sintetizohet në drejtim (5`=>3`), por në fragmente të veçanta ndërsa repliku shpërndahet.

Kështu, shtimi i nukleotideve plotësuese të fijeve "bijë" ndodh në drejtime të kundërta (antiparalele). Replikimi në të gjitha replikonet ndodh njëkohësisht. Fragmentet dhe pjesët e fijeve "bijë" të sintetizuara në replikone të ndryshme janë të qepura në një fije të vetme nga enzima ligaza. Replikimi karakterizohet nga gjysmë-konservativiteti, antiparalelizmi dhe mosvazhdimësia. I gjithë gjenomi i një qelize riprodhohet një herë gjatë një periudhe kohore që korrespondon me një cikël mitotik. Si rezultat i procesit të replikimit, dy molekula të ADN-së formohen nga një molekulë e ADN-së, në të cilën një varg është nga molekula mëmë e ADN-së dhe e dyta, vajza, e saposintetizuar (Fig. 1).

Oriz. 1. Skema e replikimit të molekulës së ADN-së.

Kështu, cikli i replikimit të ADN-së përfshin tre faza kryesore:

1. zbërthimi i spirales së ADN-së dhe divergjenca e vargjeve (denaturimi);

2. abetare ngjitëse;

3. plotësimi i zinxhirit të fillit të fëmijës.

Parimi i metodës PCR

Është replikimi i ADN-së që formon bazën e PCR. Në PCR, proceset e mësipërme kryhen në një provëz në një mënyrë ciklike. Kalimi nga një fazë reaksioni në tjetrën arrihet duke ndryshuar temperaturën e përzierjes së inkubacionit. Kur tretësira nxehet në 93-95°C, ndodh denatyrimi i ADN-së. Për të vazhduar në fazën tjetër - shtimin ose "pjekjen" e abetareve - përzierja e inkubacionit ftohet në 50-65°C. Më pas, përzierja nxehet në 70-72°C - optimale për polimerazën taq-DNA - në këtë fazë ndodh ndërtimi i një vargu të ri të ADN-së. Pastaj cikli përsëritet përsëri. Me fjale te tjera metoda PCR është një rritje e shumëfishtë e numrit të kopjeve (amplifikimi) një seksion specifik i ADN-së i katalizuar nga enzima ADN polimeraza.

Rritja e vargjeve të ADN-së së bijës duhet të ndodhë njëkohësisht në të dy vargjet e ADN-së së nënës, kështu që përsëritja e vargut të dytë kërkon gjithashtu primerin e vet. Kështu, dy abetare i shtohen përzierjes së reaksionit: një për zinxhirin "+", i dyti për zinxhirin "-". Duke u lidhur me fijet e kundërta të molekulës së ADN-së, abetaret kufizohen në pjesën e saj që më pas do të dyfishohet ose përforcohet shumë herë. Gjatësia e një fragmenti të tillë, i quajtur amplikon, zakonisht është disa qindra nukleotide.

Fazat e PCR

Çdo cikël amplifikimi përfshin 3 faza, që ndodhin në kushte të ndryshme të temperaturës (Fig. 2).

· Faza 1: Denatyrimi i ADN-së . Ndodh në 93-95° për 30-40 sekonda.

· Faza 2: pjekja e abetareve . Lidhja e primerëve ndodh si plotësuese me sekuencat përkatëse në vargjet e kundërta të ADN-së në kufijtë e një rajoni specifik. Çdo palë abetaresh ka temperaturën e vet të pjekjes, vlerat e së cilës janë në intervalin 50-65°C. Koha e pjekjes 20-60 sek.

· Faza 3: kompletimi i zinxhirëve të ADN-së Kompletimi plotësues i zinxhirëve të ADN-së ndodh nga skaji 5" deri në fundin 3" të zinxhirit në drejtime të kundërta, duke filluar nga vendet e ngjitjes së primerit. Materiali për sintezën e zinxhirëve të rinj të ADN-së janë trifosfatet deoksiribonukleozide të shtuara në tretësirë. Procesi i sintezës katalizohet nga enzima taq polimerazë dhe zhvillohet në një temperaturë prej 70-72°C. Koha e sintezës është 20-40 sekonda.

Zinxhirët e rinj të ADN-së të formuar në ciklin e parë të amplifikimit shërbejnë si shabllone për ciklin e dytë të amplifikimit, në të cilin formohet një fragment specifik amplikon i ADN-së (Fig. 3). Në ciklet pasuese të amplifikimit, amplikonët shërbejnë si shabllon për sintezën e zinxhirëve të rinj.

Kështu, akumulimi i amplikoneve në tretësirë ​​ndodh sipas formulës 2", ku n është numri i cikleve të amplifikimit. Prandaj, edhe nëse tretësira fillestare fillimisht përmbante vetëm një molekulë të ADN-së me dy fije, atëherë në 30-40 cikle rreth Në tretësirë ​​grumbullohen 108 molekula amplikone, kjo sasi është e mjaftueshme për zbulimin vizual të besueshëm të këtij fragmenti me elektroforezë me xhel agarozë.

Procesi i amplifikimit kryhet në një termostat të posaçëm të programueshëm ( ciklues termik), i cili, sipas një programi të caktuar, ndryshon automatikisht temperaturat sipas numrit të cikleve të amplifikimit.

Për të kryer amplifikimin, kërkohen komponentët e mëposhtëm:

· Matrica e ADN-së(ADN ose pjesë e saj që përmban fragmentin specifik të dëshiruar);

· Abetare(oligonukleotide sintetike (20-30 çifte nukleotide), plotësuese të sekuencave të ADN-së në kufijtë e fragmentit specifik që përcaktohet). Zgjedhja e një fragmenti specifik dhe përzgjedhja e abetareve luan një rol kritik në specifikën e amplifikimit, gjë që ndikon në cilësinë e analizës.

· Përzierje e trifosfateve deoksinukleotide (dNTP)(një përzierje e katër dNTP-ve, të cilat janë materiali për sintezën e zinxhirëve të rinj plotësues të ADN-së në përqendrime ekuivalente prej 200-500 μM)

· EnzimëTaq-polimeraza(ADN polimeraza e qëndrueshme që katalizon zgjatjen e vargjeve të primerit me shtimin sekuencial të bazave nukleotide në zinxhirin në rritje të ADN-së së sintetizuar, 2-3 mM).

· Zgjidhje buferike(Medium reaksioni që përmban jone Mg2+ të nevojshme për të ruajtur aktivitetin e enzimës, pH 6,8-7,8).

Për të identifikuar rajone specifike të gjenomit të viruseve ARN, fillimisht merret një kopje e ADN-së nga një shabllon i ARN-së duke përdorur një reaksion të transkriptimit të kundërt (RT) të katalizuar nga enzima revertaza (transkriptaza e kundërt).

Oriz. 2. Amplifikimi (cikli i 1-rë).

Oriz. 3. Amplifikimi (cikli i dytë).

Aplikimet kryesore të PCR

· mjekësi klinike:

o diagnostikimi i infeksioneve,

o identifikimin e mutacioneve, duke përfshirë diagnostikimin e sëmundjeve trashëgimore,

o gjenotipizimi, duke përfshirë gjenotipizimin HLA,

o teknologjitë celulare

· ekologjia (si një mënyrë për të monitoruar gjendjen dhe cilësinë e objekteve mjedisore dhe produkteve ushqimore)

· Përcaktimi i organizmave transgjenikë (OMGJ)

Identifikimi personal, vërtetimi i atësisë, mjekësia ligjore

· biologji e përgjithshme dhe specifike,

Parimet bazë

organizimi i laboratorëve diagnostikues

Puna në laboratorin PCR kryhet në përputhje me "Rregullat e projektimit, masat paraprake të sigurisë, higjienën industriale, regjimin anti-epidemik dhe higjienën personale kur punoni në laboratorë (departamente, departamente) të institucioneve sanitare dhe epidemiologjike të sistemit të kujdesit shëndetësor.

Kontaminimi i mostrave të ADN-së

Kryerja e diagnostikimit PCR shoqërohet me një problem për shkak të ndjeshmërisë së lartë të metodës - mundësia ndotje. Hyrja e sasive gjurmë të ADN-së pozitive në tubin e reagimit (produkte specifike të amplifikimit të ADN-së - amplikone; standardi i ADN-së i përdorur si kontroll pozitiv; ADN pozitive nga një kampion klinik) çon në amplifikimin e një fragmenti specifik të ADN-së gjatë PCR dhe, si rezultat , deri te shfaqja e rezultateve false pozitive.

Në procesin e punës mund të hasni dy lloje të ndotjes:

1. ndotje kryq nga kampioni në kampion (gjatë përpunimit të mostrave klinike ose gjatë tretjes së përzierjes së reaksionit), duke çuar në rezultate sporadike false-pozitive;

2. ndotja me produkte përforcuese(amplicons) që kanë vlera më e lartë, sepse gjatë procesit PCR, amplikonet grumbullohen në sasi të mëdha dhe janë produkte ideale për ripërforcim.

Ndotja e enëve të qelqit, pipetave automatike dhe pajisjeve laboratorike, sipërfaqes së stolave ​​të laboratorit, apo edhe sipërfaqes së lëkurës së punonjësve të laboratorit me sasi të vogla amplikonësh çon në rezultate sistematike false-pozitive. Përcaktimi i burimit të ndotjes mund të jetë shumë i vështirë dhe kërkon një investim të konsiderueshëm kohe dhe parash. Përvoja e fituar deri më sot në laboratorë duke përdorur metodën PCR për diagnostikim na lejon të formulojmë kërkesat themelore për organizimin e laboratorëve të tillë dhe kryerjen e vetë analizave. Pajtueshmëria me këto kërkesa eliminon mundësinë e kontaminimit dhe rezultateve false pozitive.

Fazat e analizës PCR

Ato ndahen gjeografikisht duke i vendosur në dhoma të veçanta (Fig. 4, 5):

· Dhoma para PCR, ku përpunohen mostrat klinike, izolohet ADN-ja, përgatitet një përzierje reaksionale për PCR dhe kryhet PCR (nëse ekzistojnë kushtet, rekomandohet gjithashtu që të kryhen dy fazat e fundit në një dhomë shtesë të veçantë). Në këto ambiente ndalohet kryerja e të gjitha llojeve të tjera të punës me agjentë testues, diagnostikimi PCR i të cilave kryhet në këtë laborator.

· Dhoma pas PCR, ku kryhet zbulimi i produkteve të amplifikimit. Metoda të tjera zbulimi mund të përdoren në këtë dhomë. Këshillohet që dhoma e zbulimit të produktit të amplifikimit të vendoset sa më larg që të jetë e mundur nga dhomat para PCR.

Dhomat e punës janë të pajisura me llamba ultraviolet me rrezatim maksimal në rajonin 260 nm (tipi DB-60) me shpejtësi 2,5 W për 1 m3. Llambat vendosen në mënyrë që sipërfaqet e tavolinave të punës, pajisjet dhe materialet me të cilat operatori ka kontakt gjatë analizës PCR të ekspozohen ndaj rrezatimit të drejtpërdrejtë. Rrezatimi kryhet brenda 1 ore para fillimit të punës dhe brenda 1 ore pas përfundimit të punës.

Mjekët e laboratorit punojnë me veshje të posaçme laboratorike, të cilat ndërrohen kur lëvizin nga një dhomë në tjetrën, dhe me doreza njëpërdorimshe. Rrobat nga dhoma të ndryshme përpunohen veçmas. Punonjës të ndryshëm punojnë në faza të ndryshme të analizës PCR.

Për punë përdoren grupe të veçanta shpërndarësish, enë plastike dhe qelqi, pajisje laboratorike, fustane dhe doreza, të destinuara për faza të ndryshme analize dhe jo të lëvizshme nga një dhomë në tjetrën. Pajisjet, materialet dhe furnizimet në çdo dhomë janë të shënuara siç duhet.

Të gjitha fazat e punës kryhen vetëm duke përdorur materiale harxhuese: këshilla për pipetat automatike, epruveta, doreza, etj. Sigurohuni që të ndryshoni majat kur kaloni nga mostra në kampion. Është e nevojshme të përdoren këshilla me një filtër - një pengesë aerosoli për të parandaluar hyrjen e mikropikave të tretësirës në pipetë. Tubat dhe majat e përdorura hidhen në enë ose enë speciale që përmbajnë zgjidhje dezinfektuese. Mostrat klinike ruhen veçmas nga reagentët.

Për të përpunuar dhe pastruar vendin e punës, çdo dhomë është e pajisur me shtupë pambuku (peceta), piskatore, dezinfektues dhe solucione inaktivizuese.

Laboratori diagnostik PCR përjashton punën që lidhet me prodhimin (klonimin) dhe izolimin e plazmideve rekombinante që përmbajnë sekuenca të ADN-së ose fragmente gjenesh të patogjenëve që diagnostikohen në këtë laborator.

Mbledhja e materialit klinik

Materiali që do të studiohet për PCR mund të jetë skrapimi i qelizave epiteliale, gjaku, plazma, serumi, lëngjet pleural dhe cerebrospinal, urina, sputum, mukus dhe sekrecione të tjera biologjike, biopsi.

Materiali mblidhet në një dhomë trajtimi të profilit të duhur. Pas grumbullimit, mostrat duhet të dorëzohen në laboratorin e diagnostikimit PCR sa më shpejt të jetë e mundur.

Mostrat duhet të merren duke përdorur instrumente sterile, mundësisht të njëpërdorimshme, vetëm në tuba plastike sterile njëpërdorimshme ose tuba qelqi, të trajtuara paraprakisht për një orë me një përzierje kromi, të lahen tërësisht me ujë të distiluar dhe të kalcinuara në një kabinet tharjeje në një temperaturë prej 150°C. për 1 orë.

Zona e zbulimit (një kat tjetër ose një ndërtesë tjetër).

Oriz. 4. Pajisja laboratorike PCR me detektim me elektroforezë.

Zona e zbulimit (një kat tjetër ose një ndërtesë tjetër)

Oriz. 5. Aparat laboratorik PCR me detektim fluoreshente (analizë sasiore).

Oriz. 6. Dhoma e nxjerrjes së ADN-së. Tregohet një kuti tavoline me një llambë germicide.

Oriz. 7. Dhoma e amplifikimit.

Oriz. 8. Dhoma e zbulimit.

Oriz. 9. Mostrat e gjakut për diagnostikimin e ADN-së të sëmundjeve trashëgimore.

Magazinimi dhe transporti i mostrave

Për të diagnostikuar sëmundjet trashëgimore, mostrat e gjakut ruhen në forma të veçanta letre ose në epindorf (tuba plastike) në gjendje të ngrirë për një kohë të gjatë (Fig. 9).

Për të diagnostikuar sëmundjet infektive, mostrat mbahen në temperaturën e dhomës jo më shumë se 2 orë. Nëse kërkohet ruajtje më e gjatë, mostrat mund të vendosen në frigorifer në një temperaturë prej 2-8°C për një periudhë jo më shumë se një ditë. Ruajtja më e gjatë (deri në 2 javë) lejohet e ngrirë në frigorifer në një temperaturë prej minus 20°C. Ngrirja dhe shkrirja e përsëritur e mostrave nuk lejohet.

Nëse laboratori diagnostik PCR dhe dhoma e procedurave për marrjen e mostrave janë të ndara gjeografikisht, atëherë transportimi i mostrave duhet të kryhet në termoza ose kontejnerë termikë në përputhje me rregullat për ruajtjen e mostrave dhe rregullat për transportin e materialeve infektive.

Nxjerrja e ADN-së nga mostrat

Është bërë e përhapur metoda e thithjes në fazë të ngurtë, e cila konsiston në shtimin e një agjenti lize që përmban një zgjidhje guanidine, thithjen e ADN-së në një sorbent, larje të përsëritur dhe resorbim të ADN-së me një zgjidhje tampon. Kur përpunohet serumi, plazma ose gjaku i plotë, zakonisht përdoret metoda e nxjerrjes së fenolit. Metoda përfshin deproteinizimin me fenol/kloroform të ndjekur nga precipitimi i ADN-së (ose ARN-së) me etanol ose izopropanol. Përpunimi kryhet në tuba mikrocentrifuge Eppendor P me vëllim 1,5 ml. Koha e përpunimit është 1,5-2 orë (Fig. 10).

Oriz. 10. Ekstraktimi i ADN-së.

Kryerja e PCR

Një sasi e caktuar kampioni nga kampioni klinik i përpunuar transferohet në një tub mikrocentrifuge të veçantë të tipit Eppendorf me vëllim 0,2 ose 0,5 ml. Një përzierje amplifikimi e përbërë nga uji, bufer PCR, tretësirë ​​dNTP, tretësirë ​​primer dhe tretësirë ​​i shtohet. i njëjti tub.Taq polimeraza (i shtuar së fundi në përzierje) Në mënyrë tipike, vëllimi i përzierjes së reaksionit është 25 µl. Më pas një pikë vaj mineral shtohet në secilin tub për të parandaluar avullimin e përzierjes së reaksionit gjatë procesit të amplifikimit. tubat transferohen në një termostat të programueshëm (përforcues), ku amplifikimi kryhet automatikisht sipas një programi të caktuar (Fig. 11).

Oriz. njëmbëdhjetë. përforcues " Termociklues ».

Koha e reagimit, në varësi të programit të specifikuar, është 2-3 orë. Paralelisht me mostrat eksperimentale vendosen kampionet e kontrollit: kontrolli pozitiv përfshin të gjithë përbërësit e reaksionit, por në vend të materialit të mostrës klinike, shtohet një preparat kontrollues i ADN-së së gjenit në studim. Kontrolli negativ përfshin të gjithë përbërësit e reaksionit, por në vend të materialit klinik ose përgatitjes së ADN-së, shtohet një sasi e përshtatshme e ujit të dejonizuar ose një ekstrakt që nuk përmban ADN-në që testohet. Kontrolli negativ është i nevojshëm për të kontrolluar komponentët e reagimit për mungesë të ADN-së për shkak të kontaminimit dhe për të përjashtuar rezultatet false-pozitive.

Regjistrimi i rezultateve

Fragmenti specifik i ADN-së i përforcuar zbulohet me elektroforezë me xhel agarozë në prani të bromidit të etidiumit. Bromidi i etidiumit formon një përbërje të qëndrueshme intersticiale me fragmente të ADN-së, e cila shfaqet në formën e brezave ndriçues kur xheli rrezatohet me rrezatim UV me një gjatësi vale 290-330 nm. Në varësi të madhësisë së amplikoneve të formuara si rezultat i PCR, përdoret një xhel me një përmbajtje agaroze prej 1.5% deri në 2.5%. Për të përgatitur një xhel agarozë, një përzierje e agarozës, tamponit dhe ujit shkrihet në një furrë me mikrovalë ose në një banjë uji dhe shtohet një tretësirë ​​e bromit etidium. Përzierja, e ftohur në 50-60°C, hidhet në kallëp në një shtresë 4-6 mm të trashë dhe me anë të krehrave të posaçëm bëhen xhepa në xhel për aplikimin e kampionit. Krehërat janë instaluar në atë mënyrë që një shtresë 0,5-1 mm e agarozës të mbetet midis pjesës së poshtme të puseve dhe bazës së xhelit. Pas ngurtësimit të xhelit, amplifikatori aplikohet në xhepa në një sasi prej 5-15 μl. Rekomandohet që të kryhet elektroforeza e një përzierjeje të shënuesve të gjatësisë së fragmenteve të ADN-së paralelisht me mostrat e kontrollit dhe ato eksperimentale. Në mënyrë tipike, një përzierje e tillë përmban dhjetë fragmente të ADN-së me gjatësi 100, 200, 300, etj. çifte bazash.

Përdorimi i një testi të tillë bën të mundur verifikimin e gjatësisë së amplikoneve në mostrat e kontrollit dhe ato eksperimentale. Xheli me kampionin e aplikuar transferohet në një dhomë elektroforeze të mbushur me tampon, dhoma lidhet me një burim energjie dhe ndarja elektroforetike e produkteve të amplifikimit kryhet për 30-45 minuta në një forcë të fushës elektrike 10-15 V/ cm. Në këtë rast, pjesa e përparme e bojës së përfshirë në përzierjen e reaksionit duhet të udhëtojë të paktën 3 cm.

Pas përfundimit të elektroforezës, xheli transferohet në një transilluminator qelqi dhe shikohet nën dritën ultravjollcë. Për dokumentacion, xheli fotografohet në filmin Micrat 300 ose regjistrohet duke përdorur një sistem video të lidhur me një kompjuter.

Para së gjithash, vlerësohen mostrat e kontrollit. Një brez i ndezur portokalli duhet të jetë i pranishëm në gjurmën elektroforetike që korrespondon me kontrollin pozitiv. Lëvizshmëria e tij elektroforetike duhet të korrespondojë me gjatësinë e amplikonit të specifikuar në udhëzime.

Në gjurmën elektroforetike që korrespondon me kontrollin negativ, një brez i tillë duhet të mungojë. Prania e një brezi të tillë në kontrollin negativ tregon kontaminim - kontaminim të reagentëve të përdorur me ADN-në e provës ose amplikon. Mostrat e provës vlerësohen nga prania e një brezi në pistën përkatëse, e cila ndodhet në të njëjtin nivel me brezin në kampionin e kontrollit pozitiv. Intensiteti i brezit korrespondon me sasinë e ADN-së që testohet në kampion, gjë që lejon një vlerësim gjysmë sasior të PCR. Në mënyrë tipike, rezultatet pozitive vlerësohen në një shkallë me katër pikë. Nëse shkëlqimi i brezit në kampionin e provës është shumë i dobët, atëherë një kampion i tillë duhet të riorganizohet (Fig. 12).

Oriz. 12. Elektroforeza me xhel agaroze.

Aplikimet e PCR përdiagnostifikimi i mutacioneve pika dhe polimorfizmave të gjeneve

Një nga fushat kryesore të aplikimit të PCR në kujdesin praktik shëndetësor është diagnostikimi i mutacioneve pika dhe polimorfizmave të gjeneve. . Ekzistojnë metoda direkte dhe indirekte të diagnostikimit të ADN-së. Në situatat kur dihet një gjen, dëmtimi i të cilit çon në zhvillimin e një sëmundjeje trashëgimore, ky dëm mund të zbulohet me metoda gjenetike molekulare. Metoda të tilla quhen të drejtpërdrejta. Duke përdorur metoda të drejtpërdrejta, zbulohen parregullsi në sekuencën primare nukleotide të ADN-së (mutacionet dhe llojet e tyre). Metodat direkte karakterizohen nga saktësia që arrin pothuajse 100%.

Megjithatë, në praktikë, këto metoda mund të përdoren në kushte të caktuara:

· me lokalizim të njohur citogjenetik të gjenit përgjegjës për zhvillimin e një sëmundjeje trashëgimore;

· Geni i sëmundjes duhet të klonohet dhe sekuenca e tij nukleotide duhet të njihet.

Qëllimi i diagnostikimit të drejtpërdrejtë të ADN-së është të identifikojë alelet mutante.

Kështu, në situatat kur dihet se çfarë lloj dëmtimi të ADN-së çon në një sëmundje trashëgimore, fragmenti i ADN-së që përmban dëmin ekzaminohet drejtpërdrejt, d.m.th., përdoret metoda e drejtpërdrejtë e diagnostikimit të ADN-së.

Megjithatë, deri më sot, gjenet e shumë sëmundjeve nuk janë hartuar, organizimi i tyre ekzon-intron është i panjohur dhe shumë sëmundjet trashëgimore karakterizohen nga heterogjenitet i theksuar gjenetik, i cili nuk lejon përdorimin e plotë të metodave të drejtpërdrejta të diagnostikimit të ADN-së. Prandaj, në rastet kur lokalizimi i dëmtimit nuk dihet, përdoret një qasje tjetër, që lidhet me studimin e afërsisë së gjenit përgjegjës për sëmundjen e gjeneve, në kombinim me analizën familjare, pra metoda indirekte të diagnostikimit gjenetik molekular të përdoren sëmundjet trashëgimore.

Mund të përdoret për të zbuluar mutacione pikash dhe fshirje të vogla mënyra të ndryshme, megjithatë, të gjitha ato bazohen në përdorimin e metodës PCR. Ky reagim ju lejon të shumëzoni sekuencën nukleotide të ADN-së shumë herë dhe më pas të kërkoni për mutacione. Metodat për kërkimin e fragmenteve të ADN-së që bartin mutacione bazohen në analiza krahasuese sekuenca nukleotide mutant dhe normale të ADN-së.

Analiza e produkteve PCR

në procesin e diagnostikimit të drejtpërdrejtë të ADN-së

Përfshin studimin e veçorive specifike të rajonit të gjenit të përforcuar. Kështu, në sëmundjet e shkaktuara nga zgjerimi i përsëritjeve të trinukleotideve, produktet e amplifikimit ndryshojnë në gjatësinë e tyre (duke reflektuar numrin e ndryshëm të trinjakëve në rajonin e gjeneve të studiuar) dhe, si pasojë, në shpejtësinë e tyre të lëvizjes në xhel. Falë kësaj, arrihet një ndarje e qartë elektroforetike e aleleve normale dhe mutante dhe një përcaktim i saktë i një fragmenti patologjikisht të zgjatur, pra diagnoza e ADN-së e sëmundjes (Fig. 13).

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width="417" height="110 src=">

Oriz. 14. Diagnoza e fshirjes GAG në gjen DYT 1 në pacientët me distoni të pavarur nga dopa (elektroforeza me xhel poliakrilamid). Korsitë 2,3,6 – të sëmurë; gjurmët 1,4,5 – kontrolli. Shigjeta e hollë tregon alelin normal, shigjeta e trashë tregon alelin më të shkurtër mutant (fshirja e tre nukleotideve).

Nëse i gjithë rajoni i ADN-së në studim është pjesë e një delecioni të zgjatur, atëherë amplifikimi PCR i ADN-së nga kjo alele e fshirë nuk do të kryhet për shkak të mungesës së vendeve për hibridizimin e primerit. Në këtë rast, një delecioni homozigot do të diagnostikohet bazuar në mungesën e plotë të një produkti të reaksionit PCR (sinteza e ADN-së është e pamundur nga të dy kopjet e gjenit). Me një fshirje heterozigot, është e mundur të zbulohet një produkt PCR i sintetizuar nga një alele normale (e mbajtur); megjithatë, për të diagnostikuar me besueshmëri një mutacion të tillë, është e nevojshme të përdoren metoda më komplekse të imazhit të ADN-së që lejojnë vlerësimin e dozës së PCR-së përfundimtare. produkt.

Për të identifikuar mutacionet e pikave (më shpesh zëvendësimet e nukleotideve) në zona të caktuara, metoda PCR përdoret në kombinim me metoda të tjera të analizës gjenetike molekulare. Nëse vendndodhja dhe natyra e mutacionit të pikës së supozuar dihen saktësisht, atëherë endonukleazat e kufizimit (enzimat kufizuese) janë enzima të veçanta qelizore të izoluara nga shtame të ndryshme bakteresh.

Këto enzima njohin sekuenca specifike nukleotide që variojnë nga katër deri në dhjetë nukleotide në gjatësi. Pas kësaj, kryhet kufizimi (lat. (prerja)) i këtyre sekuencave si pjesë e një molekule të ADN-së me dy fije. Çdo enzimë kufizuese njeh dhe pret në një vend të caktuar një sekuencë nukleotide specifike të përcaktuar rreptësisht - vend kufizimi (vend njohjeje).

Në rastet kur një mutacion i pikës ndryshon vendin e njohjes natyrore për një enzimë të caktuar kufizuese, kjo enzimë nuk do të jetë në gjendje të çajë fragmentin mutant të përforcuar me PCR. Në disa raste, një mutacion çon në shfaqjen e një vendi të ri njohjeje për një enzimë të veçantë kufizuese që normalisht mungon.

Në të dyja situatat, produktet PCR mutante dhe ato normale të trajtuara me enzimën e përzgjedhur të restriksionit do të prodhojnë fragmente kufizuese me gjatësi të ndryshme, të cilat mund të zbulohen lehtësisht me elektroforezë (Fig. 15).

Kështu, nëse është e nevojshme të zbulohet shpejt ndonjë mutacion i pikës specifike, detyra reduktohet në kërkimin e enzimës përkatëse kufizuese, vendi i njohjes së së cilës lokalizohet në vendin e sekuencës nukleotide të ndërprerë. Trajtimi i produkteve PCR me një enzimë të tillë kufizuese do të bëjë të mundur dallimin lehtësisht të aleleve normale dhe mutante. Analiza e kufizimit thjeshton shumë zbulimin e mutacioneve pika të njohura dhe tani përdoret gjerësisht për diagnostikimin e drejtpërdrejtë të ADN-së të sëmundjeve trashëgimore.

Faza përfundimtare analiza gjenetike molekulare e mutacioneveështë përcaktimi i sekuencës nukleotidike të fragmentit të ADN-së në studim (sekuenca), e cila krahasohet me normën dhe formulohet një diagnozë gjenetike përfundimtare. Falë sukseseve të gjenetikës molekulare, tani janë zhvilluar metodat e diagnostikimit të ADN-së për më shumë se 400 sëmundje trashëgimore.

Oriz. 15. Zbulimi i mutacionit të pikës duke përdorur analizën e kufizimit: A - rajon gjeni i përforcuar që përmban një vend kufizuesAGCTpër endonukleazën kufizueseAlu I. MutacioniG→ Andryshon këtë sekuencë nukleotide, duke rezultuar në enzimë restriktiveAluIbllokuar; B – elektroferograma e produkteve kufizuese: pista 1 – homozigoziteti për alelin normal; pista 2 - homozigoziteti për mutacion; pista 3 – gjendje heterozigote (alele normale + mutacion).

Diagnoza e sëmundjeve trashëgimore, bazuar në ekzaminimin e drejtpërdrejtë të aleleve mutante te pacientët, anëtarët e familjes së tyre ose bartës të dyshuar heterozigotë të mutacioneve patologjike, është i përshtatshëm për diagnozën parasimptomatike dhe prenatale, e cila mund të aplikohet në fazat më të hershme të zhvillimit të fetusit, para shfaqja e ndonjë simptome klinike ose biokimike të sëmundjes.

Pavarësisht nga metoda e zbulimit të mutacionit, karakteristikat e sakta molekulare të secilit mutacion mund të merren vetëm me sekuencë të drejtpërdrejtë. Për të automatizuar këtë proces, vitet e fundit janë përdorur gjerësisht pajisje speciale - sekuencues, të cilët bëjnë të mundur përshpejtimin e ndjeshëm të procesit të leximit të informacionit të ADN-së.

Rruga drejt përdorimit më të gjerë të kërkimit biologjik molekular në laboratorët e diagnostikimit klinik hapet duke përshpejtuar procesin analitik duke kryer të gjitha procedurat në një vazhdimësi, pa transferimin e mostrës, duke krijuar kushte për të parandaluar kontaminimin gjatë testimit paralel të një numri analitesh dhe duke regjistruar objektivisht rezulton në çdo cikël.

Modifikimet kryesore të metodës PCR

Përdoret për të skanuar dhe kërkuar shpejt mutacionet e gjeneve të njohura.

PCR Multiplex (multi-primer).

Kjo metodë bazohet në amplifikimin e njëkohshëm të disa ekzoneve të gjenit në studim në një reagim. Kjo mundëson shqyrtimin e shpejtë me kosto efektive të mutacioneve më të zakonshme. Për shembull, për të diagnostikuar shpejt bartjen e delecioneve në gjenin e distrofinës në pacientët me distrofi muskulare progresive Duchenne/Becker, kryhet një amplifikim i njëkohshëm i një grupi të ekzoneve më të mutuara të këtij gjeni. Meqenëse këto sëmundje trashëgohen në një mënyrë recesive të lidhur me X dhe shoqërohen me dëmtim të kromozomit të vetëm X tek djemtë, në rastin e një delecioni të zgjatur, elektroforeza e produkteve të reaksionit do të zbulojë mungesën e një ose më shumë fragmenteve të ADN-së (eksonet ), e cila mund të shërbejë si konfirmim molekular i diagnozës. Për më tepër, duke zgjedhur seksione specifike të gjeneve për amplifikimin PCR, është i mundur një vlerësim mjaft i saktë i gjatësisë totale të fshirjes dhe pikave të ndarjes së gjeneve (deri në ekzon).

Përdorimi i kombinuar i disa reaksioneve multiplekse bën të mundur diagnostikimin deri në 98% të të gjitha delecioneve që ndodhin në pacientët me distrofi muskulare progresive Duchenne/Becker. Kjo përfaqëson afërsisht 60% të numrit total të mutacioneve të njohura në gjenin e distrofinës dhe tregon efikasitetin shumë të lartë të kësaj metode depistuese për diagnostikimin e ADN-së të distrofinopative (Fig. 16).

Oriz. 16. Diagnoza e drejtpërdrejtë e ADN-së e distrofisë muskulare Duchenne duke përdorur multipleks PCR (elektroforeza me xhel agarose). Në secilin prej individëve të ekzaminuar, katër ekzone të gjenit të distrofinës u përforcuan njëkohësisht (eksonët 17, 19, 44 dhe 45; shigjetat tregojnë produktet përkatëse të amplifikimit). Korsia 1 – kontrolli, korsitë 2-5 – pacientët me distrofi muskulare Duchenne me delecione të ndryshme të gjenit të distrofinës (korsi 2 dhe 5 – fshirja e ekzonit 45, pista 3 – fshirja e ekzonit 44, pista 4 – fshirja e ekzoneve 17 dhe 19 ).

Amplifikimi specifik i alelit

Metoda bazohet në përdorimin e dy çifteve të pavarura të primerëve për një rajon specifik të gjenit: një primer në të dy çiftet është i zakonshëm dhe abetarja e dytë në secilin çift ka një strukturë të ndryshme dhe është plotësuese ose me një sekuencë të ADN-së normale ose mutante. Si rezultat i një reagimi të tillë, dy lloje të produkteve PCR mund të sintetizohen njëkohësisht në tretësirë ​​- normale dhe mutante. Për më tepër, dizajni i primerëve të përdorur bën të mundur dallimin e qartë të produkteve të amplifikimit normal dhe mutant sipas madhësisë së tyre molekulare. Kjo metodë është shumë vizuale dhe ju lejon të verifikoni transportin homo- dhe heterozigot të alelit mutant.

Metoda për modifikimin e drejtuar nga vendi i ADN-së së amplifikuar

Metoda bazohet në përdorimin e një të ashtuquajturi primer mospërputhjeje në PCR (jo plotësisht plotësuese me shabllonin), i cili ndryshon nga sekuenca e ADN-së së shabllonit me një nukleotid. Si rezultat i përfshirjes së primerit të specifikuar në produktin mutant PCR, në të formohet një vend kufizues i krijuar artificialisht për një nga endonukleazat kufizuese, i cili lejon diagnozën e drejtpërdrejtë të ADN-së të një mutacioni të caktuar të njohur duke përdorur analizën e kufizimit. Krijimi i një vendi të tillë kufizimi artificial është i nevojshëm nëse kërkimi nuk zbuloi ekzistencën e një enzime të njohur dhe të disponueshme, vendi "natyror" i kufizimit të së cilës preket si rezultat i shfaqjes së mutacionit që studiohet në molekulën e ADN-së. .

Metoda e anasjelltë e transkriptazës PCR (RT- PCR)

Kjo metodë përdoret në rastet kur është më i përshtatshëm të përdoret jo ADN gjenomike si objekt studimi, por një cADN më kompakte dhe më e pasur me informacione, e marrë pas përpunimit të duhur të mostrave të indeve, për shembull, materiali biopsik ose linjat qelizore të limfociteve, fibroblaste, etj. Kushti i rëndësishëm këtu është shprehja (të paktën minimale) e gjenit të dëshiruar në indin që studiohet.

Në fazën e parë, kryhet transkriptimi i kundërt i mRNA, dhe molekulat e cDNA-së që rezultojnë shërbejnë si shabllon për PCR. Më pas, rajoni kritik i cDNA, i përforcuar në sasi të mjaftueshme, i nënshtrohet sekuencës dhe metodave të tjera të shqyrtimit të mutacioneve, studimit elektroforetik të drejtpërdrejtë (zbulimi i fshirjeve, futjeve, etj.) ose integrimit në një sistem shprehjeje për të marrë një produkt proteinik. dhe analizën e drejtpërdrejtë të tij.

Kjo metodë është veçanërisht efektive për zbulimin e mutacioneve që çojnë në sintezën e një proteine ​​"të cunguar" (mutacione të pakuptimta, mutacione bashkuese, fshirje të mëdha) - e ashtuquajtura analiza PTT (Testi i shkurtimit të proteinave). Analiza PTT përdoret zakonisht në studimin e gjeneve të gjata me shumë ekzon, si distrofia muskulare Duchenne/Becker, ataksi-telangiektazia ose neurofibromatoza e tipit 1.

PCR në kohë reale(PCR në kohë reale, anglisht)

Çdo vit, PCR në kohë reale po bëhet një metodë diagnostike gjithnjë e më popullore në kujdesin shëndetësor praktik. Karakteristika e tij themelore është monitorimi dhe analiza sasiore e akumulimit të produkteve të reaksionit zinxhir polimerazë dhe regjistrimi dhe interpretimi automatik i rezultateve të marra. Kjo metodë nuk kërkon një fazë elektroforeze, e cila redukton kërkesat për një laborator PCR. Falë kursimit të hapësirës së prodhimit, reduktimit të numrit të personelit dhe kërkesës për përcaktimin sasior të ADN/ARN-së, kjo metodë është përdorur me sukses vitet e fundit në qendrat më të mëdha sanitare-epidemiologjike, diagnostike dhe kërkimore në vendet e zhvilluara të botës, duke zëvendësuar PCR në formatin aktual ("klasik").

PCR në kohë reale përdor sonda oligonukleotide të etiketuara në mënyrë fluoreshente për të zbuluar ADN-në ndërsa përforcohet. PCR në kohë reale lejon analizën e plotë të një kampioni brenda 20-60 minutave dhe teorikisht është në gjendje të zbulojë qoftë edhe një molekulë ADN ose ARN në një mostër.

Oriz. 17. PCR në kohë reale.

PCR në kohë reale përdor një sistem TaqMan që kontrollon kinetikën e PCR direkt gjatë amplifikimit duke përdorur shuarjen e fluoreshencës me rezonancë. Për zbulimin, përdoret një sondë që mbart një fluorofor dhe një shuarës që plotësojnë pjesën e mesme të fragmentit të përforcuar. Kur fluorofori dhe shuesi lidhen me sondën oligonukleotide, vërehet vetëm emetim i vogël fluoreshent. Gjatë procesit të amplifikimit, për shkak të aktivitetit të ekzonukleazës 5" të Taq polimerazës, etiketa fluoreshente futet në tretësirë, e çliruar nga afërsia e saj me shutësin dhe gjeneron një sinjal fluoreshent që rritet në kohë reale në proporcion me akumulimin e amplifikatorit ( Fig. 17).

Përparësitë kryesore të PCR në kohë reale ndaj PCR me elektroforezë xhel:

· E gjithë metoda zhvillohet në një provëz;

· Metoda zgjat 1 orë;

· Mjaftojnë 1-2 dhoma pune;

Së bashku me një vlerësim cilësor të rezultatit, ekziston mundësia e një vlerësimi sasior (për shembull, kur përshkruani terapi antivirale për AIDS ose hepatitin viral, është e nevojshme të dihet ngarkesa virale, d.m.th. sasia e virusit për njësi, e cila ofrohet me PCR në kohë reale);

· Rreziku i kontaminimit është reduktuar ndjeshëm.

konkluzioni

Metoda PCR është një nga metodat më të zakonshme të kërkimit biologjik molekular. Kjo metodë duhet të përdoret në mënyrë inteligjente nga klinicistët dhe një mjek që vendos të përdorë PCR në punën e tij duhet të ketë njohuri të caktuara për veçoritë dhe aftësitë e kësaj metode. Së dyti, duhet të ketë reagime të afërta ndërmjet klinikut dhe laboratorit PCR, i cili është i nevojshëm për të analizuar rastet komplekse dhe për të zhvilluar strategjinë e saktë diagnostikuese. Së treti, analiza PCR nuk është një ilaç në diagnostikim (kryesisht sëmundjet infektive) dhe nuk zëvendëson metodat ekzistuese të kërkimit, por vetëm i plotëson ato. Dhe më e rëndësishmja, PCR nuk mund të zëvendësojë intuitën dhe të menduarit analitik që duhet të ketë një mjek që pret sukses.

P . S . Kërkimi biologjik molekular - ndryshimi i udhëzimeve për diagnozën dhe trajtimin. Përdorimi i metodave biologjike molekulare shoqërohet me perspektivën e një ndryshimi rrënjësor në theksin në diagnostikimin laboratorik. Mund të mos jetë vetëm për informacion në kohë, por për marrjen e tij paraprakisht. Nëse tani testet laboratorike në shumicën e rasteve kryhen tashmë kur sëmundja është zhvilluar dhe trajtimi ka filluar, atëherë informacioni laboratorik biologjik molekular pritet të bëjë të mundur identifikimin e prirjes së një personi ndaj llojeve të caktuara të patologjisë dhe shkallës së ndjeshmërisë ndaj barnave të caktuara. , e cila do të justifikojë natyrën parashikuese, parandaluese dhe të personalizuar të mjekësisë së ardhshme.

NDRYSHIMI I DIAGNOZËS DHE ORIENTIMET E TRAJTIMIT

SËMUNDJET TRASHËGIMORE

Sot Në të ardhmen

Diagnoza Pasaporta gjenetike

8. Sa dhoma pune nevojiten për të operuar një laborator PCR me detektim fluoreshente (analiza sasiore, PCR në kohë reale)?

9. Çfarë është zbulimi?

10. Cilat metoda të diagnostikimit të ADN-së ekzistojnë?

11. Puna e cilës enzimë qëndron në themel të PCR?

12. Pse zona e zbulimit duhet të hiqet nga zonat e tjera të punës?

13. Çfarë është një vend kufizimi?

14. Cilat janë ndryshimet ndërmjet metodave të drejtpërdrejta dhe indirekte të diagnostikimit të ADN-së?

15. Çfarë është sekuenca?

16. Çka është multipleks PCR?

17. Cilat lloje të mutacioneve përcaktohen duke përdorur PCR?

18. Çfarë është kontaminimi?

19. Cili është thelbi i metodës së amplifikimit të alelit specifik?

20. Kushtet e ruajtjes së materialit PCR?

21. Në çfarë pajisje bëhet përforcimi?

22. Çka është metoda PCR (RT-PCR) e transkriptazës së kundërt?

23. Çfarë shërben si material për diagnostikimin e PCR?

24. Rendisni llojet e kontaminimit?

Testet për vetë-përgatitje

1. Enzimat kufizuese të endonukleazës:

a) enzimat që “thyejnë” ADN-në në vende rreptësisht specifike;

b) enzimat që bashkojnë së bashku prishen në molekulën e ADN-së;

c) enzimat që ofrojnë komponime që kryejnë riparimin e ADN-së.

2. Amplifikimi i gjenit:

3. Cila metodë e gjenetikës molekulare përdoret për të diagnostikuar sëmundjet e shkaktuara nga një gjen mutant i një sekuence të njohur?

a) përdorimi i një enzime specifike kufizuese;

b) zbulimin e drejtpërdrejtë duke përdorur sonda molekulare specifike;

V) analiza e familjes shpërndarjet e polimorfizmave të gjatësisë normale të fragmentit kufizues.

4. Sekuenca e ADN-së:

a) identifikimi i sekuencës bazë të ADN-së;

b) përsëritje të shumëfishta të çdo seksioni të ADN-së;

c) izolimi i një fragmenti të ADN-së që përmban gjenin në studim.

5. Për të marrë mostra të ADN-së mund të përdorni :

b) vilet korionike;

c) lëngu amniotik;

d) qelizat e lëngut amniotik;

e) mostrat e biopsisë së lëkurës, muskujve, mëlçisë,

e) çdo gjë është e saktë përveç pikës "c",

g) gjithçka është e saktë përveç pikës "d",

h) të gjitha sa më sipër janë të vërteta.

6. Për të diagnostikuar cilat mutacione përdoret metoda PCR:

a) gjenomik;

b) kromozomale;

c) gjen (pika).

7. Abetarja është:

a) seksioni plotësues i ADN-së;

b) një sekuencë oligonukleotide sintetike e etiketuar (radioaktive ose fluoreshente) që plotëson një gjen mutant ose normal;

c) një oligonukleotid që vepron si një "primer" dhe fillon sintezën e një zinxhiri polinukleotid në një matricë ADN ose ARN.

8. Kush e zhvilloi parimin e metodës PCR?

b) K. Mullis

9. A përdoret metoda PCR për të diagnostikuar zgjerimin e përsëritjeve të trinukleotideve (një lloj dinamik mutacioni)?

10. Në cilat fusha përdoret PCR?

a) mjekësia klinike;

b) përcaktimi i organizmave transgjenikë (OMGJ)

c) identifikimi personal, vërtetimi i atësisë, mjekësia ligjore

d) të gjitha sa më sipër,

e) asnjë nga sa më sipër..

Shembuj të përgjigjeve: 1 – a; 2 – b; 3 – b; 4 – a; 5 – e; 6 – në; 7 – në; 8 – b; 9 – a, 10 – g.

Kryesor

1.Genetika e Boçkovit. Moska. GEOTAR, 2002.

Shtesë

1. , Bakharev dhe trajtimi i sëmundjeve kongjenitale dhe trashëgimore tek fëmijët. - Moskë, 2004.

2. Diagnostifikimi i ADN-së dhe këshillimi gjenetik mjekësor. - Moskë, 2004.

3. Gjenetika Ginter. - Moskë, 2003.

4. Bazat Gorbunov të gjenetikës mjekësore. – Shën Petersburg: Intermedica, 1999.

5. J. McGee. molekulare diagnoza klinike. - Bota, 1999.

6. Menshikov - kërkime biologjike në diagnostifikimin laboratorik klinik: mundësitë e problemit (leksione). Diagnostika laboratorike klinike, Nr. 3, 2006.

7. Puna e Kornienkos në laboratorin PCR gjatë analizës në linjë të materialit biologjik. Diagnostika laboratorike klinike, Nr. 10, 2006.

8. Organizimi i punës laboratorike PCR. Udhëzime metodike. MU 1.3.1794-03. Mjeku kryesor sanitar i Federatës Ruse, 2003.

9. Teknologjia Erlich H. A. PCR. – Percin-Elmer Cetus, 1993.

10. Heid C. A., Stevens J. PCR sasiore në kohë reale. Gjenomi Res. – Nr.6, 1996.

PARIMET THEMELORE TË METODËS

REAKSIONI I ZINXHIRIT POLIMERAZË

Manual metodologjik për punën jashtëshkollore të studentëve 3-4 vjeç në specialitetet e mjekësisë së përgjithshme (060101) dhe pediatrisë (060103).

GOU VPO "Akademia Mjekësore Shtetërore Krasnoyarsk e Agjencisë Federale për Shëndetin dhe Zhvillimin Social"

Rusia, Krasnoyarsk,

Agjencia Federale për Arsimin

Shtetit institucion arsimor

Më e lartë Arsimi profesional

"Akademia Pedagogjike Shtetërore Kareliane"

Puna e kursit me temë:

Reaksioni zinxhir i polimerazës (PCR) dhe aplikimi i tij

Plotësuar nga: studentja Koryagina Valeria Aleksandrovna

Kontrolluar nga: Karpikova Natalya Mikhailovna

Petrozavodsk 2013

Prezantimi

Kapitulli 1. Rishikimi i literaturës

1.5.4 Efekti Plateau

1.5.6 Amplifikimi

konkluzioni

Prezantimi

Njëzet vitet e fundit janë shënuar nga futja e gjerë e metodave gjenetike molekulare në shkencat biologjike, mjekësore dhe bujqësore.

Nga fillimi i viteve 1970, dukej se biologjia molekulare kishte arritur një shkallë të caktuar pjekurie. Gjatë kësaj periudhe, objekti kryesor i kërkimit gjenetik molekular ishin mikroorganizmat. Kalimi te eukariotët u paraqiti studiuesve probleme krejtësisht të reja që nuk mund të zgjidheshin duke përdorur metodat e analizës gjenetike që ekzistonin në atë kohë. Një përparim në zhvillimin e gjenetikës molekulare u bë i mundur falë shfaqjes së një mjeti të ri eksperimental - endonukleazat kufizuese. Në vitet në vijim, numri i metodave për analizën e drejtpërdrejtë të ADN-së, bazuar në qasje cilësore të ndryshme, filloi të rritet me shpejtësi.

Teknologjitë moderne në shumë raste kanë bërë të mundur fillimin e studimit të organizimit të imët strukturor dhe funksional të gjenomave bërthamore dhe ekstranukleare të organizmave të ndryshëm në një nivel më të thellë. Kjo ishte e një rëndësie të veçantë për zhvillimin e metodave të reja diagnostikuese dhe mjekuese sëmundje të ndryshme. Jo më pak e rëndësishme ishte mundësia e përdorimit të arritjeve të gjenetikës molekulare në biologjinë dhe mbarështimin e popullsisë për të identifikuar dhe analizuar ndryshueshmërinë gjenetike të popullatave, varieteteve dhe shtameve, identifikimin dhe certifikimin e individëve me vlerë ekonomikisht, krijimin e organizmave të modifikuar gjenetikisht dhe zgjidhjen e çështjeve të tjera.

Secila metodë ka avantazhet dhe disavantazhet e veta. Nuk ka asnjë metodë universale që mund të zgjidhë të gjitha problemet që dalin. Prandaj, zgjedhja e një metode specifike për kërkimin që kryhet është një nga fazat më të rëndësishme të çdo pune shkencore.

Kapitulli 1. Rishikimi i literaturës

1.1 Historia e zbulimit të reaksionit zinxhir të polimerazës (PCR)

Në vitin 1983 K.B. Mullis et al. publikuan dhe patentuan metodën e reaksionit zinxhir polimerazë (PCR), e cila ishte e destinuar të kishte një ndikim të thellë në të gjitha fushat e kërkimit dhe aplikimit të acideve nukleike. Vlera e kësaj metode për Biologji Molekulare dhe gjenetika doli të ishte aq e madhe dhe e dukshme sa që pas shtatë vjetësh autori u shpërblye Çmimi Nobël në kimi.

Në fillim të përdorimit të metodës, pas çdo cikli ngrohje-ftohje, ishte e nevojshme të shtohej ADN polimeraza në përzierjen e reaksionit, pasi ajo çaktivizohej në temperaturën e lartë të nevojshme për të ndarë fijet e spirales së ADN-së. Procedura e reagimit ishte relativisht joefikase dhe kërkonte shumë kohë dhe enzimë. Në vitin 1986, metoda e reaksionit zinxhir të polimerazës u përmirësua ndjeshëm. Është propozuar që të përdoren polimerazat e ADN-së nga bakteret termofile. Këto enzima rezultuan të jenë të qëndrueshme termike dhe ishin në gjendje të përballonin shumë cikle reagimi. Përdorimi i tyre bëri të mundur thjeshtimin dhe automatizimin e PCR. Një nga polimerazat e para të ADN-së të qëndrueshme termike u izolua nga bakteret Thermus aquaticusdhe të emërtuar Taq-polimeraza.

Aftësia për të amplifikuar çdo segment të ADN-së, sekuenca nukleotide e të cilit është e njohur, dhe për ta marrë atë në një formë homogjene dhe një sasi përgatitore pas përfundimit të PCR, e bën PCR një metodë alternative për klonimin molekular të fragmenteve të shkurtra të ADN-së. Në këtë rast, nuk ka nevojë të përdoren teknika komplekse metodologjike që përdoren në Inxhinieri gjenetike me klonim konvencional. Zhvillimi i metodës PCR ka zgjeruar në masë të madhe aftësitë metodologjike të gjenetikës molekulare dhe, në veçanti, inxhinierisë gjenetike, aq sa ka ndryshuar dhe forcuar rrënjësisht potencialin shkencor të shumë fushave të saj.

1.2 Llojet e reaksionit zinxhir të polimerazës (PCR)

· PCR e vendosur- përdoret për të reduktuar numrin e nënprodukteve të reaksionit. Përdoren dy palë abetare dhe kryhen dy reaksione të njëpasnjëshme. Çifti i dytë i abetares amplifikon një rajon të ADN-së brenda produktit të reaksionit të parë.

· PCR e përmbysur- përdoret kur dihet vetëm një rajon i vogël brenda sekuencës së dëshiruar. Kjo metodë është veçanërisht e dobishme kur bëhet fjalë për përcaktimin e sekuencave fqinje pasi ADN-ja është futur në gjenom. Për të kryer PCR të përmbysur, kryhen një seri prerjesh të ADN-së duke përdorur enzima kufizuese<#"justify">primer i reaksionit zinxhir të polimerazës

· PCR specifike për grupin- PCR për të afërmit<#"center">1.3 Reaksioni zinxhir i polimerazës

Zbuluar në mesin e viteve 1980, reaksioni zinxhir i polimerazës (PCR) mund të shumëfishojë numrin e kopjeve të një kampioni origjinal miliona herë brenda disa orësh. Gjatë çdo cikli reaksioni, nga molekula origjinale formohen dy kopje. Secila prej kopjeve të sintetizuara të ADN-së mund të shërbejë si shabllon për sintezën e kopjeve të reja të ADN-së në ciklin e ardhshëm. Kështu, përsëritja e përsëritur e cikleve çon në një rritje të numrit të kopjeve në progresion gjeometrik. Nga llogaritjet rezulton se edhe me 30 cikle, numri i kopjeve të molekulës origjinale do të jetë më shumë se 1 miliard. Edhe nëse marrim parasysh se jo të gjithë amplikonët dublikohen gjatë çdo cikli, numri i përgjithshëm i kopjeve, pavarësisht kësaj, është një shifër mjaft e madhe.

Çdo cikël i reaksionit zinxhir polimerazë (PCR) përbëhet nga hapat e mëposhtëm:

· Denatyrimi - Rritja e temperaturës bën që molekula e ADN-së me dy zinxhirë të zbërthehet dhe të ndahet në dy me një fije;

· Pjekja - Reduktimi i temperaturës i lejon abetaret të lidhen me rajonet plotësuese të molekulës së ADN-së;

· Zgjatja - Enzima ADN polimeraza kompleton vargun komplementar.

Për të përforcuar një fragment të përzgjedhur, përdoren dy primerë (primera) oligonukleotidësh që rrethojnë një rajon specifik të ADN-së. Abetare të orientuara 3 - përfundon drejt njëri-tjetrit dhe drejt sekuencës që duhet të përforcohet. ADN polimeraza kryen sintezën (përfundimin) e zinxhirëve të ADN-së reciprokisht plotësuese, duke filluar me abetare. Gjatë sintezës së ADN-së, primerët integrohen fizikisht në zinxhirin e molekulave të ADN-së të saposintetizuara. Çdo varg i një molekule ADN-je të formuar duke përdorur një prej abetareve mund të shërbejë si shabllon për sintezën e një vargu plotësues të ADN-së duke përdorur një primer tjetër.

1.4 Kryerja e reaksionit zinxhir të polimerazës (PCR)

Reaksioni i zinxhirit të polimerazës kryhet në tuba të posaçëm polipropileni me mure të hollë, të përputhshëm në madhësi me cikluesin termik (përforcues) të përdorur - një pajisje që kontrollon karakteristikat e temperaturës dhe kohës së fazave të reaksionit zinxhir polimerazë (PCR).

1.5 Parimi i metodës së reaksionit zinxhir polimerazë

Reaksioni zinxhir i polimerazës (PCR) është një metodë in vitro e amplifikimit të ADN-së që mund të përdoret për të izoluar dhe shumëzuar një sekuencë specifike të ADN-së miliarda herë brenda disa orësh. Aftësia për të marrë një numër të madh të kopjeve të një në mënyrë rigoroze një zonë të caktuar gjenomi thjeshton shumë studimin e një kampioni ekzistues të ADN-së.

Për të kryer një reaksion zinxhir polimerazë, duhet të plotësohen një sërë kushtesh:

1.5.1 Prania e një numri përbërësish në përzierjen e reaksionit

Përbërësit kryesorë të përzierjes së reaksionit (PCR) janë: Tris-HCl, KCl, MgCl. 2, një përzierje e trifosfateve të nukleotideve (ATP, GTP, CTP, TTP), abetareve (oligonukleotideve), përgatitjes së ADN-së, polimerazës së ADN-së termostabël. Secili nga përbërësit e përzierjes së reaksionit është i përfshirë drejtpërdrejt në reaksionin zinxhir të polimerazës (PCR), dhe përqendrimi i reagentëve ndikon drejtpërdrejt në rrjedhën e amplifikimit.

· Tris-HCl - përcakton pH-në e përzierjes së reaksionit, krijon një kapacitet buferik. Aktiviteti i ADN polimerazës varet nga pH e mjedisit, kështu që vlera e pH-së ndikon drejtpërdrejt në rrjedhën e reaksionit zinxhir të polimerazës. Në mënyrë tipike, vlera e pH është midis 8 dhe 9,5. Vlera e lartë e pH merret sepse pH e buferit Tril-HCl bie me rritjen e temperaturës.

· KCl - përqendrimi i klorurit të kaliumit deri në 50 mM ndikon në rrjedhën e proceseve të denatyrimit dhe pjekjes; përqendrimet mbi 50 mM pengojnë polimerazën e ADN-së.

· MgCl 2- meqenëse ADN polimeraza është Mg 2+- enzima e varur, atëherë përqendrimi i joneve të magnezit ndikon në aktivitetin e enzimës (Mg 2+formon komplekse me NTP - këto komplekse janë substrati për polimerazën). Një përqendrim i lartë çon në një rritje të amplifikimit jospecifik, dhe një përqendrim i ulët çon në frenimin e reaksionit; optimali (për polimeraza të ndryshme) është në intervalin 0,5 - 5 mM. Përveç kësaj, përqendrimi i kripërave të magnezit ndikon në rrjedhën e proceseve të denatyrimit dhe pjekjes - një rritje në përqendrimin e Mg. 2+shkakton një rritje të temperaturës së shkrirjes së ADN-së (d.m.th., temperaturës në të cilën 50% e vargjeve të ADN-së me dy fije ndahen në ato me një zinxhir).

· NTP - trifosfatet nukleotide janë monomere të drejtpërdrejta të acideve nukleike. Për të parandaluar ndërprerjen e zinxhirit, rekomandohet një raport i barabartë i të katër trifosfateve nukleotide. Përqendrimi i ulët i këtyre përbërësve në përzierjen e reaksionit rrit gjasat e gabimeve gjatë ndërtimit të një zinxhiri plotësues të ADN-së.

· Primera - Më optimale është përdorimi i abetareve me një ndryshim në temperaturën e shkrirjes jo më shumë se 2 - 4 o C. Ndonjëherë gjatë ruajtjes afatgjatë në temperaturë 4 o C, ose pas një numri të madh të ngrirjes dhe shkrirjes, primerët formojnë struktura dytësore - dimerë, duke ulur efikasitetin e PCR. Eliminimi i këtij problemi zbret në inkubimin në një banjë uji (T=95 o C) për 3 minuta dhe ftohje e shpejtë pasuese në 0o ME.

· Preparatet e ADN-së - sasia dhe cilësia e preparatit të ADN-së (matricës) ndikon drejtpërdrejt në rrjedhën dhe parametrat e reaksionit zinxhir të polimerazës. Sasi të tepërta të mostrës së ADN-së pengojnë reaksionin zinxhir të polimerazës (PCR). papastërtitë substancave të ndryshme që përmban preparati i ADN-së mund të zvogëlojë gjithashtu efektivitetin e reaksionit zinxhir polimerazë (PCR): acetat natriumi, klorur natriumi, izopropanol, etanol, heparinë, fenol, ure, hemoglobinë, etj.

· ADN polimeraza - kur përdoret një sasi e vogël e ADN polimerazës, vërehet një rënie në sintezën e produktit përfundimtar në përpjesëtim të drejtë me madhësinë e fragmenteve. Një tepricë e polimerazës me 2-4 herë çon në shfaqjen e spektrave difuzë, dhe me 4-16 herë - spektrat jospecifik me molekulare të ulët. Gama e përqendrimeve të përdorura është 0,5 - 1,5 njësi aktiviteti për 25 μl përzierje PCR.

Përveç përbërësve kryesorë të përzierjes PCR, përdoren një sërë substancash shtesë që përmirësojnë treguesit cilësorë dhe sasiorë të PCR: acetamidi (5%) - rrit tretshmërinë e përbërësve kryesorë; betainë ( kripë natriumi) - stabilizimi i ADN polimerazës, ulja e temperaturës së shkrirjes së ADN-së, barazimi i temperaturës së shkrirjes; albumina e gjedhit (10-100 μg/ml) - stabilizimi i ADN polimerazës; dimetil sulfoksid (1-10%) - rrit tretshmërinë e përbërësve kryesorë; formamide (2-10%) - duke rritur specifikën e pjekjes; glicerinë (15-20%) - rrit stabilitetin termik të enzimës, uljen e temperaturës së denatyrimit të mostrës së ADN-së; sulfati i amonit - uljen e temperaturës së denatyrimit dhe pjekjes.

1.5.2 Modaliteti ciklik dhe temperatura

Pamja e përgjithshme e një programi të reaksionit zinxhir polimerazë (PCR) është si më poshtë:

fazë. Denatyrimi primar afatgjatë i preparatit të ADN-së Cikli i parë

fazë. Denatyrimi i shpejtë i përgatitjes së ADN-së. Pjekja e abetareve. Zgjatimi.30 - 45 cikle.

fazë. Zgjatim i gjatë. Ftohja e përzierjes së reaksionit Cikli i parë.

Çdo element i skenës - denatyrimi, pjekja, zgjatja - ka karakteristika individuale të temperaturës dhe kohës. Parametrat e temperaturës dhe kohës për çdo element zgjidhen në mënyrë empirike, në përputhje me treguesit cilësorë dhe sasiorë të produkteve të amplifikimit.

Denatyrimi. Gjatë këtij elementi të reaksionit zinxhir të polimerazës, një molekulë e ADN-së me dy fije ndahet në dy me një zinxhir. Parametrat e temperaturës së denatyrimit janë në intervalin 90 - 95 o C, por në rastin e një kampioni të ADN-së me përmbajtje të lartë të guaninës dhe citozinës, temperatura duhet të rritet në 98 o C. Temperatura e denatyrimit duhet të jetë e mjaftueshme për të denatyruar plotësisht vargjet e ADN-së dhe për të shmangur "ftohjen me ndezje" ose pjekjen e shpejtë, megjithatë, polimeraza e ADN-së e qëndrueshme është më pak e qëndrueshme në temperatura të larta. Kështu, zgjedhja e parametrave optimale të temperaturës së denatyrimit për raportin primer/kampion (përgatitja e ADN-së) është një kusht i rëndësishëm gjatë kryerjes së amplifikimit. Nëse temperatura e denatyrimit në fazën e parë është mbi 95 o C, rekomandohet shtimi i ADN polimerazës në përzierjen e reaksionit pas denatyrimit fillestar. Kohëzgjatja e këtij elementi të fazës gjatë reaksionit zinxhir të polimerazës (PCR) duhet të jetë e mjaftueshme për të denatyruar plotësisht ADN-në, por në të njëjtën kohë të mos ketë një efekt të rëndësishëm në aktivitetin e ADN polimerazës në një temperaturë të caktuar.

Pjekja. Temperatura e pjekjes (T A ) është një nga parametrat më të rëndësishëm të reaksionit zinxhir të polimerazës. Temperatura e pjekjes për çdo primer specifik zgjidhet individualisht. Varet nga gjatësia dhe përbërja nukleotide e abetares. Zakonisht është më e ulët me 2 - 4 o Nga vlera e pikës së shkrirjes (T m ) abetare. Nëse temperatura e pjekjes së sistemit është më e ulët se optimale, atëherë numri i fragmenteve të përforcuara jospecifike rritet dhe, anasjelltas, më shumë ngrohjes zvogëlon sasinë e produkteve të përforcuara. Në këtë rast, përqendrimi i amplikoneve specifike mund të ulet ndjeshëm, deri në frenimin e reaksionit zinxhir të polimerazës (PCR). Rritja e kohës së pjekjes çon gjithashtu në një rritje të numrit të amplikonëve jospecifik.

Zgjatimi. Në mënyrë tipike, çdo lloj polimeraza e ADN-së e qëndrueshme ka një temperaturë optimale individuale për aktivitet. Shpejtësia e sintezës së vargut plotësues të ADN-së nga enzima është gjithashtu specifike për secilën polimerazë (mesatarisht është 30 - 60 nukleotide në sekondë, ose 1 - 2 mijë baza në minutë), prandaj koha e zgjatjes zgjidhet në varësi të llojit. të ADN polimerazës dhe gjatësisë së rajonit të përforcuar.

1.5.3 Parimet bazë për përzgjedhjen e abetareve

Kur krijoni një sistem testimi PCR, një nga detyrat kryesore është zgjedhja e saktë e abetareve, të cilat duhet të plotësojnë një sërë kriteresh:

Primerat duhet të jenë specifike. Vëmendje e veçantë paguaj 3 - skajet e abetares, sepse prej tyre fillon të plotësojë polimeraza Taq të plotësojë vargun plotësues të ADN-së. Nëse specifika e tyre është e pamjaftueshme, atëherë ka të ngjarë që proceset e padëshirueshme të ndodhin në epruvetën me përzierjen e reaksionit, domethënë, sinteza e ADN-së jo specifike (fragmente të shkurtra ose të gjata). Është e dukshme në elektroforezë në formën e brezave shtesë të rëndë ose të lehtë. Kjo ndërhyn në vlerësimin e rezultateve të reagimit, pasi është e lehtë të ngatërrohet një produkt specifik i amplifikimit me ADN-në e huaj të sintetizuar. Disa primerë dhe dNTP konsumohen për sintezën e ADN-së jo specifike, gjë që çon në një humbje të konsiderueshme të ndjeshmërisë.

Primerat nuk duhet të formojnë dimerë dhe sythe, d.m.th. fijet e qëndrueshme të dyfishta nuk duhet të formohen si rezultat i pjekjes së primerëve me veten ose me njëri-tjetrin.

1.5.4 Efekti Plateau

Duhet të theksohet se procesi i akumulimit të produkteve specifike të amplifikimit në një progresion gjeometrik zgjat vetëm për një kohë të kufizuar, dhe më pas efikasiteti i tij bie në mënyrë kritike. Kjo është për shkak të të ashtuquajturit efekt pllajë.

Efekti i afatit pllajë përdoret për të përshkruar procesin e akumulimit të produkteve PCR në ciklet e fundit të amplifikimit.

Në varësi të kushteve dhe numrit të cikleve të reaksionit të amplifikimit, në momentin kur arrihet efekti pllajë ndikohen nga përdorimi i substrateve (dNTP dhe abetare), qëndrueshmëria e reaktantëve (dNTP dhe enzimë), sasia e frenuesve, duke përfshirë pirofosfatet dhe duplekset e ADN-së, konkurrenca për reaktantët nga produkte jospecifike ose dimerët e primerit, përqendrimi i një produkti specifik. dhe denatyrim jo i plotë në përqendrime të larta të produkteve të amplifikimit.

Sa më i ulët të jetë përqendrimi fillestar i ADN-së së synuar, aq më i lartë është rreziku që reagimi të dështojë. rrafshnaltë." Kjo pikë mund të ndodhë përpara se të ketë mjaft produkte të amplifikimit specifik për t'u analizuar. Vetëm sisteme testimi të optimizuara mirë mund ta shmangin këtë.

1.5.5 Përgatitja e një kampioni biologjik

Për të izoluar ADN-në, përdoren teknika të ndryshme në varësi të detyrave në fjalë. Thelbi i tyre qëndron në nxjerrjen (nxjerrjen) e ADN-së nga një preparat biologjik dhe heqjen ose neutralizimin e papastërtive të huaja për të marrë një preparat ADN me një pastërti të përshtatshme për PCR.

Metoda për marrjen e një preparati të pastër të ADN-së të përshkruar nga Marmur konsiderohet standarde dhe tashmë është bërë klasike. Ai përfshin proteolizën enzimatike të ndjekur nga deproteinizimi dhe riprecipitimi i ADN-së me alkool. Kjo metodë ju lejon të merrni një përgatitje të pastër të ADN-së. Megjithatë, është mjaft punë intensive dhe përfshin punën me substanca të tilla agresive dhe me erë të fortë si fenoli dhe kloroformi.

Një nga metodat aktualisht të njohura është metoda e nxjerrjes së ADN-së e propozuar nga Boom et al. Kjo metodë bazohet në përdorimin e një agjenti të fortë kaotropik, tiocianat guanidine (GuSCN), për lizën e qelizave dhe thithjen e mëvonshme të ADN-së në një bartës (rruaza qelqi, tokë diatomike, qumësht qelqi, etj.). Pas larjes, ADN-ja mbetet në mostër, e thithur në bartës, nga e cila hiqet lehtësisht duke përdorur një tampon elucioni. Metoda është e përshtatshme, e avancuar teknologjikisht dhe e përshtatshme për përgatitjen e një kampioni për përforcim. Sidoqoftë, humbja e ADN-së është e mundur për shkak të thithjes së pakthyeshme në transportues, si dhe gjatë larjeve të shumta. Kjo është veçanërisht e rëndësishme kur punoni me sasi të vogla të ADN-së në një mostër. Përveç kësaj, edhe sasi të vogla të GuSCN mund të pengojnë PCR. Prandaj, kur përdorni këtë metodë është shumë e rëndësishme zgjedhja e duhur sorbent dhe respektim i kujdesshëm i nuancave teknologjike.

Një grup tjetër i metodave të përgatitjes së mostrës bazohet në përdorimin e shkëmbyesve të joneve të tipit Chilex, të cilët, ndryshe nga qelqi, nuk thithin ADN-në, por përkundrazi, papastërtitë që ndërhyjnë në reagim. Si rregull, kjo teknologji përfshin dy faza: zierjen e mostrës dhe thithjen e papastërtive në një shkëmbyes jonesh. Metoda është jashtëzakonisht tërheqëse për shkak të thjeshtësisë së saj të ekzekutimit. Në shumicën e rasteve është i përshtatshëm për të punuar me material klinik. Për fat të keq, ndonjëherë ka mostra me papastërti që nuk mund të hiqen duke përdorur shkëmbyesit e joneve. Përveç kësaj, disa mikroorganizma nuk mund të shkatërrohen me zierje të thjeshtë. Në këto raste, është e nevojshme të futen faza shtesë të përpunimit të mostrës.

Kështu, zgjedhja e metodës së përgatitjes së mostrës duhet të merret parasysh duke kuptuar qëllimet e analizës së synuar.

1.5.6 Amplifikimi

Për të kryer reaksionin e amplifikimit, është e nevojshme të përgatitet një përzierje e reaksionit dhe të shtoni mostrën e analizuar të ADN-së në të. Është e rëndësishme të merren parasysh disa veçori të pjekjes së primerit. Fakti është se, si rregull, mostra biologjike e analizuar përmban molekula të ndryshme të ADN-së, ndaj të cilave abetaret e përdorura në reaksion kanë homologji të pjesshme dhe në disa raste domethënëse. Për më tepër, abetaret mund të kalojnë njëra-tjetrën, duke formuar dimerë të primerit. Të dyja çojnë në një konsum të konsiderueshëm të abetareve për sintezën e nënprodukteve (jo specifike) të produkteve të reagimit dhe, si rezultat, reduktojnë ndjeshëm ndjeshmërinë e sistemit. Kjo e bën të vështirë ose të pamundur leximin e rezultateve të reagimit gjatë elektroforezës.

1.6 Përbërja e përzierjes standarde të reaksionit PCR

x Bufer PCR (tretësirë ​​100 mM Tris-HCl, pH 9.0, tretësirë ​​KCl 500 mM, tretësirë ​​MgCl2 25 mM ) …….2,5 µl

Ujë (MilliQ)………………………………………………………….18,8 µl

Përzierja e trifosfateve nukleotide (dNTP)

mM zgjidhje e secilës………………………………………………….0,5 µl

Primer 1 (tretësirë ​​10 mM) ………………………………………………………….….1 µl

Primer 2 (tretësirë ​​10 mM) ………………………………………………………….….1 µl

ADN polimeraza (5 njësi/µl) ………………………………………… 0,2 µl

Mostra e ADN-së (20 ng/µl) ……………………………………………..1 µl

1.7 Vlerësimi i rezultateve të reagimit

Për të vlerësuar saktë rezultatet e PCR, është e rëndësishme të kuptohet se kjo metodë nuk është sasiore. Teorikisht, produktet e amplifikimit të molekulave të vetme të ADN-së mund të zbulohen duke përdorur elektroforezë pas 30-35 cikleve. Megjithatë, në praktikë, kjo bëhet vetëm në rastet kur reagimi zhvillohet në kushte afër idealit, gjë që nuk ndodh shpesh në jetë. Shkalla e pastërtisë së preparatit të ADN-së ka një ndikim veçanërisht të madh në efikasitetin e amplifikimit, d.m.th. prania në përzierjen e reaksionit të frenuesve të caktuar, të cilët në disa raste mund të jenë jashtëzakonisht të vështira për t'u hequr qafe. Ndonjëherë, për shkak të pranisë së tyre, edhe dhjetëra mijëra molekula të synuara të ADN-së nuk mund të amplifikohen. Kështu, shpesh nuk ka lidhje të drejtpërdrejtë midis sasisë fillestare të ADN-së së synuar dhe sasisë përfundimtare të produkteve të amplifikimit.

Kapitulli 2: Aplikimet e reaksionit zinxhir polimerazë

PCR përdoret në shumë fusha për testime dhe eksperimente shkencore.

Mjekësia ligjore

PCR përdoret për të krahasuar të ashtuquajturat "gjurmë gjenetike të gishtërinjve". Kërkohet mostër e materialit gjenetik nga vendi i krimit - gjak, pështymë, spermë, flokë etj. Krahasohet me materialin gjenetik të të dyshuarit. Mjafton një sasi shumë e vogël e ADN-së, teorikisht një kopje. ADN-ja ndahet në fragmente dhe më pas përforcohet duke përdorur PCR. Fragmentet ndahen duke përdorur elektroforezë të ADN-së. Modeli që rezulton i rregullimit të brezave të ADN-së quhet gjurmë gjenetike e gishtit.

Vendosja e atësisë

Rezultatet e elektroforezës së fragmenteve të ADN-së të përforcuara me PCR. Babai. Fëmija. Nëna. Fëmija trashëgoi disa tipare të gjurmës gjenetike të të dy prindërve, duke rezultuar në një gjurmë të re, unike.

Megjithëse gjurmët gjenetike të gishtërinjve janë unike, marrëdhëniet familjare mund të krijohen ende duke bërë disa gjurmë gishtash. E njëjta metodë mund të zbatohet, paksa e modifikuar, për të vendosur lidhjen evolucionare midis organizmave.

Diagnostifikimi mjekësor

PCR bën të mundur përshpejtimin dhe lehtësimin e ndjeshëm të diagnostikimit të sëmundjeve trashëgimore dhe virale. Gjeni me interes përforcohet me PCR duke përdorur primerët e duhur dhe më pas renditet për të identifikuar mutacionet. Infeksionet virale mund të zbulohen menjëherë pas infektimit, javë ose muaj përpara shfaqjes së simptomave.

Mjekësi e personalizuar

Ndonjëherë mjekimet rezultojnë të jenë toksike ose alergjike për disa pacientë. Arsyet për këtë janë pjesërisht për shkak të dallimeve individuale në ndjeshmërinë dhe metabolizmin e barnave dhe derivateve të tyre. Këto dallime përcaktohen në nivelin gjenetik. Për shembull, në një pacient një citokrom i caktuar mund të jetë më aktiv, në një tjetër - më pak. Për të përcaktuar se çfarë lloji të citokromit ka një pacient i caktuar, propozohet të kryhet një analizë PCR përpara përdorimit të ilaçit. Kjo analizë quhet gjenotipizimi paraprak.

Klonimi i gjeneve

Klonimi i gjeneve është procesi i izolimit të gjeneve dhe, si rezultat i manipulimeve të inxhinierisë gjenetike, marrja e një sasie të madhe të produktit të një gjeni të caktuar. PCR përdoret për të amplifikuar një gjen, i cili më pas futet në një vektor - një pjesë e ADN-së që transferon një gjen të huaj në të njëjtin ose në një organizëm tjetër të përshtatshëm për rritje. Për shembull, plazmidet ose ADN-ja virale përdoren si vektorë. Futja e gjeneve në një organizëm të huaj zakonisht përdoret për të prodhuar produktin e atij gjeni - ARN ose, më shpesh, një proteinë. Në këtë mënyrë, shumë proteina fitohen në sasi industriale për t'u përdorur në bujqësia, mjekësi etj.

Sekuenca e ADN-së

Në metodën e renditjes duke përdorur dideoksinukleotide të etiketuara me një etiketë fluoreshente ose izotop radioaktiv, PCR është një pjesë integrale, pasi është gjatë polimerizimit që derivatet e nukleotideve të etiketuara me një etiketë fluoreshente ose radioaktive futen në zinxhirin e ADN-së. Kjo ndalon reaksionin, duke lejuar që pozicionet e nukleotideve specifike të përcaktohen pasi zinxhirët e sintetizuar të ndahen në xhel.

Mutagjeneza

Aktualisht, PCR është bërë metoda kryesore për kryerjen e mutagjenezës. Përdorimi i PCR ka bërë të mundur thjeshtimin dhe përshpejtimin e procedurës së mutagjenezës, si dhe ta bëjë atë më të besueshme dhe të riprodhueshme.

Metoda PCR bëri të mundur analizimin e pranisë së sekuencave të papillomavirusit njerëzor në seksionet e biopsisë së ngulitur në parafinë të tumoreve të qafës së mitrës njerëzore 40 vjet përpara këtij studimi. Për më tepër, duke përdorur PCR, u bë e mundur të amplifikoheshin dhe klonoheshin fragmente të ADN-së mitokondriale nga mbetjet fosile të një truri njerëzor 7 mijë vjeçar!

Duke përdorur lizate të spermatozoideve individuale njerëzore, u demonstrua aftësia për të analizuar njëkohësisht dy lokacione të vendosura në kromozome të ndryshme jo-homologe. Kjo qasje ofron një mundësi unike për analiza të shkëlqyera gjenetike dhe studimin e rikombinimit kromozom, polimorfizmit të ADN-së, etj. Metoda për analizimin e spermës individuale u gjet menjëherë përdorim praktik në mjekësinë ligjore, meqenëse tipizimi HLA i qelizave haploide bën të mundur përcaktimin e atësisë ose identifikimin e kriminelit (kompleksi HLA është një grup gjenesh të kompleksit kryesor të histokompatibilitetit njerëzor; lokuset e kompleksit HLA janë më polimorfikët nga të gjithë të njohurit në vertebrorët më të lartë: brenda një specieje, çdo vend ka një numër të pazakonshëm të madh të aleleve të ndryshme - forma alternative të të njëjtit gjen).

Duke përdorur PCR, është e mundur të përcaktohet integrimi i saktë i strukturave gjenetike të huaja në një rajon të paracaktuar të gjenomit të qelizave që studiohen. ADN-ja totale qelizore kalohet në dy primera oligonukleotide, njëri prej të cilëve është plotësues i një pjese të ADN-së së bujtësit pranë pikës së futjes dhe tjetri me sekuencën e fragmentit të integruar në vargun antiparalel të ADN-së. Reaksioni zinxhir i polimerazës, në rastin e një strukture të pandryshuar të ADN-së kromozomale në vendin e synuar të futjes, çon në formimin e fragmenteve të ADN-së me një fije floku të madhësisë së panjohur, dhe në rastin e një futjeje të planifikuar, fragmente të ADN-së me dy zinxhirë. madhësia e njohur, e përcaktuar nga distanca midis vendeve të pjekjes së dy abetareve. Për më tepër, shkalla e amplifikimit të rajonit të analizuar të gjenomit në rastin e parë do të varet linearisht nga numri i cikleve, dhe në rastin e dytë do të jetë eksponencial. Akumulimi eksponencial i një fragmenti të përforcuar të një madhësie të paracaktuar gjatë PCR na lejon ta vëzhgojmë atë vizualisht pas fraksionimit elektroforetik të përgatitjes së ADN-së dhe të nxjerrim një përfundim të qartë në lidhje me futjen e një sekuence të huaj në një rajon të caktuar të ADN-së kromozomale.

konkluzioni

Metoda PCR aktualisht përdoret më gjerësisht si metodë për diagnostikimin e sëmundjeve të ndryshme infektive. PCR ju lejon të identifikoni etiologjinë e një infeksioni edhe nëse kampioni i marrë për analizë përmban vetëm disa molekula të ADN-së të patogjenit. PCR përdoret gjerësisht në diagnostikimin e hershëm të infeksioneve HIV, hepatitit viral etj. Sot nuk ka pothuajse asnjë agjent infektiv që nuk mund të zbulohet duke përdorur PCR.

Lista e literaturës së përdorur

1.Padutov V.E., Baranov O.Yu., Voropaev E.V. Metodat e analizës gjenetike molekulare. - Mn.: Unipol, 2007. - 176 f.

2.PCR "kohë reale" / Rebrikov D.V., Samatov G.A., Trofimov D.Yu. dhe etj.; e Redaktuar nga d.b. n. D.V. Rebrikova; parathënie L.A. Osterman dhe akademik RAS dhe RAAS E.D. Sverdlov; Botimi i 2-të, rev. dhe shtesë - M.: BINOM. Laboratori i Dijes, 2009. - 223 f.

.Patrushev L.I. Sistemet gjenetike artificiale. - M.: Nauka, 2005. - Në 2 vëll.

.B. Glick, J. Pasternak Bioteknologjia molekulare. Parimet dhe Zbatimet 589 f., 2002

5.Shchelkunov S.N. Inxhinieri gjenetike. - Novosibirsk: Sib. Univ. shtëpia botuese, 2004. - 496 f.

Redaktuar nga A.A. Vorbyeva "Reaksioni zinxhir i polimerazës dhe aplikimi i tij për diagnostikim në dermatovenerologji"; Agjencia e lajmeve mjekësore - 72 faqe

http://ru. wikipedia.org

http://dijetar. google.ru

.

.

Http://www.med2000.ru/n1/n12. htm

12.http://prizvanie. su/ - revistë mjekësore

Tutoring

Keni nevojë për ndihmë për të studiuar një temë?

Specialistët tanë do të këshillojnë ose ofrojnë shërbime tutoriale për temat që ju interesojnë.
Paraqisni aplikacionin tuaj duke treguar temën tani për të mësuar në lidhje me mundësinë e marrjes së një konsultimi.

Për adekuate dhe trajtim efektiv Shumë sëmundje infektive kërkojnë identifikim në kohë diagnozë të saktë. Në zgjidhjen e këtij problemi sot përdoren metoda diagnostikuese të teknologjisë së lartë të bazuara në metodat e biologjisë molekulare. Për momentin, reaksioni zinxhir i polimerazës (PCR) tashmë përdoret mjaft gjerësisht në mjekësinë praktike si mjeti më i besueshëm diagnostikues laboratorik.

Çfarë e shpjegon popullaritetin e PCR aktualisht?

Së pari, kjo metodë përdoret për të identifikuar patogjenët e sëmundjeve të ndryshme infektive me saktësi të lartë.

Së dyti, për të monitoruar efektivitetin e trajtimit.

Në manuale të ndryshme, broshura, artikuj, si dhe shpjegime nga mjekë specialistë, hasim shpeshherë përdorimin e termave dhe fjalëve të pakuptueshme. Është vërtet e vështirë të flasësh për produkte të teknologjisë së lartë të shkencës me fjalë të përditshme.

Cili është thelbi dhe mekanika e diagnostikimit PCR?

Çdo organizëm i gjallë ka gjenet e veta unike. Gjenet janë të vendosura në molekulën e ADN-së, e cila në fakt është "karta e thirrjes" e çdo organizmi individual. ADN-ja (materiali gjenetik) është një molekulë shumë e gjatë që përbëhet nga blloqe ndërtuese të quajtura nukleotide. Për secilin patogjen të sëmundjeve infektive ato janë të vendosura në mënyrë strikte, domethënë në një sekuencë dhe kombinim të caktuar. Kur është e nevojshme të kuptohet nëse një person ka një patogjen të veçantë, merret material biologjik (gjak, urinë, pështymë, njollë), i cili përmban fragmente të ADN-së ose ADN-së të mikrobit. Por sasia e materialit gjenetik të patogjenit është shumë e vogël dhe është e pamundur të thuhet se cilit mikroorganizëm i përket. PCR përdoret për të zgjidhur këtë problem. Thelbi i reaksionit të zinxhirit polimerazë është se merret një sasi e vogël e materialit për hulumtim që përmban ADN, dhe gjatë procesit PCR rritet sasia e materialit gjenetik që i përket një patogjeni specifik dhe, kështu, mund të identifikohet.

Diagnostifikimi i PCR - studimi gjenetik i biomaterialit.

Ideja e metodës PCR i përket shkencëtarit amerikan K. Mullins, të cilën ai e propozoi në 1983. Megjithatë, ajo mori një përdorim të gjerë klinik vetëm në mesin e viteve '90 të shekullit të 20-të.

Le të kuptojmë terminologjinë, çfarë është - ADN, etj. Çdo qelizë e çdo krijese të gjallë (kafshë, bimë, njeri, baktere, virus) ka kromozome. Kromozomet janë ruajtësit e informacionit gjenetik që përmbajnë të gjithë sekuencën e gjeneve të çdo krijese të gjallë specifike.

Çdo kromozom përbëhet nga dy fije ADN-je të përdredhura në një spirale në lidhje me njëra-tjetrën. ADN-ja është kimikisht acid deoksiribonukleik, i cili përbëhet nga përbërës strukturorë - nukleotide. Ekzistojnë 5 lloje të nukleotideve - timina (T), adenozina (A), guanina (G), citozina (C) dhe uracili (U). Nukleotidet janë rregulluar njëra pas tjetrës në një sekuencë të rreptë individuale, duke formuar gjene. Një gjen mund të përbëhet nga 20-200 nukleotide të tilla. Për shembull, gjeni që kodon prodhimin e insulinës përbëhet nga 60 çifte nukleotide.

Nukleotidet kanë vetinë e komplementaritetit. Kjo do të thotë se adenina e kundërt (A) në një zinxhir të ADN-së ka domosdoshmërisht timinë (T) në një zinxhir tjetër, dhe përballë guaninës (G) ka citozinë (C). Skematikisht duket kështu:
G - C
T - A
A - T
Kjo veti e komplementaritetit është kyçe për PCR.

Përveç ADN-së, ARN-ja ka të njëjtën strukturë - acid ribonukleik, i cili ndryshon nga ADN-ja në atë që përdor uracil në vend të timinës. ARN është ruajtësi i informacionit gjenetik në disa viruse të quajtura retroviruse (për shembull, HIV).

Molekulat e ADN-së dhe ARN-së mund të "shumohen" (kjo veti përdoret për PCR). Kjo ndodh si më poshtë: dy fije ADN ose ARN largohen nga njëra-tjetra, dhe një enzimë e veçantë ulet në secilën fije, e cila sintetizon një zinxhir të ri. Sinteza vazhdon sipas parimit të komplementaritetit, domethënë nëse zinxhiri origjinal i ADN-së përmban nukleotid A, atëherë ai i saposintetizuar do të përmbajë T, nëse G, atëherë C, etj. Për të filluar sintezën, kjo enzimë e veçantë "ndërtuese" ka nevojë për një "farë" - një sekuencë prej 5-15 nukleotidesh. Ky “primer” është përcaktuar për çdo gjen (gjeni i klamidias, mikoplazma, viruse) eksperimentalisht.

Pra, çdo cikël PCR përbëhet nga tre faza. Në fazën e parë, ndodh i ashtuquajturi zbërthim i ADN-së - domethënë, ndarja e dy vargjeve të ADN-së të lidhura me njëra-tjetrën. Në të dytën, "fara" është ngjitur në një seksion të vargut të ADN-së. Dhe së fundi, zgjatja e këtyre vargjeve të ADN-së, e cila prodhohet nga një enzimë "ndërtues". Aktualisht e gjithë kjo proces i vështirë zhvillohet në një epruvetë dhe përbëhet nga cikle të përsëritura të shumëzimit të ADN-së së detektueshme për të marrë një numër të madh kopjesh, të cilat më pas mund të zbulohen me metoda konvencionale. Kjo do të thotë, nga një varg i ADN-së marrim qindra ose mijëra.

Fazat e hulumtimit PCR

Mbledhja e materialit biologjik për kërkime

Materiali i ndryshëm biologjik përdoret si mostër: gjaku dhe përbërësit e tij, urina, pështyma, shkarkimi i mukozës, lëngu cerebrospinal, shkarkimi sipërfaqet e plagëve, Përmbajtja e zgavrave të trupit. Të gjitha biosmostrat mblidhen me instrumente të disponueshme dhe materiali i mbledhur vendoset në tuba sterilë plastikë ose vendoset në mjedise kulture, me transportimin e mëvonshëm në laborator.

Reagentët e nevojshëm shtohen në mostrat e mbledhura dhe vendosen në një termostat të programueshëm - një ciklues termik (përforcues). Në amplifikator, cikli i PCR, i përbërë nga tre faza (denaturimi, pjekja dhe shtrirja), përsëritet 30-50 herë. Çfarë do të thotë kjo? Le të hedhim një vështrim më të afërt.

Fazat e reagimit të drejtpërdrejtë të PCR, kopjimi i materialit gjenetik

IFaza e PCR - Përgatitja e materialit gjenetik për kopjim.
Ndodh në një temperaturë prej 95 ° C, ndërsa fijet e ADN-së janë të ndara dhe "farat" mund të zbresin mbi to.

"Farat" prodhohen industrialisht nga shoqata të ndryshme kërkimore dhe prodhuese, dhe laboratorët blejnë ato të gatshme. Në të njëjtën kohë, "abetarja" për identifikimin, për shembull, klamidia, funksionon vetëm për klamidia, etj. Kështu, nëse një biomaterial testohet për praninë e infeksionit klamidial, atëherë një "primer" për klamidia vendoset në përzierjen e reaksionit; nëse biomateriali testohet për virusin Epstein-Barr, atëherë ai është gjithashtu një "farë" për virusin Epstein-Barr.

IIFaza – Kombinimi i materialit gjenetik të agjentit infektiv dhe “farës”.
Nëse ka ADN të një virusi ose bakteri të zbulueshëm, "primeri" qëndron në këtë ADN. Ky proces i shtimit të një "primeri" është faza e dytë e PCR. Kjo fazë zhvillohet në një temperaturë prej 75°C.

IIIstadi - Kopjimi i materialit gjenetik të agjentit infektiv.
Ky është procesi i zgjatjes ose shumëzimit të materialit gjenetik, i cili ndodh në 72°C. Enzima "ndërtues" i afrohet "farave" dhe sintetizon një zinxhir të ri të ADN-së. Me përfundimin e sintezës së një zinxhiri të ri të ADN-së, cikli i PCR përfundon. Domethënë, në një cikël PCR sasia e materialit gjenetik dyfishohet. Për shembull, kampioni fillestar përmbante 100 molekula ADN-je të një virusi; pas ciklit të parë PCR, kampioni do të përmbajë tashmë 200 molekula ADN-je të virusit që testohet. Një cikël zgjat 2-3 minuta.

Për të gjeneruar një sasi të mjaftueshme të materialit gjenetik për identifikim, zakonisht kryhen 30-50 cikle PCR, që zgjasin 2-3 orë.

Faza e identifikimit të materialit gjenetik të shumuar

Në fakt, PCR përfundon këtu dhe më pas vjen faza jo më pak e rëndësishme e identifikimit. Për identifikim, përdoret metoda e elektroforezës ose etiketuar "fara". Kur përdorni elektroforezë, fijet e ADN-së që rezultojnë ndahen sipas madhësisë, dhe prania e fragmenteve të ADN-së me gjatësi të ndryshme tregon një rezultat pozitiv të testit (d.m.th., prania e një virusi të veçantë, bakteri, etj.). Kur përdorni "fara" të etiketuara, produktit përfundimtar të reagimit i shtohet një kromogen (ngjyrë), si rezultat i të cilit reaksioni enzimatik shoqërohet me formimin e ngjyrës. Zhvillimi i ngjyrës tregon drejtpërdrejt se një virus ose agjent tjetër i zbulueshëm është i pranishëm në kampionin origjinal.

Sot, duke përdorur "fara" të etiketuara, si dhe softuer të përshtatshëm, është e mundur që menjëherë të "lexohen" rezultatet e PCR. Kjo është e ashtuquajtura PCR në kohë reale.

Pse është kaq i vlefshëm diagnostikimi PCR?

Një nga avantazhet e rëndësishme të metodës PCR është ndjeshmëria e saj e lartë - nga 95 në 100%. Megjithatë, këto përfitime duhet të bazohen në respektimin e rreptë të kushteve të mëposhtme:

1. grumbullimi dhe transportimi korrekt i materialit biologjik;
2. disponueshmëria e instrumenteve sterile, të disponueshme, laboratorëve specialë dhe personelit të trajnuar;
3. respektimi i rreptë i metodologjisë dhe steriliteti gjatë analizës

Ndjeshmëria ndryshon midis mikrobeve të ndryshme të zbuluara. Për shembull, ndjeshmëria e metodës PCR për zbulimin e virusit të hepatitit C është 97-98%, ndjeshmëria për zbulimin e ureaplazmës është 99-100%.

Aftësitë e natyrshme në analizën PCR lejojnë specifikë analitike të pakrahasueshme. Kjo do të thotë të identifikohet saktësisht mikroorganizmi që është kërkuar, dhe jo një i ngjashëm ose i lidhur ngushtë.
Ndjeshmëria diagnostike dhe specifikat e metodës PCR janë shpesh më të larta se ato të metodës së kulturës, e quajtur "standardi i artë" për zbulimin e sëmundjeve infektive. Duke marrë parasysh kohëzgjatjen e kultivimit të kulturës (nga disa ditë në disa javë), avantazhi i metodës PCR bëhet i dukshëm.

PCR në diagnostikimin e infeksioneve
Përparësitë e metodës PCR (ndjeshmëria dhe specifika) përcaktojnë një gamë të gjerë aplikimesh në mjekësinë moderne.
Fushat kryesore të aplikimit të diagnostikimit PCR:

1. diagnoza e sëmundjeve infektive akute dhe kronike të lokalizimeve të ndryshme
2. monitorimi i efektivitetit të terapisë
3. sqarimi i llojit të patogjenit

PCR përdoret në obstetrikë, gjinekologji, neonatologji, pediatri, urologji, venerologji, nefrologji, klinikën e sëmundjeve infektive, oftalmologji, neurologji, phthisiopulmologji, etj.

Përdorimi i diagnostikimit PCR kryhet në lidhje me metoda të tjera kërkimore (ELISA, PIF, RIF, etj.). Kombinimi dhe përshtatshmëria e tyre përcaktohen nga mjeku që merr pjesë.

Agjentët infektivë të zbuluar me PCR

Viruset:

1. retroviruset HIV-1 dhe HIV-2
2. viruset herpetiforme
3. virus herpes simplex Llojet 1 dhe 2

Kohët e fundit, një i besueshëm, shumë i ndjeshëm dhe metodë e shpejtë diagnostikimi i sëmundjeve të ndryshme infektive të njeriut. Kjo metodë quhet "PCR analizë". Çfarë është, cili është thelbi i tij, cilat mikroorganizma mund të identifikojë dhe si ta marrim saktë, ne do t'ju tregojmë në artikullin tonë.

Historia e zbulimit

Metodat PCR përdoren gjithashtu në diagnostikimin e kancerit.

Përparësitë e metodës

Diagnostifikimi PCR ka një sërë përparësish:

1. Ndjeshmëri e lartë. Edhe nëse janë të pranishme vetëm disa molekula të ADN-së së mikroorganizmave, analiza PCR përcakton praninë e infeksionit. Metoda do të ndihmojë me sëmundjet kronike dhe latente. Shpesh në raste të tilla mikroorganizmi nuk është ndryshe i kultivueshëm.
2. Çdo material është i përshtatshëm për kërkime, për shembull pështymë, gjak, sekrecione gjenitale, qime, qeliza epiteliale. Më i zakonshmi është testi PCR i gjakut dhe njollave urogjenitale.

   

3. Nuk kërkohet kultivim afatgjatë i kulturave. Procesi i automatizuar i diagnostikimit ju lejon të merrni rezultatet e hulumtimit pas 4-5 orësh.
4. Metoda është pothuajse njëqind për qind e besueshme. Janë regjistruar vetëm raste të izoluara të rezultateve të rreme negative.
5. Aftësia për të identifikuar disa lloje të patogjenëve nga një mostër e materialit. Kjo jo vetëm që përshpejton procesin e diagnostikimit të sëmundjes, por gjithashtu redukton ndjeshëm kostot materiale. Shpesh, mjeku përshkruan një test kompleks PCR. Kostoja e një ekzaminimi që përbëhet nga identifikimi i gjashtë patogjenëve është rreth 1500 rubla.

Në mënyrë që rezultatet të jenë të besueshme gjatë kryerjes së një studimi PCR, duhet të bëni testin, duke ndjekur rekomandimet për përgatitjen paraprake për diagnozën:

1. Para se të dhuroni pështymë, duhet të përmbaheni nga ngrënia dhe marrja e medikamenteve 4 orë para mbledhjes së materialit. Menjëherë para procedurës, shpëlajeni gojën me ujë të zier.
2. Rregullat e mësipërme duhet të ndiqen edhe gjatë marrjes së mostrës nga sipërfaqja e brendshme e faqes. Pas shpëlarjes rekomandohet të bëni një masazh të lehtë të lëkurës për të çliruar sekrecionin e gjëndrës.
3. Urina zakonisht mblidhet në shtëpi. Për ta bërë këtë, ju duhet të pastroni plotësisht organet gjenitale. 50-60 ml urinë duhet të mblidhen në një enë plastike sterile. Për të siguruar pastërtinë e materialit, rekomandohet që femrat të fusin një tampon në vaginë dhe meshkujt të tërheqin palosjen e lëkurës sa më shumë që të jetë e mundur. Ju nuk mund të dhuroni materiale gjatë periudhës tuaj menstruale.
4. Për të dhuruar spermë, duhet të abstenoni nga marrëdhëniet seksuale për 3 ditë përpara se të merrni materialin. Mjekët këshillojnë gjithashtu shmangien e vizitave në sauna dhe bërjen e banjës së nxehtë, pirjen e alkoolit dhe ushqimeve pikante. Ju duhet të përmbaheni nga urinimi 3 orë para testit.
5. Për shembull, nëse kryhet një test PCR për klamidia, si për gratë ashtu edhe për burrat rekomandohet që të kenë pushim seksual për 3 ditë. 2 javë para testit nuk duhet të merrni barna antibakteriale. Për një javë, duhet të ndaloni së përdoruri xhel, pomada, supozitorë vaginalë dhe dush. 3 orë para testit duhet të përmbaheni nga urinimi. Gjatë menstruacioneve, materiali nuk mblidhet; vetëm 3 ditë pas ndërprerjes së gjakderdhjes, mund të merret një njollë urogjenitale.

PCR gjatë shtatzënisë

Gjatë pritjes për një fëmijë, shumë sëmundje infektive seksualisht të transmetueshme janë jashtëzakonisht të rrezikshme zhvillim normal fetusit SST-të mund të shkaktojnë vonesë të rritjes intrauterine, abort ose lindje të parakohshme dhe defekte kongjenitale të fëmijës. Prandaj, është jashtëzakonisht e rëndësishme të shkoni në fazat e hershme ekzaminimi i shtatzënisë duke përdorur metodën PCR. Testi duhet të bëhet pas regjistrimit - deri në 12 javë.



Materiali mblidhet nga kanali i qafës së mitrës duke përdorur një furçë të veçantë. Procedura është pa dhimbje dhe nuk përbën rrezik për fëmijën. Në mënyrë tipike, gjatë shtatzënisë, bëhet një analizë për klamidia duke përdorur metodën PCR, si dhe për ureaplasmosis, mykoplazmozë, citomegalovirus, herpes dhe papillomavirus. Ky grup ekzaminimesh quhet PCR-6.

PCR për diagnozën e HIV

Për shkak të faktit se metoda është shumë e ndjeshme ndaj ndryshimeve në trup dhe kushteve diagnostike, shumë faktorë mund të ndikojnë në rezultatin. Prandaj, analiza PCR për infeksionin HIV nuk është një metodë e besueshme; efektiviteti i saj është 96-98%. Në 2-4% të rasteve të mbetura, testi jep rezultate false pozitive.

Por në disa situata, nuk mund të bëni pa diagnostikimin PCR të HIV. Zakonisht kryhet te personat me rezultat fals negativ ELISA. Tregues të tillë tregojnë se një person nuk ka zhvilluar ende antitrupa ndaj virusit dhe ato nuk mund të zbulohen pa një rritje të shumëfishtë të numrit. Kjo është pikërisht ajo që mund të arrihet duke kryer një test gjaku duke përdorur metodën PCR.

Një diagnozë e tillë është e nevojshme edhe për fëmijët në vitin e parë të jetës të lindur nga një nënë HIV-pozitive. Metoda është e vetmja mënyrë përcaktimi i besueshëm i statusit të fëmijës.

PCR për diagnostikimin e hepatitit

Metoda e reaksionit të zinxhirit polimerazë ju lejon të zbuloni ADN-në e virusit të hepatitit A, B, C shumë kohë përpara formimit të antitrupave ndaj infeksionit ose shfaqjes së simptomave të sëmundjes. Testi PCR për hepatitin C është veçanërisht efektiv, pasi në 85% të rasteve kjo sëmundje është asimptomatike dhe pa trajtim në kohë bëhet kronike.



Zbulimi në kohë i patogjenit do të ndihmojë në shmangien e komplikimeve dhe trajtimin afatgjatë.

Ekzaminimi gjithëpërfshirës PCR

Analizë gjithëpërfshirëse PCR: ekzaminimi duke përdorur metodën e reaksionit zinxhir polimezik, i cili përfshin përcaktimin e njëkohshëm të disa llojeve të infeksioneve: mycoplasma genitalium, mycoplasma hominis, Gardnerella vaginalis, candida, trichomonas, citomegalovirus, herpes tipet 1 dhe 2, papivirusi, gonorrea. Çmimi i një diagnoze të tillë varion nga 2000 në 3500 rubla. në varësi të klinikës, materialeve dhe pajisjeve të përdorura, si dhe llojit të analizës: cilësore ose sasiore. Mjeku do të vendosë se cili është i nevojshëm në rastin tuaj. Në disa raste, mjafton thjesht të përcaktohet prania e patogjenit; në të tjera, për shembull, me infeksionin HIV, një titër sasior luan një rol të rëndësishëm. Kur diagnostikoni të gjithë patogjenët e mësipërm, ekzaminimi quhet "analizë PCR-12".

Dekodimi i rezultateve të analizës

Deshifrimi i analizës PCR nuk është i vështirë. Ka vetëm 2 shkallë tregues - " rezultat pozitiv" dhe "rezultat negativ". Nëse zbulohet një patogjen, mjekët mund të konfirmojnë praninë e sëmundjes me 99% besim dhe të fillojnë trajtimin e pacientit. Me metodën sasiore të përcaktimit të infeksionit, treguesi numerik i baktereve të zbuluara do të tregohet në kolonën përkatëse. Vetëm një mjek mund të përcaktojë shkallën e sëmundjes dhe të përshkruajë trajtimin e nevojshëm.



Në disa raste, për shembull, gjatë përcaktimit të infeksionit HIV duke përdorur metodën PCR, nëse rezultati është negativ, bëhet e nevojshme të kryhen ekzaminime shtesë për të konfirmuar treguesit e marrë.

Ku mund të testohem?

Ku të bëni një test PCR: në një klinikë publike apo në një laborator privat? Fatkeqësisht, në institucionet mjekësore komunale, pajisjet dhe metodat shpesh janë të vjetruara. Prandaj, është më mirë t'i jepet përparësi laboratorëve privatë me pajisje moderne dhe personel shumë të kualifikuar. Përveç kësaj, në një klinikë private do të merrni rezultate shumë më shpejt.

Në Moskë, shumë laboratorë privatë ofrojnë teste PCR për infeksione të ndryshme. Për shembull, në klinika të tilla si "Vita", "Klinika Kompleks", "Familje e lumtur", "Uro-Pro", kryhet analiza PCR. Çmimi i ekzaminimit është nga 200 rubla. për identifikimin e një patogjeni.

Mund të konkludohet se diagnoza e sëmundjeve infektive duke përdorur metodën PCR në shumicën e rasteve është një mënyrë e shpejtë dhe e besueshme për të zbuluar patogjenin në trup në fazat e hershme të infeksionit. Por megjithatë, në raste të caktuara ia vlen të zgjidhni metoda të tjera diagnostikuese. Vetëm një specialist mund të përcaktojë nevojën për një studim të tillë. Deshifrimi i analizës PCR kërkon gjithashtu një qasje profesionale. Ndiqni rekomandimet e mjekut tuaj dhe mos bëni vetë analiza të panevojshme.