Reaksioni i fiksimit të komplementit(RSC) është një reaksion serologjik kompleks me dy faza. Ai përdor pesë përbërës që përbëjnë dy sisteme: antigjen, antitrup, komplement (sistemi i parë); eritrocitet e deleve, të sensibilizuara (të trajtuara) me serum hemolitik që përmban antitrupa specifikë për to (sistemi i dytë, ose treguesi i hemit). Në këtë rast, ndërveprimi i antitrupit me antigjenin në fazën e parë të reagimit çon në formimin e një kompleksi imunitar që thith komplementin, por kjo nuk mund të zbulohet vizualisht. Në fazën e dytë, sistemi heme përdoret si një tregues i fiksimit të komplementit në kompleksin antigjen-antitrup, i cili, duke qenë një kompleks imunitar, është gjithashtu i aftë ta përthithë atë. Në fund të fundit, ka dy rezultate të mundshme të reagimit. Nëse antitrupi dhe antigjeni korrespondojnë me njëri-tjetrin dhe komplementi absorbohet nga kompleksi që rezulton, liza e eritrociteve të sistemit heme nuk do të ndodhë. Nëse antitrupi nuk përputhet me antigjenin, dhe anasjelltas, komplementi, duke mbetur i lirë, do të bashkohet me sistemin e hemit dhe do të shkaktojë hemolizë.

Ashtu si testet e tjera serologjike, RSA mund të përdoret për të zbuluar antitrupa specifikë nga një antigjen i njohur ose për të zbuluar një antigjen nga antitrupa të njohur.

karakteristikat e përgjithshme Përbërësit RSK.

1. Përpara kryerjes së reaksionit, SERUM-i që testohet nxehet në një banjë uji për 30 minuta për të çaktivizuar komplementin e tij dhe hollohet duke filluar nga 1:5.

2. ANTIGJENI mund të jenë kulturat bakteriale, lizatet e tyre, viruset dhe materialet që përmbajnë viruse, ekstraktet e organeve të ndryshuara patologjikisht dhe lipidet e indeve.

3. KOMPLEMENT – serum i derrit gini i marrë në ditën e eksperimentit. Aktualisht, përdoret komplementi i thatë industrial.

4. SISTEMI HEMOLITIK përbëhet nga serumi hemolitik dhe 3% suspension i rruazave të kuqe të gjakut të deleve të përziera në vëllime të barabarta. Për të sensibilizuar eritrocitet me hemolizinat, përzierja mbahet në një termostat në temperaturën 37°C për 30 minuta.

Vendosja e eksperimentit kryesor të RSC. SERUM, ANTIGJEN DHE KOMPLEMENT shtohen në 1 tub, serumi, komplementi dhe në vend të antigjenit një solucion izotonik i klorurit të natriumit (SERUM CONTROL) i shtohet tubit të dytë, antigjenit, komplementit dhe e njëjta tretësirë ​​e klorurit të natriumit i shtohet tubit të tretë. KONTROLLI I ANTIGJENIT). Provëzat vendosen në një termostat në temperaturën 37°C për 1 orë. Në të njëjtën kohë, përgatitet një sistem hemolitik, i cili më pas shtohet në të tre tubat pas heqjes së raftit nga termostati. Pasi të keni përzier sistemin e gurëve të çmuar me përbërësit e tre epruvetave, këto të fundit vendosen përsëri në një termostat për 1 orë dhe pas kësaj kohe merren parasysh rezultatet e RSK.

Kur merret parasysh RSC, intensiteti i reagimit tregohet nga pluset: "++++" - ashpër reagim pozitiv me vonesë të plotë të hemolizës, lëngu në epruvetën është i pangjyrë, të gjitha qelizat e kuqe të gjakut janë vendosur në fund; "+++", "++" - reagim pozitiv, i karakterizuar nga një rritje në ngjyrën e lëngut për shkak të hemolizës dhe një rënie në numrin e qelizave të kuqe të gjakut në sediment; "+" - reagim i dobët pozitiv, lëngu është me ngjyrë intensive, ka një sasi të vogël të qelizave të kuqe të gjakut në fund të tubit. Reagim negativ tregohet me shenjën “–”, në këtë rast vërehet hemolizë e plotë, lëngu në epruvetë ka ngjyrë rozë intensive (“gjak llak”).

RSC është një reagim specifik shumë kompleks, por shumë i ndjeshëm. Përdoret gjerësisht në diagnostikimin e sifilizit, formë kronike gonorreja, kolla e mirë, aktinomikoza, të gjitha rikeciozat dhe infeksionet virale.

Analiza imunosorbente e lidhur.

Metoda u zhvillua në fillim të viteve 70 në mënyrë të pavarur nga njëri-tjetri nga tre grupe shkencëtarësh. Metoda i ngjan RIA-s, por bazohet në etiketimin e Ag ose Ab që hyn në reaksion me një enzimë. Lëvizja e etiketës me nënshtresën zakonisht shoqërohet me një ndryshim në ngjyrën e mediumit. Aktualisht, janë krijuar modifikime të shumta të kësaj metode, por më e përdorura është ELISA heterogjene me fazë të ngurtë (solid-phase). Atje jane:

1) ELISA FAZË E NGURTË DIREKTE. Në këtë rast:

1. serumi me Ab inkubohet me Ag të fiksuar në një substrat të fortë (më së shpeshti është mikropllakë plastike).

2. Abs që nuk kanë lidhur Ag hiqen me larje të përsëritur.

3. Serumi i etiketuar me enzimë shtohet në Abs që kanë lidhur Ag.

4. Përcaktoni numrin e enzimave shënuese të lidhura me At.

2) ELISA KONKURUESE ME FAZË TË NGURTË.

1. Shtoni hirrë. Nëse përmban Abs specifike, atëherë ato lidhen me Ags të fiksuar në një nënshtresë të fortë. Nëse nuk ka abs specifikë, atëherë Ag shfaqet i palidhur.

2. Kur shtoni Antitrupa specifikë për një Ag fiks, në rastin e parë ata nuk do të kenë asgjë për të bashkëvepruar (shumica e Ags janë tashmë të lidhur) Þ përmbajtja e markerit është e ulët. Në rastin e dytë, Abs specifike do të lidhen me Ag dhe gjatë larjes nuk do të lahen Þ përmbajtje e lartë e markerëve.

Ngjashëm me m.b. ANTITRUPAT janë fiksuar dhe kompani të ndryshme prodhojnë tableta me antitrupa tashmë të fiksuar.

Krahasuar me metodat klasike duke zbuluar Ag, kjo metodë ju lejon të regjistroni drejtpërdrejt ndërveprimin e tyre me Ab, dhe jo manifestimet dytësore (aglutinimi, reshjet ose hemoliza). Metoda është shumë e ndjeshme (mjafton një përqendrim prej 1ng/ml).

Përcaktoni: klamidia, klostridia, HIV, etj.

8. Reaksioni i fagocitozës.

Fagocitoza kryhet nga mikrofagët dhe makrofagët. Fazat e fagocitozës: afrimi, ngjitja, zhytja, tretja.

Vlerësimi i aktivitetit funksional të qelizave fagocitare.

sasi Aktiviteti fagocitar i granulociteve dhe monociteve vlerësohet në gjakun e plotë, në një suspension leukocitor ose në fraksione të pasuruara të qelizave fagocitare. Grimcat monodisperse të lateksit me një diametër prej 1.0-2.0 mikron, një pezullim i baktereve të vrarë nga nxehtësia ose kërpudhave të ngjashme me maja përdoren si objekte standarde të fagocitozës.

Fagocitet përzihen me materialin e fagocituar në një raport 1:10 ose 1:100 dhe inkubohen në 37°C për 30 minuta me përzierje të vazhdueshme. Tubat më pas centrifugohen dhe sedimenti risuspendohet në një pikë serum gjaku për të përgatitur një njollë. Në njollat ​​e fiksuara me njollë May-Chrunwald dhe të ngjyrosura sipas Romanovsky-Giemsa, llogaritet përqindja e qelizave fagocitare (FP - tregues fagocitar) dhe numri i grimcave të absorbuara për 1 qelizë (PF - numri fagocitar).

U person i shëndetshëm FP=40-80%, FP=1-5.

9. Diagnostikimet.

Diagnosticum janë një pezullim i qelizave të caktuara mikrobike të vrarë nga nxehtësia ose formalina me një përmbajtje të njohur të qelizave për njësi vëllimi. Pezullimet e baktereve të gjalla mund të përdoren gjithashtu si antigjen. Fenomeni i reagimit shfaqet paraprak pas dy orësh (në 37 0 C), rezultati përfundimtar merret parasysh në temperaturën e dhomës pas 18-20 orësh. Për diagnozë, një reagim pozitiv është me interes vetëm në një titër të caktuar të serumit, i cili shërben si diagnostikues. Kështu, për brucelozën titri diagnostik është 1:200, dhe për tula-reminë -1:100. Për të zbuluar antitrupat, mund të kryeni teste të aglutinimit të shprehur (koha e llogaritjes është disa minuta). Për shembull: 1. Reaksioni i gjakut me pika në tularemi. Një pikë ujë të distiluar (për hemolizë) dhe një pikë tularemia diagnosticum aplikohen në një pikë gjaku të plotë të pacientit në një gotë të veçantë. Reagimi ndodh brenda 1-2 minutash, aglutinatet janë qartë të dukshme në formën e gungave të bardha. 2. Në xhami për brucelozë kryhet një reaksion aglutinimi ekspres Heddelson.

Këto reaksione nuk lejojnë përcaktimin e sasisë së antitrupave në serum.b) për të identifikuar një kulturë të pastër të patogjenëve të sëmundjeve infektive. Për këtë qëllim, përdoren teste diagnostike imune.

serumet aglutinuese të prodhuara nga institutet e vaksinave dhe serumit duke imunizuar kafshët me qeliza të plota mikrobike. Për të siguruar origjinalitetin e serumit, është më mirë të përdorni ato të absorbuara në mënyrë që të përmbajnë vetëm antitrupa që korrespondojnë me një specie ose lloj mikroorganizmi specifik.

Parimet e marrjes së serumeve imune.

Serumi imunitar (antiserumi) është serumi i gjakut që përmban antitrupa ndaj një antigjeni të caktuar. Në shumicën e rasteve, serumet imune (diagnostike) ndaj antigjeneve mikrobiale, indore dhe të tjera merren në mënyrë eksperimentale duke imunizuar kafshët me antigjenet përkatëse.

Ndër kërkesat kryesore për antiserumet janë specifika e tyre e lartë dhe përmbajtja e mjaftueshme e antitrupave. Në bazë të specifikës, antiserët dallohen midis antiserave polivalente (polispecifike) dhe njëvalente (monospecifike). Serumet polivalente përmbajnë antitrupa ndaj shumë antigjeneve, monospecifik - ndaj një antigjeni specifik. Ju mund të merrni serume monospecifike:

1) përdorimi i antigjeneve shumë të pastruar për imunizimin e kafshëve,

2) pastrimi i serumeve vendase nga antitrupat me specifikë të padëshiruar.

Për këtë përdorim:

1) metodë e imunoafinitetit, e cila bazohet në lidhjen e antitrupave me një specifikë të caktuar nga antigjenet përkatëse të imobilizuara në një bartës të fazës së ngurtë, e ndjekur nga ndarja e komplekseve antigjen-AB që rezultojnë dhe izolimi i antitrupave;

2) Metoda e adsorbimit Castellani. Për këtë qëllim, mikroorganizmat, të cilët përfshijnë të gjitha antigjenet e grupit, duke thithur kështu homologë anti-

Trupat. Antisera të tillë monospecifik të adsorbuar përmbajnë antitrupa ndaj përcaktuesve të ndryshëm të molekulës së antigjenit, të cilët janë heterogjenë sipas klasës (nënklasës).

Reaksioni i fiksimit të komplementit (CFR) është se kur antigjenet dhe antitrupat korrespondojnë me njëri-tjetrin, ato formojnë një kompleks imunitar me të cilin komplementi (C) është ngjitur përmes fragmentit Fc të antitrupave, d.m.th., komplementi është i lidhur nga kompleksi antigjen-antitrup. Nëse kompleksi antigjen-antitrup nuk formohet, atëherë komplementi mbetet i lirë.

Ndërveprimi specifik i AG dhe AT shoqërohet nga adsorbimi (lidhja) e komplementit. Duke qenë se procesi i fiksimit të komplementit nuk është vizualisht i dukshëm, J. Bordet dhe O. Zhangu propozuan përdorimin e sistemit hemolitik (qelizat e kuqe të gjakut të deleve + serum hemolitik) si tregues, i cili tregon nëse komplementi fiksohet nga kompleksi AG-AT. Nëse AG dhe AT korrespondojnë me njëra-tjetrën, d.m.th. është formuar një kompleks imunitar, atëherë komplementi është i lidhur nga ky kompleks dhe hemoliza nuk ndodh. Nëse AT nuk korrespondon me AG, atëherë kompleksi nuk formohet dhe komplementi, duke mbetur i lirë, kombinohet me sistemin e dytë dhe shkakton hemolizë.

Përparimi i reagimit

Reagimi ndodh në dy faza që përfshijnë dy sisteme; bakteriale dhe hemolitike. Reagimi i parë (specifik) përfshin antigjenin 4-+ antitrupa + komplement. Një rezultat pozitiv i reagimit, i cili ndodh kur antitrupat përputhen me një antigjen, karakterizohet nga formimi i një kompleksi specifik bakterial antigjen-antitrup me komplement të adsorbuar ose, siç thonë ata, "të lidhur". Duke mbetur i padukshëm, kompleksi nuk shkakton asnjë ndryshimet e jashtme mjedisi në të cilin është formuar. Një rezultat negativ i RSC ndodh në mungesë të afinitetit specifik midis antigjenit dhe antitrupit të serumit dhe karakterizohet nga ruajtja e komplementit aktiv të lirë. Faza e parë e RSC mund të kryhet në një termostat në 37°C (1-2 orë) ose në një frigorifer në 3-4°C (18-20 orë). Me formimin e zgjatur të kompleksit imunitar antigjen-antitrup në të ftohtë, ndodh lidhja më e plotë e komplementit dhe, si rezultat, rritet ndjeshmëria e reaksionit. Gjatë kryerjes së eksperimenteve krahasuese, imunologu sovjetik Akademik. V.I. Ioffe dhe studentët e tij treguan se në kushtet e fiksimit të zgjatur të komplementit në të ftohtë, është e mundur të kapni sasi 100-500 herë më të vogla të antigjenit dhe të merrni rezultate pozitive me hollime më të mëdha të serumit imunitar sesa në eksperimentin e fiksimit të komplementit në një temperaturë prej 37 ° C në për 1-2 orë. Faza e dytë e reaksionit (indikative) ndodh midis reagentëve të sistemit hemolitik (një përzierje prej 3% suspension i eritrociteve dhe serumit hemolitik në vëllime të barabarta) në një temperaturë prej 37 ° C. vetëm në prani të komplementit që mbetet i lirë nga faza e parë e reaksionit (reaksioni negativ). Në mungesë të komplementit aktiv të lirë, hemoliza e qelizave të kuqe të gjakut nën ndikimin e hemolizinave specifike nuk ndodh (reagimi është pozitiv).

Komponentët

Reaksioni i fiksimit të komplementit (CFR) është një reaksion kompleks serologjik. Për realizimin e tij nevojiten 5 përbërës, konkretisht: AG, AT dhe komplement (sistemi i parë), eritrocitet e deleve dhe serumi hemolitik (sistemi i dytë).

Antigjeni për CSC mund të jenë kultura të mikroorganizmave të ndryshëm të vrarë, lizatet e tyre, përbërësit e baktereve, organet e ndryshuara patologjikisht dhe ato normale, lipidet e indeve, viruset dhe materialet që përmbajnë viruse.

Hirra e freskët ose e thatë përdoret si plotësues derr gini.

Mekanizmi i reagimit

RSK kryhet në dy faza: faza e parë - inkubimi i një përzierjeje që përmban tre përbërës antigjen + antitrup + komplement; Faza e dytë (treguesi) - zbulimi i komplementit të lirë në përzierje duke shtuar në të një sistem hemolitik të përbërë nga eritrocite dele dhe serum hemolitik që përmban antitrupa ndaj tyre. Në fazën e parë të reaksionit, kur formohet kompleksi antigjen-antitrup, komplementi lidhet dhe më pas në fazën e dytë nuk do të ndodhë hemoliza e eritrociteve të sensibilizuara nga antitrupat; reagimi është pozitiv. Nëse antigjeni dhe antitrupi nuk përputhen me njëri-tjetrin (nuk ka antigjen ose antitrup në kampionin e provës), komplementi mbetet i lirë dhe në fazën e 2-të do të bashkohet me kompleksin eritrocit - antitrupave anti-eritrocitare, duke shkaktuar hemolizë; reagimi është negativ.

Aplikacion

Reaksioni i fiksimit të komplementit mund të përdoret për:
1) identifikimi i antitrupave specifikë në serumin e panjohur bazuar në ndërveprimin e tyre me një antigjen të natyrës së njohur;
2) studimi i vetive të antigjenit në reagim me një serum specifik të njohur. Përgatitja e përbërësve për vendosjen e RSC.

1. Serumi i gjakut i marrë për kërkime, në prag të reaksionit, nxehet në një banjë uji në 56°C për 30 minuta për të çaktivizuar komplementin e vet. Serumi i inaktivuar mund të ruhet në 3-4°C për 5-6 ditë. Në ditën e eksperimentit, serumi hollohet me tretësirë ​​izotonike të klorurit të natriumit në një raport 1:5 (0,1 ml serum testues + 0,4 ml tretësirë ​​izotonike klorur natriumi).

2. Antigjeni për prodhimin e CSC mund të jenë kultura të mikrobeve të ndryshme, proteina bakteriale dhe ekstrakte të marra nga kultura mikrobike, organe dhe inde të ndryshuara patologjikisht dhe normale. Karakteristikat e përgatitjes së antigjenit përcaktohen nga natyra proces infektiv dhe karakteristikat e patogjenit të tij.

3. Komplementi është një përzierje serumesh të përftuara nga 3-5 derra gini të shëndetshëm, ose komplement i thatë në ampula.

Menjëherë para përdorimit, serumi i derrit të gini hollohet me një solucion izotonik të klorurit të natriumit në një raport 1:10 për të marrë një tretësirë ​​rezervë.

4. Para kryerjes së eksperimentit, serumi hemolitik çaktivizohet duke u ngrohur në temperaturën 56 °C për 30 minuta. Për të kryer eksperimentin kryesor të RSC, si dhe për të titruar komplementin dhe antigjenin, përdoret serumi hemolitik me titër të trefishtë. Për shembull, nëse titri i serumit hemolitik është 1: 1800, në reaksion përdoret një hollim i serumit prej 1: 600.

5. Eritrocitet merren nga gjaku i defibrinuar i deleve. Për të hequr filmat e fibrinës, gjaku filtrohet përmes një filtri garzë me tre shtresa. Filtrati që rezulton centrifugohet, serumi thithet dhe kullohet, dhe eritrocitet lahen me centrifugim 3-4 herë me një tretësirë ​​izotonike të klorurit të natriumit. Kur qelizat e kuqe të gjakut lahen për herë të fundit, shtresa supernatante e lëngut duhet të jetë plotësisht transparente. Një suspension 3% përgatitet nga qelizat e kuqe të lara të gjakut në një zgjidhje izotonike të klorurit të natriumit. Pasi të keni përgatitur përbërësit e përfshirë në RSC në mënyrën e mësipërme, vazhdoni me titrimin e serumit hemolitik, komplementit dhe antigjenit.



Reagimi i hemolizës.

Reagimi i hemolizës (HR) - Ky është shkatërrimi i qelizave të kuqe të gjakut nga veprimi i antitrupave me pjesëmarrjen e komplementit.

Komponentët RG.

1. Antigjeni- 3% suspension i rruazave të kuqe të gjakut në tretësirë ​​izotonike të klorurit të natriumit;

2. Antitrupat - serum hemolitik- serum që përmban antitrupa ndaj qelizave të kuqe të gjakut (hemolizina); serumi merret duke imunizuar lepujt me eritrocite dele;

3. Komplement– një sistem proteinash gjaku që absorbohen në kompleksin antigjen-antitrup dhe formojnë një kompleks sulmi membranor që shkatërron antigjenin, d.m.th. shkatërron qelizat e kuqe të gjakut ose, me fjalë të tjera, shkakton lizën e qelizave të kuqe të gjakut ( hemoliza). I sapo pergatitur Serum gjaku i derrit të Guinesë.

Nëse qelizat e kuqe të gjakut, serumi hemolitik dhe komplementi vendosen në një epruvetë në sasi të caktuara, atëherë brenda pak minutash do të ndodhë shkatërrimi (hemoliza) e rruazave të kuqe të gjakut, si rezultat i së cilës përzierja nga e kuqe e errët do të marrë ngjyrë rozë. ("gjaku i llakut").

Reaksioni i hemolizës përdoret si tregues gjatë kryerjes së reaksionit të fiksimit të komplementit.

Reaksioni i fiksimit të komplementit (CFR) është një reaksion kompleks serologjik që përfshin 2 sisteme antigjen-antitrup dhe komplement. sistemi i parë - specifike, 2 - hemolitik sistemi.

Ky reagim u zhvillua nga J. Bordet dhe O. Zhangou, të cilët vërtetuan se gjatë formimit të një kompleksi antigjen-antitrup, komplementi lidhet me këtë kompleks. Efekt i dukshëm ku jo të dukshme, pra, për të zbuluar lidhjen e komplementit (dhe, rrjedhimisht, për të zbuluar formimin e një kompleksi antigjen-antitrup kur ato korrespondojnë me njëri-tjetrin), d.m.th. si tregues Përdoret metoda e dytë - sistemi hemolitik.

RSC përdoret më shpesh për serodiagnozën (zbulimi i antitrupave ndaj patogjenit në serumin e gjakut të pacientit ) gonorreja, sifilizi, kolla e mirë, tifoja dhe riketiozat e tjera dhe shumë sëmundje virale. RSC përdoret gjithashtu për seroidentifikim.

Komponentët RSK.

1. Antigjen– ekstrakte mikrobike, haptenet, më rrallë – një pezullim i mikrobeve, d.m.th. antigjeni mund të jetë ose korpuskular (i pazgjidhshëm) ose molekular (i tretshëm).

2 . Antitrupat– serum gjaku i një personi të sëmurë (për serodiagnozë) ose serum imun diagnostikues që përmban antitrupa të njohur (për seroidentifikim).

3. Qelizat e kuqe të gjakut të deleve – antigjenet reaksion hemolitik.

4. Serum hemolitik- serum që përmban antitrupat tek eritrocitet e deleve. Serum marr duke imunizuar një lepur me eritrocite dele.

5. Komplement– Serum gjaku i derrit të gini i sapopërgatitur (i lëngshëm ose i tharë në ngrirje).

6. Elektrolit– tretësirë ​​izotonike e klorurit të natriumit.

Skenuar nga RSK.

Para eksperimentit titrohet antigjeni, serumi i pacientit, serumi hemolitik dhe komplementi (përcaktohet titri i tyre). Serumi i pacientit nxehet në 56°C për 30 minuta.

RSK kryhet në 2 faza.

Faza I - specifike: në një epruvetë përgatitet një sistem specifik - përzihen sasi të barabarta të një antigjeni të njohur, serumi i pacientit dhe komplementi, në një epruvetë tjetër përgatitet një sistem hemolitik - një përzierje eritrociteve të deleve dhe serumit hemolitik, tubat vendosen në termostat në 37°C për 30 minuta. Në të njëjtën kohë, përgatiten kontrollet për antigjenin, komplementin dhe hemosistemin, mostrat e kontrollit me serumin e një të sëmuri të njohur (serum pozitiv) dhe të një personi të njohur të shëndetshëm (serum negativ) dhe gjithashtu vendosen në një termostat për 30 minuta.

Faza II - tregues: sasi të barabarta të sistemit hemolitik shtohen në përzierjen fillestare dhe në të gjithë tubat e kontrollit dhe rezultatet e reaksionit merren parasysh pas mbajtjes në termostat për 30 minuta.

Kontabiliteti për rezultatet e DSC kryhet me rezultate perfekte në kontrolle .

Reagim pozitiv(një person është i sëmurë dhe serumi i tij përmban antitrupat përkatës ndaj agjentit shkaktar të sëmundjes - antigjenit): në fazën I, komplekset antigjen-antitrup formohen në një sistem specifik, me të cilin lidhet komplementi; pas shtimit të sistemit hemolitik, në Faza II, hemoliza nuk vërehet, pasi komplementi është i lidhur me sistemin e 1-të specifik. Efekt i dukshëm- arsimimi sedimenti i eritrociteve.

Reagim negativ(një person është i shëndetshëm dhe nuk ka antitrupa ndaj agjentit shkaktar në serumin e tij): komplekset antigjen-antitrup nuk formohen dhe komplementi në fazën I mbetet i lirë; pas shtimit të sistemit hemolitik në fazën II, komplementi lidhet me antigjen-antitrupin. komplekse që janë domosdoshmërisht të pranishme këtu (këto janë komplekse eritrocite-antitrupa) antitrupa kundër eritrociteve) dhe shkakton hemolizën e rruazave të kuqe të gjakut. Efekt i dukshëm- hemoliza e rruazave të kuqe të gjakut - "gjak llak"

Ato përdoren gjithashtu në diagnostikimin e sëmundjeve infektive. reaksioni i neutralizimit (RN) i toksinës me serum antitoksik, reaksioni imunofluoreshencës (RIF), analiza radioimune (RIA), analiza imunosorbente e lidhur me enzimën (ELISA).

NË Reagimi bazohet në dy fenomene - bakterolizë dhe hemolizë. Komplementi është i përfshirë në manifestimin e tyre. Prandaj, në RSC përdoren dy sisteme përbërësish: 1) siguron fenomenin e bakterolizës dhe përdoret për qëllime diagnostikuese; 2) hemolitik, tregues, ndihmës; ju lejon të përcaktoni nëse komplementi është i lidhur apo jo i lidhur në sistemin e parë (shih skemën e ngjyrave, Fig. I). Më parë, një pezullim bakteresh përdorej si antigjen, kështu që sistemi i parë quhej bakterolitik (në raste pozitive, ndodhte liza e baktereve).

Ngritja e RSC kryhet në dy faza. Në fazën e parë, përgatitet një sistem bakterolitik: 0,5 ml serum testues me antigjen përzihet në epruveta, shtohet komplementi në një dozë të përcaktuar rreptësisht (titri). Përzierja antigjen-serum-komplement (sistemi bakterolitik) mbahet në një banjë uji (ose termostat) për 20...40 minuta në 37...38"C. Rezultati i ndërveprimit të përbërësve në epruvetë është i padukshëm, lëngu mbetet transparent dhe i pangjyrë Për të përcaktuar kontaktin Nëse komplementi është në sistemin bakterolitik, kryhet faza e dytë e reaksionit: në epruvetat shtohen përbërës të sistemit hemolitik - eritrocitet e lara të deleve dhe serumi hemolitik i inaktivizuar. , siç tregohet në diagram Të gjithë përbërësit e sistemit bakterolitik tunden për t'u përzier në epruvetën e vendosur në një banjë uji në 37... 38 "C për 20...40 min. Më pas shtohen përbërësit e sistemit hemologjik, gjithçka tundet përsëri dhe përsëri vendoset në një banjë uji për 10...15 minuta.

Kontabiliteti paraprak i rezultatit. Nëse serumi merret nga një kafshë e sëmurë, atëherë ai përmban antitrupa që kombinohen me një antigjen specifik. Komplementi lidhet me këtë kompleks (antigjen - antitrup) - hemoliza nuk ndodh, rezultati është pozitiv.

Nuk ka antitrupa në serumin e një kafshe të shëndetshme: kompleksi antigjen-antitrup nuk është formuar, komplementi nuk është i lidhur në sistemin bakteriologjik. Kur shtohen eritrocitet dhe hemolizina (kjo është midis një antigjeni dhe një antitrupi), komplementi reagon me këtë kompleks - ndodh hemoliza, rezultati është negativ (shih ngjyrën Fig. II).

Kontabiliteti përfundimtar i rezultatit. Provëzat lihen në temperaturë ambienti për 15...20 orë.Nëse serumi në sistemin bakterolitik ishte nga një kafshë e sëmurë, në epruvetë formohet një kompleks specifik antigjen-antitrup, i cili përthith (lidh) të gjitha të shtuarat. plotësojnë. Rrjedhimisht, në sistemin e dytë, hemolitik, hemoliza nuk do të ndodhë, qelizat e kuqe të gjakut do të vendosen në fund të epruvetës dhe lëngu supernatant do të jetë transparent. Rezultati i RSC është pozitiv.

Nëse serumi i testit nuk përmban antitrupa specifikë ndaj antigjenit të përdorur (në rastet kur serumi është nga një kafshë e shëndetshme), kompleksi antigjen-antitrup nuk formohet në sistemin bakterolitik dhe, për rrjedhojë, komplementi nuk absorbohet në këtë sistem, por mbetet i lirë. Kur shtohen komponentët e sistemit hemolitik (në fazën e dytë të reaksionit), komplementi ndërvepron me kompleksin e dytë (hemolizina - qelizat e kuqe të gjakut), ndodh hemoliza e qelizave të kuqe të gjakut - nuk formohet precipitat, lëngu në epruvetë është llak me ngjyrë të kuqe. Rezultati i RSC është negativ.

RSK. përdoret: 1) për të zbuluar antitrupa specifikë në serumin e një kafshe të sëmurë (për diagnostikimin e brucelozës, peripneumonisë, gjendrave, leptospirozës, tripanosomozës, etj.); 2) të identifikojë një antigjen specifik (bakterial ose viral) në materialin e testimit në prani të serumit specifik imunitar.

Për të kryer RSC është e nevojshme të keni: mostra serumi të marra për kërkime; dy serume të njohura si pozitive (standarde, duke siguruar një rezultat pozitiv) dhe dy serume normale. Të gjithë serumet e holluar 1:10 çaktivizohen në 56...58 °C për 30 minuta; antigjen i holluar sipas titrit; komplementi i holluar në përputhje me titrin e përcaktuar gjatë titrimit në një sistem bakterolitik; hemolizina në titrin e punës; qelizat e kuqe të gjakut të deleve (I: 40); tretësirë ​​e kripur, pipeta të shkallëzuara, epruveta, rafte, banjë uji në 37...38 °C.

Para kryerjes së RSC, gjaku i deleve defibrinohet dhe qelizat e kuqe të gjakut lahen tretësirë ​​fiziologjike me centrifugim derisa supernatanti të jetë plotësisht transparent, i cili hiqet me thithje dhe qelizat e kuqe të precipituara hollohen në tretësirë ​​fiziologjike 1:40 (2,5%). Antigjeni hollohet sipas titrit të treguar në etiketë nga biofabrika. Hemolizina dhe komplementi titrohen përpara vendosjes së RSC.

Antigjeni për RSC përgatitet në biofabrika. Zakonisht këto janë ekstrakte të pezullimeve mikrobike të shkatërruara (ose indeve që përmbajnë virus). Antigjenet nuk duhet të kenë një efekt hemolizues, i cili kontrollohet gjatë procesit të reagimit (1...2 doza antigjen dhe 0,5 ml suspension të qelizave të kuqe të gjakut hidhen në një epruvetë: nuk duhet të ketë hemolizë). Në ampulën me antigjenin, biofabrika tregon se është menduar për RSC (sapnaya, brucelozë ose të tjera). Kutia e paketimit tregon numrin e serisë, datën e prodhimit, datën e skadencës, aktivitetin e antigjenit, domethënë në çfarë hollimi duhet të përdoret gjatë kryerjes së RSC (1:100, 1:150, etj.). Në disa sëmundje, materiale të tjera shërbejnë si antigjene; për shembull, për diagnozën e peripneumonisë së madhe bagëti Antigjeni për CSC është limfa e një viçi të infektuar eksperimentalisht në mënyrë subkutane ose intrapleurale. Gjatë ruajtjes afatgjatë të antigjeneve, titri i tyre kontrollohet sërish në laborator duke përdorur një skemë të veçantë titrimi.

Serumet e provës të marra për kërkime hollohen me tretësirë ​​fiziologjike 1: 5 ose 1: 10, çaktivizohen duke u ngrohur në një banjë uji për të shkatërruar komplementin e tyre për 30 minuta në 56...58 °C (seri gomarësh, mushkash, hinnies - në 61 °C).

Hemolizina përgatitet në biofabrika duke i hiperimunizuar lepujt me qeliza të kuqe të gjakut të lara të deleve. Për ta bërë këtë, lepujt injektohen në mënyrë intravenoze me një pezullim 40 ... 50% të qelizave të kuqe të gjakut 4 ... 5 herë në intervale 2 ... 3-ditore. Një javë pas injektimit të fundit, lepujve merret gjak, aspirohet sterilisht serumi, inaktivizohet, ruhet me glicerinë 1:1 ose 0,5% fenol, titrohet dhe derdhet në ampula. Në laboratorë, përpara se të vendoset në skenë, RSC titrohet përsëri.

Skema e titrimit të hemolizinës.Është e nevojshme të përgatitet: i) hollimi i komplementit 1: 20; 2) hemolizina 1:100 (0,2 ml hemolizinë + 9,8 ml kripur); 3) suspension i eritrociteve të deleve 1:40; 4) tretësirë ​​fiziologjike NaCl.

Për të vendosur një reaksion titrimi, dy rreshta provëzash vendosen në një stendë - një ndihmës vetëm për përgatitjen e hollimeve të hemolizinës, e dyta për vetë titrimin. Një hollim fillestar i hemolizinës prej 1:100 shtohet në tubin e parë të çdo rreshti dhe më pas bëhen hollimet serike. Të gjitha epruvetat tunden dhe vendosen në një banjë uji në 37...38°C për 10...15 minuta. Kontabilizimi i rezultatit: në këtë shembull, sasia më e vogël (ose hollimi i saj më i lartë) që dha hemolizë të plotë është 1: 2000, d.m.th., ky është titri i tij aktual. Titri i punës është 2 herë më i përqendruar - 1:1000.

0,5 ml (treguar me shigjeta) të çdo hollimi nga epruvetat e rreshtit të parë transferohen në epruveta të veçanta të rreshtit të dytë. Shtoni 0,5 ml komplement (1:20), 0,5 ml qeliza të kuqe të gjakut të deleve (2,5% suspension, ose 1:40) dhe 1 ml tretësirë ​​të kripur në të gjitha epruvetat e rreshtit të dytë, në mënyrë që vëllimi i lëngut në çdo epruvetë ishte 2.5 ml.

Shënim. Bazuar në faktin se formulimi përfundimtar i RSC do të përfshijë 5 përbërës nga 0,5 ml secili, i cili do të arrijë në një vëllim prej 2,5 ml, ky vëllim ruhet gjatë gjithë punës.

Tundet tunden dhe vendosen në banjë me ujë për 10...15 minuta. Hemoliza do të ndodhë kryesisht në epruveta me përmbajtje të lartë të hemolizinës (hollimi më i ulët i saj është 1:500, 1:1000...). Sasia më e vogël e hemolizinës (hollimi më i madh i saj) që shkaktoi hemolizën e plotë të qelizave të kuqe të gjakut në kushte të caktuara quhet titrin kufizues (aktual). hemolizina. Për punë të mëtejshme, hemolizina përdoret 2 herë më e koncentruar, pra në sasi të dyfishtë, dyfishi i titrit, i cili quhet. titulli i punës. Për shembull, nëse titri aktual është I: 2500 (ose 1: 2000), atëherë titri i punës korrespondon me një hollim prej 1:1250 (ose 1: W00).

KOMPLEMENTI është komponent serum i freskët, limfë, lëngje indore tipe te ndryshme kafshët (dhe njerëzit); zbuluar nga Buchner (1889). Tek insektet nuk ka plotësim. Komplementi është një substancë proteinike me një strukturë komplekse që çaktivizohet shpejt nga ngrohja, ruajtja afatgjatë, ekspozimi ndaj rrezatimit ultravjollcë, lëkundjet e forta, filtrimi përmes filtrave qeramikë, shtimi i kaolinës, acideve, alkaleve, alkoolit, acetonit, kloroformit, i distiluar. ujë, baktere të pezulluara, etj. Komplementi mund të ruhet duke shtuar 5 g sulfat natriumi për 100 ml serum derri gini, 4 g acid borik. Aktiviteti i komplementit vazhdon deri në gjashtë muaj. Menyra me e mire konservim - tharje nën vakum në temperaturë të ulët (liofilizim). Në ampula të mbyllura në këtë gjendje zgjat dy vjet. Para çdo procedure RSC, aktiviteti i komplementit kontrollohet me titrim, domethënë përcaktohet titri i tij - sasia optimale e kërkuar për një reagim të caktuar. Komplementi titrohet dy herë: në sistemet hemolitike dhe bakterolitike.

Për titrimi i komplementit në sistemin hemolitik përgatitni përbërësit: plotësoni në një hollim 1:20 (1 ml komplement + 19 ml kripë); hemolizina, e holluar sipas titrit të punës; një suspension eritrocitesh dele të lara (1:40), zgjidhje fiziologjike. Provavet vendosen në një stendë dhe në to hidhen sasi të ndryshme komplementi me një pipetë të shkallëzuar në intervale prej 0,03 ml (0,13; 0,16; 0,19; 0,22..: deri në 0,43 ml). Pastaj shtoni komponentët e mbetur (Fig. 57). Të gjitha epruvetat tunden dhe vendosen në një banjë uji në 37...38 °C për 10...15 minuta dhe rezultati regjistrohet.

Kontabilizimi i rezultatit: si titri i komplementit merret sasia më e vogël e komplementit që siguron hemolizë të plotë (në këtë shembull - 0,25 ml).

Rezultati i titrimit fillon të merret parasysh në epruvetat me më të lartën përmbajtje të lartë komplementi, ku para së gjithash pritet hemoliza. Sasia më e vogël e komplementit që siguron hemolizën e plotë të qelizave të kuqe të gjakut në kushte të caktuara quhet titrin e komplementit në sistemin hemolitik.

Për titrimi i komplementit në sistemin bakterolitikështë e nevojshme të kemi të gjithë përbërësit e reaksionit: komplementin (1:20), qelizat e kuqe të gjakut (1:40), hemolizinën në titrin e punës, dy serume pozitive dhe dy normale, një antigjen specifik. Serumet hollohen me tretësirë ​​të kripur 1:10, inaktivizohen për 30 minuta në 56...58 X. Çdo serum hidhet në dy rreshta tubash 0,5 ml. Komplementi shtohet në epruvetat e çdo rreshti në sasi në rritje, si kur titrohet në një sistem hemolitik; filloni me sasinë e marrë për titrin në sistemin hemolitik, pastaj në çdo epruvetë pasuese rritet doza me 0,03 ml, duke e niveluar vëllimin në 0,5 ml me tretësirë ​​fiziologjike.

Pas kësaj, në një rresht të epruvetave me serum pozitiv dhe normal i shtohet 0,5 ml antigjen dhe në rreshtin e dytë të secilit serum shtohet 0,5 ml tretësirë ​​fiziologjike. Të gjitha epruvetat tunden dhe vendosen në një banjë uji për 30...40 minuta. Më pas në të gjitha epruvetat shtohen 0,5 ml hemolizinë dhe 0,5 ml eritrocite, tunden dhe vendosen sërish në një banjë uji për 10...15 minuta. Sasia më e vogël e komplementit që siguroi lizën e plotë të qelizave të kuqe të gjakut në të dy rreshtat e epruvetave (me antigjen dhe pa antigjen) të dy serumeve normale, në një rresht (pa antigjen) të çdo serumi pozitiv dhe me vonesë të plotë (mungesë) të hemoliza në rreshtat e serumeve pozitive me antigjen (në ato doza të njëjta të komplementit), e quajtur titri i komplementit, e cila përdoret në ngritjen e përvojës kryesore të RSC në studimet diagnostike.

Përvoja kryesore e RSK (në fakt test diagnostik). Dy rreshta epruvetash vendosen në rafte sipas numrit të mostrave të serumit që studiohen. 0,5 ml nga çdo serum i inaktivizuar hidhet në dy epruveta: njërës i shtohet antigjen - 0,5 ml, tjetrës (pa antigjen) 0,5 ml kripur dhe, duke shtuar komplementin, bëhet një sistem bakterolitik dhe më pas bëhet një hemolitik. shtuar.

Komponentët e nevojshëm: 1) serum testues, i inaktivizuar, i holluar me tretësirë ​​fiziologjike 1:10; 2) një antigjen specifik, i holluar sipas titrit të treguar nga biofabrika në etiketën e paketimit; 3) plotësues në titrin e përcaktuar; 4) hemolizina në titrin e punës; 5) një pezullim i eritrociteve të lara të deleve 1: 40; 6) tretësirë ​​fiziologjike NaCl. Serumet e provës derdhen në dy rreshta tubash. Për çdo numër të serumeve të testimit, një serum i njohur pozitiv (që jep një rezultat pozitiv) dhe një normal (nga një kafshë e shëndetshme, që jep një rezultat negativ) përdoret si kontroll.

Tubat me përbërësit e sistemit bakterolitik tunden dhe vendosen në një banjë uji për 20...40 minuta në 37...38°C. Tubat e testimit të sistemit bakterolitik të rreshtit të dytë pa antigjen tunden dhe vendosen në një banjë uji në të njëjtat kushte.

Më pas përbërësit e sistemit hemolitik shtohen në të gjitha epruvetat e rreshtit të parë dhe të dytë dhe vendosen për herë të dytë në një banjë uji për 10..15 minuta. Në të gjithë tubat e rreshtit të dytë pa antigjen, ndodh hemoliza e plotë.

Para se të merret rezultati përfundimtar, epruvetat lihen në temperaturën e dhomës për 18...24 orë.Në të gjitha epruvetat pa antigjen, pavarësisht nëse serumi është marrë nga një kafshë e sëmurë apo e shëndoshë, duhet të ndodhë hemoliza; në të parën. epruveta me rresht me antigjen, një rezultat më i qartë shprehet kur qëndroni në këmbë.

Leximet e reagimit në epruvetat me serum provë konsiderohen të besueshme nëse nuk ka hemolizë në epruvetat me serum dhe antigjen pozitiv, me hemolizë të plotë në epruveta me serum pozitiv pa antigjen dhe në të gjitha epruvetat me serum dukshëm normal (Fig. 61 ).

Ky reagim duhet të shoqërohet me kontrolle të antigjenit, komplementit, hemolizinës dhe eritrociteve. Për ta bërë këtë, antigjeni me qelizat e kuqe të gjakut të deleve derdhet në epruveta të veçanta; plotësoni me qeliza të kuqe të gjakut pa hemolizinë; hemolizina me qelizat e kuqe të gjakut pa komplement; qelizat e kuqe të gjakut dhe solucioni i kripur. Vëllimi në çdo epruvetë rregullohet në 2,5 ml me tretësirë ​​të kripur. Tubat e provës tunden dhe vendosen në një banjë uji në 37 °C për 20 minuta. Nuk duhet të ketë hemolizë në të gjitha tubat e kontrollit.

Rezultati RSKËshtë zakon ta shprehim atë me "kryqe". Treguesit e një reagimi pozitiv rezultojnë: + + + + (///) - sedimentim i plotë i qelizave të kuqe të gjakut (pa hemolizë), lëngu sipër sedimentit është i pangjyrë, + + + (///) - lëngu sipër sedimentit është mezi i dukshëm i verdhë. Një rezultat i dyshimtë i reagimit: prania e eritrociteve të vendosura në fund dhe ngjyrosja e pjesshme e supernatantit për shkak të lizës së disa prej eritrociteve përcaktohet + + - (++), domethënë dy kryqëzime e dy e gjysmë. . Hemoliza e rëndë (pa sediment) ose me një sediment të vogël (+) është një rezultat negativ.

Reaksioni afatgjatë i fiksimit të komplementit (LDCR). Më efektive në ndjeshmëri në kontrast me RSK-në e zakonshme klasike. Thelbi i reagimit është se sistemi bakterolitik mbahet në tre të ndryshme kushtet e temperaturës: pas përzierjes së përbërësve në temperaturën e dhomës për 15 minuta, pastaj në temperaturë të ulët (4 ° C) në frigorifer për 18...20 orë dhe në një banjë uji për 15 minuta. Pas kësaj, sistemi hemolitik shtohet, tundet, vendoset përsëri në një banjë uji dhe reaksioni regjistrohet, si me RSC. Efektiviteti i RDSC është konfirmuar në diagnostikimin e një sërë sëmundjesh infektive (tuberkulozi, vibrioza, bruceloza, etj.).

Reaksioni i shtypjes së fiksimit të komplementit (CPF), ose reaksioni i frenimit, FCC indirekte. Një komponent tjetër është i përfshirë në këtë reagim - serumi standard imunitar që përmban antitrupa ndaj antigjenit që zakonisht përdoret për diagnostikim dhe, për rrjedhojë, reagon pozitivisht në CSC klasike.

Serumi i provës përzihet me antigjenin dhe lihet për ca kohë pa komplement. Më pas shtohet komplementi dhe serumi standard, tubat tunden dhe vendosen në një banjë uji për 20...30 minuta, pas së cilës shtohet sistemi hemolitik dhe vendoset sërish në banjën me ujë. Nëse nuk ka hemolizë, rezultati është negativ, sepse serumi i testit nuk ka reaguar me antigjenin dhe ky i fundit ka reaguar me serum standard, plotësues lidhës. Nëse serumi i testit është nga një kafshë e sëmurë, ai përmban antitrupa specifikë në lidhje me antigjenin, d.m.th., ndodh një reaksion midis antigjenit dhe antitrupave pa fiksim të komplementit. Antigjeni, duke ndërvepruar me antitrupat e serumit të testit, nuk reagon (i shtypur) me serumin standard (specifik i njohur), komplementi mbetet i lirë dhe reagon në sistemin hemolitik - ndodh hemoliza, rezultati i reagimit është pozitiv në lidhje. në serumin e testimit.

Metoda antitrupat fluoreshente (MFA). Aftësitë e kësaj metode janë për shkak të specifikës së fazës së parë të reaksioneve serologjike me ndjeshmërinë e lartë të analizës lumineshente. Për të kryer MFA, është e nevojshme të keni serume lumineshente imune shumë specifike. Dihet se në reaksionet e ndryshme serologjike të përdorura në praktikën mikrobiologjike, përfshihen kryesisht tre komponentë: antigjeni bakterial, antitrupi dhe komplementi. Të tre komponentët, në fakt, janë antigjene, dhe kundër secilit prej tyre mund të merren serume imune dhe, në përputhje me rrethanat, antitrupa luminescent. Në varësi të llojit të serumit fluoreshent që përdoret (kundër antigjenit bakterial, antitrupave antibakterialë, komplementit), ekzistojnë tre variante kryesore të metodës së antitrupave fluoreshente: variantet direkte (1) dhe indirekte (2) dhe modifikimi i variantit indirekt duke përdorur komplementin. Reaksioni imunologjik midis antigjenit dhe antitrupave kryhet në këto modifikime direkt në rrëshqitjen e qelqit. Për fiksimin e mikroorganizmave përdoren tretës organikë: aceton, etanol, metanol, dioksan, si dhe fiksues konvencionalë të përdorur në praktikën mikrobiologjike: formalina, përzierja e Nikiforovit, lëngu i Carnoy, etj.

Opsioni i drejtpërdrejtë. Një serum specifik lumineshent aplikohet në përgatitjen e përfunduar kohë të caktuar, pastaj serumi i tepërt kullohet, preparati lahet dhe shikohet nën një mikroskop fluoreshent. Kjo metodë përdoret për të zbuluar bakteret në material, objekte patologjike mjedisi i jashtëm, si dhe për identifikimin e patogjenëve në kultura.

Opsioni indirekt (me dy faza). Në fazën e parë, ndodh një kombinim specifik i antigjenit me antitrupin përkatës të serumit të paetiketuar. Në fazën e dytë, një antitrup specifik i paetiketuar lidhet me një antitrup lumineshent kundër specieve që përmbahet në serumin e një kafshe të imunizuar me globulina (ose serum gjaku të plotë) të specieve nga e cila është përdorur serumi imunitar.

Opsioni indirekt anti-plotësues (tre faza). Faza e parë: formimi i kompleksit të antitrupave të paetiketuar me antigjen. Faza e dytë: shtresimi i serumit normal që përmban komplement. Faza e tretë: kompleksi antigjen-antitrup-komplement trajtohet me serum luminescent anti-komplementar të përgatitur duke imunizuar lepujt me serumin e specieve shtazore që shërbenin si burim i komplementit.

Variantet indirekte të MFA mund të përdoren si për zbulimin e antigjeneve ashtu edhe për zbulimin e antitrupave. Përveç kësaj, për të vendosur një opsion me dy faza, duhet të keni një grup të kufizuar serumesh lumineshente kundër specieve (kundër globulinave të gjedhit, dashit, kalit, derrit etj.), dhe për opsionin anti-plotësues është mjafton të ketë vetëm një serum lumineshent kundër globulinave të derrit të gini.

Metodat e imunolumineshencës dhe mikroskopisë. Në praktikën e laboratorëve bakteriologjik veterinar përdoren serume lumineshente të biofabrikuara. Në varësi të llojit të fluorokromit, serumet lumineshente i japin objektit ose një shkëlqim të gjelbër (ngjyrë me bazë fluoreshente) ose një shkëlqim të kuq (ngjyrë me bazë rodamine).

Për të kryer mikroskopin imunolumineshent, materiali që do të ekzaminohet duhet të aplikohet në një rrëshqitje qelqi pa yndyrë, të hollë dhe pa gërvishtje. Kur studioni organet dhe indet e kafshëve, përgatitjet e gjurmëve të gishtërinjve përgatiten në një shtresë të hollë. Përgatitjet thahen në ajër dhe vendosen në një lëng fiksues (etanol - 15 minuta, metanol - 5 minuta, aceton - 5 minuta). Nëse është e nevojshme, pas fiksimit, përgatitjet mund të ruhen në frigorifer për disa kohë. Sekuenca dhe procedurat e mëtejshme varen nga versioni i MPJ-së i përdorur (një-fazor, dy-fazor, tre-fazor). Trajtimi i preparateve me serum lumineshent, si dhe me serume dhe komplement të paetiketuar të fazës së parë, kryhet në 37°C në një dhomë të lagësht (enë Petri me letër filtri të lagur).

Opsioni me një fazë. Serumi lumineshent aplikohet në një rrëshqitje xhami me material testues të fiksuar (në hollimin e treguar në ampulë). Ilaçi vendoset në një dhomë të lagësht për 15...20 minuta në 37"C. Më pas lahet me tretësirë ​​të kripur të puferuar (pH 7.4) në një enë duke e ndryshuar tretësirën pas 5...10 minutash disa herë. ose nën ujë të rrjedhshëm rubineti për 3...5 minuta.Uji duhet të jetë neutral dhe pa hekur.Më pas preparati (mund të ketë disa njolla në një gotë) thahet në ajër ose me letër filtri, pas së cilës një pikë. i glicerinës së buferuar me pH 8.0 aplikohet dhe mbulohet me një mbulesë Një lëng zhytës jo-fluoreshent aplikohet në një rrëshqitës mbulese dhe ekzaminohet nën një mikroskop.

Opsioni me dy faza. Një pikë e serumit imunitar të fazës së parë, të paetiketuar, aplikohet në një rrëshqitje xhami me materialin e testimit. Ilaçi vendoset në një termostat në një dhomë të lagësht për 15 ... 20 minuta. Më pas lahet siç përshkruhet më sipër, thahet dhe hidhet një pikë serumi luminescent kundër specieve. Ilaçi vendoset përsëri në një termostat në një dhomë të lagësht për 15...20 minuta. Përsëriteni procedurën e larjes dhe thajeni me letër filtri. Aplikohet glicerina e buferuar, mbulohet me një mbulesë, aplikohet lëngu zhytës jo fluoreshent dhe ekzaminohet mikroskopikisht.

Opsioni me tre faza (anti-plotësues). Një pikë e serumit imunitar të fazës së parë, të paetiketuar, aplikohet në një rrëshqitje xhami me materialin e testimit. Ilaçi vendoset në një termostat siç përshkruhet më sipër, thahet dhe një pikë komplementi aplikohet në njollë. Ilaçi vendoset përsëri në një dhomë të lagësht dhe në një termostat për 15...20 minuta, pas së cilës lahet dhe aplikohet një serum luminescent anti-komplementar. Procedurat pasuese janë të ngjashme me opsionin me një hap.

Përgatitja dhe përpunimi i preparateve të kontrollit. 1. Për opsionin e drejtpërdrejtë, për të përcaktuar specifikën e reaksionit ndërmjet antigjenit dhe serumit lumineshent, me të njëjtin serum duhet të trajtohen preparatet e njollosjes nga specie mikrobike heterologe. Këto specie duhet të jenë antigjenikisht të ngjashme, por të ndryshme në morfologji nga mikroorganizmat që studiohen; antigjenikisht të largët nga mikroorganizmat në studim, por të ngjashëm në morfologji dhe shpërndarje me to. Përgatitjet e imprinteve trajtohen me serum normal luminescent.

2. Për opsionin indirekt, është e nevojshme të keni tre preparate kontrolli të trajtuara me serum normal, serum luminescent anti-specie pa serum imunitar të paetiketuar dhe serum luminescent anti-specie me serum imun të njohur të fazës së parë.

3. Për opsionin indirekt me plotësues Kërkohen preparate kontrolli, gjatë trajtimit të të cilave serumi imunitar zëvendësohet me serum normal të të njëjtit lloj dhe në të njëjtat hollime, si dhe preparate të trajtuara me të gjithë përbërësit përveç serumit imunitar.

Vlerësimi i rezultateve. Shkëlqimi, ngjyra, lokalizimi dhe struktura e shkëlqimit merren parasysh. Bakteret e ngjyrosura me serum lumineshent të etiketuar me izotiocianat fluorescein kanë një shkëlqim të gjelbër të ndezur përgjatë periferisë në formën e një buzë ose halo, pjesa qendrore shkëlqen dobët. Ky shkëlqim quhet specifik, në kontrast me jospecifik, kur i gjithë trupi qelizor shkëlqen në mënyrë të barabartë. Sa më e theksuar të jetë qeliza bakteriale në preparat, aq më e mprehtë është buzë. Kjo shkëlqim mund të shpjegohet me faktin se nga një zonë njësi e "periferisë" së qelizës disa herë më shumë antitrupa projektohen në retinën e syrit të vëzhguesit sesa nga pjesa qendrore e qelizës mikrobike. Duhet pasur parasysh se qelizat plastike (leptospires, vibrios) nuk kanë kontur ose bie në sy. Në qelizat e zhytura në lëngun e indeve dhe në bacilet e rinj antraksit skica zakonisht është e paqartë.

Intensiteti i lumineshencës vlerësohet duke përdorur sistemin me katër kryq: + + + + - fluoreshencë shumë e ndritshme përgjatë periferisë së qelizës mikrobike, në kontrast të qartë me trupin e errët të qelizës; + + + - fluoreshencë e ndritshme e periferisë së qelizave; + + - shkëlqim i dobët i periferisë së qelizave; + - nuk ka shkëlqim kontrasti të periferisë së trupit të qelizave mikrobike. Mungesa e një shkëlqimi specifik tregohet nga "-" (hijet e mikroorganizmave janë të dukshme). Gjatë diagnostikimit të patogjenëve të ndryshëm rezultat pozitiv Më shpesh, luminescenca specifike e qelizave bakteriale konsiderohet të jetë jo më e ulët se katër ose tre kryqe.