Реакция связывания комплемента (РСК) – сложная двухэтапная серологическая реакция. В ней используют пять ингредиентов, составляющих две системы: антиген, антитело, комплемент (первая система); эритроциты барана, сенсибилизированные (обработанные) гемолитической сывороткой, содержащей специфические к ним антитела (вторая, или индикаторная, гемсистема). При этом взаимодействие антитела с антигеном на первом этапе реакции приводит к образованию иммунного комплекса, который адсорбирует комплемент, но визуально обнаружить это невозможно. В качестве индикатора связывания комплемента на комплексе антиген–антитело на втором этапе используют гемсистему, которая, являясь иммунным комплексом, тоже способна адсорбировать его. В конечном итоге возможны два варианта результата реакции. Если антитело и антиген соответствуют друг другу и комплемент адсорбируется образовавшимся комплексом, лизиса эритроцитов гемсистемы не произойдет. При несоответствии антитела антигену, и наоборот, комплемент, оставаясь свободным, присоединится к гемсистеме и вызовет гемолиз.
Как и другие серологические реакции, РСК можно использовать для выявления специфических антител по известному антигену или для определения антигена по известным антителам.
Общая характеристика ингредиентов РСК.
1. ИССЛЕДУЕМАЯ СЫВОРОТКА перед постановкой реакции прогревается на водяной бане 30 мин для инактивации ее собственного комплемента и разводится начиная с 1:5.
2. АНТИГЕНОМ могут быть культуры бактерий, их лизаты, вирусы и вирус–содержащие материалы, экстракты патологически измененных органов и тканевые липиды.
3. КОМПЛЕМЕНТ – сыворотка морских свинок, полученная в день опыта. В настоящее время используется производственный сухой комплемент.
4. ГЕМОЛИТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА состоит из смешанных в равных объемах гемолитической сыворотки и 3% взвеси эритроцитов барана по осадку. Для сенсибилизации эритроцитов гемолизинами смесь выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 30 мин.
Постановка основного опыта РСК. В 1 пробирку вносят СЫВОРОТКУ, АНТИГЕН И КОМПЛЕМЕНТ, во вторую – сыворотку, комплемент и вместо антигена изотонический раствор натрия хлорида (КОНТРОЛЬ СЫВОРОТКИ), в третью – антиген, комплемент и тот же раствор натрия хлорида (КОНТРОЛЬ АНТИГЕНА). Пробирки ставят в термостат при температуре 37°С на 1ч. Одновременно готовят гемолитическую систему, которую затем добавляют во все три пробирки после извлечения штатива из термостата. Смешав гемсистему с ингредиентами трех пробирок, последние вновь ставят в термостат на 1 ч, и спустя это время учитывают результаты РСК.
При учете РСК интенсивность реакции обозначается плюсами: «++++»– резко положительная реакция с полной задержкой гемолиза, жидкость в пробирке бесцветная, все эритроциты осели на дно; «+++», «++» –положительная реакция, отличается нарастанием окраски жидкости вследствие гемолиза и уменьшения количества эритроцитов в осадке; «+» – слабоположительная реакция, жидкость интенсивно окрашена, на дне пробирки незначительное количество эритроцитов. Отрицательная реакция обозначается знаком «–», при этом наблюдается полный гемолиз, жидкость в пробирке имеет интенсивно–розовую окраску («лаковая кровь»).
РСК – весьма сложная, но очень чувствительная специфическая реакция. Широко применяется в диагностике сифилиса, хронической формы гонореи, коклюша, актиномикоза, всех риккетсиозов и вирусных инфекций.
Иммуноферментный анализ.
Метод был разработан в начале 70-х гг независимо друг от друга тремя группами учёных. Метод напоминает РИА, но в его основу положено маркирование Аг или Ат, вступающего в реакцию, ферментом. Взд метки с субстратом обычно сопровождается изменением окраски среды. В настоящее время созданы многочисленные модификации этого метода, но наибольшее распространение получил гетерогенный ИФА на твёрдой фазе (твердофазный). Различают:
1) ПРЯМОЙ ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИФА. В этом случае:
1. сыворотку с Ат инкубируют с Аг, фиксированным на твёрдом субстрате (чаще всего это пластиковая микропланшетка).
2. Ат, не связавшие Аг, удаляют многократным промыванием.
3. Вносят меченную ферментом сыворотку к Ат, связавшим Аг.
4. Определяют ко-во фермента–маркёра, связавшегося с Ат.
2) КОНКУРЕНТНЫЙ ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИФА.
1. Вносят сыворотку. Если в ней есть специфические Ат, то они связываются с Аг, фиксированном на твёрдом субстрате. Если специфических Ат нет, то Аг оказывается не связанным.
2. При добавлении специфических к фиксированному Аг Антител в первом случае им будет не с чем взаимодействовать (большинство Аг уже связаны) Þ содержание маркёра низкое. Во втором случае специфические Ат будут связываться с Аг и при отмывании они не будут смываться Þ высокое содержание маркёра.
Аналогично м.б. фиксированы АНТИТЕЛА, и различные фирмы выпускают именно планшеты с уже фиксированными Ат.
По сравнению с классическими методами выявления Аг этот метод позволяет непосредственно регистрировать их взаимодействие с Ат, а не вторичные проявления (агглютинацию, преципитацию или гемолиз). Метод очень ЧУВСТВИТЕЛЕН (достаточно концентрации 1нг/мл).
Определяют: Хламидии, клостридии, ВИЧ и др.
8. Реакция фагоцитоза.
Фагоцитоз осущ-ся микрофагами и макрофагами. Стадии фагоцитоза: приближение, прилипание, погружение, переваривание.
Оценка функциональной активности фагоцитирующих клеток.
Колич. оценку фагоцитарной активности гранулоцитов и моноцитов производят в цельной крови, в лейкоцитарной взвеси или в обогащенных фракциях фагоцитирующих клеток. В качестве стандартных объектов фагоцитоза используют монодисперсные частицы латекса диаметром 1,0-2,0 мкм, суспензию убитых нагреванием бактерий или дрожжеподобных грибов.
Фагоциты смешивают с фагоцитируемым материалом в соотношении 1:10 или 1:100 и инкубируют при 37°С в течение 30 мин при постоянном перемешивании. Затем пробирки центрифугируют и осадок ресуспензируют в капле сыворотки крови для приготовления мазка. В мазках, фиксированных краской Май-Чрюнвальда и окрашенных по Романовскому-Гимзе, подсчитывают процент фагоцитирующих клеток (ФП – фагоцитарный показатель) и кол-во поглощенных частиц на 1 клетку (ФЧ – фагоцитарное число).
У здорового человека ФП=40-80%, ФЧ=1-5.
9. Диагностикумы.
Диагностикумы – это взвесь убитых нагреванием или формалином определенных микробных клеток с известным содержанием клеток в единице объема. В качестве антигена могут быть использованы также взвеси живых бактерий. Феномен реакции проявляется предварительно через два часа (при 37 0 С), окончательный результат учитывается при комнатной температуре через 18-20 часов. Для диагностики представляет интерес положительная реакция только в опре-деленном титре сыворотки, который служит диагностическим. Так, при бруцеллезе диагностический титр 1:200, а при туля-ремии -1:100. Для выявления антител можно ставить экспрессные реак-ции агглютинации (время учета несколько минут). Например: 1. Кровяно-капельная реакция при туляремии. В каплю цельной крови больного на специальном стекле наносят кап-лю дистиллированной воды (для гемолиза) и каплю туляре-мийного диагностикума. Реакция происходит в течение 1-2 минут, хорошо видны агглютинаты в виде белесых комочков. 2. На стекле проводится экспрессная реакция агглютина-ции по Хеддельсону при бруцеллезе.
Данные реакции не позволяют определить количество ан-тител в сыворотке.б) для идентификации чистой культуры возбудителей ин-фекционных болезней. С этой целью используются иммунные диагностические
агглютинирующие сыворотки, выпускаемые институтамивакцин и сывороток, путем иммунизации животных целымимикробными клетками. Для достоверности сыворотки лучше использовать адсор-бированные, чтобы в них содержались только антитела, соот-ветствующие определенному виду или типу микроорганизма.
Принципы получения иммунных сывороток.
Иммунная сыворотка (антисыворотка) представляет собой сыворотку крови, содержащую антитела к данному антигену. В большинстве случаев иммунные (диагностические) сыворотки к микробным, тканевым и другим антигенам получают экспериментальным путем, иммунизируя животных соответствующими антигенами.
В числе основных требований, предъявляемых к антисывороткам, - их высокая специфичность и достаточное содержание антител. По специфичности различают поливалентные (полиспецифические) и моновалентные (моноспецифические) антисыворотки. Поливалентные сыворотки содержат антитела ко многим антигенам, моноспецифические - к одному конкретному антигену. Получить моноспецифические сыворотки можно:
1) используя для иммунизации животных высокоочищенные антигены,
2) очищая нативные сыворотки от антител нежелательной специфичности.
Для этого используют:
1) иммуноаффинный метод, в основе которого лежит связывание антител определенной специфичности соответствующими антигенами, иммобилизованными на твердофазном носителе, с последующим разделением образовавшихся комплексов АГ -АТ и выделением антител;
2) метод адсорбции по Кастеллани. Для этой цели к нативной иммунной сыворотке, содержащей группоспецифические перекрестно реагирующие антитела, последовательно добавляют микроорганизмы, в состав которых входят все групповые антигены, адсорбируя таким образом гомологичные анти-
тела. Такие адсорбированные моноспецифические антисыворотки содержат антитела к различным детерминантам молекулы антигена, которые гетерогенны по классовой (подклассовой)
Реакция связывания комплемента (РСК) заключается в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т. е. происходит связывание комплемента комплексом антиген-антитело. Если же комплекс антиген-антитело не образуется, то комплемент остается свободным.
Специфическое взаимодействие АГ и AT сопровождается адсорбцией (связыванием) комплемента. Поскольку процесс связывания комплемента не проявляется визуально, Ж. Борде и О. Жангу предложили использовать в качестве индикатора гемолитическую систему (эритроциты барана + гемолитическая сыворотка), которая показывает, фиксирован ли комплемент комплексом АГ-АТ. Если АГ и ATсоответствуют друг другу, т. е. образовался иммунный комплекс, то комплемент связывается этим комплексом и гемолиза не происходит. Если AT не соответствует АГ, то комплекс не образуется и комплемент, оставаясь свободным, соединяется со второй системой и вызывает гемолиз.
Протекание реакции
Реакция протекает в две фазы с участием двух систем; бактериальной и гемолитической. В первой реакции (специфическая) участвуют антиген 4-+ антитело + комплемент. Положительный результат реакции, наступающий при соответствии антител антигену, характеризуется образованием специфического бактериального комплекса антиген - антитело с адсорбированным, или, как говорят, «связанным», комплементом. Оставаясь невидимым, комплекс не вызывает никаких внешних изменений той среды, в которой он образовался. Отрицательный результат РСК имеет место при отсутствии специфического сродства между антигеном и антителом сыворотки и характеризуется сохранением свободного активного комплемента. Первая фаза РСК может проводиться в термостате при 37°С (1-2 ч) или в холодильнике при 3-4°С (18-20 ч). При длительном образовании иммунного комплекса антиген-антитело на холоду происходит более полное связывание комплемента и вследствие этого чувствительность реакции увеличивается. При постановке сравнительных опытов советским иммунологом акад. В. И. Иоффе и его учениками было показано, что в условиях длительного связывания комплемента на холоду можно уловить в 100-500 раз меньшие количества антигена и получить положительные результаты при больших разведениях иммунной сыворотки, чем в опыте связывания комплемента при температуре 37 °С в течение 1-2 ч. Вторая фаза реакции (индикаторная) происходит между реагентами гемолитической системы (смесь 3% взвеси эритроцитов и гемолитической сыворотки в равных объемах) при температуре 37 °С только при наличии комплемента, оставшегося свободным от первой фазы реакции (реакция отрицательная). При отсутствии свободного активного комплемента гемолиза эритроцитов под действием специфических гемолизинов не наступает (реакция положительная).
Компоненты
Реакция связывания комплемента (РСК) относится к сложным серологическим реакциям. Для ее проведения необходимы 5 ингредиентов, а именно: АГ, AT и комплемент (первая система), эритроциты барана и гемолитическая сыворотка (вторая система).
Антигеном для РСК могут быть культуры различных убитых микроорганизмов, их лизаты, компоненты бактерий, патологически измененных и нормальных органов, тканевых липидов, вирусы и вирусосодержащие материалы.
В качестве комплемента используют свежую или сухую сыворотку морской свинки.
Механизм реакции
РСК проводят в две фазы: 1-я фаза - инкубация смеси, содержащей три компонента антиген + антитело + комплемент; 2-я фаза (индикаторная) - выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген-антитело происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет; реакция положительная. Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит - антиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз; реакция отрицательная.
Применение
Реакцию связывания комплемента можно применять для:
1) выявления специфических антител в неизвестной сыворотке на основании
взаимодействия их с антигеном известной природы;
2) изучения свойств антигена в реакции с известной специфической сывороткой.
Подготовка ингредиентов для постановки РСК.
1. Сыворотку крови, полученную для исследования, накануне постановки реакции прогревают в водяной бане при 56°С в течение 30 мин для инактивации ее собственного комплемента. Инактивированная сыворотка может храниться при температуре 3-4°С в течение 5-6 дней. В день постановки-опыта сыворотку разводят изотоническим раствором хлорида натрия в соотношении 1:5 (0,1 мл исследуемой сыворотки,+ 0,4 мл изотонического раствора хлорида натрия).
2. Антигеном для постановки РСК могут быть культуры разнообразных микробов, бактериальные белки и экстракты, полученные из микробных культур, патологически измененных и нормальных органов и тканей. Особенности приготовления антигена определяются характером инфекционного процесса и особенностями его возбудителя.
3. Комплементом является смесь сывороток, полученная от 3-5 здоровых морских свинок, или сухой комплемент в ампулах.
Непосредственно перед употреблением сыворотку морской свинки разводят изотоническим раствором хлорида «атрия в отношении 1: 10, получая основной раствор.
4. Гемолитическую сыворотку перед постанов кой опыта инактивируют прогреванием при температуре 56 °С в течение 30 мин. Для постановки основного опыта РСК, а также для титрования комплемента и антигена применяют гемолитическую сыворотку в тройном титре. Например, если титр гемолитической сыворотки 1: 1800, в реакции применя ют разведение сыворотки 1: 600.
5. Эритроциты получают из дефибринированной кро ви барана. Кровь для удаления пленок фибрина фильтруют через трехслойный марлевый фильтр. Полученный фильтрат центрифугируют, сыворотку отсасывают и сливают, а эритро циты промывают 3-4-кратным центрифугированием с изото - «ическим раствором хлорида натрия. При последнем промы вании эритроцитов надосадочный слой жидкости должен быть совершенно прозрачным. Из отмытых эритроцитов готовят 3% взвесь в изотоническом растворе хлорида натрия. Подготовив указанным выше способом ингредиенты, участвующие в РСК, приступают к титрованию гемолитической сыворотки, комплемента и антигена.
Реакция гемолиза.
Реакция гемолиза (РГ) – это разрушение эритроцитов при действии антител при участии комплемента.
Компоненты РГ.
1. Антиген - 3% взвесь эритроцитов на изотоническом растворе хлорида натрия;
2. Антитело - гемолитическая сыворотка – сыворотка, содержащая антитела к эритроцитам (гемолизины); сыворотку получают путем иммунизации кроликов эритроцитами барана;
3. Комплемент – система белков крови, которые адсорбируюся на комплексе антиген-антитело и формируют мембраноатакующий комплекс, который разрушает антиген, т.е. разрушает эритроциты или, по-другому, вызывает лизис эритроцитов (гемолиз ). В качестве комплемента используется свежеприготовленная сыворотка крови морских свинок.
Если в пробирку поместить в определенных количествах эритроциты, гемолитическую сыворотку и комплемент, то в течение нескольких минут произойдет разрушение (гемолиз) эритроцитов, в результате чего смесь из темно-красной станет розовой ("лаковая кровь").
Реакция гемолиза используется в качестве индикатора при постановке реакции связывания комплемента.
Реакция связывания комплемента (РСК)– это сложная серологическая реакция, в которой участвуют 2 системы антиген-антитело и комплемент. 1-ая система – специфическая , 2-ая – гемолитическая система.
Эта реакция разработана Ж.Борде и О.Жангу, которые установили, что при образовании комплекса антиген-антител с этим комплексом связывается комплемент. Видимого эффекта при этом не наблюдается , поэтому для выявления связывания комплемента (а следовательно, и для выявления образования комплекса антиген-антитело при их соответствии друг другу), т.е. в качестве индикатора используется 2-ая – гемолитическая система.
РСК используется чаще для серодиагностики (обнаружения антител к возбудителю заболевания в сыворотке крови больного) гонореи, сифилиса, коклюша, сыпного тифа и др. риккетсиозов и многих вирусных заболеваний. РСК также используется для сероидентификации.
Компоненты РСК.
1. Антиген – экстракты микробов, гаптены, реже – взвесь микробов, т.е. антиген может быть как корпускулярным (нерастворимым), так и молекулярным (растворимым).
2 . Антитело – сыворотка крови больного человека (при серодиагностике) или иммунная диагностическая сыворотка, содержащая известные антитела (при сероидентификации).
3. Эритроциты барана – антигены гемолитической реакции.
4. Гемолитическая сыворотка – сыворотка, содержащая антитела к эритроцитам барана. Сыворотку получают путем иммунизации кролика эритроцитами барана.
5. Комплемент – свежеприготовленная сыворотка крови морских свинок (жидкая или лиофильно высушенная).
6. Электролит – изотонический раствор хлорида натрия.
Постановка РСК.
Перед постановкой опыта антиген, сыворотка больного, гемолитическая сыворотка и комплемент титруются (определяется их титр). Сыворотка больного прогревается при 56°С в течение 30 мин.
РСК проводят в 2 фазы .
I фаза – специфическая : в одной пробирке готовят специфическую систему - смешивают равные количества известного антигена, сыворотки больного и комплемента, в другой пробирке готовят гемолитическую систему – смесь эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, пробирки ставят в термостат при 37°С на 30 мин. Одновременно готовят контроли на антиген, комплемент и гемосистему, контрольные пробы с сывороткой заведомо больного человека (положительная сыворотка) и заведомо здорового человека (отрицательная сыворотка) и также помещают в термостат на 30 мин.
II фаза – индикаторная : в исходную смесь и во все контрольные пробирки добавляют одинаковые количества гемолитической системы и учитывают результаты реакции после выдерживания в термостате 30 мин.
Учет результатов РСК проводятпри безупречных результатах в контролях.
Положительная реакция (человек болен и в его сыворотке имеются соответствующие антитела к возбудителю заболевания - антигену): в I фазе в специфической системе образуются комплексы антиген-антитело, с которыми связывается комплемент, после добавления гемолитической системы во II фазе гемолиз не наблюдается, так как комплемент связан 1-ой специфической системой. Видимый эффект – образование осадка эритроцитов.
Отрицательная реакция (человек здоров и в его сыворотке нет антител к возбудителю заболевания): комплексов антиген-антитело не образуется и комплемент в I фазе остается свободным, после добавления гемолитической системы во II фазе комплемент связывается с обязательно имеющимися здесь комплексами антиген-антитело (это комплексы эритроциты-антиэритроцитарные антитела) и вызывает гемолиз эритроцитов. Видимый эффект – гемолиз эритроцитов – "лаковая кровь".
В диагностике инфекционных заболеваний также используютсяреакция нейтрализация (РН) токсина антитоксической сывороткой , реакция иммунофлюоресценции (РИФ), радиоиммунный анализ (РИА), иммуноферментный анализ (ИФА).
В основе реакции лежат два явления - бактериолизис и гемолиз. В их проявлении участвует комплемент. Поэтому в РСК применяют две системы компонентов: 1) обеспечивает феномен бактериолизиса и используется для диагностических целей; 2) гемолитическая, индикаторная, вспомогательная; позволяет установить, связался или не связался комплемент в первой системе (см. схему цв. рис. I). Ранее в качестве антигена использовали взвесь бактерий, поэтому первая система была названа бактериолитической (в положительных случаях происходил лизис бактерий).
Постановку РСК осуществляют в два этапа. На первом этапе готовят бактериолитическую систему: в пробирках смешивают по 0,5 мл исследуемой сыворотки с антигеном, добавляют комплемент в строго определенной дозе (титре). Смесь антиген - сыворотка-комплемент (бактериолитическая система) выдерживают в водяной бане (или термостате) 20...40 мин при 37...38 "С. Результат взаимодействия компонентов в пробирке невидим, жидкость остается прозрачной и бесцветной. Чтобы определить, связался ли комплемент в бактериолитической системе, осуществляют второй этап реакции: в пробирки добавляют компоненты гемолитической системы - отмытые эритроциты барана и инактивированную гемолитическую сыворотку, как показано в схеме. Все компоненты бактериолитической системы встряхивают для перемешивания в пробирке, помещают в водяную баню при 37...38 "С на 20...40 мин. Затем добавляют компоненты гемологической системы, вторично все встряхивают и вновь помещают в водяную баню на 10...15 мин.
Предварительный учет результата. Если сыворотка получена от больного животного, то в ней содержатся антитела, которые соединяются со специфическим антигеном. С этим комплексом (антиген - антитело) связывается комплемент - гемолиз не происходит, результат положительный.
В сыворотке от здорового животного антитела отсутствуют: комплекс антиген - антитело не образуется, комплемент в бактериологической системе не связывается. При добавлении эритроцитов и гемолизина (это между собой антиген и антитело) комплемент реагирует с этим комплексом - произойдет гемолиз, результат отрицательный (см. цв. рис. II).
Окончательный учет результата. Пробирки оставляют при комнатной температуре на 15...20 ч. Если в бакте-риолитической системе сыворотка была от больного животного, в пробирке образуется специфический комплекс антиген - антитело, который адсорбирует (связывает) весь добавленный комплемент. Следовательно, во второй, гемолитической, системе гемолиза не произойдет, эритроциты осядут на дно пробирки, надоса-дочная жидкость прозрачная. Результат РСК положительный.
Если в исследуемой сыворотке нет специфических антител к используемому антигену (в случаях, когда сыворотка от здорового животного), в бактериолитической системе комплекс антиген - антитело не образуется и, следовательно, комплемент в данной системе не адсорбируется, а остается свободным. При добавлении компонентов гемолитической системы (во второй фазе реакции) комплемент вступает во взаимодействие со вторым комплексом (гемолизин -эритроциты), происходит гемолиз эритроцитов - осадок не образуется, жидкость в пробирке лаково-красного цвета. Результат РСК отрицательный.
РСК. используют: 1) для обнаружения в сыворотке больного животного специфических антител (при диагностике бруцеллеза, перипневмонии, сапа, лептоспироза, трипанозомоза и др.); 2) для выявления в исследуемом материале специфического антигена (бактериального или вирусного) при наличии специфической иммунной сыворотки.
Для постановки РСК необходимо иметь: пробы сывороток, поступившие для исследования; две сыворотки, заведомо позитивные (стандартные, обеспечивающие положительный результат), и две нормальные сыворотки. Все сыворотки в разведении 1: 10 инактивируют при 56...58 °С 30 мин; антиген в разведении согласно титру; комплемент, разведенный в соответствии с установленным титром при титровании в бактериолитической системе; гемолизин в рабочем титре; эритроциты барана (I: 40); физиологический раствор, градуированные пипетки, пробирки, штативы, водяную баню на 37...38 °С.
Перед постановкой РСК кровь барана дефибринируют, эритроциты отмывают физиологическим раствором путем центрифугирования до полной прозрачности надосадочной жидкости, которую удаляют отсасыванием, а осажденные эритроциты разводят в физиологическом растворе 1:40 (2,5 %). Антиген разводят согласно титру, указанному на этикетке биофабрикой. Гемолизин и комплемент перед постановкой РСК титруют.
Антиген для РСК готовят на биофабриках. Обычно это экстракты разрушенных микробных взвесей {или вируссодержа-гдей ткани). Антигены не должны обладать гемолизирующим действием, что контролируется в процессе постановки реакции (в пробирку наливают 1...2 дозы антигена и 0,5 мл взвеси эритроцитов: гемолиза не должно быть). На ампуле с антигеном биофабрика указывает, что он предназначен для РСК (сапной, бруцеллезный или другой). На упаковочной коробке указаны номер серии, дата изготовления, срок годности, активность антигена, то есть в каком разведении его надлежит использовать при постановке РСК (1:100, 1:150 и др.). При некоторых заболеваниях антигеном служат другие материалы; например, для диагностики перипневмо-нии крупного рогатого скота антигеном для РСК служит лимфа теленка, экспериментально зараженного подкожно или интра-плеврально. При длительном хранении антигенов их титр вновь проверяют в лаборатории по специальной схеме титрования.
Испытуемые сыворотки, поступившие для исследования, разводят физиологическим раствором 1: 5 или 1: 10, инактивируют прогреванием в водяной бане для разрушения собственного комплемента 30 мин при 56...58 "С (сыворотки ослов, мулов, лошаков - при 61 °С).
Гемолизин готовят на биофабриках путем гипериммунизации кроликов отмытыми эритроцитами барана. Для этого кроликам внутривенно вводят 4...5 раз с 2...3-дневными интервалами 40...50%-ю взвесь эритроцитов. Через неделю после последней инъекции у кроликов берут кровь, стерильно отсасывают сыворотку, инактивируют ее, консервируют глицерином 1:1 или 0,5%-м фенолом, титруют, разливают по ампулам. В лабораториях перед постановкой РСК вновь титруют.
Схема титрования гемолизина. Необходимо подготовить: i) разведение комплемента 1: 20; 2) гемолизин 1:100 (0,2 мл гемолизина+9,8 мл физраствора); 3) взвесь эритроцитов барана 1:40; 4) физиологический раствор NaCl.
Для постановки реакции титрования в штативе размещают два ряда пробирок - один вспомогательный только для приготовления разведений гемолизина, второй - собственно для титрования. В первую пробирку каждого ряда вносят исходное разведение гемолизина 1: 100, а затем производят последовательное разведение. Все пробирки встряхивают и помещают в водяную баню при 37...38°С на 10...15 мин. Учет результата: в данном примере наименьшее количество (или его наибольшее разведение), давшее полный гемолиз, составляет 1: 2000, т. е. это его фактический титр. Рабочий титр в 2 раза концентрированнее - 1:1000.
По 0,5 мл (указано стрелками) каждого разведения из пробирок первого ряда переносят в отдельные пробирки второго ряда. Во все пробирки второго ряда добавляют по 0,5 мл комплемента (1: 20), по 0,5 мл эритроцитов барана (2,5%-я взвесь, или 1: 40) и по 1 мл физраствора, чтобы объем жидкости в каждой пробирке составлял 2,5 мл.
Примечание. Исходя из того что в окончательной постановке РСК будут участвовать 5 компонентов по 0,5 мл, которые составят объем 2,5 мл, на протяжении всей работы этот объем соблюдается.
Пробирки встряхивают и помещают в водяную баню на 10...15 мин. Гемолиз прежде всего произойдет в пробирках с большим содержанием гемолизина (наименьшим его разведением - 1: 500, 1:1000...). Наименьшее количество гемолизина (наибольшее его разведение), вызвавшее полный гемолиз эритроцитов в данных условиях, называется предельным (фактическим) титром гемолизина. Для дальнейшей работы гемолизин используют в 2 раза концентрированнее, то есть в удвоенном количестве, удвоенном титре, который называют рабочим титром. Например, если фактический титр I: 2500 (или 1: 2000), то рабочий титр соответствует разведению 1:1250 (или 1: Ш00).
К о м п л е м е н т -это составная часть свежей сыворотки, лимфы, тканевых жидкостей разных видов животных (и человека); открыт Бухнером (1889). У насекомых комплемент отсутствует. Комплемент - вещество белковой природы, сложной структуры, быстро инактивируется при нагревании, длительном хранении, воздействии ультрафиолетового излучения, сильном встряхивании, фильтрации через керамические фильтры, добавлении каолина, кислот, щелочей, алкоголя, ацетона, хлороформа, дистиллированной воды, взвеси бактерий и др. Комплемент можно консервировать добавлением на 100 мл сыворотки морской свинки 5 г сульфата натрия, 4 г борной кислоты. Активность комплемента при этом сохраняется до полугода. Лучший способ консервирования - высушивание в условиях вакуума при низкой температуре (лиофилизация). В запаянных ампулах в таком состоянии он сохраняется два года. Перед каждой постановкой РСК активность комплемента проверяют титрованием, то есть определяют его титр - оптимальное количество, необходимое для данной реакции. Комплемент титруют дважды: в гемолитической и бактери-олитической системах.
Для титрования комплемента в гемолитической системе готовят компоненты: комплемент в разведении 1: 20 (1 мл комплемента + 19 мл физраствора); гемолизин, разведенный соответственно рабочему титру; взвесь отмытых эритроцитов барана (1: 40), физиологический раствор. В штатив ставят пробирки и разливают в них градуированной пипеткой разное количество комплемента с интервалом 0,03 мл (0,13; 0,16; 0,19; 0,22..: до 0,43 мл). Затем добавляют остальные компоненты (рис. 57). Все пробирки встряхивают и помещают в водяную баню при 37...38 "С на 10...15 мин и проводят учет результата.
Учет результата: наименьшее количество комплемента, обеспечившее полный гемолиз (в данном примере - 0,25 мл), принимают за титр комплемента.
Результат титрования начинают учитывать в пробирках с наибольшим содержанием комплемента, где прежде всего ожидается гемолиз. Наименьшее количество комплемента, обеспечившее полный гемолиз эритроцитов при данных условиях, называют титром комплемента в гемолитической системе.
Для титрования комплемента в бактериолитической системе необходимо иметь все компоненты реакции: комплемент (1:20), эритроциты (1: 40), гемолизин в рабочем титре, две позитивные и две нормальные сыворотки, специфический антиген. Сыворотки разводят физраствором 1: 10, инактивируют 30 мин при 56...58 X. Каждую сыворотку разливают в два ряда пробирок по 0,5 мл. В пробирки каждого ряда добавляют комплемент в возрастающих количествах, как при титровании в гемолитической системе; начинают с количества, принятого за титр в гемолитической системе, затем в каждой последующей пробирке дозу увеличивают на 0,03 мл, выравнивая объем до 0,5 мл физиологическим раствором.
После этого в один ряд пробирок с позитивной и нормальной сыворотками добавляют по 0,5 мл антигена, во второй ряд каждой сыворотки-по 0,5 мл физиологического раствора. Все пробирки встряхивают и ставят в водяную баню на 30...40мин. Затем во все пробирки вносят по 0,5 мл гемолизина и по 0,5 мл эритроцитов, встряхивают и вторично помещают в водяную баню на 10...15 мин. Наименьшее количество комплемента, обеспечившее полный лизис эритроцитов в обоих рядах пробирок (с антигеном и без антигена) двух нормальных сывороток, в одном ряду (без антигена) каждой позитивной сыворотки и с полной задержкой (отсутствием) гемолиза в рядах позитивных сывороток с антигеном (в тех же дозах комплемента), называют титром комплемента, который используют в постановке главного опыта РСК при диагностических исследованиях.
Главный опыт РСК (собственно диагностическое исследование). В штативы ставят два ряда пробирок по количеству исследуемых проб сывороток. По 0,5 мл каждой инактивирован-ной сыворотки наливают в две пробирки: в одну добавляют антиген - 0,5 мл, в другую (без антигена) 0,5 мл физраствора и, добавив комплемент, составляют бактернолитическую систему, а затем добавляют гемолитическую.
Необходимые компоненты: 1) исследуемая сыворотка, инактивированная, разведенная физиологическим раствором 1: 10; 2) специфический антиген, разведенный согласно титру, указанному биофабрикой на этикетке упаковки; 3) комплемент в установленном титре; 4) гемолизин в рабочем титре; 5) взвесь отмытых эритроцитов барана 1: 40; 6) физиологический раствор NaCI. Исследуемые сыворотки разливают в два ряда пробирок. Для любого количества исследуемых сывороток в качестве контроля используют заведомо позитивную сыворотку (дающую положительный результат) и нормальную (от здорового животного, дающую отрицательный результат).
Пробирки с компонентами бактериолитической системы встряхивают, помещают в водяную баню на 20...40 мин при 37...38°С. Пробирки бактериолитической системы второго ряда без антигена встряхивают, помещают в водяную баню при тех же условиях.
Затем во все пробирки первого и второго ряда добавляют компоненты гемолитической системы, вторично помещают в водяную баню на 10..15 мин. Во всех пробирках второго ряда без антигена наступает полный гемолиз.
До получения окончательного результата пробирки оставляют при комнатной температуре на 18...24 ч. Во всех пробирках без антигена, независимо, от больного или от здорового животного получена сыворотка, должен наступить гемолиз, в пробирках первого ряда с антигеном более четкий результат выражен при отстаивании.
Показания реакции в пробирках с испытуемыми сыворотками считают достоверными, если в пробирках с позитивными сыворотками и антигеном гемолиз отсутствует при полном гемолизе в пробирках с позитивной сывороткой без антигена и во всех пробирках с заведомо нормальной сывороткой (рис. 61).
Данная реакция должна сопровождаться контролями антигена, комплемента, гемолизина, эритроцитов. Для этого в отдельные пробирки наливают антиген с эритроцитами барана; комплемент с эритроцитами без гемолизина; гемолизин с эритроцитами без комплемента; эритроциты и физиологический раствор. Объем в каждой пробирке доводят физраствором до 2,5 мл. Пробирки встряхивают, помещают в водяную баню при 37 °С на 20 мин. Во всех контрольных пробирках гемолиз должен отсутствовать.
Результат РСК принято выражать в «крестах». Показатели положительного результата реакции: + + + + (///) - полное осаждение эритроцитов (нет гемолиза), жидкость над осадком бесцветная, + + + (///) - жидкость над осадком едва заметно окрашена в желтоватый цвет. Сомнительный результат реакции: наличие осевших на дне эритроцитов и частичное окрашивание надосадоч-ной жидкости за счет лизиса некоторой части эритроцитов обозначают + + - (++), то есть два и два с половиной креста. Резко выраженный гемолиз (без осадка) или с небольшим осадком (+) - отрицательный результат.
Реакция длительного связывания комплемента (РДСК). Более эффективная по чувствительности в отличие от обычной классической РСК. Суть реакции заключается в том, что бактериолити-ческую систему выдерживают при трех различных температурных режимах: после смешения компонентов при комнатной температуре 15 мин, затем при низкой температуре (4 °С) в рефрижераторе 18...20 ч и в водяной бане 15 мин. После этого добавляют гемолитическую систему, встряхивают, вновь помешают в водяную баню и производят учет реакции, как при РСК. Подтверждена эффективность РДСК при диагностике ряда инфекционных болезней (туберкулез, вибриоз, бруцеллез идр,).
Реакция подавления связывания комплемента (РПСК), или реакция торможения, непрямая РСК. В данной реакции участвует еще один компонент - стандартная иммунная сыворотка, содержащая антитела к антигену, используемому обычно для диагностики и, следовательно, положительно реагирующая в классической РСК.
Исследуемую сыворотку смешивают с антигеном и некоторое время выдерживают без комплемента. Затем добавляют комплемент и стандартную сыворотку, пробирки встряхивают и помещают в водяную баню на 20...30 мин, после чего добавляют гемолитическую систему и вновь ставят в водяную баню. Если нет гемолиза-результат отрицательный, потому что испытуемая сыворотка не реагировала с антигеном и последний вступил в реакцию со стандартной сывороткой, связав комплемент. Если исследуемая сыворотка от больного животного, она содержит специфические антитела по отношению к антигену, т. е. происходит реакция между антигеном и антителами, не связывая комплемент. Антиген, взаимодействуя с антителами исследуемой сыворотки, не вступает в реакцию (подавляется) со стандартной (заведомо известной специфической) сывороткой, комплемент остается свободным и вступает в реакцию в гемолитической системе - происходит гемолиз, результат реакции положительный по отношению к исследуемой сыворотке.
Метод флуоресцирующих антител (МФА). Возможности данного метода обусловлены специфичностью первой фазы серологических реакций с высокой чувствительностью люминесцентного анализа. Для осуществления МФА необходимо иметь высокоспецифические иммунные люминесцирующие сыворотки. Известно, что в различных серологических реакциях, используемых в микробиологической практике, участвуют преимущественно три компонента: бактерийный антиген, антитело и комплемент. Все три компонента, по сути, являются антигенами, и против каждого из них могут быть получены иммунные сыворотки и, соответственно, люминесцирующие антитела. В зависимости от того, какого типа люминесцируюшую сыворотку используют (против бактерийного антигена, антибактериальных антител, комплемента), различают три основных варианта метода флуоресцирующих антител: прямой (1) и непрямой (2) варианты и модификация непрямого варианта с использованием комплемента. Иммунологическая реакция между антигеном и антителом осуществляется в этих модификациях непосредственно на предметном стекле. Для фиксации микроорганизмов применяют органические растворители: ацетон, этанол, метанол, диоксан, а также обычные фиксаторы, используемые в микробиологической практике: формалин, смесь Никифорова, жидкость Карнуа и др.
Прямой вариант. На готовый препарат наносят специфическую люминесцирующую сыворотку на определенное время, затем излишек сыворотки сливают, препарат промывают и просматривают в люминесцентном микроскопе. Этот метод применяют для обнаружения бактерий в патологическом материале, объектах внешней среды, а также для идентификации возбудителей заболеваний в культурах.
Непрямой (двухступенчатый) вариант. На первом этапе происходит специфическое соединение антигена с соответствующим антителом немеченой сыворотки. На втором этапе специфическое немеченое антитело связывается с антивидо-вым люминесцирующим антителом, содержащимся в сыворотке животного, иммунизированного глобулинами (или цельной сывороткой крови) того вида животных, от которых была использована иммунная сыворотка.
Непрямой антикомплементарный (трехступенчатый) вариант. Первый этап: образование комплекса антиген - немеченое антитело. Второй этап: наслаивание нормальной сыворотки, содержащей комплемент. Третий этап: комплекс антиген - антитело - комплемент обрабатывают люми-несцируюшей антикомплементарной сывороткой, приготовленной при иммунизации кроликов сывороткой того вида животного, которое служило источником комплемента.
Непрямые варианты МФА можно использовать как для выявления антигенов, так и для определения антител. Кроме того, для постановки двухступенчатого варианта нужно иметь ограниченный набор антивидовых люминесцирующих сывороток (против глобулинов быка, барана, лошади, свиньи и др.), а для антикомплементарного варианта достаточно иметь всего одну люминесцирующую сыворотку против глобулинов морской свинки.
Методика и м м у н о л ю м и н е с u e н т н о и микроскопии. В практике ветеринарных бактериологических лабораторий используют люминесцирующие сыворотки биофабричного производства. В зависимости от типа флуорохрома люминесцирующие сыворотки обеспечивают либо зеленое свечение объекта (краситель на основе флуоресценна), либо красное (краситель на основе родамина).
Для проведения иммунолюминесцентной микроскопии следует на обезжиренное тонкое без царапин предметное стекло нанести исследуемый материал. При исследовании органов и тканей животных готовят препараты-отпечатки тонким слоем. Препараты подсушивают на воздухе и помещают в фиксирующую жидкость (этанол - 15 мин, метанол - 5 мин, ацетон - 5 мин). Если необходимо, после фиксации препараты некоторое время можно сохранять в холодильнике. Последовательность и дальнейшие процедуры зависят от применяемого варианта МФА (одноступенчатый, двухступенчатый, трехступенчатый). Обработку препаратов люминесцирующими сыворотками, а также немечеными сыворотками первой ступени и комплементом проводят при 37 X в условиях влажной камеры {чашки Петри с увлажненной фильтровальной бумагой) .
Одноступенчатый вариант. На предметное стекло с фиксированным исследуемым материалом наносят люминесцирующую сыворотку (в разведении, указанном на ампуле). Препарат помещают во влажную камеру на 15...20 мин при 37 "С. Затем его промывают забуференным физиологическим раствором (рН 7,4) в сосуде, меняя раствор через 5...10 мин несколько раз, или под струей водопроводной воды в течение 3...5 мин. Вода должна быть нейтральной и не содержать железа. Затем препарат (на одном стекле может быть несколько мазков) подсушивают на воздухе или фильтровальной бумагой, после чего наносят каплю забуференного глицерина с рН 8,0 и покрывают покровным стеклом. На покровное стекло наносят иммерсионную нефлуоресцирующую жидкость и микроскопируют.
Двухступенчатый вариант. На предметное стекло с исследуемым материалом наносят каплю иммунной немеченой сыворотки первой ступени. Препарат помещают в термостат в условиях влажной камеры на 15...20 мин. Затем его промывают, как описано выше, подсушивают и наносят каплю люминесцирующей антиви-довой сыворотки. Препарат снова помещают в термостат в условиях влажной камеры на 15...20 мин. Повторяют процедуру промывания и высушивают фильтровальной бумагой. Наносят забу-ференный глицерин, покрывают покровным стеклом, наносят нефлуоресцирующую иммерсионную жидкость и микроскопируют.
Трехступенчатый вариант (антикомплементарный). На предметное стекло с исследуемым материалом наносят каплю иммунной немеченой сыворотки первой ступени. Препарат помещают в термостат, как описано выше, подсушивают и на мазок наносят каплю комплемента. Препарат вновь помещают во влажную камеру и в термостат на 15...20 мин, после чего промывают и наносят люминесцирующую антикомплементарную сыворотку. Последующие процедуры аналогичны одноступенчатому варианту.
Приготовление и обработка контрольных препаратов. 1. Для прямого варианта с целью определения специфичности реакции между антигеном с люминесцирующей сывороткой следует этой же сывороткой обработать препараты-мазки из гетерологичных видов микробов. Эти виды должны быть близкие в антигенном отношении, но отличающиеся по морфологии от исследуемых микроорганизмов; далекие в антигенном отношении к исследуемым микроорганизмам, но сходные по морфологии и распространению с ними. Препараты-отпечатки обрабатывают люминесцирующей нормальной сывороткой.
2. Для непрямого варианта необходимо иметь три контрольных препарата, обработанных нормальной сывороткой, люминесцирующей антивидовой сывороткой без иммунной немеченой сыворотки и люминесцирующей антивидовой сывороткой с заведомо иммунной сывороткой первой ступени.
3. Для непрямого варианта с комплементом необходимы контрольные препараты, при обработке которых иммунная сыворотка заменена нормальной сывороткой того же вида и в тех же разведениях, а также препараты, обработанные всеми ингредиентами, кроме иммунной сыворотки.
Оценка результатов. Учитывают яркость, цвет, локализацию и структуру свечения. Бактерии, окрашенные люминесцирующей сывороткой, меченной изотиоцианатом флуоресце-ина, имеют яркое зеленое свечение по периферии в виде ободка или ореола, центральная часть светится слабо. Такое свечение называется специфическим в отличие от неспецифического, когда все тело клетки светится равномерно. Чем более выпукло лежит бактерийная клетка в препарате, тем резче ободок. Объяснить такое свечение можно тем, что с единицы площади «периферии» клетки на сетчатку глаза наблюдателя проецируется в несколько раз больше антител, чем с центральной части клетки микроба. Следует иметь в виду, что у пластичных клеток (лептоспиры, вибрионы) нет контура или он заметен слабо. У клеток, погруженных в тканевую жидкость, и у молодых бацилл сибирской язвы контур обычно выражен нерезко.
Интенсивность свечения оценивают по четырехкрестовой системе: + + + + - очень яркая флуоресценция по периферии микробной клетки, четко контрастирующая с темным телом клетки; + + + - яркая флуоресценция периферии клетки; + + - слабое свечение периферии клетки; + - нет контрастного свечения периферии тела микробной клетки. Отсутствие специфического свечения обозначают «-» (видны тени микроорганизмов). При диагностике различных возбудителей положительным результатом чаще всего считают специфическое свечение бактерийных клеток не ниже чем на четыре или на три креста.