Bersaglio: Padroneggia la tecnica per eseguire reazioni di agglutinazione e reazioni di precipitazione per la diagnosi di malattie infettive.
Modulo 1. Morfologia e fisiologia dei microrganismi. Infezione. Immunità.
Argomento 16: Reazione di agglutinazione. Reazione di precipitazione.
Pertinenza dell'argomento. Sotto immunità implicano l'immunità del corpo agli agenti infettivi e non infettivi ( microrganismi patogeni, proteine estranee e altre sostanze). Questi agenti sono chiamati antigeni. L'immunità può essere congenita o acquisita. Congenito– quando si formano dispositivi di protezione tissutale e umorale, causando l’immunità alle malattie infettive trasmesse per via ereditaria.
Acquisita– effettuato dal sistema immunitario dell’organismo sotto forma di produzione di anticorpi o accumulo di linfociti sensibilizzati. È diviso in naturale e artificiale. Secondo il meccanismo d'azione in cui è suddiviso attiva e passiva. In tutte le reazioni immunologiche, il componente principale è l'antigene.
Funzione principale sistema immunitario, che è costituito da tessuto linfoide, è riconoscere gli agenti estranei (antigeni) e neutralizzarli.
Gli antigeni possono entrare nel corpo attraverso Vie aeree, tratto digerente, attraverso la pelle e le mucose. Ogni antigene stimola la formazione di speciali sostanze proteiche: anticorpi.
Antigeni si dividono in completi ed inferiori (apteni). Antigeni completi indurre una risposta immunitaria completa. Antigeni difettosi Da soli non inducono una risposta immunitaria, ma talvolta acquisiscono questa capacità se coniugati con trasportatori proteici ad alto peso molecolare. Inoltre, ci sono antigeni: emiapteni, proantigeni, eteroantigeni e isoantigeni.
Anticorpi sono immunoglobuline provenienti da siero di sangue umano o animale. Gli anticorpi si formano dopo un'infezione e come risultato dell'immunizzazione con batteri indeboliti o uccisi, rickettsie, virus, tossine e altri agenti. Anticorpi– proteine immunoglobuline Composizione chimica appartengono alle glicoproteine. In base alla loro struttura e alle proprietà immunobiologiche, le immunoglobuline sono suddivise in 5 classi: IgM, IgG, IgA, IgE, IgD.
Anticorpi normali trovato in persone e animali che non sono immunizzati. Anticorpi specifici si formano a seguito di infezioni o immunizzazioni.
Si chiama la reazione tra un anticorpo e un antigene sierologico. I test sierologici sono altamente specifici e vengono utilizzati nella diagnosi di molte malattie infettive. Si distingue tra reazioni di agglutinazione e di precipitazione.
1. Reazione di agglutinazione (RA) si basa sull'interazione di un antigene (agglutinogeno) e di un anticorpo (agglutinina), in cui i corpi microbici si uniscono e precipitano in presenza di un elettrolita. Esistono varie modifiche della reazione di agglutinazione.
Valore più alto Avere:
- Agglutinazione macroscopica (espansa) in provette. Una sospensione di microbi (diagnosticum) viene aggiunta al siero del paziente e dopo 1 ora in un termostato a una temperatura di 37 gradi, viene annotata la diluizione (titolo) del siero alla quale si è verificata la reazione. Una reazione di agglutinazione è considerata positiva quando sul fondo della provetta si forma un precipitato con marcata limpidezza del liquido surnatante. Questo precipitato è chiamato agglutinato.
In base alla natura dell'agglutinato si distinguono l'agglutinazione a grana fine (O) e quella a grana grossa (H). Un agglutinoscopio viene utilizzato per identificare l'agglutinato a grana fine. La registrazione dei risultati inizia con le provette di controllo. Viene considerata il suo titolo l'ultima diluizione del siero in cui si osserva l'agglutinazione.
Scopo della reazione: rilevamento degli anticorpi nel siero del paziente.
- Microscopico (accelerato ) agglutinazione approssimativa sul vetro. Una goccia di coltura batterica viene aggiunta a una goccia di siero immunitario diagnostico e miscelata uniformemente. La reazione avviene a temperatura ambiente in 5-10 minuti. Poi si fa la contabilità. Se la reazione è positiva, nella goccia di siero si nota un accumulo di batteri sotto forma di granuli o scaglie. Scopo della reazione: determinazione del tipo di agente patogeno utilizzando un siero diagnostico noto.
- Reazione di emoagglutinazione indiretta (passiva) (IRHA). L'essenza di questa reazione è che i globuli rossi delle pecore sono in grado di adsorbire gli antigeni sulla loro superficie. Sotto l'influenza di anticorpi specifici, i globuli rossi si uniscono e precipitano, formando emoagglutinato sul fondo. La reazione è altamente sensibile e specifica. L'RNGA consente di rilevare una quantità minima di anticorpi e antigeni difettosi di natura polisaccaridica. Questa reazione viene utilizzata nella diagnosi di molte malattie infettive (tifo e tifo, febbre paratifo, tubercolosi, ecc.).
2. Reazione di precipitazione (RP ) – precipitazione del complesso antigene-anticorpo. La differenza principale tra RP e RA è che nell'RA viene utilizzato un antigene corpuscolare, mentre nell'RP l'antigene è una sostanza colloidale di natura proteica o polisaccaridica. In questa reazione, l'antigene è chiamato precipitinogeno e gli anticorpi sono chiamati precipitine. La reazione viene effettuata in provette stratificando la soluzione antigenica sul siero immunitario. Con un rapporto ottimale tra antigene e anticorpi al confine
Queste soluzioni formano un anello di precipitato. Se come antigene si utilizzano estratti bolliti e filtrati di organi e tessuti, la reazione è chiamata reazione di termoprecipitazione (reazione di Ascoli, utilizzata nella diagnosi antrace, peste, tularemia, ecc.).
Le reazioni di precipitazione nell'agar sono diventate molto diffuse: metodo di diffusione semplice, metodo di doppia diffusione.
Un tipo di precipitazione è reazione di flocculazione– per determinare l’attività del siero tossoide o antitossico. Inoltre, questa reazione può essere utilizzata per determinare la tossigenicità dei ceppi di Corynebacterium diphtheriae.
Obiettivi specifici:
· Spiegare il ruolo degli antigeni come induttori di una risposta immunitaria;
· Descrivere la struttura degli antigeni, compresi gli antigeni dei microrganismi;
· Descrivere il meccanismo della reazione di agglutinazione;
· Descrivere il meccanismo della reazione di precipitazione.
Essere in grado di:
· Spiegare il ruolo degli antigeni come induttori di una risposta immunitaria;
· Descrivere la struttura degli anticorpi (diverse classi di immunoglobuline);
· Analizzare il meccanismo di interazione degli anticorpi con gli antigeni;
· Interpretare i risultati della reazione di agglutinazione;
· Interpretare i risultati della reazione di precipitazione;
· Analizzare i risultati ottenuti.
1. Definizione del concetto di “antigeni”, “anticorpi”.
2. Il ruolo degli antigeni come induttori della risposta immunitaria.
3. Struttura degli anticorpi (diverse classi di immunoglobuline).
4. Il meccanismo d'interazione degli anticorpi con gli antigeni.
5. Reazioni immunitarie, loro ruolo nella risposta immunitaria e diagnosi delle malattie infettive.
6. Meccanismo della reazione di agglutinazione.
7. Meccanismo della reazione di precipitazione.
Attività pratiche svolte in classe:
1. Esecuzione di una reazione di agglutinazione per rilevare gli anticorpi nel siero del paziente.
2. Allestimento di una reazione di microagglutinazione su vetro con sieri diagnostici per identificare una coltura pura di batteri.
3. Valutazione dei risultati della reazione di agglutinazione.
4. Impostazione di una reazione di precipitazione per rilevare l'antigene batterico.
5. Valutazione dei risultati della reazione di precipitazione.
6. Valutazione dei risultati della reazione di emoagglutinazione indiretta.
7. Stesura del protocollo.
Letteratura:
1. Pyatkin K.D., Krivoshein Yu.S. Microbiologia con virologia e immunologia – Kiev: Scuola superiore, 1992.- 431 p.
2. Vorobyov A.V., Bykov A.S., Pashkov E.P., Rybakova A.M. Microbiologia.- M.: Medicina, 1998.- 336 p.
3. Microbiologia medica /A cura di V.P. Pokrovsky. – M.: GEOTAR-MED, 2001. – 768 pag.
4. Korotyaev A.I., Babichev S.A. Microbiologia medica, immunologia e virologia / Libro di testo per università mediche, San Pietroburgo: “Letteratura speciale”, 1998.- 592 p.
5. Timakov V.D., Levashev V.S., Borisov L.B. Microbiologia/Libro di testo - 2a ed., rivista. e aggiuntivi – M.: Medicina, 1983.- 512 p.
6. Appunti delle lezioni.
1. Titov M.V. Malattie infettive.- K., 1995.– 321 pag.
2. Shuvalova E.P. Malattie infettive – M.: Medicina, 1990.- 559 p.
La reazione di agglutinazione si basa sull'interazione specifica degli anticorpi (agglutinine) con intere cellule microbiche o di altro tipo. Come risultato di questa interazione si formano particelle agglomerate che precipitano (agglutinano). Batteri, protozoi, funghi, lieviti, rickettsie, eritrociti e altre cellule, sia vive che uccise, possono partecipare alla reazione di agglutinazione. La reazione avviene in due fasi: la prima è una combinazione specifica di antigene e anticorpo, la seconda è aspecifica, cioè la formazione di un agglutinato visibile. La precipitazione dell'agglutinato avviene in presenza di elettroliti, come il cloruro di sodio. I microrganismi nell'agglutinato rimangono vivi, ma perdono la loro mobilità.
La reazione di agglutinazione è ampiamente utilizzata per la diagnosi sierologica delle malattie infettive e la determinazione della struttura antigenica dei microbi isolati. Per determinare la struttura antigenica di un agente patogeno isolato dal corpo di un paziente o di un portatore, viene utilizzato il siero immunitario specifico, ottenuto immunizzando animali (coniglio, asino, pecora) con determinati microrganismi. L'identificazione del microbo viene effettuata in una reazione di agglutinazione su vetro con sieri adsorbiti o monorecettori o in provette con sieri agglutinanti specifici. I sieri adsorbiti contengono anticorpi solo contro antigeni specifici di un dato microbo e i sieri monorecettori contengono anticorpi solo contro uno specifico antigene del patogeno.
I sieri delle specie contengono anticorpi contro tutti gli antigeni di un particolare microbo.
Se appartiene la coltura del microrganismo isolato questa specie determinato mediante agglutinazione con un siero noto al titolo anticorpale indicato sull'etichetta della fiala del siero. Il titolo anticorpale di un siero è considerato la sua ultima diluizione, nella quale si osserva ancora l'agglutinazione della coltura microbica utilizzata per immunizzare l'animale. I sieri adsorbiti e monorecettori vengono solitamente utilizzati non diluiti nella reazione di agglutinazione del vetro.
Quando si determina la presenza di anticorpi nel siero del sangue del paziente, questo viene diluito con una soluzione isotonica di cloruro di sodio a partire da una diluizione da 1: 50 a 1: 800 o più. Ad ogni diluizione viene aggiunta una sospensione di microbi vivi o uccisi. I preparati contenenti microbi uccisi dal calore o dalla formaldeide sono chiamati diagnosticum. I diagnostici ottenuti riscaldando le colture di microrganismi contengono solo antigeni somatici. Quando si utilizza solo formaldeide, i microbi conservano i loro antigeni flagellari.
In presenza di anticorpi nel sangue del paziente, il test diagnostico prelevato nella reazione si attacca e si forma un precipitato (agglutinato) su due provette. In questo caso i risultati della reazione di agglutinazione sono considerati positivi. Nella provetta di controllo, in cui vengono aggiunti la soluzione isotonica di cloruro di sodio e il diagnosticum, la sospensione dei microbi deve essere omogenea ( reazione negativa agglutinazione).
I risultati della reazione di agglutinazione in alcune malattie, come la leptospirosi, vengono presi in considerazione solo microscopicamente in un campo visivo scuro di un microscopio (microagglutinazione). Per effettuare una diagnosi sierologica di una malattia, viene presa in considerazione la malattia diagnostica. Solitamente corrisponde ad una diluizione del siero di 1:100 o 1:200.
Gli anticorpi nel siero del paziente possono essere rilevati mediante la reazione di agglutinazione in caso di febbre tifoide e paratifoide (reazione di Vidal), brucellosi (reazione di Wright), tularemia, ecc.
La reazione di Castellani. Per alcuni malattie infettive o immunizzazione con microrganismi contenenti antigeni di gruppo, nel siero del sangue, oltre agli anticorpi specifici di questo tipo, compaiono anche anticorpi di gruppo. In questo caso, le specie batteriche correlate verranno agglutinate dai sieri risultanti.
Castellani ha proposto un metodo per l'adsorbimento degli anticorpi di gruppo dai sieri immuni, basato sulla loro rimozione con l'aiuto di microrganismi di specie affini che hanno antigeni di gruppo ma mancano di antigeni specifici. Una coltura di tali microrganismi aggiunta al siero adsorbe gli anticorpi del gruppo non specifico e, dopo la rimozione del complesso antigene-anticorpo mediante centrifugazione, nel siero rimangono solo immunoglobuline specifiche. I sieri trattati secondo il metodo Castellani possono essere utilizzati nella reazione di agglutinazione in quanto altamente specifici.
Reazioni immunodiagnostiche. Reazioni antigene-anticorpo e reazioni con componenti marcati. Utilizzo per l'identificazione di microrganismi e la diagnosi di malattie infettive.
Le reazioni immunitarie sono utilizzate negli studi diagnostici e immunologici nei pazienti e persone sane. A questo scopo usano metodi sierologici (dal lat. siero - siero di latte e loghi - insegnamento), cioè metodi per studiare anticorpi e antigeni utilizzando reazioni antigene-anticorpo determinate nel siero del sangue e in altri fluidi, nonché nei tessuti corporei.
La rilevazione di anticorpi contro antigeni patogeni nel siero del paziente consente di formulare la diagnosi della malattia. Gli studi sierologici vengono anche utilizzati per identificare antigeni microbici, varie sostanze biologicamente attive, gruppi sanguigni, antigeni tissutali e tumorali, complessi immunitari, recettori cellulari, ecc.
Quando un microbo viene isolato da un paziente, l'agente patogeno viene identificato studiandolo proprietà antigeniche utilizzando sieri immunodiagnostici, cioè sieri di sangue di animali iperimmunizzati contenenti anticorpi specifici. Questo è il cosiddetto identificazione sierologica microrganismi.
In microbiologia e immunologia, sono ampiamente utilizzate agglutinazione, precipitazione, reazioni di neutralizzazione, reazioni che coinvolgono il complemento, utilizzando anticorpi e antigeni marcati (radioimmunologici, test immunoenzimatici, metodi immunofluorescenti). Le reazioni elencate differiscono nell'effetto registrato e nella tecnica di produzione, tuttavia sono tutte basilari. si basano sulla reazione di interazione dell'antigene con l'anticorpo e vengono utilizzati per rilevare sia gli anticorpi che gli antigeni. Le reazioni immunitarie sono caratterizzate da elevata sensibilità e specificità.
Di seguito sono riportati i principi e gli schemi delle principali reazioni immunodiagnostiche. Viene fornita una tecnica dettagliata per impostare le reazioni. linee guida pratiche per l’immunodiagnostica.
Reazione di agglutinazione - RA(dal lat. aggluti- nazione- adesione) è una reazione semplice in cui gli anticorpi legano antigeni corpuscolari (batteri, eritrociti o altre cellule, particelle insolubili con antigeni adsorbiti su di essi, nonché aggregati macromolecolari). Si verifica in presenza di elettroliti, ad esempio, quando viene aggiunta una soluzione isotonica di cloruro di sodio.
Vengono utilizzate varie opzioni per la reazione di agglutinazione: estesa, indicativa, indiretta, ecc. La reazione di agglutinazione si manifesta con la formazione di scaglie o sedimenti
RA è utilizzato per:
determinazione degli anticorpi nel siero del sangue di pazienti, ad esempio, con brucellosi (reazione di Wright, Heddelson), febbre tifoide e febbre paratifoide (reazione di Vidal) e altre malattie infettive;
determinazione dell'agente patogeno isolato dal paziente;
determinazione dei gruppi sanguigni mediante anticorpi monoclonali contro gli alloantigeni eritrocitari.
Per determinare gli anticorpi in un paziente Metterereazione di agglutinazione dettagliata: aggiungere alle diluizioni del siero sanguigno del paziente diagnosticum(sospensione dei microbi uccisi) e dopo diverse ore di incubazione a 37 °C si osserva la diluizione del siero più alta (titolo del siero) alla quale si è verificata l'agglutinazione, cioè si è formato un precipitato.
La natura e la velocità dell'agglutinazione dipendono dal tipo di antigene e di anticorpi. Un esempio sono le peculiarità dell'interazione dei diagnostici (antigeni O e R) con anticorpi specifici. Reazione di agglutinazione con O-diagnosticum(batteri uccisi dal calore, che si mantengono stabili al calore antigene O) avviene sotto forma di agglutinazione a grana fine. La reazione di agglutinazione con H-diagnosticum (batteri uccisi dalla formaldeide, che conservano l'antigene H flagellare termolabile) è grossolana e procede più velocemente.
Se è necessario determinare l'agente patogeno isolato dal paziente, inserire reazione di agglutinazione indicativa, utilizzando anticorpi diagnostici (siero agglutinante), cioè viene effettuata la sierotipizzazione dell'agente patogeno. Una reazione indicativa viene eseguita su un vetrino. Una coltura pura dell'agente patogeno isolato dal paziente viene aggiunta ad una goccia di siero agglutinante diagnostico ad una diluizione di 1:10 o 1:20. Accanto viene posto un controllo: al posto del siero viene applicata una goccia di soluzione di cloruro di sodio. Quando appare un sedimento flocculante in una goccia contenente siero e microbi, a estesa reazione di agglutinazione in provette con diluizioni crescenti di siero agglutinante, a cui si aggiungono 2-3 gocce della sospensione del patogeno. L'agglutinazione viene presa in considerazione dalla quantità di sedimento e dal grado di limpidezza del liquido. La reazione è considerata positiva se si osserva agglutinazione in una diluizione vicina al titolo del siero diagnostico. Allo stesso tempo, vengono presi in considerazione i controlli: il siero diluito con una soluzione isotonica di cloruro di sodio deve essere trasparente, la sospensione dei microbi nella stessa soluzione deve essere uniformemente torbida, senza sedimenti.
Diversi batteri correlati possono essere agglutinati dallo stesso siero agglutinante diagnostico, il che rende difficile la loro identificazione. Pertanto usano sieri agglutinanti adsorbiti, da cui gli anticorpi che reagiscono in modo crociato sono stati rimossi mediante adsorbimento su batteri correlati. Tali sieri trattengono anticorpi specifici solo per un dato batterio. La produzione di speciali sieri agglutinanti diagnostici monorecettori fu proposta da A. Castellani (1902).
Reazione di emoagglutinazione indiretta (passiva). (RNGA, RPGA) si basa sull'uso di globuli rossi con antigeni o anticorpi adsorbiti sulla loro superficie, la cui interazione con i corrispondenti anticorpi o antigeni del siero del sangue provoca l'adesione e la precipitazione dei globuli rossi sul fondo del sangue provetta o cella V sotto forma di sedimento smerlato (Fig. 13.2). In caso di reazione negativa, i globuli rossi ■ si depositano sotto forma di “bottone”. Tipicamente, gli anticorpi vengono rilevati nell'RNGA utilizzando un diagnostico eritrocitario antigenico, ovvero eritrociti con adsorbimento SU loro con antigeni. A volte viene utilizzata la diagnostica degli eritrociti anticorpali, sui quali vengono adsorbiti gli anticorpi. Ad esempio, la tossina botulinica può essere rilevata aggiungendo ad essa la tossina botulinica dell'anticorpo eritrocitario (questa reazione è chiamata reazione inversa di emoagglutinazione indiretta-RONG). RNGA viene utilizzato per diagnosticare malattie infettive, determinare ormone gonadotropina V urina quando si stabilisce una gravidanza, per rilevare ipersensibilità A medicinali, ormoni e in alcuni altri casi.
Reazione di coagglutinazione . Le cellule patogene vengono determinate utilizzando stafilococchi pretrattati con siero diagnostico immunologico. Stafilococchi contenenti proteine UN, avere un'affinità per FC - frammento di immunoglobuline, adsorbono in modo non specifico anticorpi antimicrobici, che poi interagiscono con centri attivi con i corrispondenti microbi isolati dai pazienti. Come risultato della coagglutinazione, si formano scaglie costituite da stafilococchi, anticorpi sierici diagnostici e il microbo rilevato.
Reazione di inibizione dell'emoagglutinazione (RTGA) si basa sul blocco, sulla soppressione degli antigeni virali da parte degli anticorpi del siero immunitario, a seguito dei quali i virus perdono la capacità di agglutinare i globuli rossi (Fig. 13.3). RTGA viene utilizzato per diagnosticare molte malattie virali, i cui agenti causali (virus dell'influenza, morbillo, rosolia, encefalite trasmessa da zecche, ecc.) Possono agglutinare i globuli rossi di vari animali.
Reazione di agglutinazione per la determinazione dei gruppi sanguigni utilizzato per stabilire il sistema ABO (vedere sezione 10.1.4.1) mediante agglutinazione di globuli rossi con anticorpi del siero immunitario contro gli antigeni del gruppo sanguigno A (II), B (III). Il controllo è: siero che non contiene anticorpi, cioè siero AB (GU) gruppi sanguigni; antigeni contenuti nei globuli rossi dei gruppi A (II), B (III). Il controllo negativo non contiene antigeni, ovvero vengono utilizzati eritrociti del gruppo 0 (I).
IN Reazioni di agglutinazione per determinare il fattore Rh(vedi sezione 10.1.4.1) utilizzare sieri anti-Rhesus (almeno due serie diverse). Se è presente un antigene Rh sulla membrana degli eritrociti in esame, si verifica l'agglutinazione di queste cellule. Gli eritrociti standard Rh positivi e Rh negativi di tutti i gruppi sanguigni fungono da controllo.
Reazione di agglutinazione per la determinazione degli anticorpi anti-Rhesus ( reazione indiretta Coombs)utilizzato in pazienti con emolisi intravascolare. In alcuni di questi pazienti vengono rilevati anticorpi anti-Rhesus, che sono incompleti e monovalenti. Interagiscono specificamente con gli eritrociti Rh-positivi, ma non provocano la loro agglutinazione. La presenza di tali anticorpi incompleti viene determinata mediante il test di Coombs indiretto. Per fare questo, il siero antiglobulina (anticorpi contro le immunoglobuline umane) viene aggiunto al sistema di anticorpi anti-Rh + eritrociti Rh-positivi, che provoca l'agglutinazione degli eritrociti (Fig. 13.4). Utilizzando la reazione di Coombs, vengono diagnosticate condizioni patologiche associate alla lisi intravascolare degli eritrociti di origine immunitaria, ad esempio la malattia emolitica del neonato: gli eritrociti di un feto Rh positivo si combinano con anticorpi incompleti contro il fattore Rh circolanti nel sangue, che hanno attraversato la placenta da madre Rh negativa.
Reazioni di precipitazione
Reazione di precipitazione -RP (dalat. praecipito- precipitato) - questa è la formazione e la precipitazione di un complesso di antigene molecolare solubile con anticorpi sotto forma di torbidità, chiamato precipitato. Si forma mescolando antigeni e anticorpi in quantità equivalenti; un eccesso di uno di essi riduce il livello di formazione del complesso immunitario.
Le reazioni di precipitazione vengono eseguite in provette (reazione di precipitazione dell'anello), in gel, terreni nutritivi, ecc. Varietà di reazioni di precipitazione in gel semiliquidi di agar o agarosio si sono diffuse: doppia immunodiffusione secondo Ouchterlony. immunodiffusione radiale, immunoelettroforesi e così via.
Reazione di precipitazione dell'anello . La reazione viene condotta in strette provette di precipitazione con siero immune, sul quale è stratificato un antigene solubile. Con un rapporto ottimale tra antigene e anticorpi, al confine di queste due soluzioni si forma un anello opaco di precipitato (Fig. 13.5). L'antigene in eccesso non influenza il risultato della reazione di precipitazione dell'anello a causa della diffusione graduale dei reagenti al confine del liquido. Se come antigeni nella reazione di precipitazione ad anello vengono utilizzati estratti acquosi bolliti e filtrati di organi o tessuti, questa reazione viene chiamata reazione di termoprecipitazione (reazione di Ascoli, con antrace/
Doppia reazione di immunodiffusione secondo Ouchteruny . Per impostare la reazione, sciolto gel di agar uno strato sottile viene versato su una lastra di vetro e dopo che si è indurito, vengono ritagliati dei fori di 2-3 mm. Gli antigeni e i sieri immunitari vengono posti separatamente in questi pozzetti, che si diffondono l'uno verso l'altro. Nel punto d'incontro, in proporzioni equivalenti, formano un precipitato a forma di striscia bianca. Nei sistemi multicomponente compaiono diverse linee di precipitato tra i pozzetti con diversi antigeni e anticorpi sierici; per antigeni identici, le linee del precipitato si uniscono; per quelli non identici si intersecano (Fig. 13.6).
Reazione di immunodiffusione radiale . Il siero immune con gel di agar fuso viene versato uniformemente sul vetro. Dopo la solidificazione nel gel vengono realizzati dei pozzetti nei quali viene inserito l'antigene varie diluizioni. L'antigene, diffondendosi nel gel, forma zone di precipitazione a forma di anello attorno ai pozzetti con anticorpi (Fig. 13.7). Il diametro dell'anello di precipitazione è proporzionale alla concentrazione dell'antigene. La reazione viene utilizzata per determinare il contenuto di immunoglobuline di varie classi, componenti del sistema del complemento, ecc. Nel sangue.
Immunoelettroforesi- una combinazione di elettroforesi e immunoprecipitazione: una miscela di antigeni viene introdotta nei pozzetti del gel e separata nel gel mediante elettroforesi. Quindi, nella scanalatura parallela alle zone di elettroforesi, viene introdotto il siero immunitario, i cui anticorpi, diffondendosi nel gel, formano linee di precipitazione nel punto di incontro con l'antigene.
Reazione di flocculazione(secondo Ramon) (dal lat. flocco - fiocchi di lana) - la comparsa di opalescenza o massa flocculante (immunoprecipitazione) in una provetta durante una reazione tossina-antitossina o tossoide-antitossina. Viene utilizzato per determinare l'attività del siero antitossico o del tossoide.
Immune microscopio elettronico - microscopia elettronica di microbi, spesso virus, trattati con anticorpi appropriati. I virus trattati con siero immunitario formano aggregati immunitari (microprecipitati). Attorno ai virioni si forma una “corolla” di anticorpi, in contrasto con l'acido fosfotungstico o altri preparati elettro-otticamente densi.
Reazioni che coinvolgono il complemento
Reazioni che coinvolgono il complementosi basano sull'attivazione del complemento da parte del complesso antigene-anticorpo (reazione di fissazione del complemento, emolisi radiale, ecc.).
Reazione di fissazione del complemento (RSK) è che, quando antigeni e anticorpi corrispondono tra loro, formano un complesso immunitario, al quale, attraverso FC -il frammento anticorpale è attaccato al complemento (C), cioè il complemento è legato al complesso antigene-anticorpo. Se il complesso antigene-anticorpo non si forma, il complemento rimane libero (Fig. 13.8). L'RSK si effettua in due fasi: 1a fase - incubazione di una miscela contenente tre componenti antigene + anticorpo + complemento; 2a fase (indicatore) - rilevamento del complemento libero nella miscela aggiungendo ad esso un sistema emolitico costituito da eritrociti di pecora e siero emolitico contenente anticorpi contro di essi. Nella 1a fase della reazione, quando si forma il complesso antigene-anticorpo, il complemento si lega, quindi nella 2a fase non si verificherà l'emolisi degli eritrociti sensibilizzati dagli anticorpi; la reazione è positiva. Se l'antigene e l'anticorpo non corrispondono tra loro (non c'è antigene o anticorpo nel campione in esame), il complemento rimane libero e nella 2a fase si unirà al complesso eritrociti - anticorpi antieritrociti, provocando l'emolisi; la reazione è negativa.
La RSC viene utilizzata per diagnosticare molte malattie infettive, in particolare la sifilide (reazione di Wassermann).
Reazione di emolisi radiale (RRH) ) posti nei pozzetti di un gel di agar contenente globuli rossi di pecora e complemento. Dopo aver introdotto il siero emolitico (anticorpi contro i globuli rossi di pecora) nei pozzetti del gel, attorno ad essi si forma una zona di emolisi (come risultato della diffusione radiale degli anticorpi). In questo modo è possibile determinare l'attività del complemento e del siero emolitico, nonché gli anticorpi nel siero del sangue di pazienti con influenza, rosolia, encefalite trasmessa da zecche. Per fare ciò, gli antigeni corrispondenti del virus vengono adsorbiti sugli eritrociti e il siero del sangue del paziente viene aggiunto ai pozzetti del gel contenente questi eritrociti. Gli anticorpi antivirali interagiscono con gli antigeni virali adsorbiti sugli eritrociti, dopo di che
Quindi i componenti del complemento si uniscono a questo complesso, provocando l'emolisi.
Reazione di adesione immunitaria (IAR) ) si basa sull'attivazione del sistema del complemento da parte di antigeni corpuscolari (batteri, virus) trattati con siero immunitario. Di conseguenza, si forma un terzo componente attivato del complemento (C3b), che si lega all'antigene corpuscolare come parte del complesso immunitario. Eritrociti, piastrine e macrofagi hanno recettori per C3b, per cui, quando queste cellule vengono mescolate con complessi immunitari che trasportano C3b, si verifica la loro combinazione e agglutinazione.
Reazione di neutralizzazione
Gli anticorpi del siero immunitario sono in grado di neutralizzare l'effetto dannoso dei microbi o delle loro tossine su cellule e tessuti sensibili, che è associato al blocco degli antigeni microbici da parte degli anticorpi, ad es. neutralizzazione. Reazione di neutralizzazione(RN) viene effettuato introducendo una miscela antigene-anticorpo negli animali o in oggetti di test sensibili (colture cellulari, embrioni). In assenza degli effetti dannosi dei microrganismi o dei loro antigeni o tossine negli animali e negli oggetti da testare, parlano dell'effetto neutralizzante del siero immunitario e, quindi, della specificità dell'interazione del complesso antigene-anticorpo (Fig. 13.9).
Reazione di immunofluorescenza - RIF (metodo Coons)
Esistono tre tipi principali di metodo: diretto, indiretto (Fig. 13.10), con complemento. La reazione di Koons è un metodo diagnostico rapido per identificare gli antigeni microbici o determinare gli anticorpi.
Metodo RIF diretto si basa sul fatto che gli antigeni tissutali o i microbi trattati con sieri immunitari con anticorpi marcati con fluorocromi sono in grado di brillare ai raggi UV di un microscopio a fluorescenza.
I batteri in uno striscio trattato con un siero così luminescente si illuminano lungo la periferia della cellula sotto forma di un bordo verde.
Metodo RIF indiretto consiste nell'identificazione del complesso antigene-anticorpo mediante siero antiglobulina (anti-anticorpo) marcato con fluorocromo. Per fare ciò, gli strisci di una sospensione di microbi vengono trattati con anticorpi provenienti da siero diagnostico antimicrobico di coniglio. Quindi gli anticorpi che non sono legati dagli antigeni microbici vengono lavati e gli anticorpi rimasti sui microbi vengono rilevati trattando lo striscio con siero antiglobulina (anti-coniglio) marcato con fluorocromi. Di conseguenza, si forma un complesso di microbo + anticorpi antimicrobici di coniglio + anticorpi anticoniglio marcati con fluorocromo. Questo complesso viene osservato al microscopio a fluorescenza, come nel metodo diretto.
Metodo o analisi immunoenzimatica (ELISA)
ELISA-rilevamento degli antigeni utilizzando i corrispondenti anticorpi coniugati a un enzima tag (perossidasi di rafano, beta-galattosidasi o fosfatasi alcalina). Dopo aver combinato l'antigene con il siero immunitario marcato con enzima, alla miscela viene aggiunto il substrato/cromogeno. Il substrato viene scisso dall'enzima e il colore del prodotto della reazione cambia: l'intensità del colore è direttamente proporzionale al numero di molecole di antigene e anticorpo legate.
ELISA in fase solida - la variante più comune di un test immunologico, quando uno dei componenti della reazione immunitaria (antigene o anticorpi) viene assorbito su un supporto solido, ad esempio nei pozzetti delle piastre di polistirene
Quando si determinano gli anticorpi, il siero del sangue del paziente, il siero antiglobulina marcato con un enzima e un substrato (cromogeno) per l'enzima vengono aggiunti in sequenza ai pozzetti delle piastre con l'antigene assorbito.
Ogni volta che si aggiunge un altro componente, i reagenti non legati vengono rimossi dai pozzetti mediante lavaggio accurato. A risultato positivo Il colore della soluzione cromogena cambia. Un trasportatore in fase solida può essere sensibilizzato non solo con l'antigene, ma anche con gli anticorpi. Quindi l'antigene desiderato viene aggiunto ai pozzetti con gli anticorpi assorbiti, viene aggiunto il siero immune contro l'antigene marcato con un enzima e quindi viene aggiunto un substrato per l'enzima.
Opzione ELISA competitiva . l'antigene bersaglio e l'antigene marcato con l'enzima competono tra loro per legare una quantità limitata di anticorpi del siero immunitario. Un altro test: gli anticorpi che stai cercando
e gli anticorpi marcati competono tra loro per gli antigeni.
Metodo o analisi radioimmunologica (RIA)
Metodo altamente sensibile basato sulla reazione antigene-anticorpo utilizzando antigeni o anticorpi marcati con radionuclide (125 J, 14 C, 3 H, 51 Cr, ecc.). Dopo la loro interazione, il complesso immunitario radioattivo risultante viene separato e la sua radioattività viene determinata nell’apposito contatore (radiazione beta o gamma):
l'intensità della radiazione è direttamente proporzionale al numero di molecole di antigeni e anticorpi legati.
A versione RIA in fase solida uno dei componenti della reazione (antigene o anticorpi) viene adsorbito su un supporto solido, ad esempio nei pozzetti dei micropannelli di polistirolo. Un'altra opzione di metodo è RIA competitiva. l'antigene desiderato e l'antigene marcato con il radionuclide competono tra loro per legare una quantità limitata di anticorpi del siero immunitario. Questa opzione viene utilizzata per determinare la quantità di antigene nel materiale da testare.
L'RIA viene utilizzata per identificare antigeni microbici, determinare ormoni, enzimi, sostanze medicinali e immunoglobuline, nonché altre sostanze contenute nel materiale di prova in concentrazioni minori - 10~ |0 -I0~ 12 g/l. Il metodo presenta un certo rischio ambientale.
Immunoblot
Immunoblotting (IB)- un metodo altamente sensibile basato su una combinazione di elettroforesi ed ELISA o RIA.
L'antigene viene isolato mediante elettroforesi in un gel di poliacrilammide, quindi trasferito (blotting - dall'inglese. macchia, macchia) dal gel su carta attivata o membrana di nitrocellulosa e sviluppata utilizzando ELISA. Le aziende producono tali strisce con “macchie”
antigeni. Su queste strisce viene applicato il siero del paziente. Quindi, dopo l'incubazione, il paziente viene lavato dagli anticorpi non legati e viene applicato il siero contro le immunoglobuline umane marcate con un enzima. Il complesso antigene + anticorpo del paziente + anticorpo contro le Ig umane formato sulla striscia viene rilevato aggiungendo un substrato/cromogeno che cambia colore sotto l'azione di un enzima (Fig. 13.12).
L'IB è utilizzato come metodo diagnostico per l'infezione da HIV, ecc.
L'agglutinazione è l'incollaggio dei batteri come risultato dell'interazione di specifici AT con essi. Per effettuare l'AR sono necessari tre componenti: 1) AG (agglutinogeno); 2) AT (agglutinina); 3) soluzione elettrolitica (soluzione isotonica di cloruro di sodio). Solo gli antigeni corpuscolari (batteri, globuli rossi, particelle di lattice caricate di antigeni) prendono parte alla reazione di agglutinazione.
Reazione di agglutinazione su vetro. Una goccia di siero diagnostico viene applicata con una pipetta su un vetrino senza grassi (diluizione del siero 1:10 - 1:20). Utilizzando un'ansa batteriologica, una coltura pura del microrganismo in studio viene prelevata dalla superficie dell'agar inclinato, trasferita in una goccia di siero e miscelata. Il risultato della reazione viene preso in considerazione ad occhio nudo dopo 3-5 minuti. Se la reazione è positiva, in una goccia di siero si nota la comparsa di scaglie (grandi o piccole), chiaramente visibili su fondo scuro quando si agita il vetrino. In caso di reazione negativa il liquido rimane uniformemente torbido.
Reazione di agglutinazione in provette. Ad una fila di provette viene aggiunto 1 ml di soluzione fisiologica. Un volume uguale del siero sanguigno da analizzare viene aggiunto alla prima provetta. Vengono preparate diluizioni seriali doppie del siero (titolazione del siero), dopodiché in ciascuna provetta vengono aggiunte 2 gocce di una sospensione di batteri inattivati (diagnosticum). Le provette vengono poste in un termostato a 37°C per 2 ore. La reazione procede con la formazione di piccole scaglie invisibili ad occhio nudo, quindi i risultati vengono registrati sotto un leggero ingrandimento in un dispositivo speciale: un agglutinoscopio. L'intensità dell'agglutinazione viene presa in considerazione secondo il sistema "quattro più": agglutinazione completa - 4+, agglutinazione parziale - 3+ o 2+, risultato discutibile - +. L'ultima diluizione in cui si osserva un'agglutinazione di 2+ viene presa come titolo anticorpale nel siero in esame.
Viene eseguita una reazione di agglutinazione in provette (una vasta reazione di agglutinazione) per determinare il titolo degli anticorpi contro i patogeni tifo e febbre paratifo (reazione di Vidal), brucellosi (reazione di Wright), tifo (reazione di Weigl).
L'agglutinazione (dal latino agglutinatio - incollare) è l'incollaggio (connessione) di particelle corpuscolari portatrici di antigene (cellule intere, particelle di lattice, ecc.) con molecole di anticorpi specifici in presenza di elettroliti, che termina con la formazione di scaglie o sedimenti (agglutinato) visibile ad occhio nudo. La natura del sedimento dipende dalla natura dell'antigene: i batteri flagellati producono un sedimento flocculante grossolano, i batteri flagellati e non capsulari producono un sedimento a grana fine e i batteri capsulari producono un sedimento filamentoso. Si distingue tra agglutinazione diretta, in cui i propri antigeni di un batterio o di qualsiasi altra cellula, come gli eritrociti, partecipano direttamente all'interazione con anticorpi specifici; e indiretto, o passivo, in cui cellule batteriche o eritrociti o particelle di lattice sono portatori non di propri, ma di antigeni (o anticorpi) estranei adsorbiti su di essi per identificare anticorpi (o antigeni) specifici per loro. La reazione di agglutinazione coinvolge principalmente anticorpi appartenenti alle classi IgG e IgM. Si verifica in due fasi: in primo luogo, avviene un'interazione specifica tra il centro attivo degli anticorpi e il determinante dell'antigene. Questa fase può verificarsi in assenza di elettroliti e non è accompagnata da cambiamenti visibili nel sistema reattivo; Per la seconda fase - la formazione dell'agglutinato - è necessaria la presenza di elettroliti, che si riducono carica elettrica complessi antigene + anticorpo e accelerano il processo del loro incollaggio. Questa fase termina con la formazione di un agglutinato.
Le reazioni di agglutinazione vengono eseguite su piastre di vetro o di cartone liscio oppure in provette di agglutinazione sterili. Le reazioni di agglutinazione (dirette e passive) sul vetro vengono solitamente utilizzate come metodo accelerato rilevamento di anticorpi specifici nel siero del paziente (ad esempio nella brucellosi) o per l'identificazione sierologica dell'agente patogeno. In quest'ultimo caso vengono solitamente utilizzati sieri diagnostici ben purificati (adsorbiti) contenenti solo anticorpi monorecettori o un insieme di essi contro vari antigeni. L'indubbio vantaggio della reazione di agglutinazione sul vetro è la semplicità della sua implementazione e il fatto che richiede diversi minuti o addirittura secondi, poiché entrambi i componenti vengono utilizzati in forma concentrata. Tuttavia ha solo un valore qualitativo ed è meno sensibile di una provetta. Un'ampia reazione di agglutinazione nelle provette fornisce risultati più accurati, poiché consente di determinare il contenuto quantitativo di anticorpi nel siero (stabilirne il titolo) e, se necessario, registrare il fatto di un aumento del titolo anticorpale, che ha valore diagnostico . Per avviare la reazione, una soluzione diluita allo 0,85% viene aggiunta in un determinato modo alle provette di agglutinazione. Soluzione NaCl siero e un volume uguale (di solito 0,5 ml) di una sospensione di un diagnosticum standard (o coltura di prova) contenente 1 miliardo di batteri in 1 ml. I risultati della reazione di agglutinazione vengono registrati prima dopo 2 ore di incubazione delle provette a 37°C ed infine dopo 20-24 ore secondo due criteri: la presenza e dimensione del precipitato ed il grado di trasparenza del liquido surnatante. La valutazione viene effettuata secondo il sistema a quattro croci. La reazione è necessariamente accompagnata dal controllo del siero e dell'antigene. Nei casi in cui viene eseguita una reazione di agglutinazione dettagliata in provetta per l'identificazione sierologica dell'agente patogeno, essa ha valore diagnostico se la reazione è valutata positiva quando il siero diagnostico è diluito almeno alla metà del suo titolo.
Va tenuto presente che quando si mescolano soluzioni di antigeni e anticorpi omologhi, non sempre si osservano manifestazioni visibili della reazione di agglutinazione. Un precipitato si forma solo a determinati rapporti ottimali di entrambi i componenti della reazione. Al di fuori di questi limiti, con un eccesso significativo di antigene o anticorpi, non si osserva alcuna reazione. Questo fenomeno è chiamato “fenomeno della prozona”. Si osserva sia nella reazione di agglutinazione che nella reazione di precipitazione. La comparsa della prozona nelle reazioni immunitarie è spiegata dal fatto che gli antigeni coinvolti in esse, di regola, sono polideterminanti e le molecole Anticorpi IgG hanno due centri attivi. Con un eccesso di anticorpi, la superficie di ciascuna particella antigene è ricoperta da molecole anticorpali in modo che non rimangano gruppi determinanti liberi, quindi il secondo centro attivo non legato degli anticorpi non può interagire con un'altra particella antigene e legarli tra loro. La formazione di un agglutinato o precipitato visibile viene soppressa anche in caso di eccesso di antigene, quando non rimane un solo centro attivo libero degli anticorpi e quindi i complessi antigene + anticorpo + antigene non possono più allargarsi.
Varianti di reazioni di agglutinazione accelerata. Reazione emoagglutinazione passiva e le sue varianti
La classica reazione di agglutinazione prevede l'utilizzo di antigeni corpuscolari. Tuttavia, possono essere coinvolti anche antigeni solubili. Per rendere ciò possibile, tali antigeni vengono adsorbiti su particelle immunologicamente inerti. Come veicolo possono essere utilizzate particelle di lattice o bentonite, ma attualmente vengono utilizzati più spesso eritrociti animali o umani, migliorandone le proprietà adsorbenti trattandoli con soluzioni di tannino, formalina o benzidina. I globuli rossi che hanno adsorbito un antigene su se stessi sono chiamati sensibilizzati da questo antigene e reazione immunitaria a cui partecipano è una reazione di emoagglutinazione indiretta o passiva (IRHA o RPHA), poiché i globuli rossi vi partecipano passivamente.
L'RPGA è posto in apposite lastre di polistirolo forate a fondo semisferico. Quando lo si utilizza per la diagnostica sierologica, in questi pozzetti vengono preparate diluizioni doppie soluzione salina siero da testare, al quale viene quindi aggiunta una sospensione di eritrociti sensibilizzati come agente diagnostico. I risultati vengono registrati dopo 2 ore di incubazione a 37 °C utilizzando il sistema a quattro croci. Con una reazione positiva, i globuli rossi agglutinati si depositano sul fondo del foro e lo coprono uniformemente sotto forma di un ombrello rovesciato. Se la reazione è negativa, anche i globuli rossi si sedimentano, il liquido diventa limpido e il sedimento appare come un piccolo “disco” al centro del pozzetto. Il titolo del siero in RPHA è considerato la sua ultima diluizione, che senza dare ancora una pronunciata emoagglutinazione segnali significativi la presenza di un “disco”.
L'RPGA può essere utilizzato anche come metodo accelerato di diagnostica batteriologica per rilevare direttamente nel materiale di prova batteri, virus, tossine sconosciuti, ad esempio agenti patogeni della peste, enterotossine stafilococciche, ecc. Con questa versione dell'RPGA, gli eritrociti adsorbiti, noti per la loro specificità sono usati come componente noto della reazione anticorpi - anticorpo eritrocitario diagnostico. Se il materiale del test contiene una quantità sufficiente di un antigene noto, l'RPGA risulterà positivo.
Le opzioni per l'utilizzo dell'RPHA sono: reazione di neutralizzazione dell'antigene (RNAg), reazione di neutralizzazione degli anticorpi (RNAb), reazione passiva di inibizione dell'emoagglutinazione (PHA). Per queste reazioni viene utilizzata la diagnostica eritrocitaria con antigeni e anticorpi. È possibile utilizzare contemporaneamente due reazioni unidirezionali che si controllano reciprocamente, ad esempio RPHA con un antigene diagnostico e RNAg con un anticorpo eritrocitario diagnostico.
La reazione di neutralizzazione degli anticorpi (RNAb) consiste nel miscelare una sospensione contenente l'antigene desiderato con un siero immunitario specifico contenente anticorpi noti in volumi appropriati e nell'incubare a 37 °C per due ore. Successivamente viene aggiunto un diagnostico eritrocitario antigenico. La miscela viene agitata e lasciata a temperatura ambiente. I risultati vengono presi in considerazione dopo 3-4 ore e infine dopo 18-24 ore. Se il materiale da testare contiene antigene, si legherà agli anticorpi (neutralizzandoli) e quindi non si verificherà emoagglutinazione.
La reazione di neutralizzazione dell'antigene (RNAg) viene eseguita utilizzando lo stesso principio. Solo in questo caso vengono rilevati anticorpi nel materiale da testare. Un antigene specifico aggiunto a tale materiale di prova si legherà agli anticorpi in esso contenuti, cioè si verificherà la neutralizzazione dell'antigene da parte degli anticorpi e pertanto non si verificherà emoagglutinazione quando si aggiunge un anticorpo eritrocitario diagnostico.
Reazione di coagglutinazione. È una delle opzioni per una reazione di agglutinazione passiva, cioè accelerata, su vetro mediata da cellule portatrici di anticorpi. Questa reazione è basata su proprietà unica Staphylococcus aureus, che contiene la proteina A nella sua parete cellulare, si lega ai frammenti Fc di IgG e IgM. In questo caso, i centri attivi degli anticorpi rimangono liberi e possono interagire con determinanti specifici degli antigeni. Su un vetrino si applica una goccia di una sospensione di stafilococchi al 2%, sensibilizzata con opportuni anticorpi, e si aggiunge una goccia di una sospensione dei batteri in studio. Se l'antigene corrisponde agli anticorpi, entro 30-60 s avviene una chiara agglutinazione degli stafilococchi carichi di anticorpi.
Reazione di agglutinazione al lattice (LAR). Il vettore degli anticorpi in questo sistema diagnostico sono piccole particelle di lattice standard. La reazione viene eseguita utilizzando il micrometodo in pozzetti su vetro. La condizione principale per il successo della stadiazione della PAH è il rigoroso rispetto dei rapporti quantitativi dei componenti del sistema: 10 μl di un preparato di lattice sensibilizzato con anticorpi vengono aggiunti a 50 μl del materiale da testare. La specificità degli IPA viene controllata utilizzando tre test di controllo contenuti nei sistemi di test commerciali: una reazione positiva nota, una reazione negativa nota e un controllo di qualità delle sospensioni di lattice utilizzando lattici non sensibilizzati IPA (non contenenti anticorpi) con il materiale del test. Nel nostro Paese, come trasportatori di anticorpi specifici, vengono utilizzati lattici di polistirene monodispersi con diversi diametri delle particelle (0,3; 0,66; 0,75; 0,8 μm). Il LAG viene utilizzato per il rilevamento rapido di microrganismi o dei loro antigeni nel materiale di prova.
Rilevazione immunomagnetica degli antigeni. Una delle opzioni per la reazione di agglutinazione accelerata sul vetro è associata all'uso di particelle polimeriche supermagnetiche rivestite con anticorpi specifici. Una di queste particelle lega fino a 107-108 cellule di microrganismi, a causa della quale sensibilità questo metodo raggiunge 5 CFU/ml. Il rilevamento immunomagnetico dei microrganismi può essere utilizzato in combinazione con la RCP.
Reazione di emoagglutinazione aggregata (AHA). Consente di rilevare rapidamente nel sangue dei pazienti sia antigeni liberamente circolanti (antigenemia) sia antigeni associati ad anticorpi - complessi immuni circolanti (CIC). Per l'RAHA vengono utilizzati globuli rossi sensibilizzati con anticorpi appropriati. L'aggiunta del siero del sangue del paziente, che contiene antigeni, agli eritrociti sensibilizzati su cui sono fissati gli anticorpi, porta all'incollaggio (agglutinazione) degli eritrociti e degli immunocomplessi.
Test dell'antiglobulina di Coombs (reazione di R. Coombs). Gli anticorpi completi (bivalenti) vengono determinati utilizzando reazioni di agglutinazione diretta e passiva. Gli anticorpi incompleti (monovalenti, bloccanti) non vengono rilevati con questi metodi, poiché, quando si combinano con l'antigene, lo bloccano, ma non possono causare l'aggregazione dell'antigene in grandi conglomerati. Gli anticorpi incompleti (bloccanti) sono quelli in cui funziona un solo centro attivo; il secondo centro attivo non funziona per un motivo sconosciuto. Per rilevare gli anticorpi incompleti viene utilizzata una speciale reazione di Coombs (Fig. 72). La reazione coinvolge: il siero del paziente, in cui vengono determinati gli anticorpi incompleti, l'antigene corpuscolare-diagnostico, il siero antiglobulina contenente anticorpi contro la globulina umana. La reazione avviene in due fasi:
Interazione dell'antigene con anticorpi incompleti. Non ci sono manifestazioni visibili. La prima fase viene completata lavando l'antigene dal siero rimanente del paziente.
Interazione del siero antiglobulina ottenuto come risultato dell'immunizzazione di un animale con globulina umana con anticorpi incompleti adsorbiti sull'antigene. Dato che gli anticorpi antiglobulina sono bivalenti, legano due anticorpi monovalenti di complessi AG+ separati anticorpo incompleto, che porta al loro incollaggio e alla comparsa di sedimenti visibili.
Indice dell'argomento "Immunomodulatori. Immunodiagnosi delle malattie infettive":Reazione di agglutinazione dettagliata (RA). Per determinare l’AT nel siero del paziente, a reazione di agglutinazione estesa (RA). Per fare ciò, a una serie di diluizioni di siero sanguigno viene aggiunto un diagnosticum: una sospensione di microrganismi o particelle uccisi con Ag assorbito. La massima diluizione che dà agglutinazione Ag è chiamato titolo del siero.
Tipi di reazione di agglutinazione (RA) per identificare l'AT - test su goccia di sangue per la tularemia (con un diagnosticum applicato su una goccia di sangue e la comparsa di agglutinati biancastri visibili) e il test di Huddleson per la brucellosi (con un diagnosticum colorato con viola di genziana applicato su una goccia di sangue siero).
Reazione di agglutinazione approssimativa (RA)
Per identificare i microrganismi isolati, un RA approssimativo viene posizionato sui vetrini. Per fare ciò, una coltura patogena viene aggiunta a una goccia di antisiero diagnostico standard (diluito 1:10, 1:20). Se il risultato è positivo, viene eseguita una reazione dettagliata con diluizioni crescenti dell'antisiero.
Reazione considerato positivo se si osserva agglutinazione in diluizioni prossime al titolo del siero diagnostico.
OSA. O-Ag somatici sono stabili al calore e possono resistere all'ebollizione per 2 ore. Quando interagiscono con l'AT, formano aggregati a grana fine.
N-Ag. N-Ag (flagellati) sono termolabili e si degradano rapidamente a 100 °C, nonché sotto l'influenza dell'etanolo. Nelle reazioni con l'antisiero H, dopo 2 ore di incubazione, si formano grandi scaglie sciolte (formate da batteri che si uniscono ai flagelli).
Vi-Ar i batteri del tifo sono relativamente stabili al calore (resiste a temperature di 60-62 °C per 2 ore); Quando incubato con l'antisiero Vi, si forma un agglutinato a grana fine.
Reazioni di emoagglutinazione diretta
Il più semplice di questi reazioni - agglutinazione globuli rossi, o emoagglutinazione, utilizzati per determinare i gruppi sanguigni nel sistema ABO. Per determinare agglutinazione(o la loro mancanza) utilizzare antisieri standard con agglutinine anti-A e anti-B. La reazione è detta diretta, poiché gli Ag studiati sono componenti naturali dei globuli rossi.
Comune con emoagglutinazione diretta l'emoagglutinazione virale ha meccanismi. Molti virus sono in grado di agglutinare spontaneamente gli eritrociti di uccelli e mammiferi, la loro aggiunta ad una sospensione di eritrociti provoca la formazione di aggregati da essi;
