Reazioni immunitarie. Applicazione delle reazioni immunitarie in diagnostica malattie infettive.
PIANO:
Tipi di reazioni immunitarie.
Condizioni per condurre reazioni sierologiche.
Requisiti del siero.
Il concetto di risultati positivi e negativi.
CONTENUTI PRINCIPALI:
Tipi di reazioni immunitarie.
Reazione immunologica – Questa è l'interazione di un antigene con un anticorpo, che è determinata dall'interazione specifica dei centri attivi dell'anticorpo (paratopo) con gli epitopi degli antigeni.
Classificazione generale delle reazioni immunologiche:
reazioni sierologiche – reazioni tra antigeni (Ag) e anticorpi (Ig)
in vitro ;
reazioni cellulari con la partecipazione di cellule immunocompetenti;
test allergici – rilevamento di ipersensibilità.
Reazioni sierologiche: 1) definizione, 2) fasi, 3) obiettivi, 4) classificazione generale.
1) Definizione
Metodi sierologici ricerca (dal latino Serum - siero e logos - insegnamento) utilizzando la reazione antigene-anticorpo.
2) Fasi
2 fasi di interazione:
IO. Specifica (visibile) – avviene rapidamente, gli anticorpi si combinano con i loro antigeni corrispondenti. Durante questa fase interagiscono i gruppi determinanti degli antigeni (AG) e i centri attivi degli anticorpi (AT).
Le forze coinvolte nella formazione del complesso AG+AT sono:
pendente;
van der Waals
Legami di idrogeno.
Non ci sono cambiamenti visibili in questa fase. La microscopia elettronica mostra il complesso AG+AT sotto forma di reticolo.
II. Non specifico – avviene lentamente, il complesso antigene-anticorpo risultante reagisce con un ulteriore fattore ambientale non specifico in cui avviene la reazione, e questo è visibile all’occhio – incollaggio, dissoluzione, scaglie di precipitazione, ecc. In presenza di un elettrolita, la carica diminuisce , la solubilità diminuisce, si formano conglomerati visibili, che precipitano (agglutinano).
3) Stabilire obiettivi :
a) per identificare l'antigene (anticorpo noto siero diagnostico):
identificazione sierologica (identificazione della specie);
sierotipizzazione (determinazione del sierotipo) – determinazione del ceppo;
in materiale patologico (diagnostica rapida);
nella cultura pura:
b) per rilevare gli anticorpi (Ig) (l'antigene è noto-diagnosticum):
presenza (reazioni qualitative);
quantità (aumento del titolo - metodo del “siero appaiato”).
4) Classificazione generale reazioni sierologiche :
a) semplice (2 componenti: Ag+Ig):
Reazioni di agglutinazione dell'AR (con antigene corpuscolare);
Reazioni di precipitazione PR (con antigene solubile);
b) complesso (3 componenti: Ag+Ig+C);
c) utilizzando un tag.
Varianti delle reazioni di agglutinazione e precipitazione
Reazione di agglutinazione :
Reazione di agglutinazione (RA) - reazione immunitaria interazione di una sospensione di antigeni (eritrociti, batteri) con antigeni in soluzione salina.
Durante l'agglutinazione, le particelle AT si uniscono per formare un sedimento flocculante.
Reazione emoagglutinazione passiva(RPGA) è un tipo di reazione di agglutinazione in cui viene utilizzato un anticorpo o antigene eritrocitario diagnostico (eritrociti con AT o AG adsorbiti sulla loro superficie).
I globuli rossi agiscono come trasportatori passivi in questa reazione.
La valutazione dei risultati dell’RPGA viene effettuata come segue:
- A reazione positiva i globuli rossi adesi passivamente ricoprono il fondo del foro a forma di U o di V con uno strato uniforme con bordi smerlati (“ombrello”);
- A reazione negativa (in assenza di agglutinazione), i globuli rossi si accumulano nella rientranza centrale del foro, formando un “bottone” compatto con bordi nettamente definiti.
Per la diagnosi viene utilizzato il test di inibizione dell’emoagglutinazione (HIT). infezione virale. Alcuni virus contengono sulla loro superficie una proteina chiamata emoagglutinina, che incolla insieme i globuli rossi. L'aggiunta di anticorpi antivirali specifici blocca l'emoagglutinina virale: non si verifica emoagglutinazione.
La reazione di emoagglutinazione indiretta (IRHA), o reazione di Coombs, viene utilizzata per determinare gli anticorpi incompleti. L'aggiunta di siero antiglobulina (AT contro Ig umane) migliora i risultati della reazione. RNGA viene utilizzato per determinare il fattore Rh.
Per eseguire una reazione di agglutinazione (RA), sono necessari tre componenti:
1) antigene (agglutinogeno) AG;
2) anticorpo(agglutinina) AT;
3)
elettrolita
(soluzione isotonica di cloruro di sodio).
Ag + AT + elettrolita = agglutinare
Agglutinazione (dal latino agglutinatio - incollaggio) - incollaggio di globuli (batteri, globuli rossi, ecc.) con anticorpi in presenza di elettroliti - cloruro di sodio.
L'AR si manifesta sotto forma di scaglie o sedimenti costituiti da corpuscoli (ad esempio batteri, globuli rossi) “incollati insieme” da anticorpi.
RA è utilizzato per:
Reazione di agglutinazione microbica diretta (RA).
In questa reazione, gli anticorpi (agglutinine) agglutinano direttamente gli antigeni corpuscolari (agglutinogeni).
Sono solitamente rappresentati da una sospensione di microrganismi inattivati (reazione di agglutinazione microbica).
Per determinare il tipo di microrganismi, utilizzareagglutinante diagnostica standard siero ( famoso AT ).
I più comuni sono l'AR lamellare (approssimativo) e l'AR espanso.
La piastra RA è posizionata sul vetro. Viene utilizzato come metodo accelerato per rilevare anticorpi o identificare microrganismi.
Componenti:
1. sieri agglutinanti diagnostici standard (AT);
2. coltura pura in studio dal paziente;
3. soluzione salina.
Nella coltura pura in studio, gli antigeni (AG) si presentano sotto forma di particelle (cellule microbiche, eritrociti e altri antigeni corpuscolari), che vengono incollati insieme da anticorpi e precipitano.
Esempio:
Messa in scena indicativo reazioni di agglutinazione (RA ) sul vetro allo scopo di identificare i batteri coliformi.
Applicare gocce su un vetrino:
1
dissenteria
;
2
-esima goccia: - siero agglutinante contro gli agenti patogenitifo
;
(1-2 sieri diagnostici)
3
-esima goccia: - soluzione salina (controllo).
Aggiungere ad ogni goccia la coltura batterica pura testata. Mescolata.
Risultato
:
positivo
- presenza di scaglie agglutinate,
negativo
- assenza di scaglie agglutinate
Conclusione:I batteri studiati sono agenti causali della febbre tifoide (sono stati determinati gli antigeni).
Per determinare l'AT nel siero del paziente (diagnosi sierologica), un microbico standarddiagnosticum , contenente sospensionefamoso microbi o i loro antigeniAG .
Determinazione dei gruppi sanguigni ABO (reazione di emoagglutinazione (HRA)) – agglutinano i globuli rossi.
Componenti della reazione:
1. AG (globuli rossi) sangue da test
2. AT (eritrotest - zolicloni)
Set di zolicloni:
Reagente anti-A del coliclone (rosa)
Reagente anti-B del coliclone (blu)
Reagente Tsoliklon anti-AV (incolore)
3. elettrolita (soluzione salina)
Tecnica di determinazione:
1
.
Una goccia (0,1 ml) di zolicone anti-A, anti-B e anti-AB viene applicata nei pozzetti della compressa (per il controllo).
2.
Accanto a ciascuna goccia del reagente viene applicata una piccola goccia (0,05-0,01 ml) del sangue da analizzare.
Quindi una goccia di zoliclone viene miscelata con una goccia di sangue utilizzando una bacchetta di vetro pulita.
3.
La reazione di agglutinazione si sviluppa durante i primi 3-5 secondi quando la piastra viene oscillata leggermente.
I risultati della reazione vengono presi in considerazione 2,5 - 3 minuti dopo la miscelazione delle gocce. Da sinistra a destra nei pozzetti ci sono anti-A, anti-B, anti-AB.
Un risultato positivo è la comparsa di un sedimento granulare (agglutinato).
RA positivo (+)
Negativo: nessun sedimento.
RA negativo(-)
4.
Analisi dei risultati.
O(IO) α β – nessuna agglutinazione
UN(II) β – agglutinazione con anti-A
B(III) α – agglutinazione con anti-B
AB(IV)O – agglutinazione con anti-A, con anti-B
Rappresentazione schematica dell'agglutinazione.
Antigeni Ag sugli eritrociti (rilevabili) + anticorpoA(zoliclon) siero diagnostico
Contabilità dell'agglutinazione nelle compresse
Reazione di precipitazione:
La reazione di precipitazione è una reazione immunitaria dell'interazione dell'antigene in uno stato solubile con l'antigene in una soluzione fisiologica.
Durante la precipitazione si forma un complesso immunitario macromolecolare, che si manifesta con la transizione di una soluzione colloidale trasparente in una sospensione opaca o precipitato.
La quantità di entrambi i reagenti deve essere in proporzioni rigorosamente definite, poiché un eccesso di uno di essi riduce il risultato.
Esistere vari modi messa in scena della reazione di precipitazione.
1. La reazione di precipitazione ad anello viene effettuata in tubi di precipitazione di piccolo diametro. Il siero immunitario viene aggiunto alla provetta e l'antigene solubile viene accuratamente stratificato. AG e AT si mescolano a causa del movimento termico delle molecole e interagiscono. A risultato positivo al confine delle due soluzioni si forma un anello di precipitato opaco.
2. La reazione di doppia immunodiffusione di Ouchterlony viene effettuata in un gel di agar, nei cui pozzetti viene aggiunta una soluzione AG o una soluzione AT secondo lo schema. AG e AT diffondono nel gel l'uno verso l'altro e, se la reazione è positiva, formano immunocomplessi visibili come linee di precipitazione.
Reazione alle precipitazioni –questa è la formazionee la precipitazione del complesso molecolare solubile antigene-anticorpo come una nuvola chiamata precipitato. Si forma mescolando antigeni e anticorpi in quantità equivalenti.
Componenti dell'AR:
siero precipitante (noto AT-precipitina);
siero del test (antigene precipitinogeno sconosciuto);
fisico Soluzione.
La reazione di precipitazione viene effettuata in speciali provette strette (reazione di precipitazione ad anello) o in piastre Petri in gel, mezzi nutritivi, ecc.
Reazione di precipitazione dell'anello
Dichiarazione e registrazione dei risultati della reazioneprecipitazione ad anelloper il rilevamento degli agenti patogeni antrace(Reazione Ascolana).
Messa in scena .
1. Il materiale in esame (pelle, lana, feltro, setole, stoffa, carne, terra, feci animali, ecc.) viene fatto bollire in soluzione salina per 5-45 minuti. per ottenere un estratto isotonico (estratto). Filtrato.
2. Il siero anti-antrace precipitante viene versato in una provetta.
3. Stratificare con cura il materiale di prova (estratto).
Contabilità .
Entro i prossimi 10 minuti. Nei casi positivi, appare un anello di torbidità all'interfaccia tra siero ed estratto (precipitazione dell'anello). La reazione dell'Ascoli è molto sensibile e specifica
Con il suo aiuto, è possibile identificare rapidamente i materiali infetti dall'antrace.
Reazione di precipitazione in agar
Dichiarazione e registrazione dei risultatiReazioni di precipitazione in agarper determinare la tossigenicità dei corinebatteri (agenti causativi della difterite)
Messa in scena
Posizionato su agar fosfato-peptone in una capsula Petri.
1. Posizionare una striscia di carta da filtro sterile inumidita lungo il centro della tazza.siero antitossico.
2. Dopo l'essiccazione, ad una distanza di 1 cm dal bordo della striscia, vengono seminate placche del diametro di 10 mmcolture selezionate.
In una tazza puoi seminare da 3 a 10 raccolti di cui unocontrollo, deve essere conosciutotossigenico.
I raccolti vengono posti in un termostato.
Contabilità
L'analisi viene effettuata dopo 24-48-72 ore.
Risultato positivo - (culturatossigenico) - ad una certa distanza dalla striscia di carta compaionolinee di precipitato, « frecce a viticcio", che sono chiaramente visibili nella luce trasmessa.
La figura mostra la reazione di precipitazione in agar per determinare la tossigenicità dei bacilli difterici. Le colture medie non hanno formato “viticci a freccia”; questi non sono agenti patogeni tossicogeni.
I ceppi dell'agente eziologico della difterite possono essere tossigeni (producendo esotossina) e non tossigeni. La formazione di un'esotossina dipende dalla presenza nei batteri di un profago portatore di un gene tox che codifica per la formazione di un'esotossina.
In caso di malattia, tutti gli agenti patogeni della difterite vengono testati per la tossigenicità - produzione di esotossina difterica utilizzando la reazione di precipitazione nell'agar
Reazioni sierologiche complesse ( 3 componenti: Ag+Ig+C):
Reazione di fissazione del complemento (CFR).
La reazione viene effettuata in due fasi.
Nella prima fase, l'AT interagisce con l'antigene e il complemento, nella seconda fase viene aggiunto un indicatore: il sistema emolitico (una miscela di globuli rossi e siero antieritrocitario).
Se il risultato è positivo, nella prima fase gli anticorpi formano con gli antigeni un immunocomplesso che lega il complemento della miscela di reazione.
In questo caso i globuli rossi del sistema emolitico aggiunti nella seconda fase non vengono distrutti.
Altrimenti, il complemento non legato causa la lisi dei globuli rossi indicatori.
Per realizzarlo sono necessari cinque ingredienti: AG, AT e complemento (primo sistema), eritrociti di pecora e siero emolitico (secondo sistema) (Fig. 1).
La reazione avviene in due fasi (Fig. 3).
Prima fase - interazione di antigene e anticorpi con la partecipazione obbligatoria del complemento.
Secondo - identificazione dei risultati della reazione utilizzando un sistema emolitico indicatore (globuli rossi di pecora e siero emolitico). La distruzione dei globuli rossi da parte del siero emolitico avviene solo se al sistema emolitico viene aggiunto il complemento. Se il complemento è stato precedentemente adsorbito sul complesso antigene-anticorpo, non si verifica l'emolisi degli eritrociti (Fig.).
Risultato dell'esperienza
valutato (Fig. 2), rilevando la presenza o l'assenza di emolisi in tutte le provette. La reazione è considerata positiva quando l'emolisi è completamente ritardata, quando il liquido nella provetta è incolore e i globuli rossi si depositano sul fondo, negativa - quando i globuli rossi sono completamente lisati, quando il liquido è intensamente colorato (sangue "vernice" ).
Il grado di ritardo dell'emolisi viene valutato in base all'intensità del colore del liquido e alla dimensione del sedimento di globuli rossi sul fondo (++++, +++, ++, +).
Riso. 4. Rendiconto e risultato della RSC.
Conclusione:Nel siero del test sono stati rilevati anticorpi.
RSK consente di rilevare gli anticorpi contro qualsiasi ceppo dello stesso sierotipo del virus.
Il valore diagnostico ha:
un aumento di quattro volte del titolo anticorpale in sieri accoppiati (durante un'epidemia di influenza);
un duplice aumento del siero sanguigno dei pazienti con un quadro clinico caratteristico.
Reazioni utilizzando un tag :
Questi metodi sono altamente sensibili. Coloranti, isotopi radioattivi, enzimi, ecc. vengono utilizzati come etichette per antigeni o anticorpi.
RIF – reazione di immunofluorescenza
La reazione di immunofluorescenza si basa sull'indicazione luminosa del complesso antigene-anticorpo
Saggio immunoassorbente collegato.
Moderno test di laboratorio, durante il quale viene condotta la ricerca di anticorpi specifici nel sangue o antigeni di malattie specifiche al fine di identificare non solo l'eziologia, ma anche lo stadio della malattia.
I risultati ELISA possono essere forniti qualitativamente e quantitativamente.
Attualmente, l'ELISA viene utilizzato nelle seguenti situazioni:
1) ricerca di anticorpi specifici contro qualsiasi malattia infettiva;
2) ricerca di antigeni di eventuali malattie (infettive, venereologiche);
3) studio dello stato ormonale del paziente;
4) esame dei marcatori tumorali;
5) esame per la presenza di malattie autoimmuni.
Nella figura, l'ELISA in fase solida mostra antigeni noti (a sinistra) adsorbiti su un pozzetto di una piastra, (a destra) su pozzetti di una piastra antigeni noti
Vantaggi del metodo ELISA:
1) Elevata specificità e sensibilità del metodo ELISA (oltre il 90%).
2) La capacità di determinare la malattia e tracciare la dinamica del processo, cioè confrontando il numero di anticorpi in diversi periodi di tempo.
3) Disponibilità della diagnostica ELISA in qualsiasi istituzione medica.
Svantaggio relativo: rilevamento di una risposta immunitaria (anticorpi), ma non dell'agente patogeno stesso, coniugato a un enzima tag.
Test ELISA (meccanismo generale):
La base del test immunoenzimatico è la reazione immunitaria dell'antigene e dell'anticorpo con la formazione di un complesso immunitario: antigene-anticorpo, a seguito del quale si verifica un cambiamento attività enzimatica segni specifici sulla superficie degli anticorpi.
Componenti della reazione:
1. AG(AT) noto - sul pozzetto della compressa.
2. AT (AG) in fase di studio.
3. AT con enzima, specifico del complesso AT(AG)-AG(AT).
4. substrato cromogenico che interagisce con l'enzima
5. interrompere la soluzione
Principali fasi dell'ELISA
1. Sulla superficie dei pozzetti della piastra è presente un antigene purificato di un agente patogeno specifico. Aggiungono materiale biologico paziente, si verifica una reazione specifica tra questo antigene e l'anticorpo desiderato (immunoglobulina). Si forma un complesso.
2. Viene aggiunto un coniugante – AT con l'enzima. Il coniugante è specifico per il complesso AT-AG del primo stadio. L'enzima è attivato.
3. Viene aggiunto il substrato e l'enzima attivo reagisce con esso, modificando il colore incolore della soluzione.
4. Viene aggiunta una soluzione di arresto per interrompere l'interazione enzima-substrato.
Contabilità.
Un risultato positivo è un cambiamento di colore, giallo nell'immagine.
Analisi immunocromatografica
Il metodo di analisi immunocromatografica (ICA, test rapidi) è un metodo di screening preliminare di alta qualità che consente di eseguire rapidamente, in pochi minuti, analisi in qualsiasi condizione, incl. "campo".
I vantaggi dell’ICA includono:
Velocità e facilità d'uso;
Piccoli volumi di campione, mancanza di preparazione del campione;
Economicità per il produttore e il consumatore;
Possibilità di produrre test in grandi volumi;
Facilità di lettura e interpretazione del risultato;
Elevata sensibilità e riproducibilità;
Possibilità di determinazione quantitativa;
Possibilità di utilizzare lettori portatili compatibili con un computer;
Possibilità di multianalisi.
Componenti (applicati sulla striscia reattiva):
1. Il coniugato con etichetta in oro colloidale è specifico per l'antigene rilevato.
2. Linea di test AT – specifica per il complesso AT-AG
3. Gli addominali della linea di controllo sono specifici del coniugato.
Impostazione ICA:
1.Applicare il campione sull'area iniziale designata della striscia.
2. Ottenere il risultato sotto forma di strisce colorate al posto delle linee di test e di controllo.
Contabilità
Positivo – quando la linea del test è colorata.
Negativo - se non è presente alcuna colorazione sulla linea del test.
Non valido – se la linea di controllo non è colorata.
Meccanismo generale IHA:
1. Il campione viene introdotto nel campo iniziale (tampone del campione) ed è associato al coniugato (un corpo specifico con un'etichetta colorata), che si trova sul tampone del coniugato. Di conseguenza, si forma un complesso colorato.
2. Il complesso immunitario colorato risultante si muove sotto l'azione delle forze capillari lungo la membrana di nitrocellulosa E interagiscecon linea di prova AT.Il risultato è un'unica striscia colorata rosa-rossa.
3. AT (coniugato) non legato alla banda testatasi sposta oltre e raggiunge la linea di controllo, comunica con l'AT della linea di controllo.Di conseguenza appare una seconda striscia colorata.Se l'analisi viene eseguita correttamente, la linea di Controllo dovrebbe sempre apparire, indipendentemente dalla presenza dell'antigene (anticorpo) del test nel campione di fluido biologico.
2. Condizioni per condurre reazioni sierologiche.
1. La presenza di omologhi - corrispondenti tra loro antigene e anticorpo.
2. Piatti puliti e asciutti.
3. Un certo rapporto tra farmaci (il più delle volte uguale).
4. Presenza obbligatoria di un elettrolita (soluzione isotonica di NaCl).
5. pH neutro o quasi leggermente alcalino.
6. Temperatura +37°C o temperatura ambiente (necessariamente positiva).
7. Vengono eseguiti il controllo dell'antigene e il controllo del siero (anticorpo).
3 Requisiti del siero
Il siero deve essere completamente trasparente senza alcuna mescolanza di cellule.
Di solito lo ricevono alla 2a settimana di malattia, quando gli anticorpi sono già disponibili.
Il sangue viene prelevato in una quantità di 3-5 ml a stomaco vuoto o 6 ore dopo un pasto.
Per ottenere il siero, il sangue viene lasciato per 1 ora a temperatura ambiente o centrifugato. Il siero viene aspirato con molta attenzione per non catturare gli elementi formati.
I sieri immunitari sono ottenuti dal sangue di persone o animali (solitamente conigli e cavalli), immunizzati secondo un determinato schema con l'antigene corrispondente (vaccino). I sieri vengono solitamente preparati durante la produzione.
4. Il concetto di risultati positivi e negativi.
RA.
Con una reazione positiva, i globuli rossi incollati passivamente coprono il fondo del foro in uno strato uniforme con bordi smerlati (“ombrello”); in assenza di agglutinazione, i globuli rossi si accumulano nel recesso centrale del foro, formando un “bottone” compatto con bordi ben definiti (vedi immagini sopra).
RP.
Se il risultato è positivo, si forma un anello lattiginoso all'interfaccia delle due soluzioni (vedi immagini sopra).
ELISA.
Un cambiamento nel colore della soluzione avviene con una reazione positiva.
RSK.
Emolisi ritardata: la reazione è positiva; se il complemento è libero, si osserva emolisi: la reazione è negativa(vedi foto sopra).
Risultati della reazione Wasserman:
a - ritardo completo dell'emolisi (+ + ++);
b - ritardo pronunciato nell'emolisi (+ ++);
c - ritardo parziale dell'emolisi (++);
d - leggero ritardo nell'emolisi (+);
d - emolisi completa (-).
La reazione è positiva con ritardo parziale, pronunciato e completo dell'emolisi, determinato dal grado di colorazione del contenuto delle provette dal rosa chiaro al rosso vivo; gli eritrociti non emolizzati formano successivamente un precipitato rosso.
Compiti a casa:
1. Studia il materiale
Prendi 3 appunti sul video
N. 29 Reazione di agglutinazione. Componenti, meccanismo, metodi di installazione. Applicazione.
Reazione di agglutinazione- una semplice reazione in cui gli anticorpi legano antigeni corpuscolari (batteri, eritrociti o altre cellule, particelle insolubili con antigeni adsorbiti su di essi, nonché aggregati macromolecolari). Si verifica in presenza di elettroliti, ad esempio, quando viene aggiunta una soluzione isotonica di cloruro di sodio.
Vengono utilizzate varie varianti della reazione di agglutinazione: estesa, indicativa, indiretta, ecc. La reazione di agglutinazione si manifesta con la formazione di scaglie o sedimenti (cellule “incollate” con anticorpi aventi due o più centri di legame con l'antigene - Fig. 13.1). RA è utilizzato per:
1) determinazioni anticorpali nel siero sanguigno di pazienti, ad esempio, con brucellosi (reazioni di Wright, Heddelson), tifo e febbre paratifo (reazione Vidal) e altre malattie infettive;
2) determinazione dell'agente patogeno, isolato da un paziente;
3) determinazione dei gruppi sanguigni utilizzando anticorpi monoclonali contro alloantigeni eritrocitari.
Per determinare gli anticorpi in un paziente eseguire una reazione di agglutinazione dettagliata: Diagnosticum (una sospensione di microbi uccisi) viene aggiunto alle diluizioni del siero del sangue del paziente e, dopo diverse ore di incubazione a 37 °C, si nota la diluizione del siero (titolo del siero) più alta alla quale si è verificata l'agglutinazione, cioè si è formato un precipitato formato.
La natura e la velocità dell'agglutinazione dipendono dal tipo di antigene e di anticorpi. Un esempio sono le peculiarità dell'interazione dei diagnostici (antigeni O e H) con anticorpi specifici. La reazione di agglutinazione con O-diagnosticum (batteri uccisi dal calore, che conservano l'antigene O termostabile) avviene sotto forma di agglutinazione a grana fine. La reazione di agglutinazione con H-diagnosticum (batteri uccisi dalla formaldeide, che conservano l'antigene H flagellare termolabile) è grossolana e procede più velocemente. Se è necessario determinare l'agente patogeno isolato dal paziente, inserire reazione di agglutinazione indicativa, utilizzando anticorpi diagnostici (siero agglutinante), cioè viene effettuata la sierotipizzazione dell'agente patogeno. Una reazione indicativa viene eseguita su un vetrino. Una coltura pura dell'agente patogeno isolato dal paziente viene aggiunta ad una goccia di siero agglutinante diagnostico ad una diluizione di 1:10 o 1:20. Accanto viene posto un controllo: al posto del siero viene applicata una goccia di soluzione di cloruro di sodio. Quando in una goccia con siero e microbi appare un sedimento flocculante, in provette viene eseguita una reazione di agglutinazione dettagliata con diluizioni crescenti del siero agglutinante, a cui vengono aggiunte 2-3 gocce di una sospensione dell'agente patogeno. L'agglutinazione viene presa in considerazione dalla quantità di sedimento e dal grado di limpidezza del liquido. La reazione è considerata positiva se si osserva agglutinazione in una diluizione vicina al titolo del siero diagnostico. Allo stesso tempo, vengono presi in considerazione i controlli: il siero diluito con una soluzione isotonica di cloruro di sodio deve essere trasparente, la sospensione dei microbi nella stessa soluzione deve essere uniformemente torbida, senza sedimenti.
Diversi batteri correlati possono essere agglutinati dallo stesso siero agglutinante diagnostico, che
li rende difficili da identificare. Pertanto, utilizzano sieri agglutinanti adsorbiti da cui
anticorpi che reagiscono in modo crociato mediante adsorbimento a batteri correlati. Gli anticorpi sono conservati in tali sieri,
specifico solo per un dato batterio.
L'agglutinazione è l'incollaggio dei batteri come risultato dell'interazione di AT specifici con essi. Per effettuare l'AR sono necessari tre componenti: 1) AG (agglutinogeno); 2) AT (agglutinina); 3) soluzione elettrolitica (soluzione isotonica di cloruro di sodio). Solo gli antigeni corpuscolari (batteri, globuli rossi, particelle di lattice caricate di antigeni) prendono parte alla reazione di agglutinazione.
Reazione di agglutinazione su vetro. Una goccia di siero diagnostico viene applicata con una pipetta su un vetrino senza grassi (diluizione del siero 1:10 - 1:20). Utilizzando un'ansa batteriologica, una coltura pura del microrganismo in studio viene prelevata dalla superficie dell'agar inclinato, trasferita in una goccia di siero e miscelata. Il risultato della reazione viene preso in considerazione ad occhio nudo dopo 3-5 minuti. Se la reazione è positiva, in una goccia di siero si nota la comparsa di scaglie (grandi o piccole), chiaramente visibili su fondo scuro quando si agita il vetrino. In caso di reazione negativa il liquido rimane uniformemente torbido.
Reazione di agglutinazione in provette. Ad una fila di provette viene aggiunto 1 ml di soluzione fisiologica. Un volume uguale del siero sanguigno da analizzare viene aggiunto alla prima provetta. Vengono preparate diluizioni seriali doppie del siero (titolazione del siero), dopodiché in ciascuna provetta vengono aggiunte 2 gocce di una sospensione di batteri inattivati (diagnosticum). Le provette vengono poste in un termostato a 37°C per 2 ore. La reazione procede con la formazione di piccole scaglie invisibili ad occhio nudo, quindi i risultati vengono registrati sotto un leggero ingrandimento in un dispositivo speciale: un agglutinoscopio. L'intensità dell'agglutinazione viene presa in considerazione secondo il sistema "quattro più": agglutinazione completa - 4+, agglutinazione parziale - 3+ o 2+, risultato discutibile - +. L'ultima diluizione in cui si osserva un'agglutinazione di 2+ viene presa come titolo anticorpale nel siero in esame.
Una reazione di agglutinazione in provette (una reazione di agglutinazione estesa) viene eseguita per determinare il titolo degli anticorpi contro gli agenti causali della febbre tifoide e della febbre paratifoide (reazione di Vidal), della brucellosi (reazione di Wright) e del tifo (reazione di Weigl).
L'agglutinazione (dal latino agglutinatio - incollare) è l'incollaggio (connessione) di particelle corpuscolari portatrici di antigene (cellule intere, particelle di lattice, ecc.) con molecole di anticorpi specifici in presenza di elettroliti, che termina con la formazione di scaglie o sedimenti (agglutinato) visibile ad occhio nudo. La natura del sedimento dipende dalla natura dell'antigene: i batteri flagellati producono un sedimento flocculante grossolano, i batteri flagellati e non capsulari producono un sedimento a grana fine e i batteri capsulari producono un sedimento filamentoso. Si distingue tra agglutinazione diretta, in cui i propri antigeni di un batterio o di qualsiasi altra cellula, come gli eritrociti, partecipano direttamente all'interazione con anticorpi specifici; e indiretto, o passivo, in cui cellule batteriche o eritrociti o particelle di lattice sono portatori non di propri, ma di antigeni (o anticorpi) estranei adsorbiti su di essi per identificare anticorpi (o antigeni) specifici per loro. La reazione di agglutinazione coinvolge principalmente anticorpi appartenenti alle classi IgG e IgM. Si svolge in due fasi: nella prima avviene un'interazione specifica tra il centro attivo degli anticorpi e il determinante dell'antigene; questa fase può verificarsi in assenza di elettroliti e non è accompagnata da cambiamenti visibili nel sistema reattivo. Per la seconda fase - la formazione dell'agglutinato - è necessaria la presenza di elettroliti, che si riducono carica elettrica complessi antigene + anticorpo e accelerano il processo del loro incollaggio. Questa fase termina con la formazione di un agglutinato.
Le reazioni di agglutinazione vengono eseguite su piastre di vetro o di cartone liscio oppure in provette di agglutinazione sterili. Le reazioni di agglutinazione (dirette e passive) sul vetro vengono solitamente utilizzate come metodo accelerato rilevamento di anticorpi specifici nel siero del paziente (ad esempio nella brucellosi) o per l'identificazione sierologica dell'agente patogeno. In quest'ultimo caso vengono solitamente utilizzati sieri diagnostici ben purificati (adsorbiti) contenenti solo anticorpi monorecettori o un insieme di essi contro vari antigeni. L'indubbio vantaggio della reazione di agglutinazione sul vetro è la semplicità della sua implementazione e il fatto che richiede diversi minuti o addirittura secondi, poiché entrambi i componenti vengono utilizzati in forma concentrata. Tuttavia ha solo un valore qualitativo ed è meno sensibile di una provetta. Un'ampia reazione di agglutinazione nelle provette fornisce risultati più accurati, poiché consente di determinare il contenuto quantitativo di anticorpi nel siero (stabilirne il titolo) e, se necessario, registrare il fatto di un aumento del titolo anticorpale, che ha valore diagnostico . Per avviare la reazione, una soluzione diluita allo 0,85% viene aggiunta in un determinato modo alle provette di agglutinazione. Soluzione NaCl siero e un volume uguale (solitamente 0,5 ml) di una sospensione di un diagnosticum standard (o coltura di prova) contenente 1 miliardo di batteri in 1 ml. I risultati della reazione di agglutinazione vengono registrati prima dopo 2 ore di incubazione delle provette a 37°C ed infine dopo 20-24 ore secondo due criteri: la presenza e dimensione del precipitato ed il grado di trasparenza del liquido surnatante. La valutazione viene effettuata secondo il sistema a quattro croci. La reazione è necessariamente accompagnata dal controllo del siero e dell'antigene. Nei casi in cui viene eseguita una reazione di agglutinazione dettagliata in provetta per l'identificazione sierologica dell'agente patogeno, essa ha valore diagnostico se la reazione è valutata positiva quando il siero diagnostico è diluito almeno alla metà del suo titolo.
Va tenuto presente che quando si mescolano soluzioni di antigeni e anticorpi omologhi, non sempre si osservano manifestazioni visibili della reazione di agglutinazione. Un precipitato si forma solo a determinati rapporti ottimali di entrambi i componenti della reazione. Al di fuori di questi limiti, con un eccesso significativo di antigene o anticorpi, non si osserva alcuna reazione. Questo fenomeno è chiamato “fenomeno prozona”. Si osserva sia nella reazione di agglutinazione che nella reazione di precipitazione. La comparsa della prozona nelle reazioni immunitarie è spiegata dal fatto che gli antigeni coinvolti in esse, di regola, sono polideterminanti e le molecole Anticorpi IgG hanno due centri attivi. Con un eccesso di anticorpi, la superficie di ciascuna particella antigene è ricoperta da molecole anticorpali in modo che non rimangano gruppi determinanti liberi, quindi il secondo centro attivo non legato degli anticorpi non può interagire con un'altra particella antigene e legarli tra loro. La formazione di un agglutinato o precipitato visibile viene soppressa anche in caso di eccesso di antigene, quando non rimane un solo centro attivo libero degli anticorpi e quindi i complessi antigene + anticorpo + antigene non possono più allargarsi.
Opzioni per reazioni di agglutinazione accelerate. Reazione di emoagglutinazione passiva e sue varianti
La classica reazione di agglutinazione prevede l'utilizzo di antigeni corpuscolari. Tuttavia, possono essere coinvolti anche antigeni solubili. Per rendere ciò possibile, tali antigeni vengono adsorbiti su particelle immunologicamente inerti. Come veicolo possono essere utilizzate particelle di lattice o bentonite, ma attualmente vengono utilizzati più spesso eritrociti animali o umani, migliorandone le proprietà adsorbenti trattandoli con soluzioni di tannino, formalina o benzidina. I globuli rossi che hanno adsorbito un antigene su se stessi sono detti sensibilizzati da questo antigene e la reazione immunitaria a cui partecipano è chiamata reazione di emoagglutinazione indiretta o passiva (IRHA o RPHA), poiché i globuli rossi vi partecipano passivamente.
L'RPGA è posto in apposite lastre di polistirolo forate a fondo semisferico. Quando lo si utilizza per la diagnostica sierologica, in questi pozzetti vengono preparate diluizioni doppie del siero in esame in soluzione fisiologica, a cui viene quindi aggiunta una sospensione di eritrociti sensibilizzati come agente diagnostico. I risultati vengono registrati dopo 2 ore di incubazione a 37 °C utilizzando il sistema a quattro croci. Con una reazione positiva, i globuli rossi agglutinati si depositano sul fondo del foro e lo coprono uniformemente sotto forma di un ombrello rovesciato. Se la reazione è negativa, anche i globuli rossi si sedimentano, il liquido diventa limpido e il sedimento appare come un piccolo “disco” al centro del pozzetto. Il titolo del siero in RPHA è considerato la sua ultima diluizione, che senza dare ancora un'emoagglutinazione pronunciata segnali significativi la presenza di un “disco”.
L'RPGA può essere utilizzato anche come metodo accelerato di diagnostica batteriologica per rilevare direttamente nel materiale di prova batteri, virus, tossine sconosciuti, ad esempio agenti patogeni della peste, enterotossine stafilococciche, ecc. Con questa versione dell'RPGA, gli eritrociti adsorbiti, noti per la loro specificità sono usati come componente noto della reazione anticorpi - anticorpo eritrocitario diagnostico. Se il materiale del test contiene una quantità sufficiente di un antigene noto, l'RPGA risulterà positivo.
Le opzioni per l'utilizzo dell'RPHA sono: reazione di neutralizzazione dell'antigene (RNAg), reazione di neutralizzazione dell'anticorpo (RNAb), reazione passiva di inibizione dell'emoagglutinazione (PHA). Per queste reazioni viene utilizzata la diagnostica eritrocitaria con antigeni e anticorpi. È possibile utilizzare contemporaneamente due reazioni unidirezionali che si controllano reciprocamente, ad esempio RPHA con un antigene diagnostico e RNAg con un anticorpo eritrocitario diagnostico.
La reazione di neutralizzazione degli anticorpi (RNAb) consiste nel miscelare una sospensione contenente l'antigene desiderato con un siero immunitario specifico contenente anticorpi noti in volumi appropriati e nell'incubare a 37 °C per due ore. Successivamente viene aggiunto un diagnostico eritrocitario antigenico. La miscela viene agitata e lasciata a temperatura ambiente. I risultati vengono presi in considerazione dopo 3-4 ore e infine dopo 18-24 ore.Se il materiale da testare contiene antigene, si legherà agli anticorpi (neutralizzandoli) e quindi non si verificherà emoagglutinazione.
La reazione di neutralizzazione dell'antigene (RNAg) viene eseguita utilizzando lo stesso principio. Solo in questo caso vengono rilevati anticorpi nel materiale da testare. Un antigene specifico aggiunto a tale materiale di prova si legherà agli anticorpi in esso contenuti, cioè si verificherà la neutralizzazione dell'antigene da parte degli anticorpi e pertanto non si verificherà emoagglutinazione quando si aggiunge un anticorpo eritrocitario diagnostico.
Reazione di coagglutinazione. È una delle opzioni per una reazione di agglutinazione passiva, cioè accelerata, su vetro mediata da cellule portatrici di anticorpi. Questa reazione è basata su proprietà unica Staphylococcus aureus, che contiene la proteina A nella sua parete cellulare, si lega ai frammenti Fc di IgG e IgM. In questo caso, i centri attivi degli anticorpi rimangono liberi e possono interagire con determinanti specifici degli antigeni. Su un vetrino si applica una goccia di una sospensione di stafilococchi al 2%, sensibilizzata con opportuni anticorpi, e si aggiunge una goccia di una sospensione dei batteri in studio. Se l'antigene corrisponde agli anticorpi, entro 30-60 s avviene una chiara agglutinazione degli stafilococchi carichi di anticorpi.
Reazione di agglutinazione al lattice (LAR). Il vettore degli anticorpi in questo sistema diagnostico sono piccole particelle di lattice standard. La reazione viene eseguita utilizzando il micrometodo in pozzetti su vetro. La condizione principale per il successo della stadiazione della PAH è il rigoroso rispetto dei rapporti quantitativi dei componenti del sistema: 10 μl di un preparato di lattice sensibilizzato con anticorpi vengono aggiunti a 50 μl del materiale da testare. La specificità degli IPA viene controllata utilizzando tre test di controllo contenuti nei sistemi di test commerciali: noti reazione positiva, ovviamente reazione negativa e controllo di qualità della sospensione di lattice utilizzando lattici non sensibilizzati agli IPA (non contenenti anticorpi) con il materiale di prova. Nel nostro Paese, come trasportatori di anticorpi specifici, vengono utilizzati lattici di polistirene monodispersi con diversi diametri delle particelle (0,3; 0,66; 0,75; 0,8 μm). Il LAG viene utilizzato per il rilevamento rapido di microrganismi o dei loro antigeni nel materiale di prova.
Rilevazione immunomagnetica degli antigeni. Una delle opzioni per la reazione di agglutinazione accelerata sul vetro è associata all'uso di particelle polimeriche supermagnetiche rivestite con anticorpi specifici. Una di queste particelle lega fino a 107-108 cellule di microrganismi, a causa della quale sensibilità questo metodo raggiunge 5 CFU/ml. Il rilevamento immunomagnetico dei microrganismi può essere utilizzato in combinazione con la RCP.
Reazione di emoagglutinazione aggregata (AHA). Consente di rilevare rapidamente nel sangue dei pazienti sia antigeni liberamente circolanti (antigenemia) sia antigeni associati ad anticorpi - complessi immuni circolanti (CIC). Per l'RAHA vengono utilizzati globuli rossi sensibilizzati con anticorpi appropriati. L'aggiunta del siero del sangue del paziente, che contiene antigeni, agli eritrociti sensibilizzati su cui sono fissati gli anticorpi, porta all'incollaggio (agglutinazione) degli eritrociti e degli immunocomplessi.
Test dell'antiglobulina di Coombs (reazione di R. Coombs). Gli anticorpi completi (bivalenti) vengono determinati utilizzando reazioni di agglutinazione diretta e passiva. Gli anticorpi incompleti (monovalenti, bloccanti) non vengono rilevati con questi metodi, poiché, quando si combinano con l'antigene, lo bloccano, ma non possono causare l'aggregazione dell'antigene in grandi conglomerati. Gli anticorpi incompleti (bloccanti) sono quelli in cui funziona un solo centro attivo; il secondo centro attivo non funziona per un motivo sconosciuto. Per rilevare gli anticorpi incompleti viene utilizzata una speciale reazione di Coombs (Fig. 72). La reazione coinvolge: il siero del paziente, in cui il anticorpi incompleti, antigene corpuscolare-diagnostico, siero antiglobulina contenente anticorpi contro la globulina umana. La reazione avviene in due fasi:
Interazione dell'antigene con anticorpi incompleti. Non ci sono manifestazioni visibili. La prima fase viene completata lavando l'antigene dal siero rimanente del paziente.
Interazione del siero antiglobulina ottenuto come risultato dell'immunizzazione di un animale con globulina umana con anticorpi incompleti adsorbiti sull'antigene. A causa del fatto che gli anticorpi antiglobulina sono bivalenti, legano due anticorpi monovalenti di complessi separati di antigene + anticorpo incompleto, il che porta al loro incollaggio e alla comparsa di un precipitato visibile.
13.1. Reazioni antigene-anticorpo e loro applicazioni
Quando viene introdotto un antigene, nel corpo si formano anticorpi. Gli anticorpi sono complementari all'antigene che ne ha causato la sintesi e sono in grado di legarsi ad esso. Il legame degli antigeni agli anticorpi consiste di due fasi. La prima fase è specifica, in cui avviene il rapido legame del determinante antigenico al centro attivo del frammento Fab degli anticorpi. Va notato che il legame è dovuto alle forze di van der Waals, all'idrogeno e alle interazioni idrofobiche. La forza del legame è determinata dal grado di corrispondenza spaziale tra il sito attivo dell'anticorpo e l'epitopo dell'antigene. Dopo la fase specifica, inizia una fase più lenta, non specifica, che si manifesta con un fenomeno fisico visibile (ad esempio la formazione di scaglie durante l'agglutinazione, ecc.).
Le reazioni immunitarie sono interazioni tra anticorpi e antigeni e queste reazioni sono specifiche e altamente sensibili. Sono ampiamente utilizzati in pratica medica. Con l'aiuto delle reazioni immunitarie, è possibile risolvere i seguenti problemi:
Determinazione di anticorpi sconosciuti mediante antigeni noti (antigenic diagnosticum). Questo compito si verifica quando è necessario determinare gli anticorpi contro un agente patogeno nel siero del paziente (sierodiagnosi). Il reperimento degli anticorpi permette di confermare la diagnosi;
Determinazione di antigeni sconosciuti utilizzando anticorpi noti (siero diagnostico). Questo studio viene effettuato quando si identifica una coltura patogena isolata dal materiale di un paziente (sierotipizzazione), nonché quando si rileva
antigeni microbici e loro tossine nel sangue e in altri fluidi biologici. Esistono molti tipi di reazioni immunitarie, che differiscono nella tecnica di stadiazione e nell'effetto registrato. Si tratta di reazioni di agglutinazione (RA), reazioni di precipitazione (RP), reazioni che coinvolgono il complemento (RSC), reazioni che utilizzano componenti marcati (RIF, ELISA, RIA).
13.2. Reazione di agglutinazione
Una reazione di agglutinazione (RA) è una reazione immunitaria dell'interazione di un antigene con anticorpi in presenza di elettroliti e l'antigene si trova in uno stato corpuscolare (eritrociti, batteri, particelle di lattice con antigeni adsorbiti). Durante l'agglutinazione, gli antigeni corpuscolari vengono incollati insieme dagli anticorpi, il che si manifesta con la formazione di un precipitato flocculante. La formazione di scaglie avviene a causa del fatto che gli anticorpi hanno due centri attivi e gli antigeni sono polivalenti, cioè hanno diversi determinanti antigenici. L'AR viene utilizzato per identificare l'agente patogeno isolato dal materiale del paziente, nonché per rilevare gli anticorpi contro l'agente patogeno nel siero del sangue del paziente (ad esempio, le reazioni di Wright e Heddleson per la brucellosi, la reazione di Widal per la febbre tifoide e la febbre paratifoide).
Il modo più semplice per diagnosticare l'AR è la reazione sul vetro; si tratta di un'AR approssimativa, che viene utilizzata per determinare l'agente patogeno isolato dal paziente. Una volta stabilita la reazione, si applica il siero agglutinante diagnostico su un vetrino (a una diluizione di 1:10 o 1:20), quindi si aggiunge una coltura del paziente. La reazione è positiva se nella goccia appare un sedimento flocculante. Accanto viene posto un controllo: al posto del siero viene applicata una goccia di soluzione di cloruro di sodio. Se il siero agglutinante diagnostico non viene adsorbito 1, viene diluito (al titolo - la diluizione alla quale dovrebbe avvenire l'agglutinazione), ad es. mettere l'RA espanso nelle provette con aumento
1 Il siero agglutinante non assorbito può agglutinare batteri correlati che presentano antigeni comuni (reattivi). Pertanto usanosieri agglutinanti adsorbiti, da cui gli anticorpi che reagiscono in modo crociato sono stati rimossi mediante adsorbimento su batteri correlati. Tali sieri trattengono anticorpi specifici solo per un dato batterio.
diluizioni di siero agglutinante, a cui vengono aggiunte 2-3 gocce di una sospensione dell'agente patogeno isolato dal paziente. L'agglutinazione viene presa in considerazione dalla quantità di sedimento e dal grado di limpidezza del liquido nelle provette. La reazione è considerata positiva se si osserva agglutinazione in una diluizione vicina al titolo del siero diagnostico. La reazione è accompagnata da controlli: il siero diluito con una soluzione isotonica di cloruro di sodio deve essere trasparente, la sospensione dei microbi nella stessa soluzione deve essere uniformemente torbida, senza sedimenti.
Per determinare gli anticorpi contro l'agente patogeno nel siero del sangue del paziente, viene utilizzata l'AR su vasta scala. Durante la preparazione, il siero del sangue del paziente viene diluito in provette e una uguale quantità di sospensione diagnosticum (sospensione di microbi uccisi) viene aggiunta alle provette. Dopo l'incubazione, viene determinata la diluizione del siero più alta alla quale si è verificata l'agglutinazione, vale a dire si è formato un precipitato (titolo del siero). In questo caso, la reazione di agglutinazione con O-diagnosticum (batteri uccisi dal riscaldamento, conservando l'antigene O termostabile) avviene sotto forma di agglutinazione a grana fine. La reazione di agglutinazione con H-diagnosticum (batteri uccisi dalla formaldeide, che conservano l'antigene H flagellare termolabile) è grossolana e procede più velocemente.
Reazione di emoagglutinazione indiretta (passiva).(RNGA o RPGA) è un tipo di RA. Questo metodo è altamente sensibile. Con l’aiuto dell’RNGA si possono risolvere due problemi: determinare gli anticorpi nel siero del paziente, a cui viene aggiunto un antigene eritrocitario diagnostico, ovvero eritrociti su cui sono adsorbiti antigeni noti; determinare la presenza di antigeni nel materiale di prova. In questo caso, la reazione è talvolta chiamata reazione di emoagglutinazione indiretta inversa (RONHA). Durante la procedura, al materiale del test viene aggiunto un anticorpo eritrocitario diagnostico (eritrociti con anticorpi adsorbiti sulla superficie). In questa reazione, i globuli rossi agiscono come trasportatori e sono passivamente coinvolti nella formazione degli aggregati immunitari. Con una reazione positiva, i globuli rossi incollati passivamente coprono il fondo del foro in uno strato uniforme con bordi smerlati (“ombrello”); in assenza di agglutinazione, i globuli rossi si accumulano nella cavità centrale del foro, formando un “bottone” compatto dai bordi ben definiti.
Reazione di coagglutinazione utilizzato per determinare le cellule patogene (antigeni) utilizzando anticorpi adsorbiti Staphylococcus aureus, contenente proteina A. La proteina A ha un'affinità per il frammento Fc delle immunoglobuline. Grazie a ciò, gli anticorpi si legano allo stafilococco indirettamente attraverso il frammento Fc, mentre i frammenti Fab sono orientati verso l'esterno e sono in grado di interagire con i corrispondenti microbi isolati dai pazienti. In questo caso si formano dei fiocchi.
Reazione di inibizione dell'emoagglutinazione (HAI) utilizzato nella diagnosi delle infezioni virali e solo delle infezioni causate da virus emoagglutinanti. Questi virus contengono una proteina sulla loro superficie: l'emoagglutinina, che è responsabile della reazione di emoagglutinazione (HRA) quando i globuli rossi vengono aggiunti ai virus. RTGA comporta il blocco degli antigeni virali con anticorpi, a seguito dei quali i virus perdono la capacità di agglutinare i globuli rossi.
Reazione di Coombs - RA per la determinazione degli anticorpi incompleti. In alcune malattie infettive, come la brucellosi, gli anticorpi incompleti contro l’agente patogeno circolano nel siero del paziente. Gli anticorpi incompleti sono chiamati anticorpi bloccanti perché hanno un sito di legame con l’antigene e non due, come gli anticorpi completi. Pertanto, quando viene aggiunto un diagnosticum antigenico, gli anticorpi incompleti si legano agli antigeni, ma non li uniscono insieme. Per manifestare la reazione, viene aggiunto siero antiglobulina (anticorpi contro le immunoglobuline umane), che porterà all'agglutinazione degli immunocomplessi (diagnostico antigenico + anticorpi incompleti) formati nella prima fase della reazione.
La reazione indiretta di Coombs viene utilizzata nei pazienti con emolisi intravascolare. In alcuni di questi pazienti vengono rilevati anticorpi anti-Rhesus monovalenti incompleti. Interagiscono specificamente con gli eritrociti Rh-positivi, ma non provocano la loro agglutinazione. Pertanto, il siero antiglobulina viene aggiunto al sistema di anticorpi anti-Rh + eritrociti Rh-positivi, che provoca l'agglutinazione degli eritrociti. Per la diagnosi viene utilizzato il test di Coombs condizioni patologiche, associato alla lisi intravascolare degli eritrociti di origine immunitaria, ad esempio, la malattia emolitica dei neonati causata dal conflitto Rh.
RA per la determinazione dei gruppi sanguigni si basa sull'agglutinazione degli eritrociti da parte degli anticorpi del siero immunitario contro gli antigeni del gruppo sanguigno A(II), B(III). Il controllo è un siero che non contiene anticorpi, cioè siero del gruppo sanguigno AB(IV) e antigeni eritrocitari dei gruppi A(P) e B(III). I globuli rossi del gruppo 0 (I) vengono utilizzati come controllo negativo perché non contengono antigeni.
Per la determinazione del fattore Rh vengono utilizzati sieri anti-Rh (almeno due serie diverse). Se è presente un antigene Rh sulla membrana degli eritrociti in esame, si verifica l'agglutinazione di queste cellule.
13.3. Reazione di precipitazione
RP è una reazione immunitaria dell'interazione di anticorpi con antigeni in presenza di elettroliti e l'antigene è in uno stato solubile. Durante la precipitazione, gli antigeni solubili vengono precipitati dagli anticorpi, che si manifesta con torbidezza sotto forma di bande di precipitazione. La formazione di un precipitato visibile si osserva quando entrambi i reagenti vengono miscelati in rapporti equivalenti. Un eccesso di uno di essi riduce il numero di complessi immuni precipitati. Esistono vari modi per eseguire la reazione di precipitazione.
Reazione di precipitazione dell'anello posti in tubi di precipitazione di piccolo diametro. Il siero immunitario viene aggiunto alla provetta e l'antigene solubile viene accuratamente stratificato. Se il risultato è positivo, all'interfaccia delle due soluzioni si forma un anello lattiginoso. La reazione di precipitazione dell'anello, che viene utilizzata per determinare la presenza di antigeni negli organi e nei tessuti, i cui estratti vengono bolliti e filtrati, è chiamata reazione di termoprecipitazione (reazione di Ascoli per la determinazione dell'antigene dell'antrace termostabile).
Doppia reazione di immunodiffusione di Ouchterlony. Questa reazione viene effettuata in un gel di agar. In uno strato di gel di spessore uniforme, i pozzetti vengono ritagliati ad una certa distanza l'uno dall'altro e riempiti rispettivamente con antigene e siero immunitario. Successivamente, gli antigeni e gli anticorpi si diffondono nel gel, si incontrano e formano complessi immunitari, che precipitano nel gel e diventano visibili come linee di precisione.
nutrizione. Questa reazione può essere utilizzata per identificare antigeni o anticorpi sconosciuti, e anche per testare la somiglianza tra diversi antigeni: se gli antigeni sono identici, le linee di precipitazione si fondono, se gli antigeni non sono identici, le linee di precipitazione si intersecano, se gli antigeni sono parzialmente identico, si forma uno sperone.
Reazione di immunodiffusione radiale. Nel fuso gel di agar Vengono aggiunti gli anticorpi e il gel viene applicato in uno strato uniforme sul vetro. I pozzetti vengono ritagliati nel gel e ad essi viene aggiunto un volume standard di soluzioni antigeniche di diverse concentrazioni. Durante l'incubazione, gli antigeni si diffondono radialmente dal pozzetto e, incontrando gli anticorpi, formano un anello di precipitazione. Finché nel pozzetto rimane l'antigene in eccesso, si verifica un graduale aumento del diametro dell'anello di precipitazione. Questo metodo viene utilizzato per determinare antigeni o anticorpi nella soluzione test (ad esempio, per determinare la concentrazione di immunoglobuline di diverse classi nel siero del sangue).
Immunoelettroforesi. La miscela di antigeni viene prima separata elettroforeticamente, quindi l'antisiero precipitante viene aggiunto nella scanalatura che corre lungo la direzione del movimento delle proteine. Gli antigeni e gli anticorpi si diffondono nel gel gli uni verso gli altri; interagendo, formano linee arcuate di precipitazione.
Reazione di flocculazione(secondo Ramon) - un tipo di reazione di precipitazione che viene utilizzata per determinare l'attività del siero antitossico o del tossoide. La reazione viene effettuata in provette. In una provetta in cui il tossoide e l'antitossina sono in rapporto equivalente, si osserva torbidità.
13.4. Reazione di fissazione del complemento
Gli anticorpi, interagendo con l'antigene corrispondente, si legano al complemento aggiunto (1° sistema). Un indicatore della fissazione del complemento sono gli eritrociti sensibilizzati con siero emolitico, ad es. anticorpi contro i globuli rossi (2° sistema). Se il complemento non è fisso nel 1° sistema, cioè Se la reazione antigene-anticorpo non avviene, i globuli rossi sensibilizzati vengono completamente lisati (reazione negativa). Quando il complemento viene fissato dagli immunocomplessi del 1° sistema dopo l'aggiunta di eritrociti sensibilizzati, si verifica l'emolisi da
assente (reazione positiva). La reazione di fissazione del complemento viene utilizzata per diagnosticare malattie infettive (gonorrea, sifilide, influenza, ecc.).
13.5. Reazione di neutralizzazione
I microbi e le loro tossine hanno un effetto dannoso sugli organi e sui tessuti del corpo umano. Gli anticorpi sono in grado di legarsi a questi agenti dannosi e bloccarli, ad es. neutralizzare. Sulla base di questa caratteristica degli anticorpi risposta diagnostica neutralizzazione. Si effettua introducendo una miscela antigene-anticorpo negli animali o in oggetti di test sensibili (colture cellulari, embrioni). Ad esempio, per rilevare le tossine nel materiale di un paziente, agli animali del 1° gruppo viene iniettato il materiale del paziente. Agli animali del 2° gruppo viene iniettato materiale simile, pretrattato con l'apposito antisiero. Gli animali del 1° gruppo muoiono se nel materiale è presente una tossina. Il secondo gruppo di animali sopravvive; l'effetto dannoso della tossina non si manifesta, poiché viene neutralizzata.
13.6. Reazioni che utilizzano anticorpi o antigeni marcati
13.6.1. Reazione di immunofluorescenza (RIF, metodo Koons)
Questo metodo viene utilizzato per la diagnostica rapida. Può essere utilizzato per rilevare sia antigeni microbici che anticorpi.
Metodo RIF diretto- una reazione immunitaria derivante dall'interazione di anticorpi con antigeni e gli anticorpi sono marcati con un fluorocromo - una sostanza in grado di emettere quanti di luce di una certa lunghezza d'onda quando esposta alla luce di una certa lunghezza d'onda. La particolarità di questo metodo è la necessità di rimuovere i componenti non reagiti al fine di escludere la rilevazione di luminescenza aspecifica. Per fare questo, lavare gli anticorpi non reagiti. I risultati vengono valutati utilizzando un microscopio a fluorescenza. I batteri in uno striscio trattato con un siero così luminescente si illuminano su uno sfondo scuro lungo la periferia della cellula.
Metodo RIF indiretto viene utilizzato più spesso del precedente. Questa reazione viene effettuata in due fasi. Nella prima fase, gli antigeni si scambiano reciprocamente
interagiscono con gli anticorpi corrispondenti, formando immunocomplessi. Tutti i componenti che non hanno reagito (cioè che non fanno parte degli immunocomplessi) devono essere rimossi mediante lavaggio. Nella seconda fase, il complesso antigene-anticorpo risultante viene rilevato utilizzando siero antiglobulina fluorocromizzato. Di conseguenza, si forma un complesso di microbo + anticorpi antimicrobici di coniglio + anticorpi contro le immunoglobuline di coniglio, marcati con fluorocromo. I risultati vengono valutati utilizzando un microscopio a fluorescenza.
13.6.2. Metodo o analisi di immunoassorbimento enzimatico
ELISA: il più comune metodo moderno, utilizzato per la diagnosi di infezioni virali, batteriche, protozoarie, in particolare per la diagnosi dell'infezione da HIV, Epatite virale e così via.
Ci sono molte modifiche ELISA. L'ELISA non competitivo in fase solida è ampiamente utilizzato. Viene effettuata in piastre di polistirene da 96 pozzetti (fase solida). Quando si esegue una reazione, è necessario lavare via i componenti non reagiti in ogni fase. Quando si determinano gli anticorpi, il siero del sangue in esame viene aggiunto ai pozzetti su cui sono assorbiti gli antigeni, quindi il siero antiglobulina viene marcato con un enzima. La reazione viene effettuata aggiungendo un substrato per l'enzima. In presenza di un enzima, il substrato cambia e il complesso enzima-substrato viene selezionato in modo che il prodotto formato nella reazione venga colorato. Pertanto, con una reazione positiva, si osserva un cambiamento nel colore della soluzione. Per determinare gli antigeni, il carrier in fase solida viene sensibilizzato con anticorpi, quindi vengono aggiunti in sequenza il materiale di prova (antigeni) e il siero marcato con enzima agli antigeni. Affinché la reazione avvenga, viene aggiunto un substrato per l'enzima. Un cambiamento nel colore della soluzione avviene con una reazione positiva.
13.6.3. Immunoblot
Questo metodo si basa su una combinazione di elettroforesi ed ELISA. Quando si esegue l'immunoblotting (blotting dall'inglese. macchia- spot) una miscela complessa di antigeni viene prima sottoposta ad elettroforesi in gel di poliacrilammide. Il risultante anti-
i peptidi genici vengono trasferiti su una membrana di nitrocellulosa. Le macchie vengono quindi trattate con anticorpi marcati con enzima contro un antigene specifico, ad es. eseguire il test ELISA. L'immunoblotting viene utilizzato nella diagnosi di infezioni come l'HIV.
13.6.4. Microscopia elettronica immune
Il metodo prevede la microscopia dei virus (meno comunemente altri microbi) in un microscopio elettronico, pretrattati con il siero immunitario appropriato marcato con preparati elettro-otticamente densi, ad esempio la ferritina, una proteina contenente ferro.
13.7. Citometria a flusso
Le cellule del sangue vengono differenziate in base alla citofluorimetria laser. Per fare ciò, le cellule desiderate vengono colorate con anticorpi monoclonali fluorescenti contro gli antigeni CD. Il campione di sangue, dopo essere stato trattato con anticorpi marcati, viene fatto passare attraverso un tubo sottile e attraverso di esso viene fatto passare un raggio laser, che eccita il fluorocromo a brillare. L'intensità della fluorescenza è correlata alla densità degli antigeni sulla superficie cellulare e può essere misurata quantitativamente utilizzando un tubo fotomoltiplicatore. I risultati ottenuti vengono convertiti in un istogramma.
Per determinare viene utilizzata la citometria a flusso stato immunitario(contenuto delle principali popolazioni di linfociti, contenuto di citochine intracellulari ed extracellulari, attività funzionale delle cellule NK, attività di fagocitosi, ecc.).
Reazione di agglutinazione dettagliata (RA). Per determinare l’AT nel siero del paziente, a reazione di agglutinazione estesa (RA). Per fare ciò, a una serie di diluizioni di siero sanguigno viene aggiunto un diagnosticum: una sospensione di microrganismi o particelle uccisi con Ag assorbito. La massima diluizione che dà agglutinazione Ag è chiamato titolo del siero.
Tipi di reazione di agglutinazione (RA) per rilevare l'AT - test su gocce di sangue per la tularemia (con un diagnosticum applicato su una goccia di sangue e la comparsa di agglutinati biancastri visibili) e il test di Huddleson per la brucellosi (con un diagnosticum colorato con viola di genziana applicato su una goccia di sangue siero).
Reazione di agglutinazione approssimativa (RA)
Per identificare i microrganismi isolati, un RA approssimativo viene posizionato sui vetrini. Per fare ciò, una coltura patogena viene aggiunta a una goccia di antisiero diagnostico standard (diluito 1:10, 1:20). Se il risultato è positivo, viene eseguita una reazione dettagliata con diluizioni crescenti dell'antisiero.
Reazione considerato positivo se si osserva agglutinazione in diluizioni prossime al titolo del siero diagnostico.
OSA. O-Ag somatici sono stabili al calore e possono resistere all'ebollizione per 2 ore e quando interagiscono con l'AT formano aggregati a grana fine.
N-Ag. N-Ag (flagellati) sono termolabili e si degradano rapidamente a 100 °C, nonché sotto l'influenza dell'etanolo. Nelle reazioni con l'antisiero H, dopo 2 ore di incubazione, si formano grandi scaglie sciolte (formate da batteri che si uniscono ai flagelli).
Vi-Ar i batteri del tifo sono relativamente stabili al calore (resiste a temperature di 60-62 °C per 2 ore); Quando incubato con l'antisiero Vi, si forma un agglutinato a grana fine.
Reazioni di emoagglutinazione diretta
Il più semplice di questi reazioni - agglutinazione globuli rossi, o emoagglutinazione, utilizzati per determinare i gruppi sanguigni nel sistema ABO. Per determinare agglutinazione(o la loro mancanza) utilizzare antisieri standard con agglutinine anti-A e anti-B. La reazione è detta diretta, poiché gli Ag studiati sono componenti naturali dei globuli rossi.
Comune con emoagglutinazione diretta l'emoagglutinazione virale ha meccanismi. Molti virus sono in grado di agglutinare spontaneamente gli eritrociti di uccelli e mammiferi; la loro aggiunta ad una sospensione di eritrociti provoca la formazione di aggregati da essi.
