Ang mga pag-aaral sa virological ay mga pag-aaral na idinisenyo upang ihiwalay ang mga virus at pag-aralan ang kanilang mga katangian, gayundin upang maitatag ang etiological na koneksyon ng mga virus na may ilang mga sakit.

Ang materyal para sa pananaliksik ay kinuha depende sa lugar ng nangingibabaw na mga virus sa katawan ng pasyente at sa mga ruta ng kanilang paglabas sa panahon ng panlabas na kapaligiran. Ang materyal ay kinokolekta sa mga sterile na lalagyan, inihatid sa laboratoryo sa lalong madaling panahon at nakaimbak sa frozen o sa yelo hanggang sa pagsusuri. Bago gamitin, ang materyal para sa paghihiwalay ng virus ay pinoproseso (at) upang sugpuin ang dayuhang microflora at pinoproseso upang alisin ang malalaking particle.

Nahihiwalay ang mga virus sa pamamagitan ng pag-infect ng mga hayop sa laboratoryo, mga embryo ng manok, at mga tissue culture na may materyal na naglalaman ng virus. Ang pagpili ng paraan ng paghihiwalay ay depende sa pinaghihinalaang causative agent ng sakit. Kaya, ang mga tissue culture (tingnan) ay ginagamit kapag nagtatrabaho sa mga virus na hindi pathogenic para sa mga hayop sa laboratoryo, o kapag sila ay natukoy sa tissue culture nang mas maaga kaysa kapag na-infect ang mga hayop. Ang mga embryo ng manok ay nahawaan upang ihiwalay ang mga pathogen, mga nakakahawang beke (sa amniotic at allantoic cavities), (sa yolk sac), bulutong (sa chorioallantoic membrane).

Sa mga hayop sa laboratoryo, ang mga puting daga ay kadalasang ginagamit upang ihiwalay ang mga virus, na sinusundan ng mga kuneho, daga, mga guinea pig, mga unggoy. Para sa mga arbovirus, ang pinaka-epektibo ay ang pagpasok ng materyal na naglalaman ng virus sa ulo o, para sa mga pneumotropic virus, papunta sa mucous membrane. respiratory tract, para sa mga virus ng bulutong, - sa isang scarified cornea.

Ang paghihiwalay ng virus ay pinaka-epektibo sa talamak na panahon ng sakit. Ang isang mahalagang punto sa pagtatatag ng viral na kalikasan ng sakit ay ang mga resulta serological na pag-aaral paulit-ulit na kinuha ang sera mula sa parehong pasyente sa simula ng sakit at sa panahon ng convalescence. Ang pagtuklas ng mga antibodies sa mga nakahiwalay na virus sa pangalawang serum sa isang titer na 4 o higit pang beses na mas malaki kaysa sa unang serum ay nagpapahiwatig ng isang etiological na koneksyon ng mga virus na may sakit na ito.

Maaga at mabilis na paraan Ang pagtuklas ng mga viral antigen ay isang paraan ng fluorescent antibodies, batay sa tiyak na pag-aayos ng mga antibodies na may label na fluorochrome sa ibabaw ng antigen. Ang antigen ay madaling makita ng fluorescent microscopy (tingnan) dahil sa maliwanag na fluorescence ng mga antibodies na na-adsorb sa antigen. Ang fluorescent antibody method ay ginagamit upang suriin ang mga smear na kinuha mula sa mga pasyente, histological section ng mga apektadong tissue, at tissue culture preparations. Ginagamit din ang mga ito upang makita ang mga elementarya na katawan (virion) (tingnan). Sa iba pang mga morphological na pamamaraan, ang mga nakakakita ng intracellular viral inclusions sa mga seksyon ng mga apektadong organo at tisyu ay ginagamit. Ang pagtuklas ng mga inklusyon ay nagpapahiwatig ng impeksiyon at sa ilang mga kaso ay nag-aambag sa pagsusuri ng isang viral disease. Upang makita ang mga viral antibodies sa dugo ng mga pasyente at upang pag-aralan antigenic na istraktura Iba't ibang mga virus ang ginagamit. Ang reaksyon ng neutralisasyon ay ginagamit para sa halos lahat ng mga impeksyon sa viral. Ito ay batay sa kakayahan ng mga immune antibodies na i-neutralize ang mga nakakahawang katangian ng mga virus kapag ang halo ay ipinakilala sa katawan ng madaling kapitan ng mga hayop o sa tissue culture. Upang matukoy ang index ng neutralisasyon, ang isang pare-parehong dosis ng serum ay halo-halong may iba't ibang mga dilution ng mga virus, at upang matukoy ang titer ng antibody - iba't ibang dilution serum na may pare-parehong dosis ng mga virus. Ang kontrol ay impeksyon ng mga hayop (o tissue culture) na may pinaghalong mga virus na may normal na serum o may solusyon sa asin. Ang reaksyon ng neutralisasyon ay ginagawa hindi lamang upang makita ang mga antibodies, kundi pati na rin upang matukoy ang uri at uri ng mga virus.

Ang complement fixation reaction [halimbawa, Bordet-Giangou reaction (tingnan)] ay ginagamit upang makita ang parehong viral antigens at antibodies. Sa unang kaso, ang reaksyon ay nagsasangkot ng pakikipag-ugnayan ng isang kilalang immune serum at materyal kung saan ang pagkakaroon ng mga antigen ay ipinapalagay: serum ng dugo, nasopharyngeal swab, mga extract ng tissue ng isang nahawaang organismo. Sa pangalawang kaso - isang kilalang antigen (diagnosticum) at suwero ng pasyente o convalescent.

Ginagamit ang RSK upang masuri ang mga sakit na dulot ng mga virus ng trangkaso, mga virus ng bulutong, mga adenovirus at mga arbovirus.

gawaing kurso

"Mga paraan ng clinical virology"

Panimula

Mga diagnostic sa laboratoryo mga impeksyon sa viral pangunahing isinasagawa gamit ang electron microscopy, mga sensitibong cell culture at immunological na pamamaraan. Bilang isang patakaran, ang isang paraan ay pinili upang makagawa ng diagnosis depende sa yugto ng impeksyon sa viral. Halimbawa, ang lahat ng tatlong diskarte ay maaaring maging kapaki-pakinabang sa pag-diagnose ng varicella, ngunit ang matagumpay na paggamit ng microscopy at mga diskarte sa kultura ng cell ay nakasalalay sa kakayahang mangolekta ng mga kasiya-siyang sample na medyo maaga sa sakit.

Malaking tagumpay viral diagnostics depende sa kalidad ng mga sample na natanggap. Para sa kadahilanang ito, ang mga kawani ng laboratoryo mismo ay dapat na direktang kasangkot sa pagkolekta ng mga kinakailangang sample. Ang mga katangian ng mga sample, pati na rin ang mga pamamaraan para sa kanilang paghahatid sa laboratoryo, ay inilarawan ni Lennett, Schmidt, Christ, et al.

Karamihan sa mga reagents at instrumento na ginagamit sa mga diagnostic ng laboratoryo ay maaaring mabili mula sa iba't ibang kumpanya. Sa karamihan ng mga kaso, ang parehong reagent ay ginawa nang sabay-sabay ng ilang mga kumpanya. Para sa kadahilanang ito, hindi namin ipinahiwatig ang mga indibidwal na kumpanya, maliban kung ang reagent ay ibinibigay lamang ng isang kumpanya. Sa lahat ng iba pang kaso, dapat kang makipag-ugnayan pangkalahatang listahan mga supplier na nakalista sa talahanayan. 1.

Hindi namin nilalayon na magbigay ng komprehensibong paglalarawan ng lahat ng kasalukuyang magagamit na pamamaraan para sa pag-diagnose ng mga impeksyon sa virus ng tao. Una sa lahat, nailalarawan namin ang mga pangunahing pamamaraan. Habang nakakakuha ka ng karanasan pansariling gawain ang mga pangunahing pamamaraan na ito ay maaaring gamitin upang malutas ang mas kumplikadong mga problema.

1. Electron microscopy

Para sa electron microscopic diagnosis ng mga impeksyon sa viral, maaaring gamitin ang manipis na mga seksyon ng apektadong tissue. Ang pinakakaraniwang materyal na ginagamit para sa electron microscopy ay feces o likido.

Talahanayan 1. Listahan ng mga kumpanyang nagbibigay ng mga reagents at kagamitan

mga vesicle na nagpapakita ng ilang sakit, tulad ng bulutong-tubig. Kapag sinusuri ang naturang materyal, maaaring matukoy ang mga virus gamit ang negatibong paglamlam, na nagreresulta sa materyal na siksik ng elektron na naglalarawan sa mga bahagi ng virion. Ang pamamaraan ay epektibo kapag ang konsentrasyon ng virus ay mataas sa mga sample ng pagsubok, tulad ng sa feces o vesicular fluid. Sa mga kaso kung saan ang nilalaman ng mga viral particle sa mga sample ay mababa, ang posibilidad ng pag-detect ng virus ay maaaring tumaas sa pamamagitan ng pag-concentrate ng virus sa pamamagitan ng ultracentrifugation o sa pamamagitan ng pagsasama-sama nito sa mga partikular na antibodies. Ang huling paraan ay maginhawa din para sa pagtukoy ng mga virus. Inilalarawan namin dito ang isang electron microscopic diagnostic method impeksyon ng rotavirus at ang paraan ng immunoelectron microscopy gamit ang halimbawa ng pagtuklas ng mga tiyak na antibodies sa mga parvovirus. Ang mga pamamaraan ng electron microscopy ay inilarawan nang mas detalyado ng Field.

2.1 Direktang electron microscopic na pagsusuri ng mga dumi

1. Isawsaw ang dulo ng Pasteur pipette sa dumi at gumuhit ng sapat na materyal upang makakuha ng 1 cm na pahid.

2. Muling suspindihin ang fecal smear sa electron microscopic negative contrast dye hanggang sa makakuha ng translucent suspension. Ang negatibong contrast dye ay isang 2% na solusyon ng phosphotungstic acid sa distilled water.

3. Upang makakuha ng electron microscopic specimen, ang isang drop ng suspension ay inilalagay sa isang electron microscopy grid na pinahiran ng carbon-formvar film. Sa panahon ng operasyong ito, ang mesh ay gaganapin gamit ang isang pares ng manipis na sipit.

4. Ang gamot ay naiwan sa hangin sa loob ng 30 s.

5. Ang labis na likido ay tinanggal sa pamamagitan ng pagpindot sa gilid ng baso na may filter na papel.

6. Ang gamot ay pinatuyo sa hangin.

7. Kung kinakailangan, ang mabubuhay na virus ay hindi aktibo sa pamamagitan ng pag-iilaw sa magkabilang panig ng grid na may ultraviolet light na may intensity na 440,000 μW-s/cm2. Sa kasong ito, ginagamit ang isang short-wave ultraviolet lamp na may filter. Ang lampara ay dapat nasa layo na 15 cm mula sa grid; Ang oras ng pag-iilaw para sa bawat panig ay 5 minuto.

8. Ang mga rotavirus virion ay maaaring mailalarawan sa ilalim ng transmission electron microscope na may magnification na 30,000 hanggang 50,000.

2.2 Immunoelectron microscopy

Ang immunoelectron microscopy method na inilarawan sa ibaba ay isa lamang sa maraming katulad na immunological na pamamaraan. Upang pag-aralan ang mga antibodies na partikular sa virus, bilang karagdagan, ginagamit ang isang paraan na nagsasangkot ng pagbubuklod sa mikroskopikong network ng protina A. Ang gumaganang konsentrasyon ng mga antiviral antibodies ay tinutukoy ng pagsubok at pagkakamali sa saklaw mula 1/10 hanggang 1/1000. Ang konsentrasyon na ipinapahiwatig namin ay karaniwang ginagamit sa karaniwang gawain. Upang makakuha ng pinakamainam na resulta para sa pakikipag-ugnayan ng mga antibodies sa virus, ang serum na naglalaman ng parvovirus ay titrated sa parehong paraan.

1. 10 µl ng antiserum sa parvovirus ng tao ay natunaw ng 100 beses sa PBS. Ang solusyon ay pinainit sa isang paliguan ng tubig sa 56 ° C.

2. Matunaw ang 10 ml ng 2% agarose sa PBS sa karaniwang paraan at palamig hanggang 56 °C sa isang paliguan ng tubig.

3. Sa 56 °C, paghaluin ang 1 ml ng diluted antiserum na may 1 ml ng 2% agarose.

4. Ilipat ang 200 µl ng nagresultang timpla sa dalawang balon ng 96-well microtiter plate.

5. Ang agarose ay pinapayagang magtakda sa temperatura ng silid. Ang tablet ay maaaring maimbak sa 4°C sa loob ng ilang linggo kung ito ay natatatakan ng adhesive tape.

6. Magdagdag ng 10 µl ng serum na naglalaman ng parvovirus sa isang balon na naglalaman ng pinaghalong agarose at antiserum.

7. Ang isang electron microscopy grid na may pre-prepared carbon-formvar coating ay inilalagay sa hindi gaanong makintab na bahagi sa isang patak ng serum.

8. Ang mesh ay pinananatili sa loob ng 2 oras sa 37 °C sa isang mahalumigmig na silid.

9. Gamit ang manipis na sipit, kunin ang mesh at ilapat ang isang patak ng 2% phosphotungstic acid sa ibabaw ng mesh na nadikit sa serum.

10. Pagkatapos ng 30 s, ang labis na pintura ay hugasan, ang paghahanda ay tuyo at ang virus ay hindi aktibo.

Ang pinagsama-samang mga partikulo ng viral ay sinusuri sa ilalim ng isang transmission electron microscope sa isang magnification na 30,000 hanggang 50,000.

3. Pagkilala sa mga viral antigens

Ang mga virus na matatagpuan sa mga tissue o tissue fluid ay maaaring matukoy ng mga protina na partikular sa virus gamit ang antigen-antibody reaction. Ang produkto ng reaksyon ng antigen-antibody ay sinusuri laban sa isang tag na direktang ipinapasok sa mga antiviral antibodies o sa mga antibodies na nakadirekta laban sa mga antibodies na partikular sa virus. Ang mga antibodies ay maaaring lagyan ng label ng fluorescein, radioactive iodine, o isang enzyme na pumuputol sa substrate na nagdudulot ng pagbabago ng kulay. Bilang karagdagan, ang reaksyon ng hemagglutination ay ginagamit upang makilala ang virus. Sa pang-araw-araw na pagsasanay, ang mga inilarawan na pamamaraan ay pangunahing ginagamit upang makita ang mga antigen ng virus ng hepatitis B sa dugo at maghanap ng mga antigen ng iba't ibang mga virus na nagdudulot ng iba't ibang mga sakit sa paghinga.

Sa kasalukuyan, maraming mga kumpanya ang gumagawa ng erythrocyte, radioactive at enzymatic diagnostics, kabilang ang mga para sa pag-detect ng hepatitis B virus. Hindi namin itinuturing na maipapayo na magbalangkas ng mga pamamaraan para sa pagtatrabaho sa mga diagnostic na ito: sapat na upang sundin ang mga nakalakip na tagubilin. Sa ibaba ay tututuon natin ang paraan ng immunofluorescence para sa pagtukoy ng respiratory syncytial virus sa nasopharyngeal secretions.

3.1 Pagkilala sa respiratory syncytial virus sa nasopharyngeal secretions sa pamamagitan ng immunofluorescence

Ang paraan para sa pagkuha ng mga paghahanda ng nasopharyngeal secretions ay inilarawan nina Gardner at McQuillin. SA mga kondisyon sa laboratoryo ang operasyong ito ay isinasagawa sa dalawang yugto. Una, ang isang smear ng nasopharyngeal mucus ay inihanda sa isang glass slide. Ang mga resultang smear ay maaaring maiimbak nang maayos sa -20°C sa loob ng maraming buwan. Sa ikalawang yugto, ang mga smear ay nabahiran upang makita ang respiratory syncytial virus antigen. Para sa layuning ito, ginagamit ang paraan ng hindi direktang immunofluorescence.

3.1.1 Paghahanda ng mga paghahanda ng nasopharyngeal secretions

1. Ang uhog mula sa mga espesyal na forceps ay hugasan ng 1-2 ml ng PBS at inilipat sa isang centrifuge tube.

2. Centrifuge sa loob ng 10 minuto sa 1500 rpm sa isang tabletop centrifuge.

3. Ang supernatant ay pinatuyo.

4. Ang cell pellet ay maingat na muling sinuspinde sa 2-3 ml ng PBS hanggang sa makuha ang isang homogenous na suspension. Upang gawin ito, gumamit ng isang malawak na leeg na Pasteur pipette.

5. Ang resultang suspensyon ay inililipat sa isang test tube.

6. Magdagdag ng isa pang 2-4 ml ng PBS sa suspensyon at ihalo sa pamamagitan ng pipetting. Ang malalaking clots ng mucus ay inalis.

7. Centrifuge sa loob ng 10 minuto sa 1500 rpm sa isang tabletop centrifuge.

8. Ang supernatant ay itinatapon, ang sediment ay muling sinuspinde sa dami ng PBS na ang resultang suspensyon ay madaling mahihiwalay sa mga dingding ng tubo.

9. Ang resultang suspensyon ay inilapat sa isang minarkahang glass slide.

10. Ang baso ay tuyo sa hangin.

Ayusin sa acetone sa loob ng 10 min sa 4°C.

12. Pagkatapos ayusin, ang salamin ay pinatuyo muli sa hangin.

13. Ang mga resultang paghahanda ay agad na nabahiran o nakaimbak sa -20 °C.

3.1.2. Pamamaraan ng paglamlam

1. I-print at palabnawin ang komersyal na RSV antiserum sa PBS sa inirerekomendang konsentrasyon sa pagtatrabaho.

2. Gamit ang isang Pasteur pipette, ilapat ang isang patak ng antiserum sa inihandang paghahanda.

3. Ang gamot ay inilalagay sa isang mahalumigmig na silid.

4. Ang gamot ay incubated para sa 30 minuto sa 37 °C.

5. Ang mga sample ay maingat na hinuhugasan ng PBS upang alisin ang labis na antibodies sa isang espesyal na reservoir.

6. Ang mga sample ay hinuhugasan sa tatlong shift ng PBS, 10 minuto bawat isa.

7. Patuyuin ang mga sample, alisin ang labis na PBS gamit ang filter na papel at tuyo sa hangin.

Pananaliksik para sa pagsusuri ng mga sakit na may likas na viral. Ito ay kinakailangan upang matukoy ang virus, pag-aralan ang biology nito at kakayahang makaapekto sa mga selula ng hayop at tao. Kaya, nagiging posible na maunawaan ang pathogenesis mga sakit na viral at, nang naaayon, piliin ang tamang paraan ng paggamot.

Ano ang diagnosis?

Sa mga buhay na selula. Upang pag-aralan ito, kinakailangan na linangin ito sa antas ng isang eksperimentong organismo o para sa layuning ito sa medikal na kasanayan at microbiology sa pangkalahatan, ang mga pamamaraan ng pananaliksik sa virological ay isinasagawa, na mayroong mga sumusunod na pangunahing diskarte:

• tuwid;
• hindi direkta;
• serological.

Ang materyal ay maaaring direktang suriin para sa pagkakaroon ng mga nucleic acid, viral antigen, o, halimbawa, ang virus ay maaaring ihiwalay at makilala mula sa klinikal na materyal.

Bilang karagdagan sa kakayahang magtatag ng etiology ng sakit, pagsubaybay therapeutic effect, ang mga pamamaraan ng pananaliksik sa virological ay may malaking papel sa mga hakbang laban sa epidemya. Ang mga embryo ng manok, mga hayop sa laboratoryo o mga kultura ng cell ay ginagamit para sa paghihiwalay.

Paano ito sinasaliksik?

Ang pinakamabilis ay ang direktang paraan. Binibigyang-daan ka nitong makakita ng virus, antigen o NA (nucleic acid) sa mismong klinikal na materyal. Ito ay tumatagal mula sa dalawang oras hanggang isang araw.

1. EM - mikroskopya ng elektron. Direktang natukoy ang virus.
2. IEM - immune electron microscopy. Gumagamit ng mga tiyak na antibodies sa mga virus.
3. RIF - reaksyon ng immunofluorescence. Gumagamit ng mga antibodies na nakatali sa isang tina. Ang ganitong mga pamamaraan ng virological research ay malawakang ginagamit upang mabilis na matukoy ang etiology ng ARVI (acute respiratory viral infections), kapag ang mga fingerprint smear ay kinuha mula sa mauhog lamad ng upper respiratory tract.
4. ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay - pagtukoy ng mga viral antigen, katulad ng RIF, ngunit batay sa pag-label ng mga antibodies na may mga enzyme.
5. RIA - radioimmunoassay. Gumagamit ng radiolabeling ng mga antibodies upang magbigay ng mataas na sensitivity sa pag-detect ng viral antigen.
6. Molecular - NK hybridization o paghihiwalay ng mga genome ng virus gamit ang PCR (polymerase chain reaction).
7. Ang cytology ay bihirang ginagamit, ngunit para sa ilang mga impeksyon ang mga pamamaraan ng virological research na ito ay napaka-epektibo. Ang mga materyales sa biopsy, autopsy at smear na naproseso para sa paglamlam at pagsusuri sa ilalim ng mikroskopyo ay sinusuri.

Ano ang punto ng pananaliksik?

Upang matagumpay na ihiwalay ang mga virus, ang klinikal na materyal ay kinuha alinsunod sa pathogenesis at sa lalong madaling panahon. Kadalasan ang prosesong ito ay nangangailangan ng ilang mga sipi bago ilapat ang ilang mga pamamaraan ng pananaliksik sa virological.

Ang microbiology ay ang pag-aaral ng microscopic na nilalang. At ang kanyang larangan ay hindi lamang gamot. Ito ang pangunahing agham para sa Agrikultura, gamot sa beterinaryo, espasyo at teknikal na industriya, heolohiya.

Ngunit siyempre ang lahat ay nilikha para sa tao at sa kanyang pag-unlad sa magandang planetang ito. Samakatuwid, napakahalaga na makita ang panganib sa oras at neutralisahin ito. Iba ang mga virus sa bacteria. Ito ay mga istruktura na pumapasok sa katawan at nagiging sanhi ng pagbuo ng isang bagong henerasyon. Mukha silang mga kristal at naglalayong kontrolin ang proseso ng kanilang pagpaparami, bagaman sila mismo ay hindi nagpapakain, hindi lumalaki, at hindi nagtatago ng mga produktong metabolic.

Maaaring sanhi ng virus malubhang sakit sa anumang buhay na organismo kung saan ito pumapasok. Dagdag pa, maaari itong mag-evolve. Iyon ang dahilan kung bakit ang mga pamamaraan ng pananaliksik sa virological sa microbiology ay dapat na paunlarin at pagbutihin, dahil ang sibilisasyon ng tao sa kabuuan ay maaaring nasa ilalim ng banta.

Mga materyales

Upang makita at matukoy ang mga virus sa gamot, bilang panuntunan, ang mga sumusunod ay kinuha:

• banlawan ng nasopharyngeal ( mga impeksyon sa paghinga);
• flush at feces ( mga impeksyon sa enterovirus);
• mga scrapings, mga nilalaman ng mga paltos (mga sugat sa balat, mauhog lamad, tulad ng herpes, bulutong);
• flushes (mga impeksyon sa exanthemal tulad ng tigdas, rubella);
• dugo, cerebrospinal fluid(mga impeksyon sa arbovirus).

Mga yugto

Ang lahat ng mga yugto ng pamamaraan ng pananaliksik sa virological ay kinabibilangan ng:

• koleksyon ng materyal;
• pagpili, pagkuha ng isang sistema ng pagsubok, pagtukoy ng posibilidad na mabuhay nito;
• impeksyon sa sistema ng pagsubok;
• indikasyon ng virus;
• pagtukoy ng uri ng virus.

Karaniwan, ang mga pathogenic na virus ay naiiba sa pagkakaroon ng tissue at pagtitiyak ng uri. Kunin, halimbawa, ang poliovirus, na nagpaparami lamang sa mga primata (sa kanilang mga selula). Alinsunod dito, ang isang partikular na tissue culture ay ginagamit upang ihiwalay ang isang partikular na virus. Kung pinag-uusapan natin tungkol sa isang hindi kilalang pathogen, ito ay ipinapayong sabay-sabay na makahawa sa tatlo, o mas mabuti sa apat, mga kultura ng cell.

Kaya, marahil ang isa sa kanila ay magiging sensitibo. Upang matukoy ang pagkakaroon ng isang virus sa mga nahawaang kultura, tinitingnan nila ang pag-unlad ng tiyak na pagkabulok ng cell, intracellular inclusions, pagkakakilanlan ng isang tiyak na antigen, positibong hemagglutination at hemadsorption reaksyon.

Ang lahat ng mga pamamaraan ng pananaliksik sa virological (direkta at hindi direkta, serological) ay dapat piliin bilang pinakaangkop para sa partikular na kaso ng pinaghihinalaang impeksyon.

Ang mga hindi direktang pamamaraan ay batay sa paghihiwalay at pagkakakilanlan ng virus. Ang mga ito ay labor-intensive, oras-ubos, ngunit tumpak.

Serodiagnosis

Ang diagnosis na ito ay tumutukoy sa isang paraan batay sa reaksyon ng antigen-antibody. Kadalasan, ginagamit ang ipinares na sera ng dugo, na kinukuha sa pagitan ng ilang linggo. Kung ang titer ng antibody ay tumaas ng 4 na beses o higit pa, ang reaksyon ay itinuturing na positibo. Upang matukoy ang uri ng pagtitiyak ng virus, ginagamit ang isang reaksyon ng neutralisasyon ng virus. Upang matukoy ang pagtitiyak ng grupo, kinakailangan upang makakuha ng reaksyon ng pag-aayos ng pandagdag.

Iba't ibang variant ng enzyme immunoassay, mga reaksyon sa pagsugpo sa hemagglutination, passive hematglutination, reverse passive hemagglutination, RIF. Nasa genetic engineering isang paraan para sa paggawa ng monoclonal antibodies ay binuo. Ang makitid na pagtitiyak ng mga monoclones ay maaaring pagtagumpayan sa pamamagitan ng paggamit ng ilang mga monoclonal antibodies sa iba't ibang viral determinants. Kaya, ang pagtitiyak at pagiging sensitibo ng pagsubok sa pagtuklas ng antigen ay nadagdagan.

Ang ilang mga tampok

Ngayon, maraming iba't ibang mga sistema ng pagsubok ang nilikha para sa immunological diagnosis ng mga impeksyon na nagreresulta mula sa pagpasok ng isang virus sa isang buhay na organismo.

Kaya, ang mga pamamaraan ng pananaliksik sa virological ay mga pamamaraan para sa paghihiwalay ng mga virus, pag-aaral ng kanilang mga katangian at pagtatatag ng kanilang etiological na koneksyon sa ilang mga sakit.

Ang virological research ay kinabibilangan ng dalawang pangunahing yugto: paghihiwalay ng mga virus at ang kanilang pagkakakilanlan. Ang materyal para sa virological research ay maaaring dugo, iba pang biological at pathological fluid, biopsy ng mga organo at tisyu.

Ang mga pagsusuri sa virological na dugo ay madalas na ginagawa upang masuri ang mga impeksyon sa arboviral. Ang mga virus ng rabies ay matatagpuan sa laway, beke, herpes simplex, Ang mga nasopharyngeal swab ay ginagamit upang ihiwalay ang mga pathogen ng trangkaso at iba pang acute respiratory viral infection, tigdas. Ang mga adenovirus ay nakita sa conjunctival swabs. Ang iba't ibang entero-, adno-, pso-, nora- at rotavirus ay nakahiwalay sa mga dumi.

Upang ihiwalay ang mga virus, mga cell culture, mga embryo ng manok, at kung minsan ay ginagamit ang mga hayop sa laboratoryo.

Karamihan sa mga pathogenic na virus ay nakikilala sa pamamagitan ng pagkakaroon ng tissue at type specificity; halimbawa, ang poliovirus ay nagpaparami lamang sa primate cells, kaya ang isang naaangkop na tissue culture ay ginagamit upang ihiwalay ang isang partikular na virus. Upang ihiwalay ang isang hindi kilalang pathogen, ipinapayong sabay-sabay na makahawa sa 3-4 na mga kultura ng cell, sa pag-aakalang ang isa sa mga ito ay maaaring sensitibo. Ang pagkakaroon ng virus sa mga nahawaang kultura ng cell ay tinutukoy ng pag-unlad ng tiyak na pagkabulok ng cell, i.e. pagkilos ng cytopathogen, pagtuklas ng mga intracellular inclusions, pati na rin batay sa pagtuklas ng isang tiyak na antigen sa pamamagitan ng immunofluorescence, positibong hemadsorption at mga reaksyon ng hemagglutination.

Ang mga embryo ng ibon na may mahinang pagkakaiba-iba ng mga tisyu ay angkop para sa paglinang ng maraming mga virus. Kadalasan, ginagamit ang mga embryo ng manok. Kapag dumarami sa mga embryo, ang mga virus ay maaaring maging sanhi ng kanilang kamatayan (arboviruses), ang paglitaw ng mga pagbabago sa chorion-allantoic membrane (mga virus ng bulutong) o sa katawan ng embryo, ang akumulasyon ng gluten sa mga embryonic fluid (mga virus ng trangkaso, mga beke. ) at umakma sa nagbubuklod na viral antigen .

Ang pagkilala sa mga virus ay isinasagawa gamit ang mga immunological na pamamaraan: hemagglutination inhibition reaction, complement fixation, neutralization, gel precipitation, immunofluorescence.

Higit pa sa paksang Virological method:

1. Pagtatasa ng pangunahing anthropometric data gamit ang parametric na pamamaraan (sigma method)
2. Paggamot gamit ang paraan ng pagkalipol ng nakakondisyon na komunikasyon at ang paraan ng sapilitang pagsasanay
3. 2. Comparative legal na pamamaraan - pribadong siyentipikong pamamaraan ng legal na agham
4. MODERNONG PARAAN NG DIAGNOSIS AT PAGPILI NG PARAAN NG PAGGAgamot PARA SA SUBMUCOUS UTERINE FIBROID
5. 5.4. Ang konsepto at istraktura ng pangkalahatang pamamaraan ng pagsisiyasat bilang isang paraan ng praktikal na aktibidad
6. Paksa 8. MGA MICROBIOLOGICAL METHODS PARA SA PAG-AARAL NG VARIABILITY AT MEKANISMO NG TRANSMISSION OF HEREDITARY INFORMATION. APPLICATION OF GENETIC METHODS PARA SA PAGLIKHA NG MGA BAGONG GAMOT
7. Paksa 15. PATHOGENICITY AT VIRULENCE NG MICROORGANISMS. VIRULENCE FACTORS. MGA PARAAN NG IMPEKSIYON NG MGA HAYOP SA LABORATORY. ANTIGENS, PARAAN NG KANILANG PAGKUKUHA. ANTIBODIYA. MGA REAKSYON SA IMUNITY AT ANG KANILANG PRAKTIKAL NA PAGGAMIT. PHAGOCYTOSIS

Mga pamamaraan ng pananaliksik sa virological

mga pamamaraan para sa pag-aaral ng biology ng mga virus at ang kanilang pagkakakilanlan. Ang mga pamamaraan ay malawakang ginagamit sa virology molecular biology, sa tulong kung saan posible na maitatag ang molekular na istraktura ng mga particle ng viral, mga pamamaraan ng kanilang pagtagos sa cell at mga tampok ng pagpaparami ng viral, ang pangunahing istraktura ng mga viral nucleic acid at protina. Ang mga pamamaraan ay binuo upang matukoy ang pagkakasunud-sunod ng mga bumubuo ng mga elemento ng viral nucleic acid at protina amino acids. Nagiging posible na maiugnay ang mga pag-andar ng mga nucleic acid at ang mga protina na kanilang na-encode sa pagkakasunud-sunod ng nucleotide at upang maitaguyod ang mga sanhi ng mga proseso ng intracellular na gumaganap ng isang mahalagang papel sa pathogenesis ng impeksyon sa viral.

Ang mga pamamaraan ng pananaliksik sa virological ay batay din sa mga proseso ng immunological (pakikipag-ugnayan ng antigen sa mga antibodies), mga biological na katangian ng virus (kakayahang para sa hemagglutination, hemolysis, aktibidad ng enzymatic), mga tampok ng pakikipag-ugnayan ng virus sa host cell (ang likas na katangian ng cytopathic effect, ang pagbuo ng intracellular inclusions, atbp.).

Sa pagsusuri ng mga impeksyon sa viral, sa paglilinang, paghihiwalay at pagkakakilanlan ng mga virus, pati na rin sa paggawa ng mga paghahanda sa bakuna, ang paraan ng tissue at cell culture ay malawakang ginagamit. Ginagamit ang pangunahin, pangalawa, matatag na tuluy-tuloy at diploid na mga kultura ng cell. Ang mga pangunahing kultura ay nakuha sa pamamagitan ng dispersing tissue na may proteolytic enzymes (trypsin, collagenase). Ang pinagmulan ng mga selula ay maaaring mga tisyu at organo (karaniwan ay mga bato) ng mga embryo ng tao at hayop. Ang isang suspensyon ng mga cell sa isang nutrient medium ay inilalagay sa tinatawag na mga kutson, bote o Petri dish, kung saan, pagkatapos na ikabit sa ibabaw ng sisidlan, ang mga selula ay nagsisimulang dumami. Para sa impeksyon sa virus, karaniwang ginagamit ang isang cell monolayer. Ang nutrient na likido ay pinatuyo, ang viral suspension ay idinagdag sa ilang mga dilution, at pagkatapos makipag-ugnay sa mga cell, ang sariwang nutrient medium, kadalasang walang suwero, ay idinagdag.

Ang mga selula ng karamihan sa mga pangunahing kultura ay maaaring i-subculture; ang naturang kultura ay tinatawag na pangalawang kultura. Sa karagdagang pagpasa ng mga selula, isang populasyon ng mga selulang tulad ng fibroblast ay nabuo, na may kakayahang mabilis na pagpaparami, karamihan ng na nagpapanatili ng orihinal na hanay ng mga chromosome. Ang mga ito ay tinatawag na diploid cells. Sa pamamagitan ng serially culturing cells, nakukuha ang mga stable na tuloy-tuloy na cell culture. Sa panahon ng mga sipi, lumilitaw ang mabilis na paghahati ng mga homogenous na selula na may heteroploid na hanay ng mga chromosome. Ang mga matatag na linya ng cell ay maaaring single-layer o suspension. Ang mga single-layer na kultura ay lumalaki sa anyo ng isang tuluy-tuloy na layer sa ibabaw ng salamin, habang ang mga kultura ng suspensyon ay lumalaki sa anyo ng mga suspensyon sa iba't ibang mga sisidlan gamit ang mga mixing device. Mayroong higit sa 400 mga linya ng cell na nagmula sa 40 iba't ibang uri mga hayop (kabilang ang mga primata, ibon, reptilya, amphibian, isda, insekto) at mga tao.

Maaaring i-culture ang mga piraso sa artipisyal na nutrient media mga indibidwal na organo at mga tisyu (mga kultura ng organ). Ang mga uri ng kulturang ito ay nagpapanatili ng istraktura ng tissue, na lalong mahalaga para sa paghihiwalay at pagpasa ng mga virus na hindi dumarami sa mga hindi nakikilalang tissue culture (halimbawa, mga coronavirus).

Sa mga nahawaang cell culture, ang mga virus ay maaaring matukoy sa pamamagitan ng mga pagbabago sa cell morphology, cytopathic effect, na maaaring tiyak, ang hitsura ng mga inklusyon, sa pamamagitan ng pagtukoy ng mga viral antigen sa cell at sa fluid ng kultura; pagtatatag ng mga biological na katangian ng viral progeny sa culture fluid at titrating virus sa tissue culture, mga embryo ng manok o mga sensitibong hayop; sa pamamagitan ng pagtukoy ng mga indibidwal na viral nucleic acid sa mga cell sa pamamagitan ng molecular hybridization o accumulations ng nucleic acids sa pamamagitan ng cytochemical method gamit ang fluorescent microscopy.

Ang pagbubukod ng mga virus ay isang matrabaho at matagal na proseso. Isinasagawa ito upang matukoy ang uri o variant ng virus na umiikot sa populasyon (halimbawa, upang matukoy ang isang serovariant ng influenza virus, isang ligaw o bakuna na strain ng polio virus, atbp.); sa mga kaso kung saan kinakailangan na magsagawa ng mga kagyat na hakbang sa epidemiological; kapag lumitaw ang mga bagong uri o variant ng mga virus; kung kinakailangan, kumpirmahin ang paunang pagsusuri; upang ipahiwatig ang mga virus sa mga bagay kapaligiran. Kapag naghihiwalay ng mga virus, ang posibilidad ng kanilang pagtitiyaga sa katawan ng tao, pati na rin ang paglitaw ng magkahalong impeksiyon na dulot ng dalawa o higit pang mga virus, ay isinasaalang-alang. Ang isang genetically homogenous na populasyon ng virus na nakuha mula sa isang virion ay tinatawag na isang viral clone, at ang proseso ng pagkuha nito ay tinatawag na cloning.

Upang ihiwalay ang mga virus, ginagamit ang impeksyon ng madaling kapitan ng mga hayop sa laboratoryo at mga embryo ng manok, ngunit kadalasan ay ginagamit ang tissue culture. Ang pagkakaroon ng isang virus ay karaniwang tinutukoy ng tiyak na pagkabulok ng cell (cytopathic effect), ang pagbuo ng mga symplast at syncytia, ang pagtuklas ng mga intracellular inclusions, pati na rin ang isang tiyak na antigen na nakita gamit ang immunofluorescence, hemadsorption, hemagglutination (para sa hemagglutinating virus), atbp. . Ang mga palatandaang ito ay makikita lamang pagkatapos ng 2-3 mga sipi ng virus.

Upang ihiwalay ang ilang mga virus, tulad ng mga virus ng trangkaso, ginagamit ang mga embryo ng manok, at upang ihiwalay ang ilang mga virus ng Coxsackie at ilang mga arbovirus, ginagamit ang mga bagong panganak na daga. Ang pagkilala sa mga nakahiwalay na mga virus ay isinasagawa gamit ang mga serological na reaksyon at iba pang mga pamamaraan.

Kapag nagtatrabaho sa mga virus, tinutukoy ang kanilang titer. Ang titration ng mga virus ay karaniwang isinasagawa sa tissue culture, na tinutukoy ang pinakamataas na pagbabanto ng virus na naglalaman ng likido kung saan nangyayari ang pagkabulok ng tissue, ang mga inklusyon at mga antigen na partikular sa virus ay nabuo. Ang paraan ng plake ay maaaring gamitin upang titrate ang isang bilang ng mga virus. Ang mga plake, o mga negatibong kolonya ng mga virus, ay foci ng mga cell na nawasak ng virus sa isang solong layer na tissue culture sa ilalim ng agar coating. Ang pagbilang ng kolonya ay nagbibigay-daan para sa isang quantitative analysis ng nakakahawang aktibidad ng mga virus sa batayan na ang isang nakakahawang virus na particle ay bumubuo ng isang plaka. Nakikita ang mga plake sa pamamagitan ng paglamlam sa kultura ng mga intravital dyes, kadalasang neutral na pula; ang mga plake ay hindi sumisipsip sa pangulay at samakatuwid ay nakikita bilang mga light spot laban sa background ng mga stained living cell. Ang titer ng virus ay ipinahayag bilang ang bilang ng mga yunit na bumubuo ng plaka bawat 1 ml.

Ang paglilinis at konsentrasyon ng mga virus ay karaniwang ginagawa sa pamamagitan ng differential ultracentrifugation na sinusundan ng concentration o density gradient centrifugation. Upang linisin ang mga virus, ginagamit ang mga immunological na pamamaraan, ion exchange chromatography, immunosorbents, atbp.

Kasama sa pagsusuri sa laboratoryo ng mga impeksyon sa viral ang pagtuklas ng pathogen o mga bahagi nito sa klinikal na materyal; ihiwalay ang virus mula sa materyal na ito; serodiagnosis. Pagpili ng isang paraan mga diagnostic sa laboratoryo sa bawat indibidwal na kaso ay depende sa likas na katangian ng sakit, ang panahon ng sakit at ang mga kakayahan ng laboratoryo. Mga modernong diagnostic Ang mga impeksyon sa viral ay batay sa mga paraan ng pagpapahayag na nagbibigay-daan sa iyong makakuha ng sagot ilang oras pagkatapos kumuha ng klinikal na materyal maagang mga petsa pagkatapos ng sakit, Kabilang dito ang electron at immune electron microscopy, pati na rin ang immunofluorescence, ang paraan ng molecular hybridization, pagtuklas ng mga antibodies ng klase ng IgM, atbp.

Ginagawang posible ng electron microscopy ng mga virus na may negatibong batik na pag-iba-iba ang mga virus at matukoy ang kanilang konsentrasyon. Ang paggamit ng electron microscopy sa diagnosis ng mga impeksyon sa viral ay limitado sa mga kaso kung saan ang konsentrasyon ng mga viral particle sa klinikal na materyal ay medyo mataas (10 5 sa 1 ml at mas mataas). Ang kawalan ng pamamaraan ay ang kawalan ng kakayahan na makilala ang mga virus na kabilang sa parehong pangkat ng taxonomic. Ang kakulangan na ito ay napagtagumpayan sa pamamagitan ng paggamit ng immune electron microscopy. Ang pamamaraan ay batay sa pagbuo ng mga immune complex sa pamamagitan ng pagdaragdag ng tiyak na suwero sa mga partikulo ng viral, habang sabay-sabay na tinutuon ang mga particle ng viral, na nagpapahintulot sa kanila na makilala. Ang pamamaraan ay ginagamit din upang makita ang mga antibodies. Para sa express diagnostic purposes, isinasagawa ang electron microscopic examination ng tissue extracts, feces, fluid mula sa vesicle, at secretions mula sa nasopharynx. Electron microscopy malawakang ginagamit upang pag-aralan ang morphogenesis ng virus, ang mga kakayahan nito ay pinalawak sa paggamit ng mga may label na antibodies.

Ang paraan ng molecular hybridization, batay sa pagtuklas ng mga nucleic acid na partikular sa virus, ay ginagawang posible na makakita ng mga solong kopya ng mga gene at walang katumbas sa sensitivity. Ang reaksyon ay batay sa hybridization ng complementary DNA o RNA strands (probes) at ang pagbuo ng double-stranded structures. Ang pinakamurang probe ay cloned recombinant DNA. Ang probe ay may label na radioactive precursors (karaniwan ay radioactive phosphorus). Ang paggamit ng mga reaksyong colorimetric ay maaasahan. Mayroong ilang mga opsyon para sa molecular hybridization: spot hybridization, blot hybridization, sandwich hybridization, in situ hybridization, atbp.

Ang mga antibodies ng klase ng IgM ay lumalabas nang mas maaga kaysa sa mga antibodies ng klase G (sa ika-3-5 araw ng pagkakasakit) at nawawala pagkatapos ng ilang linggo, kaya ang kanilang pagtuklas ay nagpapahiwatig ng isang kamakailang impeksiyon. Ang mga antibodies ng lgM class ay natutukoy ng immunofluorescence o ng enzyme immunoassay gamit ang anti-μ antisera (sera laban sa mabibigat na kadena ng lgM).

Ang mga serological na pamamaraan sa virology ay batay sa mga klasikal na immunological na reaksyon (tingnan ang Immunological research method) : complement fixation reactions, hemagglutination inhibition, biological neutralization, immunodiffusion, hindi direktang hemagglutination, radial hemolysis, immunofluorescence, enzyme immunoassay, radioimmunoassay. Ang mga micromethod para sa maraming mga reaksyon ay binuo, at ang kanilang mga diskarte ay patuloy na pinagbubuti. Ang mga pamamaraang ito ay ginagamit upang makilala ang mga virus gamit ang isang hanay ng kilalang sera at para sa serodiagnosis upang matukoy ang pagtaas ng mga antibodies sa pangalawang serum kumpara sa una (ang unang serum ay kinuha sa mga unang araw pagkatapos ng sakit, ang pangalawa - pagkatapos ng 2- 3 linggo). Halaga ng diagnostic ay may hindi bababa sa apat na beses na pagtaas ng mga antibodies sa pangalawang serum. Kung ang pagtuklas ng mga antibodies ng klase ng IgM ay nagpapahiwatig ng isang kamakailang impeksyon, kung gayon ang mga antibodies ng klase ng IgC ay mananatili sa loob ng ilang taon, at kung minsan ay habang-buhay.

Upang makilala ang mga indibidwal na antigens ng mga virus at antibodies sa kanila sa mga kumplikadong paghahalo nang walang paunang paglilinis ng mga protina, ginagamit ang immunoblotting. Pinagsasama ng pamamaraan ang fractionation ng protina gamit ang polyacrylamide gel electrophoresis na may kasunod na immunoindication ng mga protina gamit ang enzyme immunoassay method. Binabawasan ng paghihiwalay ng protina ang mga kinakailangan para sa kadalisayan ng kemikal ng antigen at ginagawang posible na makilala ang mga indibidwal na pares ng antigen-antibody. Ang gawaing ito ay may kaugnayan, halimbawa, sa serodiagnosis ng impeksyon sa HIV, kung saan ang maling-positibong enzyme-linked immunosorbent assay reaksyon ay sanhi ng pagkakaroon ng mga antibodies sa cellular antigens, na naroroon bilang isang resulta ng hindi sapat na paglilinis ng mga viral protein. Ang pagkakakilanlan ng mga antibodies sa sera ng pasyente sa panloob at panlabas na mga antigen ng viral ay ginagawang posible upang matukoy ang yugto ng sakit, at kapag pinag-aaralan ang mga populasyon, ang pagkakaiba-iba ng mga protina ng viral. Ang immunoblotting para sa impeksyon sa HIV ay ginagamit bilang confirmatory test upang matukoy ang mga indibidwal na viral antigen at antibodies sa kanila. Kapag sinusuri ang mga populasyon, ang pamamaraan ay ginagamit upang matukoy ang pagkakaiba-iba ng mga viral protein. Ang malaking halaga ng pamamaraan ay namamalagi sa posibilidad ng pag-aaral ng mga antigens na synthesize gamit ang recombinant DNA technology, na nagtatatag ng kanilang mga sukat at ang pagkakaroon ng mga antigenic determinants.