Ang pagsasagawa ng PCR analysis (PCR diagnostics) ay nagsisimula sa pagkolekta ng materyal para sa pagsusuri ng isang gynecologist, urologist o dermatovenerologist. Ang kalidad at pagiging maaasahan ng mga kasunod na nakuha na mga resulta ay sinisiguro ng pinakamataas na kwalipikasyon at malawak na karanasan ng mga doktor ng sentrong medikal ng Euromedprestige, na sumusunod sa lahat ng kinakailangang mga patakaran pagsasagawa ng PCR- pagsusuri: kumpletong sterility, paggamit ng mga disposable na materyales lamang.

Ang nakolektang materyal mula sa brush ay inilalagay sa isang lalagyan na may solusyon sa asin. Pagkatapos ng koleksyon, ang mga sample ay dapat maihatid sa laboratoryo ng PCR sa lalong madaling panahon.

Ang pagsusuri sa PCR ay isinasagawa sa laboratoryo sa tatlong yugto:

1. Pagkuha ng DNA
2. Pagpapalakas ng mga fragment ng DNA
3. Pagtuklas ng mga produkto ng DNA amplification

Ang pagkuha ng DNA ay ang paunang yugto ng mga diagnostic ng PCR, ang kakanyahan nito ay ang mga sumusunod: ang doktor ay kumukuha ng materyal para sa pananaliksik mula sa pasyente at isasailalim ito sa espesyal na pagproseso. Sa panahon ng pagproseso, ang DNA double helix ay nahahati sa mga indibidwal na hibla. Ang isang espesyal na likido ay idinagdag sa materyal ng pasyente, na natutunaw ang mga organikong sangkap na nakakasagabal sa "kadalisayan" ng reaksyon. Inaalis nito ang mga lipid, amino acid, peptides, carbohydrates, protina at polysaccharides. Bilang resulta, nabuo ang DNA o RNA.

Ang prinsipyo ng paraan ng PCR ay ang "pagbuo" ng mga bagong impeksyon sa DNA o RNA. Hindi ito magagawa nang hindi inaalis ang cellular na materyal.

Ang dami ng oras na ginugol sa pagkuha ng DNA ay nakasalalay sa sanhi ng impeksyon at sa uri ng materyal na ginamit para sa pananaliksik sa PCR. Halimbawa, tumatagal ng 1.5-2 oras upang ihanda ang dugo para sa susunod na yugto.

0Array ( => Mga Pagsusuri) Array ( => 2) Array ( =>.html) 2

Pagpapalakas ng DNA

Upang maisagawa ang susunod na yugto ng mga diagnostic ng DNA - pagpapalakas ng DNA - ginagamit ng mga doktor ang tinatawag na mga DNA matrice - mga molekula ng DNA ng mga impeksyon, kung saan ang "pag-clone" ng DNA ay kasunod na magaganap. Nabanggit na na ang pagkakaroon ng kumpletong DNA ng impeksyon ay hindi kinakailangan; upang maisagawa ang yugtong ito, ang isang maliit na piraso ng molekula ng DNA, na katangian lamang ng isang naibigay na mikrobyo (impeksyon), ay sapat.

Ang batayan ng pagpapalakas ng DNA at, nang naaayon, ang batayan ng buong prinsipyo ng reaksyon ng PCR ay ang natural na proseso ng pagkumpleto ng DNA para sa lahat ng nabubuhay na bagay - pagtitiklop ng DNA, na isinasagawa sa pamamagitan ng pagdodoble ng isang solong DNA chain.

Simula sa isang solong fragment ng DNA, kinokopya ito ng doktor sa laboratoryo at pinapataas ang bilang ng mga kopya sa isang chain reaction mode: pagkatapos ng unang cycle mayroon ka nang 2 fragment, pagkatapos ng pangalawang cycle - 4, pagkatapos ng pangatlo - 8, pagkatapos ng pang-apat - 16, pagkatapos ay 32 , 64, 128, 256... Sa bawat cycle ay dumodoble ang bilang ng mga kopya, at pagkatapos ng dalawampung cycle ang bilang ay napupunta na sa milyon-milyon, at pagkatapos ng tatlumpu - sa bilyun-bilyon. Ang cycle ay tumatagal ng ilang minuto at bumubuhos sa isang tiyak na pagbabago sa temperatura sa isang napakaliit na chemical reactor. Dito, sa solusyon, ang lahat ng mga kinakailangang sangkap ng synthesis ay naroroon sa sapat na dami, una sa lahat, ang mga nucleotides A, G, T at C, at ang mga maselan na operasyon ng kemikal sa paghahanda ay isinasagawa upang ang isang eksaktong kopya ay agad na kinuha mula sa bawat isa. tapos na ang DNA segment, pagkatapos ay mula sa kopyang ito - muli isang kopya, ito ang branched chain reaction.

Sa pamamagitan ng paglakip ng mga primer sa DNA chain—artipisyal na synthesize na "mga piraso" ng DNA (mga pares ng nucleotide) na katulad ng DNA ng mga mikrobyo (mga impeksyon) - dalawang maikling helice na binubuo ng dalawang hibla ng mga seksyon ng DNA ay nabuo, na kinakailangan para sa synthesis ng hinaharap. DNA.

Ang synthesis ng isang bagong chain ay nangyayari sa pamamagitan ng pagkumpleto ng bawat isa sa dalawang DNA strands. Ang proseso ng amplification ay nangyayari sa tulong ng isang tiyak na rehiyon - DNA polymerase, na nagbibigay ng pangalan sa pamamaraan ng laboratoryo. Ang polymerase ay gumaganap bilang isang katalista para sa reaksyon at sinusubaybayan ang sunud-sunod na pagkakabit ng mga base ng nucleotide sa lumalaking bagong DNA strand.

Kaya, ang DNA amplification ay isang maramihang pagtaas sa bilang ng mga kopya ng DNA na tiyak, ibig sabihin, likas lamang sa isang partikular na organismo. Hindi na kailangang kumpletuhin ang buong DNA chain para makita ang nakakahawang ahente. Ang lugar lamang na katangian ng isang partikular na bacterium bilang indibidwal ang kailangan.

5360 kuskusin. Gastos ng isang komprehensibong programa na may gastroenterologist

DISCOUNT 25% SA ISANG APPOINTMENT SA ISANG CARDIOLOGIST

- 25%pangunahin
Pagbisita ng doktor
therapist sa katapusan ng linggo

RUB 5,160 sa halip na 5,420 kuskusin. Pagsusuri sa mga lalaki para sa mga impeksyon sa urolohiya

ALERGOLOHIYA RUB 5,120 sa halip na 5,590 kuskusin.

Ang lahat ng mga paulit-ulit na hakbang sa amplification ay nangyayari sa iba't ibang temperatura. Upang magsagawa ng pagsusuri sa PCR, ginagamit ang mga espesyal na naka-program na kagamitan - PCR - thermostat o amplifier, na awtomatikong nagbabago ng temperatura. Isinasagawa ang amplification ayon sa isang ibinigay na programa na naaayon sa uri ng impeksyon na natukoy. Depende sa programa at uri ng impeksyon na natukoy, ang automated na proseso ng PCR ay tumatagal mula 2 hanggang 3 oras.

Ang mga kwalipikasyon ng doktor sa laboratoryo na nagsasagawa ng pagsusuri ay may mahalagang papel sa mga diagnostic ng PCR; ang tamang mga setting ng kagamitan sa PCR at ang interpretasyon ng mga resulta ay nakasalalay sa kanya. Ang mga doktor sa Euromedprestige Medical Center ay may malawak na karanasan sa pagsasagawa ng mga diagnostic ng DNA, na tinitiyak ang pagiging maaasahan ng mga resulta ng pananaliksik at ginagarantiyahan ang positibong tagumpay sa paggamot. Nakakahawang sakit. Upang masuri gamit ang PCR method at conduct buong diagnostic at paggamot ng mga nakakahawang sakit sa ating ospital"Euromedprestige".

Sa panahon ng pagtuklas ng mga produkto ng amplification, ang nagresultang timpla ng mga produkto ng amplification ay pinaghihiwalay. Ang mga espesyal na solusyon ay idinagdag sa pinaghalong, na nagbibigay sa mga fragment ng DNA ng kakayahang mag-fluoresce - na makikita sa orange-red luminous stripes. Ang resultang glow ay nagpapahiwatig ng pagkakaroon ng DNA ng mga virus, microbes o bacteria sa materyal na kinuha mula sa pasyente para sa pagsusuri ng PCR.

GOU VPO "Krasnoyarsk State Medical Academy"

pinangalanang Yasenetsky Federal Agency for Health and Social Development »

Department of Medical Genetics at Clinical Neurophysiology IPO

BATAYANG MGA PRINSIPYO NG PARAAN

POLYMERASE CHAIN ​​REACTION

Toolkit para sa 3-4 na taong mag-aaral

sa mga espesyalidad ng pangkalahatang medisina (060101) at

Krasnoyarsk - 2007

Schneider, N. A., Butyanov, R. A. Mga pangunahing prinsipyo ng paraan ng reaksyon ng polymerase chain. Metodolohikal na manwal para sa ekstrakurikular na gawain ng 3-4 taong mga mag-aaral sa mga espesyalidad ng pangkalahatang medisina (060101) at pediatrics (060103). – Krasnoyarsk: Publishing house ng State Educational Institution of Higher Professional Education KrasSMA, 2007. – 42 p.

Ang manu-manong pamamaraan ay ganap na sumusunod sa mga kinakailangan ng Pamantayan ng Estado (2000) at sumasalamin sa mga pangunahing aspeto makabagong pamamaraan mga diagnostic namamana na mga sakit human – polymerase chain reaction method, materyal na pang-edukasyon na inangkop sa mga teknolohiyang pang-edukasyon isinasaalang-alang ang mga detalye ng pagsasanay sa 3-4 na taon ng mga medikal at pediatric na faculties.

Mga Reviewer: Pinuno ng Department of Medical Genetics, Institusyon ng Edukasyon ng Estado ng Mas Mataas na Propesyonal na Edukasyon

"Novosibirsk State Medical University ng Federal Agency for Health at panlipunang pag-unlad", Doktor ng Medikal na Agham, Propesor;

Pagtitiklop ng DNA

Ang object ng pag-aaral ng paraang ito ay Deoxyribonucleic acid (DNA). Ang DNA ay ang unibersal na tagapagdala ng genetic na impormasyon sa lahat ng mga organismo na umiiral sa Earth (maliban sa mga microorganism na naglalaman ng RNA). Ang DNA ay isang double strand na pinaikot sa isang helix. Ang bawat strand ay binubuo ng mga nucleotide na konektado sa pagkakasunud-sunod. Ang mga DNA strand ay may magkasalungat na direksyon: ang 5" dulo ng isang strand ay tumutugma sa 3" na dulo ng pangalawang strand. Natatanging ari-arian Ang DNA ay ang kakayahang doblehin ang sarili nito. Ang prosesong ito ay tinatawag na pagtitiklop. Ang pagtitiklop ng molekula ng DNA ay nangyayari sa panahon ng sintetikong interphase. Ang bawat isa sa dalawang kadena ng molekula ng "ina" ay nagsisilbing template para sa "anak na babae". Pagkatapos ng pagtitiklop, ang bagong synthesize na molekula ng DNA ay naglalaman ng isang "ina" na strand, at ang pangalawa ay isang bagong synthesize na "anak na babae" na strand (semi-conservative na pamamaraan). Para sa synthesis ng matrix Upang mabuo ang isang bagong molekula ng DNA, ang lumang molekula ay kailangang i-decoiled at iunat. Nagsisimula ang pagtitiklop sa ilang lugar sa molekula ng DNA. Ang seksyon ng isang molekula ng DNA mula sa simula ng isang pagtitiklop hanggang sa simula ng isa pa ay tinatawag replika.

Ang simula ng pagtitiklop ay isinaaktibo mga panimulang aklat(primer) na binubuo ng 100-200 na mga pares ng nucleotide. Ang DNA helicase enzyme ay nag-unwind at naghahati sa ina na DNA helix sa dalawang strand, kung saan, ayon sa prinsipyo ng complementarity, kasama ang pakikilahok ng DNA polymerase enzyme, ang "anak" na mga hibla ng DNA ay binuo. Upang simulan ng enzyme ang trabaho nito, kinakailangan ang pagkakaroon ng panimulang bloke - isang maliit na paunang double-stranded na fragment. Ang panimulang bloke ay nabuo sa pamamagitan ng pakikipag-ugnayan ng panimulang aklat sa komplementaryong rehiyon ng kaukulang strand ng parent DNA. Sa bawat replicon, ang DNA polymerase ay maaaring gumalaw kasama ang "ina" strand sa isang direksyon lamang (5`=>3`).

Sa nangungunang strand, habang ang replicon ay nag-unwind, ang isang "anak na babae" na strand ay unti-unting lumalaki. Sa lagging strand, nag-synthesize din ang daughter strand sa direksyon (5`=>3`), ngunit sa magkahiwalay na mga fragment habang nag-unwind ang replicon.

Kaya, ang pagdaragdag ng mga pantulong na nucleotides ng "anak na babae" na mga hibla ay nangyayari sa magkasalungat na direksyon (antiparallel). Ang pagtitiklop sa lahat ng mga replika ay nangyayari nang sabay-sabay. Ang mga fragment at bahagi ng "anak na babae" na mga hibla na na-synthesize sa iba't ibang mga replika ay tinatahi sa isang solong strand ng enzyme ligase. Ang pagtitiklop ay nailalarawan sa pamamagitan ng semi-conservativeness, antiparallelism at discontinuity. Ang buong genome ng isang cell ay ginagaya nang isang beses sa isang yugto ng panahon na tumutugma sa isang mitotic cycle. Bilang resulta ng proseso ng pagtitiklop, dalawang molekula ng DNA ang nabuo mula sa isang molekula ng DNA, kung saan ang isang strand ay mula sa molekula ng ina ng DNA, at ang pangalawa, anak na babae, na bagong synthesize (Fig. 1).

kanin. 1. Scheme ng pagtitiklop ng molekula ng DNA.

Kaya, kasama ang ikot ng pagtitiklop ng DNA tatlong pangunahing yugto:

1. unwinding ng DNA helix at divergence ng strands (denaturation);

2. paglakip ng mga panimulang aklat;

3. pagkumpleto ng kadena ng thread ng bata.

Prinsipyo ng pamamaraan ng PCR

Ito ay DNA replication na bumubuo sa batayan ng PCR. Sa PCR, ang mga proseso sa itaas ay isinasagawa sa isang test tube sa isang cyclic mode. Ang paglipat mula sa isang yugto ng reaksyon patungo sa isa pa ay nakakamit sa pamamagitan ng pagbabago ng temperatura ng pinaghalong incubation. Kapag ang solusyon ay pinainit sa 93-95°C, nangyayari ang DNA denaturation. Upang magpatuloy sa susunod na yugto - ang pagdaragdag o "pagsusubo" ng mga panimulang aklat - ang pinaghalong pagpapapisa ng itlog ay pinalamig sa 50-65°C. Susunod, ang timpla ay pinainit sa 70-72°C - ang pinakamabuting kalagayan para sa taq-DNA polymerase - sa yugtong ito ay nagaganap ang pagtatayo ng bagong DNA strand. Pagkatapos ay umuulit muli ang ikot. Sa ibang salita ang paraan ng PCR ay maraming pagtaas sa numero ng kopya (pagpapalakas) isang partikular na seksyon ng DNA na na-catalyze ng enzyme DNA polymerase.

Ang paglaki ng mga strand ng DNA ng anak na babae ay dapat mangyari nang sabay-sabay sa parehong mga hibla ng maternal DNA, kaya nangangailangan din ang pagtitiklop ng pangalawang strand ng sarili nitong primer. Kaya, dalawang panimulang aklat ang idinagdag sa pinaghalong reaksyon: isa para sa "+" na kadena, ang pangalawa para sa "-" na kadena. Ang pagkakaroon ng nakakabit sa kabaligtaran na mga hibla ng molekula ng DNA, nililimitahan ng mga panimulang aklat ang kanilang sarili sa bahagi nito na pagkatapos ay madodoble o mapapalaki ng maraming beses. Ang haba ng naturang fragment, na tinatawag na amplicon, ay karaniwang ilang daang nucleotides.

Mga yugto ng PCR

Ang bawat cycle ng amplification ay may kasamang 3 yugto, na nagaganap sa iba't ibang kondisyon ng temperatura (Larawan 2).

· Stage 1: denaturation ng DNA . Nangyayari sa 93-95° sa loob ng 30-40 segundo.

· Stage 2: panimulang pagsusubo . Ang attachment ng mga panimulang aklat ay nangyayari bilang pantulong sa kaukulang mga pagkakasunud-sunod sa kabaligtaran ng mga hibla ng DNA sa mga hangganan ng isang partikular na rehiyon. Ang bawat pares ng mga panimulang aklat ay may sariling temperatura ng pagsusubo, ang mga halaga nito ay nasa hanay na 50-65°C. Oras ng pagsusubo 20-60 seg.

· Stage 3: pagkumpleto ng mga chain ng DNA. Ang komplementaryong pagkumpleto ng mga chain ng DNA ay nangyayari mula sa 5" dulo hanggang 3" na dulo ng chain sa magkasalungat na direksyon, simula sa mga primer attachment site. Ang materyal para sa synthesis ng mga bagong DNA chain ay deoxyribonucleoside triphosphates na idinagdag sa solusyon. Ang proseso ng synthesis ay na-catalyzed ng enzyme taq polymerase at nagaganap sa temperatura na 70-72°C. Ang oras ng synthesis ay 20-40 segundo.

Ang mga bagong DNA chain na nabuo sa unang amplification cycle ay nagsisilbing template para sa ikalawang amplification cycle, kung saan nabuo ang isang partikular na DNA amplicon fragment (Fig. 3). Sa kasunod na mga cycle ng amplification, ang mga amplicon ay nagsisilbing template para sa synthesis ng mga bagong chain.

Kaya, ang akumulasyon ng mga amplicon sa solusyon ay nangyayari ayon sa formula 2", kung saan ang n ay ang bilang ng mga cycle ng amplification. Samakatuwid, kahit na ang paunang solusyon sa una ay naglalaman lamang ng isang double-stranded na molekula ng DNA, pagkatapos ay sa 30-40 na mga cycle tungkol sa 108 amplicon molecules ang naipon sa solusyon. Ito ang halaga ay sapat para sa maaasahang visual detection ng fragment na ito sa pamamagitan ng agarose gel electrophoresis.

Ang proseso ng amplification ay isinasagawa sa isang espesyal na programmable thermostat ( thermal cycler), na, ayon sa isang ibinigay na programa, ay awtomatikong nagbabago ng mga temperatura ayon sa bilang ng mga cycle ng amplification.

Upang maisagawa ang amplification, kinakailangan ang mga sumusunod na sangkap:

· DNA matrix(DNA o bahagi nito na naglalaman ng nais na tiyak na fragment);

· Mga panimulang aklat(synthetic oligonucleotides (20-30 nucleotide pairs), pantulong sa mga sequence ng DNA sa mga hangganan ng partikular na fragment na tinutukoy). Ang pagpili ng isang partikular na fragment at ang pagpili ng mga primer ay gumaganap ng isang kritikal na papel sa pagtitiyak ng amplification, na nakakaapekto sa kalidad ng pagsusuri.

· Pinaghalong deoxynucleotide triphosphate (dNTPs)(isang pinaghalong apat na dNTP, na siyang materyal para sa synthesis ng mga bagong komplementaryong DNA chain sa katumbas na konsentrasyon na 200-500 µM)

· EnzymeTaq- polymerase(thermotable DNA polymerase na nag-catalyze sa pagpahaba ng mga primer chain sa pamamagitan ng sunud-sunod na pagdaragdag ng mga nucleotide base sa lumalaking chain ng synthesized DNA, 2-3 mM).

· Buffer solution(reaction medium na naglalaman ng Mg2+ ions na kailangan para mapanatili ang aktibidad ng enzyme, pH 6.8-7.8).

Upang matukoy ang mga partikular na rehiyon ng genome ng mga RNA virus, ang isang kopya ng DNA ay unang nakuha mula sa isang template ng RNA gamit ang isang reverse transcription (RT) na reaksyon na na-catalyze ng enzyme revertase (reverse transcriptase).

kanin. 2. Pagpapalakas (1st cycle).

kanin. 3. Pagpapalakas (2nd cycle).

Pangunahing aplikasyon ng PCR

· klinikal na gamot:

o diagnosis ng mga impeksyon,

o pagkilala sa mga mutasyon, kabilang ang diagnosis ng mga namamana na sakit,

o genotyping, kabilang ang HLA genotyping,

o mga teknolohiyang cellular

· ekolohiya (bilang isang paraan upang masubaybayan ang kalagayan at kalidad ng mga bagay sa kapaligiran at mga produktong pagkain)

· pagpapasiya ng mga transgenic na organismo (GMOs)

Personal na pagkakakilanlan, pagtatatag ng paternity, forensics

· pangkalahatan at tiyak na biology,

Mga pangunahing prinsipyo

organisasyon ng mga diagnostic na laboratoryo

Ang trabaho sa laboratoryo ng PCR ay isinasagawa alinsunod sa "Mga Panuntunan ng disenyo, pag-iingat sa kaligtasan, pang-industriya na kalinisan, rehimeng anti-epidemya at personal na kalinisan kapag nagtatrabaho sa mga laboratoryo (mga departamento, departamento) ng mga sanitary at epidemiological na institusyon ng sistema ng pangangalagang pangkalusugan.

Kontaminasyon ng mga sample ng DNA

Ang pagsasagawa ng mga diagnostic ng PCR ay nauugnay sa isang problema dahil sa mataas na sensitivity ng pamamaraan - ang posibilidad karumihan. Ang pagpasok ng mga bakas na halaga ng positibong DNA sa reaction tube (mga partikular na produkto ng amplification ng DNA - mga amplicon; pamantayan ng DNA na ginamit bilang positibong kontrol; positibong DNA mula sa isang klinikal na sample) ay humahantong sa pagpapalaki ng isang partikular na fragment ng DNA sa panahon ng PCR at, bilang isang resulta , sa paglitaw ng mga maling positibong resulta.

Sa proseso ng trabaho maaari kang makatagpo dalawang uri ng kontaminasyon:

1. cross contamination mula sa sample hanggang sa sample (sa panahon ng pagpoproseso ng mga klinikal na sample o kapag natunaw ang reaksyong timpla), na humahantong sa kalat-kalat na false-positive na mga resulta;

2. kontaminasyon sa mga produkto ng amplification(amplicons) pagkakaroon pinakamataas na halaga, dahil sa panahon ng proseso ng PCR, ang mga amplicon ay nag-iipon sa napakalaking dami at mga mainam na produkto para sa reamplification.

Ang kontaminasyon ng mga babasagin, mga awtomatikong pipette at kagamitan sa laboratoryo, ang ibabaw ng mga bangko ng laboratoryo, o kahit na ang ibabaw ng balat ng mga manggagawa sa laboratoryo na may mga bakas na dami ng mga amplicon ay humahantong sa mga sistematikong false-positive na resulta. Ang pagtukoy sa pinagmulan ng kontaminasyon ay maaaring napakahirap at nangangailangan ng malaking pamumuhunan ng oras at pera. Ang karanasang natamo hanggang sa kasalukuyan sa mga laboratoryo gamit ang paraan ng PCR para sa mga diagnostic ay nagpapahintulot sa amin na bumalangkas ng mga pangunahing kinakailangan para sa organisasyon ng naturang mga laboratoryo at ang pagsasagawa ng mga pagsusuri mismo. Ang pagsunod sa mga kinakailangang ito ay nag-aalis ng posibilidad ng kontaminasyon at mga maling positibong resulta.

Mga yugto ng pagsusuri sa PCR

Ang mga ito ay heograpikal na pinaghihiwalay sa pamamagitan ng paglalagay sa kanila sa magkahiwalay na mga silid (Larawan 4, 5):

· Pre-PCR room, kung saan pinoproseso ang mga klinikal na sample, ibinubukod ang DNA, inihahanda ang isang reaksyong timpla para sa PCR, at isinagawa ang PCR (kung may mga kundisyon, inirerekomenda din ang huling dalawang yugto na isagawa sa karagdagang hiwalay na silid). Sa mga lugar na ito, ipinagbabawal na isagawa ang lahat ng iba pang uri ng trabaho sa mga ahente ng pagsubok, ang mga diagnostic ng PCR na kung saan ay isinasagawa sa laboratoryo na ito.

· Post-PCR room, kung saan ang pagtuklas ng mga produkto ng amplification ay isinasagawa. Maaaring gumamit ng iba pang paraan ng pagtuklas sa kuwartong ito. Maipapayo na hanapin ang silid ng pagtuklas ng produkto ng amplification hangga't maaari mula sa mga silid ng pre-PCR.

Ang mga workroom ay nilagyan ng mga ultraviolet lamp na may maximum na radiation sa rehiyon na 260 nm (uri ng DB-60) sa rate na 2.5 W bawat 1 m3. Ang mga lamp ay matatagpuan upang ang mga ibabaw ng work table, kagamitan at materyales kung saan ang operator ay nakikipag-ugnayan sa panahon ng pagsusuri ng PCR ay nalantad sa direktang pag-iilaw. Ang pag-iilaw ay isinasagawa sa loob ng 1 oras bago simulan ang trabaho at sa loob ng 1 oras pagkatapos matapos ang trabaho.

Ang mga doktor sa laboratoryo ay nagtatrabaho sa mga espesyal na damit sa laboratoryo, na binago kapag lumilipat mula sa isang silid patungo sa isa pa, at sa mga disposable na guwantes. Ang mga damit mula sa iba't ibang kuwarto ay pinoproseso nang hiwalay. Ang iba't ibang empleyado ay nagtatrabaho sa iba't ibang yugto ng pagsusuri sa PCR.

Para sa trabaho, hiwalay na mga hanay ng mga dispenser, plastik at babasagin, kagamitan sa laboratoryo, gown at guwantes ay ginagamit, na nilayon para sa iba't ibang yugto ng pagsusuri at hindi portable mula sa isang silid patungo sa isa pa. Ang mga kagamitan, materyales at suplay sa bawat silid ay angkop na minarkahan.

Ang lahat ng mga yugto ng trabaho ay isinasagawa lamang gamit ang mga disposable consumable: mga tip para sa mga awtomatikong pipette, test tube, guwantes, atbp. Siguraduhing baguhin ang mga tip kapag lumilipat mula sa sample patungo sa sample. Kinakailangang gumamit ng mga tip na may filter - isang aerosol barrier upang maiwasan ang pagpasok ng mga microdroplet ng solusyon sa pipette. Ang mga ginamit na tubo at mga tip ay itinatapon sa mga espesyal na lalagyan o lalagyan na naglalaman ng solusyon sa disinfectant. Ang mga klinikal na sample ay nakaimbak nang hiwalay sa mga reagents.

Upang iproseso at linisin ang lugar ng trabaho, ang bawat silid ay nilagyan ng cotton-gauze swabs (wipes), tweezers, disinfectant at inactivating solution.

Ibinubukod ng diagnostic laboratory ng PCR ang mga gawaing nauugnay sa paggawa (pag-clone) at paghihiwalay ng mga recombinant na plasmid na naglalaman ng mga pagkakasunud-sunod ng DNA o mga fragment ng gene ng mga pathogen na na-diagnose sa laboratoryo na ito.

Koleksyon ng mga klinikal na materyal

Ang materyal na pag-aaralan para sa PCR ay maaaring mga scrapings ng epithelial cells, dugo, plasma, serum, pleural at cerebrospinal fluid, ihi, plema, mucus at iba pang biological secretions, biopsy.

Ang materyal ay kinokolekta sa isang silid ng paggamot ng naaangkop na profile. Pagkatapos ng koleksyon, ang mga sample ay dapat maihatid sa PCR diagnostic laboratory sa lalong madaling panahon.

Ang mga sample ay dapat kunin gamit ang sterile, mas mainam na disposable, mga instrumento lamang sa disposable sterile plastic tubes o glass tubes, pre-treated para sa isang oras na may chromium mixture, lubusang hugasan ng distilled water at calcined sa isang drying cabinet sa temperatura na 150°C para sa 1 oras.

Detection zone (ibang palapag o ibang gusali).

kanin. 4. PCR laboratory device na may detection sa pamamagitan ng electrophoresis.

Detection zone (ibang palapag o ibang gusali)

kanin. 5. PCR laboratory device na may fluorescent detection (quantitative analysis).

kanin. 6. Kwarto ng pagkuha ng DNA. Ang ipinapakita ay isang tabletop box na may germicidal lamp.

kanin. 7. Amplification room.

kanin. 8. Detection room.

kanin. 9. Mga sample ng dugo para sa mga diagnostic ng DNA ng mga namamana na sakit.

Sample na imbakan at transportasyon

Upang masuri ang mga namamana na sakit, ang mga sample ng dugo ay naka-imbak sa mga espesyal na form ng papel o sa mga epindorf (plastic tubes) sa isang frozen na estado sa loob ng mahabang panahon (Larawan 9).

Upang masuri ang mga nakakahawang sakit, ang mga sample ay pinananatili sa temperatura ng silid nang hindi hihigit sa 2 oras. Kung kailangan ng mas mahabang imbakan, ang mga sample ay maaaring ilagay sa refrigerator sa temperatura na 2-8°C sa loob ng hindi hihigit sa isang araw. Ang mas mahabang pag-iimbak (hanggang 2 linggo) ay pinahihintulutang frozen sa isang freezer sa temperatura na minus 20°C. Ang paulit-ulit na pagyeyelo at pagtunaw ng mga sample ay hindi pinapayagan.

Kung ang laboratoryo ng diagnostic ng PCR at ang silid ng pamamaraan para sa sampling ay heograpikal na pinaghihiwalay, kung gayon ang transportasyon ng mga sample ay dapat isagawa sa mga thermoses o thermal container bilang pagsunod sa mga patakaran para sa pag-iimbak ng mga sample at ang mga patakaran para sa pagdadala ng mga nakakahawang materyales.

Pagkuha ng DNA mula sa mga sample

Ang solid-phase sorption method ay naging laganap, na binubuo ng pagdaragdag ng lysis agent na naglalaman ng guanidine solution, sorption ng DNA sa isang sorbent, paulit-ulit na paghuhugas at resorption ng DNA na may buffer solution. Kapag nagpoproseso ng serum, plasma o buong dugo, kadalasang ginagamit ang paraan ng pagkuha ng phenol. Ang pamamaraan ay nagsasangkot ng deproteinization na may phenol/chloroform na sinusundan ng DNA (o RNA) precipitation na may ethanol o isopropanol. Ang pagproseso ay isinasagawa sa Eppendor P microcentrifuge tubes na may dami na 1.5 ml. Ang oras ng pagproseso ay 1.5-2 na oras (Larawan 10).

kanin. 10. Pagkuha ng DNA.

Pagsasagawa ng PCR

Ang isang tiyak na halaga ng sample mula sa naprosesong klinikal na sample ay inilipat sa isang espesyal na microcentrifuge tube ng uri ng Eppendorf na may dami na 0.2 o 0.5 ml. Ang isang amplification mixture na binubuo ng tubig, PCR buffer, dNTP solution, primer solution at solusyon ay idinagdag sa ang parehong tubo. Taq polymerase (idinagdag sa huling pinaghalong). Karaniwan, ang dami ng pinaghalong reaksyon ay 25 µl. Pagkatapos ay isang patak ng mineral na langis ang idinaragdag sa bawat tubo upang maiwasan ang pagsingaw ng pinaghalong reaksyon sa panahon ng proseso ng amplification. Ang ang mga tubo ay inililipat sa isang programmable thermostat (amplifier), kung saan awtomatikong isinasagawa ang amplification ayon sa isang ibinigay na programa (Fig. 11).

kanin. labing-isa. amplifier" Thermocycler ».

Ang oras ng reaksyon, depende sa tinukoy na programa, ay 2-3 oras. Kaayon ng mga pang-eksperimentong sample, ang mga control sample ay inilalagay: ang positibong kontrol ay kinabibilangan ng lahat ng bahagi ng reaksyon, ngunit sa halip na ang klinikal na sample na materyal, isang control DNA na paghahanda ng gene na pinag-aaralan ay idinagdag. Kasama sa negatibong kontrol ang lahat ng bahagi ng reaksyon, ngunit sa halip na klinikal na materyal o paghahanda ng DNA, isang naaangkop na dami ng deionized na tubig o isang katas na hindi naglalaman ng DNA na sinusuri ay idinagdag. Ang negatibong kontrol ay kinakailangan upang suriin ang mga bahagi ng reaksyon para sa kawalan ng DNA dahil sa kontaminasyon at upang ibukod ang mga maling positibong resulta.

Pagpaparehistro ng mga resulta

Ang amplified specific DNA fragment ay nakita ng agarose gel electrophoresis sa pagkakaroon ng ethidium bromide. Ang ethidium bromide ay bumubuo ng isang matatag na interstitial compound na may mga fragment ng DNA, na lumilitaw sa anyo ng mga makinang na banda kapag ang gel ay na-irradiated ng UV radiation na may wavelength na 290-330 nm. Depende sa laki ng mga amplicon na nabuo bilang isang resulta ng PCR, isang gel na may agarose na nilalaman na 1.5% hanggang 2.5% ay ginagamit. Upang maghanda ng agarose gel, ang isang halo ng agarose, buffer at tubig ay natunaw sa isang microwave oven o sa isang paliguan ng tubig, at isang solusyon ng ethidium bromide ay idinagdag. Ang halo, na pinalamig sa 50-60 ° C, ay ibinuhos sa amag sa isang layer na 4-6 mm ang kapal at, gamit ang mga espesyal na suklay, ang mga bulsa ay ginawa sa gel para sa paglalapat ng sample. Ang mga suklay ay naka-install sa paraang ang isang 0.5-1 mm na layer ng agarose ay nananatili sa pagitan ng ilalim ng mga balon at ng base ng gel. Matapos tumigas ang gel, ang amplifier ay inilapat sa mga bulsa sa halagang 5-15 μl. Inirerekomenda na magsagawa ng electrophoresis ng isang pinaghalong mga marker ng haba ng fragment ng DNA na kahanay sa mga kontrol at eksperimentong sample. Karaniwan, ang naturang halo ay naglalaman ng sampung mga fragment ng DNA na may haba na 100, 200, 300, atbp. na mga pares ng base.

Ang paggamit ng naturang pagsubok ay ginagawang posible na i-verify ang haba ng mga amplicon sa kontrol at mga eksperimentong sample. Ang gel na may inilapat na sample ay inilipat sa isang electrophoresis chamber na puno ng buffer, ang kamara ay konektado sa isang pinagmumulan ng kapangyarihan at ang electrophoretic na paghihiwalay ng mga produkto ng amplification ay isinasagawa sa loob ng 30-45 minuto sa lakas ng electric field na 10-15 V/ cm. Sa kasong ito, ang harap ng tina na kasama sa pinaghalong reaksyon ay dapat maglakbay nang hindi bababa sa 3 cm.

Matapos makumpleto ang electrophoresis, ang gel ay inilipat sa isang glass transilluminator at tiningnan sa ilalim ng ultraviolet light. Para sa dokumentasyon, ang gel ay nakuhanan ng larawan sa Micrat 300 film o naitala gamit ang isang video system na nakakonekta sa isang computer.

Una sa lahat, sinusuri ang mga control sample. Ang isang orange na kumikinang na banda ay dapat na naroroon sa electrophoretic track na naaayon sa positibong kontrol. Ang electrophoretic mobility nito ay dapat na tumutugma sa haba ng amplicon na tinukoy sa mga tagubilin.

Sa electrophoretic track na naaayon sa negatibong kontrol, ang naturang banda ay dapat na wala. Ang pagkakaroon ng naturang banda sa negatibong kontrol ay nagpapahiwatig ng kontaminasyon - kontaminasyon ng mga reagents na ginamit sa pagsubok na DNA o amplicon. Ang mga sample ng pagsubok ay tinatasa sa pamamagitan ng pagkakaroon ng isang banda sa kaukulang track, na matatagpuan sa parehong antas ng banda sa positibong control sample. Ang intensity ng banda ay tumutugma sa dami ng DNA na sinusuri sa sample, na nagbibigay-daan para sa isang semi-quantitative na pagtatasa ng PCR. Karaniwan, ang mga positibong resulta ay tinatasa sa isang sukat na apat na puntos. Kung ang glow ng banda sa sample ng pagsubok ay napakahina, kung gayon ang gayong sample ay dapat na muling ayusin (Larawan 12).

kanin. 12. Agarose gel electrophoresis.

Mga aplikasyon ng PCR para sadiagnostic ng point mutations at gene polymorphism

Ang isa sa mga nangungunang lugar ng aplikasyon ng PCR sa praktikal na pangangalagang pangkalusugan ay ang diagnosis ng point mutations at gene polymorphism . May mga direkta at hindi direktang pamamaraan ng mga diagnostic ng DNA. Sa mga sitwasyon kung saan kilala ang isang gene, ang pinsala na humahantong sa pag-unlad ng isang namamana na sakit, ang pinsalang ito ay maaaring makita ng mga molecular genetic na pamamaraan. Ang ganitong mga pamamaraan ay tinatawag na direkta. Gamit ang mga direktang pamamaraan, ang mga iregularidad sa pangunahing nucleotide sequence ng DNA (mutations at kanilang mga uri) ay nakita. Ang mga direktang pamamaraan ay nailalarawan sa pamamagitan ng katumpakan na umaabot sa halos 100%.

Gayunpaman, sa pagsasagawa, ang mga pamamaraang ito ay maaaring gamitin sa ilalim ng ilang mga kundisyon:

· may kilalang cytogenetic localization ng gene na responsable para sa pagbuo ng isang namamana na sakit;

· ang gene ng sakit ay dapat na ma-clone at alam ang pagkakasunud-sunod ng nucleotide nito.

Ang layunin ng direktang pagsusuri ng DNA ay upang matukoy ang mga mutant alleles.

Kaya, sa mga sitwasyon kung saan alam kung anong uri ng pinsala sa DNA ang humahantong sa isang namamana na sakit, ang DNA fragment na naglalaman ng pinsala ay direktang sinusuri, ibig sabihin, ang direktang paraan ng diagnostic ng DNA ay ginagamit.

Gayunpaman, hanggang ngayon, ang mga gene ng maraming sakit ay hindi pa namamapa, ang kanilang organisasyong exon-intron ay hindi kilala, at marami namamana na mga sakit ay nailalarawan sa pamamagitan ng binibigkas na genetic heterogeneity, na hindi pinapayagan ang buong paggamit ng mga direktang pamamaraan ng diagnostic ng DNA. Samakatuwid, sa mga kaso kung saan ang lokalisasyon ng pinsala ay hindi alam, ang isa pang diskarte ay ginagamit, na may kaugnayan sa pag-aaral ng paligid ng gene na responsable para sa sakit sa gene, kasama ang pagsusuri ng pamilya, iyon ay, hindi direktang pamamaraan ng molekular genetic diagnosis ng ang mga namamana na sakit ay ginagamit.

Maaaring gamitin upang makita ang mga point mutations at maliliit na pagtanggal iba't-ibang paraan, gayunpaman, lahat sila ay batay sa paggamit ng paraan ng PCR. Ang reaksyong ito ay nagpapahintulot sa iyo na i-multiply ang DNA nucleotide sequence ng maraming beses at pagkatapos ay maghanap ng mga mutasyon. Ang mga pamamaraan para sa paghahanap ng mga fragment ng DNA na nagdadala ng mga mutasyon ay batay sa paghahambing na pagsusuri mutant at normal na DNA nucleotide sequence.

Pagsusuri ng mga produkto ng PCR

sa proseso ng direktang pagsusuri ng DNA

Kinasasangkutan ng pag-aaral ng mga partikular na katangian ng rehiyon ng amplified gene. Kaya, sa mga sakit na sanhi ng pagpapalawak ng mga pag-uulit ng trinucleotide, ang mga produkto ng amplification ay naiiba sa kanilang haba (na sumasalamin sa iba't ibang bilang ng mga triplet sa pinag-aralan na rehiyon ng gene) at, bilang kinahinatnan, sa kanilang bilis ng paggalaw sa gel. Salamat sa ito, ang isang malinaw na electrophoretic na paghihiwalay ng mga normal at mutant alleles at isang tumpak na pagpapasiya ng isang pathologically elongated fragment ay nakamit, i.e. DNA diagnosis ng sakit (Fig. 13).

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width="417" height="110 src=">

kanin. 14. Diagnosis ng pagtanggal GAG sa gene DYT 1 sa mga pasyente na may dopa-independent dystonia (polyacrylamide gel electrophoresis). Lanes 2,3,6 – may sakit; track 1,4,5 – kontrol. Ang manipis na arrow ay nagpapahiwatig ng normal na allele, ang makapal na arrow ay nagpapahiwatig ng mutant na mas maikling allele (pagtanggal ng tatlong nucleotides).

Kung ang buong rehiyon ng DNA na pinag-aaralan ay bahagi ng pinalawig na pagtanggal, ang PCR amplification ng DNA mula sa tinanggal na allele na ito ay hindi isasagawa dahil sa kakulangan ng mga site para sa primer hybridization. Sa kasong ito, ang isang homozygous na pagtanggal ay masuri batay sa kumpletong kawalan ng isang produkto ng reaksyon ng PCR (imposible ang synthesis ng DNA mula sa parehong mga kopya ng gene). Sa isang heterozygous na pagtanggal, posibleng makita ang isang produkto ng PCR na na-synthesize mula sa isang normal (napanatili) na allele; gayunpaman, upang mapagkakatiwalaang masuri ang gayong mutation, kinakailangan na gumamit ng mas kumplikadong mga pamamaraan ng pag-imaging ng DNA na nagbibigay-daan sa pagtantya ng dosis ng panghuling PCR produkto.

Upang matukoy ang mga point mutations (madalas na mga pagpapalit ng nucleotide) sa ilang partikular na mga site, ang PCR method ay ginagamit kasama ng iba pang mga pamamaraan ng molecular genetic analysis. Kung ang lokasyon at kalikasan ng putative point mutation ay tiyak na kilala, kung gayon ang restriction endonucleases (mga enzyme ng paghihigpit) ay mga espesyal na cellular enzyme na nakahiwalay sa iba't ibang strain ng bacteria.

Kinikilala ng mga enzyme na ito ang mga tiyak na pagkakasunud-sunod ng nucleotide mula apat hanggang sampung nucleotide ang haba. Pagkatapos nito, isinasagawa ang paghihigpit (lat. (pagputol)) sa mga pagkakasunud-sunod na ito bilang bahagi ng isang double-stranded na molekula ng DNA. Kinikilala at pinuputol ng bawat restriction enzyme sa isang nakapirming lugar ang isang mahigpit na tinukoy, tiyak na pagkakasunud-sunod ng nucleotide - restriction site (site ng pagkilala).

Sa mga kaso kung saan binago ng isang point mutation ang natural recognition site para sa isang partikular na restriction enzyme, hindi magagawa ng enzyme na ito na buwagin ang mutant na PCR-amplified fragment. Sa ilang mga kaso, ang isang mutation ay humahantong sa paglitaw ng isang bagong site ng pagkilala para sa isang partikular na restriction enzyme na normal na wala.

Sa parehong mga sitwasyon, ang mutant at normal na mga produkto ng PCR na ginagamot sa napiling restriction enzyme ay magbubunga ng mga fragment ng paghihigpit ng iba't ibang haba, na madaling matukoy ng electrophoresis (Fig. 15).

Kaya, kung kinakailangan upang mabilis na makita ang anumang partikular na mutation ng punto, ang gawain ay nabawasan sa paghahanap para sa kaukulang restriction enzyme, ang site ng pagkilala na kung saan ay naisalokal sa site ng disrupted nucleotide sequence. Ang paggamot sa mga produktong PCR na may tulad na restriction enzyme ay gagawing posible na madaling makilala ang mga normal at mutant alleles. Ang pagsusuri sa paghihigpit ay lubos na nagpapadali sa pagtuklas ng mga kilalang point mutations at ngayon ay malawakang ginagamit para sa direktang DNA diagnosis ng mga namamana na sakit.

Ang huling yugto molecular genetic analysis ng mutations ay upang matukoy ang nucleotide sequence ng DNA fragment sa ilalim ng pag-aaral (sequencing), na kung saan ay inihambing sa mga pamantayan at isang panghuling genetic diagnosis ay formulated. Salamat sa mga tagumpay ng molecular genetics, ang mga pamamaraan ng diagnostic ng DNA para sa higit sa 400 namamana na mga sakit ay binuo na ngayon.

kanin. 15. Detection ng point mutation gamit ang restriction analysis: A – amplified gene region na naglalaman ng restriction siteAGCTpara sa restriction endonucleaseAlu ako. MutationG→ Abinabago ang nucleotide sequence na ito, na nagreresulta sa restriction enzymeAluIhinarangan; B - electropherogram ng mga produkto ng paghihigpit: track 1 - homozygosity para sa normal na allele; track 2 - homozygosity para sa mutation; track 3 – heterozygous state (normal allele + mutation).

Ang diagnosis ng mga namamana na sakit, batay sa direktang pagsusuri ng mga mutant alleles sa mga pasyente, mga miyembro ng kanilang pamilya o mga pinaghihinalaang heterozygous carrier ng pathological mutations, ay angkop para sa pre-symptomatic at prenatal diagnosis, na maaaring mailapat sa pinakamaagang yugto ng pag-unlad ng pangsanggol, bago ang paglitaw ng anumang mga klinikal o biochemical na sintomas na sakit.

Anuman ang paraan ng pag-detect ng mutation, ang mga tumpak na katangian ng molekular ng bawat mutation ay maaari lamang makuha sa pamamagitan ng direktang sequencing. Upang i-automate ang prosesong ito, sa mga nakaraang taon, ang mga espesyal na aparato ay malawakang ginagamit - mga sequencer, na ginagawang posible upang makabuluhang mapabilis ang proseso ng pagbabasa ng impormasyon ng DNA.

Ang landas sa mas malawak na paggamit ng molecular biological research sa mga clinical diagnostic laboratories ay binuksan sa pamamagitan ng pagpapabilis ng analytical na proseso sa pamamagitan ng pagsasagawa ng lahat ng mga pamamaraan sa isang continuum, nang walang sample transfer, na lumilikha ng mga kondisyon upang maiwasan ang kontaminasyon sa panahon ng parallel na pagsubok ng isang bilang ng mga analytes at sa pamamagitan ng layunin na pagtatala ng resulta sa bawat cycle.

Pangunahing pagbabago ng paraan ng PCR

Ginagamit upang mabilis na mag-scan at maghanap ng mga kilalang gene mutations.

Multiplex (multi-primer) PCR

Ang pamamaraang ito ay batay sa sabay-sabay na pagpapalakas ng ilang mga exon ng gene na pinag-aaralan sa isang reaksyon. Ito ay nagbibigay-daan para sa cost-effective na mabilis na pag-screen ng mga pinakakaraniwang mutasyon. Halimbawa, upang mabilis na ma-diagnose ang pagdadala ng mga pagtanggal sa dystrophin gene sa mga pasyente na may progresibong Duchenne/Becker muscular dystrophy, ang sabay-sabay na pagpapalakas ng isang hanay ng mga pinaka-madalas na mutated exon ng gene na ito ay isinasagawa. Dahil ang mga sakit na ito ay minana sa isang X-linked recessive na paraan at nauugnay sa pinsala sa nag-iisang X chromosome sa mga lalaki, sa kaso ng isang pinahabang pagtanggal, ang electrophoresis ng mga produkto ng reaksyon ay magbubunyag ng kawalan ng isa o higit pang mga fragment ng DNA (exon). ), na maaaring magsilbing molecular confirmation ng diagnosis. Bilang karagdagan, sa pamamagitan ng pagpili ng mga partikular na seksyon ng gene para sa PCR amplification, ang isang medyo tumpak na pagtatasa ng kabuuang haba ng pagtanggal at mga breakpoint ng gene (hanggang sa exon) ay posible.

Ang pinagsamang paggamit ng ilang multiplex na reaksyon ay ginagawang posible na masuri ang hanggang 98% ng lahat ng mga pagtanggal na nagaganap sa mga pasyenteng may progresibong Duchenne/Becker muscular dystrophy. Ito ay kumakatawan sa humigit-kumulang 60% ng kabuuang bilang ng mga kilalang mutasyon sa dystrophin gene at nagpapahiwatig ng napakataas na kahusayan ng pamamaraang ito ng screening para sa pagsusuri ng DNA ng mga dystrophinopathies (Fig. 16).

kanin. 16. Direktang DNA diagnosis ng Duchenne muscular dystrophy gamit ang multiplex PCR (agarose gel electrophoresis). Sa bawat isa sa mga sinuri na indibidwal, apat na exon ng dystrophin gene ang sabay-sabay na pinalaki (exons 17, 19, 44 at 45; ipinapahiwatig ng mga arrow ang kaukulang mga produkto ng amplification). Lane 1 – control, lane 2-5 – mga pasyenteng may Duchenne muscular dystrophy na may iba’t ibang pagtanggal ng dystrophin gene (lane 2 at 5 – pagtanggal ng exon 45, track 3 – pagtanggal ng exon 44, track 4 – pagtanggal ng mga exon 17 at 19 ).

Allele-specific amplification

Ang pamamaraan ay batay sa paggamit ng dalawang independiyenteng pares ng mga panimulang aklat para sa isang partikular na rehiyon ng gene: ang isang panimulang aklat sa parehong mga pares ay karaniwan, at ang pangalawang panimulang aklat sa bawat pares ay may iba't ibang istraktura at komplementaryo sa alinman sa isang normal o mutant na pagkakasunud-sunod ng DNA. Bilang resulta ng naturang reaksyon, ang dalawang uri ng mga produkto ng PCR ay maaaring sabay na ma-synthesize sa solusyon - normal at mutant. Bukod dito, ginagawang posible ng disenyo ng mga panimulang aklat na malinaw na makilala ang pagkakaiba ng normal at mutant na mga produkto ng amplification sa pamamagitan ng kanilang laki ng molekular. Ang pamamaraang ito ay napaka-visual at nagbibigay-daan sa iyo upang i-verify ang parehong homo- at heterozygous na karwahe ng mutant allele.

Paraan para sa pagbabagong nakadirekta sa site ng amplified DNA

Ang pamamaraan ay batay sa paggamit ng tinatawag na mismatch primer sa PCR (hindi ganap na pantulong sa template), na naiiba sa template DNA sequence ng isang nucleotide. Bilang resulta ng pagsasama ng tinukoy na panimulang aklat sa mutant na produkto ng PCR, isang artipisyal na nilikha na site ng paghihigpit para sa isa sa mga endonucleases ng paghihigpit ay nabuo dito, na nagpapahintulot sa direktang pagsusuri ng DNA ng isang tiyak na kilalang mutation gamit ang pagsusuri sa paghihigpit. Ang paglikha ng naturang artipisyal na lugar ng paghihigpit ay kinakailangan kung ang paghahanap ay hindi nagbunyag ng pagkakaroon ng isang kilalang at magagamit na enzyme, ang "natural" na lugar ng paghihigpit na apektado bilang isang resulta ng hitsura ng mutation na pinag-aaralan sa molekula ng DNA .

Reverse transcriptase PCR method (RT- PCR)

Ang pamamaraang ito ay ginagamit sa mga kaso kung saan mas maginhawang gumamit ng hindi genomic DNA bilang object ng pag-aaral, ngunit isang mas compact at mayaman sa impormasyon na cDNA na nakuha pagkatapos ng naaangkop na pagproseso ng mga sample ng tissue, halimbawa, biopsy material o cell line ng mga lymphocytes, fibroblast, atbp. Mahalaga ang kondisyon dito ay ang pagpapahayag (kahit minimal) ng gustong gene sa tissue na pinag-aaralan.

Sa unang yugto, ang reverse transcription ng mRNA ay isinasagawa, at ang nagresultang mga molekula ng cDNA ay nagsisilbing isang template para sa PCR. Kasunod nito, ang kritikal na rehiyon ng cDNA, na pinalaki sa sapat na dami, ay sumasailalim sa sequencing at iba pang mga pamamaraan ng mutation screening, direktang electrophoretic na pag-aaral (detection ng mga pagtanggal, pagsingit, atbp.) o pagsasama sa isang expression system upang makakuha ng produktong protina at ang direktang pagsusuri nito.

Ang pamamaraang ito ay lalong epektibo para sa pag-detect ng mga mutasyon na humahantong sa synthesis ng isang "pinutol" na protina (mga walang katuturang mutation, splicing mutations, malalaking pagtanggal) - ang tinatawag na PTT analysis (Protein Truncation Test). Karaniwang ginagamit ang PTT analysis sa pag-aaral ng mahabang multi-exon genes, gaya ng Duchenne/Becker muscular dystrophy, ataxia-telangiectasia, o neurofibromatosis type 1.

Real-time na PCR(Real-Time PCR, English)

Taun-taon, ang real-time na PCR ay nagiging isang lalong popular na paraan ng diagnostic sa praktikal na pangangalagang pangkalusugan. Ang pangunahing tampok nito ay ang pagsubaybay at pagsusuri ng dami ng akumulasyon ng mga produktong polymerase chain reaction at ang awtomatikong pagpaparehistro at interpretasyon ng mga resultang nakuha. Ang pamamaraang ito ay hindi nangangailangan ng isang yugto ng electrophoresis, na binabawasan ang mga kinakailangan para sa isang laboratoryo ng PCR. Salamat sa pag-save ng espasyo sa produksyon, pagbabawas ng bilang ng mga tauhan at ang pangangailangan para sa dami ng pagpapasiya ng DNA/RNA, ang pamamaraang ito ay matagumpay na ginamit sa mga nakaraang taon sa pinakamalaking sanitary-epidemiological, diagnostic at research center sa mga binuo na bansa sa mundo, na pinapalitan PCR sa kasalukuyang format nito (“classical”).

Ang real-time na PCR ay gumagamit ng fluorescently labeled oligonucleotide probes upang makita ang DNA habang ito ay pinalakas. Ang real-time na PCR ay nagbibigay-daan para sa kumpletong pagsusuri ng isang sample sa loob ng 20-60 minuto at ayon sa teorya ay may kakayahang makakita ng kahit isang molekula ng DNA o RNA sa isang sample.

kanin. 17. Real-time na PCR.

Ang real-time na PCR ay gumagamit ng TaqMan system na direktang kumokontrol sa PCR kinetics sa panahon ng amplification gamit ang resonance fluorescence quenching. Para sa pagtuklas, ginagamit ang isang probe na nagdadala ng fluorophore at isang quencher na pantulong sa gitnang bahagi ng amplified fragment. Kapag ang fluorophore at quencher ay nakatali sa oligonucleotide probe, minor fluorescent emission lamang ang naobserbahan. Sa panahon ng proseso ng amplification, dahil sa 5" exonuclease na aktibidad ng Taq polymerase, ang fluorescent label ay napupunta sa solusyon, napalaya mula sa kalapitan nito sa quencher, at bumubuo ng fluorescent signal na tumataas sa real time na proporsyon sa akumulasyon ng amplifier ( Larawan 17).

Ang pangunahing bentahe ng Real-Time PCR sa PCR na may gel electrophoresis:

· Ang buong pamamaraan ay nagaganap sa isang test tube;

· Ang pamamaraan ay tumatagal ng 1 oras;

· Sapat na ang 1-2 work room;

· Kasama ng qualitative assessment ng resulta, may posibilidad ng quantitative assessment (halimbawa, kapag nagrereseta ng antiviral therapy para sa AIDS o viral hepatitis, kinakailangang malaman ang viral load, ibig sabihin, ang dami ng virus sa bawat unit, na ay ibinibigay ng real time PCR);

· Ang panganib ng kontaminasyon ay makabuluhang nabawasan.

Konklusyon

Ang pamamaraan ng PCR ay isa sa mga pinakakaraniwang pamamaraan ng molekular na biological na pananaliksik. Ang pamamaraang ito ay dapat gamitin nang matalino ng mga clinician, at ang isang doktor na nagpasyang gumamit ng PCR sa kanyang trabaho ay dapat magkaroon ng tiyak na kaalaman tungkol sa mga tampok at kakayahan ng pamamaraang ito. Pangalawa, dapat mayroong malapit na feedback sa pagitan ng clinician at ng PCR laboratory, na kinakailangan upang pag-aralan ang mga kumplikadong kaso at bumuo ng tamang diskarte sa diagnostic. Pangatlo, ang pagsusuri ng PCR ay hindi isang panlunas sa lahat sa mga diagnostic (pangunahin ang mga nakakahawang sakit) at hindi pinapalitan ang mga umiiral na pamamaraan ng pananaliksik, ngunit pinupunan lamang ang mga ito. At higit sa lahat, hindi mapapalitan ng PCR ang intuwisyon at analytical na pag-iisip na dapat mayroon ang isang doktor na umaasa sa tagumpay.

P . S . Molecular biological research - pagbabago ng mga alituntunin para sa diagnosis at paggamot. Ang paggamit ng mga molecular biological na pamamaraan ay nauugnay sa pag-asam ng isang radikal na pagbabago sa diin sa mga diagnostic ng laboratoryo. Maaaring hindi lamang ito tungkol sa napapanahong impormasyon, ngunit tungkol sa pagtanggap nito nang maaga. Kung ngayon ang mga pagsubok sa laboratoryo sa karamihan ng mga kaso ay isinasagawa na kapag ang sakit ay umunlad at ang paggamot ay nagsimula, pagkatapos ay ang molekular na biological na impormasyon sa laboratoryo ay inaasahan na gawing posible upang matukoy ang pagkahilig ng isang tao sa ilang mga uri ng patolohiya at ang antas ng pagiging sensitibo sa ilang mga gamot. , na magbibigay-katwiran sa predictive, preventive at personalized na katangian ng hinaharap na gamot.

PAGBABAGO NG DIAGNOSIS AT MGA ORIENTASYON SA PAGGAgamot

HEREDITARY DISEASES

Ngayon Sa hinaharap

Diagnosis Genetic na pasaporte

8. Ilang mga workroom ang kailangan para magpatakbo ng isang PCR laboratory na may fluorescent detection (quantitative analysis, Real-Time PCR)?

9. Ano ang detection?

10. Anong mga paraan ng pagsusuri ng DNA ang mayroon?

11. Aling enzyme ang pinagbabatayan ng PCR?

12. Bakit kailangang alisin ang detection zone mula sa ibang mga lugar na pinagtatrabahuan?

13. Ano ang restriction site?

14. Ano ang mga pagkakaiba sa pagitan ng direkta at hindi direktang pamamaraan ng diagnostic ng DNA?

15. Ano ang sequencing?

16. Ano ang multiplex PCR?

17. Anong mga uri ng mutasyon ang tinutukoy gamit ang PCR?

18. Ano ang kontaminasyon?

19. Ano ang kakanyahan ng paraan ng pagpapalakas ng allele-specific?

20. Mga kondisyon ng imbakan para sa PCR material?

21. Sa anong aparato nagaganap ang amplification?

22. Ano ang paraan ng reverse transcriptase PCR (RT-PCR)?

23. Ano ang nagsisilbing materyal para sa PCR diagnostics?

24. Ilista ang mga uri ng kontaminasyon?

Mga pagsubok para sa paghahanda sa sarili

1. Endonuclease restriction enzymes:

a) mga enzyme na "sinisira" ang DNA sa mga partikular na lugar;

b) ang mga enzyme na nagsasama-sama ay pumuputol sa molekula ng DNA;

c) mga enzyme na nagbibigay ng mga compound na nagsasagawa ng pag-aayos ng DNA.

2. Pagpapalakas ng gene:

3. Aling paraan ng molecular genetics ang ginagamit upang masuri ang mga sakit na dulot ng mutant gene ng isang kilalang sequence?

a) paggamit ng isang tiyak na restriction enzyme;

b) direktang pagtuklas gamit ang mga tiyak na molekular na probe;

V) pagsusuri ng pamilya mga distribusyon ng normal na mga polymorphism sa haba ng fragment ng paghihigpit.

4. DNA sequencing:

a) pagkakakilanlan ng sequence ng base ng DNA;

b) maraming pag-uulit ng anumang seksyon ng DNA;

c) paghihiwalay ng isang fragment ng DNA na naglalaman ng gene na pinag-aaralan.

5. Upang makakuha ng mga sample ng DNA maaari mong gamitin :

b) chorionic villi;

c) amniotic fluid;

d) mga selula ng amniotic fluid;

e) mga sample ng biopsy ng balat, kalamnan, atay,

e) lahat ay tama maliban sa puntong "c",

g) lahat ay tama maliban sa puntong "d",

h) lahat ng nasa itaas ay totoo.

6. Upang masuri kung aling mga mutasyon ang ginagamit ng paraan ng PCR:

a) genomic;

b) chromosomal;

c) gene (punto).

7. Ang panimulang aklat ay:

a) pantulong na seksyon ng DNA;

b) isang sintetikong oligonucleotide na may label na (radioactively o fluorescently) sequence na komplementaryo sa isang mutant o normal na gene;

c) isang oligonucleotide na gumaganap bilang isang "primer" at nagpapasimula ng synthesis ng isang polynucleotide chain sa isang DNA o RNA matrix.

8. Sino ang bumuo ng prinsipyo ng pamamaraan ng PCR?

b) K. Mullis

9. Ginagamit ba ang paraan ng PCR upang masuri ang pagpapalawak ng mga pag-uulit ng trinucleotide (isang dinamikong uri ng mutation)?

10. Sa anong mga lugar ginagamit ang PCR?

a) klinikal na gamot;

b) pagpapasiya ng mga transgenic na organismo (GMOs)

c) personal na pagkakakilanlan, pagtatatag ng paternity, forensics

d) lahat ng nabanggit,

e) wala sa itaas..

Mga halimbawang sagot: 1 – a; 2 – b; 3 – b; 4 – a; 5 – e; 6 – sa; 7 – sa; 8 – b; 9 – a, 10 – g.

Pangunahing

1.Bochkov genetics. Moscow. GEOTAR, 2002.

Dagdag

1. , Bakharev at paggamot ng mga congenital at hereditary na sakit sa mga bata. - Moscow, 2004.

2. DNA diagnostics at medikal na genetic counseling. - Moscow, 2004.

3. Ginter genetics. – Moscow, 2003.

4. Gorbunov batayan ng medikal na genetika. – St. Petersburg: Intermedica, 1999.

5. J. McGee. Molekular klinikal na diagnosis. – Mundo, 1999.

6. Menshikov - biological na pananaliksik sa mga diagnostic ng klinikal na laboratoryo: mga posibilidad ng problema (mga lektura). Mga diagnostic ng klinikal na laboratoryo, No. 3, 2006.

7. Ang gawain ni Kornienko sa laboratoryo ng PCR sa panahon ng in-line na pagsusuri ng biological na materyal. Mga diagnostic ng klinikal na laboratoryo, No. 10, 2006.

8. Organisasyon ng gawaing laboratoryo ng PCR. Mga tagubilin sa pamamaraan. MU 1.3.1794-03. Punong Sanitary Doctor ng Russian Federation, 2003.

9. Erlich H. A. PCR na teknolohiya. – Percin-Elmer Cetus, 1993.

10. Heid C. A., Stevens J. Real time quantitative PCR. Genome Res. – Blg. 6, 1996.

BATAYANG MGA PRINSIPYO NG PARAAN

POLYMERASE CHAIN ​​REACTION

Metodolohikal na manwal para sa ekstrakurikular na gawain ng 3-4 taong mga mag-aaral sa mga espesyalidad ng pangkalahatang medisina (060101) at pediatrics (060103).

GOU VPO "Krasnoyarsk State Medical Academy ng Federal Agency for Health and Social Development"

Russia, Krasnoyarsk,

Pederal na Ahensya para sa Edukasyon

Estado institusyong pang-edukasyon

Mas mataas bokasyonal na edukasyon

"Karelian State Pedagogical Academy"

Takdang-aralin sa paksa:

Polymerase chain reaction (PCR) at ang aplikasyon nito

Nakumpleto ni: mag-aaral Koryagina Valeria Aleksandrovna

Sinuri ni: Karpikova Natalya Mikhailovna

Petrozavodsk 2013

Panimula

Kabanata 1. Pagsusuri sa panitikan

1.5.4 Plateau effect

1.5.6 Pagpapalakas

Konklusyon

Panimula

Ang huling dalawampung taon ay minarkahan ng malawakang pagpapakilala ng mga molecular genetic na pamamaraan sa biyolohikal, medikal at agham pang-agrikultura.

Noong unang bahagi ng 1970s, tila ang molecular biology ay umabot sa isang tiyak na antas ng kapanahunan. Sa panahong ito, ang pangunahing bagay ng molecular genetic research ay mga microorganism. Ang paglipat sa mga eukaryotes ay nagpakita sa mga mananaliksik ng ganap na bagong mga problema na hindi malulutas gamit ang mga pamamaraan ng pagsusuri ng genetic na umiiral noong panahong iyon. Ang isang pambihirang tagumpay sa pagbuo ng molecular genetics ay naging posible salamat sa paglitaw ng isang bagong pang-eksperimentong tool - restriction endonucleases. Sa kasunod na mga taon, ang bilang ng mga pamamaraan para sa direktang pagsusuri ng DNA, batay sa magkakaibang paraan ng husay, ay nagsimulang tumaas nang mabilis.

Ang mga modernong teknolohiya sa maraming mga kaso ay naging posible upang simulan ang pag-aaral ng mahusay na istruktura at functional na organisasyon ng nuclear at extranuclear genome ng iba't ibang mga organismo sa isang mas malalim na antas. Ito ay partikular na kahalagahan para sa pagbuo ng mga bagong pamamaraan ng diagnostic at paggamot iba't ibang sakit. Hindi gaanong mahalaga ang posibilidad ng paggamit ng mga tagumpay ng molecular genetics sa biology ng populasyon at pag-aanak upang matukoy at masuri ang genetic variability ng mga populasyon, varieties at strains, kilalanin at patunayan ang mga indibidwal na may halaga sa ekonomiya, lumikha ng genetically modified organism at upang malutas ang iba pang mga isyu.

Ang bawat pamamaraan ay may sariling mga pakinabang at disadvantages. Walang unibersal na pamamaraan na maaaring malutas ang lahat ng mga problema na lumitaw. Samakatuwid, ang pagpili ng isang tiyak na pamamaraan para sa pananaliksik na isinasagawa ay isa sa pinakamahalagang yugto ng anumang gawaing siyentipiko.

Kabanata 1. Pagsusuri sa panitikan

1.1 Kasaysayan ng pagtuklas ng Polymerase chain reaction (PCR)

Noong 1983 K.B. Mullis et al. naglathala at nag-patent ng polymerase chain reaction (PCR) na pamamaraan, na nakatakdang magkaroon ng malalim na epekto sa lahat ng lugar ng pananaliksik at paggamit ng mga nucleic acid. Ang halaga ng paraang ito para sa molecular biology at ang genetika ay naging napakahusay at halata na pagkatapos ng pitong taon ay ginawaran ang may-akda Nobel Prize sa kimika.

Sa simula ng paggamit ng pamamaraan, pagkatapos ng bawat siklo ng pag-init-paglamig, kinakailangan na magdagdag ng DNA polymerase sa pinaghalong reaksyon, dahil ito ay hindi aktibo sa mataas na temperatura na kinakailangan upang paghiwalayin ang mga hibla ng DNA helix. Ang pamamaraan ng reaksyon ay medyo hindi epektibo at nangangailangan ng maraming oras at enzyme. Noong 1986, ang paraan ng reaksyon ng polymerase chain ay makabuluhang napabuti. Iminungkahi na gumamit ng DNA polymerases mula sa thermophilic bacteria. Ang mga enzyme na ito ay naging thermostable at nakayanan ang maraming mga siklo ng reaksyon. Ang kanilang paggamit ay naging posible upang pasimplehin at i-automate ang PCR. Ang isa sa mga unang thermostable DNA polymerases ay nahiwalay sa bakterya Thermus aquaticusat pinangalanan Taq- polymerase.

Ang kakayahang palakasin ang anumang bahagi ng DNA na ang pagkakasunud-sunod ng nucleotide ay kilala, at upang makuha ito sa isang homogenous na anyo at dami ng paghahanda sa pagkumpleto ng PCR, ginagawang ang PCR ay isang alternatibong paraan para sa molekular na pag-clone ng mga maikling fragment ng DNA. Sa kasong ito, hindi na kailangang gumamit ng mga kumplikadong pamamaraan ng pamamaraan na ginagamit sa genetic engineering sa maginoo cloning. Ang pag-unlad ng paraan ng PCR ay lubos na nagpalawak ng mga kakayahan sa pamamaraan ng molecular genetics, at, sa partikular, genetic engineering, kaya't ito ay radikal na nagbago at pinalakas ang siyentipikong potensyal ng marami sa mga lugar nito.

1.2 Mga uri ng polymerase chain reaction (PCR)

· Nested PCR- ginagamit upang bawasan ang bilang ng mga byproduct ng reaksyon. Dalawang pares ng panimulang aklat ang ginagamit at dalawang sunud-sunod na reaksyon ang isinasagawa. Ang pangalawang pares ng mga panimulang aklat ay nagpapalaki ng isang rehiyon ng DNA sa loob ng produkto ng unang reaksyon.

· Baliktad na PCR- ginagamit kapag ang isang maliit na rehiyon lamang sa loob ng nais na pagkakasunud-sunod ay alam. Ang pamamaraang ito ay partikular na kapaki-pakinabang pagdating sa pagtukoy ng mga kalapit na pagkakasunud-sunod pagkatapos maipasok ang DNA sa genome. Upang maisagawa ang inverted PCR, isang serye ng mga pagputol ng DNA ay isinasagawa gamit ang mga restriction enzymes<#"justify">polymerase chain reaction primer

· PCR na partikular sa grupo- PCR para sa mga kamag-anak<#"center">1.3 Polymerase chain reaction

Natuklasan noong kalagitnaan ng 1980s, ang polymerase chain reaction (PCR) ay maaaring magparami ng bilang ng mga kopya ng orihinal na sample ng milyun-milyong beses sa loob ng ilang oras. Sa bawat siklo ng reaksyon, dalawang kopya ang nabuo mula sa orihinal na molekula. Ang bawat isa sa mga synthesized na kopya ng DNA ay maaaring magsilbi bilang isang template para sa synthesis ng mga bagong kopya ng DNA sa susunod na cycle. Kaya, ang paulit-ulit na pag-uulit ng mga cycle ay humahantong sa pagtaas ng bilang ng mga kopya sa geometric na pag-unlad. Mula sa mga kalkulasyon ay sumusunod na kahit na may 30 cycle, ang bilang ng mga kopya ng orihinal na molekula ay magiging higit sa 1 bilyon. Kahit na isinasaalang-alang natin na hindi lahat ng mga amplicon ay nadoble sa bawat pag-ikot, ang kabuuang bilang ng mga kopya, sa kabila nito, ay medyo malaking bilang.

Ang bawat polymerase chain reaction (PCR) cycle ay binubuo ng mga sumusunod na hakbang:

· Denaturasyon - Ang pagtaas ng temperatura ay nagiging sanhi ng double-stranded na molekula ng DNA na humiwalay at nahati sa dalawang single-stranded;

· Pagsusupil - Ang pagbabawas ng temperatura ay nagpapahintulot sa mga panimulang aklat na magbigkis sa mga pantulong na rehiyon ng molekula ng DNA;

· Elongation - Kinukumpleto ng enzyme DNA polymerase ang complementary strand.

Upang palakasin ang isang napiling fragment, ginagamit ang dalawang oligonucleotide primers (primer) sa gilid ng isang partikular na rehiyon ng DNA. Primer oriented 3 - nagtatapos patungo sa isa't isa at patungo sa pagkakasunud-sunod na kailangang palakasin. Isinasagawa ng DNA polymerase ang synthesis (pagkumpleto) ng magkasanib na komplementaryong mga chain ng DNA, simula sa mga primer. Sa panahon ng DNA synthesis, ang mga primer ay pisikal na isinama sa kadena ng mga bagong synthesize na molekula ng DNA. Ang bawat strand ng DNA molecule na nabuo gamit ang isa sa mga primer ay maaaring magsilbing template para sa synthesis ng isang complementary DNA strand gamit ang isa pang primer.

1.4 Pagsasagawa ng polymerase chain reaction (PCR)

Ang polymerase chain reaction ay isinasagawa sa mga espesyal na manipis na pader na polypropylene tubes, na katugma sa laki sa ginamit na thermal cycler (amplifier) ​​- isang aparato na kumokontrol sa temperatura at mga katangian ng oras ng mga yugto ng polymerase chain reaction (PCR).

1.5 Prinsipyo ng paraan ng polymerase chain reaction

Ang polymerase chain reaction (PCR) ay isang in vitro DNA amplification na paraan na magagamit upang ihiwalay at i-multiply ang isang partikular na sequence ng DNA bilyun-bilyong beses sa loob ng ilang oras. Ang kakayahang makakuha ng isang malaking bilang ng mga kopya ng isa nang mahigpit isang tiyak na lugar lubos na pinasimple ng genome ang pag-aaral ng isang umiiral na sample ng DNA.

Upang magsagawa ng polymerase chain reaction, dapat matugunan ang isang bilang ng mga kundisyon:

1.5.1 Ang pagkakaroon ng isang bilang ng mga sangkap sa pinaghalong reaksyon

Ang mga pangunahing bahagi ng pinaghalong reaksyon (PCR) ay: Tris-HCl, KCl, MgCl 2, isang pinaghalong nucleotide triphosphate (ATP, GTP, CTP, TTP), mga primer (oligonucleotides), sample na paghahanda ng DNA, thermostable DNA polymerase. Ang bawat isa sa mga bahagi ng pinaghalong reaksyon ay direktang kasangkot sa polymerase chain reaction (PCR), at ang konsentrasyon ng mga reagents ay direktang nakakaapekto sa kurso ng amplification.

· Tris-HCl - tinutukoy ang pH ng pinaghalong reaksyon, lumilikha ng kapasidad ng buffer. Ang aktibidad ng DNA polymerase ay nakasalalay sa pH ng kapaligiran, kaya ang halaga ng pH ay direktang nakakaapekto sa kurso ng polymerase chain reaction. Karaniwan ang halaga ng pH ay nasa pagitan ng 8 at 9.5. Kinukuha ang mataas na halaga ng pH dahil bumababa ang pH ng Tril-HCl buffer habang tumataas ang temperatura.

· Ang KCl - ang konsentrasyon ng potassium chloride hanggang 50 mM ay nakakaapekto sa kurso ng mga proseso ng denaturation at annealing; ang mga konsentrasyon na higit sa 50 mM ay pumipigil sa DNA polymerase.

· MgCl 2- dahil ang DNA polymerase ay Mg 2+- umaasa sa enzyme, kung gayon ang konsentrasyon ng mga ion ng magnesium ay nakakaapekto sa aktibidad ng enzyme (Mg 2+bumubuo ng mga complex na may NTP - ang mga complex na ito ay ang substrate para sa polymerase). Ang isang mataas na konsentrasyon ay humahantong sa isang pagtaas sa hindi tiyak na amplification, at ang isang mababang konsentrasyon ay humahantong sa pagsugpo ng reaksyon; ang pinakamabuting kalagayan (para sa iba't ibang polymerases) ay nasa hanay na 0.5 - 5 mM. Bilang karagdagan, ang konsentrasyon ng mga asing-gamot ng magnesiyo ay nakakaapekto sa kurso ng denaturation at mga proseso ng pagsusubo - isang pagtaas sa konsentrasyon ng Mg 2+nagdudulot ng pagtaas sa temperatura ng pagkatunaw ng DNA (i.e., ang temperatura kung saan ang 50% ng mga double-stranded na DNA strand ay pinaghihiwalay sa mga single-stranded).

· NTP - ang mga nucleotide triphosphate ay direktang monomer ng mga nucleic acid. Upang maiwasan ang pagwawakas ng kadena, inirerekomenda ang pantay na ratio ng lahat ng apat na nucleotide triphosphate. Ang mababang konsentrasyon ng mga sangkap na ito sa pinaghalong reaksyon ay nagdaragdag ng posibilidad ng mga pagkakamali kapag gumagawa ng isang komplementaryong DNA chain.

· Mga Primer - Ang pinakamainam ay ang paggamit ng mga primer na may pagkakaiba sa temperatura ng pagkatunaw na hindi hihigit sa 2 - 4 o C. Minsan sa pangmatagalang imbakan sa temperatura na 4 o C, o pagkatapos ng isang malaking bilang ng pagyeyelo at lasaw, ang mga primer ay bumubuo ng mga pangalawang istruktura - mga dimer, na binabawasan ang kahusayan ng PCR. Ang pag-aalis ng problemang ito ay bumababa sa pagpapapisa ng tubig sa isang paliguan ng tubig (T=95 o C) para sa 3 minuto at kasunod na mabilis na paglamig sa 0o SA.

· Paghahanda ng DNA - ang dami at kalidad ng paghahanda ng DNA (matrix) ay direktang nakakaapekto sa kurso at mga parameter ng polymerase chain reaction. Ang sobrang dami ng sample ng DNA ay pumipigil sa polymerase chain reaction (PCR). mga dumi iba't ibang sangkap na nakapaloob sa paghahanda ng DNA ay maaari ring bawasan ang pagiging epektibo ng polymerase chain reaction (PCR): sodium acetate, sodium chloride, isopropanol, ethanol, heparin, phenol, urea, hemoglobin, atbp.

· DNA polymerase - kapag gumagamit ng isang maliit na halaga ng DNA polymerase, ang pagbawas sa synthesis ng huling produkto ay sinusunod sa direktang proporsyon sa laki ng mga fragment. Ang labis na polymerase sa pamamagitan ng 2-4 na beses ay humahantong sa paglitaw ng nagkakalat na spectra, at sa pamamagitan ng 4-16 na beses - mababang-molecular nonspecific spectra. Ang hanay ng mga konsentrasyon na ginamit ay 0.5 - 1.5 na mga yunit ng aktibidad bawat 25 μl ng PCR mixture.

Bilang karagdagan sa mga pangunahing bahagi ng pinaghalong PCR, ang isang bilang ng mga karagdagang sangkap ay ginagamit na nagpapabuti sa husay at dami ng mga tagapagpahiwatig ng PCR: acetamide (5%) - pinatataas ang solubility ng mga pangunahing sangkap; betaine ( sosa asin) - pagpapapanatag ng DNA polymerase, pagpapababa ng temperatura ng pagkatunaw ng DNA, pagpantay sa temperatura ng pagkatunaw; bovine albumin (10-100 μg / ml) - pagpapapanatag ng DNA polymerase; dimethyl sulfoxide (1-10%) - pagtaas ng solubility ng mga pangunahing bahagi; formamide (2-10%) - pagtaas ng pagtitiyak ng pagsusubo; gliserol (15-20%) - pagtaas ng thermal stability ng enzyme, pagpapababa ng temperatura ng denaturation ng sample ng DNA; ammonium sulfate - pagpapababa ng denaturation at annealing temperature.

1.5.2 Cyclic at temperatura mode

Ang pangkalahatang hitsura ng isang polymerase chain reaction (PCR) program ay ang mga sumusunod:

yugto. Pangmatagalang pangunahing denaturation ng paghahanda ng DNA. 1st cycle

yugto. Mabilis na denaturation ng paghahanda ng DNA. Pagsusuri ng mga panimulang aklat. Pagpahaba.30 - 45 cycle.

yugto. Mahabang pagpahaba. Pinapalamig ang pinaghalong reaksyon. 1st cycle.

Ang bawat elemento ng yugto - denaturation, pagsusubo, pagpahaba - ay may mga indibidwal na katangian ng temperatura at oras. Ang mga parameter ng temperatura at oras para sa bawat elemento ay pinili nang empirically, alinsunod sa mga tagapagpahiwatig ng husay at dami ng mga produkto ng amplification.

Denaturasyon. Sa panahon ng elementong ito ng polymerase chain reaction, ang isang double-stranded na molekula ng DNA ay nahahati sa dalawang single-stranded. Ang mga parameter ng temperatura ng denaturation ay nasa hanay na 90 - 95 o C, ngunit sa kaso ng isang sample ng DNA na may mataas na nilalaman ng guanine at cytosine, ang temperatura ay dapat tumaas sa 98 o C. Ang temperatura ng denaturation ay dapat sapat upang ganap na ma-denature ang mga hibla ng DNA at maiwasan ang "flash cooling" o mabilis na pagsusubo, gayunpaman, ang thermostable na DNA polymerase ay hindi gaanong matatag sa mataas na temperatura. Kaya, ang pagpili ng pinakamainam na mga parameter ng temperatura ng denaturation para sa ratio ng primer/sample (paghahanda ng DNA) ay isang mahalagang kondisyon kapag nagsasagawa ng amplification. Kung ang temperatura ng denaturation sa unang yugto ay higit sa 95 o C, inirerekumenda na magdagdag ng DNA polymerase sa pinaghalong reaksyon pagkatapos ng paunang denaturation. Ang tagal ng elementong ito ng yugto sa panahon ng polymerase chain reaction (PCR) ay dapat sapat upang ganap na ma-denatur ang DNA, ngunit sa parehong oras ay walang makabuluhang epekto sa aktibidad ng DNA polymerase sa isang naibigay na temperatura.

Pagsusupil. Temperatura ng pagsusubo (T A ) ay isa sa pinakamahalagang parameter ng polymerase chain reaction. Ang temperatura ng pagsusubo para sa bawat partikular na panimulang aklat ay pinili nang paisa-isa. Depende ito sa haba at komposisyon ng nucleotide ng panimulang aklat. Kadalasan ito ay mas mababa ng 2 - 4 o Mula sa halaga ng natutunaw na punto (T m ) panimulang aklat. Kung ang temperatura ng pagsusubo ng system ay mas mababa kaysa sa pinakamainam, kung gayon ang bilang ng mga hindi tiyak na amplified na mga fragment ay tataas at, sa kabaligtaran, higit pa init binabawasan ang dami ng mga pinalakas na produkto. Sa kasong ito, ang konsentrasyon ng mga tiyak na amplicon ay maaaring bumaba nang husto, hanggang sa pagsugpo ng polymerase chain reaction (PCR). Ang pagtaas ng oras ng pagsusubo ay humahantong din sa pagtaas ng bilang ng mga hindi tiyak na amplicon.

Pagpahaba. Karaniwan, ang bawat uri ng thermostable DNA polymerase ay may indibidwal na pinakamainam na temperatura para sa aktibidad. Ang rate ng synthesis ng komplementaryong DNA strand ng enzyme ay tiyak din sa bawat polymerase (sa average na ito ay 30 - 60 nucleotides bawat segundo, o 1 - 2 libong base bawat minuto), samakatuwid ang oras ng pagpahaba ay pinili depende sa uri ng DNA polymerase at ang haba ng amplified na rehiyon.

1.5.3 Mga pangunahing prinsipyo para sa pagpili ng mga panimulang aklat

Kapag lumilikha ng isang PCR test system, ang isa sa mga pangunahing gawain ay ang tamang pagpili ng mga panimulang aklat, na dapat matugunan ang isang bilang ng mga pamantayan:

Ang mga panimulang aklat ay dapat na tiyak. Espesyal na atensyon bayaran 3 - mga dulo ng mga panimulang aklat, dahil mula sa kanila ang Taq polymerase ay nagsisimula upang makumpleto ang komplementaryong DNA strand. Kung ang kanilang pagtitiyak ay hindi sapat, malamang na ang hindi kanais-nais na mga proseso ay magaganap sa test tube na may pinaghalong reaksyon, ibig sabihin, ang synthesis ng nonspecific DNA (maikli o mahabang mga fragment). Ito ay makikita sa electrophoresis sa anyo ng mabigat o magaan na karagdagang mga banda. Nakakasagabal ito sa pagsusuri ng mga resulta ng reaksyon, dahil madaling malito ang isang partikular na produkto ng amplification na may synthesized na dayuhang DNA. Ang ilang mga primer at dNTP ay ginagamit para sa synthesis ng hindi tiyak na DNA, na humahantong sa isang makabuluhang pagkawala ng sensitivity.

Ang mga panimulang aklat ay hindi dapat bumuo ng mga dimer at mga loop, i.e. stable double strands ay hindi dapat mabuo bilang isang resulta ng mga primer na pagsusubo sa kanilang sarili o sa bawat isa.

1.5.4 Plateau effect

Dapat pansinin na ang proseso ng akumulasyon ng mga partikular na produkto ng amplification sa isang geometric na pag-unlad ay tumatagal lamang para sa isang limitadong oras, at pagkatapos ay ang kahusayan nito ay bumaba nang kritikal. Ito ay dahil sa tinatawag na plateau effect.

Epekto ng termino talampas ginamit upang ilarawan ang proseso ng akumulasyon ng mga produkto ng PCR sa mga huling cycle ng amplification.

Depende sa mga kondisyon at bilang ng mga cycle ng reaksyon ng amplification, sa oras na nakamit ang epekto talampas ay naiimpluwensyahan ng paggamit ng mga substrate (dNTPs at primers), ang katatagan ng mga reactant (dNTPs at enzyme), ang dami ng mga inhibitor, kabilang ang mga pyrophosphate at DNA duplexes, kumpetisyon para sa mga reactant ng mga nonspecific na produkto o primer dimer, ang konsentrasyon ng isang partikular na produkto at hindi kumpletong denaturation sa mataas na konsentrasyon ng mga produkto ng amplification.

Kung mas mababa ang paunang konsentrasyon ng target na DNA, mas mataas ang panganib na mabibigo ang reaksyon. talampas." Maaaring mangyari ang puntong ito bago magkaroon ng sapat na partikular na mga produkto ng amplification na susuriin. Tanging ang mga mahusay na na-optimize na sistema ng pagsubok ang makakaiwas dito.

1.5.5 Paghahanda ng biological sample

Upang ihiwalay ang DNA, iba't ibang mga pamamaraan ang ginagamit depende sa mga gawain sa kamay. Ang kanilang kakanyahan ay nakasalalay sa pagkuha (pagkuha) ng DNA mula sa isang biological na paghahanda at ang pag-alis o neutralisasyon ng mga dayuhang impurities upang makakuha ng paghahanda ng DNA na may kadalisayan na angkop para sa PCR.

Ang pamamaraan para sa pagkuha ng purong paghahanda ng DNA na inilarawan ni Marmur ay itinuturing na pamantayan at naging klasikal na. Kabilang dito ang enzymatic proteolysis na sinusundan ng deproteinization at reprecipitation ng DNA na may alkohol. Ang pamamaraang ito ay nagpapahintulot sa iyo na makakuha ng isang purong paghahanda ng DNA. Gayunpaman, ito ay medyo labor-intensive at nagsasangkot ng pagtatrabaho sa mga agresibo at malakas na amoy na mga sangkap tulad ng phenol at chloroform.

Isa sa mga kasalukuyang popular na pamamaraan ay ang paraan ng pagkuha ng DNA na iminungkahi ni Boom et al. Ang pamamaraang ito ay batay sa paggamit ng isang malakas na chaotropic agent, guanidine thiocyanate (GuSCN), para sa cell lysis at kasunod na pagsipsip ng DNA sa isang carrier (glass beads, diatomaceous earth, glass milk, atbp.). Pagkatapos ng paghuhugas, ang DNA ay nananatili sa sample, na na-sorbed sa carrier, kung saan madali itong maalis gamit ang isang elution buffer. Ang pamamaraan ay maginhawa, technologically advanced at angkop para sa paghahanda ng isang sample para sa amplification. Gayunpaman, ang pagkawala ng DNA ay posible dahil sa hindi maibabalik na sorption sa carrier, gayundin sa panahon ng maraming paghuhugas. Ito ay lalong mahalaga kapag nagtatrabaho sa maliit na halaga ng DNA sa isang sample. Bilang karagdagan, kahit na ang mga bakas na halaga ng GuSCN ay maaaring makapigil sa PCR. Samakatuwid, kapag ginagamit ang pamamaraang ito ay napakahalaga tamang pagpili sorbent at maingat na pagsunod sa mga teknolohikal na nuances.

Ang isa pang pangkat ng mga pamamaraan ng paghahanda ng sample ay batay sa paggamit ng mga Chilex-type na ion exchangers, na, hindi katulad ng salamin, ay hindi sumisipsip ng DNA, ngunit sa halip, mga impurities na nakakasagabal sa reaksyon. Bilang isang patakaran, ang teknolohiyang ito ay may kasamang dalawang yugto: kumukulo ang sample at sorption ng mga impurities sa isang ion exchanger. Ang pamamaraan ay lubhang kaakit-akit dahil sa pagiging simple ng pagpapatupad nito. Sa karamihan ng mga kaso ito ay angkop para sa pagtatrabaho sa klinikal na materyal. Sa kasamaang palad, minsan may mga sample na may mga impurities na hindi maalis gamit ang mga ion exchanger. Bilang karagdagan, ang ilang mga microorganism ay hindi maaaring sirain sa pamamagitan ng simpleng pagkulo. Sa mga kasong ito, kinakailangan na ipakilala ang mga karagdagang yugto ng pagpoproseso ng sample.

Kaya, ang pagpili ng paraan ng paghahanda ng sample ay dapat isaalang-alang na may pag-unawa sa mga layunin ng nilalayon na pagsusuri.

1.5.6 Pagpapalakas

Upang maisagawa ang reaksyon ng amplification, kinakailangan upang maghanda ng isang timpla ng reaksyon at idagdag ang nasuri na sample ng DNA dito. Mahalagang isaalang-alang ang ilang mga tampok ng panimulang pagsusubo. Ang katotohanan ay, bilang panuntunan, ang nasuri na biological sample ay naglalaman ng iba't ibang mga molekula ng DNA, kung saan ang mga primer na ginamit sa reaksyon ay may bahagyang, at sa ilang mga kaso ay makabuluhan, homology. Bilang karagdagan, ang mga panimulang aklat ay maaaring mag-anneal sa isa't isa, na bumubuo ng mga primer na dimer. Parehong humahantong sa isang makabuluhang pagkonsumo ng mga panimulang aklat para sa synthesis ng mga by-products (non-specific) na mga produkto ng reaksyon at, bilang isang resulta, makabuluhang bawasan ang sensitivity ng system. Ginagawa nitong mahirap o imposibleng basahin ang mga resulta ng reaksyon sa panahon ng electrophoresis.

1.6 Komposisyon ng karaniwang PCR reaction mixture

x PCR buffer (100 mM Tris-HCl solution, pH 9.0, 500 mM KCl solution, 25 mM MgCl2 solution ) …….2.5 µl

Tubig (MilliQ)……………………………………………………….18.8 µl

Pinaghalong nucleotide triphosphate (dNTPs)

mM solusyon ng bawat isa………………………………………………….0.5 µl

Primer 1 (10 mM solution) ………………………………………………………………….1 µl

Primer 2 (10 mM solution) ………………………………………………………………….1 µl

DNA polymerase (5 units/µl) ……………………………………………0.2 µl

Sampol ng DNA (20 ng/µl) ……………………………………………..1 µl

1.7 Pagsusuri ng mga resulta ng reaksyon

Upang masuri nang tama ang mga resulta ng PCR, mahalagang maunawaan na ang pamamaraang ito ay hindi quantitative. Sa teorya, ang mga produkto ng amplification ng mga solong target na molekula ng DNA ay maaaring makita gamit ang electrophoresis pagkatapos ng 30-35 na mga cycle. Gayunpaman, sa pagsasagawa, ito ay ginagawa lamang sa mga kaso kung saan ang reaksyon ay nagaganap sa ilalim ng mga kondisyon na malapit sa perpekto, na hindi madalas na nangyayari sa buhay. Ang antas ng kadalisayan ng paghahanda ng DNA ay may partikular na malaking impluwensya sa kahusayan ng amplification, i.e. ang presensya sa pinaghalong reaksyon ng ilang mga inhibitor, na sa ilang mga kaso ay maaaring maging lubhang mahirap na mapupuksa. Minsan, dahil sa kanilang presensya, kahit sampu-sampung libong target na molekula ng DNA ay hindi maaaring palakihin. Kaya, madalas na walang direktang kaugnayan sa pagitan ng paunang halaga ng target na DNA at ang panghuling halaga ng mga produkto ng amplification.

Kabanata 2: Mga Aplikasyon ng Polymerase Chain Reaction

Ginagamit ang PCR sa maraming lugar para sa pagsubok at siyentipikong mga eksperimento.

Forensics

Ginagamit ang PCR upang ihambing ang tinatawag na "genetic fingerprints." Kinakailangan ang isang sample ng genetic material mula sa pinangyarihan ng krimen - dugo, laway, semilya, buhok, atbp. Ikinumpara ito sa genetic material ng suspek. Ang isang napakaliit na halaga ng DNA ay sapat, ayon sa teorya ay isang kopya. Ang DNA ay pinaghiwa-hiwalay sa mga fragment at pagkatapos ay pinalaki gamit ang PCR. Ang mga fragment ay pinaghihiwalay gamit ang DNA electrophoresis. Ang resultang pattern ng pag-aayos ng mga banda ng DNA ay tinatawag na genetic fingerprint.

Pagtatatag ng pagiging ama

Mga resulta ng electrophoresis ng mga fragment ng DNA na pinalakas ng PCR. Ama. bata. Inay. Ang bata ay nagmana ng ilang mga tampok ng genetic imprint ng parehong mga magulang, na nagreresulta sa isang bago, natatanging imprint.

Bagama't kakaiba ang genetic fingerprints, maaari pa ring maitatag ang mga relasyon sa pamilya sa pamamagitan ng paggawa ng ilang fingerprint. Ang parehong paraan ay maaaring ilapat, bahagyang binago, upang magtatag ng ebolusyonaryong pagkakaugnay sa mga organismo.

Mga medikal na diagnostic

Ginagawang posible ng PCR na makabuluhang mapabilis at mapadali ang pagsusuri ng mga namamana at viral na sakit. Ang gene ng interes ay pinalaki ng PCR gamit ang naaangkop na mga panimulang aklat at pagkatapos ay pinagsunod-sunod upang makilala ang mga mutasyon. Ang mga impeksyon sa virus ay maaaring matukoy kaagad pagkatapos ng impeksyon, linggo o buwan bago lumitaw ang mga sintomas.

Personalized na gamot

Minsan ang mga gamot ay lumalabas na nakakalason o allergenic para sa ilang mga pasyente. Ang mga dahilan para dito ay bahagyang dahil sa mga indibidwal na pagkakaiba sa pagkamaramdamin at metabolismo ng mga gamot at ang kanilang mga derivatives. Ang mga pagkakaibang ito ay tinutukoy sa antas ng genetic. Halimbawa, sa isang pasyente ang isang tiyak na cytochrome ay maaaring maging mas aktibo, sa isa pa - mas mababa. Upang matukoy kung anong uri ng cytochrome ang mayroon ang isang pasyente, iminungkahi na magsagawa ng pagsusuri sa PCR bago gamitin ang gamot. Ang pagsusuring ito ay tinatawag na preliminary genotyping.

Pag-clone ng gene

Ang gene cloning ay ang proseso ng paghihiwalay ng mga gene at, bilang resulta ng genetic engineering manipulations, pagkuha ng malaking halaga ng produkto ng isang gene. Ginagamit ang PCR upang palakihin ang isang gene, na pagkatapos ay ipinasok sa isang vector - isang piraso ng DNA na naglilipat ng isang dayuhang gene sa pareho o ibang organismo na maginhawa para sa paglaki. Halimbawa, ang mga plasmid o viral DNA ay ginagamit bilang mga vector. Ang pagpasok ng mga gene sa isang dayuhang organismo ay karaniwang ginagamit upang makagawa ng produkto ng gene na iyon - RNA o, kadalasan, isang protina. Sa ganitong paraan, maraming mga protina ang nakukuha sa mga dami ng industriya para magamit sa agrikultura, gamot, atbp.

DNA sequencing

Sa paraan ng pagkakasunud-sunod gamit ang dideoxynucleotides na may label na fluorescent na label o radioactive isotope, ang PCR ay isang mahalagang bahagi, dahil sa panahon ng polymerization na ang mga derivatives ng nucleotides na may label na fluorescent o radioactive na label ay ipinasok sa DNA chain. Pinipigilan nito ang reaksyon, na nagpapahintulot sa mga posisyon ng mga tiyak na nucleotides na matukoy pagkatapos na ang mga synthesized na chain ay pinaghiwalay sa gel.

Mutagenesis

Sa kasalukuyan, ang PCR ay naging pangunahing paraan para sa pagsasagawa ng mutagenesis. Ang paggamit ng PCR ay naging posible upang pasimplehin at pabilisin ang pamamaraan ng mutagenesis, pati na rin gawin itong mas maaasahan at muling gawin.

Ginawang posible ng paraan ng PCR na pag-aralan ang pagkakaroon ng mga pagkakasunud-sunod ng human papillomavirus sa mga seksyon ng biopsy na naka-embed na paraffin ng mga cervical tumor ng tao 40 taon bago ang pag-aaral na ito. Bukod dito, gamit ang PCR, posible na palakihin at i-clone ang mga fragment ng mitochondrial DNA mula sa mga labi ng fossil ng isang 7 libong taong gulang na utak ng tao!

Gamit ang lysates ng indibidwal na spermatozoa ng tao, ipinakita ang kakayahang sabay na pag-aralan ang dalawang loci na matatagpuan sa iba't ibang mga non-homologous chromosome. Ang diskarte na ito ay nagbibigay ng isang natatanging pagkakataon para sa pinong genetic analysis at ang pag-aaral ng chromosomal recombination, DNA polymorphism, atbp. Ang paraan para sa pagsusuri ng indibidwal na tamud ay agad na natagpuan praktikal na gamit sa forensic medicine, dahil ang pag-type ng HLA ng mga haploid cell ay ginagawang posible upang matukoy ang pagiging ama o makilala ang kriminal (ang HLA complex ay isang hanay ng mga gene ng human major histocompatibility complex; ang loci ng HLA complex ay ang pinaka-polymorphic sa lahat ng kilala sa mas mataas na vertebrates: sa loob ng isang species, sa bawat locus mayroong isang hindi pangkaraniwang isang malaking bilang ng iba't ibang mga alleles - mga alternatibong anyo ng parehong gene).

Gamit ang PCR, posible na matukoy ang tamang pagsasama ng mga dayuhang istrukturang genetic sa isang paunang natukoy na rehiyon ng genome ng mga cell na pinag-aaralan. Ang kabuuang cellular DNA ay na-annealed sa dalawang oligonucleotide primers, ang isa ay komplementaryo sa isang bahagi ng host DNA malapit sa insertion point, at ang isa pa sa sequence ng integrated fragment sa antiparallel DNA strand. Ang polymerase chain reaction, sa kaso ng hindi nabagong chromosomal DNA structure sa nilalayong insertion site, ay humahantong sa pagbuo ng single-stranded DNA fragment na hindi alam ang laki, at sa kaso ng planadong pagpasok, double-stranded DNA fragment ng isang kilalang laki, na tinutukoy ng distansya sa pagitan ng mga lugar ng pagsusubo ng dalawang primer. Bukod dito, ang antas ng pagpapalakas ng nasuri na rehiyon ng genome sa unang kaso ay magiging linearly na nakasalalay sa bilang ng mga cycle, at sa pangalawang kaso ito ay magiging exponential. Ang exponential accumulation ng isang amplified fragment ng isang paunang natukoy na laki sa panahon ng PCR ay nagbibigay-daan sa amin upang biswal na obserbahan ito pagkatapos ng electrophoretic fractionation ng paghahanda ng DNA at gumawa ng isang hindi malabo na konklusyon tungkol sa pagpasok ng isang dayuhang sequence sa isang naibigay na rehiyon ng chromosomal DNA.

Konklusyon

Ang pamamaraan ng PCR ay kasalukuyang pinaka-malawak na ginagamit bilang isang paraan para sa pag-diagnose ng iba't ibang mga nakakahawang sakit. Binibigyang-daan ka ng PCR na tukuyin ang etiology ng isang impeksyon kahit na ang sample na kinuha para sa pagsusuri ay naglalaman lamang ng ilang mga molekula ng DNA ng pathogen. Ang PCR ay malawakang ginagamit sa maagang pagsusuri ng mga impeksyon sa HIV, viral hepatitis, atbp. Ngayon ay halos walang nakakahawang ahente na hindi matukoy gamit ang PCR.

Listahan ng ginamit na panitikan

1.Padutov V.E., Baranov O.Yu., Voropaev E.V. Mga pamamaraan ng molecular genetic analysis. - Mn.: Unipol, 2007. - 176 p.

2.PCR "real time" / Rebrikov D.V., Samatov G.A., Trofimov D.Yu. at iba pa.; inedit ni d.b. n. D.V. Rebrikova; paunang salita L.A. Osterman at akademiko RAS at RAAS E.D. Sverdlov; 2nd ed., rev. at karagdagang - M.: BINOM. Laboratory ng Kaalaman, 2009. - 223 p.

.Patrushev L.I. Mga artipisyal na genetic system. - M.: Nauka, 2005. - Sa 2 tomo.

.B. Glick, J. Pasternak Molecular biotechnology. Mga Prinsipyo at Aplikasyon 589 pp., 2002

5.Shchelkunov S.N. Genetic engineering. - Novosibirsk: Sib. Univ. publishing house, 2004. - 496 p.

Inedit ni A.A. Vorbyeva "Polymerase chain reaction at ang aplikasyon nito para sa mga diagnostic sa dermatovenerology"; ahensya ng balitang medikal - 72 mga pahina

http://ru. wikipedia.org

http://scholar. google.ru

.

.

Http://www.med2000.ru/n1/n12. htm

12.http://prizvanie. su/ - medikal na journal

Nagtuturo

Kailangan mo ng tulong sa pag-aaral ng isang paksa?

Ang aming mga espesyalista ay magpapayo o magbibigay ng mga serbisyo sa pagtuturo sa mga paksang interesado ka.
Isumite ang iyong aplikasyon na nagpapahiwatig ng paksa ngayon upang malaman ang tungkol sa posibilidad ng pagkuha ng konsultasyon.

Para sa sapat at mabisang paggamot Maraming mga nakakahawang sakit ang nangangailangan ng napapanahong pagkakakilanlan tumpak na diagnosis. Sa paglutas ng problemang ito ngayon, ginagamit ang mga high-tech na diagnostic na pamamaraan batay sa molecular biology. Sa ngayon, ang polymerase chain reaction (PCR) ay malawakang ginagamit sa praktikal na gamot bilang ang pinaka-maaasahang laboratory diagnostic tool.

Ano ang nagpapaliwanag sa katanyagan ng PCR sa kasalukuyan?

Una, ang pamamaraang ito ay ginagamit upang makilala ang mga pathogen ng iba't ibang mga nakakahawang sakit na may mataas na katumpakan.

Pangalawa, upang masubaybayan ang pagiging epektibo ng paggamot.

Sa iba't ibang mga manwal, polyeto, artikulo, pati na rin ang mga paliwanag ng mga medikal na espesyalista, madalas nating nakikita ang paggamit ng hindi maintindihan na mga termino at salita. Mahirap talagang pag-usapan ang mga high-tech na produkto ng agham sa pang-araw-araw na salita.

Ano ang kakanyahan at mekanika ng PCR diagnostics?

Ang bawat buhay na organismo ay may sariling natatanging mga gene. Ang mga gene ay matatagpuan sa molekula ng DNA, na talagang ang "calling card" ng bawat indibidwal na organismo. Ang DNA (genetic material) ay isang napakahabang molekula na binubuo ng mga bloke ng gusali na tinatawag na nucleotides. Para sa bawat pathogen ng mga nakakahawang sakit sila ay matatagpuan mahigpit na partikular, iyon ay, sa isang tiyak na pagkakasunud-sunod at kumbinasyon. Kapag kinakailangan upang maunawaan kung ang isang tao ay may partikular na pathogen, ang biological na materyal (dugo, ihi, laway, pahid) ay kinuha, na naglalaman ng mga fragment ng DNA o DNA ng mikrobyo. Ngunit ang halaga ng genetic na materyal ng pathogen ay napakaliit, at imposibleng sabihin kung aling microorganism ito ay kabilang. Ginagamit ang PCR upang malutas ang problemang ito. Ang kakanyahan ng polymerase chain reaction ay ang isang maliit na halaga ng materyal para sa pananaliksik na naglalaman ng DNA ay kinuha, at sa panahon ng proseso ng PCR ang dami ng genetic na materyal na kabilang sa isang tiyak na pathogen ay tumataas at, sa gayon, maaari itong makilala.

Mga diagnostic ng PCR - genetic na pag-aaral ng biomaterial.

Ang ideya ng paraan ng PCR ay kabilang sa Amerikanong siyentipiko na si K. Mullins, na iminungkahi niya noong 1983. Gayunpaman, nakatanggap ito ng malawakang klinikal na paggamit lamang sa kalagitnaan ng 90s ng ika-20 siglo.

Unawain natin ang terminolohiya, kung ano ito - DNA, atbp. Ang bawat cell ng anumang buhay na nilalang (hayop, halaman, tao, bakterya, virus) ay may mga kromosom. Ang mga Chromosome ay ang mga tagapag-ingat ng genetic na impormasyon na naglalaman ng buong pagkakasunud-sunod ng gene ng bawat partikular na nilalang na nabubuhay.

Ang bawat chromosome ay binubuo ng dalawang hibla ng DNA na pinaikot sa isang spiral na may kaugnayan sa bawat isa. Ang DNA ay chemically deoxyribonucleic acid, na binubuo ng mga structural component - nucleotides. Mayroong 5 uri ng nucleotides - thymine (T), adenosine (A), guanine (G), cytosine (C) at uracil (U). Ang mga nucleotide ay nakaayos nang isa-isa sa isang mahigpit na indibidwal na pagkakasunud-sunod, na bumubuo ng mga gene. Ang isang gene ay maaaring binubuo ng 20-200 tulad ng mga nucleotide. Halimbawa, ang gene na naka-encode sa paggawa ng insulin ay binubuo ng 60 pares ng nucleotide.

Ang mga nucleotide ay may pag-aari ng complementarity. Nangangahulugan ito na ang kabaligtaran ng adenine (A) sa isang chain ng DNA ay kinakailangang mayroong thymine (T) sa isa pang chain, at sa tapat ng guanine (G) mayroong cytosine (C). Sa eskematiko, ganito ang hitsura:
G - C
T - A
A - T
Ang ari-arian ng complementarity ay susi para sa PCR.

Bilang karagdagan sa DNA, ang RNA ay may parehong istraktura - ribonucleic acid, na naiiba sa DNA dahil gumagamit ito ng uracil sa halip na thymine. Ang RNA ay ang tagapag-ingat ng genetic na impormasyon sa ilang mga virus na tinatawag na mga retrovirus (halimbawa, HIV).

Ang mga molekula ng DNA at RNA ay maaaring "mag-multiply" (ang ari-arian na ito ay ginagamit para sa PCR). Nangyayari ito bilang mga sumusunod: dalawang hibla ng DNA o RNA ang lumalayo sa isa't isa, at isang espesyal na enzyme ang nakaupo sa bawat strand, na nag-synthesize ng bagong kadena. Ang synthesis ay nagpapatuloy ayon sa prinsipyo ng complementarity, iyon ay, kung ang orihinal na DNA chain ay naglalaman ng nucleotide A, kung gayon ang bagong synthesize ay maglalaman ng T, kung G, pagkatapos ay C, atbp. Upang simulan ang synthesis, ang espesyal na "tagabuo" na enzyme na ito ay nangangailangan ng isang "binhi" - isang pagkakasunud-sunod ng 5-15 nucleotides. Ang "primer" na ito ay tinukoy para sa bawat gene (chlamydia gene, mycoplasma, mga virus) sa eksperimento.

Kaya, ang bawat PCR cycle ay binubuo ng tatlong yugto. Sa unang yugto, ang tinatawag na unwinding ng DNA ay nangyayari - iyon ay, ang paghihiwalay ng dalawang DNA strands na konektado sa isa't isa. Sa pangalawa, ang "binhi" ay nakakabit sa isang seksyon ng DNA strand. At sa wakas, ang pagpahaba ng mga DNA strands na ito, na ginawa ng isang "tagabuo" na enzyme. Sa kasalukuyan ang lahat ng ito mahirap na proseso nagaganap sa isang test tube at binubuo ng mga paulit-ulit na cycle ng multiplikasyon ng nade-detect na DNA para makakuha ng malaking bilang ng mga kopya, na pagkatapos ay matutukoy ng mga kumbensyonal na pamamaraan. Ibig sabihin, mula sa isang strand ng DNA ay nakakakuha tayo ng daan-daan o libu-libo.

Mga yugto ng pananaliksik sa PCR

Koleksyon ng biological na materyal para sa pananaliksik

Ang iba't ibang biological na materyal ay ginagamit bilang isang sample: dugo at mga bahagi nito, ihi, laway, mucous membrane discharge, cerebrospinal fluid, discharge ibabaw ng sugat, mga nilalaman ng mga cavity ng katawan. Ang lahat ng mga biosample ay kinokolekta gamit ang mga disposable na instrumento, at ang nakolektang materyal ay inilalagay sa mga plastic na sterile na tubo o inilalagay sa culture media, na may kasunod na transportasyon sa laboratoryo.

Ang mga kinakailangang reagents ay idinagdag sa mga nakolektang sample at inilagay sa isang programmable thermostat - isang thermal cycler (amplifier). Sa amplifier, ang PCR cycle, na binubuo ng tatlong yugto (denaturation, annealing at extension), ay paulit-ulit ng 30-50 beses. Ano ang ibig sabihin nito? Tingnan natin nang maigi.

Mga yugto ng direktang reaksyon ng PCR, pagkopya ng genetic na materyal

akoPCR stage - Paghahanda ng genetic material para sa pagkopya.
Nangyayari sa temperatura na 95 ° C, habang ang mga hibla ng DNA ay pinaghihiwalay, at ang "mga buto" ay maaaring mapunta sa kanila.

Ang "mga buto" ay ginawa sa industriya ng iba't ibang mga asosasyon ng pananaliksik at produksyon, at ang mga laboratoryo ay bumili ng mga handa na. Kasabay nito, ang "primer" para sa pagkilala, halimbawa, chlamydia, ay gumagana lamang para sa chlamydia, atbp. Kaya, kung ang isang biomaterial ay nasubok para sa pagkakaroon ng impeksyon sa chlamydial, pagkatapos ay isang "primer" para sa chlamydia ay inilalagay sa pinaghalong reaksyon; kung ang biomaterial ay sinubukan para sa Epstein-Barr virus, kung gayon ito ay isa ring "binhi" para sa Epstein-Barr virus.

IIyugto - Pinagsasama ang genetic na materyal ng nakakahawang ahente at ang "binhi".
Kung mayroong DNA ng isang nakikitang virus o bakterya, ang "primer" ay nasa DNA na ito. Ang prosesong ito ng pagdaragdag ng "primer" ay ang pangalawang yugto ng PCR. Ang yugtong ito ay nagaganap sa temperaturang 75°C.

IIIyugto - Pagkopya sa genetic na materyal ng nakakahawang ahente.
Ito ang proseso ng aktwal na pagpapahaba o pagpaparami ng genetic material, na nangyayari sa 72°C. Ang "tagabuo" na enzyme ay lumalapit sa "mga buto" at nag-synthesize ng bagong DNA chain. Sa pagtatapos ng synthesis ng isang bagong DNA chain, ang PCR cycle ay nagtatapos. Ibig sabihin, sa isang PCR cycle ay dumodoble ang dami ng genetic material. Halimbawa, ang unang sample ay naglalaman ng 100 DNA molecule ng isang virus; pagkatapos ng unang PCR cycle, ang sample ay maglalaman na ng 200 DNA molecule ng virus na sinusuri. Ang isang cycle ay tumatagal ng 2-3 minuto.

Upang makabuo ng sapat na dami ng genetic na materyal para sa pagkakakilanlan, 30-50 PCR cycle ang karaniwang ginagawa, na tumatagal ng 2-3 oras.

Yugto ng pagkakakilanlan ng propagated genetic material

Sa totoo lang, ang PCR ay nagtatapos dito at pagkatapos ay darating ang hindi gaanong makabuluhang yugto ng pagkakakilanlan. Para sa pagkakakilanlan, ang paraan ng electrophoresis o may label na "mga buto" ay ginagamit. Kapag gumagamit ng electrophoresis, ang mga nagresultang DNA strands ay pinaghihiwalay ng laki, at ang pagkakaroon ng mga fragment ng DNA ng iba't ibang haba ay nagpapahiwatig ng isang positibong resulta ng pagsubok (iyon ay, ang pagkakaroon ng isang partikular na virus, bakterya, atbp.). Kapag gumagamit ng may label na "mga buto", isang chromogen (tina) ay idinagdag sa panghuling produkto ng reaksyon, bilang isang resulta kung saan ang reaksyon ng enzymatic ay sinamahan ng pagbuo ng kulay. Direktang ipinahihiwatig ng pagbuo ng kulay na mayroong virus o iba pang nakikitang ahente sa orihinal na sample.

Ngayon, gamit ang may label na "mga buto", pati na rin ang naaangkop na software, posible na agad na "basahin" ang mga resulta ng PCR. Ito ang tinatawag na real-time PCR.

Bakit napakahalaga ng mga diagnostic ng PCR?

Ang isa sa mga makabuluhang bentahe ng paraan ng PCR ay ang mataas na sensitivity nito - mula 95 hanggang 100%. Gayunpaman, ang mga benepisyong ito ay dapat na nakabatay sa mahigpit na pagsunod sa mga sumusunod na kondisyon:

1. tamang koleksyon at transportasyon ng biological na materyal;
2. pagkakaroon ng mga sterile, disposable na instrumento, mga espesyal na laboratoryo at sinanay na tauhan;
3. mahigpit na pagsunod sa pamamaraan at sterility sa panahon ng pagsusuri

Ang sensitivity ay nag-iiba sa iba't ibang microbes na nakita. Halimbawa, ang sensitivity ng paraan ng PCR para sa pag-detect ng hepatitis C virus ay 97-98%, ang sensitivity para sa pag-detect ng ureaplasma ay 99-100%.

Ang mga kakayahan na likas sa pagsusuri ng PCR ay nagbibigay-daan para sa walang kapantay na pagtutukoy ng analitikal. Nangangahulugan ito ng eksaktong pagtukoy sa mikroorganismo na hinahanap, at hindi katulad o malapit na nauugnay.
Diagnostic sensitivity at ang pagtitiyak ng paraan ng PCR ay kadalasang nakahihigit sa pamamaraan ng kultura, na tinatawag na "pamantayan ng ginto" para sa pagtuklas ng mga nakakahawang sakit. Isinasaalang-alang ang tagal ng paglilinang ng kultura (mula sa ilang araw hanggang ilang linggo), ang bentahe ng paraan ng PCR ay nagiging halata.

PCR sa pagsusuri ng mga impeksyon
Ang mga bentahe ng paraan ng PCR (sensitivity at specificity) ay tumutukoy sa isang malawak na hanay ng mga aplikasyon sa modernong gamot.
Ang mga pangunahing lugar ng aplikasyon ng mga diagnostic ng PCR:

1. diagnosis ng talamak at talamak na mga nakakahawang sakit ng iba't ibang lokalisasyon
2. pagsubaybay sa pagiging epektibo ng therapy
3. paglilinaw ng uri ng pathogen

Ginagamit ang PCR sa obstetrics, gynecology, neonatology, pediatrics, urology, venereology, nephrology, infectious disease clinic, ophthalmology, neurology, phthisiopulmonology, atbp.

Ang paggamit ng mga diagnostic ng PCR ay isinasagawa kasabay ng iba pang mga pamamaraan ng pananaliksik (ELISA, PIF, RIF, atbp.). Ang kanilang kumbinasyon at pagiging angkop ay tinutukoy ng dumadating na manggagamot.

Ang mga nakakahawang ahente ay nakita ng PCR

Mga virus:

1. retrovirus na HIV-1 at HIV-2
2. herpetiform virus
3. virus herpes simplex 1 at 2 uri

Kamakailan, isang maaasahan, lubos na sensitibo at mabilis na paraan diagnosis ng iba't ibang mga nakakahawang sakit ng tao. Ang pamamaraang ito ay tinatawag na "PCR analysis". Ano ito, kung ano ang kakanyahan nito, kung anong mga microorganism ang makikilala nito at kung paano ito kunin nang tama, sasabihin namin sa iyo sa aming artikulo.

Kasaysayan ng pagtuklas

Ginagamit din ang mga pamamaraan ng PCR sa pagsusuri ng kanser.

Mga kalamangan ng pamamaraan

Ang mga diagnostic ng PCR ay may ilang mga pakinabang:

1. Mataas na sensitivity. Kahit na kakaunti lamang ang microorganism DNA molecules, tinutukoy ng PCR analysis ang pagkakaroon ng impeksyon. Ang pamamaraan ay makakatulong sa mga talamak at nakatagong sakit. Kadalasan sa ganitong mga kaso ang mikroorganismo ay hindi maaaring kultura.
2. Ang anumang materyal ay angkop para sa pananaliksik, halimbawa laway, dugo, mga pagtatago ng ari, buhok, mga selulang epithelial. Ang pinakakaraniwan ay ang PCR test ng dugo at urogenital smear.

   

3. Hindi kinakailangan ang pangmatagalang pagtatanim ng mga pananim. Ang awtomatikong proseso ng diagnostic ay nagpapahintulot sa iyo na makakuha ng mga resulta ng pananaliksik pagkatapos ng 4-5 na oras.
4. Ang pamamaraan ay halos isang daang porsyento na maaasahan. Tanging mga nakahiwalay na kaso ng mga maling negatibong resulta ang naitala.
5. Ang kakayahang makilala ang ilang uri ng mga pathogen mula sa isang sample ng materyal. Ito ay hindi lamang nagpapabilis sa proseso ng pag-diagnose ng sakit, ngunit makabuluhang binabawasan ang mga gastos sa materyal. Kadalasan, ang doktor ay nagrereseta ng isang kumplikadong pagsusuri sa PCR. Ang halaga ng isang pagsusuri na binubuo ng pagkilala sa anim na pathogens ay humigit-kumulang 1,500 rubles.

Upang maging maaasahan ang mga resulta kapag nagsasagawa ng pag-aaral ng PCR, kailangan mong kunin ang pagsusulit, kasunod ng mga rekomendasyon para sa paunang paghahanda para sa diagnosis:

1. Bago mag-donate ng laway, dapat mong pigilin ang pagkain at pag-inom ng mga gamot 4 na oras bago kolektahin ang materyal. Kaagad bago ang pamamaraan, banlawan ang iyong bibig ng pinakuluang tubig.
2. Ang mga tuntunin sa itaas ay dapat ding sundin kapag kumukuha ng sample mula sa panloob na ibabaw ng pisngi. Pagkatapos ng banlawan, inirerekumenda na magsagawa ng isang magaan na masahe sa balat upang palabasin ang pagtatago ng glandula.
3. Karaniwang kinokolekta ang ihi sa bahay. Upang gawin ito, kailangan mong lubusan na linisin ang mga maselang bahagi ng katawan. 50-60 ML ng ihi ay dapat na kolektahin sa isang sterile plastic container. Upang matiyak ang kadalisayan ng materyal, inirerekomenda para sa mga kababaihan na magpasok ng isang tampon sa puki, at para sa mga lalaki na hilahin pabalik ang fold ng balat hangga't maaari. Hindi ka maaaring mag-abuloy ng materyal sa panahon ng iyong regla.
4. Upang mag-abuloy ng tamud, dapat kang umiwas sa pakikipagtalik sa loob ng 3 araw bago kolektahin ang materyal. Pinapayuhan din ng mga doktor na iwasan ang pagbisita sa sauna at paliguan ng mainit, pag-inom ng alak at mga maaanghang na pagkain. Dapat mong pigilin ang pag-ihi 3 oras bago ang pagsusulit.
5. Halimbawa, kung ang isang PCR test para sa chlamydia ay isinasagawa, parehong babae at lalaki ay inirerekomenda na magkaroon ng sekswal na pahinga sa loob ng 3 araw. 2 linggo bago ang pagsusuri hindi ka dapat uminom ng mga antibacterial na gamot. Para sa isang linggo, kailangan mong ihinto ang paggamit ng mga intimate gel, ointment, vaginal suppositories, at douching. 3 oras bago ang pagsusulit dapat mong pigilin ang pag-ihi. Sa panahon ng regla, ang materyal ay hindi nakolekta; 3 araw lamang pagkatapos na huminto ang pagdurugo, maaaring kumuha ng urogenital smear.

PCR sa panahon ng pagbubuntis

Habang naghihintay ng isang sanggol, maraming mga nakakahawang sakit na nakukuha sa pakikipagtalik ay lubhang mapanganib para sa normal na pag-unlad fetus Ang mga STD ay maaaring magdulot ng intrauterine growth retardation, miscarriage o premature birth, at congenital defects ng bata. Samakatuwid, ito ay lubhang mahalaga upang pumunta sa maagang yugto pagsusuri sa pagbubuntis gamit ang PCR method. Dapat gawin ang pagsusulit sa pagpaparehistro - hanggang 12 linggo.



Ang materyal ay nakolekta mula sa cervical canal gamit ang isang espesyal na brush. Ang pamamaraan ay walang sakit at hindi nagdudulot ng panganib sa sanggol. Karaniwan, sa panahon ng pagbubuntis, ang isang pagsusuri ay isinasagawa para sa chlamydia gamit ang paraan ng PCR, pati na rin para sa ureaplasmosis, mycoplasmosis, cytomegalovirus, herpes, at papillomavirus. Ang hanay ng mga pagsusuring ito ay tinatawag na PCR-6.

PCR para sa diagnosis ng HIV

Dahil sa ang katunayan na ang pamamaraan ay napaka-sensitibo sa mga pagbabago sa katawan at mga kondisyon ng diagnostic, maraming mga kadahilanan ang maaaring makaapekto sa resulta. Samakatuwid, ang pagsusuri ng PCR para sa impeksyon sa HIV ay hindi isang maaasahang paraan; ang pagiging epektibo nito ay 96-98%. Sa natitirang 2-4% ng mga kaso, ang pagsusuri ay nagbibigay ng mga maling positibong resulta.

Ngunit sa ilang mga sitwasyon, hindi mo magagawa nang walang PCR diagnostics ng HIV. Karaniwan itong ginagawa sa mga taong may maling negatibong resulta ng ELISA. Ang ganitong mga tagapagpahiwatig ay nagpapahiwatig na ang isang tao ay hindi pa nakakabuo ng mga antibodies sa virus at hindi sila maaaring makita nang walang maraming pagtaas sa bilang. Ito ay eksakto kung ano ang maaaring makamit sa pamamagitan ng pagsasagawa ng pagsusuri sa dugo gamit ang paraan ng PCR.

Ang ganitong mga diagnostic ay kinakailangan din para sa mga bata sa unang taon ng buhay na ipinanganak mula sa isang ina na may HIV. Ang pamamaraan ay ang tanging paraan maaasahang pagpapasiya ng katayuan ng bata.

PCR para sa pag-diagnose ng hepatitis

Ang polymerase chain reaction method ay nagpapahintulot sa iyo na makita ang DNA ng hepatitis A, B, C virus bago pa ang pagbuo ng mga antibodies sa impeksyon o ang hitsura ng mga sintomas ng sakit. Ang pagsusuri sa PCR para sa hepatitis C ay lalong epektibo, dahil sa 85% ng mga kaso ang sakit na ito ay asymptomatic at walang napapanahong paggamot ay nagiging talamak.



Ang napapanahong pagtuklas ng pathogen ay makakatulong upang maiwasan ang mga komplikasyon at pangmatagalang paggamot.

Komprehensibong pagsusuri sa PCR

Comprehensive PCR analysis: pagsusuri gamit ang polymesic chain reaction method, na kinabibilangan ng sabay-sabay na pagtukoy ng ilang uri ng impeksyon: mycoplasma genitalium, mycoplasma hominis, Gardnerella vaginalis, candida, trichomonas, cytomegalovirus, herpes type 1 at 2, gonorrhea, papillomavirus. Ang presyo ng naturang mga diagnostic ay mula 2000 hanggang 3500 rubles. depende sa klinika, ang mga materyales at kagamitan na ginamit, pati na rin ang uri ng pagsusuri: qualitative o quantitative. Ang doktor ang magpapasya kung alin ang kinakailangan sa iyong kaso. Sa ilang mga kaso, sapat na upang matukoy lamang ang pagkakaroon ng pathogen; sa iba, halimbawa, na may impeksyon sa HIV, ang isang quantitative titer ay gumaganap ng isang mahalagang papel. Kapag na-diagnose ang lahat ng pathogens sa itaas, ang pagsusuri ay tinatawag na "PCR-12 analysis."

Pag-decode ng mga resulta ng pagsusuri

Ang pag-decipher sa pagsusuri ng PCR ay hindi mahirap. Mayroon lamang 2 indicator scale - " positibong resulta" at "negatibong resulta". Kung may nakitang pathogen, maaaring kumpirmahin ng mga doktor ang pagkakaroon ng sakit na may 99% na kumpiyansa at simulan ang paggamot sa pasyente. Gamit ang quantitative na paraan ng pagtukoy ng impeksyon, ang numerical indicator ng nakitang bacteria ay ipahiwatig sa kaukulang column. Ang isang doktor lamang ang maaaring matukoy ang lawak ng sakit at magreseta ng kinakailangang paggamot.



Sa ilang mga kaso, halimbawa, kapag tinutukoy ang impeksyon sa HIV gamit ang paraan ng PCR, kung ang resulta ay negatibo, kinakailangan na magsagawa ng mga karagdagang pagsusuri upang kumpirmahin ang nakuha na mga tagapagpahiwatig.

Saan ako maaaring magpasuri?

Saan kukuha ng PCR test: sa isang pampublikong klinika o sa isang pribadong laboratoryo? Sa kasamaang palad, sa mga munisipal na institusyong medikal, ang mga kagamitan at pamamaraan ay madalas na hindi napapanahon. Samakatuwid, mas mahusay na bigyan ng kagustuhan ang mga pribadong laboratoryo na may modernong kagamitan at mataas na kwalipikadong tauhan. Bilang karagdagan, sa isang pribadong klinika makakakuha ka ng mga resulta nang mas mabilis.

Sa Moscow, maraming pribadong laboratoryo ang nag-aalok ng PCR testing para sa iba't ibang impeksyon. Halimbawa, sa mga klinika tulad ng "Vita", "Complex Clinic", "Maligayang Pamilya", "Uro-Pro", ang pagsusuri sa PCR ay isinasagawa. Ang presyo ng pagsusuri ay mula sa 200 rubles. para sa pagtukoy ng isang pathogen.

Maaari itong tapusin na ang diagnosis ng mga nakakahawang sakit gamit ang PCR na paraan sa karamihan ng mga kaso ay isang mabilis at maaasahang paraan upang makita ang pathogen sa katawan sa mga unang yugto ng impeksiyon. Ngunit gayon pa man, sa ilang mga kaso ito ay nagkakahalaga ng pagpili ng iba pang mga pamamaraan ng diagnostic. Ang isang espesyalista lamang ang maaaring matukoy ang pangangailangan para sa naturang pag-aaral. Ang pag-decipher sa pagsusuri ng PCR ay nangangailangan din ng isang propesyonal na diskarte. Sundin ang mga rekomendasyon ng iyong doktor at huwag magsagawa ng mga hindi kinakailangang pagsusuri sa iyong sarili.