In caso di sifilide primaria, si esaminano le secrezioni ulcerose o i linfonodi puntati per ricercare il treponema pallidum. In caso di sifilide secondaria, il materiale viene prelevato dalla superficie delle papule erose sulla pelle, dalle mucose, dalle crepe, ecc. Prima di prelevare il materiale per pulire da vari contaminanti, la superficie delle lesioni (erosioni, ulcere, crepe ) deve essere pulito accuratamente con un tampone di garza di cotone sterile, inumidito con una soluzione isotonica di cloruro di sodio o prescrivere lozioni con la stessa soluzione. La superficie pulita viene asciugata con un tampone asciutto e viene utilizzata un'ansa o una spatola di platino per irritare leggermente le aree periferiche, mentre allo stesso tempo si comprime leggermente la base dell'elemento con le dita in un guanto di gomma fino alla comparsa del fluido tissutale (siero), da cui viene preparata la preparazione per la ricerca. Ottenere il fluido tissutale è importante per diagnosticare la sifilide, poiché il treponema pallidum si trova nei lumi dei capillari linfatici, nelle fessure dei tessuti attorno ai vasi linfatici e sanguigni.

Puntura dei linfonodi regionali

La pelle sopra i linfonodi viene trattata con alcol al 96% e soluzione alcolica di iodio al 3-5%. Quindi utilizzare la prima e la seconda dita della mano sinistra per fissare il linfonodo. Mano destra prendere una siringa sterile con alcune gocce di soluzione isotonica di cloruro di sodio, che viene iniettata parallelamente asse longitudinale linfonodo. L'ago viene spinto in diverse direzioni verso la parete opposta della capsula linfonodale e il contenuto della siringa viene iniettato lentamente. Usando le dita della mano sinistra, il linfonodo viene leggermente massaggiato. Quando l'ago viene ritirato lentamente, contemporaneamente viene estratto lo stantuffo della siringa, aspirando il contenuto del linfonodo. Il materiale viene applicato su un vetrino (se la quantità di materiale è piccola, viene aggiunta una goccia di soluzione isotonica di cloruro di sodio) e coperto con un coprioggetto. Lo studio del farmaco nativo viene effettuato in campo visivo oscuro utilizzando un microscopio ottico con condensatore a campo oscuro (obiettivo 40, 7x, 10x o 15x). Il Treponema pallidum si trova anche nei preparati colorati. Se colorati secondo Romanovsky-Giemsa, i treponemi pallidi sono colorati di rosa, secondo Fontan e Morozov - marrone (nero), secondo il metodo Burri, i treponemi non colorati si rivelano su uno sfondo scuro.

Diagnosi sierologica

Importanza nella diagnosi della sifilide, nella valutazione dell'efficacia del trattamento, nella definizione di un criterio di cura, nell'identificazione delle malattie nascoste, forme resistenti assegnato a reazioni sierologiche standard (classiche) e specifiche. Le reazioni sierologiche standard o classiche (SSR) includono:

• Reazione di Wasserman (WR),
• reazioni sedimentarie di Kahn e Sachs-Vitebsky (citocoliche),
• reazione su vetro (metodo espresso),

a specifico:

• reazione di immobilizzazione del treponema pallido (reazione del treponema pallido),
• reazione di immunofluorescenza (RIF).

Reazione di Wasserman (WR)

- sviluppato da A. Wasserman insieme ad A. Neisser e C. Bruck nel 1906. La reazione di Wasserman si basa sul fenomeno della fissazione del complemento (reazione di Bordet-Gengou) e consente la determinazione di anticorpi antilipidi (reagine). Secondo idee moderne, nella reazione di Wasserman, vengono determinati gli anticorpi contro i lipidi del macroorganismo, e non contro il treponema pallidum, e la reazione rivela un processo autoimmune causato dalla denaturazione dei tessuti del macroorganismo da parte del treponema pallidum con la formazione di un complesso lipoproteico (coniugato), in cui i lipidi (apteni) sono un determinante.

Il RV viene solitamente diagnosticato con due o tre antigeni. I più comunemente usati sono l'antigene cardiolipina altamente sensibile (estratto di cuore bovino arricchito con colesterolo e lecitina) e l'antigene treponemico (sospensione sonicata di treponemi pallidi coltivati ​​anatogeni). Insieme alle reagine sieriche del paziente, questi antigeni formano un complesso immunitario capace di adsorbire e legare il complemento. Per determinare visivamente il complesso formato (reagine + antigene + complemento), come indicatore viene utilizzato il sistema emolitico (una miscela di eritrociti di pecora con siero emolitico). Se nella fase 1 della reazione (reagne + antigene + complemento) si lega il complemento, non si verifica emolisi: i globuli rossi precipitano in un precipitato facilmente visibile (PB positivo). Se nella fase 1 il complemento non si lega a causa dell'assenza di reagine nel siero in esame, verrà utilizzato dal sistema emolitico e si verificherà l'emolisi (RT negativo). Il grado di gravità dell'emolisi durante la stadiazione del RV è valutato in base ai vantaggi: completa assenza di emolisi ++++ o 4+ (RV è nettamente positivo); emolisi appena iniziata +++ o 3+ (RV positivo); emolisi significativa ++ o 2+ (RV debolmente positivo); quadro poco chiaro dell'emolisi ± (il RV è dubbio); emolisi completa - (reazione Wassermann negativa).

Oltre alla valutazione qualitativa del PB, esiste una valutazione quantitativa con varie diluizioni del siero (1:10, 1:20, 1:80, 1:160, 1:320). Il titolo della reazione è determinato dalla diluizione massima che dà comunque un risultato nettamente positivo (4+). La stadiazione quantitativa del RV è importante nella diagnosi di alcune forme cliniche di infezione sifilitica, nonché nel monitoraggio dell'efficacia del trattamento. Attualmente, la reazione Wasserman viene eseguita con due antigeni (cardiolipina e ceppo di Reiter sonorato treponemico). Di norma, il RV diventa positivo 5-6 settimane dopo l'infezione nel 25-60% dei pazienti, a 7-8 settimane - nel 75-96%, a 9-19 settimane - nel 100%, sebbene in l'anno scorso a volte prima o dopo. Allo stesso tempo, il titolo della reagina aumenta gradualmente e raggiunge un valore massimo (1:160-1:320 e oltre) in caso di eruzioni cutanee generalizzate (sifilide fresca secondaria). Quando RV è positivo, viene fatta una diagnosi di sifilide sieropositiva primaria.
Con secondario fresco e sifilide ricorrente secondaria, il RV è positivo nel 100% dei pazienti, ma nei pazienti depleti con immunità indebolita si può osservare un risultato negativo. Successivamente il titolo della reagina diminuisce gradualmente e in caso di sifilide secondaria ricorrente solitamente non supera 1:80-1:120.
Per la sifilide terziaria Il RV è positivo nel 65-70% dei pazienti e solitamente si osserva un basso titolo di reagina (1:20-1:40). Nelle forme tardive di sifilide (sifilide organi interni, sistema nervoso) RV positivo si osserva nel 50-80% dei casi. Il titolo della reazione varia da 1:5 a 1:320.
Per la sifilide latente RV positivo si osserva nel 100% dei pazienti. Il titolo della reazione va da 1:80 a 1:640 e con la sifilide latente tardiva da 1:10 a 1:20. Una rapida diminuzione del titolo della reagina (fino alla completa negatività) durante il trattamento indica l'efficacia del trattamento.

Svantaggi della reazione Wasserman- sensibilità insufficiente (in stato iniziale sifilide primaria negativa). Risulta negativo anche in 1/3 dei pazienti se sono stati trattati in passato con antibiotici, nei pazienti con sifilide terziaria attiva con lesioni della pelle e delle mucose, dell'apparato osteoarticolare, degli organi interni, del sistema nervoso centrale e con malattie congenite tardive. sifilide.
Mancanza di specificità- la reazione di Wasserman può essere positiva nelle persone che non hanno mai avuto e non hanno la sifilide. In particolare, si osservano risultati RV falsi positivi (non specifici) in pazienti che soffrono di lupus eritematoso sistemico, lebbra, malaria, neoplasie maligne, danni al fegato, infarto miocardico esteso e altre malattie, e talvolta in persone completamente sane.
Viene rilevata una reazione Wasserman falsa positiva a breve termine in alcune donne prima o dopo il parto, nelle tossicodipendenti, dopo l'anestesia o nel consumo di alcol. Di norma, il RV falso positivo è debolmente espresso, spesso con un titolo di reagina basso (1:5-1:20), positivo (3+) o debolmente positivo (2+). Durante le indagini sierologiche di massa, la frequenza dei risultati falsi positivi è dello 0,1-0,15%. Per superare la sensibilità insufficiente si utilizza il test del freddo (reazione di Kolyar) e contemporaneamente si esegue con altre reazioni sierologiche.

Reazioni sedimentarie di Kahn e Sachs-Vitebsky

La reazione Wasserman viene utilizzata in combinazione con due reazioni sedimentarie (Kahn e Sachs-Vitebsky), una volta messi in scena, vengono preparati antigeni più concentrati. Metodo Express (microreazione su vetro) - si riferisce alle reazioni lipidiche e si basa sulla reazione di precipitazione. Viene posto con uno specifico antigene cardiolipina, 1 goccia del quale viene miscelata con 2-3 gocce del siero del sangue in esame nei pozzetti di una speciale lastra di vetro.
Vantaggio- velocità di ricezione della risposta (in 30-40 minuti). I risultati vengono valutati in base alla quantità di sedimento depositato e alla dimensione delle scaglie. L'espressività è definita come CSR - 4+, 3+, 2+ e negativa. Va notato che i risultati falsi positivi si osservano più spesso che con RV. Di norma, il metodo espresso viene utilizzato per esami di massa per la sifilide, per esami nei laboratori diagnostici clinici, nei reparti somatici e negli ospedali. Sulla base dei risultati del metodo express, è vietata la diagnosi di sifilide, il suo utilizzo nelle donne in gravidanza, nei donatori ed è escluso anche per il controllo dopo il trattamento;

Reazione di immobilizzazione del Treponema pallido (TPI)

Reazione di immobilizzazione del Treponema pallido (TPI)- proposto nel 1949 da R.W.Nelson e M.Mayer. È il test diagnostico più specifico per la sifilide. Tuttavia, la complessità e l’alto costo di produzione ne limitano l’utilizzo. Nel siero dei pazienti vengono determinati anticorpi video-specifici (immobilisine), che portano all'immobilità del Treponema pallidum in presenza di complemento. L'antigene è il Treponema pallidum patogeno vivo isolato da conigli infetti da sifilide. Utilizzando un microscopio, viene contata la motilità persa (immobilizzata) del Treponema pallidum e vengono valutati i risultati del RIBT: l'immobilizzazione del Treponema pallidum dal 51 al 100% è positiva; dal 31 al 50% - debolmente positivo; dal 21 al 30% - dubbio; dallo 0 al 20% - negativo.
RIBT conta quando diagnosi differenziale per distinguere le reazioni sierologiche false positive dalle reazioni causate dalla sifilide. Tardi diventa positivo di RV, RIF e quindi per la diagnostica forme diverse non è usato per la sifilide, sebbene nel periodo secondario della sifilide sia positivo nell'85-100% dei pazienti.
Nel periodo terziario della sifilide con danni agli organi interni, al sistema muscolo-scheletrico e al sistema nervoso, il RIBT è positivo nel 98-100% dei casi ( Il RV è spesso negativo).
Va ricordato che il RIBT può risultare falso positivo se il siero del test contiene farmaci treponemocidi (penicillina, tetraciclina, macroliti, ecc.), che causano l'immobilizzazione aspecifica del Treponema pallidum. A questo scopo, il sangue viene analizzato per RIBT non prima di 2 settimane dopo la fine dell'assunzione di antibiotici e altri farmaci.
RIBT, come RIF, viene lentamente negativizzato durante il trattamento, quindi non viene utilizzato come controllo durante il trattamento.

Reazione di immunofluorescenza (RIF)

Reazione di immunofluorescenza (RIF)- sviluppato nel 1954 da A.Coons e utilizzato per la prima volta per la diagnosi di infezione sifilitica da Deacon, Falcone, Harris nel 1957. Il RIF si basa su un metodo indiretto per la determinazione degli anticorpi fluorescenti. L'antigene per la produzione è il Treponema pallidum patogeno per i tessuti fissato su vetrini su cui viene applicato il siero da testare. Se il siero del test contiene anticorpi anti-treponema legati a IgM e IgG, si legano fortemente all'antigene - treponema, che viene rilevato al microscopio a fluorescenza utilizzando siero fluorescente anti-specie ("anti-umano").
Risultati RIF vengono presi in considerazione dall'intensità del bagliore del treponema pallido nella preparazione (bagliore giallo-verde). In assenza di anticorpi antitreponemici nel siero, il treponema pallidum non viene rilevato. In presenza di anticorpi viene rilevato un bagliore di treponema pallido, il cui grado è espresso in più: 0 e 1+ - reazione negativa; da 2+ a 4+ - positivo.
RIF si riferisce a reazioni treponemiche di gruppo e viene somministrato in una diluizione di 10 e 200 volte del siero in esame (RIF-10 e RIF-200). RIF-10 è considerato più sensibile, ma spesso si ottengono risultati positivi non specifici rispetto a RIF-200 (ha una specificità più elevata). Generalmente, RIF diventa positivo prima di RV- positivo nella sifilide primaria sieronegativa nell'80% dei pazienti, nel 100% nel periodo secondario della sifilide, sempre positivo nella sifilide latente e nel 95-100% dei casi nelle forme tardive e nella sifilide congenita.
Specificità del RIF aumenta dopo il pretrattamento del siero in esame con un antigene treponemico assorbente-ultrasonico, che lega gli anticorpi del gruppo (RIF - abs).
Indicazioni per RIBT e RIF- diagnosi di sifilide latente per confermare la specificità del complesso di reazioni lipidiche in caso di sospetta infezione sifilitica sulla base di un RV positivo. RIBT e RIF positivi sono la prova di sifilide latente. In caso di falso positivo RT con varie malattie(lupus eritematoso sistemico, neoplasie maligne ecc.) e se i risultati ripetuti di RIBT e RIF sono negativi, ciò indica la natura non specifica del RV. Sospetto di lesioni sifilitiche tardive degli organi interni, del sistema muscolo-scheletrico, del sistema nervoso se i pazienti hanno RV negativo. Sospetto di sifilide sieronegativa primaria, quando in pazienti con studi ripetuti di secrezione dalla superficie di un'erosione (ulcera), puntura da linfonodi regionali ingrossati, non viene rilevato treponema pallidum - in questo caso viene dato solo RIF - 10.
Quando si esaminano persone con RT negativo che hanno avuto contatti sessuali e familiari a lungo termine con pazienti affetti da sifilide, tenendo conto della probabile possibilità di trattarli nel recente passato con farmaci antisifilitici che hanno causato la negatività del RV. Saggio immunoassorbente legato all'enzima (ELISA - saggio immunoassorbente legato all'enzima) - metodo sviluppato da E. Engvall et al., S. Avrames (1971). L'essenza consiste nel combinare un antigene sifilitico assorbito sulla superficie di un portatore in fase solida con un anticorpo del siero sanguigno in studio e identificare uno specifico complesso antigene-anticorpo utilizzando siero sanguigno anti-specie marcato con enzima. Ciò consente di valutare visivamente i risultati ELISA in base al grado di cambiamento del colore del substrato sotto l'azione dell'enzima incluso nel coniugato. Risultati ELISA inaffidabili possono verificarsi a causa di una diluizione insufficiente degli ingredienti, di una violazione delle condizioni di temperatura e tempo, di un pH incoerente delle soluzioni, di contaminazione della vetreria di laboratorio e di una tecnica errata per il lavaggio dei terreni.

Reazione di emoagglutinazione passiva (RPHA)

Proposto come test diagnostico per la sifilide da T.Rathlev (1965,1967), T.Tomizawa (1966). La macromodificazione della reazione si chiama TRHA, la micromodifica è MNA-TR, la versione automatizzata è AMNA-TR, la reazione con macrocapsule di poliurea al posto dei globuli rossi è MSA-TR. La sensibilità e la specificità dell'RPGA sono simili a RIBT, RIF, ma l'RPGA ha meno sensibilità nelle forme precoci di sifilide rispetto ai RIF-abs e maggiore sensibilità nelle forme successive di sifilide congenita. RPGA viene fornito in versioni qualitative e quantitative.

Tecnica di prelievo del sangue per test sierologici

Per studiare RV, RIF, RIBT, il sangue viene prelevato dalla vena ulnare a stomaco vuoto o non prima di 4 ore dopo un pasto utilizzando una siringa sterile o un ago (per gravità). Nel luogo di raccolta, la pelle viene pretrattata con alcol al 70%. La siringa e l'ago devono essere lavati con una soluzione isotonica di cloruro di sodio. 5-7 ml di sangue da analizzare vengono versati in una provetta pulita, asciutta e fredda. Sulla provetta viene incollato un foglio di carta bianco con il cognome, le iniziali, l’anamnesi o il numero della tessera ambulatoriale del paziente e la data del prelievo di sangue. Dopo aver prelevato il sangue, la provetta viene posta in frigorifero con condizioni di temperatura+4°+8°С fino al giorno successivo. Il giorno successivo, il siero viene drenato per essere analizzato. Se il sangue non viene utilizzato il giorno successivo, il siero deve essere drenato dal coagulo e conservato in frigorifero per non più di 1 settimana. Per il test RIBT, la provetta deve essere appositamente preparata e sterile. In caso di violazione delle regole per la raccolta del sangue a fini di ricerca, il mancato rispetto delle condizioni può comportare la distorsione dei risultati.
Non è consigliabile prelevare campioni di sangue per i test dopo aver mangiato, bevuto o bevuto farmaci, dopo la somministrazione di vari vaccini, durante ciclo mestruale tra le donne.
Per la ricerca utilizzando il metodo express, il sangue è stato prelevato dalla punta del dito, come si fa quando lo si prende per la VES, ma il sangue è stato prelevato da 1 capillare in più. Il metodo express può essere eseguito anche con siero sanguigno ottenuto mediante venipuntura. Se è necessario eseguire analisi del sangue in laboratori remoti, è possibile inviare siero secco al posto del sangue (metodo goccia secca). Per fare ciò, il giorno successivo al prelievo del sangue, il siero viene separato dal coagulo e aspirato in una siringa sterile nella quantità di 1 ml. Quindi il siero viene versato sotto forma di 2 cerchi separati su una striscia di carta spessa (carta oleata o cellophane) di 6x8 cm. Sul bordo libero del prelievo di sangue vengono scritti il ​​cognome, le iniziali del soggetto e la data del prelievo di sangue carta. La carta con il siero viene protetta dalla luce solare diretta e lasciata a temperatura ambiente fino al giorno successivo. Il siero si asciuga sotto forma di piccoli cerchi di una pellicola vetrosa giallastra lucida. Successivamente, strisce di carta con siero essiccato vengono arrotolate come polvere farmaceutica e inviate al laboratorio, indicando la diagnosi e lo scopo per cui viene esaminato.

Resistenza sierologica

In alcuni (2% o più) pazienti affetti da sifilide, nonostante la terapia antisifilitica completa, si osserva un rallentamento (assenza) di reazioni sierologiche negative dopo la fine del trattamento fino a 12 mesi o più. Si verifica la cosiddetta resistenza sierologica, che negli ultimi anni è stata osservata frequentemente. Esistono forme di resistenza sierologica:

• VERO(assoluto, incondizionato) - è necessario effettuare un ulteriore trattamento antisifilitico, combinandolo con una terapia non specifica per aumentare le forze immunitarie del corpo.
• Parente- dopo il trattamento completo, il treponema pallido forma cisti o forme L, che si trovano nel corpo in uno stato a bassa virulenza e, di conseguenza, trattamento aggiuntivo non modifica gli indicatori delle reazioni sierologiche, in particolare RIF e RIBT.

Allo stesso tempo, nelle forme di cisti si verificano processi metabolici minori e il guscio delle forme di cisti è una proteina estranea (antigene). Per proteggersi l'organismo produce anticorpi specifici, che risultano positivi o fortemente positivi quando si effettuano reazioni sierologiche e non vi sono manifestazioni della malattia. Con le forme L, i processi metabolici sono più ridotti e le proprietà antigeniche sono assenti o poco espresse. Gli anticorpi specifici non vengono prodotti o sono in piccole quantità, le reazioni sierologiche sono debolmente positive o negative. Quanto più lungo è il periodo di tempo dal momento dell'infezione, tanto maggiore è il numero di Treponema pallidums che si trasformano in forme di sopravvivenza (cisti, spore, L-forme, grani), nelle quali la terapia antisifilitica non è efficace.

Pseudoresistenza- dopo il trattamento, nonostante le reazioni sierologiche positive, il Treponema pallidum è assente nell'organismo. Non c'è antigene nel corpo, ma continua la produzione di anticorpi, che vengono rilevati durante le reazioni sierologiche.
La resistenza sierologica può svilupparsi a causa di:

• trattamento inadeguato senza tener conto della durata e dello stadio della malattia;
• dose insufficiente e in particolare dovuta alla mancata considerazione del peso corporeo dei pazienti;
• violazione dell'intervallo tra la somministrazione del farmaco;
• conservazione del Treponema pallidum nel corpo nonostante una vera e propria trattamento specifico, a causa della loro resistenza alla penicillina e ad altri farmaci chemioterapici in presenza di lesioni nascoste e incistate negli organi interni, nel sistema nervoso, linfonodi, a cui non è possibile accedere farmaci antibatterici(il treponema pallidum si riscontra spesso nel tessuto cicatriziale molti anni dopo la fine della terapia; il treponema pallidum si riscontra talvolta nei linfonodi 3-5 anni dopo la terapia antisifilitica);
• riduzione delle forze protettive in varie malattie e intossicazioni (endocrinopatie, alcolismo, tossicodipendenza, ecc.);
• esaurimento generale (mangiare cibi poveri di vitamine, proteine, grassi).

Inoltre, viene spesso rilevata una falsa positività delle reazioni sierologiche, che non è associata alla presenza di sifilide nei pazienti ed è causata da:

• accompagnamento malattie non specifiche organi interni, disturbi del sistema cardiovascolare, reumatismi, disfunzioni del sistema endocrino e nervoso, gravi dermatosi croniche, neoplasie maligne;
• danni al sistema nervoso (lesioni gravi, commozioni cerebrali, traumi mentali);
• gravidanza; intossicazione cronica alcol, droghe alla nicotina; malattie infettive (malaria, tubercolosi, epatite virale, dissenteria, tifo, febbre tifoide e ricorrente).

Questi fattori possono influenzare la reattività immunologica del corpo sia durante il periodo di sviluppo attivo delle manifestazioni sifilitiche sia durante la loro regressione.

Diagnostica di laboratorio utilizza diversi test per la sifilide contemporaneamente per ottenere il risultato più accurato. Ciò richiede più tempo, ma fornisce la risposta più accurata.

Molto spesso, il risultato dell'analisi RIF è presentato in numeri. La decodifica ha i seguenti simboli:

• affilato risultato positivo indicato con 4 più (++++);
• un risultato positivo è indicato da 3 più (+++);
• risultato debolmente positivo con 2 più (++);
• risultato dubbio 1 più (+);
• un risultato negativo è indicato da 1 meno (-).

Il risultato del RIF per la sifilide viene presentato anche in percentuale, che dipende dall'indicatore quantitativo dei batteri associati:

• se il risultato è negativo, l'immobilizzazione arriva fino al 20%;
• con un risultato debolmente positivo, l'immobilizzazione varia dal 20 al 50%;
• con un risultato positivo l'immobilizzazione è superiore al 50%.

Se il risultato è positivo risposta, allora questo indica la presenza della malattia.

Se il risultato debolmente positivo, allora questo indica una singola quantità di anticorpi residui nel sangue.

Negativo il risultato indica l'assenza di treponema pallidum, il che significa che il paziente è sano.

I medici esperti della nostra clinica diagnosticheranno la sifilide rapidamente e con elevata precisione. Siamo quindi socialmente orientati verso tutte le fasce della popolazione il costo dell'analisi RIF è poco costoso. Il prezzo è presentato nella tabella sul nostro sito web.

Nella diagnosi sierologica della sifilide è molto importante ottenere un risultato affidabile e accurato.

Per migliorare la qualità dei dati vengono intraprese alcune azioni:

• Il siero del test viene diluito 200 volte (1:200) per evitare reazioni false positive. Poi dicono che è in corso test per la sifilide RIF 200.
• In un'altra opzione, quando si diluisce il siero 1:5, viene utilizzato inoltre uno speciale assorbente che raccoglie gli anticorpi "extra" in modo che non distorcano i risultati.

Anche la dimensione dei treponemi gioca un ruolo nelle mani dei ricercatori. Grandi corpi microbici di spirochete sono chiaramente visibili al microscopio a fluorescenza. Se le proteine ​​marcate con fosforo del siero “si aggrappano” ad essi. L'uso di un antigene e di un siero standardizzati ci consente di massimizzare la sensibilità e la specificità del RIF nella diagnosi della sifilide.

Opzioni di analisi RIF private: assorbimento RIF

Uno di modi alternativi chiamato RIF-Abs. Si differenzia dal metodo abituale per la bassa diluizione del siero in esame: 1:5 contro 1:200, come al solito.

Il campione concentrato contiene molte molecole proteiche attive.

Per evitare e aumentare la sensibilità, il siero viene trattato con uno speciale assorbente costituito da frammenti di spirochete sifilitiche. L'assorbente raccoglie gli anticorpi eccessivamente attivi e quindi il campione viene trattato con un siero industriale marcato con fosforo. Grazie a questa preparazione preliminare vengono eliminate tutte le molecole non necessarie che potrebbero influenzare i risultati del test.

Viene posizionato secondo le seguenti indicazioni:

• Positivo in un contesto di benessere clinico e senza storia di rischi di infezione.
• RV positivo in pazienti affetti da malattie croniche.
• RV negativo quando compaiono sintomi sospetti di sifilide.

I primi risultati positivi compaiono già il 15-16esimo giorno dal momento dell'infezione. Se la reazione cambia da positiva a negativa, ciò segnala una cura completa per la sifilide. La probabilità di un risultato falso positivo è inferiore allo 0,4%.

Questa situazione può verificarsi durante l'esame di malati di cancro, alcolisti, donne incinte e persone che soffrono di disturbi immunitari.

Una certa percentuale è dovuta ad errori tecnici, poiché la produzione è piuttosto complessa. Ci sono momenti in cui è necessario distinguere una patologia congenita da una acquisita. Puoi farlo se effettui una ricerca tipi diversi anticorpi nel sangue del paziente.

Gli anticorpi contro la sifilide di classe M (IgM) compaiono subito dopo l'infezione e sono molto più rapidi degli IgG. Permette di identificarli analisi per l'assorbimento del RIF della sifilide IgM. Se i risultati di questa reazione sono positivi, allora possiamo parlare di infezione recente. In questo modo è possibile distinguere i casi di reinfezione dalla recidiva o individuare l'infezione di un bambino dopo il parto.

Sulla base dei risultati di questa tecnica di analisi RIF, si trae anche una conclusione sull'efficacia del trattamento della sifilide precoce.

Se sospetti la sifilide, contatta un venereologo esperto.

La sifilide è accompagnata da numerosi sintomi e ha un gran numero di forme cliniche. Il suo riconoscimento si basa su un esame clinico e di laboratorio completo del paziente. Analisi generale il sangue per la sifilide contiene poche informazioni, quindi non viene utilizzato per diagnosticare la malattia.

I seguenti materiali possono essere presi per l'analisi:

• sangue da un dito e da una vena;
• liquido cerebrospinale - liquido cerebrospinale;
• scarico di ulcere dure (ulcere);
• aree dei linfonodi regionali.

La scelta del materiale e del metodo diagnostico dipende dallo stadio della malattia. Parleremo di quali test vengono eseguiti per la sifilide nella prossima sezione.

Classificazione dei metodi per la diagnosi di laboratorio delle malattie

Nella fase iniziale è possibile utilizzare il metodo batterioscopico, basato sull'identificazione dell'agente patogeno - Treponema pallidum - al microscopio. In futuro saranno ampiamente utilizzati test sierologici basati sulla determinazione di antigeni microbici e anticorpi prodotti dall'organismo in materiale biologico.

Non vengono condotti studi batteriologici, poiché l'agente eziologico della sifilide cresce molto poco sui mezzi nutritivi in ​​condizioni artificiali.

Tutti i metodi per rilevare il treponema, cioè i tipi di test per la sifilide, sono divisi in due grandi gruppi:

1. Diretto, che rileva direttamente il microbo stesso:

• microscopia in campo scuro (rilevamento di treponemi su sfondo scuro);
• Test RIT – infezione dei conigli con il materiale del test;
• polimerasi reazione a catena(PCR), che rileva sezioni del materiale genetico di un microrganismo.

2. Indiretto (sierologico), basato sulla rilevazione di anticorpi contro il microbo prodotti dall'organismo in risposta all'infezione.

I test sierologici sono divisi in due gruppi

Non treponemico:

• reazione di fissazione del complemento con antigene cardiolipina (CCk);
• reazione di microprecipitazione (MPR);
• test rapido della reagina plasmatica (RPR);
• test con rosso di toluidina.

Treponemico:

• reazione di fissazione del complemento con antigene treponemico (RSCT);
• Reazione di immobilizzazione del treponema (RTI o RIBT);
• reazione di immunofluorescenza (RIF);
• reazione emoagglutinazione passiva(RPGA);
• test immunoenzimatico (ELISA);
• immunoblotting.

I metodi di queste analisi sono piuttosto complessi, quindi ci concentreremo principalmente su quando vengono eseguite e sulla precisione delle informazioni che forniscono.

Diciamo subito che la base per diagnosticare la sifilide sono i metodi sierologici. Come si chiama il test per la sifilide: in ogni caso l'esame può includere tecniche diverse. Di seguito ne parleremo più in dettaglio.

Prove dirette

La loro rilevazione al microscopio dimostra in modo convincente la presenza di treponemi. La probabilità di sifilide raggiunge il 97%. Tuttavia, i microbi possono essere rilevati solo in 8 pazienti su 10, quindi un test negativo non esclude la malattia.

La diagnosi viene effettuata durante i periodi in cui è presente un'eruzione cutanea o un'eruzione cutanea. È nell'emissione di questi elementi infettivi che si cercano gli agenti causali della malattia.

Più efficiente, ma allo stesso tempo più costoso e analisi complessa– rilevazione dei treponemi dopo pretrattamento con anticorpi fluorescenti. Si tratta di sostanze che “si attaccano” ai microbi e formano un “bagliore” nel campo del microscopio.

La sensibilità dei metodi diminuisce con una lunga durata della malattia, con il trattamento di ulcere ed eruzioni cutanee con antisettici e anche dopo il trattamento.

Il metodo biologico per diagnosticare il RIT è altamente specifico, ma costoso e il risultato si ottiene solo attraverso per molto tempo quando un animale infetto sviluppa la malattia. Attualmente il metodo non è praticamente utilizzato, sebbene sia praticamente il più accurato di tutti. Un eccellente esame del sangue per la sifilide per rilevare il materiale genetico dei treponemi è la PCR. La sua unica limitazione è il costo relativamente elevato della diagnostica.

Metodi sierologici

Test non treponemici

RSKk e RMP

Il più famoso di questi test è la reazione di Wasserman. Questo è il modo diagnostica rapida(test rapido per la sifilide), basato su una reazione simile degli anticorpi del sangue di una persona malata ai treponemi stessi e alla cardiolipina ottenuta dal cuore bovino. Come risultato di questa interazione di anticorpi e cardiolipina, si formano dei fiocchi.

In Russia questa analisi praticamente non utilizzato. È stato sostituito dalla reazione di microprecipitazione. Lo svantaggio del metodo è la sua bassa specificità. Test falso positivo il sangue per la sifilide si verifica nella tubercolosi, nelle malattie del sangue, nel lupus eritematoso sistemico, durante la gravidanza, dopo la nascita di un bambino, durante il sanguinamento mestruale e in molti altri casi. Pertanto, con RW positivo, di più metodi precisi diagnostica

Dopo l'infezione, la reazione diventa positiva dopo due mesi. Con la sifilide secondaria è positivo in quasi tutti i pazienti.

La reazione di microprecipitazione, che ha sostituito la reazione di Wasserman, ha un meccanismo simile. È poco costoso, facile da implementare, veloce da valutare, ma può anche dare un risultato falso positivo. Questi due test vengono utilizzati come test di screening.

L'RMP diventa positivo un mese dopo la comparsa del ciclo. Per eseguirlo viene utilizzato il sangue di un dito.

Un test per la sifilide può essere sbagliato? Naturalmente sì, soprattutto quando si utilizzano test non treponemici.

Cause di campioni falsi positivi acuti quando si utilizza RMP:

• malattie infettive acute;
• polmonite;
• infarto miocardico;
• colpo;
• lesioni e avvelenamenti.

Risultati falsi positivi cronici si verificano spesso nelle seguenti malattie:

• tubercolosi;
• brucellosi;
• leptospirosi;
• sarcoidosi;
• malattie reumatiche;
• Mononucleosi infettiva;
• tumore maligno;
• diabete;
• cirrosi epatica e altri.

Se emergono test controversi, vengono utilizzati test sierologici treponemici per chiarire la diagnosi.

RPR e test del rosso di toluidina

Il test rapido della reagina plasmatica (test della sifilide rpr) è un altro tipo di reazione con l'antigene della cardiolipina. Viene utilizzato nei seguenti casi:

• screening della popolazione;
• sospetto di sifilide;
• esame del donatore.

Ricordiamo anche il test con il rosso di toluidina. Tutti questi metodi vengono utilizzati per valutare l'efficacia del trattamento. Sono semiquantitativi, cioè diminuiscono con la guarigione e aumentano con la recidiva dell'infezione.

I risultati negativi dei test non treponemici molto probabilmente indicano che il soggetto non ha la sifilide. Pertanto, per valutare la guarigione vengono utilizzati test non treponemici. La prima analisi di questo tipo dovrebbe essere effettuata 3 mesi dopo il completamento del ciclo di trattamento.

Test treponemici

I test treponemici si basano sull'uso di antigeni treponemici, che ne aumentano significativamente il valore diagnostico. Vengono utilizzati nelle seguenti situazioni:

• test di screening positivo (reazione di microprecipitazione);
• riconoscimento dei risultati di screening falsi positivi;
• sospetto di sifilide;
• diagnosi di forme latenti;
• diagnosi retrospettiva quando il paziente aveva precedentemente sofferto della malattia.

RIT e RIF

Le qualità più elevate (altamente sensibili e altamente specifiche) sono RIT e RIF. Gli svantaggi di questi metodi sono la complessità, il tempo e la necessità di attrezzature moderne e personale qualificato. Nella maggior parte dei pazienti guariti, i test treponemici rimangono positivi per molti anni e pertanto non possono essere utilizzati come criterio di guarigione.

Il RIF diventa positivo due mesi dopo l'infezione. Se è negativo il paziente è sano; se è positivo la probabilità di malattia è alta.

La RIT viene spesso utilizzata soprattutto in caso di risultati positivi del cancro della vescica per escludere o confermare la malattia. È altamente sensibile e consente di stabilire con grande precisione se un paziente ha la sifilide o meno. Tuttavia, il test diventa positivo solo tre mesi dopo l’infezione.

Immunoblot

L'immunoblotting è ancora più sensibile del RIF, ma meno sensibile dell'RPGA. Viene utilizzato raramente, principalmente per la diagnosi di sifilide nei neonati.

I metodi elencati non sono adatti per lo screening, cioè per l'individuazione rapida della malattia, perché diventano positivi più tardi della reazione di microprecipitazione.

ELISA e RPGA

Metodi standardizzati moderni e altamente informativi per la diagnosi della sifilide: ELISA e RPGA. Sono economici, installati rapidamente e testati in grandi quantità. Questi test possono essere utilizzati per confermare la diagnosi.

L'analisi RPGA diventa positiva con la sifilide sieropositiva primaria, cioè con la comparsa del sifiloma (un mese dopo l'infezione). È particolarmente utile nella diagnosi tardiva e forme congenite malattie. Tuttavia, per garantire l'accuratezza diagnostica, l'RPHA deve essere integrato da almeno un test non treponemico e uno treponemico. Questo triplo test è il test più affidabile per la sifilide. Svantaggio dell'RPGA: conservazione reazione positiva per un lungo periodo di tempo, il che non consente di utilizzare il test come criterio di guarigione.

Un test ELISA per la sifilide diventa positivo tre settimane dopo la malattia. Lo svantaggio dell'ELISA è che può essere falso. Una reazione falsa positiva si verifica quando malattie sistemiche, disturbi metabolici, così come nei bambini nati da madri malate.

Screpolatura metodi sierologici ha portato allo sviluppo dei metodi più avanzati che non danno errori, ma sono ancora costosi e usati raramente: la gascromatografia e la spettrometria di massa.

Algoritmo per la diagnosi dell'infezione sifilitica in diversi stadi

Nel periodo sieronegativo primario (fino a 2 mesi dopo l'infezione), la ricerca del treponema viene effettuata in campo oscuro o utilizzando anticorpi fluorescenti.

Per la sifilide primaria sieropositiva, secondaria e latente vengono utilizzati RMP ed ELISA e RPGA viene utilizzato come test di conferma.

Nei pazienti con recidive di sifilide secondaria, vengono esaminati gli elementi dell'eruzione cutanea, cercando di isolare da essi i treponemi per l'esame microscopico.

Nel periodo terziario, il cancro della vescica è negativo in un terzo dei pazienti. ELISA e RPGA sono positivi, ma potrebbero non indicare la sifilide terziaria, ma una malattia precedente. Un test debolmente positivo indica la guarigione piuttosto che la sifilide terziaria.

Quando si effettua una diagnosi di "sifilide congenita", vengono presi in considerazione la presenza della malattia nella madre, la differenza nei tassi di cancro al seno nella madre e nel bambino, l'ELISA positivo e l'RPGA nel neonato e l'immunoblotting.

Le donne incinte devono essere esaminate per la sifilide, soprattutto quelle che hanno già avuto un feto morto, una gravidanza non sviluppata o aborti precoci. Eseguono RMP, ELISA, RPGA. Vengono esaminati per la presenza della malattia prima di interrompere la gravidanza.

Regole per ottenere un test per la sifilide

Per ottenere un rinvio al laboratorio, è necessario visitare il proprio medico locale. Se si desidera sottoporsi al test più velocemente, è possibile farlo in un laboratorio privato senza prescrizione (ad esempio, i laboratori Invitro eseguono un test per la sifilide in modo rapido e anonimo).

Come fare il test per la sifilide? Il sangue viene donato al mattino, a stomaco vuoto. Puoi bere solo acqua pulita.

Preparazione: Due giorni prima del test, è necessario escludere dalla dieta cibi grassi e soprattutto alcol.

Come viene effettuata l'analisi? nel solito modo da un dito o da una vena ulnare.

Quanto tempo ci vuole per testare la sifilide? Il risultato del test è solitamente pronto il giorno successivo. La trascrizione può essere presa da un medico o da un laboratorio.

Per quanto tempo è valida l'analisi? Fino a tre mesi.

Analisi del liquido cerebrospinale

In alcuni casi, viene eseguito un test del liquido cerebrospinale per diagnosticare la neurosifilide.

Questo esame è prescritto a tutti i pazienti con sifilide latente se hanno segni di patologia del sistema nervoso, nonché con neurosifilide latente e tardiva.

Inoltre, l'analisi viene eseguita su tutti i pazienti dopo il recupero se mantengono reazioni sierologiche positive. Abbiamo già scritto nel nostro articolo che questo fenomeno accade abbastanza spesso.

Un'analisi del liquido cerebrospinale per la sifilide è prescritta ed eseguita solo da un medico.

Il liquido cerebrospinale si ottiene mediante puntura tra due vertebre regione lombare. Viene raccolto in 4 ml in due provette. Quindi il sito della puntura viene trattato con iodio e coperto con una benda sterile. Dopo la puntura il paziente deve giacere a pancia in giù con la pediera del letto sollevata per almeno 3-4 ore, poi può sdraiarsi su un fianco. Riposo a letto dopo la puntura è indicato per due giorni.

Il liquido cerebrospinale della prima provetta viene esaminato utilizzando reazioni generalmente accettate per il contenuto proteico, le cellule e la determinazione dei segni di meningite (infiammazione delle meningi).

Il liquido cerebrospinale della seconda provetta viene esaminato per il contenuto di anticorpi contro il treponema utilizzando la reazione Wasserman, RMP, RIF e RIBT, di cui abbiamo discusso sopra.

Secondo la gravità dei disturbi si distinguono quattro tipi di cambiamenti nel liquido cerebrospinale. Analizzandoli, il medico può trarre conclusioni sulla presenza di diverse forme di danno al sistema nervoso (neurosifilide vascolare, meningite sifilitica, sifilide meningovascolare, tabe dorsale, neurosifilide mesenchimale tardiva), nonché sulla guarigione del paziente con sierologia positiva test.

dimensione del font

ORDINE del Ministero della Salute dell'URSS del 09.02.85 1161 SUL MIGLIORAMENTO DELLA DIAGNOSI SIEROLOGICA DELLA SIFILIDE (insieme alle ISTRUZIONI PER... Rilevante nel 2018

Metodologia di impostazione RIF - ABS

Siero sanguigno testato

Il sangue per ottenere il siero sanguigno viene prelevato dalla vena antecubitale in una provetta pulita e asciutta in un volume di 5 ml e trattato allo stesso modo della reazione Wasserman. Il siero del sangue viene inattivato una volta alla temperatura di 56° per 30 minuti. Dato che RIF-abs è posizionato non sterile, non è necessario l'uso di contenitori sterili e il rispetto delle condizioni sterili durante la conservazione del siero sanguigno. È importante solo per una conservazione più lunga dei sieri prima del test.

Come antigene viene utilizzata una sospensione del ceppo patogeno di Treponema pallido Nichols derivante da un'orchite di coniglio di 7 giorni. I conigli maschi sani con risultati negativi al test Wasserman e al RIT vengono infettati per via intratesticolare e quando si verifica l'orchite, i treponemi pallidi vengono rimossi dai testicoli allo stesso modo in cui si ottiene l'antigene per il RIT. La sospensione risultante di treponema pallido viene versata dai pezzetti d'uovo in provette sterili con tappo di cotone e lasciata in frigorifero a 4°C per un giorno, dopodiché viene separata dal sedimento e conservata nelle stesse condizioni per tutto il periodo d'uso.

L'ottenimento e la conservazione dell'antigene richiede il rispetto di condizioni sterili, perché con lo stesso antigene la reazione può avvenire entro 2-4 mesi. Per l'antigene, è necessario scegliere una sospensione in cui non si osserva l'agglutinazione dei treponemi e ce n'è una quantità sufficiente. L'antigene può essere ottenuto in fiale da altri laboratori. Prima di ogni reazione, la sospensione viene mescolata bene ed esaminata al microscopio con condensatore a campo scuro per determinarne la densità. Per eseguire il RIF-abs è necessario disporre di una sospensione contenente 40-60 treponemi in campo visivo scuro; se è presente una sospensione più densa è necessario diluirla;

Come assorbente per RIF-abs, è possibile utilizzare l'antigene treponemico ad ultrasuoni per RBC, prodotto dall'impresa Kaunas per la produzione di preparati batterici del Ministero della Salute dell'URSS. È una sospensione di una miscela di colture di Treponema pallidum dei ceppi V, VII, VIII, IX e Reiter distrutti mediante ultrasuoni. Ciascuna serie di adsorbenti deve essere titolata prima dell'uso nei RIF-abs per scopi diagnostici.

Titolazione degli assorbenti

Gli adsorbenti vengono titolati sui sieri sanguigni di pazienti affetti da sifilide, fornendo un risultato nettamente positivo (4+) e debolmente (2+) nel RIF ad una diluizione di 1:5, nonché sui sieri sanguigni di individui esenti da sifilide. infezione sifilitica, che dà un risultato negativo nel RIF-5 e positività non specifica (2+ o più).

Un esempio di determinazione del titolo del sorbente

L'intero assorbente viene diluito con tampone fosfato, pH = 7,2, 2, 3, 4 volte o più. Prendere 3 sieri di sangue da pazienti affetti da sifilide, uno dei quali dà un risultato fortemente positivo (4+) in RIF-5, 2 - un risultato debolmente positivo (2+) e 5 sieri di sangue da persone esenti da infezione sifilitica, 3 dei quali fornire risultati non specifici e RIF-5 (2+ o più). Tutto il siero del sangue viene diluito 5 volte con un assorbente, diluito a sua volta 2, 3, 4 o più volte con tampone fosfato. Quindi il siero del sangue viene testato nella reazione. Dopo aver preso in considerazione i risultati, viene selezionata una diluizione dell'assorbente, alla quale i sieri di sangue assorbiti di pazienti affetti da sifilide mantengono un grado di positività simile a quello ottenuto con sieri di sangue diluiti con un tampone fosfato, e i sieri di sangue di persone libere dall'infezione sifilitica non producono splendore. Questa diluizione dell'assorbente è il suo titolo.

Il titolo dell'assorbente in questo caso era una diluizione di 1: 3, alla quale tutti i sieri di sangue di pazienti affetti da sifilide conservavano il grado di positività ottenuto nel controllo e, allo stesso tempo, la positività non specifica dei sieri di sangue non sifilitici è stato rimosso in modo affidabile.

Siero luminescente anti-specie

Per studiare i sieri di sangue umano nei RIF-abs, è necessario il siero di sangue marcato con fluorocromo di animali immunizzati con proteine ​​del siero umano. Il siero luminescente liofilizzato viene sciolto in condizioni sterili in acqua distillata nel volume indicato sull'etichetta delle fiale, versato in una provetta sterile con tappo in gomma e conservato a 4°C per 1-2 mesi durante l'uso.

Il giorno della reazione, la quantità necessaria di questo siero viene diluita per titolo con acqua distillata. La diluizione di lavoro del siero indicata sull'etichetta non è adatta per instaurare una reazione ai fini della sierodiagnosi della sifilide, pertanto il titolo di ciascuna serie deve essere determinato nuovamente.

Tabella N13

Risultati della titolazione del sorbente

Sieri di sangue testati	Risultati RIF-5
	Diluizione del siero sanguigno 1:5 con tampone (K)	Diluizione del siero sanguigno 1:5 con assorbente in diluizione
		1: 2	1: 3	1: 4
Siero sanguigno di un paziente affetto da sifilide
N1	4+	3+	4+	4+
N2	2+	1+	2+	2+
N3	2+		2+	2+
Siero sanguigno non sifilitico
N1	3+		1+	2+
N2	2/3+			2+
N3	2+			2+
N4	2+			2+
N5

Titolazione del siero luminescente anti-specie

Prendere 5 sieri di sangue di pazienti affetti da sifilide e 5 sieri di sangue di persone sane, diluirli 5 volte con un assorbente (tenendo conto del suo titolo) ed eseguire una reazione utilizzando nella fase II varie diluizioni di siero luminescente contro globuline sieriche umane della serie il cui titolo è in corso di determinazione. Va tenuto presente che il titolo dei sieri luminescenti attualmente prodotti dall'IEM prende il nome. N.F. Gamaleya, varia quando si imposta RIF-abs da 1: 100 a 1: 140. Quando si tiene conto della reazione, il titolo preliminare del siero luminescente deve essere considerato che la diluizione, se utilizzata con sieri di sangue positivi, un buon bagliore di treponemi è stato ottenuto e non è stata ricevuta la luminescenza negativa dell'antigene. Una diluizione del siero luminescente maggiore del titolo porta ad una diminuzione della sensibilità della reazione, mentre una diluizione minore porta ad una diminuzione della specificità. Dopo aver determinato il titolo preliminare, dovrebbe essere chiarito da Di più sieri di sangue positivi e negativi. Il titolo finale può essere considerato quello testato su 100 sieri di sangue e almeno 20 di essi dovrebbero provenire da pazienti affetti da sifilide.

Per evitare la germinazione, dopo aver diluito il siero luminescente secco con acqua distillata, è necessario aggiungere mortiolato in ragione di 1 volume della sua soluzione 1: 1000 a 9 volumi di siero luminescente. Quando si assumono nuove fiale della stessa serie, il titolo deve essere controllato e chiarito solo per 10 sieri di sangue ovviamente positivi e negativi.

Un esempio di determinazione preliminare del titolo di un siero antispecie luminescente

Vengono preparati 60 preparati, numerati da 1 a 60. Vengono prelevati 10 sieri di sangue: 5 da pazienti affetti da sifilide, 5 da persone sane. Tutto il siero del sangue viene diluito 5 volte con un assorbente titolato.

Sui farmaci numerati 1-10, 11-20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, nella fase I della reazione vengono applicati gli stessi 10 sieri sanguigni, diluiti 5 volte con assorbente. Nella fase II della reazione, il siero luminescente diluito 1:100 viene applicato a 1-10 farmaci, da 1:110 a 11-20, da 1:120 a 21-30, da 1:130 a 31-40, da 1 a 41-50 : 140, a 51-60 - 1: 150.

Tecnica per impostare RIF-abs

I preparati vengono preparati dall'antigene su vetrini sottili e ben sgrassati lato posteriore che vengono tracciati con un tagliavetro in cerchi con un diametro di 0,7 cm (10 cerchi su 1 vetrino). All'interno del cerchio viene applicata sul vetro una sospensione antigenica di Treponema pallidum. L'estremità sigillata di una pipetta Pasteur con un movimento circolare la sospensione viene distribuita all'interno del cerchio, essiccata all'aria e fissata per 10 minuti in acetone chimicamente puro. Quindi i farmaci vengono numerati. I sieri del sangue inattivato vengono diluiti 5 volte con un assorbente diluito per titolo con una soluzione tampone. In un rack vengono posizionate un certo numero di provette, il cui numero e numero corrisponde al numero e al numero dei sieri del sangue da analizzare. Pipettare 0,2 ml di assorbente diluito nelle provette, quindi aggiungere 0,05 ml di siero di sangue intero da analizzare e mescolare bene. Il siero del sangue può essere diluito utilizzando l'apparecchio Florinsky. Si applica siero di sangue diluito con un assorbente all'antigene in modo da coprire uniformemente lo striscio e i preparati vengono posti in una camera umida, chiusa con un coperchio e posta in un termostato a 37° per 30 minuti (fase I del la reazione). Dopo la prima fase, le preparazioni vengono accuratamente lavate in 2 porzioni di tampone fosfato, e le preparazioni vengono poste nella seconda porzione per 10 minuti, asciugate, dopodiché vengono nuovamente poste in camera umida, viene aggiunto un siero luminescente diluito al titolo applicato e lasciato a temperatura ambiente per 30 minuti (reazioni di fase II). Al termine della seconda fase, le preparazioni vengono lavate con tampone fosfato come sopra descritto, asciugate e sulla superficie degli strisci viene applicata una goccia di olio da immersione non luminescente (dimetilftalato).

L'esame dei preparati viene effettuato al microscopio a fluorescenza con una lampada al quarzo-mercurio DRSh-250 con sistema ad immersione, un oculare 4X o 5X, filtri SZS-7 o 14, FS-1. BS-8 e ZhS-18 o T-2N. La reazione viene presa in considerazione valutando la luminosità del Treponema pallidum. I sieri di sangue che danno una luminosità di 4+, 3+ e 2+ sono considerati positivi negli anticorpi RIF. Un brillante bagliore verde-giallo è classificato 4+, brillante - 3+, debole bagliore - 2+. I sieri di sangue che danno un bagliore di 1+ (i treponemi nel preparato sono colorati più intensamente rispetto allo sfondo) o che non lo danno sono considerati negativi.

In ogni configurazione RIF-abs, devono essere utilizzati i seguenti controlli:

Forte controllo positivo. Siero sanguigno di un paziente affetto da sifilide, che conferisce una luminescenza di 4+ se diluito 5 volte con tampone. Se diluito 5 volte con un assorbente, il siero del sangue non deve perdere il suo grado di positività di oltre 1+.

Controllo positivo debole. Siero di sangue intero o diluito di un paziente affetto da sifilide, che fornisce un debole grado di luminescenza dell'antigene pari a 2+ quando diluito 5 volte con tampone. Se diluito con un assorbente, la sua positività dovrebbe rimanere.

Controllo non specifico. Siero sanguigno non sifilitico, che dà una fluorescenza di almeno 2+ se diluito con un tampone. Se diluito con un assorbente, la sua positività dovrebbe essere eliminata.

I controlli dell'antigene, dell'assorbente e del siero luminescente possono essere installati solo quando si utilizzano nuove serie di questi ingredienti.

Metodologia per eseguire RIF-abs con sangue capillare

Il RIF-abs può essere eseguito non solo con siero sanguigno, ma anche con sangue prelevato da un dito. Questa modifica del RIF-abs può essere utilizzata quando si esaminano i bambini per la sifilide, quando è difficile ottenere il sangue da una vena negli adulti e durante l'esame di massa di varie popolazioni per la sifilide.

Quando si stadiano gli anticorpi RIF con sangue, vengono utilizzati gli stessi ingredienti di reazione utilizzati quando si stadiano gli anticorpi RIF con siero di sangue (antigene, assorbente, siero luminescente). Il titolo del siero luminescente viene determinato secondo lo schema sopra, ma quando si mette in scena una reazione con il sangue. Dopo aver forato il dito del paziente, il sangue da analizzare viene prelevato con una micropipetta fino alla tacca di 0,1 ml, soffiato rapidamente in una provetta contenente 0,3 ml di acqua distillata, mescolato accuratamente con una pipetta e filtrato attraverso un filtro di carta inumidito con acqua distillata. Una reazione con sangue diluito può essere eseguita il giorno stesso del prelievo oppure dopo 1-2 giorni, purché conservato a 4°C.

Immediatamente prima della reazione, a tutti i campioni di sangue inclusi nella reazione vengono aggiunti 0,1 ml di assorbente intero, miscelati con una pipetta e agitati e posti in un termostato a 37° per 30 minuti. Successivamente il sangue trattato con l'assorbente viene applicato sugli strisci antigenici e posto in una camera umida a 37° (fase 1 della reazione). Trascorso il periodo di esposizione, i preparati vengono lavati nella prima porzione di tampone fosfato in modo che non rimangano tracce di sangue sui vetrini e posti nella seconda porzione di tampone per 10 minuti. Dopo aver asciugato gli strisci, viene effettuata la fase II della reazione. In questo caso sui preparati viene applicato siero luminescente contro globuline umane, diluito secondo il titolo stabilito per questa modificazione del RIF. I bicchieri nella camera umida vengono nuovamente posti in un termostato a 37°.

Dopo 30 minuti, i vetrini vengono nuovamente lavati in 2 porzioni di tampone fosfato per 10 minuti, asciugati e montati per la microscopia a fluorescenza. Lo studio dei farmaci e la registrazione dei risultati della reazione vengono eseguiti allo stesso modo di quando si eseguono RIF-abs con siero sanguigno.

Metodologia per l'impostazione del RIF-200

Il metodo di impostazione del RIF-abs e del RIF-200 è simile. Quando si imposta RIF-200, l'elaborazione dei sieri del sangue da testare, la preparazione dell'antigene, la preparazione del siero luminescente anti-specie e la sua titolazione vengono eseguite allo stesso modo di quando si impostano RIF-abs. Va solo tenuto presente che i titoli del siero luminescente attualmente prodotto nel RIF-200 vanno da 1:20 a 1:50.

Tecnica per impostare RIF-200

I sieri del sangue da analizzare vengono diluiti 200 volte con tampone fosfato. Per fare ciò, nel supporto vengono posizionate 3 file di provette, il cui numero e numerazione in ciascuna fila corrisponde al numero e alla numerazione dei sieri di sangue testati nella cartella di lavoro. Nella prima fila vengono versati i sieri del sangue intero da analizzare, nella seconda fila vengono versati 0,45 ml di tampone nelle provette, nella terza - 0,95 ml di tampone. Nella seconda fila viene preparata una diluizione 10 volte del siero del sangue, per la quale da ciascuna provetta della prima fila vengono prelevati 0,05 ml del siero del sangue in esame con una pipetta graduata separata da 1 ml e trasferiti nella corrispondente provetta del la seconda riga e miscelato con il buffer ivi disponibile. Da ciascuna provetta della seconda fila, utilizzando la stessa pipetta, trasferire 0,05 ml del siero sanguigno in esame diluito 10 volte nella corrispondente provetta della terza fila e ottenere una diluizione pari a 200 volte.

Quando si imposta una reazione, i sieri del sangue in esame diluiti 200 volte vengono applicati ai farmaci posti in una camera umida in modo che i loro numeri indicati sulle provette corrispondano ai numeri sui vetrini. Dopo aver applicato il siero sanguigno ai preparati, la camera umida viene posta per 30 minuti in un termostato con una temperatura di 37° (I fase della reazione). Successivamente le preparazioni vengono lavate per 10 minuti in 2 porzioni di tampone ed essiccate. Successivamente vengono posti nuovamente in camera umida e su tutti viene applicato un siero luminescente diluito al titolo (fase II della reazione). La seconda fase viene condotta per 30 minuti a temperatura ambiente, dopodiché i preparati vengono lavati per 10 minuti, asciugati e montati per la microscopia a fluorescenza.

I risultati del RIF-200 vengono presi in considerazione allo stesso modo del RIF-abs.

Nel caso in cui i medici siano interessati al titolo di anticorpi fluorescenti nel siero del paziente, RIF-abs e RIF-200 devono essere somministrati con diluizioni seriali dei sieri del sangue analizzato e il titolo di anticorpi fluorescenti deve essere considerato la diluizione più alta di il siero del sangue che dà ancora un risultato di reazione positivo. È consuetudine denotare un titolo con un numero che caratterizza il grado di diluizione del siero del sangue in esame, ad esempio 5, 10, 20, 40, ecc. (RIF-abs) oppure 200, 400, 800, ecc. (RIF-200).

Quando si impostano entrambe le modifiche della reazione, per diluire i sieri del sangue da analizzare e per lavare i preparati dopo le fasi I e II è necessario utilizzare un tampone fosfato della seguente composizione: 1 litro di acqua distillata, 6,8 g di cloruro di sodio, 1,48 g di fosfato di sodio disostituito, 0,43 g di fosfato di potassio monosostituito (PH = 7,2). La soluzione preparata viene conservata a temperatura ambiente per non più di una settimana.

A causa della possibilità di ottenere risultati negativi in ​​presenza di anticorpi fluorescenti, il sangue e il siero non devono essere analizzati con RIF-abs e RIF-200 durante il trattamento di pazienti con penicillina.

Metodologia per l'impostazione dei RIF-ts

La diagnosi precoce dei danni al sistema nervoso dovuti alla sifilide è una questione urgente nella lotta contro questa malattia. Dato che il RIF-c è più sensibile di tutti gli altri test utilizzati per la diagnosi della sifilide nel liquido cerebrospinale, questa modifica del RIF può essere raccomandata per la diagnosi delle lesioni sifilitiche del sistema nervoso centrale in tutte le forme di sifilide.

Per testare RIF-c, viene utilizzato lo stesso antigene, il siero luminescente, utilizzato per testare RIF-abs e RIF-200 con siero sanguigno. Anche la determinazione degli anticorpi fluorescenti nel liquido cerebrospinale e nel siero del sangue e la registrazione della reazione sono simili.

Il liquido cerebrospinale viene introdotto nella reazione non inattivato e intatto. Prima che la reazione venga eseguita, può essere conservata nel congelatore del frigorifero in provette sotto tappi di gomma per un massimo di 2 settimane. Lo scongelamento viene effettuato a temperatura ambiente.

Tecnica per impostare RIF-ts

Nella fase I della reazione all'antigene vengono applicati 0,05 ml di liquido cerebrospinale di prova non diluito, i preparati vengono posti in una camera umida per 30 minuti a temperatura ambiente. Successivamente vengono lavati con tampone fosfato, pH = 7,2, per 10 minuti ed essiccati. Nella fase II, ai preparati viene applicato un siero luminescente diluito, che viene titolato quando si instaura una reazione con il liquido cerebrospinale. I preparati vengono mantenuti a temperatura ambiente per 30 minuti in una camera umida, lavati, asciugati e montati per la microscopia a fluorescenza.

Fonti di errori

1. Mancato rispetto delle condizioni di preparazione, conservazione dei reagenti e impostazione della reazione.

2. Bassa qualità del siero luminescente e determinazione imprecisa del suo titolo.

3. Applicazione del materiale di prova o del siero luminescente quando si imposta una reazione non al farmaco, ma all'altro lato del vetrino.

4. Impostazione errata dell'illuminazione nel microscopio a fluorescenza.

5. Bassa qualità dell'antigene.