L'esecuzione dell'analisi PCR (diagnostica PCR) inizia con la raccolta di materiale per l'esame da parte di un ginecologo, urologo o dermatovenerologo. La qualità e l'affidabilità dei risultati ottenuti successivamente sono garantite dalle più alte qualifiche e dalla vasta esperienza dei medici del centro medico Euromedprestige, che rispettano tutte le regole necessarie effettuando la PCR- analisi: completa sterilità, utilizzo solo di materiali monouso.

Il materiale raccolto dalla spazzola viene posto in un contenitore con soluzione salina. Dopo la raccolta, i campioni devono essere consegnati al laboratorio PCR il prima possibile.

L’analisi PCR viene effettuata in laboratorio in tre fasi:

1. Estrazione del DNA
2. Amplificazione di frammenti di DNA
3. Rilevazione dei prodotti di amplificazione del DNA

L'estrazione del DNA è la fase iniziale della diagnostica PCR, la cui essenza è la seguente: il medico prende il materiale per la ricerca dal paziente e lo sottopone a un'elaborazione speciale. Durante l'elaborazione, la doppia elica del DNA viene divisa in singoli filamenti. Al materiale del paziente viene aggiunto un liquido speciale che dissolve le sostanze organiche che interferiscono con la “purezza” della reazione. Questo rimuove lipidi, aminoacidi, peptidi, carboidrati, proteine ​​e polisaccaridi. Di conseguenza, si forma DNA o RNA.

Il principio del metodo PCR è la “costruzione” di nuove infezioni a DNA o RNA. Ciò non può essere fatto senza rimuovere il materiale cellulare.

La quantità di tempo dedicata all'estrazione del DNA dipende dall'agente eziologico dell'infezione e dal tipo di materiale utilizzato per la ricerca sulla PCR. Ad esempio, sono necessarie 1,5-2 ore per preparare il sangue per la fase successiva.

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Amplificazione del DNA

Per eseguire la fase successiva della diagnostica del DNA - l'amplificazione del DNA - i medici utilizzano le cosiddette matrici di DNA - molecole di DNA di infezioni, sulle quali successivamente avverrà la "clonazione" del DNA. Si è già detto che non è necessaria la presenza del DNA completo dell'infezione; per realizzare questa fase è sufficiente un piccolo frammento della molecola di DNA, caratteristica solo di un dato microbo (infezione).

La base dell'amplificazione del DNA e, di conseguenza, la base dell'intero principio della reazione PCR è il processo naturale di completamento del DNA per tutti gli esseri viventi: la replicazione del DNA, che viene effettuata raddoppiando una singola catena di DNA.

Partendo da un singolo frammento di DNA, il medico di laboratorio lo copia e aumenta il numero di copie in una modalità di reazione a catena: dopo il primo ciclo si hanno già 2 frammenti, dopo il secondo ciclo - 4, dopo il terzo - 8, dopo il quarto - 16, poi 32 , 64, 128, 256... Ad ogni ciclo il numero di copie raddoppia, e dopo venti cicli il conteggio arriva già a milioni, e dopo trenta a miliardi. Il ciclo dura pochi minuti e si riduce a un certo cambiamento di temperatura in un reattore chimico molto piccolo. Qui, nella soluzione, sono presenti in quantità sufficiente tutti i componenti necessari alla sintesi, primi fra tutti i nucleotidi A, G, T e C, e vengono effettuate anche delicate operazioni chimiche preparatorie affinché da ciascuno venga immediatamente prelevata una copia esatta segmento di DNA finito, quindi da questa copia - ancora una copia, questa è la reazione a catena ramificata.

Attaccando i primer alla catena del DNA – “pezzi” di DNA sintetizzati artificialmente (coppie nucleotidiche) simili al DNA dei microbi (infezioni) – si formano due corte eliche costituite da due filamenti di sezioni di DNA, necessarie per la sintesi di futuri DNA.

La sintesi di una nuova catena avviene completando ciascuno dei due filamenti di DNA. Il processo di amplificazione avviene con l'aiuto di una regione specifica: la DNA polimerasi, che dà il nome al metodo di laboratorio. La polimerasi agisce come catalizzatore per la reazione e monitora l'attaccamento sequenziale delle basi nucleotidiche al nuovo filamento di DNA in crescita.

Pertanto, l'amplificazione del DNA è un aumento multiplo del numero di copie di DNA che sono specifiche, cioè inerenti solo a un determinato organismo. Non è necessario completare l'intera catena del DNA per vedere l'agente infettivo. È necessaria solo l'area caratteristica di un dato batterio come individuo.

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Tutte le fasi di amplificazione altamente ripetitive avvengono a temperature diverse. Per eseguire l'analisi PCR, viene utilizzata un'apparecchiatura appositamente programmabile - PCR - termostato o amplificatore, che modifica automaticamente la temperatura. L'amplificazione viene eseguita secondo un determinato programma corrispondente al tipo di infezione rilevata. A seconda del programma e del tipo di infezione rilevata, il processo PCR automatizzato dura dalle 2 alle 3 ore.

Le qualifiche del medico di laboratorio che esegue l'analisi svolgono un ruolo importante nella diagnostica della PCR; da lui dipendono la corretta impostazione dell'apparecchiatura PCR e l'interpretazione dei risultati. I medici del Centro medico Euromedprestige hanno una vasta esperienza nella conduzione della diagnostica del DNA, che garantisce l'affidabilità dei risultati della ricerca e garantisce il successo positivo nel trattamento malattie infettive. Sottoporsi al test utilizzando il metodo PCR e condurre diagnostica completa e cura delle malattie infettive nel ns centro medico"Euromedprestigio".

Durante la rilevazione dei prodotti di amplificazione, la miscela risultante di prodotti di amplificazione viene separata. Alla miscela vengono aggiunte soluzioni speciali che conferiscono ai frammenti di DNA la capacità di fluorescenza, riflessa in strisce luminose rosso-arancio. Il bagliore risultante indica la presenza di DNA di virus, microbi o batteri nel materiale prelevato dal paziente per l'analisi PCR.

GOU VPO "Accademia medica statale di Krasnoyarsk"

intitolato all'Agenzia federale Yasenetsky per la salute e lo sviluppo sociale »

Dipartimento di Genetica Medica e Neurofisiologia Clinica IPO

PRINCIPI FONDAMENTALI DEL METODO

REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI

Kit di strumenti per studenti di 3-4 anni

nelle specialità di medicina generale (060101) e

Krasnojarsk – 2007

Schneider, N. A., Butyanov, R. A. Principi di base del metodo di reazione a catena della polimerasi. Manuale metodologico per il lavoro extracurriculare degli studenti di 3-4 anni nelle specialità di medicina generale (060101) e pediatria (060103). – Krasnoyarsk: Casa editrice dell'Istituto statale di istruzione professionale superiore KrasSMA, 2007. – 42 p.

Il manuale metodologico è pienamente conforme ai requisiti della norma statale (2000) e ne riflette gli aspetti principali metodo moderno diagnostica malattie ereditarie umano – metodo della reazione a catena della polimerasi, materiale didattico adattato tecnologie educative tenendo conto delle specificità della formazione in 3-4 anni delle facoltà di medicina e pediatria.

Revisori: Capo del Dipartimento di Genetica Medica, Istituto statale di istruzione professionale superiore

"Università medica statale di Novosibirsk dell'Agenzia federale per la salute e sviluppo sociale", Dottore in Scienze Mediche, Professore;

replicazione del DNA

L'oggetto di studio di questo metodo è l'acido desossiribonucleico (DNA). Il DNA è il vettore universale dell'informazione genetica in tutti gli organismi esistenti sulla Terra (ad eccezione dei microrganismi contenenti RNA). Il DNA è un doppio filamento attorcigliato ad elica. Ogni filamento è costituito da nucleotidi collegati in sequenza. I filamenti di DNA hanno direzioni opposte: l'estremità da 5" di un filamento corrisponde all'estremità da 3" del secondo filamento. Immobile unico Il DNA è la sua capacità di raddoppiarsi. Questo processo si chiama replica. La replicazione della molecola di DNA avviene durante il periodo sintetico dell'interfase. Ciascuna delle due catene della molecola “madre” funge da modello per la “figlia”. Dopo la replicazione, la molecola di DNA appena sintetizzata contiene un filamento “madre” e il secondo è un filamento “figlia” appena sintetizzato (metodo semi-conservativo). Per sintesi della matrice Affinché si formi una nuova molecola di DNA, la vecchia molecola deve essere avvolta e allungata. La replicazione inizia in diversi punti della molecola del DNA. Viene chiamata la sezione di una molecola di DNA dal punto iniziale di una replicazione al punto iniziale di un'altra replicone.

L'avvio della replica è attivato primer(primer) costituiti da 100-200 coppie di nucleotidi. L'enzima DNA elicasi svolge e divide l'elica del DNA madre in due filamenti, sui quali, secondo il principio di complementarità, con la partecipazione dell'enzima DNA polimerasi, vengono assemblati i filamenti di DNA “figlia”. Affinché l'enzima possa iniziare il suo lavoro, è necessaria la presenza di un blocco di partenza: un piccolo frammento iniziale a doppio filamento. Il blocco di partenza è formato dall'interazione del primer con la regione complementare del filamento corrispondente del DNA genitore. In ciascun replicone, la DNA polimerasi può muoversi lungo il filamento “madre” in una sola direzione (5`=>3`).

Sul filo principale, man mano che il replicone si svolge, un filo “figlia” cresce gradualmente in modo continuo. Sul filamento ritardato, anche il filamento figlia si sintetizza nella direzione (5`=>3`), ma in frammenti separati man mano che il replicone si svolge.

Pertanto, l'aggiunta di nucleotidi complementari dei filamenti “figlia” avviene in direzioni opposte (antiparallele). La replica in tutti i repliconi avviene simultaneamente. Frammenti e parti di filamenti “figli” sintetizzati in diversi repliconi vengono cuciti in un unico filamento dall'enzima ligasi. La replicazione è caratterizzata da semi-conservatività, antiparallelismo e discontinuità. L'intero genoma di una cellula viene replicato una volta durante un periodo di tempo corrispondente a un ciclo mitotico. Come risultato del processo di replicazione, da una molecola di DNA si formano due molecole di DNA, in cui un filamento proviene dalla molecola di DNA madre e il secondo, figlia, appena sintetizzata (Fig. 1).

Riso. 1. Schema di replicazione della molecola di DNA.

Pertanto, il ciclo di replicazione del DNA include tre fasi principali:

1. svolgimento dell'elica del DNA e divergenza dei filamenti (denaturazione);

2. fissaggio dei primer;

3. completare la catena del thread figlio.

Principio del metodo PCR

È la replicazione del DNA che costituisce la base della PCR. Nella PCR, i processi di cui sopra vengono eseguiti in una provetta in modalità ciclica. Il passaggio da uno stadio di reazione all'altro si ottiene modificando la temperatura della miscela di incubazione. Quando la soluzione viene riscaldata a 93-95°C, avviene la denaturazione del DNA. Per procedere alla fase successiva - l'aggiunta o la "ricottura" dei primer - la miscela di incubazione viene raffreddata a 50-65°C. Successivamente, la miscela viene riscaldata a 70-72°C - la temperatura ottimale per la taq-DNA polimerasi - in questa fase avviene la costruzione di un nuovo filamento di DNA. Quindi il ciclo si ripete di nuovo. In altre parole il metodo PCR prevede un aumento multiplo del numero di copie (amplificazione) una sezione specifica di DNA catalizzata dall'enzima DNA polimerasi.

La crescita dei filamenti di DNA figlia deve avvenire simultaneamente su entrambi i filamenti del DNA materno, quindi anche la replicazione del secondo filamento richiede il proprio primer. Pertanto, alla miscela di reazione vengono aggiunti due primer: uno per la catena “+”, il secondo per la catena “-”. Essendo attaccati ai filamenti opposti della molecola di DNA, i primer si limitano alla parte di essa che verrà successivamente duplicata o amplificata molte volte. La lunghezza di un tale frammento, chiamato amplicone, è solitamente di diverse centinaia di nucleotidi.

Fasi della PCR

Ogni ciclo di amplificazione comprende 3 fasi, che si verificano a diverse condizioni di temperatura (Fig. 2).

· Fase 1: Denaturazione del DNA . Si verifica a 93-95° per 30-40 secondi.

· Fase 2: ricottura del primer . L'attacco dei primer avviene in modo complementare alle sequenze corrispondenti sui filamenti opposti del DNA ai confini di una regione specifica. Ogni coppia di primer ha una propria temperatura di ricottura, i cui valori sono compresi tra 50 e 65°C. Tempo di ricottura 20-60 sec.

· Fase 3: completamento delle catene di DNA Il completamento complementare delle catene di DNA avviene dall'estremità da 5" all'estremità da 3" della catena in direzioni opposte, a partire dai siti di attacco dei primer. Il materiale per la sintesi di nuove catene di DNA sono i trifosfati desossiribonucleosidici aggiunti alla soluzione. Il processo di sintesi è catalizzato dall'enzima taq polimerasi e avviene ad una temperatura di 70-72°C. Il tempo di sintesi è di 20-40 secondi.

Le nuove catene di DNA formate nel primo ciclo di amplificazione fungono da modelli per il secondo ciclo di amplificazione, in cui si forma uno specifico frammento di amplicone di DNA (Fig. 3). Nei successivi cicli di amplificazione, gli ampliconi fungono da modello per la sintesi di nuove catene.

Pertanto, l'accumulo di ampliconi nella soluzione avviene secondo la formula 2", dove n è il numero di cicli di amplificazione. Pertanto, anche se la soluzione iniziale inizialmente conteneva solo una molecola di DNA a doppio filamento, quindi in 30-40 cicli circa Nella soluzione si accumulano 108 molecole di amplicone, una quantità sufficiente per un rilevamento visivo affidabile di questo frammento mediante elettroforesi su gel di agarosio.

Il processo di amplificazione viene effettuato in uno speciale cronotermostato ( termociclatore), che, secondo un determinato programma, modifica automaticamente la temperatura in base al numero di cicli di amplificazione.

Per effettuare l'amplificazione sono necessari i seguenti componenti:

· Matrice del DNA(DNA o parte di esso contenente il frammento specifico desiderato);

· Primer(oligonucleotidi sintetici (20-30 coppie di nucleotidi), complementari alle sequenze di DNA ai confini del frammento specifico da determinare). La scelta di un frammento specifico e la selezione dei primer svolgono un ruolo fondamentale nella specificità dell'amplificazione, che influisce sulla qualità dell'analisi.

· Miscela di trifosfati deossinucleotidici (dNTP)(una miscela di quattro dNTP, che costituiscono il materiale per la sintesi di nuove catene di DNA complementari in concentrazioni equivalenti di 200-500 µM)

· EnzimaTaq-polimerasi(DNA polimerasi termostabile che catalizza l'allungamento delle catene di primer mediante aggiunta sequenziale di basi nucleotidiche alla catena in crescita del DNA sintetizzato, 2-3 mM).

· Soluzione tampone(mezzo di reazione contenente ioni Mg2+ necessari per mantenere l'attività enzimatica, pH 6,8-7,8).

Per identificare regioni specifiche del genoma dei virus a RNA, una copia del DNA viene prima ottenuta da uno stampo di RNA utilizzando una reazione di trascrizione inversa (RT) catalizzata dall'enzima revertasi (trascrittasi inversa).

Riso. 2. Amplificazione (1° ciclo).

Riso. 3. Amplificazione (2° ciclo).

Principali applicazioni della PCR

· medicina Clinica:

o diagnosi di infezioni,

o identificazione di mutazioni, compresa la diagnosi di malattie ereditarie,

o genotipizzazione, inclusa la genotipizzazione HLA,

o tecnologie cellulari

· ecologia (come modo per monitorare la condizione e la qualità degli oggetti ambientali e dei prodotti alimentari)

· determinazione di organismi transgenici (OGM)

Identificazione personale, accertamento della paternità, analisi forense

· biologia generale e specifica,

Principi di base

organizzazione dei laboratori diagnostici

Il lavoro nel laboratorio PCR viene svolto in conformità con le “Regole di progettazione, precauzioni di sicurezza, igiene industriale, regime antiepidemico e igiene personale quando si lavora nei laboratori (dipartimenti, dipartimenti) di istituzioni sanitarie ed epidemiologiche del sistema sanitario.

Contaminazione dei campioni di DNA

L'esecuzione della diagnostica PCR è associata a un problema dovuto all'elevata sensibilità del metodo: la possibilità contaminazione. L'ingresso di tracce di DNA positivo nella provetta di reazione (prodotti specifici di amplificazione del DNA - ampliconi; standard di DNA utilizzato come controllo positivo; DNA positivo da un campione clinico) porta all'amplificazione di uno specifico frammento di DNA durante la PCR e, di conseguenza , alla comparsa di risultati falsi positivi.

Nel processo di lavoro potresti incontrare due tipi di contaminazione:

1. contaminazione incrociata da campione a campione (durante l'elaborazione di campioni clinici o quando si scioglie la miscela di reazione), portando a sporadici risultati falsi positivi;

2. contaminazione con prodotti di amplificazione(ampliconi) avere valore più alto, perché durante il processo PCR gli ampliconi si accumulano in grandi quantità e sono prodotti ideali per la riamplificazione.

La contaminazione di vetreria, pipette automatiche e attrezzature di laboratorio, la superficie dei banchi di laboratorio o anche la superficie della pelle degli operatori di laboratorio con tracce di ampliconi porta a risultati sistematicamente falsi positivi. Determinare la fonte di contaminazione può essere molto difficile e richiede un notevole investimento di tempo e denaro. L'esperienza finora maturata nei laboratori che utilizzano il metodo PCR per la diagnostica ci consente di formulare i requisiti di base per l'organizzazione di tali laboratori e la conduzione delle analisi stesse. Il rispetto di questi requisiti elimina la possibilità di contaminazione e risultati falsi positivi.

Fasi dell'analisi PCR

Vengono separati geograficamente posizionandoli in stanze separate (Fig. 4, 5):

· Sala pre-PCR, dove si processano i campioni clinici, si isola il DNA, si prepara una miscela di reazione per la PCR e si esegue la PCR (se sussistono le condizioni, si consiglia di eseguire anche le ultime due fasi in un'ulteriore stanza separata). In questi locali è vietato svolgere tutti gli altri tipi di lavoro con agenti di test, la cui diagnostica PCR viene eseguita in questo laboratorio.

· Sala post-PCR, dove viene effettuato il rilevamento dei prodotti di amplificazione. In questa stanza possono essere utilizzati altri metodi di rilevamento. Si consiglia di posizionare la sala di rilevamento del prodotto di amplificazione il più lontano possibile dalle sale pre-PCR.

I laboratori sono dotati di lampade ultraviolette con una radiazione massima nella regione di 260 nm (tipo DB-60) con una potenza di 2,5 W per 1 m3. Le lampade sono posizionate in modo che le superfici dei tavoli di lavoro, delle attrezzature e dei materiali con cui l'operatore entra in contatto durante l'analisi PCR siano esposte all'irradiazione diretta. L'irradiazione viene effettuata entro 1 ora prima dell'inizio del lavoro ed entro 1 ora dopo la fine del lavoro.

I medici di laboratorio lavorano con indumenti speciali da laboratorio, che vengono cambiati quando si spostano da una stanza all'altra, e con guanti monouso. I vestiti di stanze diverse vengono elaborati separatamente. Diversi dipendenti lavorano in diverse fasi dell'analisi PCR.

Per il lavoro vengono utilizzati set separati di dispenser, plastica e vetreria, attrezzature da laboratorio, camici e guanti, destinati alle varie fasi di analisi e non trasportabili da una stanza all'altra. Attrezzature, materiali e forniture presenti in ogni locale sono opportunamente segnalati.

Tutte le fasi del lavoro vengono eseguite solo utilizzando materiali di consumo usa e getta: puntali per pipette automatiche, provette, guanti, ecc. Assicurati di cambiare puntali quando ti sposti da un campione all'altro. È necessario utilizzare puntali con un filtro, una barriera antiaerosol per impedire l'ingresso di microgoccioline della soluzione nella pipetta. Tubi e puntali usati vengono scartati in contenitori speciali o contenitori contenenti soluzione disinfettante. I campioni clinici vengono conservati separatamente dai reagenti.

Per la lavorazione e la pulizia degli ambienti di lavoro, ogni locale è dotato di tamponi di garza di cotone (salviette), pinzette, soluzioni disinfettanti e inattivanti.

Dal laboratorio diagnostico PCR sono esclusi i lavori relativi alla produzione (clonazione) e all'isolamento di plasmidi ricombinanti contenenti sequenze di DNA o frammenti di geni di agenti patogeni diagnosticati in questo laboratorio.

Raccolta di materiale clinico

Il materiale da studiare per la PCR può essere raschiato di cellule epiteliali, sangue, plasma, siero, liquidi pleurici e cerebrospinali, urina, espettorato, muco e altre secrezioni biologiche, biopsie.

Il materiale viene raccolto in una sala di trattamento del profilo appropriato. Dopo la raccolta, i campioni devono essere consegnati al laboratorio diagnostico PCR il prima possibile.

I campioni devono essere prelevati utilizzando strumenti sterili, preferibilmente monouso, esclusivamente in provette di plastica sterili monouso o provette di vetro, pretrattate per un'ora con una miscela di cromo, lavate accuratamente con acqua distillata e calcinate in armadio di essiccazione alla temperatura di 150°C. per 1 ora.

Zona di rilevamento (un altro piano o un altro edificio).

Riso. 4. Dispositivo da laboratorio per PCR con rilevamento mediante elettroforesi.

Zona di rilevamento (un altro piano o un altro edificio)

Riso. 5. Dispositivo da laboratorio per PCR con rilevamento fluorescente (analisi quantitativa).

Riso. 6. Sala di estrazione del DNA. Viene mostrata una scatola da tavolo con una lampada germicida.

Riso. 7. Sala di amplificazione.

Riso. 8. Sala di rilevamento.

Riso. 9. Prelievi di sangue per la diagnostica del DNA di malattie ereditarie.

Conservazione e trasporto dei campioni

Per diagnosticare le malattie ereditarie, i campioni di sangue vengono conservati per lungo tempo su speciali moduli cartacei o in epindorf (tubi di plastica) allo stato congelato (Fig. 9).

Per diagnosticare le malattie infettive, i campioni vengono conservati a temperatura ambiente per non più di 2 ore. Se è necessaria una conservazione più lunga, i campioni possono essere collocati in frigorifero a una temperatura di 2-8°C per un periodo non superiore a un giorno. Una conservazione più lunga (fino a 2 settimane) è consentita congelata nel congelatore a una temperatura di meno 20°C. Non è consentito il congelamento e lo scongelamento ripetuto dei campioni.

Se il laboratorio diagnostico PCR e la sala procedurale per il campionamento sono geograficamente separati, il trasporto dei campioni deve essere effettuato in thermos o contenitori termici in conformità con le regole per la conservazione dei campioni e le regole per il trasporto di materiali infetti.

Estrazione del DNA da campioni

Si è diffuso il metodo di assorbimento in fase solida, che consiste nell'aggiunta di un agente di lisi contenente una soluzione di guanidina, assorbimento del DNA su un assorbente, lavaggi ripetuti e riassorbimento del DNA con una soluzione tampone. Quando si processano siero, plasma o sangue intero, viene solitamente utilizzato il metodo di estrazione con fenolo. Il metodo prevede la deproteinizzazione con fenolo/cloroformio seguita dalla precipitazione del DNA (o RNA) con etanolo o isopropanolo. La lavorazione viene effettuata in provette per microcentrifuga Eppendor P con un volume di 1,5 ml. Il tempo di lavorazione è di 1,5-2 ore (Fig. 10).

Riso. 10. Estrazione del DNA.

Esecuzione della PCR

Una certa quantità di campione dal campione clinico trattato viene trasferita in una speciale provetta per microcentrifuga del tipo Eppendorf con un volume di 0,2 o 0,5 ml, alla quale viene aggiunta una miscela di amplificazione composta da acqua, tampone PCR, soluzione dNTP, soluzione di primer e soluzione. stessa provetta. Taq polimerasi (aggiunta alla miscela per ultima). Tipicamente, il volume della miscela di reazione è 25 µl. Quindi viene aggiunta una goccia di olio minerale a ciascuna provetta per prevenire l'evaporazione della miscela di reazione durante il processo di amplificazione. le provette vengono trasferite a un termostato programmabile (amplificatore), dove l'amplificazione viene eseguita automaticamente secondo un determinato programma (Fig. 11).

Riso. undici. Amplificatore" Termociclatore ».

Il tempo di reazione, a seconda del programma specificato, è di 2-3 ore. Parallelamente ai campioni sperimentali, vengono posizionati i campioni di controllo: il controllo positivo comprende tutti i componenti della reazione, ma al posto del materiale campione clinico viene aggiunta una preparazione di DNA di controllo del gene in studio. Il controllo negativo comprende tutti i componenti della reazione, ma al posto del materiale clinico o della preparazione del DNA viene aggiunta una quantità adeguata di acqua deionizzata o un estratto che non contiene il DNA da testare. Il controllo negativo è necessario per verificare l'assenza di DNA dovuta a contaminazione nei componenti della reazione e per escludere risultati falsi positivi.

Registrazione dei risultati

Il frammento di DNA specifico amplificato viene rilevato mediante elettroforesi su gel di agarosio in presenza di bromuro di etidio. Il bromuro di etidio forma un composto interstiziale stabile con frammenti di DNA, che appare sotto forma di bande luminose quando il gel viene irradiato con radiazioni UV con una lunghezza d'onda di 290-330 nm. A seconda della dimensione degli ampliconi formatisi in seguito alla PCR, viene utilizzato un gel con un contenuto di agarosio compreso tra 1,5% e 2,5%. Per preparare un gel di agarosio, una miscela di agarosio, tampone e acqua viene sciolta in un forno a microonde o a bagnomaria e viene aggiunta una soluzione di bromuro di etidio. La miscela, raffreddata a 50-60°C, viene versata nello stampo in uno strato di 4-6 mm di spessore e, mediante appositi pettini, vengono ricavate delle tasche nel gel per l'applicazione del campione. I pettini sono installati in modo tale che tra il fondo dei pozzetti e la base del gel rimanga uno strato di agarosio di 0,5-1 mm. Dopo che il gel si è indurito, l'amplificatore viene applicato alle tasche in una quantità di 5-15 μl. Si consiglia di eseguire l'elettroforesi di una miscela di marcatori di lunghezza dei frammenti di DNA in parallelo con i campioni di controllo e sperimentali. Tipicamente, una tale miscela contiene dieci frammenti di DNA di lunghezza 100, 200, 300, ecc. paia di basi.

L'utilizzo di tale test consente di verificare la lunghezza degli ampliconi nei campioni di controllo e sperimentali. Il gel con il campione applicato viene trasferito in una camera per elettroforesi riempita di tampone, la camera è collegata a una fonte di alimentazione e la separazione elettroforetica dei prodotti di amplificazione viene effettuata per 30-45 minuti con un'intensità del campo elettrico di 10-15 V/ cm. In questo caso il fronte del colorante compreso nella miscela di reazione deve percorrere almeno 3 cm.

Una volta completata l'elettroforesi, il gel viene trasferito su un transilluminatore di vetro e osservato sotto la luce ultravioletta. Per la documentazione, il gel viene fotografato su pellicola Micrat 300 o registrato utilizzando un sistema video collegato a un computer.

Innanzitutto vengono valutati i campioni di controllo. Nella traccia elettroforetica corrispondente al controllo positivo deve essere presente una banda arancione luminosa. La sua mobilità elettroforetica deve corrispondere alla lunghezza dell'amplicone specificata nelle istruzioni.

Nella traccia elettroforetica corrispondente al controllo negativo tale banda dovrebbe essere assente. La presenza di tale banda nel controllo negativo indica contaminazione - contaminazione dei reagenti utilizzati con il DNA o l'amplicone del test. I campioni di prova vengono valutati dalla presenza di una banda nella traccia corrispondente, che si trova allo stesso livello della banda nel campione di controllo positivo. L'intensità della banda corrisponde alla quantità di DNA analizzato nel campione, che consente una valutazione semiquantitativa della PCR. In genere, i risultati positivi vengono valutati su una scala a quattro punti. Se la luminosità della banda nel campione di prova è molto debole, è necessario riorganizzare tale campione (Fig. 12).

Riso. 12. Elettroforesi su gel di agarosio.

Applicazioni della PCR perdiagnostica delle mutazioni puntiformi e dei polimorfismi genici

Uno dei principali ambiti di applicazione della PCR nella pratica sanitaria è la diagnosi di mutazioni puntiformi e polimorfismi genici . Esistono metodi diretti e indiretti di diagnostica del DNA. Nelle situazioni in cui è noto un gene, il cui danno porta allo sviluppo di una malattia ereditaria, questo danno può essere rilevato mediante metodi di genetica molecolare. Tali metodi sono chiamati diretti. Utilizzando metodi diretti, vengono rilevate irregolarità nella sequenza nucleotidica primaria del DNA (mutazioni e loro tipi). I metodi diretti sono caratterizzati da una precisione che raggiunge quasi il 100%.

Tuttavia, nella pratica, questi metodi possono essere utilizzati a determinate condizioni:

· con localizzazione citogenetica nota del gene responsabile dello sviluppo di una malattia ereditaria;

· è necessario clonare il gene patogeno e conoscerne la sequenza nucleotidica.

Lo scopo della diagnostica diretta del DNA è identificare gli alleli mutanti.

Pertanto, in situazioni in cui è noto quale tipo di danno al DNA porta a una malattia ereditaria, il frammento di DNA contenente il danno viene esaminato direttamente, cioè viene utilizzato il metodo diagnostico diretto del DNA.

Tuttavia, ad oggi, i geni di molte malattie non sono stati mappati, la loro organizzazione esone-introne è sconosciuta e molte malattie ereditarie sono caratterizzati da una pronunciata eterogeneità genetica, che non consente il pieno utilizzo dei metodi diagnostici diretti sul DNA. Pertanto, nei casi in cui la localizzazione del danno è sconosciuta, viene utilizzato un altro approccio, legato allo studio della vicinanza del gene responsabile della malattia genetica, in combinazione con l'analisi familiare, cioè metodi indiretti di diagnosi genetica molecolare di vengono utilizzate le malattie ereditarie.

Può essere utilizzato per rilevare mutazioni puntiformi e piccole delezioni vari modi, tuttavia, si basano tutti sull'uso del metodo PCR. Questa reazione consente di moltiplicare più volte la sequenza nucleotidica del DNA e quindi di cercare le mutazioni. Si basano sui metodi per la ricerca di frammenti di DNA portatori di mutazioni analisi comparativa sequenze nucleotidiche del DNA mutanti e normali.

Analisi dei prodotti della PCR

nel processo di diagnostica diretta del DNA

Implica lo studio di caratteristiche specifiche della regione del gene amplificato. Pertanto, nelle malattie causate dall'espansione delle ripetizioni trinucleotidiche, i prodotti di amplificazione differiscono nella loro lunghezza (riflettendo il diverso numero di triplette nella regione del gene studiato) e, di conseguenza, nella loro velocità di movimento nel gel. Grazie a ciò si ottiene una chiara separazione elettroforetica degli alleli normali e mutanti e una determinazione accurata di un frammento patologicamente allungato, cioè la diagnosi del DNA della malattia (Fig. 13).

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Riso. 14. Diagnosi di cancellazione BAVAGLIO nel gene DYT 1 in pazienti con distonia dopa-indipendente (elettroforesi su gel di poliacrilammide). Corsie 2,3,6 – malati; tracce 1,4,5 – controllo. La freccia sottile indica l'allele normale, la freccia spessa indica l'allele più corto mutante (delezione di tre nucleotidi).

Se l'intera regione del DNA in studio fa parte di una delezione estesa, l'amplificazione PCR del DNA da questo allele eliminato non verrà eseguita a causa della mancanza di siti per l'ibridazione dei primer. In questo caso verrà diagnosticata una delezione omozigote sulla base della completa assenza di un prodotto della reazione PCR (la sintesi del DNA è impossibile da entrambe le copie del gene). Con una delezione eterozigote, è possibile rilevare un prodotto della PCR sintetizzato da un allele normale (trattenuto); tuttavia, per diagnosticare in modo affidabile tale mutazione, è necessario utilizzare metodi di imaging del DNA più complessi che consentano di stimare la dose della PCR finale Prodotto.

Per identificare le mutazioni puntiformi (il più delle volte sostituzioni nucleotidiche) in determinati siti, il metodo PCR viene utilizzato in combinazione con altri metodi di analisi genetica molecolare. Se la posizione e la natura della presunta mutazione puntiforme sono note con precisione, allora il endonucleasi di restrizione (enzimi di restrizione) sono speciali enzimi cellulari isolati da vari ceppi di batteri.

Questi enzimi riconoscono sequenze nucleotidiche specifiche di lunghezza compresa tra quattro e dieci nucleotidi. Successivamente viene effettuata la restrizione (lat. (taglio)) di queste sequenze come parte di una molecola di DNA a doppio filamento. Ciascun enzima di restrizione riconosce e taglia in un punto fisso una sequenza nucleotidica specifica rigorosamente definita - sito di restrizione (sito di riconoscimento).

Nei casi in cui una mutazione puntiforme modifica il sito di riconoscimento naturale per un particolare enzima di restrizione, questo enzima non sarà in grado di scindere il frammento mutante amplificato dalla PCR. In alcuni casi, una mutazione porta alla comparsa di un nuovo sito di riconoscimento per un particolare enzima di restrizione che normalmente è assente.

In entrambe le situazioni, i prodotti di PCR mutanti e normali trattati con l'enzima di restrizione selezionato produrranno frammenti di restrizione di diversa lunghezza, che possono essere facilmente rilevati mediante elettroforesi (Fig. 15).

Pertanto, se è necessario rilevare rapidamente una specifica mutazione puntiforme, il compito si riduce alla ricerca dell'enzima di restrizione corrispondente, il cui sito di riconoscimento è localizzato nel sito della sequenza nucleotidica interrotta. Il trattamento dei prodotti della PCR con tale enzima di restrizione consentirà di differenziare facilmente gli alleli normali e mutanti. L'analisi di restrizione semplifica notevolmente l'individuazione di mutazioni puntiformi note ed è ora ampiamente utilizzata per la diagnosi diretta del DNA di malattie ereditarie.

La fase finale analisi genetica molecolare delle mutazioni consiste nel determinare la sequenza nucleotidica del frammento di DNA in studio (sequenziamento), che viene confrontata con la norma e viene formulata una diagnosi genetica finale. Grazie ai successi della genetica molecolare sono stati sviluppati metodi diagnostici basati sul DNA per oltre 400 malattie ereditarie.

Riso. 15. Rilevamento della mutazione puntiforme mediante analisi di restrizione: A – regione del gene amplificato contenente un sito di restrizioneAGCTper l’endonucleasi di restrizioneAlu IO. MutazioneG→ UNmodifica questa sequenza nucleotidica, dando origine all'enzima di restrizioneAluIbloccato; B – elettroferogramma dei prodotti di restrizione: traccia 1 – omozigosità per l'allele normale; traccia 2 – omozigosità per mutazione; traccia 3 – stato eterozigote (allele normale + mutazione).

La diagnosi delle malattie ereditarie, basata sull'esame diretto degli alleli mutanti nei pazienti, nei loro familiari o sospetti portatori eterozigoti di mutazioni patologiche, è adatta per la diagnosi pre-sintomatica e prenatale, che può essere applicata nelle primissime fasi dello sviluppo fetale, prima della comparsa di eventuali sintomi clinici o biochimici di malattie.

Indipendentemente dal metodo di rilevamento della mutazione, le caratteristiche molecolari precise di ciascuna mutazione possono essere ottenute solo mediante sequenziamento diretto. Per automatizzare questo processo, negli ultimi anni sono stati ampiamente utilizzati dispositivi speciali: sequenziatori, che consentono di accelerare significativamente il processo di lettura delle informazioni sul DNA.

La strada verso un più ampio utilizzo della ricerca biologica molecolare nei laboratori diagnostici clinici viene aperta accelerando il processo analitico eseguendo tutte le procedure in un unico continuum, senza trasferimento del campione, creando le condizioni per prevenire la contaminazione durante i test paralleli di un numero di analiti e registrando oggettivamente il risultati in ogni ciclo.

Principali modifiche del metodo PCR

Utilizzato per scansionare e cercare rapidamente mutazioni genetiche note.

PCR multiplex (multiprimer).

Questo metodo si basa sull'amplificazione simultanea di diversi esoni del gene in studio in un'unica reazione. Ciò consente uno screening rapido ed economicamente vantaggioso delle mutazioni più comuni. Ad esempio, per diagnosticare rapidamente la presenza di delezioni nel gene della distrofina in pazienti con distrofia muscolare progressiva di Duchenne/Becker, viene effettuata l'amplificazione simultanea di un insieme degli esoni più frequentemente mutati di questo gene. Poiché queste malattie sono ereditate con modalità recessiva legata all'X e sono associate a danni all'unico cromosoma X nei ragazzi, in caso di delezione estesa, l'elettroforesi dei prodotti della reazione rivelerà l'assenza di uno o più frammenti di DNA (esoni ), che può servire come conferma molecolare della diagnosi. Inoltre, selezionando sezioni genetiche specifiche per l'amplificazione mediante PCR, è possibile una valutazione abbastanza accurata della lunghezza totale della delezione e dei breakpoint genici (fino all'esone).

L'uso combinato di diverse reazioni multiplex rende possibile diagnosticare fino al 98% di tutte le delezioni che si verificano in pazienti con distrofia muscolare progressiva di Duchenne/Becker. Ciò rappresenta circa il 60% del numero totale di mutazioni note nel gene della distrofina e indica l'altissima efficienza di questo metodo di screening per la diagnosi del DNA delle distrofinopatie (Fig. 16).

Riso. 16. Diagnosi diretta del DNA della distrofia muscolare di Duchenne mediante PCR multiplex (elettroforesi su gel di agarosio). In ciascuno degli individui esaminati sono stati amplificati contemporaneamente quattro esoni del gene della distrofina (esoni 17, 19, 44 e 45; le frecce indicano i corrispondenti prodotti di amplificazione). Corsia 1 – controllo, corsie 2-5 – pazienti con distrofia muscolare di Duchenne con varie delezioni del gene della distrofina (corsie 2 e 5 – delezione dell'esone 45, traccia 3 – delezione dell'esone 44, traccia 4 – delezione degli esoni 17 e 19 ).

Amplificazione allele-specifica

Il metodo si basa sull'uso di due coppie indipendenti di primer per una regione genetica specifica: un primer in entrambe le coppie è comune e il secondo primer in ciascuna coppia ha una struttura diversa ed è complementare a una sequenza di DNA normale o mutante. Come risultato di tale reazione, due tipi di prodotti PCR possono essere sintetizzati contemporaneamente in soluzione: normale e mutante. Inoltre, il design dei primer utilizzati consente di differenziare chiaramente i prodotti di amplificazione normali e mutanti in base alla loro dimensione molecolare. Questo metodo è molto visivo e consente di verificare la presenza sia omo che eterozigote dell'allele mutante.

Metodo per la modifica sito-diretta del DNA amplificato

Il metodo si basa sull'uso di un cosiddetto primer di mismatch nella PCR (non completamente complementare al modello), che differisce dalla sequenza del DNA modello per un nucleotide. Come risultato dell'inclusione del primer specificato nel prodotto PCR mutante, in esso si forma un sito di restrizione creato artificialmente per una delle endonucleasi di restrizione, che consente la diagnosi diretta del DNA di una determinata mutazione nota mediante l'analisi di restrizione. La creazione di un tale sito di restrizione artificiale è necessaria se la ricerca non ha rivelato l'esistenza di un enzima noto e disponibile, il cui sito di restrizione “naturale” è interessato a causa della comparsa della mutazione studiata nella molecola di DNA .

Metodo PCR con trascrittasi inversa (RT- PCR)

Questo metodo viene utilizzato nei casi in cui è più conveniente utilizzare come oggetto di studio non il DNA genomico, ma un cDNA più compatto e ricco di informazioni ottenuto dopo un'adeguata elaborazione di campioni di tessuto, ad esempio materiale bioptico o linee cellulari di linfociti, fibroblasti, ecc. Importante la condizione qui è l'espressione (almeno minima) del gene desiderato nel tessuto studiato.

Nella prima fase viene effettuata la trascrizione inversa dell'mRNA e le molecole di cDNA risultanti fungono da modello per la PCR. Successivamente, la regione critica del cDNA, amplificata in quantità sufficiente, viene sottoposta a sequenziamento e ad altri metodi di screening delle mutazioni, studio elettroforetico diretto (rilevamento di delezioni, inserzioni, ecc.) o integrazione in un sistema di espressione al fine di ottenere un prodotto proteico e la sua analisi diretta.

Questo metodo è particolarmente efficace per rilevare mutazioni che portano alla sintesi di una proteina "troncata" (mutazioni non senso, mutazioni di splicing, grandi delezioni) - la cosiddetta analisi PTT (Protein Truncation Test). L'analisi PTT è comunemente utilizzata nello studio di geni multiesoni lunghi, come la distrofia muscolare di Duchenne/Becker, l'atassia-telangectasia o la neurofibromatosi di tipo 1.

PCR in tempo reale(PCR in tempo reale, inglese)

Ogni anno, la PCR in tempo reale sta diventando un metodo diagnostico sempre più popolare nella pratica sanitaria. La sua caratteristica fondamentale è il monitoraggio e l'analisi quantitativa dell'accumulo dei prodotti della reazione a catena della polimerasi e la registrazione e interpretazione automatica dei risultati ottenuti. Questo metodo non richiede una fase di elettroforesi, il che riduce i requisiti per un laboratorio PCR. Grazie al risparmio di spazio di produzione, alla riduzione del numero del personale e della domanda di determinazione quantitativa del DNA/RNA, questo metodo è stato utilizzato con successo negli ultimi anni nei più grandi centri sanitario-epidemiologici, diagnostici e di ricerca dei paesi sviluppati del mondo, sostituendo PCR nel suo formato attuale (“classico”).

La PCR in tempo reale utilizza sonde oligonucleotidiche marcate in modo fluorescente per rilevare il DNA mentre viene amplificato. La PCR in tempo reale consente l'analisi completa di un campione entro 20-60 minuti ed è teoricamente in grado di rilevare anche una molecola di DNA o RNA in un campione.

Riso. 17. PCR in tempo reale.

La PCR in tempo reale utilizza un sistema TaqMan che controlla la cinetica della PCR direttamente durante l'amplificazione utilizzando l'estinzione della fluorescenza per risonanza. Per la rilevazione viene utilizzata una sonda che trasporta un fluoroforo e un quencher complementare alla parte centrale del frammento amplificato. Quando il fluoroforo e il quencher sono legati alla sonda oligonucleotidica, si osserva solo una minore emissione fluorescente. Durante il processo di amplificazione, a causa dell'attività esonucleasica 5" della Taq polimerasi, il marcatore fluorescente entra in soluzione, liberato dalla sua vicinanza al quencher, e genera un segnale fluorescente che aumenta in tempo reale in proporzione all'accumulo dell'amplificatore ( Figura 17).

I principali vantaggi della Real-Time PCR rispetto alla PCR con elettroforesi su gel:

· L'intero metodo avviene in una provetta;

· Il metodo richiede 1 ora;

· Sono sufficienti 1-2 locali di lavoro;

· Oltre alla valutazione qualitativa del risultato, esiste la possibilità di una valutazione quantitativa (ad esempio, quando si prescrive una terapia antivirale per l'AIDS o l'epatite virale, è necessario conoscere la carica virale, cioè la quantità di virus per unità, che è fornito dalla PCR in tempo reale);

· Il rischio di contaminazione è nettamente ridotto.

Conclusione

Il metodo PCR è uno dei metodi più comuni di ricerca biologica molecolare. Questo metodo dovrebbe essere utilizzato in modo intelligente dai medici e un medico che decide di utilizzare la PCR nel suo lavoro deve avere una certa conoscenza delle caratteristiche e delle capacità di questo metodo. In secondo luogo, deve esserci uno stretto feedback tra il clinico e il laboratorio di PCR, necessario per analizzare casi complessi e sviluppare la corretta strategia diagnostica. In terzo luogo, l’analisi PCR non è una panacea nella diagnostica (soprattutto nelle malattie infettive) e non sostituisce i metodi di ricerca esistenti, ma li integra solo. E, cosa più importante, la PCR non può sostituire l’intuizione e il pensiero analitico che deve avere un medico che si aspetta il successo.

P . S . Ricerca biologica molecolare: modifica delle linee guida per la diagnosi e il trattamento. L'uso di metodi biologici molecolari è associato alla prospettiva di un cambiamento radicale nell'enfasi nella diagnostica di laboratorio. Potrebbe non trattarsi solo di informazioni tempestive, ma di riceverle in anticipo. Se ora i test di laboratorio nella maggior parte dei casi vengono eseguiti già quando la malattia si è sviluppata e il trattamento è iniziato, allora si prevede che le informazioni di laboratorio biologico molecolare consentano di identificare la predisposizione di una persona a determinati tipi di patologia e il grado di sensibilità a determinati farmaci , che giustificherà la natura predittiva, preventiva e personalizzata della medicina futura.

CAMBIAMENTO DELLA DIAGNOSI E ORIENTAMENTI DEL TRATTAMENTO

MALATTIE EREDITARIE

Oggi Nel futuro

Diagnosi Passaporto genetico

8. Quante stanze di lavoro sono necessarie per gestire un laboratorio PCR con rilevamento fluorescente (analisi quantitativa, PCR in tempo reale)?

9. Cos'è il rilevamento?

10. Quali metodi di diagnostica del DNA esistono?

11. Il lavoro di quale enzima è alla base della PCR?

12. Perché è necessario rimuovere la zona di rilevamento da altre aree di lavoro?

13. Cos'è un sito con restrizioni?

14. Quali sono le differenze tra i metodi diagnostici del DNA diretti e indiretti?

15. Cos'è il sequenziamento?

16. Cos'è la PCR multiplex?

17. Quali tipi di mutazioni vengono determinate utilizzando la PCR?

18. Cos'è la contaminazione?

19. Qual è l'essenza del metodo di amplificazione allele-specifico?

20. Condizioni di conservazione del materiale PCR?

21. In quale dispositivo avviene l'amplificazione?

22. Cos'è il metodo PCR con trascrittasi inversa (RT-PCR)?

23. Cosa serve come materiale per la diagnostica PCR?

24. Elencare i tipi di contaminazione?

Test di autopreparazione

1. Enzimi di restrizione dell'endonucleasi:

a) enzimi che “spezzano” il DNA in luoghi strettamente specifici;

b) enzimi che uniscono le rotture nella molecola del DNA;

c) enzimi che forniscono composti che eseguono la riparazione del DNA.

2. Amplificazione genica:

3. Quale metodo di genetica molecolare viene utilizzato per diagnosticare le malattie causate da un gene mutante di sequenza nota?

a) uso di un enzima di restrizione specifico;

b) rilevazione diretta mediante sonde molecolari specifiche;

V) analisi familiare distribuzioni di polimorfismi di lunghezza dei frammenti di restrizione normali.

4. Sequenziamento del DNA:

a) identificazione della sequenza di basi del DNA;

b) ripetizioni multiple di qualsiasi sezione di DNA;

c) isolamento di un frammento di DNA contenente il gene in studio.

5. Per ottenere campioni di DNA è possibile utilizzare :

b) villi coriali;

c) liquido amniotico;

d) cellule del liquido amniotico;

e) campioni bioptici di pelle, muscoli, fegato,

e) tutto è corretto tranne il punto “c”,

g) tutto è corretto tranne il punto “d”,

h) tutto quanto sopra è vero.

6. Per diagnosticare quali mutazioni viene utilizzato il metodo PCR:

a) genomico;

b) cromosomico;

c) gene (punto).

7. Il primer è:

a) sezione complementare del DNA;

b) una sequenza oligonucleotidica sintetica marcata (radioattivamente o in modo fluorescente) complementare ad un gene mutante o normale;

c) un oligonucleotide che funge da “primer” e avvia la sintesi di una catena polinucleotidica su una matrice di DNA o RNA.

8. Chi ha sviluppato il principio del metodo PCR?

b) K. Mullis

9. Il metodo PCR viene utilizzato per diagnosticare l'espansione delle ripetizioni trinucleotidiche (un tipo di mutazione dinamica)?

10. In quali aree viene utilizzata la PCR?

a) medicina clinica;

b) determinazione di organismi transgenici (OGM)

c) identificazione personale, accertamento della paternità, analisi forense

d) tutto quanto sopra,

e) nessuna delle precedenti...

Risposte di esempio: 1 – un; 2-b; 3-b; 4-a; 5-e; 6 – dentro; 7 – dentro; 8-b; 9 – a, 10 – g.

Principale

1.Genetica di Bochkov. Mosca. GEOTAR, 2002.

Ulteriori

1. , Bakharev e il trattamento delle malattie congenite ed ereditarie nei bambini. – Mosca, 2004.

2. Diagnostica del DNA e consulenza genetica medica. – Mosca, 2004.

3. Genetica Ginter. – Mosca, 2003.

4. Fondamenti di Gorbunov di genetica medica. – San Pietroburgo: Intermedica, 1999.

5. J. McGee. Molecolare diagnosi clinica. – Mondo, 1999.

6. Menshikov - ricerca biologica nella diagnostica clinica di laboratorio: possibilità del problema (lezioni frontali). Diagnostica clinica di laboratorio, n. 3, 2006.

7. Il lavoro di Kornienko nel laboratorio PCR durante l'analisi in linea di materiale biologico. Diagnostica clinica di laboratorio, n. 10, 2006.

8. Organizzazione del lavoro del laboratorio PCR. Istruzioni metodiche. MU 1.3.1794-03. Capo Sanitario della Federazione Russa, 2003.

9. Tecnologia Erlich H. A. PCR. – Percin-Elmer Cetus, 1993.

10. Heid C. A., Stevens J. PCR quantitativa in tempo reale. Ricerca sul genoma – N. 6, 1996.

PRINCIPI FONDAMENTALI DEL METODO

REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI

Manuale metodologico per il lavoro extracurriculare degli studenti di 3-4 anni nelle specialità di medicina generale (060101) e pediatria (060103).

GOU VPO "Accademia medica statale di Krasnoyarsk dell'Agenzia federale per la salute e lo sviluppo sociale"

Russia, Krasnojarsk,

Agenzia federale per l'istruzione

Stato Istituto d'Istruzione

Più alto formazione professionale

"Accademia pedagogica statale della Carelia"

Corsi sull'argomento:

Reazione a catena della polimerasi (PCR) e sue applicazioni

Completato da: studentessa Koryagina Valeria Aleksandrovna

Controllato da: Karpikova Natalya Mikhailovna

Petrozavodsk 2013

introduzione

Capitolo 1. Revisione della letteratura

1.5.4 Effetto plateau

1.5.6 Amplificazione

Conclusione

introduzione

Gli ultimi vent'anni sono stati contrassegnati dalla diffusa introduzione dei metodi di genetica molecolare nelle scienze biologiche, mediche e agrarie.

All’inizio degli anni ’70 sembrava che la biologia molecolare avesse raggiunto un certo grado di maturità. Durante questo periodo, l'oggetto principale della ricerca genetica molecolare erano i microrganismi. Il passaggio agli eucarioti ha posto i ricercatori di fronte a problemi completamente nuovi che non potevano essere risolti utilizzando i metodi di analisi genetica esistenti a quel tempo. Una svolta nello sviluppo della genetica molecolare è diventata possibile grazie all'emergere di un nuovo strumento sperimentale: le endonucleasi di restrizione. Negli anni successivi, il numero di metodi per l’analisi diretta del DNA, basati su approcci qualitativamente diversi, cominciò ad aumentare rapidamente.

Le moderne tecnologie in molti casi hanno permesso di iniziare a studiare a un livello più profondo la fine organizzazione strutturale e funzionale dei genomi nucleari ed extranucleari di vari organismi. Ciò è stato di particolare importanza per lo sviluppo di nuovi metodi diagnostici e terapeutici varie malattie. Non meno importante è stata la possibilità di utilizzare le conquiste della genetica molecolare nella biologia delle popolazioni e nell’allevamento per identificare e analizzare la variabilità genetica di popolazioni, varietà e ceppi, identificare e certificare individui economicamente validi, creare organismi geneticamente modificati e risolvere altri problemi.

Ogni metodo ha i suoi vantaggi e svantaggi. Non esiste un metodo universale in grado di risolvere tutti i problemi che si presentano. Pertanto, la scelta di un metodo specifico per la ricerca condotta è una delle fasi più importanti di qualsiasi lavoro scientifico.

Capitolo 1. Revisione della letteratura

1.1 Storia della scoperta della reazione a catena della polimerasi (PCR)

Nel 1983 K.B. Mullis e colleghi pubblicarono e brevettarono il metodo della reazione a catena della polimerasi (PCR), destinato ad avere un profondo impatto su tutte le aree di ricerca e applicazione degli acidi nucleici. Il valore di questo metodo per biologia molecolare e la genetica si rivelò così eccezionale e ovvia che dopo sette anni l'autore fu premiato premio Nobel in chimica.

All'inizio dell'utilizzo del metodo, dopo ogni ciclo di riscaldamento-raffreddamento, era necessario aggiungere la DNA polimerasi alla miscela di reazione, poiché veniva inattivata all'elevata temperatura necessaria per separare i filamenti dell'elica del DNA. La procedura di reazione era relativamente inefficiente e richiedeva molto tempo ed enzimi. Nel 1986, il metodo della reazione a catena della polimerasi è stato notevolmente migliorato. È stato proposto di utilizzare DNA polimerasi di batteri termofili. Questi enzimi si sono rivelati termostabili e in grado di resistere a molti cicli di reazione. Il loro utilizzo ha permesso di semplificare e automatizzare la PCR. Una delle prime DNA polimerasi termostabili fu isolata dai batteri Thermus acquaticoe nominato Taq-polimerasi.

La capacità di amplificare qualsiasi segmento di DNA di cui è nota la sequenza nucleotidica e di ottenerlo in una forma e quantità preparativa omogenea al termine della PCR, rende la PCR un metodo alternativo per la clonazione molecolare di brevi frammenti di DNA. In questo caso, non è necessario utilizzare le complesse tecniche metodologiche utilizzate in Ingegneria genetica con la clonazione convenzionale. Lo sviluppo del metodo PCR ha notevolmente ampliato le capacità metodologiche della genetica molecolare, e, in particolare, dell'ingegneria genetica, tanto da cambiare radicalmente e rafforzare il potenziale scientifico di molti dei suoi settori.

1.2 Tipi di reazione a catena della polimerasi (PCR)

· PCR nidificata- utilizzato per ridurre il numero di sottoprodotti della reazione. Vengono utilizzate due coppie di primer e vengono eseguite due reazioni sequenziali. La seconda coppia di primer amplifica una regione di DNA all'interno del prodotto della prima reazione.

· PCR invertita- utilizzato quando è nota solo una piccola regione all'interno della sequenza desiderata. Questo metodo è particolarmente utile quando si tratta di determinare le sequenze vicine dopo che il DNA è stato inserito nel genoma. Per eseguire la PCR invertita, vengono eseguiti una serie di tagli del DNA utilizzando enzimi di restrizione<#"justify">primer per la reazione a catena della polimerasi

· PCR specifica del gruppo- PCR per parenti<#"center">1.3 Reazione a catena della polimerasi

Scoperta a metà degli anni '80, la reazione a catena della polimerasi (PCR) può moltiplicare il numero di copie di un campione originale milioni di volte in poche ore. Durante ogni ciclo di reazione si formano due copie della molecola originale. Ciascuna delle copie sintetizzate del DNA può servire da modello per la sintesi di nuove copie del DNA nel ciclo successivo. Pertanto, la ripetizione ripetuta dei cicli porta ad un aumento del numero di copie in progressione geometrica. Dai calcoli risulta che anche con 30 cicli il numero di copie della molecola originale sarà superiore a 1 miliardo. Anche se teniamo conto del fatto che non tutti gli ampliconi vengono duplicati durante ogni ciclo, il numero totale di copie, nonostante ciò, è una cifra piuttosto elevata.

Ogni ciclo di reazione a catena della polimerasi (PCR) è costituito dalle seguenti fasi:

· Denaturazione - Un aumento della temperatura fa sì che la molecola di DNA a doppio filamento si srotoli e si divida in due a filamento singolo;

· Ricottura - La riduzione della temperatura consente ai primer di legarsi a regioni complementari della molecola di DNA;

· Allungamento - L'enzima DNA polimerasi completa il filamento complementare.

Per amplificare un frammento selezionato vengono utilizzati due primer oligonucleotidici (primer) che fiancheggiano una specifica regione del DNA. Primer orientati 3 - termina l'uno verso l'altro e verso la sequenza che necessita di essere amplificata. La DNA polimerasi effettua la sintesi (completamento) di catene di DNA reciprocamente complementari, a partire dai primer. Durante la sintesi del DNA, i primer vengono fisicamente integrati nella catena delle molecole di DNA appena sintetizzate. Ciascun filamento di una molecola di DNA formato utilizzando uno dei primer può servire da modello per la sintesi di un filamento di DNA complementare utilizzando un altro primer.

1.4 Esecuzione della reazione a catena della polimerasi (PCR)

La reazione a catena della polimerasi viene effettuata in speciali tubi di polipropilene a pareti sottili, di dimensioni compatibili con il termociclatore (amplificatore) utilizzato, un dispositivo che controlla le caratteristiche di temperatura e tempo delle fasi della reazione a catena della polimerasi (PCR).

1.5 Principio del metodo della reazione a catena della polimerasi

La reazione a catena della polimerasi (PCR) è un metodo di amplificazione del DNA in vitro che può essere utilizzato per isolare e moltiplicare una specifica sequenza di DNA miliardi di volte in poche ore. La possibilità di ottenere un numero enorme di copie di una rigorosamente una certa zona genome semplifica notevolmente lo studio di un campione di DNA esistente.

Per eseguire una reazione a catena della polimerasi, devono essere soddisfatte una serie di condizioni:

1.5.1 La presenza di un numero di componenti nella miscela di reazione

I componenti principali della miscela di reazione (PCR) sono: Tris-HCl, KCl, MgCl 2, una miscela di nucleotidi trifosfati (ATP, GTP, CTP, TTP), primer (oligonucleotidi), preparazione del DNA, DNA polimerasi termostabile. Ciascuno dei componenti della miscela di reazione è direttamente coinvolto nella reazione a catena della polimerasi (PCR) e la concentrazione dei reagenti influenza direttamente il corso dell'amplificazione.

· Tris-HCl - determina il pH della miscela di reazione, crea una capacità tampone. L'attività della DNA polimerasi dipende dal pH dell'ambiente, quindi il valore del pH influenza direttamente il corso della reazione a catena della polimerasi. Tipicamente il valore del pH è compreso tra 8 e 9,5. Il valore pH elevato viene preso perché il pH del tampone Tril-HCl diminuisce all'aumentare della temperatura.

· KCl - la concentrazione di cloruro di potassio fino a 50 mM influenza il corso dei processi di denaturazione e ricottura; concentrazioni superiori a 50 mM inibiscono la DNA polimerasi.

· MgCl 2- poiché la DNA polimerasi è Mg 2+- enzima dipendente, quindi la concentrazione di ioni magnesio influenza l'attività dell'enzima (Mg 2+forma complessi con NTP - questi complessi sono il substrato per la polimerasi). Un'elevata concentrazione porta ad un aumento dell'amplificazione non specifica, mentre una bassa concentrazione porta all'inibizione della reazione; l'ottimale (per varie polimerasi) è compreso tra 0,5 e 5 mM. Inoltre, la concentrazione di sali di magnesio influisce sul decorso dei processi di denaturazione e ricottura: un aumento della concentrazione di Mg 2+provoca un aumento della temperatura di fusione del DNA (cioè la temperatura alla quale il 50% dei filamenti di DNA a doppio filamento vengono separati in filamenti a filamento singolo).

· NTP - i trifosfati nucleotidici sono monomeri diretti degli acidi nucleici. Per prevenire la terminazione della catena, si raccomanda un rapporto uguale di tutti e quattro i nucleotidi trifosfati. La bassa concentrazione di questi componenti nella miscela di reazione aumenta la probabilità di errori durante la costruzione di una catena di DNA complementare.

· Primer - La soluzione ottimale è utilizzare primer con una differenza di temperatura di fusione non superiore a 2 - 4 o C. A volte durante la conservazione a lungo termine a una temperatura di 4 o C, o dopo un gran numero di congelamenti e scongelamenti, i primer formano strutture secondarie - dimeri, riducendo l'efficienza della PCR. L'eliminazione di questo problema si riduce all'incubazione a bagnomaria (T=95 o C) per 3 minuti e successivo raffreddamento rapido a 0o CON.

· Preparazioni di DNA: la quantità e la qualità della preparazione del DNA (matrice) influiscono direttamente sul decorso e sui parametri della reazione a catena della polimerasi. Quantità eccessive di campione di DNA inibiscono la reazione a catena della polimerasi (PCR). Impurità varie sostanze contenuti nella preparazione del DNA possono anche ridurre l'efficacia della reazione a catena della polimerasi (PCR): acetato di sodio, cloruro di sodio, isopropanolo, etanolo, eparina, fenolo, urea, emoglobina, ecc.

· DNA polimerasi: quando si utilizza una piccola quantità di DNA polimerasi, si osserva una diminuzione della sintesi del prodotto finale in proporzione diretta alla dimensione dei frammenti. Un eccesso di polimerasi di 2-4 volte porta alla comparsa di spettri diffusi e di 4-16 volte - spettri non specifici a basso peso molecolare. L'intervallo di concentrazioni utilizzato è compreso tra 0,5 e 1,5 unità di attività per 25 μl di miscela PCR.

Oltre ai componenti principali della miscela PCR, vengono utilizzate numerose sostanze aggiuntive che migliorano gli indicatori qualitativi e quantitativi della PCR: acetamide (5%) - aumenta la solubilità dei componenti principali; betaina ( sale sodico) - stabilizzazione della DNA polimerasi, abbassando la temperatura di fusione del DNA, equalizzando la temperatura di fusione; albumina bovina (10-100 μg/ml) - stabilizzazione della DNA polimerasi; dimetilsolfossido (1-10%) - aumentando la solubilità dei componenti principali; formammide (2-10%) - aumentando la specificità della ricottura; glicerolo (15-20%) - aumenta la stabilità termica dell'enzima, abbassando la temperatura di denaturazione del campione di DNA; solfato di ammonio: abbassa la temperatura di denaturazione e ricottura.

1.5.2 Modalità ciclica e temperatura

L'aspetto generale di un programma di reazione a catena della polimerasi (PCR) è il seguente:

palcoscenico. Denaturazione primaria a lungo termine del preparato di DNA 1° ciclo

palcoscenico. Denaturazione rapida della preparazione del DNA. Ricottura dei primer. Allungamento.30 - 45 cicli.

palcoscenico. Lungo allungamento. Raffreddamento della miscela di reazione 1° ciclo.

Ogni elemento della fase - denaturazione, ricottura, allungamento - ha caratteristiche individuali di temperatura e tempo. I parametri di temperatura e tempo per ciascun elemento sono selezionati empiricamente, in conformità con gli indicatori qualitativi e quantitativi dei prodotti di amplificazione.

Denaturazione. Durante questo elemento della reazione a catena della polimerasi, una molecola di DNA a doppio filamento viene divisa in due a filamento singolo. I parametri della temperatura di denaturazione sono compresi nell'intervallo 90 - 95 o C, ma nel caso di un campione di DNA con un alto contenuto di guanina e citosina, la temperatura dovrebbe essere aumentata a 98 o C. La temperatura di denaturazione deve essere sufficiente a denaturare completamente i filamenti di DNA ed evitare il "raffreddamento rapido" o la ricottura rapida, tuttavia, la DNA polimerasi termostabile è meno stabile alle alte temperature. Pertanto, la selezione dei parametri ottimali della temperatura di denaturazione per il rapporto primer/campione (preparazione del DNA) è una condizione importante quando si esegue l'amplificazione. Se la temperatura di denaturazione nella prima fase è superiore a 95 o C, si consiglia di aggiungere la DNA polimerasi alla miscela di reazione dopo la denaturazione iniziale. La durata di questo elemento della fase durante la reazione a catena della polimerasi (PCR) dovrebbe essere sufficiente per denaturare completamente il DNA, ma allo stesso tempo non avere un effetto significativo sull'attività della DNA polimerasi ad una determinata temperatura.

Ricottura. Temperatura di ricottura (T UN ) è uno dei parametri più importanti della reazione a catena della polimerasi. La temperatura di ricottura per ciascun primer specifico viene selezionata individualmente. Dipende dalla lunghezza e dalla composizione nucleotidica del primer. Di solito è inferiore di 2 - 4 o Dal valore del punto di fusione (T M ) primer. Se la temperatura di ricottura del sistema è inferiore a quella ottimale, il numero di frammenti amplificati non specifici aumenta e, al contrario, più Calore riduce la quantità di prodotti amplificati. In questo caso, la concentrazione di ampliconi specifici può diminuire drasticamente, fino all'inibizione della reazione a catena della polimerasi (PCR). L'aumento del tempo di ricottura porta anche ad un aumento del numero di ampliconi non specifici.

Allungamento. Tipicamente, ciascun tipo di DNA polimerasi termostabile ha una temperatura individuale ottimale per l'attività. Anche la velocità di sintesi del filamento di DNA complementare da parte dell'enzima è specifica per ciascuna polimerasi (in media è di 30 - 60 nucleotidi al secondo, o 1 - 2 mila basi al minuto), pertanto il tempo di allungamento viene selezionato a seconda del tipo della DNA polimerasi e la lunghezza della regione amplificata.

1.5.3 Principi di base per la selezione dei primer

Quando si crea un sistema di test PCR, uno dei compiti principali è la corretta selezione dei primer, che devono soddisfare una serie di criteri:

I primer devono essere specifici. Attenzione speciale pagare 3 - estremità dei primer, perché è da essi che la Taq polimerasi inizia a completare il filamento complementare del DNA. Se la loro specificità è insufficiente, è probabile che nella provetta con la miscela di reazione si verifichino processi indesiderati, vale a dire la sintesi di DNA non specifico (frammenti corti o lunghi). È visibile sull'elettroforesi sotto forma di bande aggiuntive pesanti o leggere. Ciò interferisce con la valutazione dei risultati della reazione, poiché è facile confondere uno specifico prodotto di amplificazione con DNA estraneo sintetizzato. Alcuni primer e dNTP vengono consumati per la sintesi del DNA non specifico, il che porta ad una significativa perdita di sensibilità.

I primer non devono formare dimeri e anse, ad es. I doppi filamenti stabili non dovrebbero formarsi come risultato della ricottura dei primer su se stessi o tra loro.

1.5.4 Effetto plateau

Va notato che il processo di accumulo di specifici prodotti di amplificazione in progressione geometrica dura solo per un tempo limitato, dopodiché la sua efficienza diminuisce in modo critico. Ciò è dovuto al cosiddetto effetto plateau.

Effetto termine altopiano utilizzato per descrivere il processo di accumulo dei prodotti della PCR negli ultimi cicli di amplificazione.

A seconda delle condizioni e del numero di cicli della reazione di amplificazione, al momento si ottiene l'effetto altopiano sono influenzati dall'utilizzo dei substrati (dNTP e primer), dalla stabilità dei reagenti (dNTP ed enzima), dalla quantità di inibitori, inclusi pirofosfati e duplex di DNA, dalla competizione per i reagenti da parte di prodotti non specifici o dimeri di primer, dalla concentrazione di un prodotto specifico e denaturazione incompleta ad alte concentrazioni di prodotti di amplificazione.

Minore è la concentrazione iniziale del DNA bersaglio, maggiore è il rischio che la reazione fallisca. plateau." Questo punto può verificarsi prima che siano disponibili abbastanza prodotti di amplificazione specifici da analizzare. Solo sistemi di test ben ottimizzati possono evitare questo problema.

1.5.5 Preparazione di un campione biologico

Per isolare il DNA, vengono utilizzate varie tecniche a seconda delle attività da svolgere. La loro essenza sta nell'estrazione (estrazione) del DNA da una preparazione biologica e nella rimozione o neutralizzazione delle impurità estranee per ottenere una preparazione del DNA con una purezza adatta alla PCR.

Il metodo descritto da Marmur per ottenere una preparazione di DNA puro è considerato standard ed è già diventato classico. Comprende la proteolisi enzimatica seguita dalla deproteinizzazione e dalla riprecipitazione del DNA con alcol. Questo metodo consente di ottenere una preparazione di DNA puro. Tuttavia, è piuttosto laborioso e comporta il lavoro con sostanze aggressive e dall'odore forte come il fenolo e il cloroformio.

Uno dei metodi attualmente popolari è il metodo di estrazione del DNA proposto da Boom et al. Questo metodo si basa sull'utilizzo di un forte agente caotropico, la guanidina tiocianato (GuSCN), per la lisi cellulare e il successivo assorbimento del DNA su un supporto (sfere di vetro, farina fossile, vetro di latte, ecc.). Dopo il lavaggio, il DNA rimane nel campione, adsorbito sul carrier, dal quale può essere facilmente rimosso utilizzando un tampone di eluizione. Il metodo è conveniente, tecnologicamente avanzato e adatto per preparare un campione per l'amplificazione. Tuttavia, la perdita di DNA è possibile a causa dell'assorbimento irreversibile sul trasportatore, nonché durante numerosi lavaggi. Ciò è particolarmente importante quando si lavora con piccole quantità di DNA in un campione. Inoltre, anche tracce di GuSCN possono inibire la PCR. Pertanto, quando si utilizza questo metodo è molto importante giusta scelta aderenza assorbente e attenta alle sfumature tecnologiche.

Un altro gruppo di metodi di preparazione dei campioni si basa sull'uso di scambiatori ionici di tipo Chilex che, a differenza del vetro, non assorbono il DNA, ma piuttosto le impurità che interferiscono con la reazione. Di norma, questa tecnologia comprende due fasi: ebollizione del campione e assorbimento delle impurità su uno scambiatore di ioni. Il metodo è estremamente interessante per la sua semplicità di esecuzione. Nella maggior parte dei casi è adatto per lavorare con materiale clinico. Sfortunatamente, a volte ci sono campioni con impurità che non possono essere rimosse utilizzando scambiatori di ioni. Inoltre, alcuni microrganismi non possono essere distrutti dalla semplice bollitura. In questi casi è necessario introdurre fasi aggiuntive di elaborazione del campione.

Pertanto, la scelta del metodo di preparazione del campione dovrebbe essere presa in considerazione con la comprensione degli scopi dell'analisi prevista.

1.5.6 Amplificazione

Per effettuare la reazione di amplificazione è necessario preparare una miscela di reazione e addizionarvi il campione di DNA analizzato. È importante tenere conto di alcune caratteristiche della ricottura del primer. Il fatto è che, di regola, il campione biologico analizzato contiene varie molecole di DNA, con le quali i primer utilizzati nella reazione hanno un'omologia parziale, e in alcuni casi significativa. Inoltre, i primer possono ricotturarsi tra loro, formando dimeri di primer. Entrambi comportano un consumo significativo di primer per la sintesi dei sottoprodotti (non specifici) dei prodotti di reazione e, di conseguenza, riducono significativamente la sensibilità del sistema. Ciò rende difficile o impossibile leggere i risultati della reazione durante l'elettroforesi.

1.6 Composizione della miscela di reazione PCR standard

x tampone PCR (soluzione Tris-HCl 100 mM, pH 9,0, soluzione KCl 500 mM, soluzione MgCl2 25 mM ) …….2,5 µl

Acqua (MilliQ)……………….18,8 µl

Miscela di nucleotidi trifosfati (dNTP)

Soluzione mM di ciascuno……………….……….0,5 µl

Primer 1 (soluzione 10 mM) ……………………………………….….1 µl

Primer 2 (soluzione 10 mM) ……………………………………….….1 µl

DNA polimerasi (5 unità/μl) …………………0,2 µl

Campione di DNA (20 ng/μl) …………………………..1 µl

1.7 Valutazione dei risultati della reazione

Per valutare correttamente i risultati della PCR, è importante comprendere che questo metodo non è quantitativo. Teoricamente, i prodotti di amplificazione di singole molecole di DNA bersaglio possono essere rilevati mediante elettroforesi dopo 30-35 cicli. Tuttavia, in pratica, ciò avviene solo nei casi in cui la reazione avviene in condizioni prossime all'ideale, cosa che non accade spesso nella vita. Il grado di purezza della preparazione del DNA ha un'influenza particolarmente grande sull'efficienza dell'amplificazione, vale a dire la presenza nella miscela di reazione di alcuni inibitori, che in alcuni casi possono essere estremamente difficili da eliminare. A volte, a causa della loro presenza, anche decine di migliaia di molecole di DNA bersaglio non possono essere amplificate. Pertanto, spesso non esiste una relazione diretta tra la quantità iniziale di DNA target e la quantità finale di prodotti di amplificazione.

Capitolo 2: Applicazioni della reazione a catena della polimerasi

La PCR viene utilizzata in molte aree per test ed esperimenti scientifici.

Forense

La PCR viene utilizzata per confrontare le cosiddette “impronte genetiche”. È richiesto un campione di materiale genetico dalla scena del crimine: sangue, saliva, sperma, capelli, ecc. Viene confrontato con il materiale genetico del sospettato. È sufficiente una piccolissima quantità di DNA, teoricamente una copia. Il DNA viene scomposto in frammenti e poi amplificato mediante PCR. I frammenti vengono separati mediante elettroforesi del DNA. Il modello risultante della disposizione delle bande del DNA è chiamato impronta genetica.

Stabilire la paternità

Risultati dell'elettroforesi di frammenti di DNA amplificati mediante PCR. Padre. Bambino. Madre. Il bambino ha ereditato alcune caratteristiche dell'impronta genetica di entrambi i genitori, risultando in una nuova impronta unica.

Sebbene le impronte genetiche siano uniche, i rapporti familiari possono ancora essere stabiliti rilevando diverse impronte digitali. Lo stesso metodo può essere applicato, leggermente modificato, per stabilire la parentela evolutiva tra gli organismi.

Diagnostica medica

La PCR consente di accelerare e facilitare notevolmente la diagnosi di malattie ereditarie e virali. Il gene di interesse viene amplificato mediante PCR utilizzando appositi primer e quindi sequenziato per identificare le mutazioni. Le infezioni virali possono essere rilevate immediatamente dopo l’infezione, settimane o mesi prima della comparsa dei sintomi.

Medicina personalizzata

A volte i farmaci risultano tossici o allergenici per alcuni pazienti. Le ragioni di ciò sono in parte dovute alle differenze individuali nella suscettibilità e nel metabolismo dei farmaci e dei loro derivati. Queste differenze sono determinate a livello genetico. Ad esempio, in un paziente un certo citocromo può essere più attivo, in un altro meno. Per determinare quale tipo di citocromo ha un determinato paziente, si propone di condurre un'analisi PCR prima di utilizzare il medicinale. Questa analisi è chiamata genotipizzazione preliminare.

Clonazione genica

La clonazione genetica è il processo di isolamento dei geni e, come risultato di manipolazioni di ingegneria genetica, l'ottenimento di una grande quantità del prodotto di un determinato gene. La PCR viene utilizzata per amplificare un gene, che viene quindi inserito in un vettore, un pezzo di DNA che trasferisce un gene estraneo nello stesso o in un altro organismo conveniente per la crescita. Ad esempio, come vettori vengono utilizzati plasmidi o DNA virale. L'inserimento di geni in un organismo estraneo viene solitamente utilizzato per produrre il prodotto di quel gene: l'RNA o, più spesso, una proteina. In questo modo si ottengono molte proteine ​​in quantità industriali da utilizzare in agricoltura, medicine, ecc.

Sequenziamento del DNA

Nel metodo di sequenziamento che utilizza dideossinucleotidi marcati con un marcatore fluorescente o un isotopo radioattivo, la PCR è parte integrante, poiché è durante la polimerizzazione che i derivati ​​dei nucleotidi marcati con un marcatore fluorescente o radioattivo vengono inseriti nella catena del DNA. Ciò arresta la reazione, consentendo di determinare le posizioni di nucleotidi specifici dopo che le catene sintetizzate sono state separate nel gel.

Mutagenesi

Attualmente, la PCR è diventata il metodo principale per effettuare la mutagenesi. L'utilizzo della PCR ha permesso di semplificare e velocizzare la procedura di mutagenesi, oltre a renderla più affidabile e riproducibile.

Il metodo PCR ha permesso di analizzare la presenza di sequenze di papillomavirus umano in sezioni bioptiche incluse in paraffina di tumori cervicali umani 40 anni prima di questo studio. Inoltre, utilizzando la PCR, è stato possibile amplificare e clonare frammenti di DNA mitocondriale dai resti fossili di un cervello umano di 7mila anni!

Utilizzando lisati di singoli spermatozoi umani, è stata dimostrata la capacità di analizzare simultaneamente due loci situati su diversi cromosomi non omologhi. Questo approccio offre un'opportunità unica per l'analisi genetica fine e lo studio della ricombinazione cromosomica, del polimorfismo del DNA, ecc. Il metodo per analizzare i singoli spermatozoi è stato immediatamente trovato uso pratico in medicina legale, poiché la tipizzazione HLA delle cellule aploidi consente di accertare la paternità o identificare il criminale (il complesso HLA è un insieme di geni del complesso maggiore di istocompatibilità umano; i loci del complesso HLA sono i più polimorfici di tutti quelli conosciuti in vertebrati superiori: all'interno di una specie, in ciascun locus è presente un insolito gran numero di alleli diversi (forme alternative dello stesso gene).

Utilizzando la PCR è possibile determinare la corretta integrazione di strutture genetiche estranee in una regione predeterminata del genoma delle cellule studiate. Il DNA cellulare totale viene ricotto a due primer oligonucleotidici, uno dei quali è complementare a una porzione del DNA ospite vicino al punto di inserimento e l'altro alla sequenza del frammento integrato nel filamento antiparallelo del DNA. La reazione a catena della polimerasi, nel caso di una struttura del DNA cromosomico invariata nel sito di inserimento previsto, porta alla formazione di frammenti di DNA a filamento singolo di dimensioni sconosciute e, nel caso di un inserimento pianificato, frammenti di DNA a doppio filamento di dimensione sconosciuta. dimensione nota, determinata dalla distanza tra i siti di ricottura di due primer. Inoltre, il grado di amplificazione della regione del genoma analizzato nel primo caso dipenderà linearmente dal numero di cicli e nel secondo caso sarà esponenziale. L'accumulo esponenziale di un frammento amplificato di dimensioni predeterminate durante la PCR ci consente di osservarlo visivamente dopo il frazionamento elettroforetico del preparato di DNA e di trarre una conclusione inequivocabile sull'inserimento di una sequenza estranea in una determinata regione del DNA cromosomico.

Conclusione

Il metodo PCR è attualmente ampiamente utilizzato come metodo per diagnosticare varie malattie infettive. La PCR consente di identificare l'eziologia di un'infezione anche se il campione prelevato per l'analisi contiene solo poche molecole di DNA dell'agente patogeno. La PCR è ampiamente utilizzata nella diagnosi precoce delle infezioni da HIV, dell’epatite virale, ecc. Oggi non esiste quasi nessun agente infettivo che non possa essere rilevato utilizzando la PCR.

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Per adeguato e trattamento efficace Molte malattie infettive richiedono un’identificazione tempestiva diagnosi accurata. Per risolvere questo problema oggi vengono utilizzati metodi diagnostici ad alta tecnologia basati su metodi di biologia molecolare. Al momento, la reazione a catena della polimerasi (PCR) è già ampiamente utilizzata nella medicina pratica come lo strumento diagnostico di laboratorio più affidabile.

Cosa spiega la popolarità attuale della PCR?

Innanzitutto, questo metodo viene utilizzato per identificare gli agenti patogeni di varie malattie infettive con elevata precisione.

In secondo luogo, monitorare l’efficacia del trattamento.

In vari manuali, opuscoli, articoli, nonché spiegazioni di medici specialisti, spesso ci imbattiamo nell'uso di termini e parole incomprensibili. È davvero difficile parlare di prodotti scientifici ad alta tecnologia con parole quotidiane.

Qual è l'essenza e la meccanica della diagnostica PCR?

Ogni organismo vivente ha i suoi geni unici. I geni si trovano nella molecola del DNA, che in realtà è il “biglietto da visita” di ogni singolo organismo. Il DNA (materiale genetico) è una molecola molto lunga costituita da elementi costitutivi chiamati nucleotidi. Per ciascun agente patogeno delle malattie infettive si trovano in modo rigorosamente specifico, cioè in una determinata sequenza e combinazione. Quando è necessario capire se una persona ha un particolare agente patogeno, viene prelevato materiale biologico (sangue, urina, saliva, striscio), che contiene DNA o frammenti di DNA del microbo. Ma la quantità di materiale genetico dell'agente patogeno è molto piccola ed è impossibile dire a quale microrganismo appartiene. La PCR viene utilizzata per risolvere questo problema. L'essenza della reazione a catena della polimerasi è che viene prelevata una piccola quantità di materiale per la ricerca contenente DNA e durante il processo PCR aumenta la quantità di materiale genetico appartenente a uno specifico agente patogeno e, quindi, può essere identificato.

Diagnostica PCR – studio genetico del biomateriale.

L'idea del metodo PCR appartiene allo scienziato americano K. Mullins, che propose nel 1983. Tuttavia, ha ricevuto un uso clinico diffuso solo a metà degli anni '90 del XX secolo.

Comprendiamo la terminologia, di cosa si tratta: DNA, ecc. Ogni cellula di qualsiasi creatura vivente (animale, pianta, uomo, batteri, virus) ha cromosomi. I cromosomi sono i custodi delle informazioni genetiche che contengono l'intera sequenza genetica di ogni specifico essere vivente.

Ogni cromosoma è costituito da due filamenti di DNA attorcigliati a spirale l'uno rispetto all'altro. Il DNA è chimicamente acido desossiribonucleico, costituito da componenti strutturali: nucleotidi. Esistono 5 tipi di nucleotidi: timina (T), adenosina (A), guanina (G), citosina (C) e uracile (U). I nucleotidi sono disposti uno dopo l'altro in una sequenza strettamente individuale, formando i geni. Un gene può essere costituito da 20-200 di tali nucleotidi. Ad esempio, il gene che codifica per la produzione di insulina è formato da 60 coppie di nucleotidi.

I nucleotidi hanno la proprietà della complementarità. Ciò significa che di fronte all'adenina (A) in una catena di DNA c'è necessariamente la timina (T) in un'altra catena, e di fronte alla guanina (G) c'è la citosina (C). Schematicamente appare così:
G-C
T-A
A
Questa proprietà di complementarità è fondamentale per la PCR.

Oltre al DNA, l'RNA ha la stessa struttura: l'acido ribonucleico, che differisce dal DNA in quanto utilizza l'uracile invece della timina. L'RNA è il custode delle informazioni genetiche in alcuni virus chiamati retrovirus (ad esempio l'HIV).

Le molecole di DNA e RNA possono “moltiplicarsi” (questa proprietà viene utilizzata per la PCR). Ciò avviene come segue: due filamenti di DNA o RNA si allontanano l'uno dall'altro e su ciascun filamento si trova un enzima speciale che sintetizza una nuova catena. La sintesi procede secondo il principio di complementarità, cioè se la catena del DNA originale contiene il nucleotide A, allora quella appena sintetizzata conterrà T, se G, allora C, ecc. Per iniziare la sintesi, questo speciale enzima "costruttore" ha bisogno di un "seme" - una sequenza di 5-15 nucleotidi. Questo “primer” è definito per ciascun gene (gene della clamidia, micoplasma, virus) sperimentalmente.

Pertanto, ogni ciclo PCR è composto da tre fasi. Nella prima fase avviene il cosiddetto srotolamento del DNA, cioè la separazione di due filamenti di DNA collegati tra loro. Nella seconda, il “seme” è attaccato ad una sezione del filamento di DNA. E infine, l’allungamento di questi filamenti di DNA, prodotto da un enzima “costruttore”. Attualmente tutto questo processo difficile avviene in una provetta e consiste in cicli ripetuti di moltiplicazione del DNA rilevabile al fine di ottenere un gran numero di copie, che possono poi essere rilevate con metodi convenzionali. Cioè, da un filamento di DNA ne ricaviamo centinaia o migliaia.

Fasi della ricerca sulla PCR

Raccolta di materiale biologico per la ricerca

Come campione vengono utilizzati vari materiali biologici: sangue e suoi componenti, urina, saliva, secrezione delle mucose, liquido cerebrospinale, secrezione superfici della ferita, contenuto delle cavità corporee. Tutti i campioni biologici vengono raccolti con strumenti monouso e il materiale raccolto viene posto in provette di plastica sterili o posto su terreni di coltura, con successivo trasporto al laboratorio.

I reagenti necessari vengono aggiunti ai campioni raccolti e posti in un termostato programmabile - un termociclatore (amplificatore). Nell'amplificatore, il ciclo PCR, composto da tre fasi (denaturazione, ricottura ed estensione), viene ripetuto 30-50 volte. Cosa significa questo? Diamo uno sguardo più da vicino.

Fasi della reazione PCR diretta, copia del materiale genetico

IOFase PCR - Preparazione del materiale genetico per la copia.
Si verifica ad una temperatura di 95 ° C, mentre i filamenti di DNA sono separati e i “semi” possono depositarsi su di essi.

I “semi” vengono prodotti industrialmente da varie associazioni di ricerca e produzione, mentre i laboratori acquistano quelli già pronti. Allo stesso tempo, il "primer" per identificare, ad esempio, la clamidia, funziona solo per la clamidia, ecc. Pertanto, se un biomateriale viene testato per la presenza di un'infezione da clamidia, nella miscela di reazione viene inserito un "primer" per la clamidia; se il biomateriale viene testato per il virus Epstein-Barr, allora è anche un “seme” per il virus Epstein-Barr.

IIfase – Combinazione del materiale genetico dell’agente infettivo e del “seme”.
Se è presente il DNA di un virus o di un batterio rilevabile, il “primer” si trova su questo DNA. Questo processo di aggiunta di un “primer” è la seconda fase della PCR. Questa fase avviene ad una temperatura di 75°C.

IIIfase - Copia del materiale genetico dell'agente infettivo.
Questo è il processo di allungamento o moltiplicazione del materiale genetico, che avviene a 72°C. L'enzima “costruttore” si avvicina ai “semi” e sintetizza una nuova catena di DNA. Con la fine della sintesi di una nuova catena di DNA, il ciclo della PCR termina. Cioè, in un ciclo PCR la quantità di materiale genetico raddoppia. Ad esempio, il campione iniziale conteneva 100 molecole di DNA di un virus; dopo il primo ciclo di PCR, il campione conterrà già 200 molecole di DNA del virus in esame. Un ciclo dura 2-3 minuti.

Per generare una quantità sufficiente di materiale genetico per l'identificazione, vengono solitamente eseguiti 30-50 cicli di PCR, che richiedono 2-3 ore.

Stadio di identificazione del materiale genetico propagato

In realtà la PCR finisce qui e poi arriva la fase non meno significativa dell'identificazione. Per l'identificazione viene utilizzato il metodo dell'elettroforesi o i "semi" etichettati. Quando si utilizza l'elettroforesi, i filamenti di DNA risultanti vengono separati per dimensione e la presenza di frammenti di DNA di diversa lunghezza indica un risultato positivo del test (ovvero la presenza di un particolare virus, batteri, ecc.). Quando si utilizzano i "semi" etichettati, al prodotto della reazione finale viene aggiunto un cromogeno (colorante), a seguito del quale la reazione enzimatica è accompagnata dalla formazione del colore. Lo sviluppo del colore indica direttamente che nel campione originale è presente un virus o un altro agente rilevabile.

Oggi, utilizzando “semi” etichettati e software appropriati, è possibile “leggere” immediatamente i risultati della PCR. Questa è la cosiddetta PCR in tempo reale.

Perché la diagnostica PCR è così preziosa?

Uno dei vantaggi significativi del metodo PCR è la sua elevata sensibilità, dal 95 al 100%. Tuttavia, tali benefici devono basarsi sul rigoroso rispetto delle seguenti condizioni:

1. corretta raccolta e trasporto del materiale biologico;
2. disponibilità di strumenti sterili e monouso, laboratori speciali e personale formato;
3. rigorosa aderenza alla metodologia e sterilità durante l'analisi

La sensibilità varia tra i diversi microbi rilevati. Ad esempio, la sensibilità del metodo PCR per rilevare il virus dell'epatite C è del 97-98%, la sensibilità per rilevare l'ureaplasma è del 99-100%.

Le capacità inerenti all'analisi PCR consentono una specificità analitica senza rivali. Ciò significa identificare esattamente il microrganismo ricercato e non uno simile o strettamente correlato.
Sensibilità diagnostica e la specificità del metodo PCR sono spesso superiori a quelle del metodo colturale, chiamato “gold standard” per l’individuazione delle malattie infettive. Considerando la durata della coltivazione della coltura (da diversi giorni a diverse settimane), il vantaggio del metodo PCR diventa evidente.

La PCR nella diagnosi delle infezioni
I vantaggi del metodo PCR (sensibilità e specificità) determinano un'ampia gamma di applicazioni nella medicina moderna.
Le principali aree di applicazione della diagnostica PCR:

1. diagnosi di malattie infettive acute e croniche di varie localizzazioni
2. monitorare l’efficacia della terapia
3. chiarimento del tipo di agente patogeno

La PCR viene utilizzata in ostetricia, ginecologia, neonatologia, pediatria, urologia, venereologia, nefrologia, clinica di malattie infettive, oftalmologia, neurologia, tisiopolmonologia, ecc.

L'uso della diagnostica PCR viene effettuato in combinazione con altri metodi di ricerca (ELISA, PIF, RIF, ecc.). La loro combinazione e adeguatezza sono determinate dal medico curante.

Agenti infettivi rilevati mediante PCR

Virus:

1. retrovirus HIV-1 e HIV-2
2. virus erpetiformi
3. virus herpes simplex 1 e 2 tipi

Recentemente, un affidabile, altamente sensibile e metodo rapido diagnosi di varie malattie infettive umane. Questo metodo è chiamato “analisi PCR”. Cos'è, qual è la sua essenza, quali microrganismi può identificare e come assumerlo correttamente, te lo diremo nel nostro articolo.

Storia della scoperta

I metodi PCR vengono utilizzati anche nella diagnosi del cancro.

Vantaggi del metodo

La diagnostica PCR presenta numerosi vantaggi:

1. Alta sensibilità. Anche se sono presenti solo poche molecole di DNA di microorganismi, l’analisi PCR determina la presenza di infezione. Il metodo aiuterà con malattie croniche e latenti. Spesso in questi casi il microrganismo non è altrimenti coltivabile.
2. Qualsiasi materiale è adatto alla ricerca, ad esempio saliva, sangue, secrezioni genitali, capelli, cellule epiteliali. Il più comune è il test PCR del sangue e dello striscio urogenitale.

   

3. Non è richiesta alcuna coltivazione a lungo termine delle colture. Il processo diagnostico automatizzato consente di ottenere i risultati della ricerca dopo 4-5 ore.
4. Il metodo è affidabile quasi al cento per cento. Sono stati registrati solo casi isolati di risultati falsi negativi.
5. La capacità di identificare diversi tipi di agenti patogeni da un campione di materiale. Ciò non solo accelera il processo di diagnosi della malattia, ma riduce anche significativamente i costi dei materiali. Spesso il medico prescrive un test PCR complesso. Il costo di un esame consistente nell’identificazione di sei agenti patogeni è di circa 1.500 rubli.

Affinché i risultati siano affidabili durante lo studio sulla PCR, è necessario eseguire il test, seguendo le raccomandazioni per la preparazione preliminare alla diagnosi:

1. Prima di donare la saliva è necessario astenersi dal mangiare e dall'assumere farmaci 4 ore prima della raccolta del materiale. Immediatamente prima della procedura, sciacquare la bocca con acqua bollita.
2. Le regole di cui sopra dovrebbero essere seguite anche quando si preleva un campione dalla superficie interna della guancia. Dopo il risciacquo si consiglia di effettuare un leggero massaggio della pelle per liberare la secrezione della ghiandola.
3. L'urina viene solitamente raccolta a casa. Per fare questo, è necessario pulire a fondo i genitali. 50-60 ml di urina devono essere raccolti in un contenitore di plastica sterile. Per garantire la purezza del materiale, si consiglia alle donne di inserire un tampone nella vagina e agli uomini di tirare indietro il più possibile la piega della pelle. Non puoi donare materiale durante il periodo mestruale.
4. Per donare lo sperma è necessario astenersi dai rapporti sessuali per 3 giorni prima del prelievo del materiale. I medici consigliano inoltre di evitare di visitare la sauna e di fare un bagno caldo, di bere alcolici e cibi piccanti. Dovresti astenervi dall'urinare 3 ore prima del test.
5. Ad esempio, se viene eseguito un test PCR per la clamidia, si consiglia sia alle donne che agli uomini di avere un riposo sessuale per 3 giorni. 2 settimane prima del test non dovresti assumere farmaci antibatterici. Per una settimana è necessario smettere di usare gel intimi, unguenti, supposte vaginali e lavande. 3 ore prima del test dovresti astenervi dall'urinare. Durante le mestruazioni non viene raccolto materiale; solo 3 giorni dopo la cessazione del sanguinamento è possibile eseguire uno striscio urogenitale.

PCR durante la gravidanza

Durante l'attesa di un bambino, molte malattie infettive a trasmissione sessuale sono estremamente pericolose sviluppo normale feto Le malattie sessualmente trasmissibili possono causare ritardo della crescita intrauterina, aborto spontaneo o parto prematuro e difetti congeniti del bambino. Pertanto, è estremamente importante andare a fasi iniziali esame di gravidanza utilizzando il metodo PCR. Il test deve essere sostenuto al momento della registrazione - fino a 12 settimane.



Il materiale viene raccolto dal canale cervicale utilizzando uno spazzolino speciale. La procedura è indolore e non rappresenta un pericolo per il bambino. Di solito, durante la gravidanza, viene eseguita un'analisi per la clamidia utilizzando il metodo PCR, nonché per l'ureaplasmosi, la micoplasmosi, il citomegalovirus, l'herpes e il papillomavirus. Questa serie di esami è chiamata PCR-6.

PCR per la diagnosi dell'HIV

Dato che il metodo è molto sensibile ai cambiamenti del corpo e alle condizioni diagnostiche, molti fattori possono influenzare il risultato. Pertanto, l’analisi PCR per l’infezione da HIV non è un metodo affidabile; la sua efficacia è del 96-98%. Nel restante 2-4% dei casi il test dà risultati falsi positivi.

Ma in alcune situazioni, non puoi fare a meno della diagnostica PCR dell'HIV. Di solito viene eseguito su persone con un risultato ELISA falso negativo. Tali indicatori indicano che una persona non ha ancora sviluppato anticorpi contro il virus e non possono essere rilevati senza un aumento multiplo del numero. Questo è esattamente ciò che si può ottenere eseguendo un esame del sangue utilizzando il metodo PCR.

Tale diagnosi è necessaria anche per i bambini nel primo anno di vita nati da madre sieropositiva. Il metodo è l'unico modo determinazione affidabile dello status del bambino.

PCR per la diagnosi dell'epatite

Il metodo della reazione a catena della polimerasi consente di rilevare il DNA del virus dell'epatite A, B, C molto prima della formazione di anticorpi contro l'infezione o della comparsa dei sintomi della malattia. Il test PCR per l'epatite C è particolarmente efficace, poiché nell'85% dei casi questa malattia è asintomatica e senza trattamento tempestivo diventa cronica.



Il rilevamento tempestivo dell'agente patogeno aiuterà ad evitare complicazioni e trattamenti a lungo termine.

Esame PCR completo

Analisi PCR completa: esame utilizzando il metodo della reazione a catena polimesica, che comprende la determinazione simultanea di diversi tipi di infezioni: micoplasma genitalium, micoplasma hominis, Gardnerella vaginalis, candida, trichomonas, citomegalovirus, herpes di tipo 1 e 2, gonorrea, papillomavirus. Il prezzo di tale diagnostica varia da 2.000 a 3.500 rubli. a seconda della clinica, dei materiali e delle attrezzature utilizzate, nonché del tipo di analisi: qualitativa o quantitativa. Il medico deciderà quale è necessario nel tuo caso. In alcuni casi è sufficiente determinare semplicemente la presenza dell'agente patogeno, in altri, ad esempio nel caso dell'infezione da HIV, il titolo quantitativo gioca un ruolo importante. Quando si diagnosticano tutti i patogeni di cui sopra, l’esame viene chiamato “analisi PCR-12”.

Decodificare i risultati dell'analisi

Decifrare l'analisi PCR non è difficile. Ci sono solo 2 scale dell'indicatore: " risultato positivo" e "risultato negativo". Se viene rilevato un agente patogeno, i medici possono confermare la presenza della malattia con una sicurezza del 99% e iniziare a curare il paziente. Con il metodo quantitativo per determinare l'infezione, l'indicatore numerico dei batteri rilevati verrà indicato nella colonna corrispondente. Solo un medico può determinare l'entità della malattia e prescrivere il trattamento necessario.



In alcuni casi, ad esempio, quando si determina l'infezione da HIV utilizzando il metodo PCR, se il risultato è negativo, diventa necessario condurre ulteriori esami per confermare gli indicatori ottenuti.

Dove posso fare il test?

Dove fare un test PCR: in una clinica pubblica o in un laboratorio privato? Sfortunatamente, nelle istituzioni mediche municipali, le attrezzature e i metodi sono spesso obsoleti. Pertanto, è meglio dare la preferenza ai laboratori privati ​​con attrezzature moderne e personale altamente qualificato. Inoltre, in una clinica privata otterrai risultati molto più velocemente.

A Mosca molti laboratori privati ​​offrono test PCR per varie infezioni. Ad esempio, in cliniche come "Vita", "Complex Clinic", "Happy Family", "Uro-Pro" viene eseguita l'analisi PCR. Il prezzo dell'esame è di 200 rubli. per identificare un agente patogeno.

Si può concludere che la diagnosi di malattie infettive mediante il metodo PCR nella maggior parte dei casi è un modo rapido e affidabile per rilevare l'agente patogeno nel corpo nelle prime fasi dell'infezione. Tuttavia, in alcuni casi vale la pena scegliere altri metodi diagnostici. Solo uno specialista può determinare la necessità di tale studio. Anche decifrare l'analisi PCR richiede un approccio professionale. Segui le raccomandazioni del tuo medico e non eseguire tu stesso esami non necessari.