YLEINEN FARMAKOPEAN ARTIKKELI

Otettu käyttöön korvaamaan FS 42-3874-99:ssä esitetyn menetelmän

Tämä yleinen farmakopean monografia on tarkoitettu antigeenisen koostumuksen tutkimiseen biologisia materiaaleja, sekä määrittää immunobiologisen puhtauden, laadullisen ja kvantitatiivisen koostumuksen lääkkeet(ILP) immunoelektroforeesilla (IEF) agargeelissä, jossa yhdistyvät vyöhykeelektroforeesin ja immunodiffuusiomenetelmät.

Immunoelektroforeesiprosessissa geeleissä tai selluloosa-asetaattikalvoilla käyttämällä yksinkertaisia ​​tai kaksois-immunodiffuusiomenetelmiä liukoisten proteiinien ja niille spesifisten saostuvien vasta-aineiden välillä tapahtuu reaktio. Proteiinien kvantitatiivinen määritys voidaan suorittaa elektroforeesilla vasta-aineita sisältävässä väliaineessa (sähköimmunomääritys, sähköimmunodiffuusio, raketti-immunoelektroforeesi). Proteiinikomponenttien antigeenistä luonnetta voidaan tutkia vertaamalla niitä tunnettuihin markkereihin.

Immunokemiallisten testien tehokkuus riippuu käytettyjen antiseerumien spesifisyydestä sekä niiden tiitteristä ja affiniteetista antigeeneihin.

Tyypillisesti immunoelektroforeesi on agar- (tai agaroosi) geelielektroforeesin yhdistelmä, jota seuraa kaksois-immunodiffuusio samassa väliaineessa. Kaksiulotteisessa kaksoisimmunodiffuusiossa antigeeni ja vasta-aineet, jotka on sijoitettu pyöreisiin tai suorakaiteen muotoisiin syvennyksiin geelissä, kulkeutuvat toisiaan kohti, mikä johtaa saostumisviivojen (kaarien) muodostumiseen, kun ne kohtaavat. Saostumisvyöhykkeiden sijainti riippuu antigeenin diffuusiokertoimesta ja sen konsentraatiosta suhteessa vasta-aineisiin (vasta-aineen diffuusionopeutta voidaan pitää vakiona). Tiettyä antigeeni- ja vasta-ainepitoisuuksien suhdetta, joka on optimaalinen sakan muodostumiselle, kutsutaan ekvivalenssivyöhykkeeksi. Tämä tuottaa selkeät sadeviivat.

Vasta-aineiden pitoisuus (tiitteri) immuuniseerumissa voi myös vaihdella merkittävästi. Tilanne, jossa seoksen eri komponenttien vastaavuusvyöhykkeet eivät mene päällekkäin, on mahdollista. Vastaavan antigeeni-vasta-ainesuhteen valitsemiseksi on suositeltavaa suorittaa monikomponenttiseosten immunoelektroforeesi useilla suhteellisilla antigeeni-vasta-ainepitoisuuksilla, koska vain yhtä tällaista pitoisuutta käytettäessä tiettyjä komponentteja ei välttämättä havaita.

Agar-geeli-immunoelektroforeesimenetelmä

Alkoholilla käsitelty lasilevy, jonka mitat ovat 90x120 mm, asetetaan tiukasti vaakasuoraan esinelavalle. Agar-geeliä, joka on jäähdytetty lämpötilaan (45±5) 0 C, levitetään lasilevylle 18,0-20,0 ml. Huoneenlämmössä kovettumisen jälkeen 20-30 minuutin kuluttua levylle muodostuu agar-kerros, jonka paksuus on 2,0-2,5 mm.

Geelin kovettumisen jälkeen siihen leikataan erityisellä kaavaimella 6-7 reikää, joiden halkaisija on 1-2 mm. Kuopat täytetään testinäytteellä tilavuudessa, joka ei ylitä kuopan tilavuutta (2 kuoppaa jokaista testinäytettä kohti). Tässä tapauksessa kontrollinäyte lisätään lasilevyn ylempään ja alempaan kuoppaan geelillä - normaali ihmisen veriseerumi ("Testijärjestelmän standardinäyte ihmisen veriseerumista valmistettujen valmisteiden fraktionaalisen (antigeenisen) koostumuksen määrittämiseksi" immunoelektroforeesi" tai muu kontrollinäyte farmakopean monografian tai säädösasiakirjojen ohjeiden mukaisesti, värjätty pyroniini B:llä (tai muulla farmakopean monografiassa tai säädösasiakirjoissa määritellyllä väriaineella).

Lisää 500 ml veronal-medinaali- tai boraattipuskuriliuosta 1000 ml:n mittasylinteriin, säädä liuoksen tilavuus merkkiin puhdistetulla vedellä ja sekoita. Saatu liuos (tai muu puskuriliuos, joka on määritelty farmakopean monografiassa tai säädösdokumentaatiossa) kaadetaan elektroforeesilaitteen kammion elektrodiosiin.

Levy, jossa on valmistettu geeli, asetetaan elektroforeesilaitteeseen ja liitetään puskuriliuokseen laitteen elektrodikammioissa käyttämällä useita kerroksia suodatinpaperia. Jos kyseessä on elektroforeesilaitteen rakenne, jossa agar yhdistetään levyllä elektrodipuskurilla agarkolonneja käyttäen, levy asennetaan tasapainotettuun laitteeseen ja kaadetaan sulalla agarilla, kunnes se yhdistyy agarpylväiden ja geelikerroksen kanssa. Muodostuu 1-2 mm paksu.

Elektroforeesilaite peitetään kannella ja virtalähde on kytketty päälle (jännite 70-200 V, virta 10-40 mA). Elektroforeesia suoritetaan 1,5-3 tunnin ajan, kunnes pyroniini B:n täplä, joka vastaa albumiinin kulkeutumista, on 20-25 mm:n etäisyydellä kuopasta.

Elektroforeesin jälkeen agargeelin kuoppien väliin leikataan pitkittäiset "urat" (samansuuntaiset vaellussuunnan kanssa) käyttämällä erityistä stensiiliä. 0,25 ml saostuvaa antiseerumia lisätään "uriin": ihmisveren seerumiproteiineja vastaan ​​(testattaessa fraktiokoostumusta) tai moniarvoista seerumia ihmisveren seerumiproteiineja vastaan, suuri karjaa, hevoset ja siat (aitouden vahvistamiseksi).

Levy agargeelillä asetetaan kosteaan kammioon ja pidetään (5 ± 3) 0 °C:n lämpötilassa 24 - 48 tuntia.

Saostusreaktioon osallistumattomien proteiinien pesemiseksi pois agarlevy laitetaan kyvetteihin, täytetään 0,9 % natriumkloridiliuoksella ja inkuboidaan 16-18 tuntia.Liuos vaihdetaan 3-4 kertaa. Levy poistetaan sitten 0,9-prosenttisesta natriumkloridiliuoksesta, peitetään suodatinpaperilla, joka on kastettu 0,9-prosenttiseen natriumkloridiliuokseen, ja ilmakuivataan, kunnes agargeeli muuttuu ohueksi kalvoksi. Tämän jälkeen levy, jossa on kuivattu geeli, peitetään suodatinpaperilla, joka on kastettu 0,9 % natriumkloridiliuokseen jättämättä ilmakuplia, ja kuivataan huoneenlämpötilassa tai uunissa enintään 40°C:n lämpötilassa. Levyn kuivaamisen jälkeen suodatinpaperi kostutetaan vedellä ja poistetaan varovasti.

Proteiinien värjäykseen käytetään amido black dye 10B:tä tai muuta sopivaa väriainetta (farmakopean monografian tai säädösdokumentaation ohjeiden mukaisesti) asettamalla levy kyvettiin, jossa on väriliuos 30-40 minuutiksi. Sitten levyä pestään agar-agar-pesuliuoksessa (2-prosenttinen etikkahappoliuos tai muu liuos säädösdokumenttien ohjeiden mukaisesti) 15-40 minuuttia, kunnes värillinen tausta on kokonaan poissa, ja kuivataan uudelleen huoneenlämmössä. tai kuivauskaapissa alle 40°C:n lämpötilassa.

Lipoproteiinit värjätään Sudan black B:llä. Värjäämistä varten täysin kuivatut levyt asetetaan väriaineliuokseen 3 tunniksi, minkä jälkeen niistä poistetaan väriä 50 % etanolilla, kunnes tausta on täysin kirkastunut. Lipoproteiinit värjätään tummansiniseksi. Värjäys on suoritettava täysin kuivatulle valmisteelle, koska Sudan black B on veteen liukenematon ja värjää kostean geelin.

Tulosten huomioon ottaminen tutkittaessa ihmisen immunoglobuliinivalmisteiden fraktiokoostumusta suoritetaan visuaalisesti vertaamalla testinäytteen elektroferogrammia kontrollinäytteen elektroferogrammiin - normaali ihmisen veriseerumi ("Testijärjestelmän standardinäyte fraktio- () antigeeninen) valmisteiden koostumus ihmisen veren seerumista immunoelektroforeesilla" tai muulla säädösdokumentaation ohjeiden mukaisella kontrollinäytteellä), jossa on oltava säännelty määrä saostuslinjoja seerumilla ihmisen seerumin proteiineja vastaan ​​(vähintään 15 saostusviivaa käytettäessä " Vakionäyte testijärjestelmät lääkkeiden fraktionaalisen (antigeenisen) koostumuksen määrittämiseksi ihmisen veren seerumista käyttämällä immunoelektroforeesimenetelmää"). Ihmisen immunoglobuliinivalmisteen pääkomponentin on vastattava normaalin ihmisen veriseerumin immunoglobuliini G:tä (Ig G).

Tulosten huomioon ottaminen suoritettaessa tutkimuksia ihmisen verituotteiden aitouden vahvistamiseksi suoritetaan visuaalisesti tunnistamalla saostuslinjat seerumilla ihmisten, nautakarjan, hevosten ja sikojen veren seerumiproteiineja vastaan. Saostumislinjat tulee havaita vain seerumilla ihmisen seerumin proteiineja vastaan.

Huomautuksia

1. 0,05 M veronaali-medinaalipuskuriliuoksen valmistus(pH 8,6±0,1). Lisää 1,38 g veronaalia ja 8,76 g mediaalia 1000 ml:n mittapulloon, lisää puhdistettua vettä merkkiin asti ja sekoita, kunnes se on täysin liuennut.

1. 0,05 M boraattipuskuriliuoksen valmistus(pH 8,6±0,1). Lisää 6,7 g 1000 ml:n mittapulloon boorihappo, 13,4 g natriumtetraboraatti 10-vettä, lisää puhdistettua vettä merkkiin ja sekoita.
2. 1,25 % agargeelin valmistus. Agar-geeli valmistetaan jollakin seuraavista tavoista:
3. 1,25-prosenttisen agargeelin valmistamiseksi käytä 0,05 M veronal-medinaalipuskuria (pH 8,6 ± 0,1), jossa on kaksinkertainen suolapitoisuus (vastaavasti 2,76 g veronaalia ja 17,52 g medinaalia 1000 ml:ssa puhdistettua vettä).
4. 1,25 % agargeelin valmistamiseksi käytä boraattipuskuriliuosta (pH 8,6±0,1), jossa on kaksinkertainen suolapitoisuus (vastaavasti: 13,4 g boorihappoa ja 26,8 g natriumtetraboraattia 10-vesipitoista 1000 ml:ssa puhdistettua vettä).

12,5 g agaria lisätään 1000 ml:n dekantterilasiin, lisätään 500 ml puhdistettua vettä ja geelin annetaan turvota tunnin ajan lämpötilassa (20±1) 0 C. Dekantterilasi sisältöineen laitetaan kiehuvaan vesihauteeseen ja pidetään, kunnes agar on täysin sulanut. Geeliliuoksen tilavuus säädetään 500 ml:ksi vedellä, jonka jälkeen lisätään vastaava määrä veronaali-medinaali- tai boraattipuskuriliuosta (tai muuta puskuriliuosta, joka on määritelty farmakopean monografiassa tai säädösasiakirjoissa). Agarliuos suodatetaan 2-3 sidekerroksen läpi, lisätään tiomersaalia pitoisuuteen 100 µg/ml ja kaadetaan 40-50 ml:n pulloihin (kahdelle levylle tarvittava määrä). Sulan agar tulee olla kirkasta.

1. Amido black 10B -väriliuoksen valmistus. Väriaineliuos valmistetaan jollakin seuraavista tavoista:
2. Lisää 1,0 g amidimustaa 10B, 450 ml 0,1 M etikkahappoliuosta, 550 ml 0,1 M natriumasetaattiliuosta 1000 ml:n mittapulloon ja sekoita.
3. Lisää 1,0 g amidimustaa 10B ja 100 ml jääetikkaa 1000 ml:n mittapulloon, säädä tilavuus merkkiin puhdistetulla vedellä ja sekoita. Suodata 12 tunnin kuluttua paperisuodattimen läpi.
4. Väriliuoksen valmistus Sudan black V. Lisää 1,2 g mustaa Sudan B:tä, 20 ml 1 M natriumhydroksidiliuosta, 380 ml puhdistettua vettä 1000 ml:n mittapulloon ja säädä liuoksen tilavuus absoluuttisella etanolilla merkkiin ja sekoita. Seosta keitetään lyhyen aikaa, jäähdytetään huoneenlämpötilaan ja jäähdytyksen jälkeen väriaine kaadetaan tummaan pulloon, jossa on hiottu tulppa. Reagenssia säilytetään huoneenlämmössä 3 kuukautta.
5. 2-prosenttisen etikkahappoliuoksen valmistus agarin pesua varten. Lisää 20,0 ml jääetikkaa 1000 ml:n mittapulloon, säädä liuoksen tilavuus merkkiin puhdistetulla vedellä ja sekoita. Reagenssia säilytetään huoneenlämmössä 3 kuukautta.

Laboratoriolaitteisto Keksintö koskee laboratoriolaitteita. Keksinnön tarkoituksena on lyhentää tutkimusaikaa ja vähentää geelin kulutusta. Laite sisältää kyvetin 1, väliseinän 2, puskuriliuoksen 3, geelipidikkeen 4 kannella 11 ja elektrodit 12. Pitimeen 4 on tehty sen työpinnalle vaakasuorat urat, jotka on yhdistetty kanavilla, joissa on ontelot vastakkaisilla puolilla. osiosta. Kannessa 11 on rivit reikiä 7 ja 8, jotka sijaitsevat pareittain kunkin uran yläpuolella. Teline ja kansi on valmistettu läpinäkyvästä materiaalista. Seerumit asetetaan reikiin 7 ja 8 ja virta kytketään päälle. Reaktion seurauksena muodostuu sakka, jota käytetään arvioimaan antigeenin läsnäolo tai puuttuminen. Reaktio tapahtuu suljetussa lohkossa; geeli ei täytä koko pidikettä, vaan vain urat, mikä mahdollistaa sen kulutuksen vähentämisen. 1 palkka f-ly, 3 sairas.

NEUVOSTOLIITTO

SOSIALISTI

TASAVALTA

KEKSINNÖN KUVAUS

BTOPCKOMY SERTIFIKAATTIIN

VALTIOKOMITEA

KEKSINNÖISTÄ JA LÖYTÖSTÄ

Neuvostoliiton valtion tiede- ja teknologiakomiteassa

1 2) 11 4) 6111(1>(-1-1 (221 1(1.(n>.X7))

I 4t> I;3(I. I (j.>Ü. I «>. i X 4(1 (711 Veeeon)zn>>y n(e.(b(ni i and konetr3ktrskiy nne git ug 31(nninekoy lbor)) >triple technpki (721 V. (!. (:obole(3, . 3. V. bap(tano>3, V.. 1. Von,iüåv ja 3. V.;;r3 IIHh(>v)

N ()6)7471), luokka. A 6! Kohdassa 5i ():), 1(177.

1541 U(. E C3(g1(:Th() L, 15(!! P()BE:.,(.1!1! SI)

1! U:) (U((OE.1()..(;TR(.)FOR! .3>"3 V (l, 1(. (. (571) AND (571 AND) ()()j) ()),"(onvin) I I(.lb tt 3(>()е l (.<.>„„SU„„15179 8 A 1 (5() 4 A b(B 5/04, C(01 3 33) 48)

2 eo ja (1.11 hv>ttl g„(, osio Ђ”, b 1),(, ter”t.>b 4 gel e kansi 11 II s. (elektrolit 12. Pitimessä 4 sen päällä

Raen>i ll OVSRKNOETn VYPO.>N kibl G)RIZONt;1.>bHl,i(113>bi, yhdistetty (kanavat onteloilla pitkin E);t 1 p(>zoch.,((pidike ja kansi ovat valmistettu luonnollisesta h;>ts rialista. Sy(>s>rotki ps>m“p11>n>t gveretiya 7 ja 8 and on)11)n>t lohko withania. In re T 3T(. reaktio(( ii obrdz3e1 ja; i.t(>h, ja kT()I) «%ted e) lyat o n,), (ja «Hll lt, lit o «: an. l (ll »p ja ll. k().). 1it 13 3 1 kE>tT(>M (<.1>h(, Г(. lь 3,!в

tl >t(ll а.(b1, And T(> new>;o 1,1() 3 ъ1еHbllll(Tb (go P;t 1 3, ja

Väite

Keksintö liittyy lääketieteellisiin laitteisiin ja sitä voidaan käyttää veripalveluissa, tartuntatautiosastoilla

6 sairaalaa hoito- ja ehkäisylaitosten kliinisissä diagnostisissa laboratorioissa.

Keksinnön tarkoituksena on lyhentää tutkimusaikaa ja vähentää geelin kulutusta.

Kuvassa 1 näyttää laitteen

II!)()k3äåíèß Red)I(HI(; kid Kuva 2 pidike, leikkaus, kuva 3 sama, ylhäältä katsottuna.

Laite liuoksen 1 immunoelektroforeesiin, joka on jaettu koko pituudelta väliseinällä 2 kahteen osaan, jolloin muodostuu puskuriliuoksella 3 täytettyjä puskurielektroditiloja.

111k osio 2, pidike 4 gs I) on asennettu, joka on läpinäkyvä ja

6 1()k, joka sisältää joukon uria 5, cat()!)bl(. imageK)T autonomisia kanavia, jotka yhdistävät puskurin 3 osion 2 molemmilla puolilla. Jokaisessa kanavassa on kaksi ()Tk3cpcTkIkI b sonorien tuomiseksi niihin ()tki 7 ja actis seerumi 8. Kanavat on erotettu toisistaan ​​ohuella seinämällä 9.

Elektroforeesin suorittamiseksi laitteessa valmistetaan veronal-medinaalipuskuri barbitol.l natriumista (medinaali 17,5 g ja barG>i I I.ld Be!)on 1) l) 2,7 g 1000 ml:ssa dis1 i, h , l)11)()k)k)III()II Voi.

Gol g() govyaz osoitteesta 1)gara fi pMI>

k.(»I1kckIT1), 1 g agaria 100 ml:ssa puskuriliuosta.

11er.l nicha)om elektroforeesiurat 5 zai().)nyak)1 kantaja 0 (agargeeli), 3dT(I geelissä dslak)t syvennykset, yhdessä

I I 3). puskuri 3, pidike ustin B.II)k)dk()T ja osio 2. Cuve Tv

3dk !)I l«d l() l kansi 11 elektrodeilla 2.

Laite toimii seuraavasti.

Kamerassa on vakiojännite. Kun tasavirta kulkee piirielektrodipuskuri – kantaja – puskuri – elektrodi läpi, antigeenit ja vasta-aineet liikkuvat toisiaan kohti ja muodostavat vuorovaikutuksessa paljaalla silmällä näkyvän sakan. Sedimentin avulla voimme arvioida läsnäolon tai poissaolon

10 antigeeniä testiseerumissa. Siten on mahdollista tunnistaa potilaat, joilla on puutiaiskefaliitti, aivokalvontulehdus, seerumihepatiitti ja muut immunologiset sairaudet.

Ehdotetussa suorituslaitteessa -! 5 elektroforeesi, valmistustekniikka yksinkertaistuu merkittävästi, pidike on eliminoitu monimutkainen muotoilu, mutta johtuu siitä, että reaktio tapahtuu suljetussa lohkossa, ja haihtuminen ja muut ulkoiset tekijät ei voi vaikuttaa seerumiin ja uriin 5 sijoitettuun kantoaineeseen, kansi voidaan tehdä litteäksi. Tämä parantaa laatuindikaattoreita.

1. Laite immunoelektroforeesin suorittamiseksi geelissä, joka sisältää kyvetin, elektrodit, väliseinän, joka erottaa kammiokyvetin kahdeksi onteloksi, ja väliseinään asennetun geelipidikkeen, tunnettu siitä, että kyvetin lyhentämiseksi geelin tutkiminen ja kulutuksen vähentäminen, pidike, joka on valmistettu vaakasuorilla urilla työpinnalla, yhdistetty kanavilla kyvetin eri kerroksiin ja varustettu levyllä Ç5, joka on kosketuksessa sen työpintaan ja jossa on reikärivejä. paria jokaisen uran yläpuolella.

Immunoelektroforeesi- yksi laajalti käytetyistä antigeenien kvalitatiivisen analyysin menetelmistä. Kun käytössä on sopiva saostus-AS, sitä voidaan käyttää minkä tahansa antigeeniseoksen tutkimiseen. Erityisesti proteiinit veriseerumista, aivo-selkäydinnesteestä, virtsasta, maidosta, elinuutteista sekä kasvi- ja bakteeriperäisiä proteiineja analysoidaan onnistuneesti. Klinikalla tätä menetelmää käytetään useimmiten paraproteinemian diagnosoinnissa ja immuunipuutostilat. SISÄÄN Oikeuslääketiede sitä käytetään haptoglobiinin ja ryhmäspesifisen komponentin Gc systeemien analysointiin.

Tutkimustyössä immunoelektroforeesi toimii päämenetelmänä monimutkaisten seosten sisältämien proteiinien tunnistamisessa. Se on välttämätön menetelmänä proteiinivalmisteiden puhdistusprosessin johdonmukaisessa seurannassa. Sitä käytetään usein myös näiden lääkkeiden aitouden ja puhtauden valvomiseen. Luonnollisesti menetelmää, jolla on niin laaja käyttökohde, piti muokata ja parantaa eri suuntiin. Uusia kantajia ehdotettiin: agaroosigeeli, PAGE, selluloosa-asetaattikalvot.

Samaan aikaan IEF:ää alettiin yhdistää erilaisia ​​menetelmiä spesifinen värjäys ja fluorokromi entsyymien, hiilihydraattien, lipoproteiinien ja nukleoproteiinien havaitsemiseksi. Yhdistelmänä muiden analyyttisten menetelmien kanssa syntyi levy-immunoelektroforeesi, immunoelektrofokusointi, radioimmunoelektroforeesi jne. Kaksiulotteista IEF:ää on äskettäin ehdotettu kvantitatiiviseen määritykseen käyttämällä polyspesifistä AS:ta. Kaksiulotteisen IEF:n erityinen muunnos voi lisätä sen herkkyyttä RIA-tasolle. Tämä saavutetaan eluoimalla antigeeni elektroforeettisesti pienistä 0,1-10 ml:n lasisäiliöistä. Wime suunnitteli jäähdytyksellä varustetulle IEF:lle laitteen, joka piti automaattisesti vakiona lämpötilan ja virran erotusprosessin aikana.

Tämä laite on erittäin kätevä erilaisten aineiden elektroforeettisen liikkuvuuden määrittämiseen. Termosähköisen jäähdytyksen (Peltier-akku) käyttöä tässä laitteessa suositellaan erityisesti työskenneltäessä entsyymien ja muiden lämpölabiilien aineiden kanssa. Äskettäin on ehdotettu yksinkertaista menetelmää proteiinien erottamiseksi käyttämällä kaksiulotteista elektroforeesia. On tunnettu herkkä menetelmä saostumattomien antigeeni-vasta-ainejärjestelmien määrittämiseksi, joka perustuu mAb:ien käyttöön, ns. kaskadi-IEF, mukaan lukien antigeenien kiinnittäminen elektroforeesin jälkeen, vasta-aineiden kiinnittäminen antigeeneihin, sitoutuneiden vasta-aineiden poistaminen ja niiden kvantitatiivisuus. arviointi.

Immunofiksaatioelektroforeesissa AT erotetaan, ei antigeeni. Tämä on nopea ja taloudellinen menetelmä, se soveltuu erityisen hyvin massaseulomiseen paraproteinemian havaitsemiseksi ja proteiinivalmisteiden saamiseksi. IEF:ssä havaitaan usein häiriöitä prosessin normaalissa kulussa, eikä niiden syytä aina voida heti havaita. Jos esimerkiksi käytetään riittämättömästi puhdistettua agaria, tämä johtaa useimmiten kolmeen rikkomukseen: huonoon geelin muodostukseen, voimakkaaseen sähkösmoosiin ja valmisteiden huonoon värjäytymiseen. Agar, joka ei ole tarpeeksi puhdas, on aina puhdistettava. Kun aloitat työskentelyn uudella agar-annoksella, sinun on ensin testattava sen soveltuvuus. Usein havaitaan, että samoilla antigeeneillä on erilainen elektroforeettinen liikkuvuus ja että ne värjäytyvät eri tavalla, kun kulutetaan eri agar-eriä. IEF:n häiriöiden syy voi olla agarin hydrolyysi, joka johtuu toistuvasta tai liian pitkästä kuumennuksesta.

Hydrolyysiä ilmaisee geelinmuodostusominaisuuksien heikkeneminen ja epätasaisuuksien ilmaantuminen geelin pinnalle. Väärän puskuriliuoksen käyttö voi vaikuttaa elektroforeettiseen erotukseen. Useimmat puskurit tarjoavat hyvän kasvualustan bakteereille ja homeille. Siksi puskurivarasto tulee säilyttää jääkaapissa tai lisätä siihen säilöntäainetta. Elektroforeesikammion täyttävä puskuri tulee vaihtaa vähintään kerran viikossa. Käytettäessä elektrodipuskuria useita kertoja, elektrodin navat on vaihdettava jokaisen erotuksen jälkeen. Kameraliitäntöjen jännite ei yleensä anna meidän arvioida fyysinen voima geelin läpi kulkeva virta, joten piiriin on kytkettävä sarjaan milliampeerimittari. Erotusprosessin aikana virta kasvaa lähes aina. Tämä ilmiö johtuu geelin kuumenemisesta, joka lisääntyy elektroforeesin keston pidentyessä.

Ensimmäisen nousun jälkeen virtapiirissä voi kuitenkin pudota. Tämä johtuu usein geelin puskuriin yhdistävien suodatinpaperiliuskojen kuivumisesta tai jopa itse geelin kuivumisesta. Tässä tapauksessa sinun tulee vähentää puskurin ionivoimakkuutta tai jännitettä kammion liittimissä. Lisäksi kuivuminen voidaan estää käärimällä geelilevy ja paperiliuskat polymeerikalvolla ennen elektroforeesia. On kätevintä työskennellä sellaisen lähteen kanssa, joka tarjoaa jatkuva voima virta (virran stabilointi). On sanomattakin selvää, että IEF:n tulokset riippuvat antigeenien ja antiseerumien laadusta.

Riisi. 8. Immunoelektroforeesin periaate.

Vaihe 1: antigeenin agargeelielektroforeesi. Antigeeni kulkeutuu tietyn hypoteettisen etäisyyden yli.

Vaihe 2: Virta on pois päältä. Agariin leikataan ura ja täytetään vasta-aineilla. Muodostuu sadekaari. Teoreettisesti antigeeni diffundoituu säteittäisesti pistelähteestä ja vasta-aineet diffundoituvat urasta sileässä etuosassa. Antigeenin ja vasta-aineiden optimaalisen suhteen kohdissa muodostuneet sakat muodostavat kaaren. Kaari on lähinnä uraa, jossa antigeenipitoisuus on suurin.

Immunoelektroforeesi auttaa tunnistamaan antigeenit elektroforeettisen liikkuvuuden perusteella, etenkin kun näytteessä on myös muita antigeenejä.

Käyttämällä tätä menetelmää kliinisessä immunologiassa immunoglobuliinien pitoisuus määritetään semikvantitatiivisesti ja myeloomaproteiinit tunnistetaan (kuvio 9).

Riisi. 9. Immunoelektroforeesilla havaitut ihmisen immunoglobuliinien pääluokat veren seerumissa. Kanin antiseerumi lisättiin uraan. Pääglobuliinifraktioiden sijainti on esitetty. Kolme viidestä ihmisen immunoglobuliinien pääluokasta on tunnistettu: IgG, IgA ja IgM. IgG:n saostumisen kaari ulottuu y-alueelta ά2-globuliinialueelle, mikä heijastaa vasta-ainepopulaation äärimmäistä heterogeenisyyttä sekä aminohappokoostumuksessa että kokonaisvarauksessa.

Elektroforeesin ja immunosaostuksen yhdistelmän perusteella on kehitetty useita onnistuneita menetelmiä, joissa jokaisessa antigeenin liike sähkökentässä johtaa sen kosketukseen vasta-aineiden kanssa. Vastaimmunoelektroforeesia voidaan käyttää agarissa positiivisesti varautuneelle elektrodille siirtyvien antigeenien havaitsemiseen.

Kuva 10. Vasta-immunoelektroforeesi. Endosmoosin vuoksi vasta-aineet liikkuvat "taaksepäin" geelissä; antigeeni, joka on negatiivisesti varautunut tietyssä pH:ssa, siirtyy positiiviselle elektrodille ja muodostaa sakan joutuessaan kosketuksiin vasta-aineiden kanssa.

Tämä menetelmä vie vähemmän aikaa ja on herkempi kuin Uchterlonin kaksoisdiffuusio. Sitä käytetään tunnistamaan hepatiitti B -viruksen antigeenit ja vastaavat vasta-aineet, DNA-vasta-aineet systeemisessä lupus erythematosuksessa, autovasta-aineet liukeneville tumaantigeeneille kollagenoosissa ja Asperqilluksen vasta-aineet (presipitiinit) allergisessa bronkopulmonaalisessa aspergilloosissa.

Rakettielektroforeesi on kvantitatiivinen menetelmä, joka sisältää antigeenin lisäämisen vasta-aineita sisältävään geeliin. Saostusviiva on raketin muotoinen, jonka pituus määräytyy antigeenin pitoisuuden mukaan.

Kuva 11. Rakettielektroforeesi. Antigeenille, tässä tapauksessa ihmisen seerumin albumiinille, suoritetaan elektroforeesi vasta-aineita sisältävässä geelissä. Lähtökaivon ja raketin muotoisen kaaren etureunan välinen etäisyys riippuu antigeenipitoisuudesta. Tässä tapauksessa ihmisen seerumin albumiinin suhteelliset pitoisuudet ovat (vasemmalta oikealle) 3, 2 ja 1.

Kuten vastaelektroforeesi, tämä on nopea menetelmä, mutta myös tässä antigeenin täytyy siirtyä positiivisesti varautuneelle elektrodille. Siten rakettielektroforeesi soveltuu proteiineille, kuten albumiinille, transferriinille ja seruloplasmiinille, kun taas immunoglobuliinien pitoisuus määritetään yleensä yksinkertaisella radiaalisella immunodiffuusiolla.

Yksi rakettielektroforeesin menestyneimmistä muunnelmista on Lorell-kaksiulotteinen tai risti-immunoelektroforeesi. Ensimmäisessä vaiheessa antigeeniseos erotetaan elektroforeettisesti agaroosigeelissä. Erotetut proteiinit pakotetaan sitten jälleen diffundoitumaan geelissä sähkökentän vaikutuksesta eri suunnassa kohtisuoraan ensimmäiseen nähden. Tällä tavalla on mahdollista määrittää kunkin seoksen antigeenin määrä. Vaikuttavin esimerkki on SZ:n muuntumisasteen arviointi S3:n inaktivoituneeksi muotoksi, jota esiintyy usein pahenemisen aikana potilaiden, joilla on systeeminen lupus erythematosus, seerumissa tai akuutin vaiheen sairastuneiden nivelten nivelnesteessä. nivelreuma, samoin kuin muissa tapauksissa.

Kuva 12. Risti-immunoelektroforeesi.

A. Antigeenit erotetaan elektroforeettisella liikkuvuudella agargeelissä. Kapea pitkittäinen kaistale (rajoitettu katkoviivalla), joka sisältää erotetut antigeenit, leikataan geelistä ja levitetään toiselle geelille, joka sisältää antiseerumin. Sitten elektroforeesi suoritetaan suunnassa, joka on kohtisuorassa ensimmäiseen nähden; tässä tapauksessa antigeenit reagoivat geelin sisältämän antiseerumin kanssa muodostaen saostumispiikkejä. Piikin alla oleva alue riippuu tietyn antigeenin pitoisuudesta.

b. Elektroferogrammi, joka näyttää komplementin komponentin C3 (C3 → C3c) konversion seerumissa. Geeli on lisäksi värjätty. Tässä tapauksessa kaaret sulautuvat toisiinsa, koska antigeeneillä on yhteisiä determinantteja.

V. "Mountain Fantasy", tämä elektroferogrammi osoittaa risti-immunoelektroforeesin hämmästyttävät ominaisuudet monimutkaisen antigeeniseoksen erottamiseksi.

Immunofluoresenssi sisältää fluoresoivan väriaineen, kuten natrium-isotiosyanaatin, kiinnittämisen vasta-ainemolekyyliin. Antigeeninen materiaali (bakteerit, solut tai niiden komponentit), jotka ovat kiinnittäneet leimattuja vasta-aineita, tulevat näkyviin ultraviolettivalossa. Menetelmä ei ole kvantitatiivinen, mutta erittäin tärkeä immunomorfologiassa lokalisoinnin määrittämiseksi antigeeniset rakenteet tai vasta-aineita.

Kilpailu radioaktiivisen antigeenin kanssa(radioimmunologinen menetelmä) on yksi parhaista nykyaikaisia ​​menetelmiä. Antigeeni-vasta-ainereaktion huomioon ottaminen voidaan suorittaa käyttämällä radioisotooppimenetelmät"leimattuja" vasta-aineita tai antigeenejä käytettäessä. Saostuman radioaktiivisuuden mittaaminen mahdollistaa vasta-aineen tai antigeenin määrän arvioinnin testinäytteissä. Tämä lisää arvioinnin objektiivisuutta, nopeuttaa kirjanpitoa ja lisää vastauksen herkkyyttä. Herkimmät menetelmät (1 - 10 ng:n aineen määritys) ovat menetelmiä, joilla kilpaillaan vasta-aineista leimaamattoman ja leimatun antigeenin välillä. Menetelmän periaate on seuraava. Käytä standardimäärää testiantigeeniä vastaan ​​olevaa antiseerumia ja tämän antigeenin standardimäärää, joka on leimattu radioaktiivisella 125 I:llä, 131 I:llä, 2 H:lla tai muulla isotoopilla. Niiden suhde on sellainen, että 70-80 % leimatusta antigeenistä sitoutuu vasta-aineisiin, jolloin muodostuu radioaktiivinen sakka, jonka radioaktiivisuusarvo on N. Jos reagoivaan järjestelmään lisätään substraattia, joka on testattu tämän antigeenin esiintymisen suhteen, niin antigeeni se kilpailee leimatun antigeenin kanssa ja sakan radioaktiivisuus laskee. Mitä enemmän antigeeniä testinäytteessä on, sitä pienempi on sakan radioaktiivisuus. Tällä menetelmällä määritetään sellaisten aineiden pitoisuus veressä, virtsassa ja muissa aineissa, joita ei vähäisten pitoisuuksien vuoksi havaita biokemiallisin menetelmin (hormonit: insuliini, kasvuhormoni, ACTH, gonadotropiini, digoksiini, somatotropiini jne.) .

Riisi. 13. Menetelmä kalvon immunoglobuliinin (IgM - 8S) eristämiseksi B-lymfosyyttien pinnasta.

1. Lymfosyyttien pintaproteiinien leimaus 125 I:llä laktoperoksidaasin (LP) läsnä ollessa.

2. Solujen hajoaminen ja pintaproteiinien vapautuminen liuokseen.

3. Leimattujen immunoglobuliinien saostus käyttämällä spesifistä anti-Ig-seerumia.

4. Saostuman pesu ja sedimentointi.

5. Saostuman tuhoaminen ja kevyiden ja raskaiden ketjujen elektroforeettinen analyysi polyakryyliamidigeelissä

Immunoentsyymimenetelmä edustaa eniten kehitystä Viime vuosina. Sen herkkyys ei ole huonompi kuin edellinen, mutta on yksinkertaisempi, jos kaupallisia reagensseja on saatavilla. Vasta-aineet tiettyä antigeeniä vastaan ​​sorboidaan polystyreeniputkien seinämiin. Testattava substraatti lisätään tähän koeputkeen. Kun tämä antigeeni on läsnä, se yhdistyy vasta-aineisiin. Substraatti valutetaan ja koeputkeen lisätään vasta-aineita samaa antigeeniä vastaan. Nämä vasta-aineet on leimattu entsyymillä, useimmiten kromiperoksidaasilla. Leimatut vasta-aineet liittyvät edelliseen kompleksiin ja jäävät myös koeputken seinille. Koeputken sisältö korvataan kromogeenin (ortofenyleenidiamiinin) seoksella tämän entsyymin substraatilla - H 2 0 2. Jos haluttu antigeeni oli testinesteessä, entsyymi kiinnittyy koeputken seinämiin ja hajottaa H 2 0 2: vapautunut happi värjää kromogeenin keltaiseksi.

Huonompi menetelmä on fotoelektronifelometrin käyttö saostumisen huomioon ottamiseksi, jonka avulla rekisteröidään seerumin optisen tiheyden muutos antigeenin lisäyksen jälkeen. Kun seerumia laimennetaan tislatulla vedellä, optinen tiheys pienenee. Jos seerumi sisältää vasta-aineita ja sitä käytetään laimentimena vesiliuosta antigeeniä, optisen tiheyden muutoskäyrä on erilainen. Aluksi tapahtuu optisen tiheyden lasku; kun riittävä määrä antigeeniä kerääntyy, väheneminen pysähtyy, sitten havaitaan antigeeni-vasta-aineseoksen optisen tiheyden kasvu.

Lyysi-ilmiö- joidenkin vasta-aineiden kyky liuottaa soluja, joita vastaan ​​ne syntyivät. Näitä vasta-aineita, kun niitä käytetään bakteereihin, kutsutaan bakteriolysiineiksi ja punasoluille - erytrolysiineiksi tai hemolysiineiksi. Immuunihajotusreaktioihin on ominaista se, että ne eivät tapahdu vain kahden aineosan - antigeenin ja vasta-aineen - läsnä ollessa. Kolmannen komponentin, jota kutsutaan komplementiksi, läsnäolo on välttämätöntä. Komplementtia löytyy vaihtelevina määrinä monien eläinten veriseerumissa; sitä on erityisen runsaasti veren seerumissa marsut. Aluksi reaktio seuraa aglutinaation tyyppiä, sitten komplementti kiinnittyy antigeeni-vasta-ainekompleksiin ja tapahtuu bakteerien, punasolujen tai muiden solujen kalvon paikallista liukenemista.

Sytotoksisuusilmiö määrittävät vasta-aineet, joita kutsutaan sytotoksiineiksi. Niiden vaikutus on se, että niillä on myrkyllinen vaikutus, mikä riistää solujen elinkyvyn. Reaktio sytotoksiinien havaitsemiseksi suoritetaan solususpensiolla natriumkloridin isotonisessa puskuriliuoksessa. Niihin lisätään väriainetta, kuten eosiinia tai trypaanisinistä. Eläviä soluja ei värjätä; kuolleet solut havaitsevat värin nopeasti (30 sekunnissa). Jos lisäät solususpensioon sytotoksiineja sisältävää immuuniseerumia ja komplementtia, solut kuolevat ja värjäytyvät väriainetestattaessa. Kuolleiden solujen prosenttiosuus osoittaa sytotoksiinien määrän veren seerumissa. Reaktio vaatii komplementin läsnäolon.

Komplementin kiinnitysreaktio (CFR) perustuu edellä kuvattuun komplementin ominaisuuteen kiinnittyä antigeeni-vasta-ainekompleksiin. Tarkemmin sanottuna komplementti kiinnittyy vasta-ainemolekyylin raskaan ketjun erityiseen alueeseen. Tämä kohta tulee kuitenkin käytettävissä vasta, kun vasta-aine on kiinnittynyt antigeeniin. Yhdistettyään yhteen antigeeni-vasta-ainekompleksiin komplementti ei voi siirtyä toiseen kompleksiin, joka viedään reagoivaan järjestelmään ensimmäisen kompleksin ja lisätyn tietyn määrän komplementin vuorovaikutuksen jälkeen. Toisena kompleksina käytetään yleensä niin kutsuttua hemolyyttistä järjestelmää - lampaan erytrosyyttien seosta, jossa on vasta-aineita niitä vastaan. Jos ensimmäinen kompleksi on antigeeni-vasta-ainekompleksi, reagoivassa seoksessa ei ole vapaata komplementtia; punasolujen hemolyysiä ei tapahdu. Päinvastoin, jos testimateriaali (esimerkiksi veriseerumi) ei sisällä vasta-aineita käytetyille antigeeneille, komplementti pysyy vapaana ja mahdollistaa punasolujen hemolyysin. RSC:tä käytetään kupan diagnosoinnissa (Wassermann-reaktio), kudosvasta-aineiden ja autovasta-aineiden tutkimuksissa; sitä käytetään laajalti useiden virusinfektioiden diagnosoinnissa.

Erityinen viiveilmiö käytetään usein kahden kiinnostavan antigeenin vertaamiseen. Esimerkiksi immuuniseerumi valmistetaan hiiren punasoluja vastaan. Sen määrittämiseksi, sisältääkö se vasta-aineita sukua olevan eläinlajin (rotan) punaisia ​​verisoluja vastaan, seerumia käsitellään rotan punasoluilla. Jos vasta-ainetaso seerumissa laskee, on olemassa samankaltaisia ​​antigeenejä; jos se vähenee kokonaan, antigeenit ovat identtisiä. Tätä reaktiota käyttämällä on analysoitu monien samankaltaisten antigeenien ja hapteenien identiteetti tai ei-identtisyys.

Toksiinien neutralointireaktio. Antitoksiinit ovat vasta-aineita bakteeri- ja eräitä muita (esimerkiksi käärmeen myrkkyjä) vastaan, jotka ovat luonteeltaan antigeenisiä. Antitoksiinit yhdessä vastaavien myrkyllisten aineiden kanssa neutraloivat ne. Neutralisaatioastetta voidaan säätää antamalla toksiini-antitoksiini-seosta herkälle eläimelle. Immuuniseerumin antitoksiinin määrälle on tunnusomaista se, kuinka monta kuolettavaa toksiiniannoksia voidaan neutraloida tietyllä määrällä seerumia. Neutralointireaktiota käytetään kurkkumätäen, tetanuksen jne. aiheuttajien toksiinien pitoisuuden määrittämiseen. Tätä varten käytetään standardoituja antitoksisia seerumeja.

Opsonisaatioilmiö perustuu siihen tosiasiaan, että vasta-aineet lisäävät neutrofiilien ja makrofagien fagosyyttistä aktiivisuutta niitä antigeenisiä aineita tai mikro-organismeja vastaan, joita vastaan ​​niitä tuotetaan. Esimerkiksi fagosyyttien aktiivisuus stafylokokkeja vastaan ​​lisääntyy merkittävästi, jos leukosyyttejä tai leukosyyttien luovuttajaa hoidetaan antistafylokokkiseerumilla. Tämä vaikutus liittyi erityisten opsoniinivasta-aineiden esiintymiseen. On kuitenkin pidettävä mielessä, että opsoniinien, hemolysiinien, bakteriolysiinien tai saostumien erityisiä vasta-aineita ei ole. Nämä ovat vain ilmentymiä immunoglobuliinimolekyylien päätehtävästä tuottaa spesifinen antigeeni-vasta-ainekompleksi.

D. Grey johtaa hyvä esimerkki tämän toiminnon yhtenäisyys ja monimuotoisuus. Tyypin I pneumokokkipolysakkaridia vastaan ​​valmistetut vasta-aineet voivat:

1) aiheuttaa tyypin I pneumokokkien agglutinaatiota ja niiden kapselin turvotusta;

2) aiheuttaa liukoisen uutteen saostumista tyypin I pneumokokeista;

3) liittää komplementti, eli tarjota RSC;

4) niillä on opsonoiva vaikutus leukosyytteihin tyypin I pneumokokkeja vastaan;

5) suorittaa eläinten erityissuojelua pneumokokki-infektiota vastaan.

Tästä huolimatta erilaisissa spesifisissä kokeellisissa tai kliinisissä tilanteissa spesifiset antigeeni-vasta-ainereaktiot ovat edullisia. Kun diagnosoidaan lavantauti he käyttävät Widal-reaktiota - bakteerien agglutinaatiota, monimutkaisten biologisten nesteiden tai kudosuutteiden antigeenisten komponenttien analysointiin - saostumisreaktiot agarissa immunodiffuusiona tai immunoelektroforeesina. Työskenneltäessä toksiinien ja monien liukoisten antigeenien kanssa käytetään menetelmiä passiivinen hemagglutinaatio. Veren hormonitason määrittämiseen soveltuu parhaiten radioimmunologinen menetelmä jne. Eri immunoglobuliiniluokilla on erilaisia ​​antigeenin kanssa yhdistymistoimintoja.

Periaate vasta-immunoelektroforeesi(VIEF) koostuu antigeenien ja vasta-aineiden samanaikaisesta liikkeestä geelissä toisiaan kohti sähkövirran vaikutuksesta.

Niiden spesifisen vuorovaikutuksen seurauksena muodostuu sakkaviiva. Menetelmässä yhdistyvät geelissä tapahtuvan diffuusisen saostusreaktion yksinkertaisuus ja elektroforeesin korkea resoluutio. Vaikka tämä menetelmä on herkkyydeltään huonompi kuin fluoresoivien vasta-aineiden ja reaktion menetelmä epäsuora hemagglutinaatio se ei kuitenkaan vaadi luminoivia vasta-aineita, luminesoivaa mikroskooppia ja punasoludiagnostiikkapakkausta.

VIEF on kvalitatiivinen menetelmä. Se on erittäin spesifinen ja helppo suorittaa. Sitä voidaan käyttää bakteeri- tai virusantigeenien havaitsemiseen patologisesta materiaalista, laboratorio- (biologisten) eläinten elimistä tai ympäristön esineistä.

Materiaalit ja varusteet. 1. Agaroosi A ja B. 2. 0,05 M medinal-HCl-puskuri (pH 8,6). 3. Natriumkloridi. 4. Dinatriumfosfaatti. 5. Monokaliumfosfaatti. 6. Kaliumkloridi. 7. Ammoniumoksalaatti. 8. Spesifinen bakteeri- tai virusantigeeni. 9. Elektroforeesikammio. 10. 50 mA DC tasasuuntaaja. 11. Sähköinen kuivailmatermostaatti. 12. Laboratorion pöytäsentrifugi.

Lavastustekniikka. 30 ml sulaa 1-prosenttista agaroosia, joka on valmistettu medinal-HCl-puskurissa (pH 8,6), kaadetaan vaakasuoraan asetetulle lasilevylle. Kun geeli on kovettunut, leikataan kaksi kaksoisriviä halkaisijaltaan 5 mm:n reikiä (8 reikää jokaisessa rivissä); välinen etäisyys kaksinkertaiset rivit on 30 mm. Geeli poistetaan kuopista, kerätään koeputkeen, sulatetaan polttimen liekillä ja lisätään kuoppien pohjalle käyttämällä Pasteur-pipettiä.

Testimateriaali asetetaan katodipuolelle ja monospesifinen seerumi asetetaan anodipuolelle, mutta edullisesti monoklonaalisia vasta-aineita (mAb:t) 0,035 ml:n tilavuudessa. Esimerkiksi pneumokokkien havaitsemiseksi - antapneumokokin seerumi, influenssaviruksen antigeenin havaitsemiseksi - influenssan vastainen seerumi jne.

Levy asetetaan elektroforeesikammioon siten, että puskurijärjestelmän ja kantajageelin välisenä yhdyssiltana käytetty vaahto koskettaa jälkimmäistä. Elektroforeesi suoritetaan huoneenlämmössä 140...150 V jännitteellä ja 35 mA virralla 18...35 minuutin ajan.

Ohjaus. VIEF:ssä olevan materiaalin tutkimukseen tietyn antigeenin esiintymisen varalta on liitettävä kontrolli, jossa on selvästi positiivista materiaalia.

Patogeenin havaitseminen, kun VIEF yhdistetään kasvatukseen. Saastuneen materiaalin inokulointiin tulee käyttää valikoivaa väliainetta.

36 tunnin 37 °C:ssa inkuboinnin jälkeen 0,3 ml 0,85 % NaCl-liuos 4 % formaldehydillä tehdään pesu, joka imetään koeputkeen ja 1 tunnin altistuksen jälkeen tutkitaan VIEF:ssä.

Tulosten kirjanpito. klo positiivinen tulos viiva ilmestyy testimateriaalia sisältävän kuopan ja tietyn seerumin sisältävän kuopan väliin. Sakkaviiva, riippuen testimateriaalissa olevan antigeenin määrästä, voi sijaita joko kuoppien välisen etäisyyden keskellä tai lähempänä seerumisäiliötä.

Tyypillisesti sakkaviivat muodostuvat 18...35 minuuttia elektroforeesin aloittamisen jälkeen.

Jos löydät virheen, korosta tekstinpätkä ja napsauta Ctrl+Enter.