BENDRASIS FARMAKOPĖJOS STRAIPSNIS

Pristatytas siekiant pakeisti metodą, nurodytą FS 42-3874-99

Ši bendroji farmakopėjos monografija skirta tirti antigeninę sudėtį biologinės medžiagos, taip pat nustatyti grynumą, kokybinę ir kiekybinę imunobiologinės sudėties vaistai(ILP) naudojant imunoelektroforezę (IEF) agaro gelyje, derinant zoninės elektroforezės ir imunodifuzijos metodus.

Atliekant imunoelektroforezę geliuose arba ant celiuliozės acetato plėvelių naudojant paprastus arba dvigubus imunodifuzijos metodus, vyksta reakcija tarp tirpių baltymų ir jiems būdingų antikūnų nusodinimo. Baltymų kiekybinis nustatymas gali būti atliekamas naudojant elektroforezę terpėje, kurioje yra antikūnų (elektroimunoanalizė, elektroimunodifuzija, raketinė imunoelektroforezė). Baltymų komponentų antigeniškumą galima ištirti lyginant juos su žinomais žymenimis.

Imunocheminių tyrimų veiksmingumas priklauso nuo naudojamo antiserumo specifiškumo, taip pat nuo jų titro ir afiniteto antigenams.

Paprastai imunoelektroforezė yra agaro (arba agarozės) gelio elektroforezės derinys, po kurio atliekama dviguba imunodifuzija toje pačioje terpėje. Dvimatėje dviguboje imunodifuzijoje antigenai ir antikūnai, patalpinti į apvalias arba stačiakampes gelio įdubas, migruoja vienas kito link, todėl jiems susitikus susidaro kritulių linijos (lankos). Kritulių juostų padėtis priklauso nuo antigeno difuzijos koeficiento ir jo koncentracijos antikūnų atžvilgiu (antikūno difuzijos greitis gali būti laikomas pastoviu). Tam tikras antigeno ir antikūnų koncentracijų santykis, optimalus nuosėdoms susidaryti, vadinamas ekvivalentiškumo zona. Taip susidaro aiškios kritulių linijos.

Antikūnų koncentracija (titras) imuniniame serume taip pat gali labai skirtis. Galima situacija, kai skirtingų mišinio komponentų lygiavertiškumo zonos nesutampa. Norint pasirinkti lygiavertį antigeno ir antikūnų santykį, kelių komponentų mišinių imunoelektroforezę rekomenduojama atlikti esant kelioms santykinėms antigeno ir antikūnų koncentracijoms, nes naudojant tik vieną tokią koncentraciją tam tikrų komponentų gali nepavykti aptikti.

Agaro gelio imunoelektroforezės metodas

Ant objekto scenos griežtai horizontaliai dedama spiritu apdorota 90x120 mm dydžio stiklo plokštė. Ant stiklinės plokštelės užtepamas 18,0-20,0 ml agaro gelis, atvėsintas iki (45±5) 0 C temperatūros. Sukietėjus kambario temperatūroje, po 20-30 minučių ant plokštelės susidaro 2,0 - 2,5 mm storio agaro sluoksnis.

Geliui sukietėjus specialiu trafaretu jame išpjaunamos 6-7 1-2 mm skersmens skylutės. Į duobutes pripildomas tiriamasis mėginys, kurio tūris neviršija šulinėlio tūrio (kiekvienam tiriamajam mėginiui po 2 duobutes). Tokiu atveju kontrolinis mėginys įpilamas į viršutinį ir apatinį stiklinės plokštelės šulinukus su geliu - normalus žmogaus kraujo serumas („Standartinis bandymo sistemos mėginys, skirtas žmogaus kraujo serumo preparatų frakcinei (antigeninei) sudėčiai nustatyti. imunoelektroforezė“ arba kitas kontrolinis mėginys pagal farmakopėjos monografijoje ar norminiuose dokumentuose pateiktus nurodymus, nudažytas pironinu B (arba kitu dažikliu, nurodytu farmakopėjos monografijoje ar norminiuose dokumentuose).

Į 1000 ml talpos matavimo cilindrą įpilkite 500 ml veronalio-medinalio arba borato buferinio tirpalo, išgrynintu vandeniu sureguliuokite tirpalo tūrį iki žymės ir išmaišykite. Gautas tirpalas (arba kitas buferinis tirpalas, nurodytas farmakopėjos monografijoje ar norminiuose dokumentuose) pilamas į elektroforezės aparato kameros elektrodų sekcijas.

Plokštelė su paruoštu geliu dedama į elektroforezės aparatą ir sujungiama su buferiniu tirpalu prietaiso elektrodų kamerose, naudojant kelis filtravimo popieriaus sluoksnius. Jei elektroforezės prietaiso konstrukcija numato lėkštelės agaro sujungimą su elektrodo buferiu naudojant agaro kolonėles, plokštelė įdedama į subalansuotą įrenginį ir pilama išlydytu agaru, kol susijungs su agaro kolonėlėmis ir gelio sluoksniu. Susidaro 1 - 2 mm storio.

Elektroforezės aparatas uždengiamas dangteliu ir įjungiamas maitinimo šaltinis (įtampa 70-200 V, srovė 10-40 mA). Elektroforezė atliekama 1,5-3 valandas, kol pironino B dėmė, atitinkanti albumino migraciją, yra 20-25 mm atstumu nuo šulinio.

Po elektroforezės, naudojant specialų trafaretą, tarp agaro gelio šulinėlių išpjaunami išilginiai „grioveliai“ (lygiagrečiai migracijos krypčiai). Į „griovelius“ įpilama 0,25 ml nusodinančio antiserumo: prieš žmogaus kraujo serumo baltymus (tiriant frakcinę kompoziciją) arba polivalentinį serumą prieš žmogaus kraujo serumo baltymus, didelius galvijai, arkliai ir kiaulės (tikrumui patvirtinti).

Plokštelė su agaro geliu dedama į drėgną kamerą ir laikoma (5 ± 3) 0 C temperatūroje 24 - 48 valandas.

Į nusodinimo reakciją nepatekusiems baltymams nuplauti agaro plokštelė dedama į kiuvetes, pripildoma 0,9% natrio chlorido tirpalo ir inkubuojama 16-18 val.Tirpalas keičiamas 3-4 kartus. Tada plokštelė pašalinama iš 0,9 % natrio chlorido tirpalo, uždengiama filtravimo popieriumi, suvilgytu 0,9 % natrio chlorido tirpale, ir džiovinama ore, kol agaro gelis virsta plona plėvele. Po to plokštelė su išdžiūvusiu geliu padengiama filtravimo popieriumi, suvilgytu 0,9% natrio chlorido tirpale, nepaliekant oro burbuliukų, ir džiovinama kambario temperatūroje arba orkaitėje ne aukštesnėje kaip 40°C temperatūroje. Išdžiovinus plokštelę, filtravimo popierius sudrėkinamas vandeniu ir atsargiai nuimamas.

Baltymams nudažyti naudokite amido juodąjį dažiklį 10B arba kitą tinkamą dažą (pagal farmakopėjos monografijoje arba norminėje dokumentacijoje pateiktas instrukcijas), plokštelę įdėkite į kiuvetę su dažų tirpalu 30-40 minučių. Tada plokštelė plaunama agaro plovimo tirpalu (2% acto rūgšties tirpalu arba kitu tirpalu, kaip nurodyta norminiuose dokumentuose) 15-40 minučių, kol visiškai išnyks spalvotas fonas, ir vėl džiovinama kambario temperatūroje. arba džiovinimo spintoje ne aukštesnėje kaip 40°C temperatūroje.

Lipoproteinai dažomi Sudano juodu B. Dažymui visiškai išdžiovintos plokštelės dedamos į dažų tirpalą 3 valandoms, po to nuspalvinamos 50 % etanoliu, kol fonas visiškai išvalomas. Lipoproteinai nusidažo tamsiai mėlyna spalva. Dažyti reikia visiškai išdžiovintą preparatą, nes Sudano juodasis B netirpsta vandenyje ir nudažo drėgną gelį.

Rezultatų apskaita tiriant frakcinę žmogaus imunoglobulino preparatų sudėtį atliekama vizualiai lyginant tiriamojo mėginio elektroferogramą su kontrolinio mėginio – normalaus žmogaus kraujo serumo – elektroferograma („Standartinis tyrimo sistemos mėginys, skirtas frakcijinei () antigeninė) preparatų sudėtis iš žmogaus kraujo serumo imunoelektroforezės būdu" arba kitu kontroliniu mėginiu pagal norminiuose dokumentuose pateiktus nurodymus), kuriame turi būti nustatytas nusodinimo linijų skaičius su serumu prieš žmogaus serumo baltymus (ne mažiau kaip 15 nusodinimo linijų, kai naudojamas “ Standartinis pavyzdys tyrimų sistemos, skirtos vaistų frakcinei (antigeninei) sudėčiai iš žmogaus kraujo serumo nustatyti imunoelektroforezės metodu). Pagrindinis žmogaus imunoglobulino preparato komponentas turi atitikti normalaus žmogaus kraujo serumo imunoglobulino G (Ig G).

Rezultatų apskaita atliekant tyrimus, siekiant patvirtinti žmogaus kraujo produktų autentiškumą, atliekama vizualiai, nustatant nusodinimo linijas su serumu prieš serumo baltymus žmonių, galvijų, arklių ir kiaulių kraujyje. Nusodinimo linijos turėtų būti nustatomos tik naudojant serumą prieš žmogaus serumo baltymus.

Pastabos

1. 0,05 M veronal-medinalio buferinio tirpalo paruošimas(pH 8,6±0,1).Į 1000 ml matavimo kolbą įpilkite 1,38 g veronalio ir 8,76 g medinalo, įpilkite išgryninto vandens iki žymės ir maišykite, kol visiškai ištirps.

1. 0,05M borato buferinio tirpalo paruošimas(pH 8,6±0,1).Į 1000 ml matavimo kolbą įpilkite 6,7 g boro rūgštis, 13,4 g natrio tetraborato 10-vandens, įpilkite išgryninto vandens iki žymės ir išmaišykite.
2. 1,25% agaro gelio paruošimas. Agaro gelis paruošiamas vienu iš šių būdų:
3. Norėdami paruošti 1,25% agaro gelį, naudokite 0,05 M veronal-medinalio buferį (pH 8,6 ± 0,1) su dviguba druskų koncentracija (atitinkamai 2,76 g veronalio ir 17,52 g medinalo 1000 ml išgryninto vandens).
4. Norėdami paruošti 1,25% agaro gelį, naudokite borato buferinį tirpalą (pH 8,6±0,1) su dviguba druskų koncentracija (atitinkamai: 13,4 g boro rūgšties ir 26,8 g natrio tetraborato 10 vandeninio 1000 ml išgryninto vandens).

Į 1000 ml talpos stiklinę įpilama 12,5 g agaro, įpilama 500 ml išgryninto vandens ir gelis paliekamas valandą brinkti (20±1) 0 C temperatūroje. Stiklinė su turiniu dedamas į verdančio vandens vonelę ir laikomas tol, kol agaras visiškai ištirps. Gelio tirpalo tūris sureguliuojamas iki 500 ml vandeniu, po to įpilamas toks pat buferinio veronalio-medinalio arba borato tirpalo kiekis (arba kitoks buferinis tirpalas, nurodytas farmakopėjos monografijoje ar norminiuose dokumentuose). Agaro tirpalas filtruojamas per 2-3 sluoksnius marlės, įpilama tiomersalio iki 100 μg/ml koncentracijos ir supilama į 40-50 ml buteliukus (dviem lėkštelėms reikalingas kiekis). Ištirpęs agaras turi būti skaidrus.

1. Amido black 10B dažų tirpalo paruošimas. Dažų tirpalas paruošiamas vienu iš šių būdų:
2. Į 1000 ml matavimo kolbą įpilkite 1,0 g juodojo amido 10B, 450 ml 0,1 M acto rūgšties tirpalo, 550 ml 0,1 M natrio acetato tirpalo ir sumaišykite.
3. Į 1000 ml matavimo kolbą įpilkite 1,0 g juodojo amido 10B ir 100 ml ledinės acto rūgšties, išgrynintu vandeniu sureguliuokite tūrį iki žymės ir sumaišykite. Po 12 valandų filtruokite per popierinį filtrą.
4. Dažymo tirpalo paruošimas Sudano juodasis V.Į 1000 ml matavimo kolbą įpilkite 1,2 g juodojo Sudano B, 20 ml 1 M natrio hidroksido tirpalo, 380 ml išgryninto vandens ir sureguliuokite tirpalo tūrį absoliučiu etanoliu iki žymės ir išmaišykite. Mišinys trumpai virinamas, atšaldomas iki kambario temperatūros ir atvėsus dažai supilami į tamsų buteliuką su įmaltu kamščiu. Reagentas laikomas kambario temperatūroje 3 mėnesius.
5. 2% acto rūgšties tirpalo paruošimas agaro plovimui. Į 1000 ml matavimo kolbą įpilkite 20,0 ml ledinės acto rūgšties, išgrynintu vandeniu sureguliuokite tirpalo tūrį iki žymės ir sumaišykite. Reagentas laikomas kambario temperatūroje 3 mėnesius.

Išradimas yra susijęs su laboratorine įranga. Išradimo tikslas – sutrumpinti tyrimų laiką ir sumažinti gelio suvartojimą. Įrenginyje yra kiuvetė 1, pertvara 2, buferinis tirpalas 3, gelio laikiklis 4 su dangteliu 11 ir elektrodai 12. Laiklyje 4 ant jo darbinio paviršiaus padaryti horizontalūs grioveliai, sujungti kanalais su ertmėmis priešingose ​​pusėse. pertvaros. Dangtis 11 turi skylių 7 ir 8 eiles, išdėstytas poromis virš kiekvieno griovelio. Laikiklis ir dangtelis pagaminti iš skaidrios medžiagos. Serumai dedami į 7 ir 8 skylutes ir įjungiamas maitinimas. Dėl reakcijos susidaro nuosėdos, pagal kurias galima spręsti apie antigeno buvimą ar nebuvimą. Reakcija vyksta uždarame bloke; gelis užpildo ne visą laikiklį, o tik griovelius, o tai leidžia sumažinti jo suvartojimą. 1 atlyginimas f-ly, 3 lig.

TARYBŲ SĄJUNGA

SOCIALISTAS

RESPUBLIKA

IŠRADIMO APRAŠYMAS

Į BTOPCKOMY SERTIFIKATĄ

VALSTYBĖS KOMITETAS

APIE IŠRADIMUS IR ATRADIMUS

TSRS valstybiniame mokslo ir technologijų komitete

1 2)11 4)6111(1>(-1-1 (221 1(1.(n>.X7))

I 4t> I;3(I. I (j.>Ü. I «>. i X 4(1 (711 Veeeon)zn>>y n(e.(b(ni i and konetr3ktrskiy nne git ug 31(nninekoy lbor)) >trigubas technpki (721 V. (!. (:obole(3, . 3. V. bap(tano>3, V.. 1. Von,iüåv and 3. V.;;r3 IIHh(>v))

N ()6)7471), klasė. A 6! 5i ():), 1 (177.

1541 U(. E C3(g1(:Th() L, 15(!! P()BE:.,(.1!1! SI)

1! U:) (U((OE.1()..(;TR(.)FOR! .3>"3 V (l, 1(. (571 AND) (571 AND) ()()j) ()),"(onvin) I I(.lb tt 3(>()е l (.).<.>„„SU„„15179 8 A 1 (5() 4 A b(B 5/04, C(01 3 33)48)

2 eo ir (1.11 hv>ttl g„(, pertvara Ђ”, b 1),(, ter”t.>b 4 gel e dangtelis 11 II s. (elektrols 12. Ant jo esančiame laikiklyje 4

Raen>i ll OVSRKNOETn VYPO.>N kibl G)RIZONt;1.>bHl,i(113>bi, sujungti (ortakiai įdubimais išilgai E);t 1 p(>zoch.,((laikiklis ir dangtis yra pagamintas iš natūralaus h;>ts rialo. Sy(>s>rotki ps>m «p11>n>t gveretijoje 7 ir 8 ir toliau)11)n>t withanijos blokas. In re T 3T(. reakcija(( ii obrdz3e1 ir; i.t(>h, ir kT()I) «%ted e) lyat o n,), (ir «Hll lt, lit o «: an. l (ll »p ir ll. k().). 1it 13 3 1 kE>tT(>M (<.1>h(, Г(. lь 3,!в

tl >t(ll а.(b1, Ir T(> new>;o 1,1() 3 ъ1еHbllll(Tb (eiti P;t 1 3 ir

Reikalauti

Išradimas yra susijęs su medicinine įranga ir gali būti naudojamas kraujo tarnybos, infekcinių ligų skyriuose

6 ligoninės, gydymo ir profilaktikos įstaigų klinikinės diagnostikos laboratorijose.

Išradimo tikslas – sutrumpinti tyrimų laiką ir sumažinti gelio suvartojimą.

Fig. 1 parodytas įrenginys, skirtas

II!)()k3äåíèß Raudona)I(HI(; kid 2 pav. laikiklis, sekcija, 3 pav. tas pats, vaizdas iš viršaus.

Įtaisas 1 tirpalo imunoelektroforezei, per visą ilgį padalytas pertvara 2 į dvi dalis, sudarydamas buferinio elektrodo erdves, užpildytas buferiniu tirpalu 3.

111k pertvara 2, sumontuotas laikiklis 4 gs I) I, kuris yra skaidrus ir

6 1()k, kuriame yra daug griovelių 5, cat()!)bl(. imageK)T autonominiai kanalai, jungiantys buferį 3 abiejose skaidinio 2 pusėse. Kiekviename kanale yra du ()Tk3cpcTkIkI b, skirti į juos įvesti sonorus ()tki 7 ir actis serumas 8. Kanalai vienas nuo kito atskirti plona sienele 9.

Elektroforezei aparate atlikti veronal-medinalio buferis ruošiamas iš barbitolio.l natrio (medinalis 17,5 g ir barG>i I I.ld Be!)on 1) l) 2,7 g 1000 ml dis1 i, h , l)11)()k)k)III()II t.

Gol g() govyaz iš 1)gara fi pMI>

k.(»I1kckIT1), 1 g agaro 100 ml buferinio tirpalo.

11er.l nicha)om elektroforezės grioveliai 5 zai().)nyak)1 nešiklis 0 (agaro gelis), 3dT(I gelyje dslak)t įdubimai, viename

I I 3). buferis 3, laikiklis ustin B.II)k)dk()T ir pertvara 2. Cuve Tv

3dk !)I l«d l() l uždenkite 11 elektrodais 2.

Prietaisas veikia taip.

Kamera tiekiama nuolatine įtampa. Kai nuolatinė srovė praeina per grandinės elektrodo buferį – nešiklį – buferį – elektrodą, antigenai ir antikūnai juda vienas kito link ir, sąveikaudami, susidaro plika akimi matomos nuosėdos. Nuosėdos leidžia spręsti apie buvimą ar nebuvimą

1O antigeno tiriamajame serume. Taigi galima atpažinti pacientus, sergančius erkiniu cefalitu, meningitu, seruminiu hepatitu ir kitomis imunologinėmis ligomis.

Siūlomame įrenginyje atlikti -! 5 elektroforezė, gamybos technologija žymiai supaprastinta, laikiklis pašalinamas sudėtingas dizainas, bet dėl ​​to, kad reakcija vyksta uždarame bloke, o garavimas ir kt išoriniai veiksniai negali paveikti serumo ir nešiklio, įdėto į griovelius 5, dangtelį galima padaryti plokščią. Tai pagerina kokybės rodiklius.

1. Įtaisas imunoelektroforezei atlikti gelyje, turintis kiuvetę, elektrodus, pertvarą, skiriančią kameros kiuvetę į dvi ertmes, ir ant pertvaros sumontuotą gelio laikiklį, pasižymintį tuo, kad, siekiant sutrumpinti džiovinimo laiką ištirti ir sumažinti gelio sunaudojimą, laikiklis pagamintas su horizontaliais grioveliais darbiniame paviršiuje, kanalais sujungtas su skirtingais kiuvetės aukštais ir su plokštele Ç5, besiliečiančia su jo darbiniu paviršiumi ir turinčia skylių eiles. poros virš kiekvieno griovelio.

Imunoelektroforezė– vienas iš plačiai naudojamų kokybinės antigenų analizės metodų. Turint tinkamą nusodinimo AS, jis gali būti naudojamas tirti bet kokį antigeninį mišinį. Visų pirma sėkmingai analizuojami baltymai iš kraujo serumo, smegenų skysčio, šlapimo, pieno, organų ekstraktų, taip pat augalinės ir bakterinės kilmės baltymai. Klinikoje šis metodas dažniausiai taikomas diagnozuojant paraproteinemiją ir imunodeficito būsenos. IN teismo medicinos jis naudojamas haptoglobino ir grupei specifinio komponento Gc sistemoms analizuoti.

Moksliniame darbe imunoelektroforezė yra pagrindinis sudėtinguose mišiniuose esančių baltymų identifikavimo metodas. Jis yra būtinas kaip nuoseklaus baltymų preparatų valymo proceso stebėjimo metodas. Jis taip pat dažnai naudojamas šių vaistų autentiškumui ir grynumui kontroliuoti. Natūralu, kad tokį plačiai pritaikytą metodą teko įvairiomis kryptimis keisti ir tobulinti. Buvo pasiūlyti nauji nešikliai: agarozės gelis, PAGE, celiuliozės acetato plėvelės.

Tuo pačiu metu IEF buvo pradėtas derinti su įvairių metodų specifinis dažymas ir fluorochromas fermentams, angliavandeniams, lipoproteinams, nukleoproteinams aptikti. Dėl derinimo su kitais analitiniais metodais atsirado disko imunoelektroforezė, imunoelektrofokusavimas, radioimunoelektroforezė ir kt.. Neseniai buvo pasiūlytas dvimatis IEF kiekybiniam nustatymui naudojant polispecifinį AS. Speciali dvimačio IEF modifikacija gali padidinti jo jautrumą RIA lygiui. Tai pasiekiama elektroforetiniu būdu eliuuojant antigeną iš mažų 0,1-10 ml talpos stiklinių rezervuarų. IEF su aušinimu Wime sukūrė įrenginį, kuris atskyrimo proceso metu automatiškai palaikė pastovią temperatūrą ir srovę.

Šiuo prietaisu labai patogu nustatyti įvairių medžiagų elektroforezinį mobilumą. Šiame įrenginyje ypač rekomenduojama naudoti termoelektrinį aušinimą (Peltier akumuliatorių) dirbant su fermentais ir kitomis termolabiomis medžiagomis. Neseniai buvo pasiūlytas paprastas baltymų atskyrimo metodas naudojant dvimatę elektroforezę. Yra žinomas jautrus nenusėdančių antigenų ir antikūnų sistemų nustatymo metodas, pagrįstas mAb naudojimu, vadinamasis kaskadinis IEF, įskaitant antigenų fiksavimą po elektroforezės, antikūnų prijungimą prie antigenų, surištų antikūnų pašalinimą ir jų kiekybinį nustatymą. įvertinimas.

Imunofiksacinės elektroforezės atveju išskiriamas AT, o ne antigenas. Tai greitas ir ekonomiškas metodas, ypač tinkamas masinei atrankai paraproteinemijai nustatyti ir baltyminiams preparatams gauti. Naudojant IEF, dažnai pastebimi įprastos proceso eigos sutrikimai, kurių priežastis ne visada įmanoma iš karto nustatyti. Pavyzdžiui, jei naudojamas nepakankamai išgrynintas agaras, tai dažniausiai sukelia tris pažeidimus: blogą gelio susidarymą, stiprią elektroszmozę ir prastą preparatų spalvos pakitimą. Nepakankamai grynas agaras visada turi būti išvalytas. Pradėdami dirbti su nauja agaro porcija, pirmiausia turite patikrinti jos tinkamumą. Dažnai nustatoma, kad tie patys antigenai turi skirtingą elektroforezinį judrumą ir nudažosi skirtingai, kai vartojamos skirtingos agaro partijos. IEF sutrikimų priežastis gali būti agaro hidrolizė dėl pakartotinio arba per ilgo kaitinimo.

Hidrolizę rodo gelio formavimo savybių susilpnėjimas ir nelygumų atsiradimas gelio paviršiuje. Jei naudojamas netinkamas buferinis tirpalas, tai gali turėti įtakos elektroforetiniam atskyrimui. Dauguma buferių yra gera terpė daugintis bakterijoms ir pelėsiams. Todėl buferinę atsargą reikia laikyti šaldytuve arba į ją įpilti konservanto. Buferis, užpildantis elektroforezės kamerą, turi būti keičiamas bent kartą per savaitę. Naudojant elektrodo buferį kelis kartus, po kiekvieno atskyrimo būtina keisti elektrodų polius. Įtampa kameros gnybtuose dažniausiai neleidžia spręsti fizinė jėga srovė, einanti per gelį, todėl prie grandinės turi būti nuosekliai prijungtas miliampermetras. Atskyrimo proceso metu srovė beveik visada didėja. Šį reiškinį sukelia gelio kaitinimas, kuris didėja ilgėjant elektroforezės trukmei.

Tačiau po pradinio pakilimo srovė grandinėje gali nukristi. Tai dažnai nutinka dėl filtravimo popieriaus juostelių, jungiančių gelį su buferiu, išdžiūvimo arba net dėl ​​paties gelio išdžiūvimo. Tokiu atveju turėtumėte sumažinti buferio joninį stiprumą arba įtampą kameros gnybtuose. Be to, išdžiūvimo galima išvengti prieš elektroforezę gelio plokštelę ir popieriaus juosteles apvyniojus polimerine plėvele. Patogiausia dirbti su šaltiniu, kuris suteikia nuolatinė jėga srovė (srovės stabilizavimas). Savaime suprantama, kad IEF rezultatai priklauso nuo antigenų ir antiserumo kokybės.

Ryžiai. 8. Imunoelektroforezės principas.

1 etapas: antigeno agaro gelio elektroforezė. Antigenas migruoja tam tikru hipotetiniu atstumu.

2 etapas: srovė išjungta. Agare išpjaunamas griovelis ir pripildomas antikūnų. Susidaro kritulių lankas. Teoriškai antigenas difunduoja radialiai iš taškinio šaltinio, o antikūnai difunduoja iš griovelio lygiame priekyje. Optimalaus antigeno ir antikūnų santykio taškuose susidariusios nuosėdos sudaro lanką. Lankas yra arčiausiai griovelio, kuriame antigeno koncentracija yra didžiausia.

Imunoelektroforezė padeda nustatyti antigenus pagal elektroforezinį mobilumą, ypač kai mėginyje yra ir kitų antigenų.

Taikant šį metodą klinikinėje imunologijoje, pusiau kiekybiškai nustatoma imunoglobulinų koncentracija ir identifikuojami mielomos baltymai (9 pav.).

Ryžiai. 9. Pagrindinės žmogaus imunoglobulinų klasės kraujo serume, nustatytos imunoelektroforezės būdu. Į griovelį buvo pridėtas triušio antiserumas. Parodyta pagrindinių globulino frakcijų vieta. Buvo nustatytos trys iš penkių pagrindinių žmogaus imunoglobulinų klasių: IgG, IgA ir IgM. IgG nusodinimo lankas tęsiasi nuo γ srities iki ά2-globulino srities, o tai atspindi didžiulį antikūnų populiacijos heterogeniškumą tiek aminorūgščių sudėties, tiek bendro krūvio atžvilgiu.

Remiantis elektroforezės ir imunoprecipitacijos deriniu, buvo sukurti keli sėkmingi metodai, kurių kiekviename iš jų antigeno judėjimas elektriniame lauke sukelia jo kontaktą su antikūnais. Antigenams, migruojantiems agare į teigiamai įkrautą elektrodą, gali būti naudojama priešinė imunoelektroforezė.

10 pav. Priešinė imunoelektroforezė. Dėl endosmozės antikūnai gelyje juda "atgal"; antigenas, neigiamai įkrautas esant tam tikram pH, juda prie teigiamo elektrodo ir, susilietus su antikūnais, sudaro nuosėdas.

Šis metodas trunka mažiau laiko ir yra jautresnis nei Uchterlon dviguba difuzija. Jis naudojamas identifikuoti hepatito B viruso antigenus ir atitinkamus antikūnus, antikūnus prieš DNR sergant sistemine raudonąja vilklige, autoantikūnus prieš tirpius branduolinius antigenus sergant kolagenoze ir antikūnus (precipitinus) prieš Asperqillus sergant alergine bronchopulmonine aspergilioze.

Raketų elektroforezė yra kiekybinis metodas, apimantis antigeno pridėjimą į gelį, kuriame yra antikūnų. Kritulių linija yra raketos formos, kurios ilgį lemia antigeno koncentracija.

11 pav. Raketų elektroforezė. Antigenas, šiuo atveju žmogaus serumo albuminas, elektroforezuojamas gelyje, kuriame yra antikūnų. Atstumas tarp pradinio šulinio ir raketos formos lanko priekinio krašto priklauso nuo antigeno koncentracijos. Šiuo atveju santykinė žmogaus serumo albumino koncentracija yra (iš kairės į dešinę) 3, 2 ir 1.

Kaip ir priešelektroforezė, taip yra greitas metodas, bet ir čia antigenas turi persikelti į teigiamai įkrautą elektrodą. Taigi, raketinė elektroforezė tinka baltymams, tokiems kaip albuminas, transferinas ir ceruloplazminas, o imunoglobulinų koncentracija dažniausiai nustatoma naudojant paprastą radialinę imunodifuziją.

Vienas iš sėkmingiausių raketų elektroforezės variantų yra Lorell dvimatė arba kryžminė imunoelektroforezė. Pirmajame etape antigenų mišinys elektroforetiškai atskiriamas agarozės gelyje. Tada atskirti baltymai vėl priversti difunduoti gelyje, veikiami elektrinio lauko kita kryptimi, statmena pirmajam. Tokiu būdu galima kiekybiškai įvertinti kiekvieną mišinyje esantį antigeną. Įspūdingiausias pavyzdys yra SZ konversijos į inaktyvuotą S3 formą laipsnio įvertinimas, kuris dažnai pasireiškia paūmėjimo metu pacientų, sergančių sistemine raudonąja vilklige, serume arba pažeistų sąnarių sinoviniame skystyje ūminėje fazėje. reumatoidinis artritas, taip pat kitais atvejais.

12 pav. Kryžminė imunoelektroforezė.

A. Antigenai yra atskiriami elektroforeziniu judumu agaro gelyje. Iš gelio nupjaunama siaura išilginė juostelė (apribota laužta linija), kurioje yra atskirti antigenai, ir uždedama ant kito gelio, kuriame yra antiserumo. Tada elektroforezė atliekama statmena pirmajai kryptimi; šiuo atveju antigenai reaguoja su gelyje esančiu antiserumu, sudarydami kritulių smailes. Plotas po smaile priklauso nuo tam tikro antigeno koncentracijos.

b. Elektroferograma, rodanti komplemento komponento C3 (C3 → C3c) konversiją serume. Gelis papildomai dažomas. Šiuo atveju lankai susilieja vienas su kitu, nes antigenai turi bendrų determinantų.

V. „Kalnų fantazija“ – ši elektroferograma demonstruoja nuostabias kryžminės imunoelektroforezės galimybes atskirti sudėtingą antigenų mišinį.

Imunofluorescencija apima fluorescencinių dažų, tokių kaip natrio izotiocianatas, prijungimą prie antikūno molekulės. Antigeninė medžiaga (bakterijos, ląstelės ar jų komponentai), surišusios paženklintus antikūnus, tampa matomos ultravioletinėje šviesoje. Metodas nėra kiekybinis, bet labai svarbus imunomorfologijoje, nustatant lokalizaciją antigeninės struktūros arba antikūnai.

Konkurencija su radioaktyviuoju antigenu(radioimunologinis metodas) yra vienas iš labiausiai šiuolaikiniai metodai. Antigeno ir antikūno reakciją galima apskaityti naudojant radioizotopiniai metodai jei naudojami „pažymėti“ antikūnai ar antigenai. Matuojant nuosėdų radioaktyvumą, galima įvertinti antikūnų arba antigenų kiekį tiriamuosiuose mėginiuose. Tai padidina vertinimo objektyvumą, pagreitina apskaitą ir padidina atsakymo jautrumą. Jautriausi metodai (1–10 ng medžiagos nustatymas) yra antikūnų konkurencijos tarp nepažymėto ir paženklinto antigeno metodai. Metodo principas yra toks. Naudojamas standartinis antiserumo kiekis prieš tiriamąjį antigeną ir standartinis šio antigeno, paženklinto radioaktyviuoju 125 I, 131 I, 2 H ar kitu izotopu, kiekis. Jų santykis yra toks, kad 70–80 % pažymėto antigeno yra surišti antikūnais, sudarydami radioaktyvias nuosėdas, kurių radioaktyvumo reikšmė N. Jei į reaguojančią sistemą įpilama substrato, kuriame patikrintas šio antigeno buvimas, tada, esant antigenas jis konkuruoja su paženklintu antigenu ir nuosėdų radioaktyvumas mažėja. Kuo daugiau antigeno tiriamajame mėginyje, tuo mažesnis nuosėdų radioaktyvumas. Šiuo metodu nustatoma medžiagų, kurios dėl nereikšmingos koncentracijos biocheminiais metodais neaptinkamos (hormonų: insulino, augimo hormono, AKTH, gonadotropino, digoksino, somatotropino ir kt.) koncentracija kraujyje, šlapime ir kitose medžiagose. .

Ryžiai. 13. Membraninio imunoglobulino (IgM - 8S) išskyrimo nuo B limfocitų paviršiaus metodas.

1. Limfocitų paviršiaus baltymų ženklinimas 125 I, esant laktoperoksidazei (LP).

2. Ląstelių lizė ir paviršiaus baltymų išsiskyrimas į tirpalą.

3. Pažymėtų imunoglobulinų nusodinimas naudojant specifinį anti-Ig serumą.

4. Nuosėdų plovimas ir nusodinimas.

5. Nuosėdų sunaikinimas ir lengvųjų bei sunkiųjų grandinių elektroforezinė analizė poliakrilamido gelyje

Imunofermentinis metodas atstovauja labiausiai vystymuisi Pastaraisiais metais. Jautrumu jis nėra prastesnis nei ankstesnis, tačiau yra paprastesnis, jei yra komercinių reagentų. Antikūnai prieš konkretų antigeną yra sorbuojami ant polistirolo vamzdelių sienelių. Į šį mėgintuvėlį įpilamas tiriamas substratas. Kai šio antigeno yra, jis susijungia su antikūnais. Substratas nusausinamas ir į mėgintuvėlį įpilama antikūnų prieš tą patį antigeną. Šie antikūnai yra paženklinti fermentu, dažniausiai chromo peroksidaze. Pažymėti antikūnai prisijungia prie ankstesnio komplekso ir taip pat lieka ant mėgintuvėlio sienelių. Mėgintuvėlio turinys pakeičiamas chromogeno (ortofenilendiamino) mišiniu su šio fermento substratu - H 2 0 2. Jei norimas antigenas buvo tiriamajame skystyje, fermentas fiksuojamas ant mėgintuvėlio sienelių ir suskaido H 2 0 2: išsiskyręs deguonis nuspalvina chromogeną geltonai.

Wanier metodas apima fotoelektronfelometro naudojimą, siekiant atsižvelgti į kritulių kiekį, kurio pagalba registruojamas serumo optinio tankio pokytis po antigeno pridėjimo. Skiedžiant serumą distiliuotu vandeniu optinis tankis mažėja. Jei serume yra antikūnų ir jis naudojamas kaip skiediklis vandens tirpalas antigeno, tada optinio tankio kitimo kreivė bus kitokia. Iš pradžių sumažėja optinis tankis, susikaupus pakankamam antigeno kiekiui, mažėjimas sustoja, tada stebimas antigeno-antikūno mišinio optinio tankio padidėjimas.

Lizės reiškinys- kai kurių antikūnų gebėjimas ištirpinti ląsteles, prieš kurias jie atsirado. Šie antikūnai, patekę į bakterijas, vadinami bakteriolizinais, o prieš raudonuosius kraujo kūnelius – eritrolizinais arba hemolizinais. Imuninės lizės reakcijos pasižymi tuo, kad jos nevyksta esant tik dviems ingredientams – antigenui ir antikūnui. Būtinas trečiojo komponento, vadinamo komplemento, buvimas. Daugelio gyvūnų kraujo serume komplementas randamas įvairiais kiekiais; jo ypač gausu kraujo serume jūrų kiaulytės. Iš pradžių reakcija vyksta pagal agliutinacijos tipą, vėliau komplementas prisijungia prie antigeno-antikūno komplekso ir atsiranda vietinis bakterijų, raudonųjų kraujo kūnelių ar kitų ląstelių membranos tirpimas.

Citotoksiškumo reiškinys nustatomi antikūnų, vadinamų citotoksinais. Jų poveikis yra toks, kad jie turi toksinį poveikį, atimdami ląstelių gyvybingumą. Reakcija citotoksinams aptikti atliekama su ląstelių suspensija izotoniniame buferiniame natrio chlorido tirpale. Į juos dedama dažų, tokių kaip eozinas arba tripano mėlynasis. Gyvos ląstelės nedažytos, negyvos ląstelės greitai suvokia dažus (per 30 s). Jei į ląstelių suspensiją pridėsite imuninio serumo, kuriame yra citotoksinų ir papildo, ląstelės žus ir taps spalvos, kai bus tiriamos dažais. Negyvų ląstelių procentas rodo citotoksinų kiekį kraujo serume. Reakcijai reikalingas komplemento buvimas.

Komplemento fiksavimo reakcija (CFR) remiantis aukščiau aprašyta komplemento savybe prisijungti prie antigeno-antikūno komplekso. Tiksliau, komplementas yra pritvirtintas prie specialios antikūno molekulės sunkiosios grandinės srities. Tačiau ši vieta tampa prieinama tik tada, kai antikūnas prisijungia prie antigeno. Susijungęs su vienu antigeno-antikūno kompleksu, komplementas negali pereiti į kitą kompleksą, kuris patenka į reaguojančią sistemą po pirmojo komplekso sąveikos ir pridėjus tam tikrą komplemento kiekį. Kaip antrasis kompleksas dažniausiai naudojama vadinamoji hemolizinė sistema – avių eritrocitų mišinys su antikūnais prieš juos. Jei pirmasis kompleksas yra antigeno-antikūno kompleksas, tai reaguojančiame mišinyje nebus laisvo komplemento; raudonųjų kraujo kūnelių hemolizė neįvyks. Priešingai, jei tiriamojoje medžiagoje (pavyzdžiui, kraujo serume) nėra antikūnų prieš naudojamus antigenus, komplementas išliks laisvas ir užtikrins raudonųjų kraujo kūnelių hemolizę. RSC naudojamas sifilio (Wassermann reakcijos) diagnostikai, anti-audinių antikūnų ir autoantikūnų tyrimams; jis plačiai naudojamas diagnozuojant daugybę virusinių infekcijų.

Specifinis vėlavimo reiškinys dažnai naudojamas dviejų dominančių antigenų palyginimui. Pavyzdžiui, imuninis serumas ruošiamas nuo pelių raudonųjų kraujo kūnelių. Norint nustatyti, ar jame yra antikūnų prieš giminingos gyvūnų rūšies (žiurkės) raudonuosius kraujo kūnelius, serumas apdorojamas žiurkės raudonaisiais kraujo kūneliais. Jei antikūnų kiekis serume sumažėja, tada yra susijusių antigenų, jei visiškai sumažėja, antigenai yra identiški. Naudojant šią reakciją, buvo ištirta daugelio susijusių antigenų ir haptenų tapatybė ar netapatumas.

Toksinų neutralizavimo reakcija. Antitoksinai – tai antikūnai prieš bakterinius ir kai kuriuos kitus (pavyzdžiui, gyvatės nuodų) antigeninio pobūdžio toksinus. Antitoksinai, susijungę su atitinkamomis toksinėmis medžiagomis, juos neutralizuoja. Neutralizacijos laipsnį galima reguliuoti jautriam gyvūnui suleidus toksino ir antitoksino mišinio. Antitoksino kiekis imuniniame serume apibūdinamas minimalių mirtinų toksino dozių kiekiu, kurį gali neutralizuoti tam tikras serumo kiekis. Neutralizacijos reakcija naudojama toksinų koncentracijai nustatyti iš difterijos, stabligės ir kt. sukėlėjų. Tam naudojami standartizuoti antitoksiniai serumai.

Opsonizacijos reiškinys slypi tame, kad antikūnai sustiprina neutrofilų ir makrofagų fagocitinį aktyvumą prieš tas antigenines medžiagas ar mikroorganizmus, prieš kuriuos jie gaminami. Pavyzdžiui, fagocitų aktyvumas prieš stafilokokus žymiai padidėja, jei leukocitai arba leukocitų donoras gydomi antistafilokokiniu serumu. Šis poveikis buvo susijęs su specialių opsonino antikūnų buvimu. Tačiau reikia nepamiršti, kad specialių opsoninų, hemolizinų, bakteriolizinų ar precipitinų antikūnų nėra. Tai tik pagrindinės imunoglobulino molekulių funkcijos, suteikiančios specifinį antigeno-antikūno kompleksą, apraiškos.

D. Grėjus veda geras pavyzdysšios funkcijos vienybę ir įvairovę. Antikūnai, paruošti prieš I tipo pneumokokinį polisacharidą, gali:

1) sukelti I tipo pneumokokų agliutinaciją ir jų kapsulės patinimą;

2) sukelti I tipo pneumokokų tirpaus ekstrakto nusodinimą;

3) pridėti papildymą, ty pateikti RSC;

4) turi opsonizuojantį poveikį leukocitams prieš I tipo pneumokokus;

5) vykdyti specifinę gyvūnų apsaugą nuo pneumokokinės infekcijos.

Nepaisant to, įvairiose specifinėse eksperimentinėse ar klinikinėse situacijose pirmenybė teikiama specifinėms antigeno ir antikūnų reakcijoms. Diagnozuojant vidurių šiltinės jie naudoja Widal reakciją – bakterijų agliutinaciją, sudėtingų biologinių skysčių ar audinių ekstraktų antigeniniams komponentams analizuoti – nusodinimo reakcijas agare imunodifuzijos arba imunoelektroforezės forma. Dirbant su toksinais ir daugeliu tirpių antigenų, naudojami metodai pasyvi hemagliutinacija. Hormonų kiekiui kraujyje nustatyti tinkamiausias radioimunologinis metodas ir kt. Skirtingų klasių imunoglobulinai atlieka skirtingas jungimosi su antigenu funkcijas.

Principas priešinė imunoelektroforezė(VIEF) susideda iš vienalaikio antigenų ir antikūnų judėjimo gelyje vienas kito, veikiant elektros srovei.

Dėl specifinės jų sąveikos susidaro nuosėdų linija. Metodas sujungia difuzinio nusodinimo gelyje reakcijos paprastumą ir didelę elektroforezės skiriamąją gebą. Nors šis metodas yra prastesnis už fluorescencinių antikūnų ir reakcijos metodą netiesioginė hemagliutinacija, tačiau tam nereikia liuminescencinių antikūnų, liuminescencinio mikroskopo ir eritrocitų diagnostikos rinkinio.

VIEF yra kokybinis metodas. Tai labai specifinė ir lengvai atliekama. Jis gali būti naudojamas aptikti bakterijų ar virusų antigenus patologinėje medžiagoje, laboratorinių (biologinių) gyvūnų organuose ar aplinkos objektuose.

Medžiagos ir įranga. 1. Agarozė A ir B. 2. 0,05 M medinal-HCl buferis (pH 8,6). 3. Natrio chloridas. 4. Dinatrio fosfatas. 5. Monokalio fosfatas. 6. Kalio chloridas. 7. Amonio oksalatas. 8. Specifinis bakterinis arba virusinis antigenas. 9. Kameros elektroforezei. 10. 50 mA nuolatinės srovės lygintuvas. 11. Elektrinis sauso oro termostatas. 12. Laboratorinė stalinė centrifuga.

Inscenizacijos technika. 30 ml išlydytos 1 % agarozės, paruoštos medinal-HCl buferyje (pH 8,6), pilama ant horizontaliai padėtos stiklinės plokštelės. Geliui sukietėjus perforatoriumi išpjaunamos dvi dvigubos 5 mm skersmens skylučių eilės (kiekvienoje eilėje po 8 skyles); atstumas tarp dvigubos eilutės yra 30 mm. Gelis pašalinamas iš šulinėlių, surenkamas į mėgintuvėlį, ištirpinamas virš degiklio liepsnos ir, naudojant Pasteur pipetę, įpilamas į šulinių dugną.

Tiriamoji medžiaga dedama ant katodo pusės, o monospecifinis serumas dedamas ant anodo pusės, bet pageidautina, kad monokloniniai antikūnai (mAb) būtų 0,035 ml tūrio. Pavyzdžiui, aptikti pneumokoką – antapneumokoko serumą, nustatyti gripo viruso antigeną – antigripo serumą ir kt.

Plokštelė dedama į elektroforezės kamerą taip, kad putplastis, naudojamas kaip jungiamasis tiltelis tarp buferinės sistemos ir nešiklio gelio, paliestų pastarąjį. Elektroforezė atliekama kambario temperatūroje, esant 140...150 V įtampai ir 35 mA srovei 18...35 minutes.

Kontrolė. Tiriant medžiagą VIEF, siekiant nustatyti specifinio antigeno buvimą, turi būti atlikta kontrolė su akivaizdžiai teigiama medžiaga.

Patogeno aptikimas derinant VIEF su auginimu. Užterštoms medžiagoms inokuliuoti reikia naudoti selektyvią terpę.

Po 36 valandų inkubacijos 37 °C temperatūroje 0,3 ml 0,85 proc. NaCl tirpalas su 4% formaldehidu, padarykite plovimą, kuris įsiurbiamas į mėgintuvėlį ir po 1 valandos poveikio tiriamas VIEF.

Rezultatų apskaita. At teigiamas rezultatas tarp duobutės su tiriamąja medžiaga ir šulinėlio su specifiniu serumu atsiranda linija. Nuosėdų linija, priklausomai nuo antigeno kiekio tiriamojoje medžiagoje, gali būti arba atstumo tarp šulinėlių viduryje, arba arčiau serumo rezervuaro.

Paprastai nuosėdų linijos susidaro praėjus 18...35 minutėms nuo elektroforezės pradžios.

Jei radote klaidą, pažymėkite teksto dalį ir spustelėkite Ctrl + Enter.