Jis pagrįstas tuo, kad raudonieji kraujo kūneliai, ant kurių anksčiau buvo adsorbuoti antigenai, įgyja galimybę agliutinuotis esant homologiniams serumams (antikūnams).

Šiuo atveju raudonieji kraujo kūneliai veikia kaip specifinių determinantų nešiotojai, kurių agliutinacija atsiranda dėl antigeno + antikūno reakcijos.

Raudonieji kraujo kūneliai, prie kurių paviršiaus tvirtai prisitvirtinę antigenai, vadinami eritrocitų antigeno diagnostikomis arba antigenu įjautrintais eritrocitais.

Kitas RNGA tipas – antikūnai adsorbuojami eritrocitų paviršiuje ir vėliau vyksta jų agliutinacija, esant homologiniam antigenui. Tokiu atveju tokie eritrocitai vadinami eritrocitų antikūnų diagnostiniais arba eritrocitais, įjautrintais antikūnais.

Remiantis šiais dviem pagrindiniais metodiniais metodais, buvo sukurta ir naudojama daug RNGA modifikacijų. Taigi mažos standartinės latekso dalelės naudojamos kaip nešikliai. Šiuo atveju reakcija vadinama latekso agliutinacijos reakcija (RLA) arba naudojama Staphylococcus aureus- krešėjimo reakcija ir kt. Paprastai eritrocitų diagnostikos yra ruošiamos biologinės pramonės įmonėse, o pagrindinė RNGA patirtis atliekama diagnostinėse laboratorijose.

Eritrocitų diagnostikos paruošimas apima šiuos veiksmus:

raudonųjų kraujo kūnelių fiksavimas formaldehidu arba glutaro ar akrilo aldehidais. Tokie apdoroti raudonieji kraujo kūneliai saugomi ilgą laiką. Dažniau tam naudojami eritrocitai iš avių, žmonių, vištų ir kt.;
fiksuotų eritrocitų gydymas tanino tirpalu. Dėl to raudonieji kraujo kūneliai įgyja gebėjimą negrįžtamai adsorbuoti baltymus (virusus ir antikūnus) savo paviršiuje;
Tanizuotų eritrocitų jautrinimas virusais arba antikūnais.

Pažymėtina, kad eritrocitų diagnostikos paruošimo metodai virusinės infekcijos skirtinga.

RNGA atlikimo procedūra, skirta aptikti ir nustatyti antikūnų titrą, yra tokia:

vienodos antigenu įjautrintų eritrocitų dozės dedamos į 2 kartus didesnius serumo skiedimus;
mišinys paliekamas 2-3 valandoms kambario temperatūroje arba 16-18 valandų 4 °C temperatūroje;
atsižvelgti į rezultatus. Jei serume yra antikūnų prieš virusą, su kuriuo buvo įjautrinti raudonieji kraujo kūneliai, stebima hemagliutinacija, kuri vertinama kryžminant.

Antikūnų titras serume laikomas didžiausiu serumo praskiedimu, kuris vis dar užtikrina hemagliutinaciją bent dviem kryžminimo būdu.

RNGA yra kartu su visais susijusiais valdikliais. Paprastai reakcija atliekama naudojant mikrometodą.

RNGA leidžia išspręsti šias diagnostikos problemas:

aptikti antikūnus ir nustatyti jų titrą kraujo serume naudojant žinomą eritrocitų antigeno diagnostiką;
aptikti ir identifikuoti nežinomą virusą naudojant žinomą eritrocitų antikūnų diagnostiką.

RNGA privalumai: didelis jautrumas, išdėstymo technikos paprastumas ir reakcijos greitis. Tačiau svarbu pažymėti, kad didelių sunkumų iškyla rengiant stabilią eritrocitų diagnostiką (didelė priklausomybė nuo naudojamų komponentų grynumo, būtinybė parinkti kiekvieno viruso tipo eritrocitų fiksavimo, tanizacijos ir jautrinimo būdą).

RTGA principas susideda iš vienodo kiekio kraujo serumo ir viruso suspensijos sumaišymo mėgintuvėlyje ir po ekspozicijos nustatymo, ar viruso lieka mišinyje, pridedant raudonųjų kraujo kūnelių suspensijos. Eritrocitų agliutinacija rodo buvimą, o hemagliutinacijos nebuvimas – viruso nebuvimą mišinyje. Viruso išnykimas iš viruso + serumo mišinio laikomas serumo antikūnų ir viruso sąveikos požymiu.

Tačiau antikūnai sąveikauja su antigenais griežtai apibrėžtais kiekybiniais santykiais. Todėl, norint, kad tam tikras viruso kiekis netektų hemagliutinacijos gebėjimo, reikalingas tam tikras antikūnų minimumas, o kadangi vienas iš RTHA komponentų visada nežinomas, reakcija turi būti įtraukta į eilę mėgintuvėliai su skirtingomis antikūnų dozėmis ir tomis pačiomis viruso dozėmis arba atvirkščiai. Tai pasiekiama vartojant skirtingus serumo skiedimus ir tą patį viruso praskiedimą, arba skirtingus viruso skiedimus ir tą patį serumo praskiedimą.

RTGA leidžia išspręsti šias problemas: nustatyti antikūnų prieš hemagliutinuojantį virusą titrą serume; nustatyti nežinomą hemagliutinuojantį virusą iš žinomų serumų; nustatyti dviejų virusų antigeninio giminingumo laipsnį.

RTGA privalumai: technikos paprastumas, greitis, nereikia sterilaus darbo, konkretumas, maža kaina. Trūkumas: RTGA galima tik su hemagliutinuojančiais virusais.

Antikūnų titravimo principas RTGA yra taip:

– paruošti vienodais tūriais (dažniausiai 0,25 arba 0,2 ml) tiriamojo serumo skiedimų seriją (dažniausiai 2 kartus);

– į kiekvieną skiedimą pridedamas toks pat homologinio viruso kiekis, kurio titras yra 4 HAE;

– mišiniai laikomi tam tikras laikas tam tikroje temperatūroje (Niukaslio ligos virusui 40–60 min. kambario temperatūroje);

– į visus mišinius įpilama vienodo tūrio 1 % nuplautų eritrocitų suspensijos;

– po ekspozicijos hemagliutinacija kiekviename mišinyje vertinama kryžminimo būdu.

Reakcija apima serumo, viruso ir raudonųjų kraujo kūnelių kontrolę.

Didžiausias serumo praskiedimas, kuris vis dar visiškai slopina hemagliutinaciją, laikomas antikūnų titro šiame serume rodikliu.

Hemadsorbcijos reakcijos panaudojimas virusologijoje.

RGAd. Hemadsorbciją – eritrocitų ryšį su viruso paveiktų ląstelių paviršiumi – pirmą kartą atrado Vogelis ir Shchelokovas (1957) ant audinių kultūros, užkrėstos gripo virusu. Šis reiškinys pagrįstas viruso receptorių, esančių paveiktos ląstelės paviršiuje, afinitetu su eritrocitų receptoriais, o tai lemia jų tarpusavio sukibimą, panašų į hemagliutinacijos reakciją. Šios reakcijos pranašumas yra tas, kad ji tampa teigiama dar prieš atsirandant ryškiems citopatiniams pokyčiams užkrėstose ląstelėse.

RGAd technika yra taip. 3-4 dieną po ląstelių užkrėtimo paimami du mėgintuvėliai su ta pačia ląstelių kultūra, iš kurių vienas užkrėstas viruso turinčia medžiaga, o antrasis – kontrolinis. Kultūrinis skystis nupilamas iš abiejų mėgintuvėlių ir į abu įlašinama po 2–3 lašus 0,5 % nuplautų eritrocitų suspensijos. Abu mėgintuvėliai paliekami 5–10 minučių, kad raudonieji kraujo kūneliai atsidurtų ląstelių paviršiuje (statykite horizontaliai ant stalo), po to lengvai nuplaunami fiziologiniu tirpalu ir tiriami mikroskopu (mažu padidinimu). Kontroliniame mėgintuvėlyje raudonieji kraujo kūneliai visiškai pašalinami fiziologiniu tirpalu, o dalis likusių plūduriuoja kartu su skysčiu. Jei raudonieji kraujo kūneliai užkrėstame mėgintuvėlyje nebuvo pašalinti fiziologiniu tirpalu ir neplūduriuoja, o yra prisitvirtinę prie ląstelių paviršiaus, RGAd turėtų būti laikomas teigiamu.

Priklausomai nuo viruso ir ląstelės tipo, raudonųjų kraujo kūnelių išsidėstymas gali būti trejopas:

– raudonieji kraujo kūneliai adsorbuojami tik išilgai ląstelių sluoksnio periferijos „karolių“ pavidalu (afrikinio kiaulių maro virusas);

– raudonieji kraujo kūneliai yra ant ląstelių sluoksnio židiniuose arba sankaupose (gripo virusas);

– raudonieji kraujo kūneliai išsidėstę difuziškai ląstelių sluoksnyje (paragripo virusas).

Kiekvienas virusas gali adsorbuoti tam tikrų rūšių gyvūnų raudonuosius kraujo kūnelius.

Serologinė virusinių ligų diagnozė padidinus antikūnų titrą suporuotuose kraujo serumuose.

Hemagliutinacijos reakcija (HRA) ir hemagliutinacijos slopinimo reakcija (HIR), reakcijų mechanizmas, komponentai ir taikymas.

Hemagliutinacijos reakcija pagrįsta raudonųjų kraujo kūnelių klijavimo reiškiniu, kuris atsiranda veikiant įvairių veiksnių. Yra tiesioginė ir netiesioginė hemagliutinacija.

Pirmiausia raudonieji kraujo kūneliai plaunami izotoniniu natrio chlorido tirpalu, tada, jei reikia (naudojant baltymų antigenus), jie apdorojami tanino tirpalu santykiu 1:20 000 ir jautrinami tirpiais antigenais. Išplovus buferiniu izotoniniu natrio chlorido tirpalu, eritrocitų antigenas yra paruoštas naudoti.

Tiriamasis serumas skiedžiamas izotoniniu natrio chlorido tirpalu mėgintuvėliuose arba specialiose plastikinėse plokštelėse su duobutėmis, tada į kiekvieną serumo praskiedimą pridedama eritrocitų diagnostinė medžiaga. Reakcijos rezultatai netiesioginė hemagliutinacija atsižvelgiama į mėgintuvėlio dugne susidariusių raudonųjų kraujo kūnelių nuosėdų pobūdį. Reakcijos rezultatas, kai raudonieji kraujo kūneliai tolygiai padengia visą vamzdelio dugną, laikomas teigiamu. Neigiamos reakcijos atveju raudonieji kraujo kūneliai mažo disko arba „mygtuko“ pavidalu yra mėgintuvėlio dugno centre.

Pagrindiniai RP komponentai:

A) tirpus antigenas,

B) Specifiniai antikūnai (serumas)

(RTGA) yra viruso identifikavimo arba antivirusinių antikūnų nustatymo paciento kraujo serume metodas, pagrįstas raudonųjų kraujo kūnelių agliutinacijos nebuvimu viruso turinčiu vaistu, kai yra jam atsparus kraujo serumas.
yra pagrįstas blokada, viruso antigenų slopinimu imuninio serumo antikūnais, dėl kurių virusai praranda gebėjimą agliutinuoti raudonuosius kraujo kūnelius.

RTGA naudojama diagnozuoti daugybę virusinių ligų, kurių sukėlėjai (gripo virusai, tymai, raudonukė, erkinis encefalitas ir kt.) gali agliutinuoti įvairių gyvūnų eritrocitus.
Mechanizmas. Viruso tipavimas atliekamas naudojant hemagliutinacijos slopinimo reakciją (HAI) su tipui būdingų serumų rinkiniu. Į reakcijos rezultatus atsižvelgiama į tai, kad nėra hemagliutinacijos. Viruso A potipiai su antigenais H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 ir kt.

RTGA galima diferencijuoti su homologinio tipo specifinių serumų rinkiniu.

Pagrinde hemagliutinacijos reakcijos slypi raudonųjų kraujo kūnelių sukibimo reiškinys, kuris atsiranda įvairių veiksnių įtakoje.

Yra tiesioginė ir netiesioginė hemagliutinacija.
Tiesioginės hemagliutinacijos reakcijos metu raudonieji kraujo kūneliai sulimpa, kai ant jų adsorbuojami tam tikri antigenai, pavyzdžiui, virusai.
Serologiniuose tyrimuose naudojama tiesioginė hemagliutinacijos slopinimo reakcija, kai iš paciento išskirtas virusas neutralizuojamas specifiniu imuniniu serumu ir po to sujungiamas su raudonaisiais kraujo kūneliais.

Hemagliutinacijos nebuvimas rodo viruso ir naudojamo imuninio serumo konsistenciją.

Netiesioginė hemagliutinacijos reakcija (pasyvi hemagliutinacija) stebima tais atvejais, kai imuninis serumas arba paciento serumas, turintis atitinkamų antikūnų, pridedamas prie raudonųjų kraujo kūnelių, anksčiau apdorotų (įjautrintų) įvairiais antigenais.

Vyksta specifinis raudonųjų kraujo kūnelių klijavimas, jų pasyvi hemagliutinacija.

Netiesioginė arba pasyvi hemagliutinacijos reakcija yra pranašesnė už kitus serologinius metodus jautrumu ir specifiškumu, ji naudojama diagnozuojant bakterijų, riketsijų ir pirmuonių sukeltas infekcijas.

Netiesioginės hemagliutinacijos reakcijos atlikimo metodas susideda iš kelių etapų.

Išplovus buferiniu izotoniniu natrio chlorido tirpalu, eritrocitų antigenas yra paruoštas naudoti. Tiriamasis serumas skiedžiamas izotoniniu natrio chlorido tirpalu mėgintuvėliuose arba specialiose plastikinėse plokštelėse su duobutėmis, tada į kiekvieną serumo praskiedimą pridedama eritrocitų diagnostinė medžiaga.

Į netiesioginės hemagliutinacijos reakcijos rezultatus atsižvelgiama pagal vamzdelio apačioje susidariusių raudonųjų kraujo kūnelių nuosėdų pobūdį. Reakcijos rezultatas, kai raudonieji kraujo kūneliai tolygiai padengia visą vamzdelio dugną, laikomas teigiamu. Esant neigiamai reakcijai, raudonieji kraujo kūneliai mažo disko arba „mygtuko“ pavidalu yra mėgintuvėlio dugno centre.

Hemagliutinacijos slopinimo reakcija- serologinė reakcija, pagrįsta antikūnų gebėjimu užkirsti kelią eritrocitų agliutinacijai dėl hemagliutinuojančių virusų tipų (adenovirusų, arbovirusų, kai kurių enterovirusų, gripo ir paragripo virusų, tymų, reovirusų).

Specifiniai antivirusiniai antikūnai sąveikauja su šių virusų virionų paviršiaus hemagliutinino molekulėmis ir blokuoja jų prisijungimą prie papildomų eritrocitų membranos molekulių.

IN Pastaruoju metu reakcija plačiai naudojama klinikinės virusologijos laboratorijose, nustatant specifinių antikūnų prieš tam tikrus virusus titrus, taip pat serologiniam virusų izoliatų identifikavimui ir tipavimui iš pacientų klinikinės medžiagos.

Jų naudojimas yra šiek tiek ribotas, nes žmogaus kraujo serume yra nespecifinių viruso inhibitorių, taip pat natūralių antikūnų - agliutininų.

Neutralizacijos reakcija yra hemagliutinacijos slopinimo reakcija (HRI).

RTGA naudojamas:
-virusams serotipuoti;
- infekcijų serodiagnostikai.
Yra du nustatymo būdai:
- lašinimo metodas ant stiklo ( orientacinė reakcija), naudojamas virusams seroskopuoti;
- išplėstas mėgintuvėliuose.

Mechanizmas.

Kai kurie virusai (pavyzdžiui, gripas) turi hemagliutinino, kuris, priklausomai nuo viruso tipo, sukelia įvairių gyvūnų raudonųjų kraujo kūnelių agliutinaciją.

Jei serume yra antikūnų – antihemagliutininų, stebimas viruso aktyvumo slopinimas.
RTGA.
Tikslas: A gripo viruso serotipų nustatymas

Komponentai:
1. Tiriama medžiaga yra vištienos embriono alantoinis skystis,
2. Diagnostiniai antigripo tipo specifiniai serumai,
3. 5% vištienos eritrocitų suspensija.
4.

Druskos tirpalas.

Reakcija atliekama ant stiklo, naudojant lašų metodą. Ant stiklinės užlašinkite 1 lašą diagnostinio serumo ir tiriamosios medžiagos, sumaišykite, tada įlašinkite 1 lašą raudonųjų kraujo kūnelių suspensijos. Esant teigiamai reakcijai, pastebimas vienalytis paraudimas, o esant neigiamai - raudoni dribsniai iškrenta (hemagliutinacija).

Ankstesnis31323334353637383940414243444546Kitas

Gripo virusų charakteristikos. Gripo epidemiologija ir diagnostika. RTGA naudojimas gripo virusų serotipams nustatyti. Preparatai specifinei profilaktikai ir gydymui.

Gripas arba gripas – ūmus infekcija, būdingas viršutinės dalies gleivinės pažeidimas kvėpavimo takų, karščiavimas, bendras apsinuodijimas, širdies ir kraujagyslių bei nervų sistemų sutrikimai.

Gripas yra linkęs plisti epidemijai ir pandemijai dėl didelio patogeno užkrečiamumo ir kintamumo.

Patogenų charakteristikos. Ligos sukėlėjai – gripo virusai priklauso šeimai. Orthomyxoviridae, Influenzavirus A, B ir Influenzavirus C gentys. Gripo virusai yra RNR virusai. A tipo gripo virusą 1933 metais išskyrė W. Smithas, K. Andrewsas ir P. Laidlaw. 1940 metais T.

Hemagliutinacijos metodo taikymas virusologijoje.

Francis ir R. Magillas išskyrė B tipo gripo virusus, 1949 m. R. Taylor - C tipą. Rusijoje pirmuosius gripo virusus 1936 metais išskyrė A. A. Smorodincevas ir priskyrė A tipui. Morfologija. Gripo virusai yra sferinės formos (rutulio formos) - 80 - 120 nm, rečiau yra siūlinės formos. Susideda iš: 1) šerdies - spiralinės simetrijos tipo nukleokapsidės (viengrandė linijinė RNR grandinė + baltymo kapsidė); 2) bazinė membrana- išorinė lipoproteinų membrana - superkapsidas.

Korpuso paviršiuje yra 2 tipų glikoproteinai (spyglių ir gaurelių pavidalu): 1) hemagliutininas – skatina prisirišimą prie ląstelės receptorių; 2) neuraminidazė – skatina viruso išsiskyrimą iš ląstelės. Auginimas. Auginimui naudojami viščiukų embrionai, pirminės tripsinizuotos ląstelių kultūros ir kartais laboratoriniai gyvūnai.

Patogiausias modelis yra vištienos embrionai 10-12 - dienų amžiaus. Tai leidžia gauti didelius viruso kiekius, kurie yra būtini gaminant vakcinas ir antibakterinius vaistus.

Infekcija atliekama į alontoinę ertmę, į choriono-allontoinę membraną, į amniono ertmę, į amnioną. Viruso buvimas vištienos embrione nustatomas hemagliutinacijos reakcija. Antigeninė struktūra. Virusai turi vidinį antigeną – S ir paviršinius antigenus: HA-hemagliutininą ir NA-neuraminidazę. S-antigenas yra specifinis grupei, bendras visam tipui, pagal šį antigeną gripo virusai skirstomi į A, B ir C tipus. Tai komplementą fiksuojantis, stabilus (nekintantis) antigenas.

HA ir NA antigenai yra specifiniai antigenai. HA antigenas sukelia virusą neutralizuojančių antikūnų susidarymą ir raudonųjų kraujo kūnelių sukibimą.

NA antigenas sukelia antikūnų, kurie iš dalies neutralizuoja virusus, susidarymą.

B tipo virusas yra mažiau kintantis, o C tipas yra labai stabilus.

Toksiškos savybės. Toksinis viruso poveikis organizmui ( galvos skausmas, raumenų skausmas, karščiavimas, katariniai simptomai) sukelia virusiniai baltymai (pati viruso dalelė). Šis veiksmas yra griežtai specifinis ir jį neutralizuoja tik atitinkamo tipo ar potipio imuninis serumas arba tų, kurie pasveiko nuo ligos. Atsparumas. Gripo virusai jautrūs UV spinduliams, dezinfekcinėms medžiagoms (formalinui, alkoholiui, fenoliui, chloraminui) ir riebalų tirpikliams.

Skystoje aplinkoje jie žūva 50 - 60°C temperatūroje keletą minučių. Kambario temperatūroje ore virusai kelias valandas išlaiko infekcines savybes. Džiovinami jie ilgai išsilaiko, o sušalę (-70°C) ne tik ilgai išsilaiko, bet ir nepraranda virulentiškumo.

Gyvūnų jautrumas. Natūraliomis sąlygomis A tipo virusai užkrečia žmones ir gyvūnus (pažeidžiami arkliai ir kiaulės), o B ir C tipo virusai – tik žmones. Tarp laboratorinių gyvūnų virusams jautrios baltosios pelės, afrikiniai šeškai, sirų žiurkėnai ir beždžionės.

Gyvūnų liga pasižymi plaučių pažeidimu, karščiavimu ir gali baigtis gyvūnų mirtimi. Ligos epidemiologija. Infekcijos šaltinis – sergantis žmogus, turintis kliniškai ryškią ar besimptomę formą. Sergantis žmogus išskiria virusą į aplinką kosint, kalbant, čiaudint seilių, gleivių, skreplių lašeliais jau inkubaciniu laikotarpiu.

Pacientas užsikrečia likus 24 valandoms iki pagrindinių simptomų atsiradimo ir kelia epidemijos pavojų per 48 valandas po jų išnykimo.

Transmisijos mechanizmas yra aerogeninis. Perdavimo kelias yra oru. Žmonių imlumas gripui yra labai didelis. Visi serga amžiaus grupėse, daugiausia in žiemos laikas. Vaikai ir pagyvenę žmonės yra labiausiai jautrūs. Ligos pavadinimas atspindi epidemiologijos ypatumus: gripas iš prancūzų kalbos. griebtuvas – grab, gripas – iš italų kalbos. Influenza di freddo – šalčio įtaka.

Iš visų aštrių kvėpavimo takų ligos gripas yra labiausiai paplitęs ir rimta liga. Pandemijos ir gripo epidemijos apima iki 30-50% ir daugiau gyventojų gaublys, darantis didžiulę žalą šalių sveikatai ir ekonomikai. Pirmieji gripo epidemijų aprašymai datuojami XII-XIV a. Pandemijų ir didelių epidemijų atsiradimą sukelia A tipo gripo virusas, kuris atsiranda dėl didelio viruso kintamumo ir yra susijęs su naujo potipio atsiradimu dėl antigenų poslinkio.

Tarp pandemijų epidemijos protrūkiai įvyksta kas 1,5–2 metus, o tai susiję su antigeniniu virusų dreifu. 1918 metais Ispanijos gripo pandemiją (susirgo 1,5 mlrd. žmonių, mirė 20 mln. žmonių) sukėlė A1 gripo virusas. Iš pradžių registruota Ispanijoje, ši pandemija apėmė beveik visus Žemės gyventojus; liga pasižymėjo itin sunkios hemoraginės pneumonijos išsivystymu su rekordiniu mirtingumu (iki 1 proc. visų atvejų).

1957 m. „Azijos“ pandemiją (susirgo 2 mlrd. žmonių) sukėlė naujas potipis - A2 potipis. 1968 m. „Honkongo“ pandemiją (susirgo 1 milijardas žmonių) sukėlė naujai atsiradęs potipis - A3 potipis. Paprastai, naujas variantas virusas išstumia iš žmonių populiacijos anksčiau cirkuliavusį variantą.

Tačiau 1977 m., po 20 metų pertraukos, A1 tipas netikėtai „grįžo“, o tai sukėlė didelę epidemiją. Todėl išstumti gripo viruso variantai išlieka ir tam tikrais laiko tarpais vėl gali sukelti epidemiją. B tipo virusas sukelia vietines epidemijas, tačiau C tipas nesukelia epidemijų. Patogenezė ir klinikinis ligos vaizdas. Įėjimo vartai yra viršutiniai kvėpavimo takai. Virusas įsiskverbia į gleivinės epitelio ląsteles ir jose dauginasi.

Viruso poveikis epitelio ląstelėms sukelia jų nekrozę ir epitelio deskvamaciją (atmetimą), ko pasekoje gleivinė tampa pralaidi virusams ir bakterijoms. Jie prasiskverbia į kraują ir pasklinda po visą kūną.“ Viremiją lydi daugybiniai kapiliarų endotelio pažeidimai, padidėja jų pralaidumas.

IN sunkūs atvejai Plaučiuose, miokarde ir parenchiminiuose organuose pastebimi dideli kraujavimai. Pažeistų ląstelių ir virusinių baltymų skilimo produktai turi toksinis poveikis ant įvairių organų ir organų sistemų. Viruso toksinai stipriai slopina centrinę nervų sistemą, ir nors procesas netrunka ilgai (3 - 5 dienas), sergantis žmogus ilgai išlieka nusilpęs ir prie nusilpusio organizmo prisijungia kokia nors antrinė infekcija ir atsiranda komplikacijų: gripo pneumonija. , ūminė plaučių edema, inkstų, širdies, bronchų pažeidimas.

Dažna gripo komplikacija yra bakterinė pneumonija(B grupės streptokokai). Per Ispanijos gripo pandemiją žmonės mirė daugiausia nuo antrinės bakterinės pneumonijos.

Gripo patogenezėje svarbi ne tik intoksikacija, bet ir alergija, taip pat imunokompetentingų ląstelių funkcinių savybių pažeidimas, kai išsivysto imunodeficitas. Inkubacinis periodas- kelios valandos - 1-3 dienos. Būdinga ūmi pradžia, temperatūros padidėjimas iki 37,5–38 ° C, bendras apsinuodijimas, išreikštas negalavimu, galvos skausmu, skausmu akių obuoliai, įvairaus sunkumo kvėpavimo takų uždegiminiai procesai (rinitas, laringitas, tracheitas, faringitas).

Karščiuojanti gripo būklė be komplikacijų trunka 5-6 dienas. Imunitetas. Susirgus susiformuoja tipui ir padermei būdingas imunitetas, kurį užtikrina specifiniai ir nespecifiniai ląsteliniai bei humoraliniai veiksniai. Didelė svarba turi Ig A antikūnus.Kryžminis imunitetas nesusidaro,susirgus A1 tipo gripu galima susirgti A2 tipo gripu ir kt. Po B tipo viruso imunitetas išlieka 1-2 metus, po B tipo viruso - 3-5 metus.

Pasyvus natūralus imunitetas – vaikams iki 8 – 11 mėn. Dėl didelio viruso antigeninio kintamumo atsigavimas nesukuria stabilaus imuniteto pakartotinėms infekcijoms.

Laboratorinė diagnostika. Tiriama medžiaga: tepinėliai-atspaudai iš nosies ertmės gleivinės, nosiaryklės išskyros, plaučių gabaliukai, smegenų mirties atveju.

Diagnostikos metodai: 1) citoroskopijos metodas - virusui būdingų viduląstelinių intarpų nustatymas - mikroskopu nudažius pioktaninu, ciliarinio epitelio ląstelėse matomi ryškiai raudoni gripo viruso intarpai; 2) virusologinis metodas- gripo viruso išskyrimas iš žmogaus kūno užkrečiant vištų embrionus tepinėliais iš paciento nosiaryklės; viruso indikacija (buvimas) atliekama naudojant RGA (gripo virusai agliutinuoja žmonių ir įvairių gyvūnų eritrocitus), viruso identifikavimas atliekamas etapais: tipas nustatomas RSC, hemagliutinino potipis nustatomas. RGA, o neuraminidazės potipis nustatomas fermentų aktyvumo slopinimo reakcijoje; 3) serologinis metodas - specifinių antikūnų titro padidėjimo (4 kartus) nustatymas paciento kraujo serume naudojant RSK, RTGA, RN ląstelių kultūroje, nusodinimo reakciją gelyje, ELISA; 4) biologinis metodas— intranazalinė pelių infekcija — medžiagos suleidimas į plaučius eterio anestezija; pelės miršta po 2–3 dienų nuo plaučių uždegimo; 5) greitoji diagnostika – viruso antigeno nustatymas naudojant RIF.

Gydymas ir profilaktika.

Profilaktikai ir gydymui pirmosiomis ligos dienomis vartojamas žmogaus leukocitų interferonas (intranazaliai). IN medicininiais tikslais naudoti antivirusiniai vaistai- remantadinas (A tipo gripas), adaprominas, virazolas ir imunomoduliuojantys vaistai - dibazolas, prodigiosanas, levamizolis.

Sergant sunkiu gripu, ypač vaikams, naudojamas donorinis antigripinis imunoglobulinas, taip pat vaistai – ląstelių proteazių inhibitoriai (Gordox, Contrical, aminokaproinė rūgštis).

Speciali prevencija. Naudojami šie antivirusiniai vaistai ir imunomoduliatoriai, taip pat vakcinos – gyvos ir inaktyvuotos: 1) gyvos monovakcinos, skirtos vartoti per burną – susilpnintos virusų padermės, kurios šiuo metu cirkuliuoja (A1, A3 ir B); pasižymi didžiausiu imunogeniškumu; 2) viso viriono vakcinos iš virulentiškų padermių, inaktyvuotų formaldehidu arba UV spinduliais; 3) subvienetinės gripo vakcinos tik iš paviršinių antigenų – HA ir NA antigenų (turi minimalų reaktogeniškumą).

Norint gauti vakcinas, virusai auginami viščiukų embrionuose ir viščiukų embrionų ląstelių kultūrose.

Įvedus vakcinas, susidaro vietinis ir humoralinis imunitetas. Vakcinacija atliekama didžiausios epidemijos rizikos laikotarpiais. Jis daugiausia skirtas jaunesniems ir vyresniems žmonėms. Naudojant nužudytas vakcinas reikia kasmet pakartotinai skiepytis; jų efektyvumas neviršija 60 - 70%.

Nes Dažnai stebimos antigeninės patogeno variacijos, tuomet atitinkamo viruso antigenų rinkinį imunizacijai galima nustatyti tik prasidėjus ligos protrūkiui.

Bilietas 15.

Hemagliutinacijos reakcija (HRA).

Laboratorijoje naudojamos dvi skirtingo veikimo mechanizmo hemagliutinacijos reakcijos.

Pirmasis RGA yra serologinis. Šios reakcijos metu raudonieji kraujo kūneliai agliutinuojasi, kai sąveikauja su atitinkamais antikūnais (hemagliutininais).

Reakcija plačiai naudojama kraujo grupėms nustatyti.

Antrasis RGA nėra serologinis. Jame raudonųjų kraujo kūnelių sukibimą sukelia ne

antikūnų, bet specialių virusų suformuotų medžiagų. Pavyzdžiui, gripo virusas agliutinuoja vištienos raudonuosius kraujo kūnelius ir jūrų kiaulytės, poliomielito virusas – avies raudonieji kraujo kūneliai. Ši reakcija leidžia spręsti apie konkretaus viruso buvimą tiriamoje medžiagoje.

Reakcija atliekama mėgintuvėliuose arba specialiose plokštelėse su šuliniais.

Medžiaga, ištirta dėl viruso, skiedžiama izotoniniu tirpalu nuo 1:10 iki 1:1280; 0,5 ml kiekvieno skiedimo sumaišoma su tokiu pat kiekiu 1-2% raudonųjų kraujo kūnelių suspensijos. Kontrolinėje 0,5 ml eritrocitų sumaišoma su 0,5 ml izotoninio tirpalo. Mėgintuvėliai 30 minučių įdedami į termostatą, o plokštelės paliekamos kambario temperatūroje 45 minutes.

Rezultatų apskaita. Jei reakcija yra teigiama, mėgintuvėlio arba šulinėlio dugne atsiranda raudonųjų kraujo kūnelių nuosėdos su iškirptais kraštais („skėtis“), dengiančios visą duobutės dugną.

Hemagliutinacijos slopinimo reakcija

Jei rezultatas yra neigiamas, raudonieji kraujo kūneliai sudaro tankias nuosėdas su lygiais kraštais ("mygtukas"). Kontrolėje turėtų būti tos pačios nuosėdos.

Reakcijos intensyvumas išreiškiamas „+“ ženklais. Viruso titras yra maksimalus medžiagos, kurioje vyksta agliutinacija, praskiedimas.

Hemagliutinacijos slopinimo reakcija

Tai serologinė reakcija, kurios metu specifiniai antivirusiniai antikūnai, sąveikaudami su virusu (antigenu), jį neutralizuoja ir atima galimybę agliutinuoti raudonuosius kraujo kūnelius, t.y.

e. slopina hemagliutinacijos reakciją. Ši reakcija leidžia nustatyti virusų tipą ir tipą.

Reakcijos nustatymas. 0,25 ml antivirusinis serumas sumaišyti su tokiu pat kiekiu medžiagos, kurioje yra viruso. Mišinys suplakamas ir dedamas į termostatą 30 minučių, po to įpilama 0,5 ml 1-2 % raudonųjų kraujo kūnelių suspensijos.

Rezultatų apskaita. Jei eksperimentas atliktas teisingai, serumo ir eritrocitų kontrolei turėtų būti suformuotas „mygtukas“ - nėra eritrocitus agliutinuojančio faktoriaus; kontroliuojant antigenus, susidaro „skėtis“ - virusas sukėlė raudonųjų kraujo kūnelių agliutinaciją.

Jei serumas yra homologiškas tiriamam virusui, susidaro „mygtukas“ – serumas virusą neutralizavo.

Netiesioginė hemagliutinacijos reakcija

Netiesioginė (pasyvi) hemagliutinacijos reakcija (RIHA) pagrįsta tuo, kad raudonieji kraujo kūneliai, jei jų paviršiuje adsorbuojamas tirpus antigenas, sąveikaudami su antikūnais prieš adsorbuotą antigeną įgyja gebėjimą agliutinuotis.

Reakcijos nustatymas.

Serumas kaitinamas 30 minučių 56 °C temperatūroje, paeiliui skiedžiamas santykiu 1:10 - 1:1280 ir po 0,25 ml supilamas į mėgintuvėlius arba šulinėlius, kur po 2 lašai raudonųjų kraujo kūnelių su adsorbuotais antigenais. pridėta.

Valdikliai: eritrocitų suspensija su adsorbuotais antigenais su akivaizdžiai imuniniu serumu, eritrocitų suspensija su ant jų adsorbuotais antigenais su normaliu serumu; normalių raudonųjų kraujo kūnelių suspensija su tiriamuoju serumu.

Pirmoje kontrolėje turėtų atsirasti agliutinacija, antroje ir trečioje – ne.

Kontroliniai klausimai.

1. Ką rodo teigiamas rentgeno analizės rezultatas tarp raudonųjų kraujo kūnelių ir tiriamos medžiagos, ar nėra viruso?

2. Ar įvyks raudonųjų kraujo kūnelių agliutinacijos reakcija, jei prie jų bus pridėtas virusas ir jį atitinkantis serumas?

Kaip vadinasi reakcija, atskleidžianti šį reiškinį?

PRAKTINIS DARBAS Nr.12.

Komplemento fiksavimo reakcija.

Komplemento fiksavimo reakcija (FFR) pagrįsta tuo, kad specifinis antigeno-antikūno kompleksas visada adsorbuoja (suriša) su savimi komplementą.

Ši reakcija plačiai naudojama nustatant antigenus ir infekcijų, ypač spirochetų (Wassermanno reakcija), riketsijos ir virusų sukeltų ligų, serodiagnostiką.

RKS yra sudėtinga serologinė reakcija.

Tai apima komplementą ir dvi antigenų-antikūnų sistemas. Iš esmės tai yra dvi serologinės reakcijos.

Dešinioji pagrindinė sistema susideda iš antigeno ir antikūno (vienas žinomas, kitas ne). Prie jo pridedamas tam tikras papildo kiekis. Jei šios sistemos antigenas ir antikūnas sutaps, jie susijungs ir suriš komplimentą. Gautas kompleksas yra smulkiai išsklaidytas ir nesimato.

Šio komplekso susidarymas nustatomas naudojant antrą hemolizinę arba indikatorinę sistemą.

Jį sudaro avių raudonieji kraujo kūneliai (antigenas) ir atitinkamas hemolizinis serumas (antikūnas), t.y. paruoštas imuninis kompleksas. Šioje sistemoje raudonųjų kraujo kūnelių lizė gali vykti tik esant komplementui. Jei komplementas yra susietas su pirmąja sistema, tada antroje sistemoje hemolizės nebus, nes

nėra nemokamo papildymo. Hemolizės nebuvimas (vamzdelio turinys drumstas arba apačioje yra eritrocitų nuosėdų) registruojamas kaip teigiamas RSC rezultatas.

Jei pirmoje sistemoje antigenas neatitinka antikūno, tai imuninis kompleksas nesusiformuos ir komplementas liks laisvas. Likęs laisvas, komplimentas dalyvauja antroje sistemoje, sukelia hemolizę, RSC rezultatas yra neigiamas (vamzdelių turinys skaidrus - „lakuotas kraujas“).

Komponentai, komplemento fiksavimo reakcijos:

Antigenas – dažniausiai lizatas, ekstraktas, haptenas,

rečiau mikroorganizmų suspensija.

2. Antikūnas – paciento serumas.

3. Komplementas – jūrų kiaulytės serumas.

Antigenas – avies raudonieji kraujo kūneliai.

5. Antikūnas – hemolizinas avies eritrocitams.

6. Izotoninis tirpalas.

Dėl to, kad dalyvauja RSK didelis skaičius sudėtingi komponentai,

juos pirmiausia reikia titruoti ir reaguoti tiksliais kiekiais ir vienodais tūriais: 0,5 arba 0,25, rečiau 0,2, 1,25 arba 1,0 ml (didesnis tūris duoda tikslesnį rezultatą). Reakcijos komponentų titravimas atliekamas tokiu pat tūriu kaip ir eksperimentas, trūkstamas sudedamąsias dalis pakeičiant izotoniniu tirpalu.

Susijusi informacija:

Ieškoti svetainėje:

Jis pagrįstas tuo, kad raudonieji kraujo kūneliai, ant kurių anksčiau buvo adsorbuoti antigenai, įgyja galimybę agliutinuotis esant homologiniams serumams (antikūnams).

Šiuo atveju raudonieji kraujo kūneliai veikia kaip specifinių determinantų nešiotojai, kurių agliutinacija atsiranda dėl antigeno + antikūno reakcijos.

Raudonieji kraujo kūneliai, prie kurių paviršiaus tvirtai prisitvirtinę antigenai, vadinami eritrocitų antigeno diagnostikomis arba antigenu įjautrintais eritrocitais.

Kitas RNGA tipas – antikūnai adsorbuojami eritrocitų paviršiuje ir vėliau vyksta jų agliutinacija, esant homologiniam antigenui.

Tokiu atveju tokie eritrocitai vadinami eritrocitų antikūnų diagnostiniais arba eritrocitais, įjautrintais antikūnais.

Remiantis šiais dviem pagrindiniais metodiniais metodais, buvo sukurta ir naudojama daug RNGA modifikacijų. Taigi mažos standartinės latekso dalelės naudojamos kaip nešikliai.

Hemagliutinacijos slopinimo reakcija (HAI)

Tokiu atveju reakcija vadinama latekso agliutinacijos reakcija (LAR) arba naudojama Staphylococcus aureus - krešėjimo reakcija ir kt. Paprastai eritrocitų diagnostika ruošiama biologinės pramonės įmonėse, o pagrindinė RNGA patirtis atliekama diagnostinėse laboratorijose.

Eritrocitų diagnostikos paruošimas apima šiuos veiksmus:

raudonųjų kraujo kūnelių fiksavimas formaldehidu arba glutaro ar akrilo aldehidais.
Tokie apdoroti raudonieji kraujo kūneliai saugomi ilgą laiką. Dažniau tam naudojami eritrocitai iš avių, žmonių, vištų ir kt.;
fiksuotų eritrocitų gydymas tanino tirpalu. Dėl to raudonieji kraujo kūneliai įgyja gebėjimą negrįžtamai adsorbuoti baltymus (virusus ir antikūnus) savo paviršiuje;
Tanizuotų eritrocitų jautrinimas virusais arba antikūnais.

Pažymėtina, kad virusinių infekcijų eritrocitų diagnostikos rengimo metodai yra skirtingi.

RNGA atlikimo procedūra, skirta aptikti ir nustatyti antikūnų titrą, yra tokia:

vienodos antigenu įjautrintų eritrocitų dozės dedamos į 2 kartus didesnius serumo skiedimus;
mišinys paliekamas 2-3 valandoms kambario temperatūroje arba 16-18 valandų 4 °C temperatūroje;
atsižvelgti į rezultatus.
Jei serume yra antikūnų prieš virusą, su kuriuo buvo įjautrinti raudonieji kraujo kūneliai, stebima hemagliutinacija, kuri vertinama kryžminant.

Antikūnų titras serume laikomas didžiausiu serumo praskiedimu, kuris vis dar užtikrina hemagliutinaciją bent dviem kryžminimo būdu.

RNGA yra kartu su visais susijusiais valdikliais. Paprastai reakcija atliekama naudojant mikrometodą.

RNGA leidžia išspręsti šias diagnostikos problemas:

aptikti antikūnus ir nustatyti jų titrą kraujo serume naudojant žinomą eritrocitų antigeno diagnostiką;
aptikti ir identifikuoti nežinomą virusą naudojant žinomą eritrocitų antikūnų diagnostiką.

RNGA privalumai: didelis jautrumas, išdėstymo technikos paprastumas ir reakcijos greitis.

Tačiau svarbu pažymėti, kad didelių sunkumų iškyla rengiant stabilią eritrocitų diagnostiką (didelė priklausomybė nuo naudojamų komponentų grynumo, būtinybė parinkti kiekvieno viruso tipo eritrocitų fiksavimo, tanizacijos ir jautrinimo būdą).

Jei radote klaidą, pasirinkite teksto dalį ir paspauskite Ctrl + Enter.

Susisiekus su

Klasės draugai

Jame naudojami raudonieji kraujo kūneliai arba neutralios sintetinės medžiagos (pavyzdžiui, latekso dalelės), kurių paviršiuje sorbuojami antigenai (bakteriniai, virusai, audiniai) arba antikūnai.

Jų agliutinacija įvyksta, kai pridedami atitinkami serumai arba antigenai. Raudonieji kraujo kūneliai, įjautrinti antigenais, vadinami antigeniniais eritrocitų diagnostikais ir naudojami antikūnams aptikti bei titruoti. Eritrocitai įjautrinti antikūnais. yra vadinami imunoglobulino eritrocitų diagnostika ir naudojami antigenams nustatyti.

Pasyvioji hemagliutinacijos reakcija naudojama diagnozuoti bakterijų sukeltas ligas (vidurių šiltinė ir paratifas, dizenterija, bruceliozė, maras, cholera ir kt.), pirmuonys (maliarija) ir virusai (gripas, adenovirusinės infekcijos, virusinis hepatitas B, tymai, erkinio encefalito, Krymo hemoraginė karštligė ir kt.), taip pat kai kuriems hormonams nustatyti, nustatyti padidėjęs jautrumas kantrus vaistai ir hormonų, tokių kaip penicilinas ir insulinas.

Pasyvi hemagliutinacijos reakcija (RPHA).

Pasyvus hemagliutinacijos testas yra jautrus serologinės diagnostikos metodas, naudojamas tiek ankstyvai, tiek retrospektyviai diagnostikai, taip pat imunopoginei vakcinuotų asmenų būklei nustatyti. Pacientams, sergantiems tuliaremija, antikūnai dažniausiai nustatomi 1-osios ar 2-osios ligos savaitės pabaigoje, po 1-1,5 mėnesio RPHA titrai pasiekia maksimalų lygį (1: 100 000-1: 20 000, rečiau didesnis), po to sumažinimas iki lygio 1:100-1:200 yra saugomi ilgą laiką.

Paskiepytiems žmonėms antikūnai taip pat nuolat aptinkami, tačiau mažesniais titrais, neviršijančiais 1:2000-1:5000 praėjus 1-1,5 mėnesio po vakcinacijos, ir keletą metų išlieka žemame 1:20-1:80.

RPHA stadijos antigenas yra eritrocitų diagnostinė tuliaremija (antigeninis).

Vaistas yra formalinizuoti avių raudonieji kraujo kūneliai, įjautrinti tuliaremijos antigenu, tiekiami skysto ir sauso pavidalo. Skystas preparatas - 10% raudonųjų kraujo kūnelių suspensija 10% koncentracijos formaldehido tirpale. Sausas liofilizuotas preparatas – tai vakuume išdžiovinta 10 % raudonųjų kraujo kūnelių suspensija be konservantų. Prieš naudojimą jis praskiedžiamas pagal nurodymus etiketėje. Reakcijai atlikti polistireno plokštelėse abu vaistai naudojami 2,5% koncentracijos, o atliekant reakciją mikrotūriais - 0,5% koncentracijos.

RPGA nustatymo technika.

Tiriamasis serumas praskiedžiamas druskos tirpalas 1:5 (1:10) ir kaitinama 56 laipsnių C temperatūroje 30 minučių.

Hemagliutinacijos reakcija (HRA) ir

Po to, siekiant pašalinti heterogeninius antikūnus prieš avių eritrocitus, serumai apdorojami 50 % formalinizuotų avių eritrocitų suspensija. Norėdami tai padaryti, į 1 ml serumo įlašinkite raudonųjų kraujo kūnelių po 2 lašus (0,05 ml) ir gerai išmaišykite.

Serumas paliekamas, kol visiškai nusistovi eritrocitai, arba po valandos centrifuguojamas kambario temperatūroje, o po to paruošiamas tyrimui.

Skiedimo skystis 0,5 ml tūriu pilamas į polistirolo plokštelės šulinių eilę.

Preliminariai tiriant serumus, patartina juos išbandyti nustatant reakciją trumpoje plokštelės eilėje (6 šulinėliai). Jei antikūnai aptinkami trumpoje serijoje, serumai pakartotinai tiriami ilgoje praskiedimų serijoje (12 šulinėlių).

Išpylę skiedimo skystį, į kiekvienos eilės (trumposios arba ilgosios) pirmąją duobutę įpilkite 0,5 ml tiriamojo serumo 1:5 praskiedimu. Tada tie patys serumo kiekiai titruojami du kartus praskiedus. Taigi serumo praskiedimai gaunami trumpose serijose nuo 1:10 iki 1:320, o ilgose - nuo 1:10 iki 1:20480. Titravus serumą, į kiekvieną duobutę įlašinamas vienas lašas (0,05 ml) darbinės 2,5 % jautrintų eritrocitų suspensijos.

Lėkštelių turinys kruopščiai sukratomas, kol gaunama vienalytė suspensija. Lėkštės paliekamos kambario temperatūroje ant nejudančio stalo paviršiaus. Preliminarus reakcijos registravimas atliekamas po 2-3 valandų, galutinis titro nustatymas atliekamas po visiško raudonųjų kraujo kūnelių nusėdimo šuliniuose. Reakcijai pateikiamos šios kontrolinės medžiagos: 1) tiriamasis serumas, praskiestas santykiu 1:10 0,5 ml tūryje + 1 lašas 2,5 % nejautrintų eritrocitų suspensijos; 2) skiedimo skystis 0,5 ml tūrio + 1 lašas 2,5 % nejautrintų eritrocitų suspensijos; 3) skiedimo skystis 0,5 ml tūrio + 1 lašas 2,5 % įjautrintų eritrocitų suspensijos.

Visos kontrolės priemonės turi duoti aiškiai neigiamą reakciją.

RPGA apskaita ir vertinimas. Reakcija vertinama pagal šią schemą:

1) ryškiai teigiama reakcija (++++) - raudonieji kraujo kūneliai nukrenta į skylės dugną lygiu sluoksniu „skėčio“ pavidalu, kurio kraštai dažnai tirpsta;

2) teigiama reakcija (+++) – raudonieji kraujo kūneliai dengia ne mažiau kaip 2/3 duobutės dugno;

3) silpnai teigiama reakcija (++) - agliutinatas yra mažas ir yra pačiame šulinio centre;

4) abejotina reakcija (+) - aplink eritrocitų nuosėdas pačiame šulinio centre yra atskiri agliutinato grūdeliai;

5) neigiamas (-) - skylės apačioje raudonieji kraujo kūneliai nusėda „mygtuko“ arba mažo žiedo su lygiais, ryškiai apibrėžtais kraštais pavidalu.

Į serumo titrą atsižvelgiama pagal paskutinį serumo praskiedimą, kuris davė labai aiškią reakciją (bent trys pliusai).

Diagnostiniu titru laikomas praskiedimas 1:100 ar didesnis, tačiau, kaip ir RA atveju, būtina stebėti jo padidėjimą.

Tularemijos RPHA yra gana specifinė ir kai kurias kryžmines reakcijas nustato tik su bruceliozės serumais. Diferencinė diagnostikaįmanoma dėl titrų aukščio RPGA, kurie yra žymiai didesni su homologiniu antigenu.

RPHA nustatymo mikrotūriuose technika.

RPGA galima atlikti mikrotūriais, naudojant Takachi tipo mikrotitratorių (arba apvaliadugnes mikroplokštes su mikropipetėmis), kuri leidžia titruoti medžiagą 25 μl ir 50 μl tūriais. Reakcijos technika ir visų operacijų seka yra tokia pati kaip ir tiriant polistireno plokšteles. Tačiau reikia turėti omenyje, kad mikrometodo jautrumas paprastai yra vieno praskiedimo (t.

2 kartus) mažesnis nei makrometodas.

Norint nustatyti reakciją mikrotitratoriuje, į kiekvieną šulinėlį pipete arba lašintuvu įpilama 50 µl skiedimo skysčio. Tada naudojant titratorius su 50 μl galvute surenkamas tiriamasis serumas, panardinant į jį galvutę.

Įsitikinkite, kad skystis užpildė titratoriaus galvutę. Titratorius su serumu perkeliamas į pirmąjį šulinėlį ir, laikant jį vertikalioje padėtyje, kelis sukamieji judesiai kelionė pirmyn ir atgal. Tada titratorius perkeliamas į kitą šulinėlį ir manipuliavimas kartojamas. Titravimas gali būti atliekamas vienu metu keliomis eilėmis. Titravus visą seriją, titratorius sukamaisiais judesiais nuplaunamas distiliuotu vandeniu (keičiant 2 porcijas), tamponu pašalinamas vanduo nuo galvos ir sudeginamas ant degiklio liepsnos.

Po titravimo į šulinėlius įpilkite 25 μl eritrocitų diagnostikos skysčio.

Diagnostinės RPHA koncentracija mikrotūriuose turi būti 0,5% (t. y. 2,5% raudonųjų kraujo kūnelių suspensija papildomai skiedžiama 5 kartus). Įdėjus raudonųjų kraujo kūnelių, plokšteles reikia šiek tiek pakratyti, kol susidarys vienalytė suspensija. Rezultatai gali būti užfiksuoti per 1-1,5 valandos, o tai yra reikšmingas RPGA privalumas mikrotiteryje.

Be to, šiam metodui reikia nedidelio visų reakcijos ingredientų ir tiriamojo serumo kiekių.

Į reakciją atsižvelgiama pagal šią schemą:

1) „+“ – visiška hemagliutinacija, kai raudonieji kraujo kūneliai nukrenta į šulinio dugną lygiu sluoksniu „skėčio“ pavidalu, užimančiu ne mažiau kaip 2/3 dugno;

2) „+-“ - dalinė hemagliutinacija, kai raudonieji kraujo kūneliai nukrenta į apačią mažo dydžio laisvo žiedo pavidalu;

3) „-“ – hemagliutinacijos nebuvimas, kai raudonieji kraujo kūneliai nukrenta į apačią mažo mygtuko ar žiedo pavidalu lygiu kraštu.

Specifiškumas teigiamas rezultatas, gautas RPHA, gali būti išbandytas naudojant trijų komponentų reakciją – pasyviosios hemagliutinacijos (RPHA) slopinimo reakciją.

RTPGA nustatymo technika.

Ši reakcija naudojama patvirtinti teigiamo RPGA rezultato specifiškumą, kai jis abejotinas arba yra ypač svarbus epidemiologiškai. Reakcijos mechanizmas yra specifinis hemagliutinacijos slopinimas, kai į tiriamąjį serumą pridedama nužudytų tularemijos bakterijų suspensija. Reakcijoje sąveikauja trys komponentai: tiriamasis serumas, specifinis tularemijos antigenas ir antigeninis eritrocitų diagnostinis RTPHA paprastai dedamas į 7-8 šulinėlių eilę.

Patartina kartu su RTPGA įdiegti kartotinį RPGA. Į dvi šulinėlių eiles supilama 0,25 ml skiedimo skysčio, po to į pirmąsias abiejų eilučių duobutes pilamas tiriamasis serumas 0,25 ml tūryje ir atliekamas titravimas.Gaunamos dvi identiškos serumo skiedimų eilės. Į visus antros eilės šulinėlius įpilkite 0,25 ml skiedimo skysčio, o į pirmosios eilės šulinėlius – 0,25 ml tuliaremijos bakterijų suspensijos.

Naudojama Tularemia diagnosticum (1 ml yra 25 mlrd. tularemijos bakterijų), prieš tai praskiesta 50 kartų.

Šioje suspensijoje yra 500 milijonų bakterijų 1 ml arba 125 milijonų 0,25 ml tūryje. Įdėjus antigeną, plokštelė paliekama 1 valandai kambario temperatūroje, po to į visus abiejų eilių šulinėlius įlašinama po vieną lašą (0,05 ml) eritrocitų diagnostikos, plokštelė suplakama ir paliekama ant lygaus stalo paviršiaus.

Apskaita atliekama po 2-3 val.

RTPGA apskaita ir vertinimas. Jei tiriamajame serume yra specifinių tuliaremijos antikūnų, juos neutralizuoja pridėtas antigenas ir pirmoje šulinėlių eilėje neįvyks hemagliutinacija arba, esant aukštam serumo titrui, hemagliutinacija bus stebima mažesniame (2–4) skaičiuje. šulinių nei eilėje su RPHA. Šiuo atveju rezultatų specifiškumas buvo patvirtintas.

Jei abiejose eilutėse pažymėta hemagliutinacija, t.y. Jei RTPGA ir RPGA rezultatai sutampa, tai rodo, kad tiriamajame serume nėra tuliaremijos antikūnų. Šiuo atveju pagrindinis RPGA rezultatas laikomas nespecifiniu.

RTHG pastatymo mikrotūriuose technika. RTPGA, kaip ir RPGA, gali būti atliktas mikrotūriais naudojant Takachi tipo mikrotitrą.

Norėdami tai padaryti, į mikroplokštelių duobutes dviem eilėmis po 7-8 duobutes įpilkite 0,25 μl skiedimo skysčio. Tada, naudojant titratorių, įpilama 0,25 μl tiriamojo serumo ir titruojama abiejose eilutėse. Po to į kiekvieną pirmos eilės šulinėlį įpilama po 25 μl tuliaremijos antigeno (kurio koncentracija 1 ml yra 500 mln. tuliaremijos bakterijų), o į antrąją eilutę – 25 μl skiedimo skysčio.

Lėkštelės paliekamos 1 valandai kambario temperatūroje, po to į visus abiejų eilučių šulinėlius įpilama 25 μl antigeninio zritrocitinio diagnostinio preparato (0,5 % koncentracija).

Rezultatų apskaita ir vertinimas vykdomas panašiai kaip reakcijos makrotūriuose.

Paskelbimo data: 2015-02-03; Skaityta: 3176 | Puslapio autorių teisių pažeidimas

studopedia.org – Studopedia.Org – 2014–2018 (0,003 s)…

Vidalo reakcija. Nuo antrosios ligos savaitės pacientų kraujyje kaupiasi antikūnai prieš infekcijos sukėlėją. Norint juos nustatyti, agliutinacijos reakcijos metu tiriamas paciento kraujo serumas. Užmuštos salmonelių kultūros – diagnostinės medžiagos – naudojamos kaip antigenai.

Widal reakcijai atlikti naudojamas paciento serumas, diagnostinių rinkinių rinkinys ir izotoninis natrio chlorido tirpalas.

Kraujas (2-3 ml) iš piršto pulpos arba kubitinės venos surenkamas į sterilų mėgintuvėlį ir pristatomas į laboratoriją. Laboratorijoje mėgintuvėlis dedamas į termostatą 20-30 minučių, kad susidarytų krešulys, tada Pasteur pipete krešulys apjuosiamas, kad būtų atskirtas nuo mėgintuvėlio sienelės, ir dedamas į šaltą. 30-40 minučių. Atskirtas serumas išsiurbiamas ir naudojamas agliutinacijos reakcijai atlikti su Salmonella typhus ir paratifoidinės karštinės diagnostika. Kraujas gali būti centrifuguojamas, kad būtų gautas serumas.

Kai kada infekcinis procesas- vidurių šiltinės arba paratifos karštligė – organizmas gamina O ir H antikūnus prieš tuos pačius patogeno antigenus.

O-antikūnai atsiranda pirmiausia ir gana greitai išnyksta. H-antikūnai išlieka ilgai. Tas pats nutinka ir skiepijant, todėl teigiama Widal reakcija su O- ir H-antigenais rodo ligos buvimą, o reakcija tik su H-antigenais gali pasireikšti tiek pasveikusiems nuo ligos (anamnestinė reakcija), tiek paskiepytų (vakcinos reakcija). Tuo remiantis Widal reakcija atliekama atskirai su O- ir H-antigenais (diagnostika).

Kadangi vidurių šiltinė ir A ir B paratifas yra kliniškai panašūs, siekiant nustatyti ligos pobūdį, paciento serumas tiriamas kartu su Salmonella typhus ir paratifo A ir B diagnostika.

Widal reakcija yra plačiai naudojama, nes ji yra paprasta ir nereikalauja specialių sąlygų.

Reakcija gali būti vykdoma dviem būdais: lašinama ir tūrinė (žr. 12 skyrių). Praktikoje dažniau naudojamas tūrinis metodas. Atliekant tiesinės agliutinacijos reakciją, eilučių skaičius turi atitikti antigenų (diagnostikos) skaičių. Ligos sukėlėju laikomas mikroorganizmas, iš kurio diagnostiką agliutinavo paciento serumas. Kartais pastebima grupinė agliutinacija, nes vidurių šiltinės ir paratifos sukėlėjai turi bendrų grupės antigenų. Šiuo atveju reakcijos rezultatas serijoje, kurioje agliutinacija pastebima didesniame serumo praskiedime, laikomas teigiamu (36 lentelė).

36 lentelė. Galimas agliutinacijos reakcijos rezultatas

Pastaba. Praktikoje Widal reakcija atliekama keturiomis diagnostinėmis priemonėmis: vidurių šiltine „O“ ir „H“, o paratifos A ir B – diagnostinėmis „ON“.

Jei agliutinacija vyksta tik nedideliais serumo praskiedimais – 1:100, 1:200, tai norėdami atskirti reakciją ligos metu nuo vakcinacijos ar anamnezinės reakcijos, agliutinacijos reakciją kartoja po 5-7 dienų. Pacientui antikūnų titras didėja, tačiau paskiepytam ar pasveikusiam jis nekinta. Taigi, antikūnų titro padidėjimas kraujo serume yra ligos rodiklis.

Reaguojant į vidurių šiltinės patogenų, turinčių Vi antigeną, patekimą į organizmą, paciento kraujyje atsiranda Vi agliutininai. Jie nustatomi nuo 2-os ligos savaitės, tačiau jų titras dažniausiai neviršija 1:10. Vi-antikūnų nustatymas siejamas su vidurių šiltinės sukėlėjų buvimu organizme, todėl šių antikūnų nustatymas turi didelę epidemiologinę reikšmę, nes leidžia nustatyti bakterijų nešiojus.

Vi-hemagliutinacijos reakcija. Tai pati jautriausia reakcija aptikti antikūnus.

Reakcijos principas yra tas, kad žmogaus (I grupės) arba avies eritrocitai po specialaus apdorojimo gali adsorbuoti Vi-antigeną savo paviršiuje ir taip įgyti gebėjimą agliutinuotis su atitinkamais Vi-antikūnais.

Raudonieji kraujo kūneliai, kurių paviršiuje adsorbuoti antigenai, vadinami eritrocitų diagnostikomis.

Norėdami atlikti Vi-hemagliutinacijos reakciją, imkitės:

1) paciento kraujo serumas (1-2 ml); 2) eritrocitų Salmonella Vi-diagnosticum; H) Vi-serumas; 4) O serumas; 5) izotoninis natrio chlorido tirpalas.

Reakcija atliekama agliutinacijos mėgintuvėliuose arba plastikinėse plokštelėse su šuliniais.

Kraujas iš paciento imamas taip pat, kaip ir Vidal reakcijai. Gaunamas serumas. Iš serumo ruošiami dvigubi serijiniai skiedimai, pradedant nuo 1:10 iki 1:160.

Į duobutę įpilama po 0,5 ml kiekvieno skiedimo ir įpilama 0,25 ml eritrocitų diagnostinio tirpalo. Reakcija atliekama 0,75 ml tūrio.

Kontrolės yra: 1) standartinis agliutinuojantis monoreceptorių serumas + diagnostinis - reakcija turi būti teigiama iki serumo titro; 2) diagnosticum izotoniniame natrio chlorido tirpale (kontrolė) – reakcija turi būti neigiama.

Šulinių turinys kruopščiai išmaišomas, 2 valandoms dedamas į termostatą ir paliekamas kambario temperatūroje iki kitos dienos (18-24 val.).

Apskaita prasideda nuo kontrolės. Reakcija vertinama priklausomai nuo diagnostinės medžiagos agliutinacijos laipsnio.

Į rezultatus atsižvelgiama pagal keturių kryžių sistemą:

Raudonieji kraujo kūneliai yra visiškai agliutinuoti - nuosėdos šulinio apačioje „skėčio“ pavidalu;

+++ "skėtis" yra mažesnis, ne visi raudonieji kraujo kūneliai yra agliutinuoti;

++ "skėtis" mažas, skylės apačioje yra neagliutinuotų eritrocitų nuosėdos;

Reakcija yra neigiama; raudonieji kraujo kūneliai nesusiliejo ir mygtuko pavidalu nusėdo šulinio apačioje.

Kontroliniai klausimai

1. Kokiu ligos periodu atliekama Vidalio reakcija?

2. Kokių ingredientų reikia Widal reakcijai atlikti?

3. Kokia diagnostika naudojama Vidal reakcijai atlikti?

4. Kuri serologinė reakcija yra jautriausia diagnozuojant vidurių šiltinės paratifo infekcijas?

5. Kokia diagnostika naudojama atliekant Vi-hemagliutinacijos reakciją?

6. Koks serumas naudojamas Vi-antigeno buvimui tiriamoje kultūroje nustatyti?

7. Kokia yra Vi-fagotipo nustatymo reikšmė?

Paimkite O ir H diagnostiką iš Salmonella typhus, paratifido A ir paratifido B ir paciento serumą iš mokytojo. Pateikite Vidalo reakciją.

Kultūros žiniasklaida

Medicinos pramonė gamina EMS, Ploskireva ir bismuto-sulfito agaro terpę sausų miltelių pavidalu. Jie ruošiami pagal nurodymus etiketėje: pasverti tam tikrą kiekį miltelių, užpilti reikiamu kiekiu vandens, užvirti ir supilti į sterilias Petri lėkštes.

Russell trečiadienį. Į 950 ml distiliuoto vandens įpilama 40 g sausos maistinės terpės ir įpilama 5 g maistinio agaro. Kaitinkite, kol užvirs ir milteliai ištirps. 1 g x ištirpinama 50 ml distiliuoto vandens. valandų gliukozės ir supilkite į paruoštą mišinį. Terpė supilama į sterilius 5-7 ml mėgintuvėlius, sterilizuojama tekančiais garais (2 dienas po 2 minutes) ir nuskleista taip, kad liktų kolonėlė. Taip pat ruošiama Russell terpė su manitoliu ir sacharoze.

Olkenitsky terpė iš sauso agaro. 2,5 g sauso maistinių medžiagų agaro ištirpinama 100 ml distiliuoto vandens. Visi recepte (etiketėje) nurodyti ingredientai dedami į agarą, atšaldytą iki 50°C. Į mėgintuvėlius supilta terpė sterilizuojama tekančiais garais (3 dienas po 20 min.) ir nupjaunama. Paruošta terpė turi būti šviesiai rausvos spalvos.

Hemagliutinacijos slopinimo reakcija

Hemagliutinacijos reakcija

Agliutinacijos reakcija

Agliutinacijos reakcija (RA) – tai mikrobų ar kitų ląstelių sulipimas ir nusodinimas veikiant antikūnams, esant elektrolitui (izotoniniam natrio chlorido tirpalui). Susidariusios nuosėdos vadinamos agliutinuoti.

Reakcijai jums reikia:

1. Antikūnai (agliutininai) – randami paciento serume arba imuniniame serume.

2. Antigenas – gyvų ar žuvusių mikroorganizmų, raudonųjų kraujo kūnelių ar kitų ląstelių suspensija.

3. Izotoninis tirpalas.

Serodiagnostikai plačiai naudojamas agliutinacijos testas vidurių šiltinės, paratifido karštinė (Vidal reakcija), bruceliozė (Wright reakcija) ir kt. Šiuo atveju antikūnas yra paciento serumo, o antigenas yra žinomas mikrobas.

Identifikuojant mikrobus ar kitas ląsteles, jų suspensija naudojama kaip antigenas, o žinomas imuninis serumas – kaip antikūnas. Ši reakcija plačiai naudojama diagnostikoje žarnyno infekcijos, kokliušo ir kt.

Laboratorinėje praktikoje naudojamos dvi hemagliutinacijos reakcijos (HRA), kurios skiriasi savo veikimo mechanizmu.

Pirmoji RGA nurodo serologinius. Šios reakcijos metu raudonieji kraujo kūneliai agliutinuojasi, kai sąveikauja su atitinkamais antikūnais (hemagliutininais). Reakcija plačiai naudojama kraujo grupėms nustatyti.

Antra RGA nėra serologinis. Jame raudonųjų kraujo kūnelių sulipimą sukelia ne antikūnai, o specialios virusų suformuotos medžiagos. Pavyzdžiui, gripo virusas agliutinuoja viščiukų ir jūrų kiaulyčių raudonuosius kraujo kūnelius, o poliomielito virusas – avių raudonuosius kraujo kūnelius. Ši reakcija leidžia spręsti apie konkretaus viruso buvimą tiriamoje medžiagoje.

Tai serologinė reakcija, kurios metu specifiniai antivirusiniai antikūnai, sąveikaudami su virusu (antigenu), jį neutralizuoja ir atima galimybę agliutinuoti raudonuosius kraujo kūnelius, t.y. slopina hemagliutinacijos reakciją. Didelis hemagliutinacijos slopinimo reakcijos (HAI) specifiškumas leidžia ją naudoti nustatant HRA testo metu aptiktų virusų tipą ir net tipą.

Netiesioginė (pasyvi) hemagliutinacijos reakcija (IRHA) pagrįsta tuo, kad raudonieji kraujo kūneliai, jei jų paviršiuje adsorbuojamas tirpus antigenas, sąveikaudami su antikūnais prieš adsorbuotą antigeną įgyja gebėjimą agliutinuotis. RNGA diagrama parodyta fig. RNGA plačiai naudojamas diagnozuojant daugybę infekcijų.

Ryžiai. Pasyviosios hemagliutinacijos reakcijos (RPHA) schema. A - eritrocitų diagnostikos gavimas; B – RNGA: 1-eritrocitas: 2 – tiriamas antigenas; 3 - eritrocitų diagnostika; 4 - antikūnas prieš tiriamą antigeną: 5 - agliutinatas.

Naudodamiesi RNGA, galite nustatyti nežinomą antigeną, jei žinomi antikūnai yra adsorbuoti ant eritrocitų.

Hemagliutinacijos reakcija (HRA)

RGA pagrįsta tuo, kad kai kurios bakterijų ir virusų rūšys gali adsorbuotis ant raudonųjų kraujo kūnelių paviršiaus. skirtingi tipai gyvūnai (ir paukščiai), todėl jie sulimpa ir sudaro agliutinatą (tiesioginis RGA).

Antigeno (bakterijų, virusų) adsorbcija eritrocitų paviršiuje ne visada pasireiškia matomų nuosėdų susidarymu; Be to, RHA yra nespecifinė, nes tos pačios rūšies gyvūnų raudonieji kraujo kūneliai gali adsorbuoti skirtingus antigenus.

Pasyvi (netiesioginė) hemagliutinacijos reakcija (RPHA) yra specifinė. Šiai procedūrai atlikti pirmiausia paruošiama eritrocitų diagnostika (eritrocitai, ant kurių adsorbuojamas antigenas). Šiuo tikslu steriliai paimamas avies (arba gaidžio) kraujas, defibrinuojamas ir kelis kartus plaunamas fosfatiniu buferiniu tirpalu (pH 7,2), centrifuguojant 3-5 kartus. Supernatantas pašalinamas, eritrocitų koncentracija nustatoma iki 2,5% (1:40). Į 2,5% eritrocitų suspensiją įpilkite vienodo tūrio (1 ml arba 0,5 ml) tiriamų mikrobų rūšių bakterijų suspensijos, kurios koncentracija yra 5-10 milijardų ląstelių 1 ml. Raudonieji kraujo kūneliai lengvai adsorbuoja polisacharidų antigenus. Norint adsorbuoti baltymo antigeną, eritrocitai iš anksto apdorojami taninu, praskiedimu santykiu 1:20 000. Eritrocitai kartu su pridėtu antigenu paliekami 2 valandas termostate (37 °C), tada centrifuguojami. vėl 3-4 tūkst.min.min 5 min fosfatiniu buferiniu tirpalu (9.13 pav.).

Gautas eritrocitų diagnostinis tirpalas dedamas į mėgintuvėlius (arba organinio stiklo plokštės duobutes) ir į jį įpilamas standartinis imuninis serumas.

Teigiamais atvejais atsiras RHA – raudonųjų kraujo kūnelių netekimas būdingų dribsnių arba granuliuotų nuosėdų pavidalu, pasiskirstęs visame mėgintuvėlio dugno paviršiuje (hemagliutinatas). Tai reiškia, kad tiriamo mikrobo tipas (antigenas) yra specifinis imuninio serumo antikūnams. Neigiamais atvejais nesuklijuoti raudonieji kraujo kūneliai nusėda apačioje mažo lygaus apskritimo pavidalu.

Siekiant didesnio rezultatų patikimumo, atliekamas RPGA reakcijos vėlavimas(stabdymas) hemagliutinacijos reiškinys(RZGA) arba jo modifikacija - antikūnų neutralizavimo reakcija(RIA).

Ryžiai. 9.13. Pasyvi hemagliutinacijos reakcija (schema): Er - raudonieji kraujo kūneliai: AG - antigenas: AT - antikūnas

RZGA esmė susideda iš to, kad agliutinacijos reakcija atliekama naudojant specifinį diagnostinį serumą ir tiriamąjį antigeną (tiriamo mikrobo tipas naudojamas kaip antigenas). Šis mišinys laikomas 1-2 valandas 37 °C temperatūroje, tada pridedami raudonieji kraujo kūneliai. Jei tiriamasis antigenas yra homologiškas diagnostinio serumo antikūnams, jie sąveikauja tarpusavyje ir pridėję raudonieji kraujo kūneliai neagliutinuojasi – reakcijos rezultatas teigiamas. Jei tiriamasis antigenas nėra homologiškas serumo antikūnams arba jo nėra medžiagoje, tada pridėti eritrocitai adsorbuoja antigeną ir atsiranda RGA – RGA rezultatas neigiamas, tiriamo mikrobo (antigeno) tipas nenustatytas.

PH A nustatymo metodika susideda iš vienodų tūrių paėmimo ir diagnostinio imuninio serumo sumaišymo su įvairūs skiedimai tiriama medžiaga (norimas antigenas), paliekama kontaktui 1-2 val., tada pridedami raudonieji kraujo kūneliai, įjautrinti tam tikru (žinomu) antigenu, specifiniu serumo antikūnams (eritrocitų diagnostika). Kai norimas antigenas reaguoja su serumo antikūnais, jie neutralizuojami, o pridėję raudonieji kraujo kūneliai neagliutinuojasi, RHA neatsiranda – RHA rezultatas teigiamas. Jei tiriamojoje medžiagoje nėra naudojamo serumo antikūnams specifinio antigeno, antikūnų neutralizavimas neįvyks. Todėl, pridedant eritrocitų diagnostiką, atsiranda eritrocitų agliutinacija (hemagliutinacija), o RNR rezultatas yra neigiamas. Antikūnų neutralizavimo reakcija yra labai jautrus būdas aptikti antigeną ne tik gyvų (ar žuvusių) bakterijų suspensijoje, bet ir įvairių organų gruntinio audinio suspensijoje, vietinėse ir įkaitintose išskyrose bei sergančio organizmo išmatose.

Trumpai hemagliutinacijos reakcija. Netiesioginė hemagliutinacijos reakcija (netiesioginė hemagliutinacijos reakcija) arba pasyvi hemagliutinacijos reakcija (rpga). Analizės laikas