Komplementa fiksācijas reakcija(RSC) ir sarežģīta divpakāpju seroloģiska reakcija. Tas izmanto piecas sastāvdaļas, kas veido divas sistēmas: antigēnu, antivielu, komplementu (pirmā sistēma); aitu eritrocīti, sensibilizēti (apstrādāti) ar hemolītisko serumu, kas satur tiem specifiskas antivielas (otrā jeb indikatora hēma sistēma). Šajā gadījumā antivielas mijiedarbība ar antigēnu reakcijas pirmajā stadijā noved pie imūnkompleksa veidošanās, kas adsorbē komplementu, taču to nevar vizuāli noteikt. Otrajā posmā hēma sistēma tiek izmantota kā komplementa fiksācijas indikators uz antigēna-antivielu kompleksa, kas, būdams imūnkomplekss, spēj to arī adsorbēt. Galu galā ir divi iespējamie reakcijas iznākumi. Ja antiviela un antigēns atbilst viens otram un iegūtais komplekss adsorbē komplementu, hēmas sistēmas eritrocītu līze nenotiks. Ja antiviela neatbilst antigēnam un otrādi, komplements, paliekot brīvs, pievienosies hēma sistēmai un izraisīs hemolīzi.

Tāpat kā citus seroloģiskos testus, RSA var izmantot, lai noteiktu specifiskas antivielas no zināma antigēna vai noteiktu antigēnu no zināmām antivielām.

vispārīgās īpašības RSK sastāvdaļas.

1. Pirms reakcijas veikšanas testējamais SERUMS tiek karsēts ūdens vannā 30 minūtes, lai inaktivētu savu komplementu, un tiek atšķaidīts, sākot no 1:5.

2. ANTIGĒNS var būt baktēriju kultūras, to lizāti, vīrusi un vīrusus saturoši materiāli, patoloģiski izmainītu orgānu ekstrakti un audu lipīdi.

3. KOMPLEMENTS – eksperimenta dienā iegūts jūrascūciņas serums. Pašlaik tiek izmantots rūpnieciskais sausais papildinājums.

4. HEMOLYTISKĀ SISTĒMA sastāv no hemolītiskā seruma un 3% aitas sarkano asins šūnu suspensijas, kas sajauktas vienādos tilpumos. Lai sensibilizētu eritrocītus ar hemolizīniem, maisījumu 30 minūtes tur termostatā 37°C temperatūrā.

RSC galvenā eksperimenta iestatīšana. 1 mēģenei pievieno SERUMU, ANTIGĒNU UN KOMPLEMENTU, otrai mēģenei pievieno serumu, komplementu un antigēna vietā izotonisko nātrija hlorīda šķīdumu (SERUM CONTROL), trešajā mēģenē pievieno antigēnu, komplementu un to pašu nātrija hlorīda šķīdumu ( ANTIGĒNU KONTROLE). Mēģenes ievieto termostatā 37°C temperatūrā uz 1 stundu. Tajā pašā laikā tiek sagatavota hemolītiskā sistēma, kas tiek pievienota visām trim caurulēm pēc statīva noņemšanas no termostata. Sajaucot dārgakmeņu sistēmu ar trīs mēģeņu sastāvdaļām, tās atkal ievieto termostatā uz 1 stundu, un pēc šī laika tiek ņemti vērā RSK rezultāti.

Ņemot vērā RSC, reakcijas intensitāti norāda ar plusiem: “++++” – asi pozitīva reakcija ar pilnīgu hemolīzes aizkavēšanos šķidrums mēģenē ir bezkrāsains, visas sarkanās asins šūnas ir nosēdušās apakšā; “+++”, “++” - pozitīva reakcija, ko raksturo šķidruma krāsas palielināšanās hemolīzes dēļ un sarkano asins šūnu skaita samazināšanās nogulsnēs; “+” – vāji pozitīva reakcija, šķidrums ir intensīvi krāsots, tūbiņas apakšā ir neliels sarkano asinsķermenīšu daudzums. Negatīvā reakcija apzīmē ar zīmi “–”, šajā gadījumā tiek novērota pilnīga hemolīze, šķidrumam mēģenē ir intensīvi rozā krāsa (“lakas asinis”).

RSC ir ļoti sarežģīta, bet ļoti jutīga specifiska reakcija. Plaši izmanto sifilisa diagnostikā, hroniska forma gonoreja, garais klepus, aktinomikoze, visas riketsiozes un vīrusu infekcijas.

Saistīts imūnsorbcijas tests.

Šo metodi 70. gadu sākumā neatkarīgi viena no otras izstrādāja trīs zinātnieku grupas. Metode atgādina RIA, bet tās pamatā ir Ag vai Ab marķēšana, kas nonāk reakcijā ar fermentu. Etiķetes kustību ar substrātu parasti pavada barotnes krāsas maiņa. Šobrīd ir radītas daudzas šīs metodes modifikācijas, bet visplašāk tiek izmantots heterogēnās cietās fāzes ELISA (solid-phase). Tur ir:

1) TIEŠĀ CIETĀ FĀZES ELISA. Šajā gadījumā:

1. serumu ar Ab inkubē ar Ag, kas fiksēts uz cieta substrāta (visbiežāk tā ir plastmasas mikroplāksne).

2. Abs, kas nav saistījuši Ag, tiek noņemti, atkārtoti mazgājot.

3. Abs, kas ir saistījuši Ag, pievieno ar enzīmu iezīmētu serumu.

4. Nosakiet ar At saistīto marķieru enzīmu skaitu.

2) KONKURĒTSPĒJAS CIETU FĀZES ELISA.

1. Pievienojiet sūkalas. Ja tas satur specifiskus Abs, tad tie saistās ar Ags, kas fiksēts uz cieta substrāta. Ja nav īpašu Abs, tad Ag šķiet nesaistīts.

2. Pievienojot fiksētam Ag specifiskas antivielas, pirmajā gadījumā tām nebūs nekā, ar ko mijiedarboties (lielākā daļa Ag jau ir saistīti) Þ marķiera saturs ir zems. Otrajā gadījumā specifiskie Abs saistās ar Ag un mazgāšanas laikā tie netiks nomazgāti Þ augsts marķiera saturs.

Līdzīgi kā m.b. ANTIVIELAS ir fiksētas, un dažādi uzņēmumi ražo tabletes ar jau fiksētām antivielām.

Salīdzinot ar klasiskās metodes nosakot Ag, šī metode ļauj tieši reģistrēt to mijiedarbību ar Ab, nevis sekundārās izpausmes (aglutināciju, izgulsnēšanos vai hemolīzi). Metode ir ļoti JŪTĪGA (pietiek ar koncentrāciju 1ng/ml).

Nosakiet: hlamīdijas, klostridijas, HIV utt.

8. Fagocitozes reakcija.

Fagocitozi veic mikrofāgi un makrofāgi. Fagocitozes stadijas: pieeja, adhēzija, iegremdēšana, gremošana.

Fagocītu šūnu funkcionālās aktivitātes novērtējums.

Daudzums Granulocītu un monocītu fagocītisko aktivitāti novērtē pilnās asinīs, leikocītu suspensijā vai bagātinātās fagocītu šūnu frakcijās. Kā standarta fagocitozes objekti tiek izmantotas monodispersas lateksa daļiņas ar diametru 1,0-2,0 mikroni, termiski nogalinātu baktēriju vai raugam līdzīgu sēnīšu suspensija.

Fagocītus sajauc ar fagocitētu materiālu attiecībā 1:10 vai 1:100 un inkubē 37°C 30 minūtes, nepārtraukti maisot. Pēc tam mēģenes centrifugē un nogulsnes atkārtoti suspendē asins seruma pilē, lai sagatavotu uztriepi. Uztriepēs, kas fiksētas ar May-Chrunwald krāsojumu un krāsotas pēc Romanovska-Giemsa, tiek aprēķināts fagocītu šūnu procentuālais daudzums (FP - fagocītiskais indikators) un absorbēto daļiņu skaits uz 1 šūnu (PF - fagocītu skaits).

U vesels cilvēks FP=40-80%, FP=1-5.

9. Diagnostika.

Diagnosticums ir noteiktu mikrobu šūnu suspensija, kas nogalināta ar karstumu vai formalīnu ar zināmu šūnu saturu tilpuma vienībā. Kā antigēnu var izmantot arī dzīvo baktēriju suspensijas. Reakcijas parādība provizoriski parādās pēc divām stundām (pie 37 0 C), gala rezultāts tiek ņemts vērā istabas temperatūrā pēc 18-20 stundām. Diagnozei pozitīva reakcija interesē tikai noteiktu seruma titru, kas kalpo kā diagnostika. Tādējādi brucelozes diagnostikas titrs ir 1:200, bet tula-remia - 1:100. Lai noteiktu antivielas, varat veikt ekspress aglutinācijas testus (uzskaites laiks ir vairākas minūtes). Piemēram: 1. Asins pilienu reakcija tularēmijas gadījumā. Pilieni destilēta ūdens (hemolīzei) un pilienu tularēmijas diagnostikā uzpilina pacienta pilno asiņu pilienam uz speciāla stikla. Reakcija notiek 1-2 minūšu laikā, ir skaidri redzami aglutināti bālganu gabaliņu veidā. 2. Brucelozes gadījumā uz stikla tiek veikta izteikta Hedelsona aglutinācijas reakcija.

Šīs reakcijas neļauj noteikt antivielu daudzumu serumā.b) identificēt infekcijas slimību patogēnu tīrkultūru. Šim nolūkam tiek izmantoti imūndiagnostikas testi.

aglutinējošie serumi, ko ražo vakcīnu un serumu institūti, imunizējot dzīvniekus ar veselām mikrobu šūnām. Lai nodrošinātu seruma autentiskumu, labāk izmantot adsorbētos, lai tie saturētu tikai noteiktai mikroorganismu sugai vai tipam atbilstošas ​​antivielas.

Imūnserumu iegūšanas principi.

Imūnserums (antiserums) ir asins serums, kas satur antivielas pret noteiktu antigēnu. Vairumā gadījumu imūnos (diagnostiskos) serumus pret mikrobu, audu un citiem antigēniem iegūst eksperimentāli, imunizējot dzīvniekus ar attiecīgajiem antigēniem.

Viena no galvenajām prasībām pretserumiem ir to augstā specifika un pietiekams antivielu saturs. Pamatojoties uz specifiku, antiserumus izšķir polivalentos (polispecifiskos) un monovalentos (monospecifiskos) antiserumus. Polivalentie serumi satur antivielas pret daudziem antigēniem, monospecifiski – pret vienu konkrētu antigēnu. Jūs varat iegūt monospecifiskus serumus:

1) ļoti attīrītu antigēnu izmantošana dzīvnieku imunizācijai,

2) dabisko serumu attīrīšana no nevēlamas specifiskuma antivielām.

Šim lietojumam:

1) imūnafinitātes metode, kuras pamatā ir noteiktas specifiskuma antivielu saistīšana ar atbilstošiem antigēniem, kas imobilizēti uz cietās fāzes nesēja, kam seko iegūto antigēna-AB kompleksu atdalīšana un antivielu izolēšana;

2) Castellani adsorbcijas metode. Šim nolūkam mikroorganismi, kas ietver visus grupas antigēni, tādējādi adsorbējot homologos anti-

ķermeņi. Šādi adsorbēti monospecifiski antiserumi satur antivielas pret dažādiem antigēna molekulas determinantiem, kas ir neviendabīgi pēc klases (apakšklases)

Komplementa saistīšanās reakcija (CFR) ir tāda, ka tad, kad antigēni un antivielas atbilst viens otram, tie veido imūnkompleksu, kuram komplements (C) tiek piesaistīts caur antivielu Fc fragmentu, t.i., komplementu saista antigēna-antivielu komplekss. Ja antigēna-antivielu komplekss neveidojas, komplements paliek brīvs.

AG un AT specifisko mijiedarbību pavada komplementa adsorbcija (saistīšanās). Tā kā komplementa fiksācijas process nav vizuāli redzams, J. Bordet un O. Zhangu ierosināja izmantot hemolītisko sistēmu (aitas sarkanās asins šūnas + hemolītiskais serums) kā indikatoru, kas parāda, vai komplements ir fiksēts ar AG-AT kompleksu. Ja AG un AT atbilst viens otram, t.i., ir izveidojies imūnkomplekss, tad ar šo kompleksu saistās komplements un hemolīze nenotiek. Ja AT neatbilst AG, tad komplekss neveidojas un komplements, paliekot brīvs, savienojas ar otro sistēmu un izraisa hemolīzi.

Reakcijas gaita

Reakcija notiek divās fāzēs, iesaistot divas sistēmas; bakteriālas un hemolītiskas. Pirmā reakcija (specifiskā) ietver antigēnu 4-+ antivielu + komplementu. Pozitīvu reakcijas rezultātu, kas rodas, antivielām sakrītot ar antigēnu, raksturo specifiska baktēriju antigēna-antivielu kompleksa veidošanās ar adsorbētu jeb, kā saka, “saistītu” komplementu. Paliekot neredzams, komplekss nekādu neizraisa ārējās izmaiņas vide, kurā tā veidojusies. Negatīvs RSC rezultāts rodas, ja nav specifiskas afinitātes starp antigēnu un seruma antivielu, un to raksturo brīvā aktīvā komplementa saglabāšanās. Pirmo RSC fāzi var veikt termostatā 37°C (1-2 stundas) vai ledusskapī 3-4°C (18-20 stundas). Ilgstoši veidojoties antigēna-antivielu imūnkompleksam aukstumā, notiek pilnīgāka komplementa saistīšanās, un rezultātā palielinās reakcijas jutība. Veicot salīdzinošos eksperimentus, padomju imunologs akadēmiķis. V.I.Ioffe un viņa studenti parādīja, ka ilgstošas ​​komplementa fiksācijas apstākļos aukstumā ir iespējams uztvert 100-500 reižu mazāku antigēna daudzumu un iegūt pozitīvus rezultātus ar lielākiem imūnseruma atšķaidījumiem nekā komplementa saistīšanas eksperimentā pie temperatūras 37 ° C iekšā 1-2 stundas. Otrā reakcijas fāze (orientējoši) notiek starp hemolītiskās sistēmas reaģentiem (3% eritrocītu suspensijas un hemolītiskā seruma maisījums vienādos tilpumos) 37 ° C temperatūrā. tikai komplementa klātbūtnē, kas paliek brīvs no reakcijas pirmās fāzes (negatīva reakcija). Ja nav brīva aktīvā komplementa, sarkano asins šūnu hemolīze specifisku hemolizīnu ietekmē nenotiek (reakcija ir pozitīva).

Sastāvdaļas

Komplementa saistīšanās reakcija (CFR) ir sarežģīta seroloģiska reakcija. Lai to veiktu, ir nepieciešamas 5 sastāvdaļas, proti: AG, AT un komplements (pirmā sistēma), aitas eritrocīti un hemolītiskais serums (otrā sistēma).

CSC antigēns var būt dažādu nogalinātu mikroorganismu kultūras, to lizāti, baktēriju sastāvdaļas, patoloģiski izmainīti un normāli orgāni, audu lipīdi, vīrusi un vīrusus saturoši materiāli.

Svaigas vai sausas sūkalas tiek izmantotas kā papildinājums jūrascūciņa.

Reakcijas mehānisms

RSK tiek veikts divās fāzēs: 1. fāze - maisījuma, kas satur trīs komponentus antigēns + antiviela + komplements, inkubācija; 2. fāze (indikators) - brīvā komplementa noteikšana maisījumā, pievienojot tam hemolītisko sistēmu, kas sastāv no aitu eritrocītiem un hemolītiskā seruma, kas satur antivielas pret tiem. Reakcijas 1.fāzē, veidojoties antigēna-antivielu kompleksam, saistās komplements, un tad 2.fāzē nenotiks ar antivielām sensibilizēto eritrocītu hemolīze; reakcija ir pozitīva. Ja antigēns un antiviela nesakrīt (pārbaudāmajā paraugā nav antigēna vai antivielas), komplements paliek brīvs un 2.fāzē pievienosies eritrocītu - antieritrocītu antivielu kompleksam, izraisot hemolīzi; reakcija ir negatīva.

Pieteikums

Komplementa fiksācijas reakciju var izmantot, lai:
1) specifisku antivielu identificēšana nezināmā serumā, pamatojoties uz to mijiedarbību ar zināma rakstura antigēnu;
2) antigēna īpašību izpēte reakcijā ar zināmu specifisku serumu. Sastāvdaļu sagatavošana RSC iestudēšanai.

1. Pētījumiem iegūto asins serumu reakcijas priekšvakarā 30 minūtes karsē ūdens vannā 56°C, lai inaktivētu savu komplementu. Inaktivētu serumu var uzglabāt 3-4°C temperatūrā 5-6 dienas. Eksperimenta dienā serumu atšķaida ar izotoniskā nātrija hlorīda šķīdumu attiecībā 1:5 (0,1 ml testa seruma + 0,4 ml izotoniskā nātrija hlorīda šķīduma).

2. Antigēns CSC ražošanai var būt dažādu mikrobu kultūras, baktēriju proteīni un ekstrakti, kas iegūti no mikrobu kultūrām, patoloģiski izmainītiem un normāliem orgāniem un audiem. Antigēna sagatavošanas iezīmes nosaka raksturs infekcijas process un tā patogēna īpašības.

3. Komplements ir serumu maisījums, kas iegūts no 3-5 veselām jūrascūciņām, vai sausais komplements ampulās.

Tieši pirms lietošanas jūrascūciņu serumu atšķaida ar izotonisku nātrija hlorīda šķīdumu attiecībā 1:10, lai iegūtu izejas šķīdumu.

4. Pirms eksperimenta veikšanas hemolītisko serumu inaktivē, karsējot 56 °C temperatūrā 30 minūtes. Lai veiktu galveno RSC eksperimentu, kā arī titrētu komplementu un antigēnu, hemolītisko serumu izmanto trīskāršā titrā. Piemēram, ja hemolītiskā seruma titrs ir 1:1800, reakcijā izmanto seruma atšķaidījumu 1:600.

5. Eritrocītus iegūst no defibrinētām aitas asinīm. Lai noņemtu fibrīna plēves, asinis filtrē caur trīsslāņu marles filtru. Iegūto filtrātu centrifugē, serumu atsūc un notecina, un eritrocītus mazgā, 3-4 reizes centrifugējot ar izotonisku nātrija hlorīda šķīdumu. Kad sarkanās asins šūnas tiek mazgātas pēdējo reizi, šķidruma supernatantam jābūt pilnīgi caurspīdīgam. 3% suspensiju pagatavo no mazgātām sarkanajām asins šūnām izotoniskā nātrija hlorīda šķīdumā. Sagatavojot RSC iesaistītās sastāvdaļas iepriekšminētajā veidā, pārejiet pie hemolītiskā seruma, komplementa un antigēna titrēšanas.



Hemolīzes reakcija.

Hemolīzes reakcija (HR) - Tā ir sarkano asins šūnu iznīcināšana, iedarbojoties antivielām, piedaloties komplementam.

RG sastāvdaļas.

1. Antigēns- 3% sarkano asins šūnu suspensija izotoniskā nātrija hlorīda šķīdumā;

2. Antiviela - hemolītiskais serums- satur serumu antivielas pret sarkanajām asins šūnām (hemolizīni); serumu iegūst, imunizējot trušus ar aitas eritrocītiem;

3. Papildināt– asins proteīnu sistēma, kas adsorbējas uz antigēna-antivielu kompleksa un veido membrānas uzbrukuma kompleksu, kas iznīcina antigēnu, t.i. iznīcina sarkanās asins šūnas vai, citiem vārdiem sakot, izraisa sarkano asins šūnu līzi ( hemolīze). Svaigi pagatavots Jūrascūciņu asins serums.

Ja mēģenē noteiktos daudzumos ievieto sarkanās asins šūnas, hemolītisko serumu un komplementu, tad dažu minūšu laikā notiks sarkano asinsķermenīšu iznīcināšana (hemolīze), kā rezultātā maisījums no tumši sarkana kļūs rozā. ("lakas asinis").

Hemolīzes reakcija tiek izmantota kā indikators, veicot komplementa fiksācijas reakciju.

Komplementa fiksācijas reakcija (CFR) ir sarežģīta seroloģiska reakcija, kas ietver 2 antigēnu-antivielu un komplementa sistēmas. 1. sistēma - specifisks, 2.- hemolītisks sistēma.

Šo reakciju izstrādāja J. Bordet un O. Zhangou, kuri konstatēja, ka antigēna-antivielu kompleksa veidošanās laikā komplements saistās ar šo kompleksu. Redzams efekts kurā nav redzams, tādēļ, lai noteiktu komplementa saistīšanos (un līdz ar to, lai noteiktu antigēna-antivielu kompleksa veidošanos, kad tie atbilst viens otram), t.i. kā indikators Tiek izmantota otrā metode - hemolītiskā sistēma.

RSC biežāk izmanto serodiagnostikai (antivielu noteikšanai pret patogēnu pacienta asins serumā ) gonoreja, sifiliss, garais klepus, tīfs un citas riketsiozes un daudzas vīrusu slimības. RSC izmanto arī seridentifikācijai.

RSK sastāvdaļas.

1. Antigēns– mikrobu ekstrakti, haptēni, retāk – mikrobu suspensija, t.i. antigēns var būt korpuskulārs (nešķīstošs) vai molekulārs (šķīstošs).

2 . Antiviela– slima cilvēka asins serums (serodiagnostikai) vai imūndiagnostikas serums, kas satur zināmas antivielas (seroidentifikācijai).

3. Aitu sarkanās asins šūnas – antigēni hemolītiskā reakcija.

4. Hemolītiskais serums- satur serumu antivielas uz aitu eritrocītiem. Serums gūt imunizējot trušu ar aitas eritrocītiem.

5. Papildināt– svaigi pagatavots jūrascūciņu asins serums (šķidrs vai liofilizēts).

6. Elektrolīts– izotonisks nātrija hlorīda šķīdums.

Iestudējis RSK.

Pirms eksperimenta tiek titrēts antigēns, pacienta serums, hemolītiskais serums un komplements (tiek noteikts to titrs). Pacienta serumu 30 minūtes karsē 56°C temperatūrā.

RSK tiek veikta gadā 2 fāzes.

I fāze - specifisks: vienā mēģenē sagatavo specifisku sistēmu - vienādos daudzumos sajauc zināmu antigēnu, pacienta serumu un komplementu, citā mēģenē sagatavo hemolītisko sistēmu - aitas eritrocītu un hemolītiskā seruma maisījumu, mēģenes ievieto a. termostats 37°C temperatūrā 30 minūtes. Tajā pašā laikā tiek sagatavoti kontroles paraugi antigēnam, komplementam un hemosistēmai, kontroles paraugi ar zināma slima cilvēka serumu (pozitīvs serums) un zināma vesela cilvēka serums (negatīvs serums), kā arī ievietoti termostatā uz 30 minūtēm.

II fāze - indikators: sākuma maisījumam un visām kontroles mēģenēm pievieno vienādus hemolītiskās sistēmas daudzumus, un reakcijas rezultātus ņem vērā pēc turēšanas termostatā 30 minūtes.

DSC rezultātu uzskaite veikta ar nevainojamiem rezultātiem vadības ierīcēs .

Pozitīva reakcija(cilvēks ir slims un viņa serumā ir atbilstošās antivielas pret slimības izraisītāju - antigēnu): I fāzē specifiskā sistēmā veidojas antigēna-antivielu kompleksi, ar kuriem saistās komplements; pēc hemolītiskās sistēmas pievienošanas II fāzē hemolīze netiek novērota, jo komplements ir saistīts ar 1. specifisko sistēmu. Redzams efekts- izglītība eritrocītu nogulsnes.

Negatīvā reakcija(cilvēks ir vesels un viņa serumā nav antivielu pret izraisītāju): neveidojas antigēna-antivielu kompleksi un komplements I fāzē paliek brīvs, pēc hemolītiskās sistēmas pievienošanas II fāzē komplements saistās ar antigēnu-antivielu. kompleksi, kas šeit noteikti ir (tie ir eritrocītu-antivielu kompleksi) antieritrocītu antivielas) un izraisa sarkano asins šūnu hemolīzi. Redzams efekts- sarkano asins šūnu hemolīze, "lakas asinis"

Tos izmanto arī infekcijas slimību diagnostikā. toksīna neitralizācijas reakcija (RN) ar antitoksisku serumu, imūnfluorescences reakcija (RIF), radioimūntests (RIA), ar enzīmu saistīts imūnsorbcijas tests (ELISA).

IN Reakcija balstās uz divām parādībām - bakteriolīzi un hemolīzi. Papildinājums ir iesaistīts to izpausmē. Tāpēc RSC tiek izmantotas divas komponentu sistēmas: 1) nodrošina bakteriolīzes fenomenu un tiek izmantota diagnostikas nolūkos; 2) hemolītiskais, indikators, palīglīdzeklis; ļauj noteikt, vai komplements ir vai nav saistīts pirmajā sistēmā (sk. krāsu shēmu, I att.). Iepriekš kā antigēns tika izmantota baktēriju suspensija, tāpēc pirmo sistēmu sauca par bakteriolītisko (pozitīvos gadījumos notika baktēriju līze).

RSC izveide tiek veikta divos posmos. Pirmajā posmā tiek sagatavota bakteriolītiskā sistēma: mēģenēs sajauc 0,5 ml testa seruma ar antigēnu, pievieno komplementu stingri noteiktā devā (titrā). Antigēna-seruma-komplementa maisījumu (bakteriolītiskā sistēma) 20...40 minūtes tur ūdens vannā (vai termostatā) 37...38 "C. Sastāvdaļu mijiedarbības rezultāts mēģenē ir neredzams, šķidrums paliek caurspīdīgs un bezkrāsains Lai noteiktu, kontakts Ja komplements ir bakteriolītiskajā sistēmā, tiek veikta otrā reakcijas stadija: mēģenēs tiek pievienoti hemolītiskās sistēmas komponenti - mazgāti aitas eritrocīti un inaktivēts hemolītiskais serums. , kā parādīts diagrammā.Visas bakteriolītiskās sistēmas sastāvdaļas sakrata, lai sajauktos mēģenē, ievieto ūdens vannā 37... 38 "C uz 20...40 min. Tad pievieno hemoloģiskās sistēmas komponentus, visu atkal un atkal liek ūdens vannā uz 10...15 minūtēm.

Iepriekšēja rezultāta uzskaite. Ja serumu iegūst no slima dzīvnieka, tad tajā ir antivielas, kas savienojas ar konkrētu antigēnu. Komplements saistās ar šo kompleksu (antigēns - antiviela) - hemolīze nenotiek, rezultāts ir pozitīvs.

Vesela dzīvnieka serumā antivielu nav: antigēna-antivielu komplekss neveidojas, komplements nav saistīts bakterioloģiskajā sistēmā. Pievienojot eritrocītus un hemolizīnu (tas ir starp antigēnu un antivielu), komplements reaģē ar šo kompleksu – notiek hemolīze, rezultāts ir negatīvs (sk. krāsu II att.).

Galīgā rezultāta uzskaite. Mēģenes atstāj istabas temperatūrā 15...20 stundas.Ja serums bakteriolītiskajā sistēmā bija no slima dzīvnieka, mēģenē veidojas specifisks antigēna-antivielu komplekss, kas adsorbē (saista) visu pievienoto. papildināt. Līdz ar to otrajā, hemolītiskajā sistēmā, hemolīze nenotiks, sarkanās asins šūnas nogulsnējas mēģenes apakšā, un supernatants būs dzidrs. RSC rezultāts ir pozitīvs.

Ja testa serums nesatur specifiskas antivielas pret izmantoto antigēnu (gadījumos, ja serums ir no vesela dzīvnieka), antigēna-antivielu komplekss neveidojas bakteriolītiskajā sistēmā un līdz ar to komplements šajā sistēmā netiek adsorbēts, bet paliek brīvs. Pievienojot hemolītiskās sistēmas komponentus (reakcijas otrajā fāzē), komplements mijiedarbojas ar otro kompleksu (hemolizīns - sarkanās asins šūnas), notiek sarkano asins šūnu hemolīze - neveidojas nogulsnes, šķidrums mēģenē laka-sarkanā krāsā. RSC rezultāts ir negatīvs.

RSK. izmanto: 1) specifisku antivielu noteikšanai slima dzīvnieka serumā (brucelozes, peripneimonijas, ienāšu, leptospirozes, tripanosomozes u.c. diagnostikai); 2) noteikt specifisku antigēnu (baktēriju vai vīrusu) testa materiālā specifiska imūnseruma klātbūtnē.

RSC veikšanai nepieciešami: pētniecībai saņemtie seruma paraugi; divi serumi, par kuriem zināms, ka tie ir pozitīvi (standarta, kas nodrošina pozitīvu rezultātu), un divi normāli serumi. Visi serumi, kas atšķaidīti attiecībā 1:10, tiek inaktivēti 56...58 °C 30 minūtes; antigēns, kas atšķaidīts atbilstoši titram; komplements, kas atšķaidīts saskaņā ar noteikto titru titrēšanas laikā bakteriolītiskā sistēmā; hemolizīns darba titrā; aitas sarkanās asins šūnas (I: 40); sāls šķīdums, graduētas pipetes, mēģenes, statīvi, ūdens vanna 37...38 °C.

Pirms RSC veikšanas aitas asinis tiek defibrinētas un sarkanās asins šūnas tiek mazgātas sāls šķīdums centrifugējot, līdz supernatants ir pilnīgi caurspīdīgs, kas tiek noņemts ar sūkšanu, un nogulsnētās sarkanās asins šūnas tiek atšķaidītas fizioloģiskā šķīdumā 1:40 (2,5%). Antigēnu atšķaida saskaņā ar titru, ko uz etiķetes norāda biofabrika. Hemolizīns un komplements tiek titrēti pirms RSC ievietošanas.

RSC antigēnu sagatavo biofabrikās. Parasti tie ir iznīcinātu mikrobu suspensiju (vai vīrusu saturošu audu) ekstrakti. Antigēniem nevajadzētu būt hemolizējošai iedarbībai, kas tiek kontrolēta reakcijas procesā (mēģenē ielej 1...2 antigēna devas un 0,5 ml eritrocītu suspensijas: nedrīkst būt hemolīzes). Uz ampulas ar antigēnu biofabrika norāda, ka tā ir paredzēta RSC (sapnaya, bruceloze vai cita). Uz iepakojuma kastītes ir norādīts partijas numurs, izgatavošanas datums, derīguma termiņš, antigēna aktivitāte, tas ir, kādā atšķaidījumā tas jālieto, veicot RSC (1:100, 1:150 utt.). Dažās slimībās citi materiāli kalpo kā antigēni; piemēram, lielu peripneimonijas diagnosticēšanai liellopi CSC antigēns ir eksperimentāli subkutāni vai intrapleurāli inficēta teļa limfa. Antigēnu ilgstošas ​​uzglabāšanas laikā to titru vēlreiz pārbauda laboratorijā, izmantojot īpašu titrēšanas shēmu.

Pētījumam saņemtos testa serumus atšķaida ar fizioloģisko šķīdumu 1:5 vai 1:10, inaktivē, karsējot ūdens vannā, lai 30 minūtes 56...58 °C temperatūrā iznīcinātu pašu komplementu (ēzeļu, mūļu, zirgēzeļu serumi - 61 °C temperatūrā).

Hemolizīnu gatavo biofabrikās, hiperimunizējot trušus ar mazgātām aitas sarkanajām asins šūnām. Lai to izdarītu, trušiem intravenozi injicē 40...50% sarkano asins šūnu suspensiju 4...5 reizes ar 2...3 dienu intervālu. Nedēļu pēc pēdējās injekcijas trušiem paņem asinis, sterili aspirē serumu, to inaktivē, konservē ar glicerīnu 1:1 vai 0,5% fenolu, titrē un ielej ampulās. Laboratorijās pirms inscenēšanas RSC vēlreiz titrē.

Hemolizīna titrēšanas shēma. Ir nepieciešams sagatavot: i) komplementa atšķaidījumu 1:20; 2) hemolizīns 1:100 (0,2 ml hemolizīna + 9,8 ml fizioloģiskā šķīduma); 3) aitu eritrocītu suspensija 1:40; 4) fizioloģiskais NaCl šķīdums.

Lai iestatītu titrēšanas reakciju, divas mēģeņu rindas ievieto statīvā – vienu palīgierīci tikai hemolizīna atšķaidījumu pagatavošanai, otru – pašai titrēšanai. Katras rindas pirmajai mēģenei pievieno sākotnējo hemolizīna atšķaidījumu 1:100 un pēc tam veic sērijveida atšķaidījumus. Visas mēģenes sakrata un ievieto ūdens vannā 37...38°C uz 10...15 minūtēm. Rezultāta uzskaite: šajā piemērā mazākais daudzums (vai tā lielākais atšķaidījums), kas nodrošināja pilnīgu hemolīzi, ir 1:2000, t.i., tas ir tā faktiskais titrs. Darba titrs ir 2 reizes koncentrētāks - 1:1000.

0,5 ml (norādīts ar bultiņām) katra atšķaidījuma no pirmās rindas mēģenēm pārnes uz atsevišķām otrās rindas mēģenēm. Visām otrās rindas mēģenēm pievienojiet 0,5 ml komplementa (1:20), 0,5 ml aitas sarkano asins šūnu (2,5% suspensija vai 1:40) un 1 ml fizioloģiskā šķīduma, lai šķidruma tilpums katra mēģene bija 2,5 ml.

Piezīme. Pamatojoties uz to, ka RSC galīgajā sastāvā būs 5 komponenti pa 0,5 ml katra, kas sasniegs 2,5 ml tilpumu, šis tilpums tiek saglabāts visa darba laikā.

Mēģenes sakrata un ievieto ūdens vannā uz 10...15 minūtēm. Hemolīze galvenokārt notiks mēģenēs ar augstu hemolizīna saturu (tā zemākais atšķaidījums ir 1:500, 1:1000...). Mazāko hemolizīna daudzumu (tā lielāko atšķaidījumu), kas izraisīja pilnīgu sarkano asins šūnu hemolīzi noteiktos apstākļos, sauc limita (faktiskais) titrs hemolizīns. Turpmākam darbam hemolizīnu izmanto 2 reizes koncentrētāk, tas ir, dubultā daudzumā, dubultā titrā, ko sauc. darba nosaukums. Piemēram, ja faktiskais titrs ir I: 2500 (vai 1: 2000), tad darba titrs atbilst atšķaidījumam 1:1250 (vai 1: W00).

KOMPLEMENTS ir komponents svaigs serums, limfa, audu šķidrumi dažādi veidi dzīvnieki (un cilvēki); atklāja Buhners (1889). Kukaiņiem nav komplementa. Komplements ir proteīna viela ar sarežģītu struktūru, kas tiek ātri inaktivēta karsējot, ilgstoši uzglabājot, pakļaujot ultravioletajam starojumam, spēcīgai kratīšanai, filtrējot caur keramikas filtriem, pievienojot kaolīnu, skābes, sārmus, spirtu, acetonu, hloroformu, destilējot. ūdens, suspendētās baktērijas utt. Komplementu var saglabāt, pievienojot 5 g nātrija sulfāta uz 100 ml jūrascūciņas seruma, 4 g borskābe. Papildinājuma darbība saglabājas līdz sešiem mēnešiem. Labākais veids konservēšana - žāvēšana vakuumā zemā temperatūrā (liofilizācija). Aizzīmogotās ampulās šādā stāvoklī tas ilgst divus gadus. Pirms katras RSC procedūras komplementa aktivitāti pārbauda titrējot, tas ir, nosaka tā titru – optimālo daudzumu, kas nepieciešams konkrētai reakcijai. Komplementu titrē divreiz: hemolītiskajā un bakteriolītiskajā sistēmā.

Priekš komplementa titrēšana hemolītiskajā sistēmā sagatavo sastāvdaļas: komplementu atšķaidījumā 1:20 (1 ml komplementa + 19 ml fizioloģiskā šķīduma); hemolizīns, atšķaidīts atbilstoši darba titram; mazgātu aitu eritrocītu suspensija (1:40), fizioloģisks šķīdums. Mēģenes ievieto statīvā un tajās ar graduētu pipeti ieber dažādus komplementa daudzumus ar intervālu 0,03 ml (0,13; 0,16; 0,19; 0,22..: līdz 0,43 ml). Pēc tam pievienojiet atlikušās sastāvdaļas (57. att.). Visas mēģenes sakrata un ievieto ūdens vannā 37...38 °C uz 10...15 minūtēm, un rezultātu pieraksta.

Rezultāta uzskaite: par komplementa titru tiek ņemts mazākais komplementa daudzums, kas nodrošina pilnīgu hemolīzi (šajā piemērā - 0,25 ml).

Titrēšanas rezultātu sāk ņemt vērā mēģenēs ar visaugstāko augsts saturs komplements, kur galvenokārt ir sagaidāma hemolīze. Tiek saukts mazākais komplementa daudzums, kas nodrošina pilnīgu sarkano asins šūnu hemolīzi noteiktos apstākļos komplementa titrs hemolītiskajā sistēmā.

Priekš komplementa titrēšana bakteriolītiskajā sistēmā nepieciešams, lai darba titrā būtu visas reakcijas sastāvdaļas: komplements (1:20), sarkanās asins šūnas (1:40), hemolizīns, divi pozitīvi un divi normāli serumi, specifisks antigēns. Serumus atšķaida ar fizioloģisko šķīdumu 1:10, inaktivē 30 minūtes pie 56...58 X. Katru serumu ielej divās rindās pa 0,5 ml mēģenēm. Katras rindas mēģenēm pievieno komplementu pieaugošā daudzumā, tāpat kā titrējot hemolītiskā sistēmā; sāc ar daudzumu, kas ņemts titram hemolītiskajā sistēmā, tad katrā nākamajā mēģenē devu palielina par 0,03 ml, ar fizioloģisko šķīdumu izlīdzinot tilpumu līdz 0,5 ml.

Pēc tam vienai mēģeņu rindai ar pozitīviem un normāliem serumiem pievieno 0,5 ml antigēna, bet katra seruma otrajai rindai pievieno 0,5 ml fizioloģiskā šķīduma. Visas mēģenes sakrata un ievieto ūdens vannā uz 30...40 minūtēm. Tad visām mēģenēm pievieno 0,5 ml hemolizīna un 0,5 ml eritrocītu, sakrata un atkal ievieto ūdens vannā uz 10...15 minūtēm. Mazākais komplementa daudzums, kas nodrošināja pilnīgu sarkano asins šūnu līzi abās mēģeņu rindās (ar antigēnu un bez antigēna) no diviem normāliem serumiem, vienā rindā (bez antigēna) no katra pozitīvā seruma un ar pilnīgu aizkavēšanos (neesot) hemolīze pozitīvo serumu rindās ar antigēnu (tajās pašās komplementa devās), ko sauc komplementa titrs, kas tiek izmantots, veidojot RSC galveno pieredzi diagnostikas pētījumos.

Galvenā RSK pieredze (faktiski diagnostikas tests). Divas mēģeņu rindas ievieto plauktos atbilstoši pētāmo seruma paraugu skaitam. 0,5 ml katra inaktivētā seruma ielej divās mēģenēs: vienai pievieno antigēnu - 0,5 ml, otrai (bez antigēna) 0,5 ml fizioloģiskā šķīduma un, pievienojot komplementu, izveido bakteriolītisku sistēmu un pēc tam hemolītisko. pievienots.

Nepieciešamās sastāvdaļas: 1) testa serums, inaktivēts, atšķaidīts ar fizioloģisko šķīdumu 1:10; 2) specifisks antigēns, atšķaidīts atbilstoši biofabrikas norādītajam titram uz iepakojuma etiķetes; 3) komplements noteiktajā titrā; 4) hemolizīns darba titrā; 5) mazgātu aitas eritrocītu suspensija 1:40; 6) fizioloģiskais NaCl šķīdums. Testa serumus ielej divās stobriņu rindās. Jebkuram testa serumu skaitam kā kontroli izmanto zināmu pozitīvu serumu (ar pozitīvu rezultātu) un normālu serumu (no vesela dzīvnieka, kas dod negatīvu rezultātu).

Caurules ar bakteriolītiskās sistēmas sastāvdaļām sakrata un ievieto ūdens vannā uz 20...40 minūtēm 37...38°C temperatūrā. Otrās rindas bakteriolītiskās sistēmas mēģenes bez antigēna sakrata un ievieto ūdens vannā tādos pašos apstākļos.

Pēc tam hemolītiskās sistēmas komponentus pievieno visām pirmās un otrās rindas mēģenēm un otrreiz ievieto ūdens vannā uz 10...15 minūtēm. Visās otrās rindas mēģenēs bez antigēna notiek pilnīga hemolīze.

Pirms gala rezultāta iegūšanas mēģenes atstāj istabas temperatūrā 18...24 stundas.Visās mēģenēs bez antigēna neatkarīgi no tā, vai serums iegūts no slima vai vesela dzīvnieka, jānotiek hemolīzei, pirmajā rindu mēģenes ar antigēnu, skaidrāks rezultāts izpaužas stāvot .

Reakcijas rādījumi mēģenēs ar testa serumu tiek uzskatīti par ticamiem, ja nav hemolīzes mēģenēs ar pozitīviem serumiem un antigēnu, ar pilnīgu hemolīzi mēģenēs ar pozitīvu serumu bez antigēna un visās mēģenēs ar acīmredzami normālu serumu (61. att. ).

Šai reakcijai jāpievieno antigēna, komplementa, hemolizīna un eritrocītu kontrole. Lai to izdarītu, atsevišķās mēģenēs ielej antigēnu ar aitu sarkanajām asins šūnām; papildināt ar sarkanajām asins šūnām bez hemolizīna; hemolizīns ar sarkanajām asins šūnām bez komplementa; sarkanās asins šūnas un sāls šķīdums. Tilpumu katrā mēģenē noregulē līdz 2,5 ml ar fizioloģisko šķīdumu. Mēģenes sakrata un uz 20 minūtēm ievieto ūdens vannā 37 °C temperatūrā. Visās kontroles mēģenēs nedrīkst būt hemolīze.

RSK rezultāts Ir ierasts to izteikt "krustos". Pozitīvas reakcijas rezultāta rādītāji: + + + + (///) - pilnīga sarkano asins šūnu sedimentācija (bez hemolīzes), šķidrums virs nogulsnēm ir bezkrāsains, + + + (///) - šķidrums virs nogulumiem ir tikko manāmi dzeltenīgs. Apšaubāms reakcijas rezultāts: apakšā nosēdušos eritrocītu klātbūtne un daļēja supernatanta iekrāsošanās dažu eritrocītu līzes dēļ tiek apzīmēta ar + + - (++), tas ir, divi un divarpus krusti. . Smaga hemolīze (bez nogulsnēm) vai ar nelielām nogulsnēm (+) ir negatīvs rezultāts.

Ilgtermiņa komplementa saistīšanās reakcija (LDCR). Efektīvāka jutībā atšķirībā no parastā klasiskā RSK. Reakcijas būtība ir tāda, ka bakteriolītiskā sistēma tiek uzturēta trīs dažādās temperatūras apstākļi: pēc komponentu maisīšanas istabas temperatūrā 15 minūtes, pēc tam zemā temperatūrā (4 ° C) ledusskapī 18...20 stundas un ūdens vannā 15 minūtes. Pēc tam pievieno hemolītisko sistēmu, sakrata, atkal ievieto ūdens vannā un reģistrē reakciju, tāpat kā ar RSC. RDSC efektivitāte ir apstiprināta vairāku infekcijas slimību (tuberkulozes, vibriozes, brucelozes u.c.) diagnostikā.

Komplementa fiksācijas nomākšanas reakcija (CPF) vai inhibīcijas reakcija, netiešā FCC.Šajā reakcijā ir iesaistīts vēl viens komponents - standarta imūnserums, kas satur antivielas pret antigēnu, ko parasti izmanto diagnozei un tādējādi pozitīvi reaģē klasiskajā CSC.

Testa serumu sajauc ar antigēnu un kādu laiku atstāj bez komplementa. Tad pievieno komplementu un standarta serumu, mēģenes sakrata un ievieto ūdens vannā uz 20...30 minūtēm, pēc tam pievieno hemolītisko sistēmu un atkal ievieto ūdens vannā. Ja hemolīzes nav, rezultāts ir negatīvs, jo testa serums nereaģēja ar antigēnu un pēdējais reaģēja ar standarta serums, saistošs papildinājums. Ja testa serums ir no slima dzīvnieka, tas satur specifiskas antivielas attiecībā pret antigēnu, t.i., notiek reakcija starp antigēnu un antivielām, nefiksējot komplementu. Antigēns, mijiedarbojoties ar testa seruma antivielām, nereaģē (nomākts) ar standarta (zināms specifisko) serumu, komplements paliek brīvs un reaģē hemolītiskajā sistēmā - notiek hemolīze, reakcijas rezultāts ir pozitīvs attiecībā pret uz testa serumu.

Metode fluorescējošās antivielas (MFA).Šīs metodes iespējas ir saistītas ar seroloģisko reakciju pirmās fāzes specifiku ar augstu luminiscences analīzes jutīgumu. Lai veiktu MFA, ir nepieciešami ļoti specifiski imūni luminiscējoši serumi. Ir zināms, ka dažādās seroloģiskās reakcijās, ko izmanto mikrobioloģiskajā praksē, galvenokārt tiek iesaistīti trīs komponenti: baktēriju antigēns, antiviela un komplements. Visas trīs sastāvdaļas faktiski ir antigēni, un pret katru no tiem var iegūt imūnserumus un attiecīgi luminiscējošas antivielas. Atkarībā no tā, kāda veida fluorescējošs serums tiek izmantots (pret baktēriju antigēnu, antibakteriālām antivielām, komplementu), ir trīs galvenie fluorescējošo antivielu metodes varianti: tiešais (1) un netiešais (2) variants un netiešā varianta modifikācija, izmantojot komplementu. Imunoloģiskā reakcija starp antigēnu un antivielu šajās modifikācijās tiek veikta tieši uz stikla priekšmetstikliņa. Mikroorganismu fiksēšanai tiek izmantoti organiskie šķīdinātāji: acetons, etanols, metanols, dioksāns, kā arī parastie mikrobioloģiskajā praksē izmantotie fiksatori: formalīns, Nikiforova maisījums, Carnoy šķidrums utt.

Tiešā iespēja. Gatavajam preparātam tiek uzklāts īpašs luminiscējošais serums noteikts laiks, pēc tam lieko serumu notecina, preparātu nomazgā un apskata fluorescējošā mikroskopā. Šo metodi izmanto baktēriju noteikšanai patoloģiskā materiālā, objektos ārējā vide, kā arī patogēnu identificēšanai kultūraugos.

Netiešā (divpakāpju) iespēja. Pirmajā posmā notiek specifiska antigēna kombinācija ar atbilstošu nemarķēta seruma antivielu. Otrajā posmā specifiska nemarķēta antiviela saistās ar pretsugas luminiscējošu antivielu, kas atrodas tāda dzīvnieka serumā, kas imunizēts ar tās sugas globulīniem (vai pilnu asins serumu), no kuras tika izmantots imūnserums.

Netieša anti-komplementāra (trīspakāpju) iespēja. Pirmais posms: ar antigēnu nemarķētu antivielu kompleksa veidošanās. Otrais posms: normāla seruma slāņošana, kas satur komplementu. Trešais posms: antigēna-antivielu-komplementa kompleksu apstrādā ar luminiscējošu anti-komplementāru serumu, kas sagatavots, imunizējot trušus ar tās dzīvnieku sugas serumu, kas kalpoja par komplementa avotu.

MFA netiešos variantus var izmantot gan antigēnu noteikšanai, gan antivielu noteikšanai. Turklāt, lai iestatītu divpakāpju opciju, jums ir nepieciešams ierobežots pretsugas luminiscējošu serumu komplekts (pret liellopu, aunu, zirgu, cūku utt. globulīniem), un anti-komplementāram variantam tas ir pietiekami, lai būtu tikai viens luminiscējošais serums pret jūrascūciņu globulīniem.

Imunoluminiscences un mikroskopijas metodes. Veterināro bakterioloģisko laboratoriju praksē tiek izmantoti biofabrikāti luminiscējošie serumi. Atkarībā no fluorohroma veida luminiscējošie serumi objektam nodrošina vai nu zaļu mirdzumu (krāsviela uz fluorescējošas bāzes), vai sarkanu mirdzumu (krāsviela uz rodamīna bāzes).

Lai veiktu imūnluminiscences mikroskopiju, pētāmais materiāls jāuzklāj uz beztauku, plānas, bez skrāpējumiem stikla priekšmetstikliņa. Pētot dzīvnieku orgānus un audus, pirkstu nospiedumu preparātus sagatavo plānā kārtā. Preparātus žāvē gaisā un ievieto fiksējošā šķidrumā (etanols - 15 minūtes, metanols - 5 minūtes, acetons - 5 minūtes). Ja nepieciešams, pēc fiksācijas preparātus kādu laiku var uzglabāt ledusskapī. Secība un turpmākās procedūras ir atkarīgas no izmantotās MFA versijas (vienpakāpes, divpakāpju, trīspakāpju). Preparātu apstrādi ar luminiscējošiem serumiem, kā arī nemarķētiem pirmās pakāpes serumiem un komplementu veic 37°C mitrā kamerā (Petri trauciņos ar samitrinātu filtrpapīru).

Viena posma iespēja. Luminiscējošo serumu uzklāj uz stikla priekšmetstikliņa ar fiksētu testa materiālu (atšķaidījumā, kas norādīts uz ampulas). Zāles ievieto mitrā kamerā uz 15...20 minūtēm 37 "C. Pēc tam traukā mazgā ar buferētu fizioloģisko šķīdumu (pH 7,4), vairākas reizes mainot šķīdumu pēc 5...10 minūtēm, vai zem tekoša krāna ūdens iekšā 3...5 minūtes.Ūdenim jābūt neitrālam un bez dzelzs.Tad preparātu (uz vienas glāzes var būt vairāki smērējumi) žāvē gaisā vai ar filtrpapīru, pēc kā pilina uzklāj buferētu glicerīnu ar pH 8,0 un pārklāj ar segstikliņu Nefluorescējošu iegremdēšanas šķidrumu uzklāj uz pārklājuma un pārbauda mikroskopā.

Divpakāpju iespēja. Pirmās pakāpes, nemarķēta imūnseruma pilienu uzklāj uz stikla priekšmetstikliņa ar testa materiālu. Zāles ievieto termostatā mitrā kamerā uz 15...20 minūtēm. Pēc tam to mazgā, kā aprakstīts iepriekš, žāvē un uzklāj pilienu luminiscējoša pretsugas seruma. Zāles atkal ievieto termostatā mitrā kamerā uz 15...20 minūtēm. Atkārtojiet mazgāšanas procedūru un nosusiniet ar filtrpapīru. Uzklāj buferētu glicerīnu, pārklāj ar segstikliņu, uzklāj nefluorescējošu iegremdēšanas šķidrumu un mikroskopiski izmeklē.

Trīspakāpju iespēja (anti-komplementārs). Pirmās pakāpes, nemarķēta imūnseruma pilienu uzklāj uz stikla priekšmetstikliņa ar testa materiālu. Zāles ievieto termostatā, kā aprakstīts iepriekš, žāvē un uztriepes uzklāj komplementa pilienu. Zāles atkal ievieto mitrā kamerā un termostatā uz 15...20 minūtēm, pēc tam tās nomazgā un uzklāj luminiscējošu antikomplementāru serumu. Turpmākās procedūras ir līdzīgas vienpakāpes opcijai.

Kontroles preparātu sagatavošana un apstrāde. 1. Tiešajam variantam, lai noteiktu reakcijas specifiku starp antigēnu un luminiscējošu serumu, heterologu mikrobu sugu uztriepes preparāti jāapstrādā ar to pašu serumu. Šīm sugām jābūt antigēniski līdzīgām, bet morfoloģijas ziņā atšķirīgām no pētāmajiem mikroorganismiem; antigēni attāli no pētāmajiem mikroorganismiem, bet pēc morfoloģijas un izplatības tiem līdzīgi. Nospiedumu preparātus apstrādā ar luminiscējošu normālu serumu.

2. Netiešajam variantam ir nepieciešami trīs kontroles preparāti, kas apstrādāti ar normālu serumu, luminiscējošu pretsugu serumu bez imūnā nemarķēta seruma un luminiscējošu pretsugu serumu ar zināmu pirmās pakāpes imūnserumu.

3. Netiešajam variantam ar papildinājumu nepieciešami kontroles preparāti, kuru ārstēšanas laikā imūnserumu aizstāj ar parasto tāda paša tipa serumu un tādos pašos atšķaidījumos, kā arī preparātus, kas apstrādāti ar visām sastāvdaļām, izņemot imūnserumu.

Rezultātu izvērtēšana. Tiek ņemts vērā mirdzuma spilgtums, krāsa, lokalizācija un struktūra. Baktērijām, kas iekrāsotas ar luminiscējošu serumu, kas marķēts ar fluoresceīna izotiocianātu, ir spilgti zaļš mirdzums gar perifēriju loka vai halo veidā, centrālā daļa spīd vāji. Šo mirdzumu sauc par specifisku, atšķirībā no nespecifiskā, kad viss šūnas ķermenis spīd vienmērīgi. Jo pamanāmāk preparātā atrodas baktēriju šūna, jo asāka ir maliņa. Šo mirdzumu var izskaidrot ar to, ka no šūnas “perifēras” vienības laukuma uz novērotāja acs tīkleni tiek projicēts vairākas reizes vairāk antivielu nekā no mikrobu šūnas centrālās daļas. Jāpatur prātā, ka plastmasas šūnām (leptospirām, vibrioniem) nav kontūras vai tā ir vāji pamanāma. Audu šķidrumā iegremdētās šūnās un jaunos baciļos Sibīrijas mēris kontūras parasti ir izplūdušas.

Luminiscences intensitāte tiek novērtēta, izmantojot četru krustu sistēmu: + + + + - ļoti spilgta fluorescence gar mikrobu šūnas perifēriju, skaidri kontrastējot ar tumšo šūnas ķermeni; + + + - spilgta šūnas perifērijas fluorescence; + + - vājš šūnas perifērijas spīdums; + - mikrobu šūnu ķermeņa perifērijā nav kontrasta mirdzuma. Konkrēta mirdzuma neesamību norāda ar “-” (ir redzamas mikroorganismu ēnas). Diagnosticējot dažādus patogēnus pozitīvs rezultāts Visbiežāk baktēriju šūnu specifiskā luminiscence tiek uzskatīta par ne zemāku par četriem vai trim krustiem.