OPĆE FARMAKOPEJSKO DOBRO

Uvedeno umjesto metode navedene u FS 42-3874-99

Ova monografija Opće farmakopeje namijenjena je proučavanju antigenskog sastava biološki materijali, kao i za određivanje čistoće, kvalitativnog i kvantitativnog sastava imunobioloških lijekovi(ILP) metodom imunoelektroforeze (IEF) u agar gelu, kombinirajući metode zonske elektroforeze i imunodifuzije.

U procesu imunoelektroforeze u gelovima ili na filmovima celuloznog acetata metodom jednostavne ili dvostruke imunodifuzije dolazi do reakcije između topivih proteina i taloženih antitijela specifičnih za njih. Kvantitativno određivanje proteina može se provesti elektroforezom u mediju koji sadrži protutijela (elektroimunotest, elektroimunodifuzija, raketna imunoelektroforeza). Antigenska priroda proteinskih komponenti može se istražiti njihovom usporedbom s poznatim markerima.

Učinkovitost imunokemijskih testova ovisi o specifičnosti korištenih antiseruma, kao io njihovom titru i afinitetu za antigene.

Tipično, imunoelektroforeza je kombinacija elektroforeze u agar (ili agaroza) gelu praćene dvostrukom imunodifuzijom u istom mediju. U dvodimenzionalnoj dvostrukoj imunodifuziji, antigen i antitijela smješteni u okruglim ili pravokutnim udubljenjima u gelu migriraju jedno prema drugome, što rezultira stvaranjem precipitacijskih linija (lukova) kada se susretnu. Položaj precipitacijskih traka ovisi o koeficijentu difuzije antigena, njegovoj koncentraciji u odnosu na antitijela (brzina difuzije antitijela može se smatrati konstantnom). Određeni omjer koncentracija antigena i antitijela, koji je optimalan za nastanak precipitata, naziva se zona ekvivalencije. To rezultira jasnim linijama padalina.

Koncentracija (titar) protutijela u imunološkom serumu također može značajno varirati. Moguće je da se zone ekvivalencije za različite komponente smjese neće preklapati. Za odabir ekvivalentnog omjera antigen-protutijelo preporučuje se imunoelektroforeza višekomponentnih smjesa pri nekoliko relativnih koncentracija antigen-antitijela, budući da se pri korištenju samo jedne takve koncentracije jedna ili druga komponenta možda neće otkriti.

Metoda imunoelektroforeze u agar gelu

Staklena ploča 90x120 mm tretirana alkoholom postavljena je strogo vodoravno na pozornicu. Ohlađen na temperaturu od (45±5) 0 C, agar gel se nanosi na staklenu ploču u količini od 18,0-20,0 ml. Nakon skrućivanja na sobnoj temperaturi, nakon 20-30 minuta, na ploči se formira sloj agara debljine 2,0-2,5 mm.

Nakon što se gel stvrdne, posebnom šablonom u njemu se izreže 6-7 rupa promjera 1-2 mm. Jažice se pune ispitnim uzorkom u volumenu koji ne prelazi volumen jažice (2 jažice za svaki ispitni uzorak). Istovremeno se u gornju i donju jažicu staklene ploče s gelom unosi kontrolni uzorak - normalni ljudski krvni serum ("Standardni uzorak test sustava za određivanje frakcijskog (antigenog) sastava pripravaka iz ljudskog krvnog seruma. imunoelektroforezom" ili drugog kontrolnog uzorka prema uputama monografije ili normativne dokumentacije), obojen pironinom B (ili drugom bojom navedenom u monografiji ili normativnoj dokumentaciji).

U mjerni cilindar zapremine 1000 ml dodajte 500 ml veronal-medinala ili boratne pufer otopine, dovedite volumen otopine do oznake pročišćenom vodom i promiješajte. Dobivena otopina (ili druga puferska otopina navedena u monografiji ili regulatornoj dokumentaciji) ulijeva se u elektrodne dijelove komore uređaja za elektroforezu.

Ploča s pripremljenim gelom stavlja se u uređaj za elektroforezu i spaja s puferskom otopinom u elektrodnim komorama uređaja pomoću nekoliko slojeva filter papira. U slučaju uređaja za elektroforezu, koji omogućuje povezivanje agara na ploči s puferom elektrode pomoću kolona agara, ploča se ugrađuje u balansirani uređaj i prelijeva rastaljenim agarom dok se ne poveže s kolonama agara i gelom. stvara se sloj debljine 1–2 mm.

Uređaj za elektroforezu se pokrije poklopcem i uključi izvor struje (napon 70-200 V, struja 10-40 mA). Elektroforeza se provodi 1,5-3 sata dok mjesto pironina B, koje odgovara migraciji albumina, ne bude na udaljenosti od 20-25 mm od jažice.

Nakon elektroforeze, pomoću posebne šablone, između jažica u agar gelu izrezuju se uzdužni “žljebovi” (paralelni sa smjerom migracije). 0,25 ml precipitirajućeg antiseruma dodaje se u "žljebove": protiv proteina ljudskog seruma (pri ispitivanju frakcijskog sastava) ili polivalentnog seruma protiv proteina ljudskog seruma, veliki goveda, konji i svinje (za potvrdu autentičnosti).

Ploča s agar gelom stavlja se u vlažnu komoru i drži na temperaturi od (5 ± 3) 0 C 24-48 sati.

Za ispiranje proteina koji nisu ušli u reakciju taloženja, ploča s agarom se stavi u kivete, prelije 0,9% otopinom natrijevog klorida i inkubira 16-18 sati.Otopina se mijenja 3-4 puta. Zatim se ploča izvadi iz 0,9% otopine natrijevog klorida, prekrije filtar papirom natopljenim 0,9% otopinom natrijevog klorida i suši na zraku dok se agar gel ne pretvori u tanki film. Nakon toga se ploča s osušenim gelom prekrije filtar papirom namočenim u 0,9% otopinu natrijevog klorida bez mjehurića zraka i osuši na sobnoj temperaturi ili u pećnici na temperaturi ne višoj od 40°C. Nakon sušenja ploča, filter papir se navlaži vodom i pažljivo ukloni.

Za bojenje proteina koristi se amido crna 10B boja ili druga prikladna boja (u skladu s uputama u monografiji ili regulatornoj dokumentaciji), stavljajući ploču u kivetu s otopinom boje 30-40 minuta. Zatim se ploča ispere u otopini za pranje agara (2% otopina octene kiseline ili druga otopina, u skladu s uputama u regulatornoj dokumentaciji) 15-40 minuta dok pozadina boje potpuno ne nestane i ponovno se osuši na sobnoj temperaturi ili u u pećnici na temperaturi ne višoj od 40°C.

Lipoproteini se boje sudanskim crnim B. Za bojenje se potpuno osušene ploče stave u otopinu boje na 3 sata, zatim se obezboje s 50% etanolom dok se podloga potpuno ne razbistri. Lipoproteini se boje tamnoplavo. Treba izvršiti bojanje potpuno osušenog preparata, budući da je sudansko crno B netopljivo u vodi i boji vlažni gel.

Obračunavanje rezultata u istraživanju frakcijskog sastava pripravaka humanih imunoglobulina provodi se vizualno usporedbom elektroforegrama ispitivanog uzorka s elektroforegramom kontrolnog uzorka - normalnog ljudskog krvnog seruma ("Standardni uzorak testnog sustava za određivanje frakcijski (antigenski) sastav pripravaka iz ljudskog krvnog seruma imunoelektroforezom" ili drugog kontrolnog uzorka u skladu s uputama iz regulatorne dokumentacije), koji treba pokazivati ​​propisani broj precipitacijskih linija sa serumom prema proteinima ljudskog seruma (najmanje 15 precipitacijskih linija). kada koristite " standardni uzorak test sustavi za određivanje frakcijskog (antigenog) sastava pripravaka iz seruma ljudske krvi imunoelektroforezom). Glavna komponenta pripravka humanog imunoglobulina treba odgovarati imunoglobulinu G (Ig G) normalnog ljudskog krvnog seruma.

Obračunavanje rezultata pri provođenju studija za potvrdu autentičnosti produkata ljudske krvi provodi se vizualno identificiranjem linija taloženja sa serumom protiv serumskih proteina ljudske, goveđe, konjske i svinjske krvi. Precipitacijske linije treba otkriti samo sa serumom protiv proteina ljudskog seruma.

Bilješke

1. Priprema 0,05M pufer otopine veronal-medinal(pH 8,6±0,1). U odmjernu tikvicu zapremine 1000 ml dodati 1,38 g veronala, 8,76 g medinala, dodati pročišćenu vodu do oznake i miješati dok se potpuno ne otopi.

1. Priprema 0,05 M otopine boratnog pufera(pH 8,6±0,1). U odmjernu tikvicu zapremine 1000 ml dodajte 6,7 g Borna kiselina, 13,4 g natrijevog tetraborata 10-vodenog, dodati pročišćenu vodu do oznake i promiješati.
2. Priprema 1,25% agar gela. Priprema agar gela vrši se na jedan od sljedećih načina:
3. Za pripremu 1,25% agar gela koristi se 0,05 M pufer veronal-medinal (pH 8,6 ± 0,1) s dvostrukom koncentracijom soli (odnosno 2,76 g veronala i 17,52 g medinala na 1000 ml pročišćene vode).
4. Za pripremu 1,25% agar gela koristi se otopina boratnog pufera (pH 8,6 ± 0,1) s dvostrukom koncentracijom soli (odnosno: 13,4 g borne kiseline i 26,8 g natrijevog tetraborata 10-vodenog na 1000 ml pročišćene vode).

U kemijsku čašu zapremine 1000 ml doda se 12,5 g agara, doda se 500 ml pročišćene vode i ostavi da gel bubri jedan sat na temperaturi od (20 ± 1) 0 C. Čaša s sadržaj se stavi u kipuću vodenu kupelj i inkubira dok se agar potpuno ne otopi. Volumen otopine gela dotjera se vodom do 500 ml, zatim se doda jednaki volumen otopine veronal-medinala ili boratnog pufera (ili druge puferske otopine navedene u monografiji ili normativnoj dokumentaciji). Otopina agara se filtrira kroz 2-3 sloja gaze, doda se tiomersal do koncentracije od 100 μg/ml i ulije u bočice od 40-50 ml (količina potrebna za dvije ploče). Otopljeni agar trebao bi biti bistar.

1. Priprema otopine za bojenje amido crnog 10B. Priprema otopine boje provodi se na jedan od sljedećih načina:
2. U odmjernu tikvicu kapaciteta 1000 ml dodati 1,0 g amidne crne boje 10B, 450 ml 0,1 M otopine octene kiseline, 550 ml 0,1 M otopine natrijeva acetata i promiješati.
3. U odmjernu tikvicu zapremine 1000 ml dodati 1,0 g aminocrnila 10B, 100 ml ledene octene kiseline, dovesti volumen pročišćenom vodom do oznake i promiješati. Nakon 12 sati procijediti kroz papirnati filter.
4. Priprema otopine za bojanje sudansko crno B. U odmjernu tikvicu zapremine 1000 ml dodati 1,2 g crnog sudana B, 20 ml 1M otopine natrijevog hidroksida, 380 ml pročišćene vode i apsolutnim etanolom dovesti volumen otopine do oznake i promiješati. Smjesa se kratko prokuha, ohladi na sobnu temperaturu, a nakon hlađenja boja se ulije u tamnu bocu s brušenim čepom. Reagens se čuva na sobnoj temperaturi 3 mjeseca.
5. Priprema 2% otopine octene kiseline za ispiranje agara. U odmjernu tikvicu zapremine 1000 ml dodajte 20,0 ml ledene octene kiseline, dovedite volumen otopine pročišćenom vodom do oznake i promiješajte. Reagens se čuva na sobnoj temperaturi 3 mjeseca.

Izum se odnosi na laboratorijsku opremu. Svrha izuma je smanjiti vrijeme istraživanja i smanjiti potrošnju gela. Uređaj sadrži kivetu 1, pregradu 2, pufersku otopinu 3, držač 4 gela s poklopcem 11 i elektrode 12. U držaču 4 na radnoj površini nalaze se horizontalni utori povezani kanalima sa šupljinama na suprotnim stranama. od particije. Poklopac 11 ima redove rupa 7 i 8 raspoređenih u parovima iznad svakog utora. Držač i poklopac izrađeni su od prozirnog materijala. Serumi se stavljaju u rupe 7 i 8 i uključuje se napajanje. Kao rezultat reakcije nastaje talog, prema kojem se prosuđuje prisutnost ili odsutnost antigena. Reakcija se odvija u zatvorenom bloku, gel ne ispunjava cijeli držač, već samo utore, što omogućuje smanjenje njegove potrošnje. 1 z.p. f-ly, 3 ilustr.

SAVEZ SOVJETA

SOCIJALISTA

REPUBLIKA

OPIS IZUMA

NA BTOPCKOMY CERTIFIKAT

DRŽAVNI ODBOR

ZA IZUME I OTKRIĆA

U SCST SSSR

1 2)11 4)6111(1>(-1-1 (221 1(1.(n>.X7)

I 4t> I; 3 (I. I (j.> Ü. I ">. i X 4 (1 (711 Veeeon) zn>> n (e. (b (ni i lbor> trostruki tehnpki (721 V. () !. (:obole(3, . 3. V. bap (tano> 3, V.. 1. Won, iüåv i 3. V. (; g3 IIHh (> v)

N ()6)7471), cl. A 6! U 5i ():), 1(177.

1541 Y(. E C3(r1(:Th() L, 15(!! P()BE:., ((.1!1! SI

1! Y:) (Y ((OE.1 () .. (; TR (.) ZA! .3> "3 V (l, 1 (. (571 I (obreT (ni (od nouite> 1 do 1) "l ()()j) ()),"(onwin) I I(.lb tt 3(>()e l (. niya okrap (epis vremenskog vela. i ne.> elova1eni)<.>„„SU„„15179 8 A 1 (5() 4 A b (V 5/04, C (01 3 33) 48

2 eo i (1.11 hv>ttl g „(, pregrada -”, b 1), (, terzh "te.> 4 gel e poklopac 11 II s. (ektrols 12. U držaču 4 na njegovom

Raen> i ll VISOKI DOGAĐAJ EXP.> N kibl G) RIZONT; 1.> ʹHl, i (113> bi, spojen (kanali s poloetima duž E); t 1 p (> pogl., ((napravljeni su susjedni i poklopac) od h;>ts riala. Sy(>s>rotki ps>m"n11>n>t u geretiji 7 i 8 i incln)11)n>t bloku bjelanjka. U re T 3T (. reakcija ((ii obrdz3e1 u; i.t (> h, i kT () I) "% ted e) lyat o n,), (i" Hll lt, lit o ": an". l (ll "n i ll. k (). 1it 13 3 1 kE>tT(>M (<.1>h(, G(. l b 3 ,!v

tl >t(ll a.(b1, i T(>novo>;o 1,1() 3 b1eHbllll(Tb (th P;t 1 3, i

Zahtjev

Izum se odnosi na medicinsku opremu i može se koristiti u krvnoj službi, odjelima za zarazne bolesti

6 bolnica, u kliničkim dijagnostičkim laboratorijima zdravstvenih ustanova.

Svrha izuma je smanjiti vrijeme provođenja istraživanja i smanjiti potrošnju gela.

Na Sl. 1 prikazuje uređaj za

II!)()k3Deniss Red)I(HI(; klinac sl. 2 držač, rez, sl. 3 isto, pogled odozgo.

Uređaj za imunoelektroforezu sastoji se od vetu 1, koji je cijelom dužinom podijeljen pregradom 2 na dva dijela, tvoreći pufer-elektrodne prostore ispunjene puferskom otopinom 3.

111k pregrada 2, ugrađen je držač 4 gs I) I koji je proziran i

6 1()k, koji sadrži niz utora 5, cat()!)bl(. imageK)T autonomnih kanala koji povezuju međuspremnik 3 s obje strane particije 2. Svaki kanal ima dva ()Tk3cpcTkIkI b za njihovu izradu sin () tkivo 7 i serum 8. Kanali su međusobno odvojeni tankom stijenkom 9.

Za elektroforezu u aparatu priprema se veronal-medinalni pufer od barbita l I natrij (medinal 17,5 g i barG> i I I.ld Be!) on 1) l) 2,7 g B 1000 ml dis1 i, s , l )11)()k)k)IIII()II Svezak.

Cilj r () govyaz iz 1) gara fi pmi>

k.("I1kckIT1), 1 g agara na 100 ml pufer otopine.

11re.l nocha) ohm elektroforeza žljebovi 5 zai (.) nyak) 1 nosač 0 (agar gel), 3dT (I u dslak gel) t udubljenja, u jednom

1 I 3), r)) odbojnik 3, držač potpore B.II)k)dk()T kroz septum 2. Cuvée Tv

3dk!)I l«d l() l pokrijte 11 elektrodama 2.

Uređaj radi na sljedeći način.

Komora se napaja konstantnim naponom. Prolaskom istosmjerne struje kroz strujni krug elektroda pufer - nosač - pufer - elektroda, antigeni i antitijela se kreću jedni prema drugima i međusobno djelujući stvaraju talog vidljiv golim okom. Sediment omogućuje procjenu prisutnosti ili odsutnosti

1O antigen u proučavanim serumima. Tako je moguće identificirati bolesnike s krpeljnim k3blM encefalitisom, meningitisom, serumskim hepatitisom i drugim imunološkim bolestima.

U predloženom uređaju za provođenje -! 5 elektroforeza, tehnologija proizvodnje je uvelike pojednostavljena, držač je eliminiran složen dizajn, ali zbog činjenice da se reakcija odvija u zatvorenoj jedinici, te isparavanje i dr vanjski faktori ne može utjecati na serum i nosač postavljen u utore 5, poklopac se može napraviti ravnim. Time se poboljšavaju pokazatelji kvalitete.

1. Uređaj za izvođenje imunoelektroforeze u gelu, koji sadrži kivetu, elektrode, pregradu koja dijeli kivetu komore u dvije šupljine i držač gela montiran na pregradu, naznačen time što, kako bi se smanjilo vrijeme proučiti i smanjiti potrošnju gela, držač izrađen s horizontalnim utorima na radnoj površini, spojen kanalima s različitim podovima (kivetama), te opremljen pločicom Ç5 koja je u kontaktu s njegovom radnom površinom i ima nizove rupa smještenih u paru iznad svakog utora .

Imunoelektroforeza- jedna od široko korištenih metoda kvalitativne analize antigena. S odgovarajućim AS za taloženje, može se koristiti za ispitivanje bilo koje antigenske smjese. Posebno se uspješno analiziraju proteini krvnog seruma, cerebrospinalne tekućine, urina, mlijeka, ekstrakata iz organa, kao i proteini biljnog i bakterijskog podrijetla. U klinici se ova metoda najčešće koristi u dijagnostici paraproteinemije i stanja imunodeficijencije. U sudska medicina koristi se za analizu sustava haptoglobina i Gc komponente specifične za skupinu.

U istraživačkom radu, imunoelektroforeza je glavna metoda za identifikaciju proteina sadržanih u složenim smjesama. Neophodan je kao metoda za dosljedno praćenje procesa pročišćavanja proteinskih pripravaka. Također se često koristi za kontrolu autentičnosti i čistoće ovih pripravaka. Naravno, metodu koja ima tako široku primjenu trebalo je modificirati i usavršavati u raznim smjerovima. Predloženi su novi nosači: agarozni gel, PAAG, filmovi celuloznog acetata.

U isto vrijeme, IEF se počeo kombinirati s razne metode specifično bojenje i fluorokromizacija za otkrivanje enzima, ugljikohidrata, lipoproteina, nukleoproteina. Kao rezultat kombinacije s drugim metodama analize pojavile su se disk imunoelektroforeza, imunoelektrofokusiranje, radioimunoelektroforeza itd. Za kvantitativno određivanje pomoću polispecifične AS, nedavno je predložen dvodimenzionalni IEF. Posebna modifikacija dvodimenzionalnog IEF-a može povećati njegovu osjetljivost na razinu RIA. To se postiže elektroforetskom elucijom antigena iz malih staklenih posuda volumena 0,1-10 ml. Za IEF s hlađenjem Wimet je dizajnirao uređaj koji automatski održava konstantnu temperaturu i struju tijekom procesa odvajanja.

Ovaj je uređaj vrlo prikladan za određivanje elektroforetske pokretljivosti raznih tvari. Korištenje termoelektričnog hlađenja (Peltier baterija) u ovom uređaju posebno treba preporučiti pri radu s enzimima i drugim termolabilnim tvarima. Nedavno je predložena jednostavna metoda za odvajanje proteina u dvodimenzionalnoj elektroforezi. Poznata je osjetljiva metoda za određivanje neprecipitirajućih sustava antigen-protutijelo koja se temelji na upotrebi MAb, tzv. kaskadni IEF, uključujući fiksaciju AG nakon elektroforeze, pričvršćivanje antitijela na antigene, uklanjanje vezanih antitijela i njihovu kvantifikaciju.

Kod imunofiksacijske elektroforeze odvajaju se antitijela, a ne antigen. To je brza i ekonomična metoda, a posebno je pogodna za masovni probir za otkrivanje paraproteinemije i za dobivanje proteinskih pripravaka. U IEF-u se često opažaju poremećaji u normalnom tijeku procesa, a njihov uzrok nije uvijek moguće odmah otkriti. Ako se, na primjer, koristi nedovoljno pročišćeni agar, ali to najčešće dovodi do tri kršenja: lošeg stvaranja gela, jake elektrosmoze, loše obezbojenosti preparata. Nedovoljno čisti agar treba uvijek pročistiti. Za početak rada s novom porcijom agara prvo morate testirati njegovu prikladnost. Često se otkrije da isti antigeni imaju različitu elektroforetsku pokretljivost i različito se boje kada se koriste različite serije agara. Poremećaji IEF mogu biti uzrokovani hidrolizom agara zbog opetovanog ili predugog zagrijavanja.

Hidroliza se dokazuje slabljenjem svojstava tvorbe gela i pojavom neravnina na površini gela. Elektroforetsko odvajanje može biti oslabljeno ako se koristi pogrešna otopina pufera. Većina pufera služi kao dobro tlo za razmnožavanje bakterija i plijesni. Stoga, pufer temeljac treba čuvati u hladnjaku ili mu dodati konzervans. Pufer koji ispunjava elektroforetsku komoru treba mijenjati najmanje jednom tjedno. Kod višekratne uporabe elektrodnog pufera potrebno je mijenjati polove elektroda nakon svakog odvajanja. Veličina napona na stezaljkama kamere obično ne dopušta prosuđivanje fizička snaga struja koja prolazi kroz gel, pa miliampermetar mora biti spojen u seriju u krug. Tijekom odvajanja, struja se gotovo uvijek povećava. Ova pojava je posljedica zagrijavanja gela, koje se povećava s trajanjem elektroforeze.

Međutim, nakon početnog porasta, struja u krugu može pasti. Često je to zbog sušenja traka filter papira koje povezuju gel s puferom ili čak zbog sušenja samog gela. U tom slučaju smanjite ionsku snagu pufera ili napon na terminalima komore. Osim toga, isušivanje se može spriječiti omotavanjem gel ploče i papirnatih traka polimernim filmom prije elektroforeze. Najprikladnije je raditi s izvorom koji pruža stalna sila struja (stabilizacija struje). Podrazumijeva se da rezultati IEF ovise o kvaliteti antigena i antiseruma.

Riža. 8. Princip imunoelektroforeze.

Faza 1: elektroforeza antigena u agar gelu. Antigen migrira na neku hipotetsku udaljenost.

Faza 2: struja je isključena. U agaru je urezan utor i ispunjen antitijelima. Nastaje oborinski luk. Teoretski, antigen radijalno difundira iz točkastog izvora, a antitijela difundiraju iz utora u ravnomjernoj prednjoj strani. Precipitati nastali na mjestima optimalnog omjera antigena i protutijela oblikuju luk. Luk se nalazi najbliže utoru gdje je koncentracija antigena najveća.

Imunoelektroforeza pomaže identificirati antigene elektroforetskom pokretljivošću, osobito kada su drugi antigeni prisutni u uzorku.

Ovom se metodom u kliničkoj imunologiji semikvantitativno određuje koncentracija imunoglobulina i identificiraju proteini mijeloma (slika 9).

Riža. 9. Glavne klase humanih imunoglobulina u krvnom serumu, detektirane imunoelektroforezom. U utor je dodan zečji antiserum. Prikazan je položaj glavnih frakcija globulina. Identificirane su tri od pet glavnih klasa ljudskih imunoglobulina: IgG, IgA i IgM. Luk taloženja IgG proteže se od γ-regije do ά2-globulinske regije, što odražava ekstremnu heterogenost populacije protutijela kako u sastavu aminokiselina tako iu ukupnom naboju.

Na temelju kombinacije elektroforeze s imunoprecipitacijom razvijeno je nekoliko uspješnih metoda od kojih svaka kretanjem antigena u električnom polju dovodi do njegovog kontakta s protutijelima. Protuimunoelektroforeza se može koristiti za otkrivanje antigena koji migriraju u agaru na pozitivno nabijenu elektrodu.

Sl.10. Kontra imunoelektroforeza. Zbog endosmoze, antitijela se kreću "unatrag" u gelu; antigen koji je negativno nabijen pri određenom pH kreće se prema pozitivnoj elektrodi i stvara talog nakon kontakta s antitijelima.

Ova metoda traje manje vremena i osjetljiviji je od Uchterlonijeve dvostruke difuzije. Koristi se za identifikaciju antigena virusa hepatitisa B i odgovarajućih protutijela, protutijela na DNA u sistemskom eritematoznom lupusu, autoantitijela na topive nuklearne antigene u kolagenozama i protutijela (precipitina) na Asperqillus u alergijskoj bronhopulmonalnoj aspergilozi.

Raketna elektroforeza je kvantitativna metoda koja uključuje uvođenje antigena u gel koji sadrži antitijela. Precipitacijska linija ima oblik rakete čija je duljina određena koncentracijom antigena.

Sl.11. raketna elektroforeza. Antigen, u ovom slučaju humani serumski albumin, podvrgava se elektroforezi u gelu koji sadrži antitijela. Udaljenost između početne rupe i vodećeg ruba luka, u obliku rakete, ovisi o koncentraciji antigena. U ovom slučaju, relativne koncentracije humanog serumskog albumina su (s lijeva na desno) 3, 2 i 1.

Kao kontraelektroforeza, jest brza metoda, ali i ovdje se antigen mora pomaknuti do pozitivno nabijene elektrode. Tako je raketna elektroforeza prikladna za proteine ​​kao što su albumin, transferin i ceruloplazmin, dok se koncentracija imunoglobulina obično određuje jednostavnom radijalnom imunodifuzijom.

Jedna od najuspješnijih varijanti raketne elektroforeze je Laurellova dvodimenzionalna ili ukrštena imunoelektroforeza. Istodobno, u prvoj fazi, mješavina antigena se elektroforetski odvaja u agaroznom gelu. Odvojeni proteini su tada ponovno prisiljeni difundirati kroz gel pod utjecajem električnog polja u drugom smjeru, okomitom na prvi. Stoga je moguće kvantificirati svaki od antigena smjese. Najupečatljiviji primjer je procjena stupnja konverzije C3 u inaktivirani oblik C3c, koji se često javlja tijekom egzacerbacije u serumu bolesnika sa sistemskim eritemskim lupusom ili u sinovijalnoj tekućini zahvaćenih zglobova u akutnoj fazi. reumatoidni artritis, kao i u drugim slučajevima.

sl.12. Križna imunoelektroforeza.

A. Antigeni se odvajaju elektroforetskom pokretljivošću u agar gelu. Uska uzdužna traka (ograničena isprekidanom linijom) koja sadrži odvojene antigene izrezuje se iz gela i nanosi na drugi gel koji sadrži antiserum. Zatim se elektroforeza provodi u smjeru okomitom na prvi; dok antigeni reagiraju s antiserumom sadržanim u gelu, uz stvaranje precipitacijskih pikova. Područje ispod pika ovisi o koncentraciji danog antigena.

b. Elektroferogram koji pokazuje konverziju komponente komplementa C3 (C3 → C3c) u serumu. Gel je dodatno obojen. U ovom slučaju, lukovi se spajaju jedni s drugima, budući da antigeni imaju zajedničke determinante.

V. "Planinska fantazija" - ovaj elektroforegram pokazuje nevjerojatne mogućnosti umrežene imunoelektroforeze za odvajanje složene mješavine antigena.

Imunofluorescencija uključuje vezanje fluorescentne boje, kao što je natrijev izotiocijanat, na molekulu antitijela. Antigenski materijal (bakterije, stanice ili njihove komponente) koji imaju pričvršćena obilježena antitijela postaju vidljivi na ultraljubičastom svjetlu. Metoda nije kvantitativna, ali vrlo važna u imunomorfologiji za određivanje lokalizacije antigene strukture odnosno antitijela.

Kompeticija s radioaktivnim antigenom(radioimunološka metoda) – jedna od naj modernim metodama. Računanje reakcije antigen-protutijelo može se provesti korištenjem radioizotopske metode u slučaju korištenja "obilježenih" antitijela ili antigena. Mjerenje radioaktivnosti taloga omogućuje procjenu količine antitijela ili antigena u ispitivanim uzorcima. Time se povećava objektivnost procjene, ubrzava obračun i povećava osjetljivost reakcije. Najosjetljivije (određivanje 1 - 10 ng tvari) metode natjecanja za protutijela neobilježenog antigena s obilježenim. Princip metode je sljedeći. Koristi se standardna količina antiseruma protiv antigena koji se proučava i standardna količina ovog antigena obilježenog radioaktivnim 125 I, 131 I, 2 H ili drugim izotopom. Njihov je omjer takav da se 70-80% obilježenog antigena veže na antitijela, stvarajući radioaktivni talog s vrijednošću radioaktivnosti N. Ako se u sustav za reakciju uvede supstrat koji se ispituje na prisutnost ovog antigena, tada u prisutnosti antigena natječe se s obilježenim antigenom i radioaktivnost precipitata se smanjuje. Što je više antigena u ispitivanom uzorku, manja je radioaktivnost taloga. Ovom metodom utvrđuje se koncentracija u krvi, urinu i drugim tvarima onih tvari koje se zbog zanemarivih koncentracija ne otkrivaju biokemijskim metodama (hormoni: inzulin, hormon rasta, ACTH, gonadotropin, digoksin, somatotropin i dr.). .).

Riža. 13. Metoda izolacije membranskog imunoglobulina (IgM - 8S) s površine B-limfocita.

1. Označavanje površinskih proteina limfocita s 125 I u prisutnosti laktoperoksidaze (LP).

2. Liza stanice i otpuštanje površinskih proteina u otopinu.

3. Precipitacija obilježenih imunoglobulina specifičnim anti-Ig serumom.

4. Pranje i taloženje taloga.

5. Destrukcija taloga i elektroforetska analiza lakih i teških lanaca u poliakrilamidnom gelu

ELISA metoda predstavlja razvoj naj zadnjih godina. Što se tiče osjetljivosti, nije niži od prethodnog, ali je jednostavniji u prisutnosti komercijalnih reagensa. Protutijela protiv određenog antigena adsorbirana su na stijenkama polistirenskih epruveta. U tu se epruvetu dodaje ispitni supstrat. U prisustvu ovog antigena, on se spaja s antitijelima. Supstrat se ocijedi i u epruvetu se unesu antitijela protiv istog antigena. Ta su antitijela obilježena enzimom, najčešće krom peroksidazom. Označena antitijela se vežu za prethodni kompleks i također ostaju na stijenkama epruvete. Sadržaj epruvete zamjenjuje se mješavinom kromogena (ortofenilendiamina) sa supstratom za ovaj enzim - H 2 0 2 . Ako je u ispitivanoj tekućini bio željeni antigen, enzim se fiksira na stijenkama epruvete, razgrađuje H 2 0 2: oslobođeni kisik obojit će kromogen u žuto.

Wannier metoda uključuje korištenje fotoelektričnog nefelometra za računanje taloženja, s kojim se bilježi promjena optičke gustoće seruma nakon dodatka antigena. Kada se serum razrijedi destiliranom vodom, optička gustoća se smanjuje. Ako u serumu ima antitijela, a kao razrjeđivač, vodena otopina antigena, tada će krivulja promjena optičke gustoće biti drugačija. Najprije dolazi do smanjenja optičke gustoće, nakupljanjem dovoljne količine antigena, smanjenje prestaje, zatim se uočava povećanje optičke gustoće mješavine antigen-antitijelo.

Fenomen lize- sposobnost nekih antitijela da rastvaraju stanice protiv kojih su nastala. Ova antitijela u odnosu na bakterije nazivaju se bakteriolizini, na eritrocite - eritrolizini ili hemolizini. Za reakcije imunološke lize karakteristično je da se ne javljaju u prisutnosti samo dva sastojka – antigena i antitijela. Treća komponenta, koja se naziva komplement, mora biti prisutna. U različitim količinama, komplement je sadržan u krvnom serumu mnogih životinja; osobito mnogo toga u krvnom serumu zamorci. U početku se reakcija odvija prema vrsti aglutinacije, zatim se kompleksu antigen-antitijelo pridružuje komplement i dolazi do lokalnog otapanja membrane bakterija, eritrocita ili drugih stanica.

Fenomen citotoksičnosti određuju protutijela koja se nazivaju citotoksini. Njihovo djelovanje leži u činjenici da pokazuju toksični učinak, lišavajući stanice vitalnosti. Reakciju za otkrivanje citotoksina staviti sa suspenzijom stanica u izotoničnoj puferskoj otopini natrijevog klorida. Dodaje im se boja, na primjer, eozin ili tripan plava. Žive stanice nisu obojene, mrtve stanice brzo percipiraju boju (unutar 30 s). Ako se staničnoj suspenziji doda imunološki serum koji sadrži citotoksine i komplement, stanice će umrijeti i postati obojene kada se testiraju bojama. Postotak mrtvih stanica pokazuje količinu citotoksina u krvnom serumu. Reakcija zahtijeva obaveznu prisutnost komplementa.

Reakcija vezanja komplementa (CFR) temelji se na gore opisanom svojstvu komplementa da se pridruži kompleksu antigen-antitijelo. Točnije, komplement je fiksiran na posebnom dijelu teškog lanca molekule antitijela. Međutim, ovo mjesto postaje dostupno tek nakon što se antitijelo pričvrsti za antigen. Nakon povezivanja s jednim kompleksom antigen-protutijelo, komplement ne može prijeći na drugi kompleks uveden u reakcijski sustav nakon interakcije prvog kompleksa i komplementa dodanog u poznatoj količini. Kao drugi kompleks obično se koristi tzv. hemolitički sustav - mješavina eritrocita ovna s protutijelima protiv njih. Ako je prvi kompleks kompleks antigen-antitijelo, tada u reakcijskoj smjesi neće biti slobodnog komplementa; neće doći do hemolize eritrocita. Naprotiv, ako nema antitijela na antigene koji se koriste u ispitivanom materijalu (na primjer, u krvnom serumu), tada će komplement ostati slobodan i osigurati hemolizu eritrocita. RSK se koristi u dijagnostici sifilisa (Wassermanova reakcija), studijama antitkivnih antitijela i autoantitijela; naširoko se koristi u dijagnostici niza virusnih infekcija.

Fenomen specifičnog kašnjenjačesto se koristi za usporedbu dva antigena koja se proučavaju. Na primjer, imuni serumi se pripremaju protiv eritrocita miša. Da bi se utvrdilo sadrži li antitijela protiv eritrocita srodne životinjske vrste (štakora), serum se tretira eritrocitima štakora. Ako se razina antitijela u serumu smanji, onda postoje srodni antigeni, ako potpuno padne, onda su antigeni identični. Uz pomoć ove reakcije, mnogi srodni antigeni i hapteni su analizirani na identičnost ili neidentičnost.

Reakcija neutralizacije toksina. Antitoksinima se nazivaju protutijela protiv bakterijskih i nekih drugih (na primjer, zmijskog otrova) toksina antigene prirode. Antitoksini, u kombinaciji s odgovarajućim otrovnim tvarima, neutraliziraju ih. Stupanj neutralizacije može se uzeti u obzir davanjem mješavine toksina i antitoksina osjetljivoj životinji. Količina antitoksina u imunološkom serumu karakterizirana je brojem minimalnih letalnih doza toksina koje može neutralizirati određena količina seruma. Reakcija neutralizacije koristi se za određivanje koncentracije toksina uzročnika difterije, tetanusa itd. Za to se koriste standardizirani antitoksični serumi.

Fenomen opsonizacije sastoji se u činjenici da protutijela pojačavaju fagocitnu aktivnost neutrofila i makrofaga u odnosu na one antigene tvari ili mikroorganizme protiv kojih su dobiveni. Na primjer, aktivnost fagocita protiv stafilokoka značajno se pojačava ako se leukociti ili donor leukocita tretiraju antistafilokoknim serumom. To je djelovanje bilo povezano s prisutnošću specifičnih protutijela na opsonin. Međutim, treba imati na umu da nema posebnih antitijela opsonina, hemolizina, bakteriolizina ili precipitina. To su samo manifestacije glavne funkcije molekula imunoglobulina da daju specifičan kompleks antigen-antitijelo.

D. Sivi vodi dobar primjer jedinstvo i raznolikost ove funkcije. Protutijela pripremljena protiv pneumokoknog polisaharida tipa I mogu:

1) izazvati aglutinaciju pneumokoka tipa I i oticanje njihove kapsule;

2) izazvati taloženje topljivog ekstrakta iz pneumokoka tipa I;

3) priložiti komplement, tj. pružiti RSK;

4) da ima opsonizirajuće djelovanje na leukocite protiv pneumokoka tipa I;

5) provodi specifičnu zaštitu životinja od pneumokokne infekcije.

Unatoč tome, u raznim specifičnim eksperimentalnim ili kliničkim situacijama prednost se daje specifičnim reakcijama antigen-protutijelo. Prilikom dijagnosticiranja trbušni tifus koristiti Vidalovu reakciju - aglutinaciju bakterija, za analizu antigenskih komponenti složenih bioloških tekućina ili ekstrakata tkiva - reakcije taloženja u agaru u obliku imunodifuzije ili imunoelektroforeze. Pri radu s toksinima i mnogim topivim antigenima koriste se metode pasivna hemaglutinacija. Za određivanje razine hormona u krvi najprikladnija je radioimunološka metoda, itd. Različite klase imunoglobulina na različite načine pokazuju funkciju spajanja s antigenom.

Načelo kontra imunoelektroforeza(VIEF) sastoji se u istovremenom kretanju antigena i antitijela jednih prema drugima u gelu pod utjecajem električne struje.

Kao rezultat njihove specifične interakcije nastaje linija taloga. Metoda kombinira jednostavnost reakcije difuznog taloženja u gelu s visokom rezolucijom elektroforeze. Iako je ova metoda inferiorna u osjetljivosti na metodu fluorescentnih protutijela i reakcije neizravna hemaglutinacija, međutim, ne zahtijeva luminescentna protutijela, luminescentni mikroskop i eritrocitni dijagnostikum.

WIEF je kvalitativna metoda. Vrlo je specifičan i jednostavan za implementaciju. Može se koristiti za otkrivanje bakterijskih ili virusnih antigena u patološkom materijalu, organima laboratorijskih (bioloških) životinja ili objektima iz okoliša.

Materijali i oprema. 1. Agaroza A i B. 2. 0,05 M medinal-HCl pufer (pH 8,6). 3. Natrijev klorid. 4. Disupstituirani natrijev fosfat. 5. Kalijev fosfat monosupstituirani. 6. Kalijev klorid. 7. Amonijev oksalat. 8. Specifični bakterijski ili virusni antigen. 9. Kamera za elektroforezu. 10. Istosmjerni ispravljač 50 mA. 11. Električni termostat za suhi zrak. 12. Stolna laboratorijska centrifuga.

Tehnika postavljanja. Na staklenu ploču, postavljenu vodoravno, izlije se 30 ml rastaljene 1% agaroze, pripremljene u Medinal - HCl puferu (pH 8,6). Nakon što se gel stvrdne, bušilicom se izrezuju dva dvostruka reda rupa promjera 5 mm (8 rupa u svakom redu); udaljenost između dupli redovi je 30 mm. Gel se ukloni iz jažica, skupi u epruvetu, otopi na plamenu plamenika i pomoću Pasteurove pipete prenese na dno jažica.

Sa strane katode stavlja se ispitivani materijal, a sa strane anode - monospecifični serum, ali bolje monoklonska antitijela (MAB) u volumenu od 0,035 ml. Na primjer, za otkrivanje pneumokoka - antapneumokokni serum, za otkrivanje antigena virusa influence - antiinfluenca itd.

Ploča se postavlja u komoru za elektroforezu na takav način da pjena koja se koristi kao spojni most između puferskog sustava i nosivog gela dodiruje potonji. Elektroforeza se provodi na sobnoj temperaturi pri naponu od 140...150 V i struji od 35 mA tijekom 18...35 minuta.

Kontrolirati. Proučavanje materijala u VIEF-u za prisutnost specifičnog antigena treba biti popraćeno kontrolom s poznatim pozitivnim materijalom.

Detekcija uzročnika u kombinaciji VIEF s uzgojem. Za sjetvu kontaminiranog materijala treba koristiti selektivne medije.

Nakon 36-satne inkubacije na 37 °C, 0,3 ml 0,85% otopina NaCl s 4% formalinom napravi se ispiranje koje se usisava u epruvetu i nakon izlaganja od 1 sata pregledava na VIEF-u.

Računovodstvo za rezultate. Na pozitivan rezultat između jažice s ispitivanim materijalom i jažice sa specifičnim serumom pojavljuje se preschitata linija. Linija precipitata, ovisno o količini antigena u ispitivanom materijalu, može se nalaziti ili na sredini udaljenosti između jažica ili bliže spremniku seruma.

Obično se linije taloga formiraju 18-35 minuta nakon početka elektroforeze.

Ako pronađete grešku, označite dio teksta i kliknite Ctrl+Enter.