Temelji se na činjenici da eritrociti, na kojima su prethodno adsorbirani antigeni, stječu sposobnost aglutinacije u prisutnosti homolognih seruma (protutijela).

U ovom slučaju eritrociti igraju ulogu nosača sa specifičnim determinantama, čija se aglutinacija javlja kao rezultat reakcije antigen + antitijelo.

Eritrociti, za čiju su površinu čvrsto vezani antigeni, nazivaju se eritrocitni antigenski dijagnostikum ili eritrociti senzibilizirani antigenom.

Drugi tip RNHA - antitijela adsorbira se na površini eritrocita i njihova naknadna aglutinacija se događa u prisustvu homolognog antigena. U tom slučaju se takvi eritrociti nazivaju dijagnostikum eritrocitnih antitijela, odnosno eritrociti senzibilizirani antitijelima.

Na temelju ova dva temeljna metodološka pristupa razvijene su i koriste se mnoge modifikacije RNGA. Dakle, kao nosači se koriste male standardne čestice lateksa. U tom slučaju, reakcija se naziva reakcija lateks aglutinacije (RLA) ili se koristi Staphylococcus aureus- reakcija koaglutinacije, itd. Obično se dijagnostikumi eritrocita pripremaju u poduzećima biološke industrije, a glavno iskustvo RNGA već je instalirano u dijagnostičkim laboratorijima.

Priprema dijagnostikuma eritrocita uključuje sljedeće korake:

fiksacija eritrocita formaldehidom ili glutarnim ili akrilnim aldehidima. Tako obrađeni eritrociti se dugo čuvaju. Češće se u tu svrhu koriste eritrociti ovaca, ljudi, kokoši itd.;
tretiranje fiksiranih eritrocita otopinom tanina. Kao rezultat toga, eritrociti stječu svojstvo nepovratne adsorpcije proteina (virusa i antitijela) na svojoj površini;
senzibilizacija taniziranih eritrocita virusima ili antitijelima.

Valja napomenuti da su metode pripreme eritrocitnih dijagnostikuma za virusne infekcije drugačiji.

Tehnika postavljanja RNHA za otkrivanje i određivanje titra protutijela je sljedeća:

uzastopnim 2-strukim razrjeđenjima seruma dodati jednake doze eritrocita senzibiliziranih antigenom;
smjesa se ostavi 2-3 sata na sobnoj temperaturi ili 16-18 sati na 4 °C;
uzeti u obzir rezultate. Ako serum sadrži antitijela na virus kojim su eritrociti senzibilizirani, uočava se hemaglutinacija, koja se procjenjuje u križevima.

Titar antitijela u serumu uzima se kao najveće razrjeđenje seruma koje još osigurava hemaglutinaciju s najmanje dva križanja.

RNGA je popraćena svim relevantnim kontrolama. Obično postavljaju reakciju mikrometodom.

RNHA omogućuje rješavanje sljedećih dijagnostičkih zadataka:

otkriti protutijela i odrediti njihov titar u krvnom serumu poznatim eritrocitnim antigenskim dijagnostikumom;
otkriti i identificirati nepoznati virus pomoću poznatog dijagnostikuma antitijela na eritrocite.

Prednosti RNGA: visoka osjetljivost, jednostavnost tehnike postavljanja i brz odziv. Međutim, važno je napomenuti da postoje velike poteškoće u izradi stabilnih eritrocitnih dijagnostikuma (velika ovisnost o čistoći korištenih komponenti, potreba odabira načina fiksacije, tanizacija i senzibilizacija eritrocita za svaki tip virusa) .

RTGA princip sastoji se u tome da se u epruveti pomiješaju jednaki volumeni krvnog seruma i suspenzije virusa, te se nakon izlaganja utvrđuje da li je virus sačuvan u smjesi dodavanjem suspenzije eritrocita. Aglutinacija eritrocita ukazuje na prisutnost, a odsutnost hemaglutinacije na odsutnost virusa u smjesi. Nestanak virusa iz mješavine virusa i seruma smatra se znakom interakcije seruma i virusnih protutijela.

Ali protutijela stupaju u interakciju s antigenima u strogo određenim kvantitativnim omjerima. Dakle, da bi određena količina virusa bila lišena sposobnosti hemaglutinacije, potreban je određeni minimum antitijela, a kako je jedna od komponenti RTHA uvijek nepoznata, potrebno je reakciju staviti u niz epruveta. s različitim dozama protutijela i istim dozama virusa, ili obrnuto. To se postiže uzimanjem različitih razrjeđenja seruma i istog razrjeđenja virusa ili različitih razrjeđenja virusa i istog razrjeđenja seruma.

RTGA vam omogućuje rješavanje sljedećih zadataka: određivanje titra antitijela na hemaglutinirajući virus u serumu; identificirati nepoznati hemaglutinirajući virus iz poznatih seruma; utvrditi stupanj antigenske povezanosti dvaju virusa.

Prednosti RTGA: jednostavnost tehnike, brzina, nije potreban sterilan rad, specifičnost, niska cijena. Nedostatak: RTGA je moguća samo kod hemaglutinirajućih virusa.

Princip titracije antitijela u RTGA sastoji se od sljedećeg:

- pripremite niz uzastopnih (obično dvostrukih) razrjeđenja testnog seruma u jednakim volumenima (obično 0,25 ili 0,2 ml);

– svakom razrjeđenju dodajte iste volumene homolognog virusa u titru od 4 HAU;

- smjese izdržati Određeno vrijeme na određenoj temperaturi (za virus newcastleske bolesti 40-60 minuta na sobnoj temperaturi);

– u sve smjese dodaju se jednaki volumeni 1%-tne suspenzije ispranih eritrocita;

- nakon izlaganja, hemaglutinacija u svakoj smjesi se procjenjuje u križićima.

Reakcija uključuje kontrole seruma, virusa i eritrocita.

To najveće razrjeđenje seruma, koje još uvijek potpuno inhibira hemaglutinaciju, uzima se kao pokazatelj titra antitijela u ovom serumu.

Upotreba hemadsorpcijske reakcije u virologiji.

RGad. Hemadsorpciju - vezu eritrocita s površinom stanica zahvaćenih virusom - prvi su otkrili Vogel i Shchelokov (1957.) na kulturi tkiva zaraženoj virusom influence. Ovaj fenomen temelji se na afinitetu receptora virusa koji se nalaze na površini zahvaćene stanice s receptorima eritrocita, što dovodi do njihovog međusobnog povezivanja slično reakciji hemaglutinacije. Prednost ove reakcije je što postaje pozitivna i prije nego što se pojave izrazite citopatske promjene u inficiranim stanicama.

RGAd metodologija sastoji se od sljedećeg. Trećeg do četvrtog dana nakon infekcije stanica uzimaju se dvije epruvete s istom staničnom kulturom, od kojih je jedna zaražena materijalom koji sadrži virus, a druga je kontrolna. Tekućina kulture se iscijedi iz obje epruvete i u obje epruvete se dodaju 2-3 kapi 0,5% suspenzije ispranih eritrocita. Obje epruvete se ostave 5-10 minuta da eritrociti budu na površini stanica (postavljene vodoravno na stol), a zatim se malo isperu fiziološkom otopinom i pregledaju pod mikroskopom (malo povećanje). U kontrolnoj epruveti eritrociti su potpuno uklonjeni fiziološkom otopinom, a dio preostalih pluta s tekućinom. Ako se eritrociti u zaraženoj epruveti ne uklone fiziološkom otopinom i ne plutaju, već su pričvršćeni na površinu stanica, RHAd treba smatrati pozitivnim.

Ovisno o virusu i vrsti stanica, raspored crvenih krvnih stanica može biti trostruk:

- eritrociti se adsorbiraju samo na periferiji sloja stanica u obliku "ogrlice" (virus afričke svinjske kuge);

- eritrociti se nalaze na sloju stanica u žarištima ili nakupinama (virus influence);

- eritrociti su difuzno smješteni na sloju stanica (virus parainfluence).

Svaki virus može adsorbirati crvena krvna zrnca određene životinjske vrste.

Serološka dijagnostika virusnih bolesti povećanjem titra protutijela u uparenim krvnim serumima.

Reakcija hemaglutinacije (RGA) i reakcija inhibicije hemaglutinacije (HITA), mehanizam, komponente i primjena reakcija.

Osnova reakcije hemaglutinacije je pojava aglutinacije eritrocita koja nastaje pod utjecajem razni faktori. Razlikovati izravnu i neizravnu hemaglutinaciju.

Prvo se eritrociti isperu izotoničnom otopinom natrijevog klorida, zatim, ako je potrebno (kada se koriste antigeni proteinske prirode), tretiraju se otopinom tanina 1: 20 000 i senzibiliziraju topivim antigenima. Nakon ispiranja puferiranom izotoničnom otopinom natrijevog klorida, eritrocitni antigen je spreman za upotrebu.

Testirani se serumi razrjeđuju izotoničnom otopinom natrijevog klorida u epruvetama ili posebnim plastičnim pločicama s rupicama, zatim se u svako razrjeđenje seruma dodaje eritrocitni dijagnostikum. Rezultati reakcije neizravna hemaglutinacija uzimaju se u obzir prirodom sedimenta eritrocita formiranog na dnu epruvete. Pozitivnim se smatra rezultat reakcije u kojem eritrociti ravnomjerno pokrivaju cijelo dno epruvete. S negativnom reakcijom, crvene krvne stanice u obliku malog diska ili "gumba" nalaze se u središtu dna epruvete.

Glavne komponente RP-a:

A) topljivi antigen

B) Specifična antitijela (serum)

(RTGA) je metoda za identifikaciju virusa ili detekciju antivirusnih protutijela u krvnom serumu bolesnika, koja se temelji na fenomenu izostanka aglutinacije eritrocita lijekom koji sadrži virus u prisutnosti krvnog seruma imunog na njega.
temelji se na blokadi, supresiji antigena virusa protutijelima imunološkog seruma, uslijed čega virusi gube sposobnost aglutinacije crvenih krvnih stanica.

RTHA se koristi za dijagnosticiranje mnogih virusnih bolesti, čiji uzročnici (gripa, ospice, rubeola, krpeljni encefalitis itd.) mogu aglutinirati eritrocite različitih životinja.
Mehanizam. Tipizacija virusa provodi se u testu inhibicije hemaglutinacije (HITA) sa setom seruma specifičnih za tip. Rezultati reakcije uzimaju se u obzir odsutnošću hemaglutinacije. Podtipovi virusa A s antigenima H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 itd.

mogu se razlikovati u RTGA sa skupom homolognih seruma specifičnih za tip.

U srži reakcije hemaglutinacije leži fenomen aglutinacije eritrocita, koji se javlja pod utjecajem različitih čimbenika.

Razlikovati izravnu i neizravnu hemaglutinaciju.
U reakciji izravne hemaglutinacije eritrociti se lijepe zajedno kada se na njih adsorbiraju određeni antigeni, poput virusa.
U serološkim studijama koristi se izravna reakcija inhibicije hemaglutinacije, kada se virus izoliran od bolesnika neutralizira specifičnim imunološkim serumom, a zatim kombinira s crvenim krvnim stanicama.

Odsutnost hemaglutinacije ukazuje na korespondenciju virusa i korištenog imunološkog seruma.

Reakcija neizravne hemaglutinacije (pasivna hemaglutinacija) uočava se kada se eritrocitima prethodno tretiranim (senzibiliziranim) različitim antigenima doda imunološki serum ili serum bolesnika koji ima odgovarajuća antitijela.

Postoji specifično vezivanje eritrocita, njihova pasivna hemaglutinacija.

Reakcija neizravne ili pasivne hemaglutinacije superiornija je po osjetljivosti i specifičnosti u odnosu na druge serološke metode, a koristi se u dijagnostici infekcija uzrokovanih bakterijama, rikecijama i protozoama.

Metoda postavljanja reakcije neizravne hemaglutinacije sastoji se od nekoliko faza.

Nakon ispiranja puferiranom izotoničnom otopinom natrijevog klorida, eritrocitni antigen je spreman za upotrebu. Testirani se serumi razrjeđuju izotoničnom otopinom natrijevog klorida u epruvetama ili posebnim plastičnim pločicama s rupicama, zatim se u svako razrjeđenje seruma dodaje eritrocitni dijagnostikum.

Rezultati reakcije neizravne hemaglutinacije uzimaju se u obzir prirodom sedimenta eritrocita formiranog na dnu epruvete. Pozitivnim se smatra rezultat reakcije u kojem eritrociti ravnomjerno pokrivaju cijelo dno epruvete. S negativnom reakcijom, eritrociti u obliku malog diska ili "gumba" nalaze se u središtu dna epruvete.

Reakcija inhibicije hemaglutinacije- serološka reakcija koja se temelji na sposobnosti protutijela da spriječe aglutinaciju eritrocita hemaglutinirajućim vrstama virusa (adenovirusi, arbovirusi, neki enterovirusi, virusi influence i parainfluence, ospica, reovirusi).

Specifična antivirusna protutijela stupaju u interakciju s površinskim molekulama hemaglutinina viriona ovih virusa i blokiraju njihovo vezanje na komplementarne molekule membrane eritrocita.

U U zadnje vrijeme reakcija se široko koristi u laboratorijima kliničke virologije za određivanje titra specifičnih protutijela na pojedine viruse, kao i za serološku identifikaciju i tipizaciju izolata virusa iz kliničkog materijala bolesnika.

Primjena je donekle ograničena zbog prisutnosti u krvnom serumu ljudi nespecifičnih inhibitora virusa, kao i prirodnih protutijela - aglutinina.

Reakcija neutralizacije – reakcija inhibicije hemaglutinacije (RTGA).

RTGA se primjenjuje:
-za serotipizaciju virusa;
- za serodijagnostiku infekcija.
Postoje dva načina postavljanja:
- metoda kapanja na staklo ( orijentacijska reakcija), koristi se za serokopiranje virusa;
- raspoređeni u epruvetama.

Mehanizam.

Neki virusi (npr. gripe) imaju hemaglutinin, koji uzrokuje aglutinaciju eritrocita raznih životinja, ovisno o vrsti virusa.

U prisutnosti antitijela u serumu - antihemaglutinina, uočava se inhibicija aktivnosti virusa.
RTGA.
Svrha: serotipizacija virusa influence A

Komponente:
1. Materijal koji se proučava je alantoisna tekućina pilećeg embrija,
2. Dijagnostički serumi specifični za influencu,
3. 5% suspenzija eritrocita kokoši.
4.

Fiziološka otopina.

Reakcija se stavlja na staklo metodom kapanja. Na staklo se nanese 1 kap dijagnostičkog seruma i ispitivanog materijala, promiješa, zatim se doda 1 kap suspenzije eritrocita. S pozitivnom reakcijom uočava se homogeno crvenilo, a s negativnom reakcijom pojavljuju se crvene ljuskice (hemaglutinacija).

Prethodna31323334353637383940414243444546Sljedeća

karakteristike virusa influence. Epidemiologija i dijagnostika gripe. Upotreba RTGA za serotipizaciju virusa influence. Pripravci za specifičnu profilaksu i liječenje.

Gripa ili influenca - akutna infekcija karakteriziran lezijama sluznice gornjeg dišni put, groznica, opća intoksikacija, poremećaji kardiovaskularnog i živčanog sustava.

Gripu karakterizira tendencija epidemijskog i pandemijskog širenja zbog visoke zaraznosti i varijabilnosti uzročnika.

karakteristike patogena. Patogeni - virusi influence pripadaju obitelji. Orthomyxoviridae, rodovi Influenzavirus A, B i Influenzavirus C. Virusi influence su RNA virusi. Virus gripe tipa A izolirali su 1933. W. Smith, K. Andrews, P. Laidlaw. Godine 1940. T.

Primjena metode hemaglutinacije u virologiji.

Francis i R. Medzhill izolirali su viruse gripe tipa B, 1949. R. Taylor - tip C. U Rusiji je prve viruse influence izolirao 1936. A. A. Smorodintsev i svrstao ih u tip A. Morfologija. Virusi influence imaju sferni oblik (oblik lopte) - 80 - 120 nm, rjeđe imaju filamentni oblik. Sastoje se od: 1) jezgre - nukleokapside spiralnog tipa simetrije (jednolančani linearni "-" -lanac RNK + proteinski kapsid); 2) bazalna membrana- vanjska lipoproteinska ovojnica - superkapsida.

Na površini membrane postoje glikoproteini (u obliku šiljaka i resica) 2 vrste: 1) hemaglutinin - potiče vezanje na stanične receptore; 2) neuraminidaza - potiče oslobađanje virusa iz stanice. Uzgoj. Za uzgoj se koriste pileći embriji, primarne tripsinizirane stanične kulture, a ponekad i laboratorijske životinje.

Najprikladniji model su pileći embriji 10-12 - star dan. Omogućuje vam dobivanje velikih količina virusa, što je neophodno u proizvodnji cjepiva i bakterijskih pripravaka.

Infekcija se odvija u alontoičkoj šupljini, na korion-alontoičkoj membrani, u amnionskoj šupljini, u amnionu. Prisutnost virusa u pilećem embriju otkriva se testom hemaglutinacije. Antigenska struktura. Virusi imaju unutarnji antigen – S i površinske antigene: HA-hemaglutinin i NA-neuraminidazu. S-antigen - specifičan za skupinu, zajednički za cijeli tip, prema ovom antigenu virusi influence podijeljeni su u tipove A, B i C. Ovo je stabilan (nepromjenjiv) antigen za fiksiranje komplementa.

Antigeni HA i NA su specifični antigeni. HA antigen uzrokuje stvaranje virusneutralizirajućih protutijela i aglutinaciju eritrocita.

Antigen NA uzrokuje stvaranje protutijela koja djelomično neutraliziraju viruse.

Virus tipa B manje je varijabilan, dok je tip C vrlo stabilan.

toksična svojstva. Toksični učinak virusa na tijelo ( glavobolja, bol u mišićima, temperatura, kataralni fenomeni) posljedica je proteina virusa (sama virusna čestica). Ovo djelovanje je strogo specifično i neutralizira se samo imunološkim serumom odgovarajućeg tipa ili podtipa ili serumom oboljelih. otpornost. Virusi gripe osjetljivi su na UV zrake, sredstva za dezinfekciju (formalin, alkohol, fenol, kloramin) i otapala masti.

U tekućem mediju umiru na temperaturi od 50 - 60 ° C nekoliko minuta. Na sobnoj temperaturi u zraku virusi ostaju zarazni nekoliko sati. Dugo se čuvaju u osušenom obliku, au smrznutom stanju (-70 ° C) ne samo da dugo ostaju, već i ne gube virulentnost.

osjetljivost životinja. U prirodnim uvjetima virusi tipa A zaraze ljude i životinje (obolijevaju konji i svinje), dok virusi tipa B i C zaraze samo ljude. Od laboratorijskih životinja, bijeli miševi, afrički tvorovi, sirijski hrčci i majmuni osjetljivi su na viruse.

Bolest kod životinja karakterizira oštećenje pluća, povišena tjelesna temperatura i može dovesti do smrti životinja. Epidemiologija bolesti. Izvor infekcije je bolesna osoba s klinički izraženim ili asimptomatskim oblikom. Bolesna osoba prenosi virus okoliš kod kašljanja, razgovora, kihanja s kapljicama sline, sluzi, ispljuvka već u razdoblju inkubacije.

Bolesnik postaje zarazan 24 sata prije pojave glavnih simptoma i predstavlja epidemijsku opasnost unutar 48 sati nakon njihovog nestanka.

Mehanizam prijenosa je aerogeni. Put prijenosa je zrakom. Ljudska osjetljivost na gripu je vrlo visoka. Svi se razbole dobne skupine, uglavnom u zimsko vrijeme. Najosjetljivija su djeca i starije osobe. Naziv bolesti odražava značajke epidemiologije: gripa s francuskog jezika. hvataljka - zgrabiti, influenca - od tal. Influenza di freddo - utjecaj prehlade.

Od svih oštrih bolesti dišnog sustava gripa je najraširenija i ozbiljna bolest. Pandemije i epidemije gripe zahvaćaju do 30-50% ili više stanovništva globus nanoseći ogromne štete zdravlju i gospodarstvu zemalja. Prvi opisi epidemija gripe datiraju iz 12.-14. stoljeća. Pojavu pandemija i većih epidemija uzrokuje virus influence tipa A, koji je zbog velike varijabilnosti virusa povezan s pojavom novog podtipa kao posljedice antigenskog pomaka.

Između pandemija, epidemije se javljaju svake 1,5-2 godine, što je povezano s antigenskim driftom virusa. Godine 1918. pandemiju španjolske gripe (1,5 milijarda ljudi oboljelo, 20 milijuna ljudi umrlo) izazvala je virus influence A1. Prvenstveno registrirana u Španjolskoj, ova je pandemija zahvatila gotovo cjelokupno stanovništvo Zemlje; bolest je karakterizirana razvojem iznimno teške hemoragične pneumonije s rekordnom stopom smrtnosti (do 1% svih slučajeva).

Godine 1957. "azijsku" pandemiju (oboljelo je 2 milijarde ljudi) uzrokovao je novi podtip - podtip A2. Godine 1968. pandemiju "Hong Konga" (1 milijarda ljudi oboljelo) uzrokovao je novonastali podtip - podtip A3. Obično, nova verzija virusa istiskuje prethodno cirkulirajuću varijantu iz ljudske populacije.

Ali 1977. godine, nakon 20 godina pauze, tip A1 se neočekivano "vratio", što je dovelo do velike epidemije. Posljedično, potisnute varijante virusa influence opstaju iu određenim vremenskim razmacima mogu ponovno izazvati epidemiju. Virus tipa B uzrokuje lokalne epidemije, dok tip C ne uzrokuje epidemije. Patogeneza i klinika bolesti. Ulazna vrata su gornji dišni putevi. Virus prodire u epitelne stanice sluznice i u njima se razmnožava.

Utjecaj virusa na epitelne stanice uzrokuje njihovu nekrozu i deskvamaciju (odbacivanje) epitela, uslijed čega sluznica postaje propusna za viruse i bakterije. Prodiru u krv i šire se po cijelom tijelu.“ Viremiju prate višestruke lezije endotela kapilara s povećanjem njihove propusnosti.

U teški slučajevi postoje opsežna krvarenja u plućima, miokardu, parenhimskim organima. Produkti raspadanja oštećenih stanica i virusni proteini imaju toksični učinak na razne organe i organske sustave. Toksini virusa snažno deprimiraju središnji živčani sustav, i iako proces ne traje dugo (3-5 dana), bolesna osoba ostaje dugo oslabljena, a svaka sekundarna infekcija pridružuje se oslabljenom tijelu i nastaju komplikacije: gripozna upala pluća. , akutni plućni edem, oštećenje bubrega, srca, bronha.

Česta komplikacija gripe bakterijska upala pluća(streptokoki skupine B). Tijekom pandemije španjolske gripe ljudi su uglavnom umirali od sekundarne bakterijske upale pluća.

U patogenezi gripe važna je ne samo intoksikacija, već i alergija, kao i kršenje funkcionalnih svojstava imunokompetentnih stanica s razvojem imunodeficijencije. Trajanje inkubacije- nekoliko sati - 1-3 dana. Karakterizira ga akutni početak, porast temperature na 37,5 - 38 ° C, opća intoksikacija izraženo u malaksalosti, glavobolji, bolovima u očne jabučice, upalni procesi dišnog trakta različite težine (rinitis, laringitis, traheitis, faringitis).

Grozničavo stanje kod gripe bez komplikacija traje 5-6 dana. Imunitet. Nakon bolesti stvara se tipspecifična i sojospecifična imunost koju osiguravaju specifični i nespecifični stanični i humoralni čimbenici. Velika važnost imaju antitijela Ig A. Ne razvija se unakrsna imunost, nakon preboljele gripe tipa A1, može se dobiti gripa tipa A2 itd. Nakon virusa tipa imunitet - 1-2 godine, nakon virusa tipa B - 3-5 godina.

Pasivna prirodna imunost - kod djece do 8 - 11 mjeseci. Zbog visoke antigenske varijabilnosti virusa, oporavak ne dovodi do razvoja postojanog imuniteta na ponovnu infekciju.

Laboratorijska dijagnostika. Materijal koji se proučava: razmazi-otisci nosne sluznice, nazofaringealni iscjedak, komadići pluća, mozak u slučaju smrtnog ishoda.

Dijagnostičke metode: 1) metoda citorinoskopije - otkrivanje intracelularnih inkluzija specifičnih za virus - kod bojenja pioktaninom pod mikroskopom vidljive su svijetlo crvene inkluzije virusa influence u stanicama cilijarnog epitela; 2) virusološka metoda- izolacija virusa influence iz ljudskog tijela inficiranjem pilećih embrija ispiranjem iz nazofarinksa pacijenta; indikacija (prisutnost) virusa provodi se pomoću RGA (virusi influence aglutiniraju eritrocite ljudi i raznih životinja), identifikacija virusa se provodi u fazama: tip se određuje u RSC, podtip hemaglutinina se određuje u RTGA, a podtip neuraminidaze se određuje u reakciji inhibicije aktivnosti enzima; 3) serološka metoda - detekcija porasta titra (4 puta) specifičnih protutijela u krvnom serumu bolesnika pomoću RSK, RTGA, PH u kulturi stanica, reakcija taloženja u gelu, ELISA; 4) biološka metoda- intranazalna infekcija miševa - unošenje materijala u pluća pod eterskom anestezijom; miševi ugibaju nakon 2-3 dana od upale pluća; 5) ekspresna dijagnostika - otkrivanje virusnog antigena pomoću RIF-a.

Liječenje i prevencija.

Za prevenciju i liječenje u prvim danima bolesti koristi se humani leukocitni interferon (intranazalno). U ljekovite svrhe koristiti antivirusni lijekovi- rimantadin (influenca tipa A), adapromin, virazol i imunomodulatori - dibazol, prodigiosan, levomizol.

U teškim oblicima gripe, posebno u djece, koristi se donorski antiinfluenca imunoglobulin, kao i lijekovi - inhibitori staničnih proteaza (gordoks, kontrikal, aminokapronska kiselina).

Posebna prevencija. Koriste se sljedeći antivirusni lijekovi i imunomodulatori, kao i živa i inaktivirana cjepiva: 1) žive monocjepiva za oralnu primjenu - atenuirani sojevi trenutno cirkulirajućih virusa (A1, A3 i B); pokazuju najveću imunogenost; 2) cjepiva s cijelim virionom iz virulentnih sojeva inaktiviranih formaldehidom ili UV zrakama; 3) podjedinična cjepiva protiv gripe samo od površinskih antigena - HA i NA antigeni (imaju minimalnu reaktogenost).

Za dobivanje cjepiva, virusi se uzgajaju u pilećim embrijima iu kulturi stanica pilećih embrija.

Uvođenjem cjepiva stvara se lokalna i humoralna imunost. Cijepljenje se provodi u razdobljima najveće opasnosti od razvoja epidemija. Pogodniji je za mlade i starije osobe. Upotreba mrtvih cjepiva zahtijeva godišnju revakcinaciju; njihova učinkovitost ne prelazi 60-70%.

Jer Budući da se često uočavaju antigene varijacije uzročnika, skup antigena odgovarajućeg virusa za imunizaciju može se odrediti tek nakon početka epidemije.

Ulaznica 15.

Reakcija hemaglutinacije (RGA).

U laboratoriju se koriste dvije različite reakcije hemaglutinacije.

Prvi RGA odnosi se na serološke. U ovoj reakciji dolazi do aglutinacije eritrocita u interakciji s odgovarajućim protutijelima (hemaglutininima).

Reakcija se široko koristi za određivanje krvnih grupa.

Drugi RHA nije serološki. U njemu se ne uzrokuje aglutinacija eritrocita

protutijela, već posebne tvari koje stvaraju virusi. Na primjer, virus influence aglutinira kokošje eritrocite i zamorci, virus poliomijelitisa - ovčji eritrociti. Ova reakcija omogućuje procjenu prisutnosti određenog virusa u ispitivanom materijalu.

Reakcija se provodi u epruvetama ili na posebnim pločama s jažicama.

Materijal koji se ispituje na prisutnost virusa razrijedi se izotoničnom otopinom od 1:10 do 1:1280; 0,5 ml svakog razrjeđenja pomiješa se s jednakim volumenom 1-2% suspenzije eritrocita. U kontroli se 0,5 ml eritrocita pomiješa s 0,5 ml izotonične otopine. Epruvete se stave u termostat na 30 minuta, a ploče se ostave na sobnoj temperaturi 45 minuta.

Računovodstvo za rezultate. S pozitivnim rezultatom reakcije na dno epruvete ili jažice pada talog eritrocita s nazubljenim rubovima ("kišobran") koji pokriva cijelo dno jažice.

Reakcija inhibicije hemaglutinacije

Ako je rezultat negativan, eritrociti stvaraju gusti precipitat s glatkim rubovima ("gumb"). Isti talog bi trebao biti u kontroli.

Intenzitet reakcije izražava se znakovima "+". Titar virusa je maksimalno razrjeđenje materijala u kojem dolazi do aglutinacije.

Reakcija inhibicije hemaglutinacije

To je serološka reakcija u kojoj specifična antivirusna protutijela u interakciji s virusom (antigenom) neutraliziraju virus i oduzimaju mu sposobnost aglutinacije crvenih krvnih stanica, tj.

e. inhibiraju reakciju hemaglutinacije. Ova reakcija vam omogućuje određivanje vrste i vrste virusa.

Postavka reakcije. 0,25 ml antivirusni serum pomiješan s jednakim volumenom materijala koji sadrži virus. Smjesa se protrese i stavi u termostat 30 minuta, nakon čega se doda 0,5 ml 1-2% suspenzije eritrocita.

Računovodstvo za rezultate. Uz pravilnu postavku pokusa u kontroli seruma i eritrocita trebao bi se formirati "gumb" - nema faktora aglutinacije eritrocita; u antigenskoj kontroli nastaje "kišobran" - virus je izazvao aglutinaciju eritrocita.

Ako je serum homologan virusu koji se proučava, formira se "gumb" - serum je neutralizirao virus.

Reakcija neizravne hemaglutinacije

Reakcija neizravne (pasivne) hemaglutinacije (RIHA) temelji se na činjenici da eritrociti, ako se na njihovu površinu adsorbira topljivi antigen, stječu sposobnost aglutinacije u interakciji s protutijelima na adsorbirani antigen.

Postavka reakcije.

Serum se zagrijava 30 minuta na 56 ° C, razrijedi uzastopno u omjeru 1:10 - 1:1280 i ulije u epruvete ili jažice u 0,25 ml, gdje se zatim dodaju 2 kapi eritrocita s antigenima adsorbiranim na njima.

Kontrole: suspenzija eritrocita s antigenima adsorbiranim na njima s očito imunološkim serumom, suspenzija eritrocita s antigenima adsorbiranim na njima s normalnim serumom; suspenzija normalnih eritrocita s ispitivanim serumom.

U prvoj kontroli treba doći do aglutinacije, u drugoj i trećoj ne.

Kontrolna pitanja.

1. Što znači pozitivan RGA nalaz između eritrocita i ispitanog materijala na prisutnost virusa?

2. Hoće li doći do reakcije aglutinacije eritrocita ako im se doda virus i njegov odgovarajući serum?

Kako se zove reakcija koja otkriva ovu pojavu?

PRAKTIČNI RAD №12.

Reakcija vezanja komplementa.

Reakcija vezanja komplementa (RCT) temelji se na činjenici da specifični kompleks antigen-antitijelo uvijek adsorbira (veže) komplement na sebe.

Ova reakcija ima široku primjenu u identifikaciji antigena i serodijagnostici infekcija, posebice bolesti uzrokovanih spirohetama (Wassermannova reakcija), rikecijama i virusima.

PCS je složena serološka reakcija.

Uključuje komplement i dva sustava antigen-protutijelo. U biti, radi se o dvije serološke reakcije.

Desni bazični sustav sastoji se od antigena i antitijela (jedno poznato, drugo ne). Dodana mu je određena količina komplementa. Kada se antigen i antitijelo ovog sustava poklope, oni će se povezati i povezati kompliment. Nastali kompleks je fino raspršen i nije vidljiv.

Formiranje ovog kompleksa poznato je uz pomoć drugog hemolitičkog ili indikatorskog sustava.

Uključuje ovčje eritrocite (antigen) i njihov odgovarajući hemolitički serum (antitijela), tj. gotovi imunološki kompleks. U ovom sustavu do lize eritrocita može doći samo u prisutnosti komplementa. Ako je komplement vezan prvim sustavom, tada neće doći do hemolize u drugom sustavu;

bez slobodnog komplementa. Odsutnost hemolize (sadržaj u epruveti je zamućen ili se na dnu epruvete nalazi sediment eritrocita) bilježi se kao pozitivan rezultat RSK.

Ako u prvom sustavu antigen ne odgovara protutijelu, tada se imunološki kompleks ne formira i kompliment će ostati slobodan. Ostajući slobodan, kompliment sudjeluje u drugom sustavu, uzrokujući hemolizu, rezultat RSK je negativan (sadržaj epruveta je proziran - "lak krv").

Komponente, reakcije fiksacije komplementa:

Antigen - obično lizat, ekstrakt, hapten,

rjeđe suspenzija mikroorganizama.

2. Antitijela – serum bolesnika.

3. Komplement - serum zamorca.

Antigen – ovčji eritrociti.

5. Antitijelo – hemolizin na ovčje eritrocite.

6. Izotonična otopina.

S obzirom na to da RSC sudjeluje veliki broj složene komponente,

moraju se prethodno titrirati i unijeti u reakciju u točnim količinama i jednakim volumenima: 0,5 ili 0,25 ml, rjeđe 0,2,1,25 ili 1,0 ml (veći volumeni daju točniji rezultat). Titracija reakcijskih komponenata provodi se u istom volumenu kao i eksperiment, zamjenjujući sastojke koji nedostaju izotoničnom otopinom.

Povezane informacije:

Pretraživanje stranice:

Temelji se na činjenici da eritrociti, na kojima su prethodno adsorbirani antigeni, stječu sposobnost aglutinacije u prisutnosti homolognih seruma (protutijela).

U ovom slučaju eritrociti igraju ulogu nosača sa specifičnim determinantama, čija se aglutinacija javlja kao rezultat reakcije antigen + antitijelo.

Eritrociti, za čiju su površinu čvrsto vezani antigeni, nazivaju se eritrocitni antigenski dijagnostikum ili eritrociti senzibilizirani antigenom.

Drugi tip RNHA - antitijela adsorbira se na površini eritrocita i njihova naknadna aglutinacija se događa u prisustvu homolognog antigena.

U tom slučaju se takvi eritrociti nazivaju dijagnostikum eritrocitnih antitijela, odnosno eritrociti senzibilizirani antitijelima.

Na temelju ova dva temeljna metodološka pristupa razvijene su i koriste se mnoge modifikacije RNGA. Dakle, kao nosači se koriste male standardne čestice lateksa.

Reakcija inhibicije hemaglutinacije (HITA)

U ovom slučaju, reakcija se naziva reakcija lateks aglutinacije (RLA) ili se koristi Staphylococcus aureus - reakcija koaglutinacije, itd. Obično se dijagnostikumi eritrocita pripremaju u poduzećima biološke industrije, a glavno iskustvo RNGA već je postavljeno u dijagnostičkim laboratorijima.

Priprema dijagnostikuma eritrocita uključuje sljedeće korake:

fiksacija eritrocita formaldehidom ili glutarnim ili akrilnim aldehidima.
Tako obrađeni eritrociti se dugo čuvaju. Češće se u tu svrhu koriste eritrociti ovaca, ljudi, kokoši itd.;
tretiranje fiksiranih eritrocita otopinom tanina. Kao rezultat toga, eritrociti stječu svojstvo nepovratne adsorpcije proteina (virusa i antitijela) na svojoj površini;
senzibilizacija taniziranih eritrocita virusima ili antitijelima.

Treba napomenuti da su metode pripreme eritrocitnih dijagnostikuma za virusne infekcije različite.

Tehnika postavljanja RNHA za otkrivanje i određivanje titra protutijela je sljedeća:

uzastopnim 2-strukim razrjeđenjima seruma dodati jednake doze eritrocita senzibiliziranih antigenom;
smjesa se ostavi 2-3 sata na sobnoj temperaturi ili 16-18 sati na 4 °C;
uzeti u obzir rezultate.
Ako serum sadrži antitijela na virus kojim su eritrociti senzibilizirani, uočava se hemaglutinacija, koja se procjenjuje u križevima.

Titar antitijela u serumu uzima se kao najveće razrjeđenje seruma koje još osigurava hemaglutinaciju s najmanje dva križanja.

RNGA je popraćena svim relevantnim kontrolama. Obično postavljaju reakciju mikrometodom.

RNHA omogućuje rješavanje sljedećih dijagnostičkih zadataka:

otkriti protutijela i odrediti njihov titar u krvnom serumu poznatim eritrocitnim antigenskim dijagnostikumom;
otkriti i identificirati nepoznati virus pomoću poznatog dijagnostikuma antitijela na eritrocite.

Prednosti RNGA: visoka osjetljivost, jednostavnost tehnike postavljanja i brz odziv.

Međutim, važno je napomenuti da postoje velike poteškoće u izradi stabilnih eritrocitnih dijagnostikuma (velika ovisnost o čistoći korištenih komponenti, potreba odabira načina fiksacije, tanizacija i senzibilizacija eritrocita za svaki tip virusa) .

Ako pronađete pogrešku, odaberite dio teksta i pritisnite Ctrl+Enter.

U kontaktu s

Kolege

Koristi eritrocite ili neutralne sintetske materijale (primjerice, čestice lateksa), na čijoj su površini adsorbirani antigeni (bakterijski, virusni, tkivni) ili antitijela.

Njihova aglutinacija nastaje kada se dodaju odgovarajući serumi ili antigeni. RBC senzibilizirani antigenima nazivaju se antigenski dijagnostikum eritrocita i koriste se za otkrivanje i titraciju protutijela. Eritrociti senzibilizirani antitijelima. nazivaju se imunoglobulinski eritrocitni dijagnostikumi i koriste se za dokazivanje antigena.

Reakcija pasivne hemaglutinacije koristi se za dijagnosticiranje bolesti uzrokovanih bakterijama (tifus i paratifus, dizenterija, bruceloza, kuga, kolera itd.), protozoama (malarija) i virusima (gripa, adenovirusne infekcije, virusni hepatitis B, ospice, krpeljni encefalitis, Krimski hemoragijska groznica itd.), kao i za određivanje nekih hormona, identificirati preosjetljivost bolestan do lijekovi te hormoni poput penicilina i inzulina.

Reakcija pasivne hemaglutinacije (RPHA).

Test pasivne hemaglutinacije je osjetljiva metoda serološke dijagnostike i koristi se kako za ranu tako i za retrospektivnu dijagnostiku, kao i za određivanje imunološkog stanja cijepljenih osoba. U bolesnika s tularemijom, antitijela se obično otkrivaju na kraju 1. ili 2. tjedna bolesti, nakon 1-1,5 mjeseci titri TPHA dostižu svoje maksimalne vrijednosti (1: 100 000-1: 20 000, rjeđe više), nakon čega se smanjuju na razini 1:100-1:200 i ostaju dugo.

Kod cijepljenih, antitijela se također stalno otkrivaju, međutim, u nižim titrima, koji ne prelaze 1: 2000-1: 5000 1-1,5 mjeseci nakon cijepljenja, ostaju nekoliko godina na niskoj razini od 1: 20-1: 80.

Tularemijski eritrocitni dijagnostikum (antigen) služi kao antigen za postavljanje RPHA.

Lijek je formalizirani eritrocit ovna senzibiliziran antigenom tularemije, dostupan u tekućem i suhom obliku. Tekući pripravak - 10% suspenzija eritrocita u otopini formalina koncentracije 10%. Suhi liofilizirani pripravak - vakuumski osušena 10% suspenzija eritrocita bez konzervansa. Prije upotrebe razrjeđuje se prema uputama na etiketi. Za postavljanje reakcije u polistirenskim pločama oba pripravka koriste se u koncentraciji od 2,5%, a kod postavljanja reakcije u mikrovolumenima u koncentraciji od 0,5%.

Tehnika postavljanja RPGA.

Ispitni serumi se razrjeđuju fiziološka otopina 1:5 (1:10) i zagrijavana na 56 stupnjeva C 30 minuta.

Reakcija hemaglutinacije (RHA) i

Nakon toga, radi uklanjanja heterogenih protutijela na eritrocite ovna, serumi se tretiraju 50%-tnom suspenzijom formaliziranih eritrocita ovna. Da biste to učinili, eritrociti se dodaju brzinom od 2 kapi (0,05 ml) na 1 ml seruma i temeljito promiješaju mućkanjem.

Serum se ostavi do potpune sedimentacije eritrocita ili centrifugira nakon sat vremena na sobnoj temperaturi, nakon čega je spreman za istraživanje.

Tekućina za razrjeđivanje se ulije u volumenu od 0,5 ml u nekoliko jažica polistirenske ploče.

U preliminarnoj studiji seruma, preporučljivo je testirati ih postavljanjem reakcije u kratkom nizu ploče (6 rupa). U slučaju otkrivanja protutijela u kratkoj seriji seruma, serumi se ponovno ispituju u dugoj seriji razrjeđenja (12 jažica).

Nakon prolijevanja tekućine za razrjeđivanje, u prvu jažicu svakog reda (kratku ili dugu) dodaje se 0,5 ml ispitnog seruma u razrjeđenju 1:5. Zatim se u istim volumenima serum titrira dvostrukim razrjeđenjima. Tako se razrjeđenja seruma dobivaju u kratkoj seriji od 1:10 do 1:320, au dugoj seriji - od 1:10 do 1:20480. Nakon titracije seruma, u svaku jažicu doda se jedna kap (0,05 ml) radne 2,5% suspenzije senzibiliziranih eritrocita.

Sadržaj pločica se temeljito protrese dok se ne dobije homogena suspenzija. Ploče se ostave na sobnoj temperaturi na nepokretnoj površini stola. Preliminarna registracija reakcije provodi se nakon 2-3 sata, konačno određivanje titra provodi se nakon potpune sedimentacije eritrocita u jažicama. Za reakciju su predviđene sljedeće kontrole: 1) ispitni serum u razrjeđenju 1:10 u volumenu od 0,5 ml + 1 kap 2,5% suspenzije nesenzibiliziranih eritrocita; 2) tekućina za razrjeđivanje u volumenu od 0,5 ml + 1 kap 2,5% suspenzije nesenzibiliziranih eritrocita; 3) tekućina za razrjeđivanje u volumenu od 0,5 ml + 1 kap 2,5% suspenzije senzibiliziranih eritrocita.

Sve kontrole trebale bi dati jasno negativnu reakciju.

Računovodstvo i evaluacija RPGA. Reakcija se procjenjuje prema sljedećoj shemi:

1) oštro pozitivna reakcija (++++) - eritrociti padaju na dno jažice u ravnomjernom sloju u obliku "kišobrana", koji često ima nazubljene rubove;

2) pozitivna reakcija (+++) - eritrociti prekrivaju najmanje 2/3 dna rupice;

3) slabo pozitivna reakcija (++) - aglutinat je malen i nalazi se u samom središtu rupice;

4) dvojbena reakcija (+) - postoje odvojena zrnca aglutinata oko sedimenta eritrocita u samom središtu rupice;

5) negativno (-) - na dnu rupice eritrociti se talože u obliku "gumbića" ili malog prstena s glatkim, oštro definiranim rubovima.

Titar seruma se uzima u obzir prema zadnjem razrjeđenju seruma, koje je dalo vrlo jasnu reakciju (barem tri plusa).

Razrjeđenje od 1:100 i više smatra se dijagnostičkim titrom, međutim, kao iu slučaju RA, potrebno je pratiti njegov porast.

TPHA u tularemiji je prilično specifičan i otkriva neke križne reakcije samo sa serumima bruceloze. Diferencijalna dijagnoza moguće visinom titara u TPHA, koji su puno viši s homolognim antigenom.

Tehnika postavljanja RPHA u mikrovolumenima.

RPHA se može provesti u mikrovolumenima korištenjem mikrotitara tipa Takachi (ili mikrotitarskih ploča s okruglim dnom s mikropipetama), što omogućuje titriranje materijala u volumenima od 25 µl i 50 µl. Tehnika postavljanja reakcija, redoslijed svih operacija je isti kao u studiji u polistirenskim pločama. Međutim, treba imati na umu da je osjetljivost mikro metode obično po razrjeđenju (tj.

2 puta) niže od makrometode.

Za postavljanje reakcije u mikrotitru pomoću pipete-kapaljke, tekućina za razrjeđivanje unosi se u svaku jažicu u volumenu od 50 µl. Zatim se pomoću titratora s glavom od 50 μl uzima testni serum uranjanjem glave u njega.

Provjerite je li tekućina ispunila glavu titratora. Titrator sa serumom se prenese u prvu jažicu i, držeći ga u uspravnom položaju, napravi nekoliko rotacijski pokreti povratno putovanje. Zatim se titrator prenese u sljedeću jažicu i manipulacija se ponovi. Titracija se može provoditi istovremeno u nekoliko redova. Nakon titracije cijelog reda, titrator se ispere destiliranom vodom (uz izmjenu 2 obroka) rotacijskim pokretima, voda se skine s glave tamponom i spali na plamenu plamenika.

Nakon titracije, u jažice se doda 25 μl eritrocitnog dijagnostikuma.

Koncentracija dijagnostikuma za RPHA u mikrovolumenima treba biti 0,5% (tj. 2,5% suspenzija eritrocita dodatno se razrijedi 5 puta). Nakon dodavanja eritrocita, ploče treba lagano protresti dok se ne dobije homogena suspenzija. Rezultati se mogu zabilježiti već nakon 1-1,5 sat, što je značajna prednost RPHA u mikrotitru.

Osim toga, ova metoda zahtijeva malu količinu svih sastojaka reakcije i ispitnih seruma.

Reakcija se objašnjava na sljedeći način:

1) "+" - potpuna hemaglutinacija, u kojoj eritrociti padaju na dno jažice u ravnomjernom sloju u obliku "kišobrana", zauzimajući najmanje 2/3 dna;

2) "+ -" - djelomična hemaglutinacija, u kojoj eritrociti padaju na dno u obliku labavog prstena male veličine;

3) "-" - odsutnost hemaglutinacije, kada eritrociti padaju na dno u obliku malog gumba ili prstena s glatkim rubom.

Specifičnost pozitivan rezultat dobiven u TPHA može se provjeriti pomoću trokomponentne reakcije – reakcije inhibicije pasivne hemaglutinacije (RPHA).

Tehnika postavljanja RTPGA.

Ova reakcija je postavljena da potvrdi specifičnost pozitivnog rezultata RPHA kada je upitna ili je od posebnog epidemiološkog interesa. Mehanizam reakcije sastoji se u specifičnoj inhibiciji hemaglutinacije kada se ispitivanom serumu doda suspenzija ubijenih bakterija tularemije. U reakciji međusobno djeluju tri komponente: testni serum, specifični antigen tularemije i antigenski eritrocitni dijagnostikum RTPGA obično se stavljaju u niz od 7-8 jažica.

Preporučljivo je instalirati drugi RPHA paralelno s RTPGA. U dva reda jažica ulije se 0,25 ml tekućine za razrjeđivanje, zatim se u prve jažice oba reda doda ispitni serum u volumenu od 0,25 ml i titrira. Dobiju se dva identična reda razrjeđenja seruma. U sve jažice drugog reda dodajte 0,25 ml tekućine za razrjeđivanje, au jažice prvog reda 0,25 ml suspenzije bakterije tularemije.

Koristi se Tularemia diagnosticum (sadrži 25 milijardi bakterija tularemije u 1 ml), prethodno razrijeđen 50 puta.

Takva suspenzija sadrži 500 milijuna bakterija u 1 ml ili 125 milijuna u volumenu od 0,25 ml. Nakon dodavanja antigena, ploča se ostavi 1 sat na sobnoj temperaturi, nakon čega se u sve jažice oba reda doda po jedna kap (0,05 ml) eritrocitnog dijagnostikuma, protrese se i ostavi na ravnoj površini stola.

Obračun se obavlja za 2-3 sata.

Računovodstvo i procjena RTPGA. Ako ispitivani serum sadrži specifična protutijela protiv tularemije, ona se neutraliziraju dodanim antigenom i hemaglutinacija se neće pojaviti u prvom redu jažica ili će se, s visokim titrom seruma, hemaglutinacija uočiti u manjem broju (2-4) jažica nego u red s TPHA. U ovom slučaju potvrđena je specifičnost rezultata.

Ako se uoči hemaglutinacija u oba reda, tj. rezultati RTHA i RPHA se podudaraju, to ukazuje na odsutnost protutijela protiv tularemije u ispitivanom serumu. U ovom slučaju, primarni rezultat RPHA smatra se nespecifičnim.

Tehnika postavljanja RTPGA u mikrovolumenima. RTHA, kao i RPHA, mogu se izvesti u mikrovolumenima korištenjem mikrotitra Takachi tipa.

Da biste to učinili, 0,25 μl tekućine za razrjeđivanje se dodaje u jažice mikropločica u dva reda od po 7-8 jažica. Zatim se uz pomoć titratora boduje i titrira 0,25 μl ispitivanog seruma u oba reda. Nakon toga se u svaku jažicu u prvom redu doda 25 μl antigena tularemije (čija je koncentracija 500 milijuna bakterija tularemije u 1 ml), au drugom redu 25 μl tekućine za razrjeđivanje.

Ploče se ostave 1 sat na sobnoj temperaturi, nakon čega se u sve jažice oba reda doda po 25 μl antigenskog eritrocitnog dijagnostikuma (0,5% koncentracije).

Računovodstvo i procjena rezultata provodi se slično reakciji u makrovolumenima.

Datum objave: 2015-02-03; Očitano: 3176 | Kršenje autorskih prava stranice

studopedia.org - Studopedia.Org - 2014-2018. (0,003 s) ...

Vidalova reakcija. Od drugog tjedna bolesti u krvi bolesnika nakupljaju se protutijela protiv uzročnika infekcije. Da bi ih identificirali, bolesnikov krvni serum ispituje se u reakciji aglutinacije. Kao antigen koriste se usmrćene kulture salmonela – dijagnostikumi.

Za postavljanje Vidalove reakcije koristi se pacijentov serum, set dijagnostičkih pribora i izotonična otopina natrijevog klorida.

Krv (2-3 ml) iz pulpe prsta ili kubitalne vene skuplja se u sterilnu epruvetu i dostavlja u laboratorij. U laboratoriju se epruveta stavi u termostat na 20-30 minuta da se stvori ugrušak, zatim se ugrušak kruži Pasteur-ovom pipetom da se odvoji od stijenke epruvete i stavi na hladno 30- 40 minuta. Izdvojeni serum se odsisa i koristi za postavljanje reakcije aglutinacije s dijagnostikumima salmonele tifusa i paratifusa. Da bi se dobio serum, krv se može centrifugirati.

Kada infektivni proces- trbušni tifus ili paratifus - u organizmu se stvaraju O- i H-antitijela na istoimene antigene uzročnika.

Prvo se pojavljuju O-protutijela koja vrlo brzo nestaju. H-antitijela perzistiraju dugo vremena. Isto se događa i tijekom cijepljenja, dakle pozitivna Vidalova reakcija s O- i H-antigenima ukazuje na prisutnost bolesti, a reakcija samo s H-antigenima može biti i kod oboljelih (anamnestička reakcija) i kod oni koji su cijepljeni (cijepljenje). Na temelju toga se Vidalova reakcija postavlja odvojeno s O- i H-antigenima (dijagnostikumi).

Budući da su trbušni tifus i paratifus A i B klinički slični, radi utvrđivanja prirode bolesti, serum bolesnika ispituje se istovremeno s dijagnostikumima na salmonelu tifusa i paratifusa A i B.

Vidalova reakcija ima široku primjenu jer je jednostavna i ne zahtijeva posebne uvjete.

Postoje dva načina za postavljanje reakcije: kap i volumen (vidi Poglavlje 12). U praksi se češće koristi volumetrijska metoda. Kod postavljanja reakcije linearne aglutinacije, broj redaka treba odgovarati broju antigena (dijagnostikuma). Uzročnik bolesti smatra se mikroorganizmom, čiji je dijagnostikum aglutiniran serumom bolesnika. Ponekad se primjećuje grupna aglutinacija, budući da uzročnici tifusa i paratifusa imaju zajedničke grupne antigene. U tom slučaju pozitivnim se smatra rezultat reakcije u nizu u kojem se uočava aglutinacija u većem razrjeđenju seruma (tablica 36).

Tablica 36. Mogući rezultat reakcije aglutinacije

Bilješka. U praksi se Vidalova reakcija postavlja s četiri dijagnostikuma: trbušni tifus "O" i "H", a paratifus A i B - s dijagnostikumom "OH".

Ako se aglutinacija javlja samo u malim razrjeđenjima seruma - 1:100, 1:200, tada se za razlikovanje reakcije u slučaju bolesti od cijepljenja ili anamnestike pribjegava ponovnom postavljanju reakcije aglutinacije nakon 5-7 dana. U bolesnika titar protutijela raste, ali se u cijepljenog ili prelijepljenog bolesnika ne mijenja. Dakle, povećanje titra antitijela u krvnom serumu služi kao pokazatelj bolesti.

Vi-aglutinini se pojavljuju u krvi pacijenta kao odgovor na uvođenje u tijelo patogena tifusa koji posjeduju Vi-antigen. Određuju se od 2. tjedna bolesti, ali njihov titar obično ne prelazi 1:10. Otkrivanje Vi-protutijela povezano je s prisutnošću uzročnika tifusa u tijelu, stoga je određivanje ovih antitijela od velike epidemiološke važnosti jer omogućuje identifikaciju bakterijskih nositelja.

Vi-reakcija hemaglutinacije. Ovo je najosjetljivija reakcija za otkrivanje protutijela.

Princip reakcije je da ljudski (I. skupina) ili ovčji eritrociti nakon posebnog tretmana mogu adsorbirati Vi-antigen na svojoj površini i steći sposobnost aglutinacije s odgovarajućim Vi-antitijelima.

Eritrociti s antigenima adsorbiranim na površini nazivaju se eritrocitni dijagnostikumi.

Za postavljanje Vi-hemaglutinacijske reakcije uzmite:

1) krvni serum pacijenta (1-2 ml); 2) eritrocitni Salmonella Vi diagnosticum; H) Vi-serum; 4) O-serum; 5) izotonična otopina natrijeva klorida.

Reakcija se stavlja u aglutinacijske epruvete ili u plastične pločice s jažicama.

Krv se pacijentu uzima na isti način kao i kod Vidalove reakcije. Uzmi serum. Iz seruma se pripremaju dvostruka serijska razrjeđenja, počevši od 1:10 do 1:160.

U jažicu se doda 0,5 ml svakog razrjeđenja i doda se 0,25 ml eritrocitnog dijagnostikuma. Reakcija se stavi u volumen od 0,75 ml.

Kontrole su: 1) standardni aglutinirajući monoreceptorski serum + dijagnostikum - reakcija mora biti pozitivna do titra seruma; 2) dijagnostikum u izotoničnoj otopini natrijevog klorida (kontrola) - reakcija treba biti negativna.

Sadržaj jažica se temeljito promiješa, stavi u termostat 2 sata i ostavi na sobnoj temperaturi do sljedećeg dana (18-24 sata).

Računovodstvo počinje kontrolom. Reakcija se procjenjuje ovisno o stupnju aglutinacije dijagnostikuma.

Rezultati se uzimaju u obzir prema sustavu četiri križića:

Eritrociti su potpuno aglutinirani - talog na dnu rupice u obliku "kišobrana";

+++ "kišobran" je manji, nisu svi eritrociti bili aglutinirani;

++ "kišobran" je malen, na dnu rupice nalazi se talog neaglutiniranih eritrocita;

Reakcija je negativna; eritrociti nisu aglutinirali i taložili su se na dnu jažice u obliku gumba.

Kontrolna pitanja

1. U kojem razdoblju bolesti se dijagnosticira Vidalova reakcija?

2. Koji su sastojci potrebni za izvođenje Vidalove reakcije?

3. Koji se dijagnostikumi koriste za Vidalovu reakciju?

4. Koja je od seroloških reakcija najosjetljivija u dijagnostici infekcija tifusa i paratifusa?

5. Koji se dijagnostikum koristi u formuliranju Vi-hemaglutinacijske reakcije?

6. Kojim se serumom utvrđuje prisutnost Vi-antigena u ispitivanoj kulturi?

7. Koje je značenje definicije Vi-fag tipa?

Uzeti od nastavnika O- i H-dijagnostikume salmonele tifusa, paratifusa A i paratifusa B i serum bolesnika. Stavite Vidalovu reakciju.

Hranjivi mediji

Medicinska industrija proizvodi okruženja EMS, Ploskirev, bizmut-sulfit agar u obliku suhog praha. Pripremaju se prema uputama na naljepnici: određena količina praha se odvaže, prelije odgovarajućom količinom vode, prokuha i ulije u sterilne Petrijeve zdjelice.

Wednesday Russell. U 950 ml destilirane vode dodati 40 g suhe hranjive podloge i dodati 5 g hranjivog agara. Zagrijte do vrenja i otopite prahove. Otopiti 1 g x u 50 ml destilirane vode. sati glukoze i doda u pripremljenu smjesu. Medij se ulije u sterilne epruvete od 5-7 ml, sterilizira protočnom parom (2 dana po 2 minute) i zakosi tako da ostane stupac. Na isti način priprema se Russellova podloga s manitolom i saharozom.

Olkenitskyjev medij iz suhog agara. 2,5 g suhog hranjivog agara otopi se u 100 ml destilirane vode. U agar ohlađen na 50°C dodaju se svi sastojci navedeni u recepturi (etiketi). Medij izliven u epruvete sterilizira se tekućom parom (3 dana po 20 minuta), a zatim se zakosi. Gotov medij trebao bi biti blijedo ružičaste boje.

Reakcija inhibicije hemaglutinacije

Reakcija hemaglutinacije

Reakcija aglutinacije

Reakcija aglutinacije (RA) je aglutinacija i taloženje mikroba ili drugih stanica pod djelovanjem protutijela u prisutnosti elektrolita (izotonične otopine natrijeva klorida). Dobiveni talog naziva se aglutinirati.

Za reakciju vam je potrebno:

1. Antitijela (aglutinini) – nalaze se u serumu bolesnika ili u imunološkom serumu.

2. Antigen – suspenzija živih ili mrtvih mikroorganizama, eritrocita ili drugih stanica.

3. Izotonična otopina.

Test aglutinacije za serodijagnozu naširoko se koristi u trbušni tifus, paratifus (Vidalova reakcija), bruceloza (Wrightova reakcija) itd. U ovom slučaju antitijelo je serum pacijenta, a antigen je poznati mikrob.

Kada se identificiraju mikrobi ili druge stanice, njihova suspenzija služi kao antigen, a poznati imunološki serum služi kao antitijelo. Ova reakcija se naširoko koristi u dijagnozi crijevne infekcije, veliki kašalj itd.

U laboratorijskoj praksi koriste se dvije reakcije hemaglutinacije (RHA) koje se razlikuju po mehanizmu djelovanja.

Prva RGA odnosi se na serologiju. U ovoj reakciji dolazi do aglutinacije eritrocita u interakciji s odgovarajućim protutijelima (hemaglutininima). Reakcija se široko koristi za određivanje krvnih grupa.

Drugi RGA nije serološki. U njemu, lijepljenje crvenih krvnih stanica nije uzrokovano antitijelima, već posebnim tvarima koje stvaraju virusi. Na primjer, virus influence aglutinira eritrocite kokoši i zamoraca, virus dječje paralize aglutinira eritrocite ovaca. Ova reakcija omogućuje procjenu prisutnosti određenog virusa u ispitivanom materijalu.

To je serološka reakcija u kojoj specifična antivirusna protutijela u interakciji s virusom (antigenom) neutraliziraju virus i oduzimaju mu sposobnost aglutinacije crvenih krvnih stanica, odnosno inhibiraju reakciju hemaglutinacije. Visoka specifičnost reakcije inhibicije hemaglutinacije (HITA) omogućuje njezinu upotrebu za određivanje tipa, pa čak i vrste virusa otkrivenih tijekom HA.

Riža. Shema reakcije pasivne hemaglutinacije (RPHA). A - dobivanje eritrocitnog dijagnostikuma; B - RNGA: 1-eritrocit: 2 - proučavani antigen; 3 - dijagnostikum eritrocita; 4 - antitijelo na proučavani antigen: 5 - aglutinirati.

Uz pomoć RNHA može se odrediti nepoznati antigen ako su poznata antitijela adsorbirana na eritrocitima.

Reakcija hemaglutinacije (RHA)

RGA se temelji na činjenici da neke vrste bakterija i virusa imaju sposobnost adsorpcije na površini crvenih krvnih stanica. različiti tipoviživotinje (i ptice), uzrokujući njihovo lijepljenje i stvaranje aglutinacije (izravno RGA).

Adsorpcija antigena (bakterija, virusa) na površini eritrocita ne očituje se uvijek stvaranjem vidljivog taloga; osim toga, RGA je nespecifičan, jer eritrociti iste životinjske vrste mogu adsorbirati različite antigene.

Specifična je reakcija pasivne (indirektne) hemaglutinacije (RPHA). Za njegovo postavljanje prethodno se pripremi eritrocitni dijagnostikum (eritrociti na kojima je adsorbiran antigen). U tu se svrhu sterilno uzima krv ovna (ili pijetla), defibrinira i nekoliko puta ispere u otopini fosfatnog pufera (pH 7,2) 3-5 puta centrifugiranjem. Supernatant se ukloni, koncentracija eritrocita se podesi na 2,5% (1:40). U 2,5% suspenziju eritrocita dodaje se u jednakom volumenu (1 ml ili 0,5 ml) suspenzija bakterija ispitivanih vrsta mikroba u koncentraciji od 5-10 milijardi stanica po 1 ml. Eritrociti lako adsorbiraju antigen polisaharidne prirode. Za adsorpciju antigena proteinske prirode, eritrociti se prethodno tretiraju taninom u razrjeđenju od 1: 20 000. Eritrociti u kombinaciji s dodanim antigenom ostavljaju se za senzibilizaciju (adsorpciju) 2 sata u termostatu (37 ° C) , zatim ponovno centrifugiran na 3-4 tisuće okretaja u minuti / min tijekom 5 minuta s otopinom fosfatnog pufera (Sl. 9.13).

Dobiveni eritrocitni dijagnostikum stavlja se u epruvete (ili jažice u ploču od pleksiglasa) i u njega se dodaje standardni imunološki serum.

U pozitivnim slučajevima dolazi do RGA - gubitka eritrocita u obliku karakterističnog ljuskastog ili zrnastog sedimenta raspoređenog po cijeloj površini dna epruvete (hemaglutinata). To znači da je vrsta mikroba (antigena) koja se proučava specifična za imunoserumska antitijela. U negativnim slučajevima, nezalijepljena crvena krvna zrnca će se smjestiti na dno u obliku malog ravnomjernog kruga.

Za veću pouzdanost rezultata RPGA, odgođena reakcija(kočenje) fenomen hemaglutinacije(RZGA) ili njegova izmjena - reakcija neutralizacije antitijela(RIA).

Riža. 9.13. Reakcija pasivne hemaglutinacije (shema): Er - eritrociti: AG - antigen: AT - antitijelo

Suština RZGA sastoji se u tome što se reakcija aglutinacije postavlja specifičnim dijagnostičkim serumom i ispitivanim antigenom (kao antigen koristi se proučavana vrsta mikroba). Ova smjesa se drži 1-2 sata na 37°C, zatim se dodaju eritrociti. Ako je ispitivani antigen homologan antitijelima dijagnostičkog seruma, ona međusobno djeluju i dodani eritrociti ne aglutiniraju – rezultat reakcije je pozitivan. Ako ispitivani antigen nije homologan serumskim antitijelima ili ga nema u materijalu, tada dodani eritrociti adsorbiraju antigen i dolazi do RHA - rezultat RHA je negativan, vrsta mikroba (antigena) koji se ispituje se ne utvrđuje.

Način postavljanja PH A je da uzmu jednake količine i pomiješaju dijagnostički imunološki serum sa razna razrjeđenja materijala koji se proučava (željeni antigen), ostaviti za kontakt 1-2 sata, zatim dodati eritrocite senzibilizirane određenim (poznatim) antigenom specifičnim za serumska protutijela (eritrocitni dijagnostikum). Kada željeni antigen reagira sa serumskim protutijelima, ona se neutraliziraju i dodani eritrociti ne aglutiniraju, ne dolazi do RHA – nalaz PHA je pozitivan. Ako ispitivani materijal ne sadrži antigen specifičan za protutijela korištenog seruma, neće doći do neutralizacije protutijela. Stoga se pri dodavanju eritrocitnog dijagnostikuma očituje aglutinacija (hemaglutinacija) eritrocita, a rezultat RHA je negativan. Test neutralizacije antitijela je vrlo osjetljiva metoda za dokazivanje antigena ne samo u suspenziji živih (ili ubijenih) bakterija, već iu suspenziji mljevenog tkiva raznih organa, nativnih i zagrijanih sekreta i izlučevina bolesnog organizma.

Reakcija hemaglutinacije kratko. Reakcija neizravne hemaglutinacije (rnga), odnosno reakcija pasivne hemaglutinacije (rpga). Vrijeme analize