Cilj: Ovladati tehnikom postavljanja reakcije aglutinacije i reakcije precipitacije za dijagnostiku zaraznih bolesti.
Modul 1 Morfologija i fiziologija mikroorganizama. Infekcija. Imunitet.
Tema 16: Reakcija aglutinacije. reakcija taloženja.
Relevantnost teme. Pod, ispod imunitet podrazumijevaju otpornost tijela na infektivne i neinfektivne agense ( patogeni mikroorganizmi, strane bjelančevine itd. tvari). Ti se agensi nazivaju antigeni. Imunitet je urođen ili stečen. Kongenitalna- kada se stvaraju tkivni i humoralni zaštitni uređaji, koji uzrokuju imunitet na zarazne bolesti koje su naslijeđene.
Stečena- provodi ga imunološki sustav organizma u obliku stvaranja protutijela ili nakupljanja senzibiliziranih limfocita. Podijeljen je na prirodni i umjetni. Prema mehanizmu djelovanja dijeli se na aktivni i pasivni. U svim imunološkim reakcijama glavna komponenta je antigen.
glavna funkcija imunološki sustav, koji se sastoji od limfoidnog tkiva, je prepoznavanje stranih agenasa (antigena) i njihova neutralizacija.
Antigeni mogu ući u tijelo kroz Zračni putovi, probavni trakt kroz kožu i sluznicu. Svaki antigen potiče stvaranje specifičnih proteinskih tvari – protutijela.
Antigeni dijele se na potpune i donje (haptene). Potpuni antigeni potaknuti potpuni imunološki odgovor. Defektni antigeni ne uzrokuju samostalno imunološki odgovor, ali ponekad stječu ovu sposobnost kada su konjugirani s proteinskim nosačima velike molekularne težine. Osim toga postoje i antigeni: poluhapteni, proantigeni, heteroantigeni i izoantigeni.
Antitijela su ljudski ili životinjski serumski imunoglobulini. Protutijela se stvaraju nakon infekcije, te kao rezultat imunizacije oslabljenim ili ubijenim bakterijama, rikecijama, virusima, toksinima i drugim uzročnicima. Antitijela- proteini imunoglobulina kemijski sastav spadaju u glikoproteine. Prema građi i imunobiološkim svojstvima imunoglobulini se dijele na 5 razreda: IgM, IgG, IgA, IgE, IgD.
Normalna antitijela pronađen u ljudi i životinja koje nisu imunizirane. Specifična antitijela nastaju kao posljedica infekcije ili imunizacije.
Reakcija između antitijela i antigena naziva se serološki. Serološke reakcije su vrlo specifične i koriste se u dijagnostici mnogih zaraznih bolesti. Postoje reakcije aglutinacije i precipitacije.
1. Reakcija aglutinacije (RA) temelji se na interakciji antigena (aglutinogena) i protutijela (aglutinina), pri čemu dolazi do aglutinacije i taloženja mikrobnih tijela u prisutnosti elektrolita. Postoje različite modifikacije formulacije reakcije aglutinacije.
Najveća vrijednost imati:
- Makroskopska (raspoređena) aglutinacija u epruvetama. U serum bolesnika dodaje se suspenzija mikroba (diagnosticum) i nakon 1 sata u termostatu na temperaturi od 37 stupnjeva bilježi se razrjeđenje (titar) seruma pri kojem je nastala reakcija. Reakcija aglutinacije se smatra pozitivnom kada se na dnu epruvete formira talog s izraženim bistrenjem supernatanta. Taj se talog naziva aglutinatom.
Prema prirodi aglutinata razlikujemo sitnozrnatu (O) i krupnozrnastu (H) aglutinaciju. Za otkrivanje sitnozrnatog aglutinata koristi se aglutinoskop. Obračunavanje rezultata počinje s kontrolnim epruvetama. Zadnje razrjeđenje seruma u kojem se uoči aglutinacija smatra se njegovim titrom.
Svrha reakcije: otkrivanje antitijela u serumu bolesnika.
- mikroskopski (ubrzani) ) približna aglutinacija na staklu. Kap bakterijske kulture dodaje se kapi dijagnostičkog imunološkog seruma i ravnomjerno miješa. Reakcija se nastavlja na sobnoj temperaturi nakon 5-10 minuta. Zatim se pravi račun. Uz pozitivnu reakciju u kapi seruma, bilježi se nakupljanje bakterija u obliku zrna ili pahuljica. Svrha reakcije: odrediti vrstu uzročnika prema poznatom dijagnostičkom serumu.
- Reakcija neizravne (pasivne) hemaglutinacije (RNGA). Bit ove reakcije leži u činjenici da su eritrociti ovna sposobni adsorbirati antigene na svojoj površini. Pod utjecajem specifičnih protutijela eritrociti se lijepe i talože, stvarajući na dnu hemaglutinat. Reakcija je vrlo osjetljiva i specifična. RNGA vam omogućuje otkrivanje minimalne količine antitijela i neispravnih antigena polisaharidne prirode. Ova reakcija se koristi u dijagnozi mnogih zaraznih bolesti (tifus i tifus, paratifus, tuberkuloza itd.).
2. Reakcija taloženja (RP ) – taloženje kompleksa antigen-antitijelo. Glavna razlika između RP i RA je u tome što se kod RA koristi korpuskularni antigen, dok je kod RP antigen koloidna tvar proteinske ili polisaharidne prirode. U ovoj se reakciji antigen naziva precipitinogen, a protutijela precipitini. Reakcija se stavlja u epruvete nanošenjem otopine antigena na imunološki serum. S optimalnim omjerom antigena i antitijela na granici
te otopine tvore taložni prsten. Ako se kao antigen koriste prokuhani i procijeđeni ekstrakti organa i tkiva, reakcija se naziva reakcija termoprecipitacije (Ascolijeva reakcija, koja se stavlja u dijagnozu antraks, kuga, tularemija itd.).
Reakcije taloženja u agaru naširoko se koriste: metoda jednostavne difuzije, metoda dvostruke difuzije.
Vrsta oborine je reakcija flokulacije- odrediti aktivnost toksoida ili antitoksičnog seruma. Osim toga, ova se reakcija može koristiti za određivanje toksigenosti sojeva Corynebacterium diphtheriae.
Specifični ciljevi:
· Objasniti ulogu antigena kao induktora imunološkog odgovora;
· Opisati strukturu antigena, uključujući antigene mikroorganizama;
· Opisati mehanizam reakcije aglutinacije;
· Opišite mehanizam reakcije taloženja.
Biti u mogućnosti:
· Objasniti ulogu antigena kao induktora imunološkog odgovora;
Opisati strukturu protutijela (različite klase imunoglobulina);
· Analizirati mehanizam interakcije protutijela s antigenima;
· Interpretirati rezultate reakcije aglutinacije;
· Interpretirati rezultate reakcije taloženja;
· Analizirajte rezultate.
1. Definicija pojma "antigeni", "antitijela".
2. Uloga antigena kao induktora imunološkog odgovora.
3. Struktura protutijela (različite klase imunoglobulina).
4. Mehanizam interakcije protutijela s antigenima.
5. Reakcije imuniteta, njihova uloga u imunološkom odgovoru i dijagnostici zaraznih bolesti.
6. Mehanizam reakcije aglutinacije.
7. Mehanizam reakcije taloženja.
Praktični zadaci koji se izvode u nastavi:
1. Postavljanje reakcije aglutinacije za otkrivanje protutijela u serumu bolesnika.
2. Postavljanje reakcije mikroaglutinacije na staklu s dijagnostičkim serumima za identifikaciju čiste bakterijske kulture.
3. Procjena rezultata reakcije aglutinacije.
4. Postavljanje reakcije taloženja za otkrivanje bakterijskog antigena.
5. Procjena rezultata reakcije taloženja.
6. Procjena rezultata reakcije neizravne hemaglutinacije.
7. Registracija protokola.
Književnost:
1. Pyatkin K.D., Krivoshein Yu.S. Mikrobiologija s virologijom i imunologijom - Kijev: Viša škola, 1992. - 431 str.
2. Vorobyov A.V., Bykov A.S., Pashkov E.P., Rybakova A.M. Mikrobiologija.- M.: Medicina, 1998.- 336s.
3. Medicinska mikrobiologija /Uredio V.P. Pokrovsky. - M .: GEOTAR-MED, 2001. - 768s.
4. Korotyaev A.I., Babichev S.A. Medicinska mikrobiologija, imunologija i virologija / Udžbenik za medicinska sveučilišta, St. Petersburg: "Posebna literatura", 1998.- 592s.
5. Timakov V.D., Levashev V.S., Borisov L.B. Mikrobiologija / Udžbenik - 2. izdanje, revidirano. i dodati - M .: Medicina, 1983.- 512s.
6. Bilješke s predavanja.
1. Titov M.V. zarazne bolesti.- K., 1995.- 321s.
2. Shuvalova E.P. Zarazne bolesti - M .: Medicina, 1990. - 559s.
Reakcija aglutinacije temelji se na specifičnoj interakciji protutijela (aglutinina) s cijelim mikrobnim ili drugim stanicama. Kao rezultat te interakcije nastaju čestice-aglomerati koje se talože (aglutiniraju). U reakciji aglutinacije mogu sudjelovati bakterije, protozoe, gljivice, kvasci, rikecije, eritrociti i druge stanice, žive i mrtve. Reakcija se odvija u dvije faze: prva je specifična kombinacija antigena i antitijela, druga je nespecifična, tj. stvaranje vidljivog aglutinata. Taloženje aglutinata događa se u prisutnosti elektrolita, kao što je natrijev klorid. Mikroorganizmi u aglutinatu ostaju živi, ali gube pokretljivost.
Reakcija aglutinacije naširoko se koristi za serološku dijagnostiku zaraznih bolesti i određivanje antigenske strukture izoliranih mikroba. Za utvrđivanje antigene strukture uzročnika izoliranog iz organizma bolesnika ili kliconoše koristi se specifični imunološki serum dobiven imunizacijom životinja (kunić, magarac, ovan) određenim mikroorganizmima. Identifikacija mikroba provodi se reakcijom aglutinacije na staklu s adsorbiranim ili monoreceptorskim serumima ili u epruvetama sa specifičnim aglutinirajućim serumima. Adsorbirani serumi sadrže protutijela samo na antigene specifične za određeni mikrob, a monoreceptorski serumi sadrže protutijela samo na jedan specifičan antigen uzročnika.
Serumi vrsta sadrže antitijela na sve antigene određenog mikroba.
Pripadnost izolirane kulture mikroorganizama ove vrste određuje se aglutinacijom s poznatim serumom na titar protutijela naznačen na naljepnici ampule seruma. Titrom serumskih antitijela smatra se njegovo posljednje razrjeđenje, u kojem se još uočava aglutinacija kulture mikroba korištenih za imunizaciju životinje. Adsorbirani i monoreceptorski serumi obično se koriste nerazrijeđeni u reakciji aglutinacije na staklu.
Prilikom utvrđivanja prisutnosti protutijela u krvnom serumu bolesnika, isti se razrjeđuje izotoničnom otopinom natrijeva klorida, počevši od razrjeđenja 1:50 do 1:800 ili više. Svakom razrjeđenju dodaje se suspenzija živih ili mrtvih mikroba. Pripravci koji sadrže mikrobe ubijene toplinom ili formalinom nazivaju se dijagnostikumi. Dijagnostikumi dobiveni zagrijavanjem kultura mikroorganizama sadrže samo somatske antigene. Kada se koristi samo formalin, flagelarni antigeni su također sačuvani u mikrobima.
U prisutnosti protutijela u krvi bolesnika, dijagnostikum uzet u reakciji se lijepi i stvara se talog (aglutinat) u dvije epruvete. U tom se slučaju rezultati reakcije aglutinacije smatraju pozitivnima. U kontrolnoj epruveti, u koju se dodaju izotonična otopina natrijevog klorida i dijagnostikum, suspenzija mikroba treba biti homogena ( povratni udar aglutinacija).
Obračunavanje rezultata reakcije aglutinacije kod nekih bolesti, kao što je leptospiroza, provodi se samo mikroskopski u tamnom vidnom polju mikroskopa (mikroaglutinacija). Za postavljanje serološke dijagnoze bolesti uzima se u obzir dijagnostička bolest. Obično odgovara razrjeđenju seruma od 1:100 ili 1:200.
Protutijela u krvnom serumu bolesnika reakcijom aglutinacije mogu se dokazati u slučajevima trbušnog tifusa i paratifusa (Vidalova reakcija), bruceloze (Wrightova reakcija), tularemije itd.
Castellanijeva reakcija. Za neke zarazne bolesti ili imunizacija mikroorganizmima koji sadrže skupni antigeni, u krvnom serumu se osim antitijela specifičnih za ovaj tip pojavljuju i grupna antitijela. U ovom slučaju, srodne bakterijske vrste će biti aglutinirane dobivenim serumima.
Castellani je predložio metodu za adsorpciju grupnih antitijela iz imunoloških seruma, koja se temelji na njihovom uklanjanju uz pomoć mikroorganizama srodnih vrsta koji imaju grupne antigene, ali nemaju specifične. Kultura takvih mikroorganizama dodana u serum adsorbira antitijela nespecifične skupine, a nakon uklanjanja kompleksa antigen-antitijelo centrifugiranjem u serumu ostaju samo specifični imunoglobulini. Serumi tretirani po Castellanijevoj metodi mogu se koristiti u reakciji aglutinacije kao visoko specifični.
imunodijagnostičke reakcije. Reakcije antigen-protutijelo i reakcije s obilježenim komponentama. Koristi se za identifikaciju mikroorganizama i dijagnostiku zaraznih bolesti.
Imunološke reakcije koriste se u dijagnostičkim i imunološkim studijama kod bolesnika i zdravi ljudi. U tu svrhu primijenite serološke metode (od lat. serum - serum i logotipi - doktrina), tj. metode proučavanja antitijela i antigena pomoću reakcija antigen-antitijelo utvrđenih u krvnom serumu i drugim tekućinama, kao i tjelesnim tkivima.
Otkrivanje antitijela protiv antigena uzročnika u krvnom serumu pacijenta omogućuje dijagnosticiranje bolesti. Serološkim istraživanjima također se identificiraju mikrobni antigeni, različite biološki aktivne tvari, krvne grupe, tkivni i tumorski antigeni, imunološki kompleksi, stanični receptori itd.
Kada se mikrob izolira iz pacijenta, uzročnik se identificira njegovim proučavanjem. antigenska svojstva korištenjem imunoloških dijagnostičkih seruma, tj. krvnih seruma hiperimuniziranih životinja koji sadrže specifična protutijela. Ovaj tzv serološka identifikacija mikroorganizama.
U mikrobiologiji i imunologiji naširoko se koriste reakcije aglutinacije, precipitacije, reakcije neutralizacije, reakcije koje uključuju komplement, uz korištenje obilježenih protutijela i antigena (radioimunološki, enzimski imunotestovi, metode imunofluorescencije). Navedene reakcije razlikuju se po registriranom učinku i tehnici postavljanja, no sve su bazične. vans na reakciju interakcije antigena s protutijelom i koriste se za otkrivanje i protutijela i antigena. Reakcije imuniteta karakteriziraju visoka osjetljivost i specifičnost.
U nastavku su dani principi i sheme glavnih imunodijagnostičkih reakcija. Detaljna tehnika za postavljanje reakcija data je u. praktične smjernice za imunodijagnostiku.
Reakcija aglutinacije – RA(od lat. agluti- nacija- bonding) - jednostavna reakcija u kojoj protutijela vežu korpuskularne antigene (bakterije, eritrocite ili druge stanice, netopljive čestice na kojima su adsorbirani antigeni, kao i makromolekularne nakupine). Javlja se u prisutnosti elektrolita, na primjer, kada se doda izotonična otopina natrijeva klorida.
Koriste se razne varijante reakcije aglutinacije: proširena, aproksimativna, neizravna itd. Reakcija aglutinacije se očituje stvaranjem ljuskica ili taloga.
RA se koristi za:
određivanje protutijela u krvnom serumu pacijenata, na primjer, s brucelozom (Wright, Heddelsonove reakcije), trbušnog tifusa i paratifusa (Vidalova reakcija) i drugih zaraznih bolesti;
određivanje uzročnika izoliranog od pacijenta;
određivanje krvnih grupa monoklonskim antitijelima na alogene eritrocita.
Za određivanje antitijela pacijenta stavitiprodužena reakcija aglutinacije: dodati u razrjeđenja krvnog seruma bolesnika dijagnostikum(suspenzija ubijenih mikroba) i nakon višesatne inkubacije na 37°C bilježi se najveće razrjeđenje seruma (titar seruma) pri kojem je došlo do aglutinacije, tj. do stvaranja taloga.
Priroda i brzina aglutinacije ovise o vrsti antigena i protutijela. Primjer je interakcija dijagnostikuma (O- i R-antigena) sa specifičnim antitijelima. Reakcija aglutinacije sa O-dijagnostikum(bakterije ubijaju toplinom, zadržavajući termostabilan O antigen) javlja se u obliku sitnozrnaste aglutinacije. Reakcija aglutinacije s H-diagnosticumom (bakterije ubijene formalinom, zadržavajući toplinski labilni flagelarni H-antigen) je gruba i odvija se brže.
Ako je potrebno odrediti uzročnika izoliranog od pacijenta, staviti orijentacijska reakcija aglutinacije, pomoću dijagnostičkih antitijela (aglutinirajući serum), tj. provodi se serotipizacija uzročnika. Približna reakcija provodi se na predmetnom staklu. Kapi dijagnostičkog aglutinirajućeg seruma u razrjeđenju 1:10 ili 1:20 dodati čistu kulturu uzročnika izoliranu od bolesnika. U blizini se nalazi kontrola: umjesto seruma nanosi se kap otopine natrijevog klorida. Kad se u kapi pojavi flokulantni talog sa serumom i mikrobima, stavljaju opsežna reakcija aglutinacije u epruvetama s rastućim razrjeđenjima aglutinirajućeg seruma u koji se dodaju 2-3 kapi suspenzije uzročnika. Aglutinacija se uzima u obzir količinom sedimenta i stupnjem bistrenja tekućine. Reakcija se smatra pozitivnom ako se primijeti aglutinacija u razrjeđenju bliskom titru dijagnostičkog seruma. Istodobno se uzimaju u obzir kontrole: serum razrijeđen izotoničnom otopinom natrijevog klorida treba biti proziran, suspenzija mikroba u istoj otopini mora biti jednoliko mutna, bez sedimenta.
Različite srodne bakterije mogu se aglutinirati istim dijagnostičkim aglutinirajućim serumom, što otežava njihovu identifikaciju. Stoga, uživajte adsorbirani aglutinirajući serumi, iz kojih su unakrsno reaktivna protutijela uklonjena adsorpcijom njima srodnih bakterija. U takvim serumima ostaju protutijela specifična samo za ovu bakteriju. Pripravu monoreceptorskih dijagnostičkih aglutinirajućih seruma na ovaj način predložio je A. Castellani (1902.).
Reakcija neizravne (pasivne) hemaglutinacije (RNGA, RPHA) temelji se na korištenju eritrocita s antigenima ili antitijelima adsorbiranim na površini, čija interakcija s odgovarajućim antitijelima ili antigenima krvnog seruma kuglice uzrokuje da se eritrociti slijepe i padnu na dno epruvetu ili ćeliju V oblik nazubljenog sedimenta (sl. 13.2). Uz negativnu reakciju, eritrociti se talože u obliku "gumba". Obično se protutijela u RNHA otkrivaju pomoću antigenskog dijagnostikuma eritrocita, koji se sastoji od eritrocita s adsorbiranim na njih antigene. Ponekad koristimo dijagnostiku antitijela eritrocita, na kojima se antitijela adsorbiraju. Na primjer, botulinum toksin se može otkriti dodavanjem eritrocitnog antitijela botulinum diagnosticum (ova reakcija se zove reverzna reakcija neizravne hemaglutinacije- RONGA). RNHA se koristi za dijagnosticiranje zaraznih bolesti, utvrđivanje gonadotropnog hormona V urina kada se utvrdi trudnoća, za otkrivanje preosjetljivost Do lijekovi, hormoni iu nekim drugim slučajevima.
Reakcija koaglutinacije . Stanice patogena određuju se pomoću stafilokoka, prethodno tretiranih imunološkim dijagnostičkim serumom. Protein koji sadrži stafilokoke A, imati afiniteta prema Fc -fragment imunoglobulina, nespecifično adsorbira antimikrobna protutijela, koja zatim stupaju u interakciju s aktivnim centrima s odgovarajućim mikrobima izoliranima od pacijenata. Kao rezultat koaglutinacije nastaju pahuljice koje se sastoje od stafilokoka, dijagnostičkih serumskih antitijela i mikroba koji se određuje.
Reakcija inhibicije hemaglutinacije (RTGA) temelji se na blokadi, supresiji antigena virusa antitijelima imunološkog seruma, zbog čega virusi gube sposobnost aglutinacije crvenih krvnih stanica (slika 13.3). RTHA se koristi za dijagnosticiranje mnogih virusnih bolesti, čiji uzročnici (gripa, ospice, rubeola, krpeljni encefalitis itd.) mogu aglutinirati eritrocite različitih životinja.
Reakcija aglutinacije za određivanje krvnih grupa koristi se za uspostavljanje ABO sustava (vidi odjeljak 10.1.4.1) pomoću aglutinacije eritrocita s protutijelima imunološkog seruma protiv antigena krvnih grupa A (II), B (III). Kontrole su: serum bez antitijela, tj. serum AB (GU) krvne grupe; antigeni sadržani u eritrocitima skupina A (II), B (III). Negativna kontrola ne sadrži antigene, tj. koriste se eritrociti skupine 0 (I).
U reakcije aglutinacije za određivanje Rh faktora(vidi odjeljak 10.1.4.1) koristite anti-Rh serume (barem dvije različite serije). U prisutnosti Rh antigena na membrani proučavanih eritrocita dolazi do aglutinacije ovih stanica. Kao kontrola služe standardni Rh pozitivni i Rh negativni eritrociti svih krvnih grupa.
Reakcija aglutinacije za određivanje anti-rezus antitijela ( neizravna reakcija Coombs)koristi se kod bolesnika s intravaskularna hemoliza. U nekih od ovih bolesnika nađu se anti-rezus antitijela, koja su nepotpuna, monovalentna. Oni specifično djeluju na Rh-pozitivne eritrocite, ali ne uzrokuju njihovu aglutinaciju. Prisutnost takvih nepotpunih protutijela utvrđuje se neizravnom Coombsovom reakcijom. Da bi se to postiglo, sustavu anti-Rh protutijela + Rh-pozitivni eritrociti dodaje se antiglobulinski serum (antitijela protiv humanih imunoglobulina), što uzrokuje aglutinaciju eritrocita (slika 13.4). Pomoću Coombsove reakcije dijagnosticiraju se patološka stanja povezana s intravaskularnom lizom eritrocita imunološkog podrijetla, na primjer, hemolitička bolest novorođenčadi: eritrociti Rh-pozitivnog fetusa kombiniraju se s nepotpunim antitijelima na Rh faktor koji cirkulira u krvi, koji su prešli posteljica od Rh-negativne majke.
Reakcije taloženja
reakcija taloženja - RP (odlat. praeci-pito- precipitat,) je stvaranje i taloženje kompleksa topljivog molekularnog antigena s protutijelima u obliku zamućenja tzv. talog. Nastaje miješanjem antigena i antitijela u ekvivalentnim količinama; višak jednog od njih smanjuje razinu formiranja imunološkog kompleksa.
Reakcije taloženja staviti u epruvete (reakcija taloženja prstena), u gelovima, hranjivim medijima itd. Različite reakcije taloženja u polutekućem gelu agara ili agaroze naširoko se koriste: dvostruka imunodifuzija po Ouchterlonyju. radijalna imunodifuzija, imunoelektroforeza i tako dalje.
Prstenasta reakcija taloženja . Reakcija se provodi u uskim epruvetama za taloženje s imunološkim serumom, na koji je naslojen topljivi antigen. Uz optimalan omjer antigena i protutijela, na granici ovih dviju otopina nastaje neproziran precipitatni prsten (slika 13.5). Višak antigena ne utječe na rezultat reakcije taloženja prstena zbog postupne difuzije reagensa do granice tekućine. Ako se kao antigeni u reakciji prstenaste precipitacije koriste prokuhani i filtrirani vodeni ekstrakti organa ili tkiva, tada se takva reakcija naziva reakcija termoprecipitacije-iii (Ascolijeva reakcija, s antraksom /
Oukhterunijeva reakcija dvostruke imunodifuzije . Za postavljanje reakcije, rastopljeno agar gel tanki sloj se izlije na staklenu ploču i nakon stvrdnjavanja u njoj se izrezuju rupe veličine 2-3 mm. Antigeni i imunološki serumi stavljaju se odvojeno u te jažice, koje difundiraju jedna prema drugoj. Na mjestu susreta u jednakim omjerima stvaraju talog u obliku bijele trake. U višekomponentnim sustavima pojavljuje se nekoliko linija precipitata između jažica s različitim antigenima i serumskim protutijelima; za identične antigene, linije precipitata se spajaju; za neidentične se sijeku (sl. 13.6).
Reakcija radijalne imunodifuzije . Imuni serum s rastopljenim agar gelom ravnomjerno se izlije na staklo. Nakon skrućivanja u gelu prave se jažice u koje se stavlja antigen razna razrjeđenja. Antigen, difundirajući u gel, formira prstenaste precipitacijske zone oko jažica s protutijelima (slika 13.7). Promjer precipitacijskog prstena proporcionalan je koncentraciji antigena. Reakcija se koristi za određivanje razine imunoglobulina različitih klasa u krvi, komponenti sustava komplementa itd.
Imunoelektroforeza- kombinacija metode elektroforeze i imunoprecipitacije: smjesa antigena se unosi u jažice gela i elektroforezom razdvaja u gelu. Zatim se, paralelno sa zonama elektroforeze, u utor unosi imunološki serum, čija se antitijela, difuzijom u gel, formiraju na mjestu susreta s antigenom linije taloženja.
reakcija flokulacije(prema Ramonu) (od lat. flokus- wool flakes) - pojava opalescencije ili flokulentne mase (imunoprecipitacija) u epruveti tijekom reakcije toksin-antitoksin ili anatoksin-antitoksin. Koristi se za određivanje aktivnosti antitoksičnog seruma ili toksoida.
imun elektronska mikroskopija - elektronska mikroskopija mikroba, češće virusa, tretiranih odgovarajućim antitijelima. Virusi tretirani imunološkim serumom stvaraju imunološke nakupine (mikroprecipitate). Oko viriona formira se "vijenac" protutijela, u kontrastu s fosfovolframovom kiselinom ili drugim elektronoptički gustim pripravcima.
Reakcije koje uključuju komplement
Reakcije koje uključuju komplementtemelji se na aktivaciji komplementa kompleksom antigen-antitijelo (reakcija fiksacije komplementa, radijalna hemoliza itd.).
Reakcija fiksacije komplementa (RSK) leži u činjenici da, kada odgovaraju jedni drugima, antigeni i antitijela tvore imunološki kompleks, na koji, kroz Fc -fragment antitijela pridružuje se komplementu (C), tj. do vezivanja komplementa dolazi s kompleksom antigen-antitijelo. Ako se kompleks antigen-antitijelo ne formira, tada komplement ostaje slobodan (slika 13.8). RSK se provodi u dvije faze: 1. faza - inkubacija smjese koja sadrži tri komponente antigen + antitijelo + komplement; 2. faza (indikator) - detekcija slobodnog komplementa u smjesi dodavanjem hemolitičkog sustava koji se sastoji od ovčjih eritrocita i hemolitičkog seruma koji sadrži protutijela na njih. U 1. fazi reakcije, tijekom stvaranja kompleksa antigen-antitijelo, dolazi do vezanja komplementa, a zatim u 2. fazi neće doći do hemolize eritrocita senzibiliziranih protutijelima; reakcija je pozitivna. Ako antigen i antitijelo ne odgovaraju jedno drugom (nema antigena ili antitijela u ispitivanom uzorku), komplement ostaje slobodan iu 2. fazi će se pridružiti kompleksu eritrocit-antieritrocitno antitijelo, uzrokujući hemolizu; reakcija je negativna.
RSK se koristi za dijagnosticiranje mnogih zaraznih bolesti, posebice sifilisa (Wassermanova reakcija).
Reakcija radijalne hemolize (RRH ) stavljen u jažice agar gela koji sadrži ovnove eritrocite i komplement. Nakon dodavanja hemolitičkog seruma (protutijela na eritrocite ovna) u jažice gela, oko njih se formira zona hemolize (kao rezultat radijalne difuzije antitijela). Tako je moguće odrediti aktivnost komplementa i hemolitičkog seruma, kao i protutijela u krvnom serumu oboljelih od gripe, rubeole, krpeljni encefalitis. Da bi se to postiglo, odgovarajući antigeni virusa adsorbiraju se na eritrocite, a pacijentov krvni serum se dodaje u jažice gela koji sadrži te eritrocite. Antivirusna protutijela stupaju u interakciju s virusnim antigenima adsorbiranim na eritrocitima nakon
Komponente komplementa vežu se za ovaj kompleks, uzrokujući hemolizu.
Reakcija imunološke adhezije (RIP ) temelji se na aktivaciji sustava komplementa korpuskularnim antigenima (bakterije, virusi) tretiranim imunološkim serumom. Kao rezultat toga nastaje aktivirana treća komponenta komplementa (C3b) koja se veže za korpuskularni antigen kao dio imunološkog kompleksa. Na eritrocitima, trombocitima, makrofagima postoje receptori za C3b, zbog čega, kada se te stanice pomiješaju s imunološkim kompleksima koji nose C3b, dolazi do njihove kombinacije i aglutinacije.
Reakcija neutralizacije
Antitijela u imunološkom serumu sposobna su neutralizirati štetni učinak mikroba ili njihovih toksina na osjetljive stanice i tkiva, što je povezano s blokadom mikrobnih antigena protutijelima, tj. neutralizacija. Reakcija neutralizacije(RN) provodi se unošenjem mješavine antigen-protutijelo u životinje ili u osjetljive test objekte (kultura stanica, embriji). U nedostatku štetnog učinka mikroorganizama ili njihovih antigena, toksina u životinja i testnih objekata, govore o neutralizirajućem učinku imunološkog seruma i, prema tome, specifičnosti interakcije kompleksa antigen-antitijelo (slika 13.9).
Reakcija imunofluorescencije - RIF (Koonsova metoda)
Postoje tri glavne vrste metode: izravna, neizravna (slika 13.10), s komplementom. Koonsova reakcija je brza dijagnostička metoda za otkrivanje mikrobnih antigena ili otkrivanje protutijela.
Izravna RIF metoda temelji se na činjenici da tkivni antigeni ili mikrobi tretirani imunološkim serumima s antitijelima obilježenim fluorokromima mogu svijetliti u UV zrakama fluorescentnog mikroskopa.
Bakterije u razmazu, tretiranom takvim luminiscentnim serumom, svijetle duž periferije stanice u obliku zelene granice.
Indirektna RIF metoda je identificirati kompleks antigen-antitijelo korištenjem antiglobulinskog (antitijela) seruma obilježenog fluorokromom. Da biste to učinili, razmazi iz suspenzije mikroba tretiraju se antitijelima antimikrobnog dijagnostičkog seruma kunića. Zatim se isperu antitijela koja nisu vezana mikrobnim antigenima, a antitijela koja su ostala na mikrobima detektiraju se tretiranjem razmaza antiglobulinskim (antizečjim) serumom obilježenim fluorokromima. Kao rezultat toga nastaje kompleks mikrob + antimikrobna zečja protutijela + anti-zečja protutijela obilježena fluorokromom. Ovaj kompleks promatra se fluorescentnim mikroskopom, kao i kod izravne metode.
ELISA metoda, odnosno analiza (ELISA)
ELISA -otkrivanje antigena pomoću njihovih odgovarajućih antitijela konjugiranih s enzimom markerom (peroksidaza hrena, beta-galaktozidaza ili alkalna fosfataza). Nakon što se antigen pomiješa s imunološkim serumima obilježenim enzimima, u smjesu se dodaje supstrat/kromogen. Supstrat se cijepa enzimom, a boja produkta reakcije se mijenja - intenzitet boje je izravno proporcionalan broju vezanih molekula antigena i antitijela.
Čvrsta faza ELISA - najčešća varijanta imunološkog testa, kada se jedna od komponenti imunološkog odgovora (antigen ili antitijela) adsorbira na čvrstom nosaču, na primjer, u jažicama polistirenskih ploča
Pri određivanju protutijela u jažice pločica s adsorbiranim antigenom redom se dodaju krvni serum bolesnika, enzimom obilježeni antiglobulinski serum i supstrat (kromogen) za enzim.
Svaki put nakon dodavanja sljedeće komponente, nevezani reagensi se uklanjaju iz jažica temeljitim pranjem. Na pozitivan rezultat mijenja se boja otopine kromogena. Nosilac čvrste faze može se senzibilizirati ne samo antigenom, već i antitijelima. Zatim se u jažice s adsorbiranim antitijelima unosi željeni antigen, dodaje se imunološki serum protiv antigena obilježenog enzimom, a zatim se dodaje supstrat za enzim.
Kompetitivni ELISA . ciljni antigen i enzimom obilježeni antigen međusobno se natječu za vezanje ograničene količine protutijela imunološkog seruma. Drugi test su antitijela koja tražite
a obilježena protutijela međusobno se natječu za antigene.
Radioimunološka metoda ili analiza (RIA)
Vrlo osjetljiva metoda koja se temelji na reakciji antigen-antitijelo pomoću antigena ili antitijela obilježenih radionuklidom (125 J, 14 C, 3 H, 51 Cr itd.). Nakon njihove interakcije, nastali radioaktivni imunološki kompleks se odvaja i njegova radioaktivnost se određuje u odgovarajućem brojaču (beta ili gama zračenje):
intenzitet zračenja izravno je proporcionalan broju vezanih molekula antigena i protutijela.
Na verzija RIA-e u čvrstoj fazi jedna od reakcijskih komponenti (antigen ili antitijela) adsorbira se na čvrsti nosač, na primjer, u jažicama polistirenskih mikronizova. Druga verzija metode je konkurentni RIA. ciljni antigen i radionuklidom obilježeni antigen međusobno se natječu za vezanje ograničene količine protutijela imunološkog seruma. Ova se opcija koristi za određivanje količine antigena u ispitivanom materijalu.
RIA se koristi za otkrivanje mikrobnih antigena, određivanje hormona, enzima, ljekovite tvari i imunoglobulini, kao i druge tvari sadržane u ispitivanom materijalu u manjim koncentracijama - 10 ~ | 0 -I0 ~ 12 g / l. Metoda predstavlja određenu opasnost za okoliš.
Imunobloting
Imunobloting (IB)- visoko osjetljiva metoda koja se temelji na kombinaciji elektroforeze i ELISA ili RIA.
Antigen se izolira elektroforezom u poliakrilamidnom gelu, zatim se prenosi (blotiranje - od engl. mrlja, spot) iz gela na aktivirani papir ili nitroceluloznu membranu i razvijen pomoću ELISA. Tvrtke proizvode takve trake s "mrljama"
antigeni. Na ove trakice nanosi se serum pacijenta. Zatim se nakon inkubacije bolesnik ispere od nevezanih protutijela bolesnika i aplicira serum protiv humanih imunoglobulina, obilježen enzimom. Kompleks antigen + antitijelo pacijenta + antitijelo protiv humanog Ig koji se formira na traci detektira se dodavanjem supstrata / kromogena koji mijenja boju pod djelovanjem enzima (slika 13.12).
IB se koristi kao dijagnostička metoda za HIV infekciju itd.
Aglutinacija se naziva aglutinacija bakterija kao rezultat interakcije s njima specifičnih AT. RA zahtijeva tri komponente: 1) AG (aglutinogen); 2) AT (aglutinin); 3) otopina elektrolita (izotonična otopina natrijeva klorida). U reakciji aglutinacije sudjeluju samo korpuskularni antigeni (bakterije, eritrociti, čestice lateksa opterećene antigenom).
Reakcija aglutinacije na staklu. Kap dijagnostičkog seruma (razrjeđenje seruma 1:10 - 1:20) pipetom se nanese na nemasno predmetno staklo. Čista kultura mikroorganizma koji se proučava uzima se s površine kosog agara bakteriološkom petljom, prenosi u kap seruma i miješa. Rezultat reakcije se uzima u obzir golim okom nakon 3-5 minuta. Uz pozitivnu reakciju u kapi seruma, bilježi se pojava pahuljica (velikih ili malih), jasno vidljivih na tamnoj pozadini kada se predmetno staklo protrese. U slučaju negativne reakcije, tekućina ostaje jednoliko zamućena.
Reakcija aglutinacije u epruvetama. Dodajte 1 ml fiziološke otopine u određeni broj epruveta. Dodajte jednaki volumen ispitivanog krvnog seruma u prvu epruvetu. Pripravljaju se sekvencijalna dvostruka razrjeđenja seruma (titracija seruma), nakon čega se u svaku epruvetu dodaju po 2 kapi suspenzije inaktiviranih bakterija (diagnosticum). Epruvete se stave 2 sata u termostat na 37°C. Reakcija se nastavlja stvaranjem malih pahuljica, nevidljivih golim okom, stoga se rezultati bilježe pod blagim porastom u posebnom uređaju - aglutinoskopu. Intenzitet aglutinacije uzima se u obzir prema sustavu "četiri plusa": potpuna aglutinacija - 4+, djelomična aglutinacija - 3+ ili 2+, sumnjiv rezultat - +. Posljednje razrjeđenje u kojem se opaža aglutinacija na 2+ uzima se kao titar protutijela u ispitivanom serumu.
Reakcija aglutinacije u epruvetama (reakcija produžene aglutinacije) provodi se radi određivanja titra protutijela na uzročnike bolesti. trbušni tifus i paratifus (Vidalova reakcija), bruceloza (Wrightova reakcija), tifus (Weiglova reakcija).
Aglutinacija (od lat. agglutinatio - veza) - vezivanje (povezivanje) korpuskularnih čestica koje nose antigen (cijele stanice, čestice lateksa itd.) sa specifičnim molekulama antitijela u prisutnosti elektrolita, koje završava stvaranjem ljuskica ili taloga (aglutinacija). ) vidljivo golim okom. Priroda sedimenta ovisi o prirodi antigena: flagelarne bakterije daju sediment velikih pahuljica, flagelarne i bez kapsule - fino zrnate, kapsularne - žilaste. Razlikovati izravnu aglutinaciju, u kojoj interakcija sa specifičnim protutijelima izravno uključuje vlastite antigene bakterijske ili bilo koje druge stanice, poput eritrocita; i neizravne, ili pasivne, u kojima su bakterijske stanice ili eritrociti, ili čestice lateksa nositelji ne svojih vlastitih, već stranih antigena (ili antitijela) adsorbiranih na njih kako bi se otkrila antitijela (ili antigeni) koja su za njih specifična. Reakcija aglutinacije uglavnom uključuje protutijela koja pripadaju klasama IgG i IgM. Protječe u dvije faze: prvo, postoji specifična interakcija aktivnog središta protutijela s determinantom antigena, ova se faza može dogoditi u nedostatku elektrolita i nije popraćena vidljivim promjenama u reakcijskom sustavu. Za drugu fazu - stvaranje aglutinata - neophodna je prisutnost elektrolita koji smanjuju električno punjenje komplekse antigen + antitijelo i ubrzavaju proces njihova vezivanja. Ova faza završava stvaranjem aglutinata.
Aglutinacijske reakcije postavljaju se na staklene ili glatke kartonske ploče ili u sterilne aglutinacijske epruvete. Obično se koriste reakcije aglutinacije (izravne i pasivne) na staklu ubrzana metoda otkrivanje specifičnih protutijela u serumu bolesnika (na primjer, s brucelozom) ili za serološku identifikaciju patogena. U potonjem slučaju obično se koriste dobro pročišćeni (adsorbirani) dijagnostički serumi koji sadrže samo monoreceptorska protutijela ili njihov skup na različite antigene. Nedvojbena prednost reakcije aglutinacije na staklu je jednostavnost njezine formulacije i činjenica da traje nekoliko minuta ili čak sekundi, budući da se obje komponente koriste u njoj u koncentriranom obliku. Međutim, on ima samo kvalitativnu vrijednost i manje je osjetljiv od epruvete. Prošireni test aglutinacije u epruvetama daje točnije rezultate, jer vam omogućuje određivanje kvantitativnog sadržaja protutijela u serumu (postavljanje njegovog titra) i, ako je potrebno, registraciju činjenice povećanja titra protutijela, što je dijagnostički. vrijednost. Za postavljanje reakcije u aglutinacijske epruvete dodajte na određeni način razrijeđen sa 0,85% otopina NaCl seruma i jednakog volumena (obično 0,5 ml) suspenzije standardnog dijagnostikuma (ili test kulture) koja sadrži 1 milijardu bakterija u 1 ml. Računanje rezultata reakcije aglutinacije provodi se preliminarno nakon 2 sata inkubacije epruveta na 37 ° C i konačno nakon 20-24 sata prema dva kriterija: prisutnosti i veličini precipitata i stupnju prozirnosti taloga. supernatant. Ocjenjivanje se provodi po sustavu četiri križića. Reakcija je nužno popraćena kontrolom seruma i antigena. U onim slučajevima kada se za serološku identifikaciju uzročnika koristi detaljan test aglutinacije u epruveti, dijagnostičku vrijednost ima ako je reakcija ocijenjena pozitivnom kada je dijagnostički serum razrijeđen s najmanje polovicom svog titra.
Treba uzeti u obzir da se pri miješanju otopina homolognih antigena i protutijela ne uočavaju uvijek vidljive manifestacije reakcije aglutinacije. Talog nastaje samo pri određenim optimalnim omjerima obje komponente reakcije. Izvan ovih granica, sa značajnim viškom antigena ili antitijela, nema reakcije. Taj se fenomen naziva "fenomen prozone". Uočava se i u reakciji aglutinacije i u reakciji taloženja. Pojava prozona u imunološkim reakcijama objašnjava se činjenicom da su antigeni uključeni u njih u pravilu polideterminantni, a molekule IgG antitijela imaju dva aktivna centra. S viškom protutijela površina svake antigenske čestice prekriva se molekulama protutijela tako da ne ostaju slobodne determinantne skupine, pa drugi, nevezani aktivni centar protutijela ne može djelovati s drugom antigenskom česticom i međusobno ih vezati. Stvaranje vidljivog aglutinata ili precipitata također je potisnuto kada postoji višak antigena, kada nema više niti jednog slobodnog aktivnog mjesta antitijela, pa se stoga kompleksi antigen + antitijelo + antigen više ne mogu povećavati.
Mogućnosti ubrzanih reakcija aglutinacije. Reakcija pasivna hemaglutinacija i njegove varijante
Klasična reakcija aglutinacije uključuje upotrebu korpuskularnih antigena. Međutim, topljivi antigeni također mogu biti uključeni. Da bi to bilo moguće, takvi antigeni se adsorbiraju na imunološki inertne čestice. Kao nosač mogu se koristiti čestice lateksa ili bentonita, ali trenutno se najčešće koriste eritrociti životinja ili ljudi, koji poboljšavaju svoja adsorpcijska svojstva tretiranjem otopinama tanina, formalina ili benzidina. Eritrociti koji adsorbiraju antigen na sebe nazivaju se senzibilizirani ovim antigenom, i imunološki odgovor, u kojoj sudjeluju, - reakcija neizravne ili pasivne hemaglutinacije (RNHA ili RPHA), budući da eritrociti u njoj sudjeluju pasivno.
RPGA se postavlja u posebne polistirenske ploče s rupama koje imaju polukuglasto dno. Kada se koristi za serološku dijagnostiku, u tim se jažicama pripremaju dvostruka razrjeđenja fiziološka otopina ispitivanog seruma, a zatim mu se kao dijagnostički pribor dodaje suspenzija senzibiliziranih eritrocita. Rezultati se bilježe nakon 2 sata inkubacije na 37 °C prema sustavu četiri križa. Uz pozitivnu reakciju, aglutinirani eritrociti talože se na dnu rupe i ravnomjerno ga prekrivaju u obliku obrnutog kišobrana. Uz negativnu reakciju, eritrociti se također talože, tekućina postaje prozirna, talog izgleda kao mali "disk" u središtu rupe. Titar seruma u RPHA smatra se njegovim posljednjim razrjeđenjem, koje još uvijek daje izraženu hemaglutinaciju bez značajni znakovi imajući disk.
RPHA se također može koristiti kao ubrzana metoda bakteriološke dijagnostike za otkrivanje nepoznatih bakterija, virusa, toksina, kao što su uzročnici kuge, stafilokokni enterotoksini i dr., izravno u ispitivanom materijalu antitijela - antitijela eritrocitni dijagnostikum. Ako testni materijal sadrži dovoljnu količinu poznatog antigena, TPHA će biti pozitivan.
Mogućnosti korištenja RPGA su: reakcija neutralizacije antigena (RNAg), reakcija neutralizacije antitijela (RNAt), reakcija inhibicije pasivne hemaglutinacije (RPHA). Za ove reakcije koriste se eritrocitni dijagnostikumi antigena i antitijela. Dvije međusobno kontrolirane jednosmjerne reakcije mogu se koristiti istovremeno, na primjer, RPHA s antigenskim dijagnostikumom i RNAg s eritrocitnim dijagnostikumom protutijela.
Reakcija neutralizacije antitijela (RNAt) sastoji se u činjenici da se suspenzija koja sadrži željeni antigen pomiješa sa specifičnim imunološkim serumom koji sadrži poznata antitijela u odgovarajućim količinama i inkubira se na 37 °C dva sata. Nakon toga se dodaje antigenski eritrocitni dijagnostikum. Smjesa se protrese i ostavi na sobnoj temperaturi. Rezultati se uzimaju u obzir nakon 3-4 sata i konačno - nakon 18-24 sata.Ako u ispitivanom materijalu postoji antigen, on će vezati antitijela (neutralizirati ih), te stoga neće doći do hemaglutinacije.
Po istom principu provodi se reakcija neutralizacije antigena (RNAg). Samo u ovom slučaju, antitijela se otkrivaju u ispitivanom materijalu. Specifični antigen dodan takvom ispitivanom materijalu vezat će se za antitijela koja se u njemu nalaze, odnosno antigen će biti neutraliziran antitijelima, pa stoga neće doći do hemaglutinacije kada se doda eritrocitni dijagnostikum antitijela.
Reakcija koaglutinacije. To je jedna od opcija za pasivnu, tj. stanično posredovanu reakciju ubrzane aglutinacije na staklu s antitijelom-nosačem. Ova reakcija se temelji na jedinstveno svojstvo Staphylococcus aureus, koji ima protein A u svojoj staničnoj stijenci, vežu se na Fc fragmente IgG i IgM. U isto vrijeme, aktivni centri antitijela ostaju slobodni i mogu komunicirati sa specifičnim determinantama antigena. Na predmetno staklo nanese se kap 2% suspenzije stafilokoka senzibiliziranog odgovarajućim antitijelima i doda se kap suspenzije ispitivane bakterije. Kada antigen odgovara antitijelima, nakon 30-60 sekundi dolazi do jasne aglutinacije stafilokoka opterećenih antitijelima.
Reakcija lateks aglutinacije (LAH). Nositelj antitijela u ovom dijagnostičkom sustavu su male standardne čestice lateksa. Reakcija se provodi mikrometodom u jažicama na staklu. Glavni uvjet za uspješno postavljanje PAH-a je strogo poštivanje kvantitativnih omjera komponenti sustava: 10 µl pripravka lateksa senzibiliziranog antitijelima dodaje se u 50 µl ispitivanog materijala. Specifičnost PAH-a kontrolira se pomoću tri kontrolna testa sadržana u komercijalnim testnim sustavima: poznata pozitivna reakcija, poznata negativna reakcija i kontrola kvalitete suspenzije lateksa za lateks koji nije osjetljiv na PAH (ne sadrži antitijela) s testom materijal. U našoj se zemlji kao nositelji specifičnih protutijela koriste monodisperzni polistirenski lateksi s različitim promjerima čestica (0,3; 0,66; 0,75; 0,8 μm). LAH se koristi za brzu detekciju mikroorganizama ili njihovih antigena u ispitivanom materijalu.
Imunomagnetska detekcija antigena. Jedna od opcija za ubrzanu reakciju aglutinacije na staklu povezana je s uporabom supermagnetskih polimernih čestica obloženih specifičnim protutijelima. Jedna takva čestica veže do 107-108 stanica mikroorganizama, zbog čega se osjetljivost ovu metodu doseže 5 CFU / ml. Imunomagnetska detekcija mikroorganizama može se koristiti u kombinaciji s CPR-om.
Reakcija agregatno-hemaglutinacije (RAGA). Omogućuje vam brzo otkrivanje u krvi pacijenata i antigena koji slobodno cirkuliraju (antigenemija) i antigena povezanih s antitijelima - cirkulirajućih imunoloških kompleksa (CIC). Za RAGA se koriste eritrociti senzibilizirani odgovarajućim antitijelima. Dodavanjem krvnog seruma bolesnika koji sadrži antigene na senzibilizirane eritrocite, na koje su fiksirana antitijela, dolazi do lijepljenja (aglutinacije) eritrocita i imunoloških kompleksa.
Antiglobulinski Coombsov test (R. Coombsova reakcija). Uz pomoć izravne i pasivne reakcije aglutinacije određuju se kompletna (bivalentna) protutijela. Nepotpuna (monovalentna, blokirajuća) protutijela ne otkrivaju se ovim metodama, jer u kombinaciji s antigenom blokiraju ga, ali ne mogu uzrokovati agregaciju antigena u velike konglomerate. Nepotpuna (blokirajuća) protutijela su ona kod kojih djeluje samo jedno aktivno središte; drugi aktivni centar ne radi iz nepoznatog razloga. Za identifikaciju nepotpunih protutijela koristi se posebna Coombsova reakcija (slika 72). U reakciji sudjeluju: bolesnikov serum u kojem se utvrđuju nepotpuna antitijela, korpuskularni antigen-dijagnostikum, antiglobulinski serum koji sadrži antitijela na humani globulin. Reakcija se odvija u dvije faze:
Interakcija antigena s nepotpunim antitijelima. Nema vidljivih manifestacija. Prva faza je završena ispiranjem antigena iz ostataka pacijentovog seruma.
Interakcija antiglobulinskog seruma, dobivenog kao rezultat imunizacije životinje humanim globulinom, s nepotpunim antitijelima adsorbiranim na antigen. Zbog činjenice da su antiglobulinska antitijela bivalentna, ona vežu dva monovalentna antitijela zasebnih kompleksa antigen +. nepotpuno antitijelo, što dovodi do njihovog lijepljenja i pojave vidljivog taloga.
Sadržaj predmeta "Imunomodulatori. Imunodijagnostika zaraznih bolesti.":Proširena reakcija aglutinacije (RA). Da biste odredili AT u krvnom serumu pacijenta, stavite produljena reakcija aglutinacije (RA). Da bi se to postiglo, nizu razrjeđenja krvnog seruma dodaje se dijagnostikum - suspenzija ubijenih mikroorganizama ili čestica s adsorbiranim Ag. Maksimalno davanje razrjeđenja aglutinacija Ag, naziva se titar krvnog seruma.
Vrste reakcija aglutinacije (RA) za otkrivanje AT - test kapi krvi na tularemiju (sa nanošenjem dijagnostikuma na kap krvi i pojavom vidljivih bjelkastih aglutinata) i Huddlesonova reakcija na brucelozu (sa nanošenjem dijagnostikuma gentian violeta na kap krvnog seruma).
Približna reakcija aglutinacije (RA)
Za identifikaciju izoliranih mikroorganizama, približna RA se stavlja na stakalce. Da biste to učinili, kultura patogena se dodaje kapi standardnog dijagnostičkog antiseruma (u razrjeđenju 1:10, 1:20). Ako je rezultat pozitivan, daju detaljnu reakciju s rastućim razrjeđenjima antiseruma.
reakcija smatra se pozitivnim ako se aglutinacija uoči u razrjeđenjima bliskim titru dijagnostičkog seruma.
OAS. Somatski O-Ag toplinski su stabilni i podnose vrenje 2 h. U interakciji s AT stvaraju sitnozrnate agregate.
N-Ag. H-Ag (flagelat) termolabilan i brzo se uništava na 100 °C, kao i pod djelovanjem etanola. U reakcijama s H-antiserumom, nakon 2 sata inkubacije, stvaraju se rastresite velike ljuskice (tvore ih bakterije koje se slijepe flagelama).
Vi Ar bakterija tifusa je relativno termostabilna (podnosi temperaturu od 60-62 ° C 2 sata); pri inkubaciji s Vi-antiserumom nastaje sitnozrnati aglutinat.
Reakcije izravne hemaglutinacije
Najjednostavniji od ovih reakcije - aglutinacija eritrocita, odnosno hemaglutinacija, služi za određivanje krvnih grupa u sustavu AB0. Za određivanje aglutinacija(ili njegovog odsustva) koriste se standardni antiserumi s anti-A i anti-B aglutininima. Reakcija se naziva izravna, budući da su proučavani antigeni prirodne komponente eritrocita.
Podijeljeno sa izravna hemaglutinacija mehanizama ima virusnu hemaglutinaciju. Mnogi virusi sposobni su spontano aglutinirati eritrocite ptica i sisavaca, a njihov dodatak u suspenziju eritrocita uzrokuje stvaranje nakupina iz njih.
