imunološke reakcije. Primjena imunoloških odgovora u dijagnostici zarazne bolesti.
PLAN:
Vrste imunoloških reakcija.
Uvjeti za provođenje seroloških reakcija.
Zahtjevi za serum.
Pojam pozitivnih i negativnih rezultata.
GLAVNI SADRŽAJ:
Vrste imunoloških reakcija.
Imunološka reakcija – ovo je interakcija antigena s antitijelom, koja je određena specifičnom interakcijom aktivnih centara antitijela (paratopa) s epitopima antigena.
Opća klasifikacija imunoloških reakcija:
serološke reakcije – reakcije između antigena (Ag) i antitijela (Ig)
in vitro ;
stanične reakcije uz sudjelovanje imunokompetentnih stanica;
alergijski testovi - otkrivanje preosjetljivosti.
Serološke reakcije: 1) definicija, 2) faze, 3) postavljanje cilja, 4) opća klasifikacija.
1) Definicija
Serološke metode istraživanje (od lat. Serum - serum i logos - podučavanje) pomoću reakcije antigen-antitijelo.
2) Faze
2 faze interakcije:
ja Specifično (vidljiv) - dolazi brzo, antitijela se spajaju sa svojim odgovarajućim antigenima. U ovoj fazi međusobno djeluju determinantne skupine antigena (AG) i aktivni centri antitijela (AT).
Sile uključene u formiranje kompleksa AG + AT su:
Coulomb;
Van der Waals
Vodikove veze.
U ovoj fazi nema vidljivih promjena. Pod elektronskom mikroskopijom, kompleks AG + AT u obliku rešetke.
II. Nespecifičan - dolazi sporo, formirani kompleks antigen-protutijelo reagira s dodatnim nespecifičnim čimbenikom sredine u kojoj se reakcija javlja, a to je vidljivo oku - lijepljenje, otapanje, taloženje ljuskica i sl. U prisutnosti elektrolita, smanjuje se naboj, smanjuje se topljivost, stvaraju se taloženi (aglutiniraju) vidljivi konglomerati.
3) Postavljanje ciljeva :
a) za identifikaciju antigena (poznato antitijelo-dijagnostički serum):
serološka identifikacija (identifikacija vrste);
serotipizacija (određivanje serovara) - određivanje soja;
u patološkom materijalu (ekspresna dijagnostika);
u čistoj kulturi:
b) za otkrivanje antitijela (Ig) (antigen poznat-diagnosticum):
prisutnost (kvalitativne reakcije);
količina (porast titra – metoda „parnih seruma“).
4) Opća klasifikacija serološke reakcije :
a) jednostavni (2-komponentni: Ag + Ig):
RA reakcije aglutinacije (s korpuskularnim antigenom);
RP precipitacijske reakcije (s topivim antigenom);
b) kompleksni (3-komponentni: Ag + Ig + C);
c) pomoću oznake.
Varijante reakcije aglutinacije i taloženja
Reakcija aglutinacije :
Reakcija aglutinacije (RA) - imunološki odgovor interakcija suspenzije AG (eritrociti, bakterije) s AT u fiziološka otopina.
Tijekom aglutinacije čestice AT se lijepe uz stvaranje flokulentnog taloga.
Reakcija pasivna hemaglutinacija(RPHA) je vrsta reakcije aglutinacije u kojoj se koristi antitijelo ili antigenski eritrocitni dijagnostikum (eritrociti s adsorbiranim AT ili AG na svojoj površini).
Eritrociti u ovoj reakciji djeluju kao pasivni prijenosnici.
Evaluacija rezultata RPGA provodi se na sljedeći način:
- na pozitivna reakcija pasivno zalijepljeni eritrociti pokrivaju dno rupice u obliku slova U ili V ravnomjernim slojem s nazubljenim rubovima ("kišobran");
- na povratni udar (nedostatak aglutinacije), eritrociti se nakupljaju u središnjem udubljenju rupe, tvoreći kompaktni "gumb" s oštro definiranim rubovima.
U dijagnozi se koristi test inhibicije hemaglutinacije (RTGA). virusne infekcije. Neki virusi sadrže protein hemaglutinin na svojoj površini, koji spaja crvene krvne stanice. Dodatak specifičnih antivirusnih antitijela blokira virusni hemaglutinin – nema hemaglutinacije.
Za određivanje nepotpunih protutijela koristi se reakcija neizravne hemaglutinacije (RIHA) ili Coombsova reakcija. Dodatak antiglobulinskog seruma (AT protiv humanog Ig) pojačava rezultate reakcije. RNGA se koristi za određivanje Rh faktora.
Za postavljanje reakcije aglutinacije (RA) potrebne su tri komponente:
1) antigen (aglutinogen) AG;
2) antitijelo(aglutinin) AT;
3)
elektrolit
(izotonična otopina natrijeva klorida).
Ag + AT + elektrolit = aglutinat
Aglutinacija (od lat. agglutinatio - lijepljenje) - lijepljenje tjelešaca (bakterija, eritrocita i dr.) protutijelima u prisutnosti elektrolita - natrijeva klorida.
RA se manifestira u obliku pahuljica ili sedimenta koji se sastoje od tjelešaca (na primjer, bakterija, eritrocita), "slijepljenih" protutijelima.
RA se koristi za:
Reakcija izravne aglutinacije mikroba (RA).
U ovoj reakciji protutijela (aglutinini) izravno aglutiniraju korpuskularne antigene (aglutinogene).
Obično su predstavljeni suspenzijom inaktiviranih mikroorganizama (reakcija mikrobne aglutinacije).
služi za određivanje vrste mikroorganizmastandardni dijagnostički aglutinirajući serum ( poznat AT ).
Najčešći su lamelarni (indikativni) i raspoređeni RA.
Lamelarni RA postavlja se na staklo. Koristi se kao ubrzana metoda za otkrivanje protutijela ili identifikaciju mikroorganizama.
Komponente:
1. standardni dijagnostički aglutinirajući serumi (AT);
2. ispitati čistu kulturu od pacijenta;
3. fiziološka otopina.
U proučavanoj čistoj kulturi antigeni (AG) su u obliku čestica (stanice mikroba, eritrocita i drugih korpuskularnih antigena), koje su slijepljene protutijelima i talože se.
Primjer:
uprizorenje indikativan reakcije aglutinacije (RA ) na staklu kako bi se identificirale bakterije crijevne skupine.
Kapi se nanose na predmetno staklo:
1
dizenterija
;
2
-ta kap: - aglutinirajući serum na patogenetrbušni tifus
;
(1-2 dijagnostička seruma)
3
-ta kap: - fiziološka otopina (kontrola).
U svaku kap dodaje se ispitana čista kultura bakterija. Promiješati.
Proizlaziti
:
pozitivan
- prisutnost aglutiniranih ljuskica,
negativan
- nema aglutiniranih ljuskica
Zaključak:Proučavane bakterije su uzročnici trbušnog tifusa (utvrđeni su antigeni).
Za određivanje antitijela u serumu bolesnika (serološka dijagnoza), standardni mikrobdijagnostikum koji sadrži suspenzijupoznati mikroba ili njihovih antigenaAG .
Određivanje krvnih grupa ABO sustava (reakcija hemaglutinacije (RHA)) – aglutinirati eritrocite.
Komponente reakcije:
1. AG (eritrociti) test krvi
2. AT (eritrotestovi - tsolikloni)
Zoliclone set:
Reagens Tsoliklon anti-A (ružičasti)
Reagens Tsoliklon anti-B (plavi)
Zoliclone anti-AB reagens (bezbojan)
3. elektrolit (fiziološka otopina)
Tehnika definicije:
1
.
Jedna kap (0,1 ml) anti-A, anti-B i anti-AB tsoliklona (za kontrolu) aplicira se u jažice tablete.
2.
Uz svaku kap reagensa stavlja se mala (0,05-0,01 ml) kap ispitivane krvi.
Zatim se kap tsoliklona pomiješa s kapi krvi s pojedinačnim čistim staklenim štapićem.
3.
Reakcija aglutinacije se razvija tijekom prvih 3-5 sekundi kada se ploča lagano ljulja.
Rezultati reakcije uzimaju se u obzir 2,5 - 3 minute nakon miješanja kapi. S lijeva na desno u anti-A, anti-B, anti-AB jažicama.
Pozitivan rezultat je pojava zrnastog taloga (aglutinata).
pozitivan RA (+)
Negativno - nema taloga.
negativan RA(-)
4.
Analiza rezultata.
O(ja) α β – nema aglutinacije
A(II) β – aglutinacija s anti-A
B(III) α – aglutinacija s anti-B
AB(IV)O - aglutinacija s anti-A, s anti-B
Shematski prikaz aglutinacije.
AH antigeni na eritrocitima (otkriveni) + antitijelaNA(tsoliklon) dijagnostički serum
Računanje aglutinacije u pločama
Reakcija taloženja:
Reakcija precipitacije je imunološka reakcija interakcije AG u topljivom stanju s AT u fiziološkoj otopini.
Tijekom taloženja dolazi do stvaranja makromolekularnog imunološkog kompleksa, što se očituje prijelazom prozirne koloidne otopine u neprozirnu suspenziju, odnosno precipitat.
Količina oba reagensa mora biti u strogo određenim omjerima, jer višak jednog od njih smanjuje rezultat.
postojati razne načine postavljanje reakcije taloženja.
1. Reakcija prstenastog taloženja stavlja se u taložne cijevi malog promjera. U epruvetu se dodaje imunološki serum, a topljivi antigen pažljivo se slojevito postavlja. AG i AT se miješaju zbog toplinskog kretanja molekula i međusobno djeluju. Na pozitivan rezultat na granici dviju otopina nastaje prsten neprozirnog taloga.
2. Ouchterlonyjeva dvostruka imunodifuzijska reakcija provodi se u agar gelu, u čije se jažice dodaje otopina AG ili otopina AT prema shemi. AG i AT difundiraju u gel jedan prema drugom i, ako je reakcija pozitivna, tvore imunološke komplekse, vidljive kao precipitacijske linije.
Reakcija taloženja -ovu formacijui taloženje kompleksa topljivog molekularnog antigena s protutijelima u obliku zamućenja, koje se naziva precipitat. Nastaje miješanjem antigena i antitijela u ekvivalentnim količinama.
RA komponente:
taloženi serum (poznat kao AT-precipitin);
testni serum (nepoznati AG-precipitinogen);
fizički Riješenje.
Reakcija taloženja se stavlja u ili u posebne uske epruvete (reakcija prstenaste precipitacije), ili u Petrijeve zdjelice u gelovima, hranjivim podlogama i sl.
Prstenasta reakcija taloženja
Izjava i obračun rezultata reakcijeprstenasta oborinaza otkrivanje patogena antraks(Ascolijeva reakcija).
uprizorenje .
1. Ispitni materijal (koža, vuna, filc, čekinje, tkanina, meso, zemlja, životinjski izmet itd.) kuha se u fiziološkoj otopini 5-45 minuta. da se dobije izotonični ekstrakt (ekstrakt). Filtar.
2. Ulijte taloženi serum protiv antraksa u epruvetu.
3. Pažljivo nanesite sloj ispitnog materijala (ekstrakta).
Računovodstvo .
U sljedećih 10 min. na granici između seruma i ekstrakta, u pozitivnih slučajeva, pojavljuje se prsten zamućenja (prstenasta precipitacija). Ascolijeva reakcija je vrlo osjetljiva i specifična
Uz njegovu pomoć moguće je brzo identificirati materijale zaražene antraksom.
Reakcija taloženja u agaru
Iskaz i obračun rezultatareakcije taloženja agaraza određivanje toksigenosti korinebakterija (uzročnika difterije)
uprizorenje
Postavljen na fosfat-peptonski agar u Petrijevu zdjelicu.
1. Traka sterilnog filter papira navlažena saantitoksični serum.
2. Nakon sušenja, na udaljenosti od 1 cm od ruba trake, posijane su ploče promjera 10 mm.izolirani usjevi.
U jednoj čašici možete posijati od 3 do 10 kultura, od kojih je jedna,kontrolirati, mora se znatitoksigeni.
Usjevi se stavljaju u termostat.
Računovodstvo
Analiza se provodi nakon 24-48-72 sata.
Pozitivan rezultat - (kulturatoksigeni) - na određenoj udaljenosti od trake papira nastatitaložne linije, « vitičaste strijele“, koji su jasno vidljivi u prolaznom svjetlu.
Na slici je prikazana reakcija taloženja u agaru za određivanje toksigenosti bacila difterije. Srednje kulture nisu formirale "strelice-antene", to nisu toksikogeni patogeni.
Sojevi uzročnika difterije mogu biti toksigeni (stvaraju egzotoksin) i netoksigeni. Stvaranje egzotoksina ovisi o prisutnosti u bakterijama profaga koji nosi tox gen koji kodira stvaranje egzotoksina.
U slučaju bolesti, svi uzročnici difterije se testiraju na toksigenost - stvaranje egzotoksina difterije reakcijom taloženja u agaru.
Složene serološke reakcije ( 3-komponentni: Ag + Ig + C):
Reakcija vezanja komplementa (RSC).
Reakcija se provodi u dvije faze.
U prvoj fazi protutijela stupaju u interakciju s AG i komplementom, u drugoj fazi dodaje se indikator - hemolitički sustav (mješavina eritrocita i antieritrocitnog seruma).
S pozitivnim rezultatom, u prvoj fazi, AT stvara imunološki kompleks s AG, koji veže komplement reakcijske smjese.
U ovom slučaju, eritrociti hemolitičkog sustava dodani u drugoj fazi nisu uništeni.
Inače, nevezani komplement uzrokuje lizu indikatorskih crvenih krvnih stanica.
Potrebno je pet sastojaka: AG, AT i komplement (prvi sustav), eritrociti ovna i hemolitički serum (drugi sustav) (slika 1).
Reakcija se odvija u dvije faze (slika 3).
Prva faza - interakcija antigena i protutijela uz obvezno sudjelovanje komplementa.
Drugi - identifikacija rezultata reakcije pomoću indikatorskog hemolitičkog sustava (ovčji eritrociti i hemolitički serum). Uništavanje eritrocita hemolitičkim serumom događa se samo u slučaju vezanja komplementa na hemolitički sustav. Ako je komplement ranije adsorbiran na kompleks antigen-antitijelo, tada ne dolazi do hemolize eritrocita (slika).
Rezultat iskustva
procijeniti (slika 2), bilježeći prisutnost ili odsutnost hemolize u svim epruvetama. Reakcija se smatra pozitivnom s potpunim odgodom hemolize, kada je tekućina u epruveti bezbojna, a eritrociti se talože na dno, negativnom - s potpunom lizom eritrocita, kada je tekućina intenzivno obojena ("lakirana" krv) .
Stupanj odgode hemolize procjenjuje se ovisno o intenzitetu boje tekućine i količini sedimenta eritrocita na dnu (++++, +++, ++, +).
Riža. 4. Izjava i rezultat RSC.
Zaključak:Protutijela su otkrivena u ispitivanom serumu.
RSK vam omogućuje otkrivanje protutijela na bilo koji soj istog serotipa virusa.
Dijagnostička vrijednost je:
četverostruko povećanje titra protutijela u uparenim serumima (tijekom epidemije gripe);
dvostruko povećanje krvnog seruma bolesnika s karakterističnom kliničkom slikom.
Reakcije etikete :
Ove metode su vrlo osjetljive. Boje, radioaktivni izotopi, enzimi itd. koriste se kao oznake za antigene ili antitijela.
RIF - reakcija imunofluorescencije
Reakcija imunofluorescencije temelji se na svjetlosnoj indikaciji kompleksa antigen-antitijelo
Vezani imunosorbentni test.
Suvremeni laboratorijska istraživanja, tijekom koje se traže specifična protutijela u krvi ili antigeni za određene bolesti kako bi se utvrdila ne samo etiologija, već i stadij bolesti.
Rezultati ELISA testa mogu se izdati kvalitativno i kvantitativno.
Trenutno se ELISA koristi u sljedećim situacijama:
1) traženje specifičnih antitijela na bilo koju zaraznu bolest;
2) traženje antigena bilo koje bolesti (zarazne, spolne bolesti);
3) proučavanje hormonskog statusa pacijenta;
4) pretraga na tumorske markere;
5) ispitivanje prisutnosti autoimunih bolesti.
Na slici, čvrsta faza ELISA - poznati antigeni (lijevo) su adsorbirani na jažici ploče, (desno) na jažici ploče su poznata antitijela
Prednosti ELISA metode:
1) Visoka specifičnost i osjetljivost ELISA metode (više od 90%).
2) Sposobnost utvrđivanja bolesti i praćenja dinamike procesa, odnosno usporedbe količine antitijela u različitim vremenskim intervalima.
3) Dostupnost ELISA dijagnostike u bilo kojoj medicinskoj ustanovi.
Relativni nedostatak: Detekcija imunološkog odgovora (protutijela), ali ne i samog patogena, konjugiranog s enzimskom oznakom.
ELISA postavka (opći mehanizam):
Osnova imunoenzimskog testa je imunološka reakcija antigena i protutijela uz stvaranje imunološkog kompleksa: antigen-antitijelo, uslijed čega dolazi do promjene enzimska aktivnost specifične oznake na površini antitijela.
Komponente reakcije:
1. AG(AT) poznato - na jažici ploče.
2. AT (AG) ispitan.
3. AT s enzimom specifičnim za kompleks AT(AG)-AG(AT).
4.kromogeni supstrat u interakciji s enzimom
5. stop rješenje
Glavne faze ELISA testa
1. Na površini jažica tablete nalazi se pročišćeni antigen specifičnog patogena. Dodani su biološki materijal pacijenta, dolazi do specifične reakcije između ovog antigena i željenog antitijela (imunoglobulina). Formira se kompleks.
2. Dodaje se konjugat - AT s enzimom. Konjugant je specifičan za AT-AG kompleks prvog stadija. Enzim se aktivira.
3. Dodaje se supstrat i aktivni enzim stupa u interakciju s njim, mijenjajući bezbojnu boju otopine.
4. Dodana je otopina za zaustavljanje kako bi se zaustavila interakcija enzim-supstrat.
Računovodstvo.
Pozitivan rezultat je promjena boje, na slici - žuta.
Imunokromatografska analiza
Metoda imunokromatografske analize (ICA, brzi testovi) kvalitativna je preliminarna metoda probira koja vam omogućuje brzo, unutar nekoliko minuta, analizu u svim uvjetima, uklj. "polje".
Prednosti ICA uključuju:
Brzina i jednostavnost korištenja;
Male količine uzorka, nema pripreme uzorka;
Jeftino za proizvođača i potrošača;
Sposobnost izrade testova u velikim količinama;
Jednostavnost očitavanja i tumačenja rezultata;
Visoka osjetljivost i ponovljivost;
Mogućnost kvantitativnog određivanja;
Mogućnost korištenja prijenosnih čitača kompatibilnih s računalom;
Mogućnost multianalize.
Komponente (nanesene na test traku):
1. Konjugat obilježen koloidnim zlatom - specifičan za određeni AG.
2. AT test linije - specifično za kompleks AT-AG
3. Trbušnjaci kontrolne linije specifični su za konjugat.
IHA postavka:
1. Nanošenje uzorka na naznačeno početno područje trake.
2. Dobivanje rezultata u obliku pojavljivanja obojenih traka na mjestu testnih i kontrolnih linija.
Računovodstvo
Pozitivno - kod bojenja test linije.
Negativno - u nedostatku bojenja testne linije.
Nevažeće - u nedostatku bojenja kontrolne linije.
Opći mehanizam IHA:
1. Uzorak se stavlja na početno polje (jastučić za uzorke) i veže za konjugat (specifično tijelo s oznakom u boji) koji se nalazi na jastučiću za konjugat. Kao rezultat, formira se obojeni kompleks.
2. Rezultirajući obojeni imunološki kompleks kreće se pod djelovanjem kapilarnih sila duž nitrocelulozne membrane I međusobno djelujes AT test linijom.Rezultat je jednobojna ružičasto-crvena pruga.
3. Trbušnjaci nisu vezani na testnoj traci (konjugat)kreće dalje i dolazi do kontrolne linije, veže se za AT kontrolne linije.Kao rezultat, pojavljuje se traka druge boje.Ako je analiza ispravno obavljena, kontrolna linija bi se uvijek trebala pojaviti, bez obzira na prisutnost ispitivanog antigena (antitijela) u uzorku biološke tekućine.
2. Uvjeti za provođenje seroloških reakcija.
1. Prisutnost homolognih - odgovarajućih jedni drugima antigena i protutijela.
2. Čisto, suho posuđe.
3. Određeni omjer lijekova (najčešće jednak).
4. Obavezna prisutnost elektrolita (izotonična otopina NaCl).
5. pH neutralan ili blizu blago alkalnom.
6. Temperatura + 37 ° C ili sobna temperatura (nužno pozitivna).
7. Provodi se kontrola antigena i kontrola seruma (antitijela).
3 Zahtjevi za serum
Serum mora biti potpuno bistar bez primjesa stanica.
Obično se dobiva u 2. tjednu bolesti, kada su antitijela već prisutna.
Krv se uzima u količini od 3-5 ml natašte ili 6 sati nakon obroka.
Za dobivanje seruma krv se ostavi 1 sat na sobnoj temperaturi ili centrifugira. Serum se isisava vrlo pažljivo kako ne bi uhvatio formirane elemente.
Imuni serumi dobivaju se iz krvi ljudi ili životinja (najčešće kunića i konja) imuniziranih prema određenoj shemi s odgovarajućim antigenom (cjepivom). Sirutka se najčešće priprema u proizvodnji.
4. Pojam pozitivnih i negativnih rezultata.
RA.
Uz pozitivnu reakciju, pasivno zalijepljeni eritrociti pokrivaju dno jažice ravnomjernim slojem s nazubljenim rubovima ("kišobran"); u nedostatku aglutinacije, eritrociti se nakupljaju u središnjem udubljenju jažice, tvoreći kompaktni "gumb" s oštro definiranim rubovima (vidi gornje slike).
RP.
S pozitivnim rezultatom, na granici dviju otopina formira se mliječni prsten (vidi gornje slike).
ELISA.
Kod pozitivne reakcije dolazi do promjene boje otopine.
RSK.
Odgoda hemolize - reakcija je pozitivna; ako je komplement slobodan uočava se hemoliza – reakcija je negativna(vidi slike gore).
Rezultati Wassermanove reakcije:
a - potpuno odlaganje hemolize (+ + ++);
b - izraženo kašnjenje hemolize (+ ++);
c - djelomična odgoda hemolize (++);
d - slabo odlaganje hemolize (+);
e - potpuna hemoliza (-).
Reakcija je pozitivna s djelomičnim, izraženim i potpunim odgodom hemolize, određenom stupnjem bojenja sadržaja epruveta od svijetlo ružičaste do svijetlo crvene, nehemolizirani eritrociti naknadno stvaraju crveni talog.
Domaća zadaća:
1. Proučite gradivo
Napravite 3 bilješke na videu
Br. 29 Reakcija aglutinacije. Sastavni dijelovi, mehanizam, načini podešavanja. Primjena.
Reakcija aglutinacije- jednostavna reakcija u kojoj protutijela vežu korpuskularne antigene (bakterije, eritrocite ili druge stanice, netopljive čestice na kojima su adsorbirani antigeni, kao i makromolekularne nakupine). Javlja se u prisutnosti elektrolita, na primjer, kada se doda izotonična otopina natrijeva klorida.
Koriste se razne varijante reakcije aglutinacije: proširena, aproksimativna, neizravna itd. Reakcija aglutinacije se očituje stvaranjem ljuskica ili sedimenta (stanice "slijepljene" protutijelima koja imaju dva ili više centara za vezanje antigena - sl. 13.1) . RA se koristi za:
1) otkrivanje antitijela u krvnom serumu bolesnika, na primjer, s brucelozom (Wrightova, Heddelsonova reakcija), trbušni tifus i paratifus (Vidalova reakcija) i druge zarazne bolesti;
2) definicije patogena izoliran od pacijenta;
3) određivanje krvnih grupa korištenjem monoklonskih antitijela protiv aloantigena eritrocita.
Za određivanje antitijela pacijenta staviti detaljnu reakciju aglutinacije: razrjeđenjima krvnog seruma bolesnika dodaje se dijagnostikum (suspenzija ubijenih mikroba) te se nakon nekoliko sati inkubacije na 37 °C bilježi najveće razrjeđenje seruma (serumski titar) pri kojem je došlo do aglutinacije, tj. formiran talog.
Priroda i brzina aglutinacije ovise o vrsti antigena i protutijela. Primjer su značajke interakcije dijagnostikuma (O- i H-antigena) sa specifičnim antitijelima. Reakcija aglutinacije s O-diagnosticumom (bakterije ubijene zagrijavanjem, zadržavajući termostabilni O-antigen) javlja se u obliku sitnozrnate aglutinacije. Reakcija aglutinacije s H-diagnosticumom (bakterije ubijene formalinom, zadržavajući toplinski labilni flagelarni H-antigen) je gruba i odvija se brže. Ako je potrebno odrediti uzročnika izoliranog od pacijenta, staviti orijentacijska reakcija aglutinacije, pomoću dijagnostičkih antitijela (aglutinirajući serum), tj. provodi se serotipizacija uzročnika. Približna reakcija provodi se na predmetnom staklu. Kapi dijagnostičkog aglutinirajućeg seruma u razrjeđenju 1:10 ili 1:20 dodati čistu kulturu uzročnika izoliranog od bolesnika. U blizini se nalazi kontrola: umjesto seruma nanosi se kap otopine natrijevog klorida. Kad se u kapi sa serumom i mikrobima pojavi flokulentni talog, provodi se detaljna reakcija aglutinacije u epruvetama sa sve većim razrjeđenjima aglutinirajućeg seruma, u koji se dodaju 2-3 kapi suspenzije uzročnika. Aglutinacija se uzima u obzir količinom sedimenta i stupnjem bistrenja tekućine. Reakcija se smatra pozitivnom ako se primijeti aglutinacija u razrjeđenju bliskom titru dijagnostičkog seruma. Istodobno se uzimaju u obzir kontrole: serum razrijeđen izotoničnom otopinom natrijevog klorida treba biti proziran, suspenzija mikroba u istoj otopini mora biti jednoliko mutna, bez sedimenta.
Različite srodne bakterije mogu se aglutinirati istim dijagnostičkim aglutinirajućim serumom, koji
otežava njihovo prepoznavanje. Stoga se koriste adsorbirani aglutinirajući serumi iz kojih
protutijela koja unakrsno reagiraju adsorpcijom na njima srodne bakterije. Ovi serumi sadrže antitijela
specifičan za ovu bakteriju.
Aglutinacija se naziva aglutinacija bakterija kao rezultat interakcije s njima specifičnih AT. RA zahtijeva tri komponente: 1) AG (aglutinogen); 2) AT (aglutinin); 3) otopina elektrolita (izotonična otopina natrijeva klorida). U reakciji aglutinacije sudjeluju samo korpuskularni antigeni (bakterije, eritrociti, čestice lateksa opterećene antigenom).
Reakcija aglutinacije na staklu. Kap dijagnostičkog seruma (razrjeđenje seruma 1:10 - 1:20) pipetom se nanese na nemasno predmetno staklo. Čista kultura mikroorganizma koji se proučava uzima se s površine kosog agara bakteriološkom petljom, prenosi u kap seruma i miješa. Rezultat reakcije se uzima u obzir golim okom nakon 3-5 minuta. Uz pozitivnu reakciju u kapi seruma, bilježi se pojava pahuljica (velikih ili malih), jasno vidljivih na tamnoj pozadini kada se predmetno staklo protrese. U slučaju negativne reakcije, tekućina ostaje jednoliko zamućena.
Reakcija aglutinacije u epruvetama. Dodajte 1 ml fiziološke otopine u određeni broj epruveta. Dodajte jednaki volumen ispitivanog krvnog seruma u prvu epruvetu. Pripravljaju se sekvencijalna dvostruka razrjeđenja seruma (titracija seruma), nakon čega se u svaku epruvetu dodaju po 2 kapi suspenzije inaktiviranih bakterija (diagnosticum). Epruvete se stave 2 sata u termostat na 37°C. Reakcija se nastavlja stvaranjem malih pahuljica, nevidljivih golim okom, stoga se rezultati bilježe pod blagim porastom u posebnom uređaju - aglutinoskopu. Intenzitet aglutinacije uzima se u obzir prema sustavu "četiri plusa": potpuna aglutinacija - 4+, djelomična aglutinacija - 3+ ili 2+, sumnjiv rezultat - +. Posljednje razrjeđenje u kojem se opaža aglutinacija na 2+ uzima se kao titar protutijela u ispitivanom serumu.
Reakcija aglutinacije u epruvetama (reakcija produžene aglutinacije) provodi se za određivanje titra protutijela na uzročnike trbušnog tifusa i paratifusa (Vidalova reakcija), bruceloze (Wrightova reakcija), tifusa (Weiglova reakcija).
Aglutinacija (od lat. agglutinatio - veza) - vezivanje (povezivanje) korpuskularnih čestica koje nose antigen (cijele stanice, čestice lateksa itd.) sa specifičnim molekulama antitijela u prisutnosti elektrolita, koje završava stvaranjem ljuskica ili taloga (aglutinacija). ) vidljivo golim okom. Priroda sedimenta ovisi o prirodi antigena: flagelarne bakterije daju sediment velikih pahuljica, flagelarne i bez kapsule - fino zrnate, kapsularne - žilaste. Razlikovati izravnu aglutinaciju, u kojoj interakcija sa specifičnim protutijelima izravno uključuje vlastite antigene bakterijske ili bilo koje druge stanice, poput eritrocita; i neizravne, ili pasivne, u kojima su bakterijske stanice ili eritrociti, ili čestice lateksa nositelji ne svojih vlastitih, već stranih antigena (ili antitijela) adsorbiranih na njih kako bi se otkrila antitijela (ili antigeni) koja su za njih specifična. Reakcija aglutinacije uglavnom uključuje protutijela koja pripadaju klasama IgG i IgM. Protječe u dvije faze: prvo, postoji specifična interakcija aktivnog središta protutijela s determinantom antigena, ova se faza može dogoditi u nedostatku elektrolita i nije popraćena vidljivim promjenama u reakcijskom sustavu. Za drugu fazu - stvaranje aglutinata - neophodna je prisutnost elektrolita koji smanjuju električno punjenje komplekse antigen + antitijelo i ubrzavaju proces njihova vezivanja. Ova faza završava stvaranjem aglutinata.
Aglutinacijske reakcije postavljaju se na staklene ili glatke kartonske ploče ili u sterilne aglutinacijske epruvete. Obično se koriste reakcije aglutinacije (izravne i pasivne) na staklu ubrzana metoda otkrivanje specifičnih protutijela u serumu bolesnika (na primjer, s brucelozom) ili za serološku identifikaciju patogena. U potonjem slučaju obično se koriste dobro pročišćeni (adsorbirani) dijagnostički serumi koji sadrže samo monoreceptorska protutijela ili njihov skup na različite antigene. Nedvojbena prednost reakcije aglutinacije na staklu je jednostavnost njezine formulacije i činjenica da traje nekoliko minuta ili čak sekundi, budući da se obje komponente koriste u njoj u koncentriranom obliku. Međutim, on ima samo kvalitativnu vrijednost i manje je osjetljiv od epruvete. Prošireni test aglutinacije u epruvetama daje točnije rezultate, jer vam omogućuje određivanje kvantitativnog sadržaja protutijela u serumu (postavljanje njegovog titra) i, ako je potrebno, registraciju činjenice povećanja titra protutijela, što je dijagnostički. vrijednost. Za postavljanje reakcije u aglutinacijske epruvete dodajte na određeni način razrijeđen sa 0,85% otopina NaCl seruma i jednakog volumena (obično 0,5 ml) suspenzije standardnog dijagnostikuma (ili test kulture) koja sadrži 1 milijardu bakterija u 1 ml. Računanje rezultata reakcije aglutinacije provodi se preliminarno nakon 2 sata inkubacije epruveta na 37 ° C i konačno nakon 20-24 sata prema dva kriterija: prisutnosti i veličini precipitata i stupnju prozirnosti taloga. supernatant. Ocjenjivanje se provodi po sustavu četiri križića. Reakcija je nužno popraćena kontrolom seruma i antigena. U onim slučajevima kada se za serološku identifikaciju uzročnika koristi detaljan test aglutinacije u epruveti, dijagnostičku vrijednost ima ako je reakcija ocijenjena pozitivnom kada je dijagnostički serum razrijeđen s najmanje polovicom svog titra.
Treba uzeti u obzir da se pri miješanju otopina homolognih antigena i protutijela ne uočavaju uvijek vidljive manifestacije reakcije aglutinacije. Talog nastaje samo pri određenim optimalnim omjerima obje komponente reakcije. Izvan ovih granica, sa značajnim viškom antigena ili antitijela, nema reakcije. Taj se fenomen naziva "fenomen prozone". Uočava se i u reakciji aglutinacije i u reakciji taloženja. Pojava prozona u imunološkim reakcijama objašnjava se činjenicom da su antigeni uključeni u njih u pravilu polideterminantni, a molekule IgG antitijela imaju dva aktivna centra. S viškom protutijela površina svake antigenske čestice prekriva se molekulama protutijela tako da ne ostaju slobodne determinantne skupine, pa drugi, nevezani aktivni centar protutijela ne može djelovati s drugom antigenskom česticom i međusobno ih vezati. Stvaranje vidljivog aglutinata ili precipitata također je potisnuto s viškom antigena, kada nema niti jednog slobodnog aktivnog mjesta protutijela, pa se stoga kompleksi antigen + antitijelo + antigen više ne mogu povećati.
Mogućnosti ubrzanih reakcija aglutinacije. Reakcija pasivne hemaglutinacije i njezine varijante
Klasična reakcija aglutinacije uključuje upotrebu korpuskularnih antigena. Međutim, topljivi antigeni također mogu biti uključeni. Da bi to bilo moguće, takvi antigeni se adsorbiraju na imunološki inertne čestice. Kao nosač mogu se koristiti čestice lateksa ili bentonita, ali trenutno se najčešće koriste eritrociti životinja ili ljudi, koji poboljšavaju svoja adsorpcijska svojstva tretiranjem otopinama tanina, formalina ili benzidina. Eritrociti koji na sebe adsorbiraju antigen nazivaju se senzibilizirani tim antigenom, a imunološka reakcija u kojoj sudjeluju je reakcija neizravne ili pasivne hemaglutinacije (RNHA, ili RPHA), budući da eritrociti u njoj sudjeluju pasivno.
RPGA se postavlja u posebne polistirenske ploče s rupama koje imaju polukuglasto dno. Kada se koristi za serološku dijagnostiku, u te se jažice pripremaju dvostruka razrjeđenja u fiziološkoj otopini ispitivanog seruma, a zatim mu se kao dijagnostičko sredstvo dodaje suspenzija senzibiliziranih eritrocita. Rezultati se bilježe nakon 2 sata inkubacije na 37 °C prema sustavu četiri križa. Uz pozitivnu reakciju, aglutinirani eritrociti talože se na dnu rupe i ravnomjerno ga prekrivaju u obliku obrnutog kišobrana. Uz negativnu reakciju, eritrociti se također talože, tekućina postaje prozirna, talog izgleda kao mali "disk" u središtu rupe. Titar seruma u RPHA smatra se njegovim posljednjim razrjeđenjem, koje još uvijek daje izraženu hemaglutinaciju bez značajni znakovi imajući disk.
RPHA se također može koristiti kao ubrzana metoda bakteriološke dijagnostike za otkrivanje nepoznatih bakterija, virusa, toksina, kao što su uzročnici kuge, stafilokokni enterotoksini i dr., izravno u ispitivanom materijalu antitijela - antitijela eritrocitni dijagnostikum. Ako testni materijal sadrži dovoljnu količinu poznatog antigena, TPHA će biti pozitivan.
Mogućnosti korištenja RPGA su: reakcija neutralizacije antigena (RNAg), reakcija neutralizacije antitijela (RNAt), reakcija inhibicije pasivne hemaglutinacije (RPHA). Za ove reakcije koriste se eritrocitni dijagnostikumi antigena i antitijela. Dvije međusobno kontrolirane jednosmjerne reakcije mogu se koristiti istovremeno, na primjer, RPHA s antigenskim dijagnostikumom i RNAg s eritrocitnim dijagnostikumom protutijela.
Reakcija neutralizacije antitijela (RNAt) sastoji se u činjenici da se suspenzija koja sadrži željeni antigen pomiješa sa specifičnim imunološkim serumom koji sadrži poznata antitijela u odgovarajućim količinama i inkubira se na 37 °C dva sata. Nakon toga se dodaje antigenski eritrocitni dijagnostikum. Smjesa se protrese i ostavi na sobnoj temperaturi. Rezultati se uzimaju u obzir nakon 3-4 sata i konačno - nakon 18-24 sata.Ako u ispitivanom materijalu postoji antigen, on će vezati antitijela (neutralizirati ih), te stoga neće doći do hemaglutinacije.
Po istom principu provodi se reakcija neutralizacije antigena (RNAg). Samo u ovom slučaju, antitijela se otkrivaju u ispitivanom materijalu. Specifični antigen dodan takvom ispitivanom materijalu vezat će se za antitijela koja se u njemu nalaze, odnosno antigen će biti neutraliziran antitijelima, pa stoga neće doći do hemaglutinacije kada se doda eritrocitni dijagnostikum antitijela.
Reakcija koaglutinacije. To je jedna od opcija za pasivnu, tj. stanično posredovanu reakciju ubrzane aglutinacije na staklu s antitijelom-nosačem. Ova reakcija se temelji na jedinstveno svojstvo Staphylococcus aureus, koji ima protein A u svojoj staničnoj stijenci, vežu se na Fc fragmente IgG i IgM. U isto vrijeme, aktivni centri antitijela ostaju slobodni i mogu komunicirati sa specifičnim determinantama antigena. Na predmetno staklo nanese se kap 2% suspenzije stafilokoka senzibiliziranog odgovarajućim antitijelima i doda se kap suspenzije ispitivane bakterije. Kada antigen odgovara antitijelima, nakon 30-60 sekundi dolazi do jasne aglutinacije stafilokoka opterećenih antitijelima.
Reakcija lateks aglutinacije (LAH). Nositelj antitijela u ovom dijagnostičkom sustavu su male standardne čestice lateksa. Reakcija se provodi mikrometodom u jažicama na staklu. Glavni uvjet za uspješno postavljanje PAH-a je strogo poštivanje kvantitativnih omjera komponenti sustava: 10 µl pripravka lateksa senzibiliziranog antitijelima dodaje se u 50 µl ispitivanog materijala. Specifičnost PAH-a kontrolira se pomoću tri kontrolna testa sadržana u komercijalnim testnim sustavima: poznat pozitivna reakcija, očito povratni udar i kontrola kvalitete suspenzije lateksa za lateks koji nije osjetljiv na PAH (ne sadrži antitijela) s ispitivanim materijalom. U našoj se zemlji kao nositelji specifičnih protutijela koriste monodisperzni polistirenski lateksi s različitim promjerima čestica (0,3; 0,66; 0,75; 0,8 μm). LAH se koristi za brzu detekciju mikroorganizama ili njihovih antigena u ispitivanom materijalu.
Imunomagnetska detekcija antigena. Jedna od opcija za ubrzanu reakciju aglutinacije na staklu povezana je s uporabom supermagnetskih polimernih čestica obloženih specifičnim protutijelima. Jedna takva čestica veže do 107-108 stanica mikroorganizama, zbog čega se osjetljivost ovu metodu doseže 5 CFU / ml. Imunomagnetska detekcija mikroorganizama može se koristiti u kombinaciji s CPR-om.
Reakcija agregatno-hemaglutinacije (RAGA). Omogućuje vam brzo otkrivanje u krvi pacijenata i antigena koji slobodno cirkuliraju (antigenemija) i antigena povezanih s antitijelima - cirkulirajućih imunoloških kompleksa (CIC). Za RAGA se koriste eritrociti senzibilizirani odgovarajućim antitijelima. Dodavanjem krvnog seruma bolesnika koji sadrži antigene na senzibilizirane eritrocite, na koje su fiksirana antitijela, dolazi do lijepljenja (aglutinacije) eritrocita i imunoloških kompleksa.
Antiglobulinski Coombsov test (R. Coombsova reakcija). Uz pomoć izravne i pasivne reakcije aglutinacije određuju se kompletna (bivalentna) protutijela. Nepotpuna (monovalentna, blokirajuća) protutijela ne otkrivaju se ovim metodama, jer u kombinaciji s antigenom blokiraju ga, ali ne mogu uzrokovati agregaciju antigena u velike konglomerate. Nepotpuna (blokirajuća) protutijela su ona kod kojih djeluje samo jedno aktivno središte; drugi aktivni centar ne radi iz nepoznatog razloga. Za identifikaciju nepotpunih protutijela koristi se posebna Coombsova reakcija (slika 72). U reakciji sudjeluju: serum bolesnika u kojem određuju nepotpuna antitijela, corpuscular antigen diagnosticum, antiglobulinski serum koji sadrži antitijela na humani globulin. Reakcija se odvija u dvije faze:
Interakcija antigena s nepotpunim antitijelima. Nema vidljivih manifestacija. Prva faza je završena ispiranjem antigena iz ostataka pacijentovog seruma.
Interakcija antiglobulinskog seruma, dobivenog kao rezultat imunizacije životinje humanim globulinom, s nepotpunim antitijelima adsorbiranim na antigen. S obzirom na to da su antiglobulinska antitijela dvovalentna, ona vežu dva monovalentna antitijela zasebnih antigenskih kompleksa + nepotpuno antitijelo, što dovodi do njihovog međusobnog lijepljenja i pojave vidljivog precipitata.
13.1. Reakcije antigen-protutijelo i njihova upotreba
Kada se antigen ubrizga, u tijelu se stvaraju antitijela. Protutijela su komplementarna antigenu koji je uzrokovao njihovu sintezu i mogu se na njega vezati. Vezanje antigena za antitijela sastoji se od dvije faze. Prva faza je specifična, u kojoj dolazi do brzog vezanja antigene determinante na aktivno središte Fab fragmenta protutijela. Treba napomenuti da je vezanje posljedica van der Waalsovih sila, vodika i hidrofobnih interakcija. Snaga veze određena je stupnjem prostorne podudarnosti između aktivnog mjesta protutijela i epitopa antigena. Nakon specifične faze počinje sporija - nespecifična, koja se očituje vidljivom fizikalnom pojavom (npr. stvaranje ljuskica pri aglutinaciji i sl.).
Imunološke reakcije su interakcije između antitijela i antigena, a te su reakcije specifične i vrlo osjetljive. Naširoko se koriste u medicinska praksa. Uz pomoć imunoloških reakcija mogu se riješiti sljedeći zadaci:
Određivanje nepoznatih protutijela poznatim antigenima (antigenski dijagnostikum). Takav zadatak je kada je potrebno odrediti protutijela na uzročnika u krvnom serumu bolesnika (serodijagnostika). Pronalaženje protutijela omogućuje potvrdu dijagnoze;
Određivanje nepoznatih antigena poznatim antitijelima (dijagnostički serum). Ova se studija provodi pri identificiranju kulture patogena izoliranog iz materijala pacijenta (serotipizacija), kao i pri otkrivanju
antigeni mikroba i njihovi toksini u krvi i drugim biološkim tekućinama. Postoje mnoge vrste imunoloških reakcija koje se razlikuju po tehnici postavljanja i zabilježenom učinku. To su reakcije aglutinacije (RA), precipitacije (RP), reakcije s komplementom (RCC), reakcije pomoću obilježenih komponenti (RIF, ELISA, RIA).
13.2. Reakcija aglutinacije
Reakcija aglutinacije (RA) je imunološka reakcija interakcije antigena s protutijelima u prisutnosti elektrolita, a antigen je u korpuskularnom stanju (eritrociti, bakterije, čestice lateksa s adsorbiranim antigenima). Tijekom aglutinacije antitijelima se lijepe korpuskularni antigeni, što se očituje stvaranjem pahuljastog taloga. Stvaranje pahuljica nastaje zbog činjenice da antitijela imaju dva aktivna centra, a antigeni su polivalentni, tj. imaju više antigenih determinanti. RA se koristi za identifikaciju uzročnika izoliranog iz materijala bolesnika, kao i za otkrivanje protutijela na uzročnika u krvnom serumu bolesnika (primjerice, Wrightova i Huddlesonova reakcija kod bruceloze, Vidalova reakcija kod trbušnog tifusa i paratifusa ).
Najlakši način za postavljanje RA je reakcija na staklu, to je približni RA, pomoću kojeg se utvrđuje uzročnik izoliran od bolesnika. Prilikom postavljanja reakcije na stakalcu se aplicira dijagnostički aglutinirajući serum (u razrjeđenju 1:10 ili 1:20), zatim se unosi kultura od bolesnika. Reakcija je pozitivna ako se u kapi pojavi flokulantni talog. U blizini se nalazi kontrola: umjesto seruma nanosi se kap otopine natrijevog klorida. Ako je dijagnostički aglutinirajući serum neadsorbirani 1, tada se razrjeđuje (do titra – razrjeđenja do kojeg treba doći do aglutinacije), tj. staviti ekspandirani RA u epruvete s povećanjem
1 Neadsorbirani aglutinirajući serum može aglutinirati srodne bakterije koje imaju zajedničke antigene (križne reakcije). Stoga, uživajteadsorbirani aglutinirajući serumi, iz kojih su unakrsno reaktivna protutijela uklonjena adsorpcijom njima srodnih bakterija. U takvim serumima ostaju protutijela specifična samo za ovu bakteriju.
razrjeđenja aglutinirajućeg seruma, u koji se dodaju 2-3 kapi suspenzije uzročnika izoliranog od bolesnika. Aglutinacija se uzima u obzir količinom taloga i stupnjem bistrenja tekućine u epruvetama. Reakcija se smatra pozitivnom ako se primijeti aglutinacija u razrjeđenju bliskom titru dijagnostičkog seruma. Reakcija je popraćena kontrolama: serum razrijeđen izotoničnom otopinom natrijevog klorida treba biti proziran, suspenzija mikroba u istoj otopini mora biti jednoliko mutna, bez taloga.
Za određivanje protutijela na patogen u krvnom serumu pacijenta koristi se prošireni RA. Kada se stavi u epruvete, krvni serum bolesnika se razrijedi i u epruvete se doda jednaka količina suspenzije dijagnostikuma (suspenzija ubijenih mikroba). Nakon inkubacije odredi se najveće razrjeđenje seruma pri kojem je došlo do aglutinacije, tj. nastao talog (titar seruma). U tom slučaju dolazi do reakcije aglutinacije s O-diagnosticumom (bakterije ubijene zagrijavanjem, zadržavajući termostabilni O-antigen) u obliku sitnozrnate aglutinacije. Reakcija aglutinacije s H-diagnosticumom (bakterije ubijene formalinom, zadržavajući toplinski labilni flagelarni H-antigen) je gruba i odvija se brže.
Reakcija neizravne (pasivne) hemaglutinacije(RNGA ili RPGA) je vrsta RA. Ova metoda je vrlo osjetljiva. Pomoću RNGA mogu se riješiti dva zadatka: odrediti protutijela u krvnom serumu bolesnika kojemu se dodaje antigenski eritrocitni dijagnostikum, a to su eritrociti na koje su adsorbirani poznati antigeni; utvrditi prisutnost antigena u ispitivanom materijalu. U tom slučaju, reakcija se ponekad naziva reakcija reverzne neizravne hemaglutinacije (RONGA). Prilikom stadija ispitivanom materijalu dodaje se eritrocitni dijagnostikum s antitijelima (eritrociti s adsorbiranim antitijelima na svojoj površini). Eritrociti u ovoj reakciji djeluju kao prijenosnici i pasivno sudjeluju u stvaranju imunoloških nakupina. Uz pozitivnu reakciju, pasivno zalijepljeni eritrociti pokrivaju dno jažice ravnomjernim slojem s nazubljenim rubovima ("kišobran"); u nedostatku aglutinacije, eritrociti se nakupljaju u središnjem udubljenju rupe, tvoreći kompaktni "gumb" s oštro definiranim rubovima.
Reakcija koaglutinacije koristi se za otkrivanje stanica patogena (antigena) pomoću antitijela adsorbiranih na Staphylococcus aureus, koji sadrži protein A. Protein A ima afinitet prema Fc fragmentu imunoglobulina. Zbog toga se antitijela na stafilokok vežu neizravno preko Fc fragmenta, a Fab fragmenti su usmjereni prema van i mogu komunicirati s odgovarajućim mikrobima izoliranim od pacijenata. U tom slučaju nastaju pahuljice.
Reakcija inhibicije hemaglutinacije (HITA) koristi se u dijagnostici virusnih infekcija i samo infekcija uzrokovanih hemaglutinirajućim virusima. Ovi virusi na svojoj površini sadrže protein - hemaglutinin, koji je odgovoran za reakciju hemaglutinacije (RHA) kada se doda eritrocitnim virusima. RTGA se sastoji u blokiranju virusnih antigena antitijelima, zbog čega virusi gube sposobnost aglutinacije crvenih krvnih stanica.
Coombsova reakcija - RA za otkrivanje nepotpunih protutijela. Kod nekih zaraznih bolesti, poput bruceloze, u krvnom serumu bolesnika cirkuliraju nepotpuna protutijela na uzročnika. Nepotpuna antitijela nazivaju se blokirajuća jer imaju jedno mjesto vezanja antigena, a ne dva, kao puna antitijela. Stoga se pri dodavanju antigenskog dijagnostikuma nepotpuna antitijela vežu za antigene, ali ih ne lijepe. Za manifestiranje reakcije dodaje se antiglobulinski serum (protutijela na humane imunoglobuline) koji će dovesti do aglutinacije imunoloških kompleksa (antigenski dijagnostikum + nepotpuna antitijela) nastalih u prvoj fazi reakcije.
Neizravna Coombsova reakcija koristi se u bolesnika s intravaskularna hemoliza. U nekih od ovih bolesnika nađena su nepotpuna monovalentna anti-rezus antitijela. Oni specifično djeluju na Rh-pozitivne eritrocite, ali ne uzrokuju njihovu aglutinaciju. Zbog toga se u sustav anti-Rh protutijela + Rh-pozitivni eritrociti dodaje antiglobulinski serum koji uzrokuje aglutinaciju eritrocita. Za dijagnozu se koristi Coombsova reakcija patološka stanja povezana s intravaskularnom lizom eritrocita imunološkog podrijetla, na primjer, hemolitička bolest novorođenčadi zbog Rhesus sukoba.
RA za određivanje krvnih grupa temelji se na aglutinaciji eritrocita antitijelima imunološkog seruma na antigene krvnih grupa A (II), B (III). Kontrola je serum koji ne sadrži antitijela, tj. serumske AB (IV) krvne grupe, te antigeni eritrocita skupine A (P) i B (III). Kao negativna kontrola koriste se eritrociti skupine 0(I) jer nemaju antigene.
Za određivanje Rh faktora koriste se anti-Rh serumi (barem dvije različite serije). U prisutnosti Rh antigena na membrani proučavanih eritrocita dolazi do aglutinacije ovih stanica.
13.3. reakcija taloženja
RP je imunološka reakcija interakcije protutijela s antigenima u prisutnosti elektrolita, a antigen je u topljivom stanju. Tijekom taloženja dolazi do taloženja topljivih antigena protutijelima, što se očituje zamućenjem u obliku precipitacijskih traka. Stvaranje vidljivog taloga se opaža kada se oba reagensa pomiješaju u ekvivalentnim omjerima. Višak jednog od njih smanjuje količinu istaloženih imunoloških kompleksa. Postoje različiti načini postavljanja reakcije taloženja.
Prstenasta reakcija taloženja smješteni u taložne cijevi malog promjera. Imunološki serum se dodaje u epruvetu i topljivi antigen se pažljivo slojevito postavlja. Uz pozitivan rezultat, na granici dviju otopina formira se mliječni prsten. Reakcija prstenaste precipitacije, kojom se utvrđuje prisutnost antigena u organima i tkivima, čiji se ekstrakti kuhaju i filtriraju, naziva se reakcija termoprecipitacije (Ascolijeva reakcija za određivanje termostabilnog antigena antraksa).
Ouchterlony dvostruka imunodifuzijska reakcija. Ova reakcija se provodi na agar gelu. Jažice su izrezane u sloju gela jednake debljine na određenoj udaljenosti jedna od druge i napunjene antigenom, odnosno imunološkim serumom. Nakon toga antigeni i antitijela difundiraju u gel, međusobno se susreću i stvaraju imunološke komplekse koji se talože u gelu i postaju vidljivi kao linije taloženja.
prehrana. Ova se reakcija može koristiti za otkrivanje nepoznatih antigena ili protutijela, kao i za provjeru sličnosti između različitih antigena: ako su antigeni identični, linije taloženja se spajaju; ako antigeni nisu identični, linije precipitacije se sijeku; ako su antigeni djelomično identične, nastaje ostruga.
Reakcija radijalne imunodifuzije. U rastopljeni agar gel dodajte antitijela i nanesite gel u ravnomjernom sloju na staklo. U gelu se izrezuju jažice i u njih se unosi standardni volumen otopina antigena različitih koncentracija. Tijekom inkubacije, antigeni radijalno difundiraju iz jažice i, nakon susreta s antitijelima, formiraju precipitacijski prsten. Sve dok u jažici postoji višak antigena, dolazi do postupnog povećanja promjera precipitacijskog prstena. Ova se metoda koristi za određivanje antigena ili protutijela u ispitivanoj otopini (na primjer, za određivanje koncentracije imunoglobulina različitih klasa u krvnom serumu).
Imunoelektroforeza. Mješavina antigena prethodno se odvaja elektroforezom, zatim se taloženi antiserum uvodi u žlijeb koji ide duž smjera kretanja proteina. Antigeni i antitijela difundiraju u gel jedni prema drugima; međusobno djelujući, tvore lučne linije padalina.
reakcija flokulacije(prema Ramonu) - vrsta reakcije taloženja, koja se koristi za određivanje aktivnosti antitoksičnog seruma ili toksoida. Reakcija se provodi u epruvetama. U epruveti u kojoj su toksoid i antitoksin u jednakom omjeru uočava se zamućenje.
13.4. Reakcija fiksacije komplementa
Antitijela, u interakciji s odgovarajućim antigenom, vežu dodani komplement (1. sustav). Indikator fiksacije komplementa su eritrociti senzibilizirani hemolitičkim serumom, t.j. protutijela na eritrocite (2. sustav). Ako komplement nije fiksan u 1. sustavu, t j . ne dolazi do reakcije antigen-antitijelo, tada su senzibilizirane crvene krvne stanice potpuno lizirane (negativna reakcija). Kada se komplement veže imunološkim kompleksima 1. sustava, nakon dodatka senzibiliziranih eritrocita, hemoliza
odsutan (pozitivna reakcija). Reakcija vezanja komplementa koristi se za dijagnosticiranje zaraznih bolesti (gonoreja, sifilis, gripa itd.).
13.5. Reakcija neutralizacije
Mikrobi i njihovi toksini štetno djeluju na organe i tkiva ljudskog tijela. Protutijela se mogu vezati za ove štetne agense i blokirati ih, tj. neutralizirati. Ova značajka antitijela temelji se dijagnostička reakcija neutralizacija. Provodi se unošenjem mješavine antigen-antitijelo u životinje ili u osjetljive test objekte (kultura stanica, embriji). Na primjer, za otkrivanje toksina u materijalu pacijenta, životinjama 1. skupine se ubrizgava materijal pacijenta. Životinjama 2. skupine ubrizgan je sličan materijal, prethodno tretiran odgovarajućim antiserumom. Životinje 1. skupine ugibaju u prisutnosti toksina u materijalu. Druga skupina životinja preživi, štetni učinak toksina se ne očituje, budući da je neutraliziran.
13.6. Reakcije s obilježenim antitijelima ili antigenima
13.6.1. Reakcija imunofluorescencije (RIF, Koonsova metoda)
Ova metoda se koristi za ekspresnu dijagnostiku. Može detektirati i mikrobne antigene i antitijela.
Izravna RIF metoda- imunološka reakcija interakcije protutijela s antigenima, a protutijela su obilježena fluorokromom - tvari koja je sposobna emitirati kvante svjetlosti određene valne duljine kada ih pogodi svjetlost određene valne duljine. Osobitost postavljanja ove metode je potreba za uklanjanjem komponenti koje nisu reagirale kako bi se isključila detekcija nespecifične luminiscencije. Da biste to učinili, izvršite pranje neizreagiranih antitijela. Rezultati se procjenjuju pomoću fluorescentnog mikroskopa. Bakterije u razmazu tretiranom takvim luminescentnim serumom svijetle na tamnoj podlozi duž periferije stanice.
Indirektna RIF metoda korišten više od prethodnog. Ova reakcija se provodi u dva koraka. U prvoj fazi, antigeni međusobno
komuniciraju s odgovarajućim protutijelima, tvoreći imunološke komplekse. Sve komponente koje nisu reagirale (tj. nisu dio imunoloških kompleksa) moraju se ukloniti pranjem. U drugoj fazi, formirani kompleks antigen-antitijelo detektira se pomoću fluorokromnog antiglobulinskog seruma. Kao rezultat toga nastaje složeni mikrob + antimikrobna zečja protutijela + protutijela na zečje imunoglobuline obilježene fluorokromom. Rezultati se procjenjuju pomoću fluorescentnog mikroskopa.
13.6.2. Imunotest ili analiza
ELISA je najčešći moderna metoda koristi se za dijagnosticiranje virusnih, bakterijskih, protozoalnih infekcija, posebice za dijagnosticiranje HIV infekcije, virusni hepatitis i tako dalje.
Postoji mnogo modifikacija ELISA testa. Nekompetitivni ELISA test čvrste faze široko se koristi. Provodi se u polistirenskim pločama s 96 jažica (kruta faza). Tijekom reakcije potrebno je u svakoj fazi isprati neizreagirane komponente. Prilikom određivanja protutijela jažice na koje su adsorbirani antigeni pune se ispitivanim krvnim serumom, zatim antiglobulinskim serumom obilježenim enzimom. Pokažite reakciju dodavanjem supstrata za enzim. U prisutnosti enzima supstrat se mijenja, a kompleks enzim-supstrat odabire se na način da produkt koji nastaje u reakciji bude obojen. Dakle, s pozitivnom reakcijom uočava se promjena boje otopine. Da bi se odredili antigeni, nositelj krute faze se senzibilizira antitijelima, zatim se uzastopno uvode ispitni materijal (antigeni) i enzimom obilježeni antigenski serum. Za manifestaciju reakcije uvodi se supstrat za enzim. Kod pozitivne reakcije dolazi do promjene boje otopine.
13.6.3. Imunobloting
Ova metoda se temelji na kombinaciji elektroforeze i ELISA. Prilikom provođenja imunoblotinga (blotiranje s engleskog. mrlja- spot) složena mješavina antigena najprije se podvrgava elektroforezi u poliakrilamidnom gelu. Dobiveni frakcionirani anti-
genski peptidi se prenose na nitroceluloznu membranu. Mrlje se zatim tretiraju enzimom obilježenim protutijelima na specifični antigen, tj. provesti ELISA blot. Imunobloting se koristi u dijagnostici infekcija kao što je HIV.
13.6.4. Imunološka elektronska mikroskopija
Metoda se sastoji u mikroskopiranju u elektronskom mikroskopu virusa (rjeđe drugih mikroba), prethodno tretiranih odgovarajućim imunološkim serumom obilježenim elektronski optički gustim preparatima, na primjer, feritinom, proteinom koji sadrži željezo.
13.7. protočna citometrija
Krvne stanice diferenciraju se na temelju laserske citofluorometrije. Da bi se to postiglo, željene stanice se boje fluorescentnim monoklonskim antitijelima na CD antigene. Uzorak krvi nakon tretmana obilježenim antitijelima prolazi kroz tanku cjevčicu i kroz nju se propušta laserska zraka koja pobuđuje luminiscenciju fluorokroma. Intenzitet fluorescencije korelira s gustoćom antigena na površini stanice i može se kvantificirati pomoću fotomultiplikatora. Dobiveni rezultati se pretvaraju u histogram.
Za određivanje se koristi protočna citometrija imunološki status(sadržaj glavnih populacija limfocita, sadržaj intracelularnih i izvanstaničnih citokina, funkcionalna aktivnost NK stanica, aktivnost fagocitoze itd.).
Produžena reakcija aglutinacije (RA). Da biste odredili AT u krvnom serumu pacijenta, stavite produljena reakcija aglutinacije (RA). Da bi se to postiglo, nizu razrjeđenja krvnog seruma dodaje se dijagnostikum - suspenzija ubijenih mikroorganizama ili čestica s adsorbiranim Ag. Maksimalno davanje razrjeđenja aglutinacija Ag, naziva se titar krvnog seruma.
Vrste reakcija aglutinacije (RA) za otkrivanje AT - kapljični test krvi na tularemiju (sa nanošenjem dijagnostikuma na kap krvi i pojavom vidljivih bjelkastih aglutinata) i Huddlesonova reakcija na brucelozu (sa nanošenjem dijagnostikuma gentianvioleta na kap krvnog seruma).
Približna reakcija aglutinacije (RA)
Za identifikaciju izoliranih mikroorganizama, približna RA se stavlja na stakalce. Da biste to učinili, kultura patogena se dodaje kapi standardnog dijagnostičkog antiseruma (u razrjeđenju 1:10, 1:20). Ako je rezultat pozitivan, daju detaljnu reakciju s rastućim razrjeđenjima antiseruma.
reakcija smatra se pozitivnim ako se aglutinacija uoči u razrjeđenjima bliskim titru dijagnostičkog seruma.
OAS. Somatski O-Ag toplinski su stabilni i podnose vrenje 2 h. U interakciji s AT stvaraju sitnozrnate agregate.
N-Ag. H-Ag (flagelat) termolabilan i brzo se uništava na 100 °C, kao i pod djelovanjem etanola. U reakcijama s H-antiserumom, nakon 2 sata inkubacije, stvaraju se rastresite velike ljuskice (tvore ih bakterije koje se slijepe flagelama).
Vi Ar bakterija tifusa je relativno termostabilna (podnosi temperaturu od 60-62 ° C 2 sata); pri inkubaciji s Vi-antiserumom nastaje sitnozrnati aglutinat.
Reakcije izravne hemaglutinacije
Najjednostavniji od ovih reakcije - aglutinacija eritrocita, odnosno hemaglutinacija, služi za određivanje krvnih grupa u sustavu AB0. Za određivanje aglutinacija(ili njegovog odsustva) koriste se standardni antiserumi s anti-A i anti-B aglutininima. Reakcija se naziva izravna, budući da su proučavani antigeni prirodne komponente eritrocita.
Podijeljeno sa izravna hemaglutinacija mehanizama ima virusnu hemaglutinaciju. Mnogi virusi sposobni su spontano aglutinirati eritrocite ptica i sisavaca, a njihov dodatak u suspenziju eritrocita uzrokuje stvaranje nakupina iz njih.
