אישור תרופות כללי

הוצג במקום השיטה המפורטת ב-FS 42-3874-99

מונוגרפיה פרמקופיה כללית זו מיועדת לחקר ההרכב האנטיגני חומרים ביולוגיים, כמו גם לקבוע את הטוהר, ההרכב האיכותי והכמותי של אימונוביולוגי תרופות(ILP) בשיטת אימונואלקטרופורזה (IEF) בג'ל אגר, בשילוב שיטות של אלקטרופורזה אזורית ודיפוזיה חיסונית.

בתהליך של אימונואלקטרופורזה בג'לים או על סרטים של אצטט תאית בשיטות אימונודיפוזיה פשוטות או כפולות, מתרחשת תגובה בין חלבונים מסיסים ונוגדנים מזיזים ספציפיים להם. קביעה כמותית של חלבונים יכולה להתבצע באמצעות אלקטרופורזה במדיום המכיל נוגדנים (אלקטרואימוניות, דיפוזיה אלקטרואימונית, אימונואלקטרופורזה רקטה). ניתן לחקור את האופי האנטיגני של רכיבי חלבון על ידי השוואה ביניהם עם סמנים ידועים.

היעילות של בדיקות אימונוכימיות תלויה בספציפיות של האנטיסרה המשמשת, כמו גם בטיטר ובזיקה שלהם לאנטיגנים.

בדרך כלל, אימונואלקטרופורזה היא שילוב של אלקטרופורזה של ג'ל אגר (או אגרוז) ואחריה אימונודיפוזיה כפולה באותו המדיום. בדו מימד אימונודיפוזיה כפולה, אנטיגן ונוגדנים המונחים בשקעים עגולים או מלבניים בג'ל נודדים זה אל זה, וכתוצאה מכך נוצרים קווי משקעים (קשתות) כאשר הם נפגשים. מיקומן של פסי המשקעים תלוי במקדם הדיפוזיה של האנטיגן, בריכוזו ביחס לנוגדנים (ניתן להתייחס לקצב הדיפוזיה של הנוגדן כקבוע). יחס מסוים של ריכוזי אנטיגן ונוגדנים, האופטימלי ליצירת משקעים, נקרא אזור השקילות. זה מביא לקווי משקעים ברורים.

גם ריכוז (טיטר) של נוגדנים בסרום החיסון יכול להשתנות באופן משמעותי. ייתכן שאזורי השקילות עבור רכיבים שונים של התערובת לא יהיו חופפים. כדי לבחור יחס שווה ערך של אנטיגן-נוגדן, מומלץ לבצע אימונואלקטרופורזה של תערובות מרובות רכיבים בכמה ריכוזים יחסיים של אנטיגן-נוגדן, שכן כאשר משתמשים רק בריכוז אחד כזה, ייתכן שלא יתגלה רכיב כזה או אחר.

שיטת אימונואלקטרופורזה של ג'ל אגר

צלחת זכוכית בגודל 90x120 מ"מ שטופלה באלכוהול מונחת אופקית לחלוטין על הבמה. מקורר לטמפרטורה של (45±5) 0 C, אגר ג'ל מורח על צלחת זכוכית בכמות של 18.0-20.0 מ"ל. לאחר התמצקות בטמפרטורת החדר, לאחר 20-30 דקות, נוצרת על הצלחת שכבת אגר בעובי 2.0-2.5 מ"מ.

לאחר שהג'ל מתקשה, חותכים בו 6-7 חורים בקוטר 1-2 מ"מ באמצעות שבלונה מיוחדת. את הבארות ממלאים בדגימת הבדיקה בנפח שאינו עולה על נפח הבאר (2 בארות לכל דגימת בדיקה). במקביל, מוחדרת דגימת בקרה לבארות העליונות והתחתונות של צלחת זכוכית עם ג'ל - סרום דם אנושי רגיל ("דגימה סטנדרטית של מערכת בדיקה לקביעת ההרכב החלקי (אנטיגני) של תכשירים מסרום דם אנושי על ידי אימונואלקטרופורזה" או דגימת בקרה אחרת בהתאם להוראות במונוגרפיה או בתיעוד נורמטיבי), צבועה בפירונין B (או בצבע אחר המצוין במונוגרפיה או בתיעוד הנורמטיבי).

בגליל מדידה בנפח 1000 מ"ל מוסיפים 500 מ"ל תמיסת חיץ ורונאל-מדינאל או בוראט, מביאים את נפח התמיסה לסימון עם מים מטוהרים ומערבבים. התמיסה המתקבלת (או תמיסת חיץ אחרת המצוינת במונוגרפיה או בתיעוד הרגולטורי) מוזגת לתוך חלקי האלקטרודה של החדר של מכשיר האלקטרופורזה.

את הצלחת עם הג'ל המוכן מניחים במכשיר לאלקטרופורזה ומשולבים בתמיסת חיץ בחדרי האלקטרודות של המכשיר באמצעות מספר שכבות של נייר סינון. במקרה של תכנון המכשיר לאלקטרופורזה, המאפשר חיבור אגר על פלטה עם חיץ אלקטרודה באמצעות עמודי אגר, הצלחת מותקנת במכשיר מאוזן ויוצקת אגר מותך עד לחיבורה עם עמודי אגר. ונוצרת שכבת ג'ל בעובי 1-2 מ"מ.

המכשיר לאלקטרופורזה מכוסה במכסה ומקור מתח מופעל (מתח 70-200 V, זרם 10-40 mA). אלקטרופורזה מתבצעת במשך 1.5-3 שעות עד שהנקודה של פירונין B, התואמת לנדידת אלבומין, תהיה במרחק של 20-25 מ"מ מהבאר.

לאחר אלקטרופורזה, באמצעות סטנסיל מיוחד, חותכים "חריצים" אורכיים (מקביל לכיוון הנדידה) בין הבארות בג'ל האגר. ל"חריצים" מוסיפים 0.25 מ"ל של אנטי-סרום משקע: נגד חלבוני סרום אנושי (בעת בדיקת ההרכב השברירי) או סרום רב ערכי נגד חלבוני סרום אנושי, גדול בקר, סוסים וחזירים (כדי לאשר את האותנטיות).

הצלחת עם ג'ל אגר ממוקמת בתא לח ונשמרת בטמפרטורה של (5 ± 3) 0 C למשך 24-48 שעות.

כדי לשטוף חלבונים שלא נכנסו לתגובת המשקעים מניחים את צלחת האגר בקובטות, יוצקים בתמיסת נתרן כלורי 0.9% ומדגגרים במשך 16-18 שעות. התמיסה משתנה 3-4 פעמים. לאחר מכן מסירים את הצלחת מתמיסת 0.9% נתרן כלורי, מכסים בנייר סינון ספוג בתמיסת נתרן כלורי 0.9% ומייבשים באוויר עד שהאגר ג'ל הופך לסרט דק. לאחר מכן, הצלחת עם הג'ל המיובש מכוסה בנייר סינון ספוג בתמיסת 0.9% נתרן כלורי, ללא בועות אוויר, ומייבשים בטמפרטורת החדר או בתנור בטמפרטורה שאינה עולה על 40 מעלות צלזיוס. לאחר ייבוש הצלחות מרטיבים את נייר הסינון במים ומסירים בזהירות.

לצביעת חלבון, נעשה שימוש בצבע amido black 10B או בצבע מתאים אחר (בהתאם להוראות במונוגרפיה או בתיעוד הרגולטורי), הנחת הצלחת בקובטה עם תמיסת צבע למשך 30-40 דקות. לאחר מכן שוטפים את הצלחת בתמיסת שטיפת אגר (תמיסת חומצה אצטית 2% או תמיסה אחרת, בהתאם להוראות בתיעוד הרגולטורי) למשך 15-40 דקות עד שהרקע הצבעוני נעדר לחלוטין ומתייבש שוב בטמפרטורת החדר או בתוך תנור בטמפרטורה שאינה עולה על 40 מעלות צלזיוס.

ליפופרוטאינים מוכתמים בסודן שחור B. לצביעה, צלחות מיובשות לחלוטין מונחות בתמיסת צבע למשך 3 שעות, ואז מחלישות את הצבע עם 50% אתנול עד שהרקע ברור לחלוטין. ליפופרוטאינים צובעים כחול כהה. יש לבצע צביעה של תכשיר מיובש לחלוטין, שכן סודן שחור B אינו מסיס במים ומכתים את הג'ל הרטוב.

התחשבנות בתוצאות בחקר ההרכב השברירי של תכשירי אימונוגלובולינים אנושיים מתבצעת חזותית על ידי השוואת האלקטרופורגרמה של דגימת הבדיקה לאלקטרופורגרמה של דגימת הביקורת - סרום דם אנושי תקין ("דגימה סטנדרטית של מערכת הבדיקה לקביעת הרכב חלקי (אנטיגני) של תכשירים מסרום דם אנושי באמצעות אימונואלקטרופורזה" או דגימת בקרה אחרת בהתאם להוראות בתיעוד הרגולטורי), אשר אמור להראות מספר מוסדר של קווי משקעים עם סרום כנגד חלבוני סרום אנושי (לפחות 15 קווי משקעים כשמשתמש " מדגם סטנדרטימערכות בדיקה לקביעת ההרכב החלקי (אנטיגני) של תכשירים מסרום דם אנושי על ידי אימונואלקטרופורזה). המרכיב העיקרי של תכשיר אימונוגלובולין אנושי צריך להתאים לאימונוגלובולין G (Ig G) של סרום דם אנושי תקין.

התחשבות בתוצאות בעת ביצוע מחקרים לאישור האותנטיות של מוצרי דם אנושיים מתבצעת באופן ויזואלי על ידי זיהוי קווי משקעים עם סרום כנגד חלבוני סרום של דם אדם, בקר, סוס וחזיר. יש לזהות קווי משקעים רק עם סרום כנגד חלבוני סרום אנושיים.

הערות

1. הכנת תמיסת חיץ של 0.05 M veronal-medinal(pH 8.6±0.1).בבקבוק נפח בנפח 1000 מ"ל מוסיפים 1.38 גרם ורונאל, 8.76 גרם מדינל, מוסיפים מים מטוהרים לסימון ומערבבים עד להמסה מלאה.

1. הכנת תמיסת חיץ בוראט 0.05M(pH 8.6±0.1).בבקבוק נפח עם קיבולת של 1000 מ"ל מוסיפים 6.7 גרם חומצה בורית, 13.4 גרם נתרן טטרבוראט 10-מימי, מוסיפים מים מטוהרים עד לסימון ומערבבים.
2. הכנת ג'ל אגר 1.25%.. הכנת ג'ל אגר מתבצעת באחת מהדרכים הבאות:
3. להכנת ג'ל אגר 1.25%, נעשה שימוש במאגר ורונאל-מדינלי של 0.05 M (pH 8.6 ± 0.1) עם ריכוז מלח כפול (בהתאמה, 2.76 גרם ורונאל ו-17.52 גרם מדינל לכל 1000 מ"ל מים מטוהרים).
4. להכנת ג'ל אגר 1.25% משתמשים בתמיסת חיץ בוראט (pH 8.6 ± 0.1) עם ריכוז מלח כפול (בהתאמה: 13.4 גרם חומצה בורית ו-26.8 גרם נתרן טטרבוראט 10-מימי לכל 1000 מ"ל מים מטוהרים).

12.5 גרם אגר מוסיפים לכוס כימית בנפח 1000 מ"ל, מוסיפים 500 מ"ל מים מטוהרים ומשאירים את הג'ל להתפחה למשך שעה בטמפרטורה של (20 ± 1) 0 C. הכוס עם ה. את התוכן מכניסים לאמבט מים רותחים ומודגרים עד שהאגר נמס לחלוטין. נפח תמיסת הג'ל מותאם עם מים ל-500 מ"ל, ואז מוסיפים נפח שווה של תמיסת חיץ ורונאל-מדינלית או בוראט (או תמיסת חיץ אחרת המצוינת במונוגרפיה או בתיעוד הנורמטיבי). את תמיסת האגר מסננים דרך 2-3 שכבות גזה, מוסיפים תיומרסל לריכוז של 100 מיקרוגרם/מ"ל ומוזגים לבקבוקונים של 40-50 מ"ל (הכמות הנדרשת לשתי צלחות). האגר המומס צריך להיות שקוף.

1. הכנת תמיסת צביעה של amido black 10B.הכנת תמיסת הצבע מתבצעת באחת מהדרכים הבאות:
2. בבקבוק נפח עם קיבולת של 1000 מ"ל מוסיפים 1.0 גרם של אמיד שחור 10B, 450 מ"ל תמיסת חומצה אצטית 0.1M, 550 מ"ל תמיסת 0.1M נתרן אצטט ומערבבים.
3. בבקבוקון נפח בנפח 1000 מ"ל מוסיפים 1.0 גר' אמינו שחור 10B, 100 מ"ל חומצה קרחונית, מביאים את הנפח לסימן עם מים מטוהרים ומערבבים. לאחר 12 שעות, מסננים דרך מסנן נייר.
4. הכנת תמיסת הצביעה סודן שחור B.בבקבוקון נפח בנפח 1000 מ"ל מוסיפים 1.2 גרם סודן B שחור, 20 מ"ל תמיסת נתרן הידרוקסיד 1M, 380 מ"ל מים מטוהרים ומביאים את נפח התמיסה לסימן עם אתנול מוחלט ומערבבים. את התערובת מרתיחים לזמן קצר, מצננים לטמפרטורת החדר ולאחר הקירור יוצקים את הצבע לבקבוק כהה עם פקק טחון. המגיב נשמר בטמפרטורת החדר למשך 3 חודשים.
5. הכנת תמיסת חומצה אצטית 2% לשטיפת אגר. בבקבוקון נפח בנפח 1000 מ"ל מוסיפים 20.0 מ"ל חומצה קרחונית, מביאים את נפח התמיסה עם מים מטוהרים לסימון ומערבבים. המגיב נשמר בטמפרטורת החדר למשך 3 חודשים.

ההמצאה מתייחסת לציוד מעבדה. מטרת ההמצאה היא לצמצם את זמן המחקר ולהפחית את צריכת הג'ל. המכשיר מכיל קובטה 1, מחיצה 2, תמיסת חיץ 3, מחזיק 4 של הג'ל עם מכסה 11 ואלקטרודות 12. במחזיק 4 על משטח העבודה שלו ישנם חריצים אופקיים המחוברים בתעלות עם חללים בצדדים מנוגדים של המחיצה. לכריכה 11 יש שורות של חורים 7 ו-8 המסודרים בזוגות מעל כל חריץ. המחזיק והכיסוי עשויים מחומר שקוף. הסרה ממוקמת בחורים 7 ו-8 וספק הכוח מופעל. כתוצאה מהתגובה נוצר משקע, לפיו נבחן נוכחות או היעדרו של האנטיגן. התגובה מתרחשת בגוש סגור, הג'ל לא ממלא את כל המחזיק, אלא רק את החריצים, מה שמאפשר להפחית את צריכתו. 1 ז.פ. פלי, 3 חולה.

איחוד הסובייטים

סוֹצִיאָלִיסט

רפובליקה

תיאור ההמצאה

לתעודת BTOPCKOMY

הוועדה הממלכתית

להמצאות ותגליות

ב-SCST ברית המועצות

1 2)11 4)6111(1>(-1-1 (221 1(1.(n>.X7)

I 4t> I; 3 (I. I (j.> Ü. I ">. i X 4 (1 (711 Veeeon) zn>> n (e. (b (ni and lbor>triple technpki (721 V. () !. (:obole(3, . 3. V. bap (tano> 3, V.. 1. Won, iüåv ו-3. V. (; g3 IIHh (> v)

נ ()6)7471), קל. א 6! ב-5i():), 1(177.

1541 Y(. E C3(r1(:Th() L, 15(!! P()BE:., ((.1!1! SI

1! Y:) (Y ((OE.1 () .. (; TR (.) FOR! .3> "3 V (l, 1 (. (571 And (obreT (ni (מ- nouite> 1 ל-1 "l) ()()j) ()),"(onwin) I I(.lb tt 3(>()e l (. niya okrap (epis of time veilingll. i ne.> elova1eni<.>„„SU„„15179 8 A 1 (5() 4 A b (V 5/04, C (01 3 33) 48

2 eo i (1.11 hv>ttl g "(, baffle -", b 1), (, terzh "te.> 4 gel e lid 11 II s. (ektrols 12. In holder 4 on his

Raen> and ll HIGH EVENT EXP.> N kibl G) RIZONT; 1.> ьHl, i (113> bi, מחוברים (ערוצים עם פולוטים לאורך E); t 1 p (> ch., ((השני והכיסוי עשויים of h;>ts rial. Sy(>s>rotki ps>m"n11>n>t in geretia 7 and 8 and incln)11)n>t the block of whining. In re T 3T (. תגובה ((ii) obrdz3e1 u; i.t (> h, and kT () I) "%ted e) lyat o n,), (ו" Hll lt, lit o ": an". l (ll "n and ll. k (). 1it 13 3 1 kE>tT(>M (<.1>h(, Г(. l b 3 ,!v

tl >t(ll a.(b1, ו-T(>new>;o 1,1() 3 b1eHbllll(Tb (th P;t 1 3, and

תְבִיעָה

ההמצאה מתייחסת לציוד רפואי וניתנת לשימוש בשירותי הדם, במחלקות למחלות זיהומיות

6 בתי חולים, במעבדות אבחון קליני של מוסדות רפואיים.

מטרת ההמצאה היא לצמצם את זמן ביצוע המחקר ולהפחית את צריכת הג'ל.

באיור. 1 מציג מכשיר עבור

II!)()k3Deniss Red)I(HI(; מחזיק איור 2 ילד, חתוך, איור 3 זהה, מבט מלמעלה.

המכשיר לאימונואלקטרופורזה מורכב מוטו 1, המחולק לכל האורך על ידי מחיצה 2 לשני חלקים, ויוצרים חללי חיץ-אלקטרודה מלאים בתמיסת חיץ 3.

111k מחיצה 2, מחזיק 4 gs I) מותקן I, שהוא שקוף ו

6 1()k, המכילה סדרה של חריצים 5, cat()!)bl(. imageK)T ערוצים אוטונומיים המחברים את המאגר 3 משני צידי המחיצה 2. לכל ערוץ יש שני ()Tk3cpcTkIkI b להכנתם בן () רקמה 7 וסרום 8. הערוצים מופרדים זה מזה על ידי דופן דק 9.

לאלקטרופורזה במכשיר מכינים חיץ ורונאל-מדינלי מברביט. l I נתרן (מדינאל 17.5 גרם ו-barG> ו-I.ld Be!) he 1) l) 2.7 גרם B 1000 מ"ל דיס1 ו, s , l )11)()ק)ק)IIII()II Vol.

מטרה ר ( ) גוביאז מ 1 ) גארא פי פמי>

k.("I1kckIT1), 1 גרם אגר לכל 100 מ"ל תמיסת חיץ.

11re.l nicha) om electrophoresis grooves 5 zai (.) nyak) 1 carrier 0 (אגר ג'ל), 3dT (I in dslak gel) t recesses, in one

I I 3), r)) 6. 1 n and i V i os Ya t sy V o r k x 7, V I I 1) חוצץ 3, מחזיק תמיכה B.II)k)dk()T דרך מחיצה 2. Cuvée Tv

3dk!)I l«d l() l מכסה 11 עם אלקטרודות 2.

המכשיר פועל באופן הבא.

החדר מסופק עם מתח קבוע. עם מעבר זרם ישר דרך מעגל חיץ האלקטרודה - נושא - חיץ - אלקטרודה, אנטיגנים ונוגדנים נעים זה לקראת זה ובאינטראקציה יוצרים משקע הנראה לעין בלתי מזוינת. משקעים מאפשרים לשפוט את נוכחותו או היעדרו של

אנטיגן 1O בסרה הנחקרת. כך, ניתן לזהות חולים עם דלקת קדחת קרציות k3blM, דלקת קרום המוח, דלקת כבד בסרום ומחלות אימונולוגיות אחרות.

במכשיר המוצע לניצוח -! 5 אלקטרופורזה, טכנולוגיית הייצור מפושטת מאוד, המחזיק בוטל עיצוב מורכב, אלא בשל העובדה שהתגובה מתרחשת ביחידה סגורה, ואידוי ועוד גורמים חיצונייםלא יכול להשפיע על הסרום והמנשא המונח בחריצים 5, ניתן להפוך את המכסה שטוח. לפיכך, מדדי האיכות משתפרים.

1. מכשיר לביצוע אימונואלקטרופורזה בג'ל, המכיל קובטה, אלקטרודות, מחיצה המחלקת את הקובטה החדרית לשני חללים ומחזיק ג'ל המותקן על המחיצה, המאופיין בכך שכדי לצמצם את זמן למד והפחת את צריכת הג'ל, המחזיק עשוי בחריצים אופקיים על משטח העבודה, מחובר באמצעות תעלות עם רצפות שונות (קובטות), ומצויד בצלחת Ç5 במגע עם משטח העבודה שלו ובעל שורות של חורים הממוקמות בזוגות מעל כל חריץ .

אימונואלקטרופורזה- אחת השיטות הנפוצות לניתוח איכותי של אנטיגנים. עם ה-AS המשקע המתאים, ניתן להשתמש בו כדי לחקור כל תערובת אנטיגני. בפרט, חלבונים של סרום דם, נוזל מוחי, שתן, חלב, תמציות מאיברים, כמו גם חלבונים ממקור צמחי וחיידקי מנותחים בהצלחה. במרפאה, שיטה זו משמשת לרוב באבחון של paraproteinemia ו מצבי כשל חיסוני. IN רפואה משפטיתהוא משמש לניתוח מערכות ההפטוגלובין ורכיב Gc הספציפי לקבוצה.

בעבודת מחקר, אימונואלקטרופורזה היא השיטה העיקרית לזיהוי חלבונים הכלולים בתערובות מורכבות. זה הכרחי כשיטה לניטור עקבי של תהליך הטיהור של תכשירי חלבון. הוא משמש לעתים קרובות גם כדי לשלוט על האותנטיות והטוהר של תכשירים אלה. מטבע הדברים, השיטה, בעלת יישום כה רחב, הייתה צריכה להשתנות ולשפר בכיוונים שונים. נשאים חדשים הוצעו: agarose gel, PAAG, סרטי אצטט תאית.

במקביל, החלו לשלב IEF עם שיטות שונותצביעה ספציפית ופילואורכרום לזיהוי אנזימים, פחמימות, ליפופרוטאינים, נוקלאופרוטאין. כתוצאה מהשילוב עם שיטות ניתוח אחרות, נוצרו אימונואלקטרופורזה של דיסק, מיקוד אימונואלקטרו, רדיואימונואלקטרופורזה וכו'. לקביעה כמותית באמצעות AS polyspecific הוצע לאחרונה IEF דו מימדי. שינוי מיוחד של IEF הדו מימדי יכול להגביר את רגישותו לרמת RIA. זה מושג על ידי אלוציה אלקטרופורטית של האנטיגן ממיכלי זכוכית קטנים בנפח של 0.1-10 מ"ל. עבור IEF עם קירור, Wimet עיצבה מכשיר ששומר אוטומטית על טמפרטורה וזרם קבועים במהלך תהליך ההפרדה.

מכשיר זה נוח מאוד לקביעת הניידות האלקטרופורטית של חומרים שונים. יש להמליץ ​​במיוחד על השימוש בקירור תרמו-אלקטרי (סוללת Peltier) במכשיר זה כאשר עובדים עם אנזימים וחומרים תרמולאביליים אחרים. לאחרונה הוצעה שיטה פשוטה להפרדת חלבונים באלקטרופורזה דו מימדית. ידועה שיטה רגישה לקביעת מערכות אנטיגן-נוגדנים שאינן מזרזות בהתבסס על שימוש ב-MAb, מה שנקרא cascade IEF, כולל קיבוע של AG לאחר אלקטרופורזה, הצמדת נוגדנים לאנטיגנים, הסרת נוגדנים קשורים וכימותם.

במקרה של אלקטרופורזה של אימונופיקציה, הנוגדנים מופרדים, לא האנטיגן. זוהי שיטה מהירה וחסכונית, ומתאימה במיוחד להקרנה המונית לאיתור פראפרוטינמיה ולהשגת תכשירי חלבון. ב-IEF נצפות לעתים קרובות הפרעות במהלך התקין של התהליך, ולא תמיד ניתן לזהות מיד את הסיבה להן. אם, למשל, נעשה שימוש באגר לא מטוהר מספיק, אבל זה מוביל לרוב לשלוש הפרות: היווצרות ג'ל לקויה, אלקטרומוזה חזקה, שינוי צבע לקוי של תכשירים. יש לטהר תמיד אגר לא טהור מספיק. מתחילים עם מנת אגר חדשה, תחילה עליך לבדוק את התאמתו. לעתים קרובות נמצא כי לאותם אנטיגנים יש ניידות אלקטרופורטית שונה וצובעים בצורה שונה כאשר משתמשים בקבוצות שונות של אגר. הפרעות IEF יכולות להיגרם על ידי הידרוליזה של אגר עקב חימום חוזר או ארוך מדי.

הידרוליזה מתבטאת בהיחלשות של תכונות יוצרות הג'ל והופעת אי סדרים על פני הג'ל. ההפרדה האלקטרופורטית עלולה להיפגע אם נעשה שימוש בפתרון חיץ שגוי. רוב המאגרים משמשים כר גידול טוב לחיידקים ועובשים. לכן יש לאחסן ציר חיץ במקרר או להוסיף לו חומר משמר. יש להחליף את המאגר הממלא את התא האלקטרופורטי לפחות פעם בשבוע. עם שימוש רב במאגר האלקטרודות, יש צורך להחליף את הקטבים של האלקטרודות לאחר כל הפרדה. גודל המתח במסופי המצלמה בדרך כלל אינו מאפשר לשפוט כוח פיזיזרם העובר דרך הג'ל, ולכן יש לחבר מיליאממטר בסדרה במעגל. במהלך ההפרדה, הזרם כמעט תמיד עולה. תופעה זו נובעת מחימום הג'ל, אשר מתגבר עם משך האלקטרופורזה.

עם זאת, לאחר העלייה הראשונית, הזרם במעגל עשוי לרדת. לעתים קרובות זה נובע מייבוש של רצועות נייר הסינון המחברים את הג'ל למאגר, או אפילו בגלל ייבוש הג'ל עצמו. במקרה זה, הפחיתו את החוזק היוני של המאגר או את המתח במסופי התאים. בנוסף, ניתן למנוע ייבוש על ידי עטיפת צלחת הג'ל ורצועות הנייר בסרט פולימר לפני האלקטרופורזה. הכי נוח לעבוד עם מקור שמספק כוח קבועזרם (ייצוב זרם). מובן מאליו שתוצאות IEF תלויות באיכות האנטיגנים והאנטיסרים.

אורז. 8. עקרון האימונואלקטרופורזה.

שלב 1: אלקטרופורזה בג'ל אגר של האנטיגן. האנטיגן נודד למרחק היפותטי כלשהו.

שלב 2: הזרם כבוי. חותכים חריץ באגר וממלאים אותו בנוגדנים. נוצרת קשת משקעים. תיאורטית, אנטיגן מתפזר באופן רדיאלי ממקור נקודתי, ונוגדנים מתפזרים מחריץ בחזית אחידה. משקעים הנוצרים בנקודות של יחס אופטימלי בין אנטיגן ונוגדנים יוצרים קשת. הקשת ממוקמת הכי קרוב לחריץ שבו ריכוז האנטיגן הוא הגבוה ביותר.

אימונואלקטרופורזה עוזרת לזהות אנטיגנים על ידי ניידות אלקטרופורטית, במיוחד כאשר אנטיגנים אחרים נמצאים בדגימה.

באמצעות שיטה זו באימונולוגיה קלינית, ריכוז האימונוגלובולינים נקבע באופן חצי כמותי ומזהים חלבוני מיאלומה (איור 9).

אורז. 9. המחלקות העיקריות של אימונוגלובולינים אנושיים בסרום הדם, זוהו על ידי אימונואלקטרופורזה. לחריץ נוסף אנטי-סרום לארנב. המיקום של שברי הגלובולינים העיקריים מוצג. שלוש מתוך חמש הקבוצות העיקריות של אימונוגלובולינים אנושיים זוהו: IgG, IgA ו-IgM. קשת המשקעים של IgG משתרעת מאזור γ ועד לאזור ά 2 -גלובולין, מה שמשקף את ההטרוגניות הקיצונית של אוכלוסיית הנוגדנים הן בהרכב חומצות האמינו והן במטען הכולל.

על בסיס השילוב של אלקטרופורזה עם משקעים אימונו, פותחו מספר שיטות מוצלחות, שבכל אחת מהן תנועת אנטיגן בשדה חשמלי מובילה למגע שלו עם נוגדנים. ניתן להשתמש באימונואלקטרופורזה נגדית כדי לזהות אנטיגנים הנודדים באגר אל אלקטרודה טעינה חיובית.

איור.10. נגד אימונואלקטרופורזה. עקב אנדוזמוזה, נוגדנים נעים "אחורה" בג'ל; אנטיגן טעון שלילי ב-pH נתון עובר אל האלקטרודה החיובית ויוצר משקעים במגע עם נוגדנים.

השיטה הזאתלוקח פחות זמן והוא רגיש יותר מהדיפוזיה הכפולה של Uchterlony. הוא משמש לזיהוי אנטיגנים של וירוס הפטיטיס B ונוגדנים מתאימים, נוגדנים ל-DNA בזאבת אדמנתית מערכתית, נוגדנים עצמיים לאנטיגנים גרעיניים מסיסים בקולגנוזיס, ונוגדנים (פרזיפיטינים) לאספרקילוס באספרגילוזיס ברונכו-פולמונרי אלרגי.

אלקטרופורזה רקטה היא שיטה כמותית הכוללת הכנסת אנטיגן לג'ל המכיל נוגדנים. לקו המשקעים יש צורה של רקטה, שאורכה נקבע לפי ריכוז האנטיגן.

איור.11. אלקטרופורזה רקטית. האנטיגן, במקרה זה אלבומין בסרום אנושי, נתון לאלקטרופורזה בג'ל המכיל נוגדנים. המרחק בין חור ההתחלה לקצה המוביל של הקשת, בצורת רקטה, תלוי בריכוז האנטיגן. במקרה זה, הריכוזים היחסיים של אלבומין בסרום אנושי הם (משמאל לימין) 3, 2 ו-1.

כמו אלקטרופורזה נגדית, זה כן שיטה מהירה, אבל גם כאן האנטיגן חייב לעבור לאלקטרודה הטעונה חיובית. לפיכך, אלקטרופורזה רקטה מתאימה לחלבונים כמו אלבומין, טרנספרין וצרולופלזמין, בעוד שריכוז האימונוגלובולינים נקבע לרוב על ידי אימונודיפוזיה רדיאלית פשוטה.

אחת הגרסאות המוצלחות ביותר של אלקטרופורזה רקטה היא האימונואלקטרופורזה הדו-ממדית או הצולבת של לורל. במקביל, בשלב הראשון, תערובת האנטיגנים מופרדת אלקטרופורטית בג'ל אגרוז. החלבונים המופרדים נאלצים שוב להתפזר דרך הג'ל בהשפעת שדה חשמלי בכיוון אחר, בניצב לכיוון הראשון. לפיכך, ניתן לכמת כל אחד מהאנטיגנים של התערובת. הדוגמה המרשימה ביותר היא הערכת מידת ההמרה של C3 לצורה מושבתת של C3c, המתרחשת לעיתים קרובות במהלך החמרה בנסיוב של חולים עם זאבת אריתמטית מערכתית או בנוזל הסינוביאלי של המפרקים הפגועים בשלב החריף. דלקת מפרקים שגרונית, כמו גם במקרים אחרים.

איור.12. אימונואלקטרופורזה צולבת.

א. אנטיגנים מופרדים על ידי ניידות אלקטרופורטית בג'ל אגר. רצועה אורכית צרה (מוגבלת בקו שבור) המכילה את האנטיגנים המופרדים נכרתת מהג'ל ומורחת על ג'ל אחר המכיל אנטי-סרום. אז אלקטרופורזה מתבצעת בכיוון מאונך לראשון; ואילו האנטיגנים מגיבים עם האנטי-סרום הכלול בג'ל, עם היווצרות פסגות משקעים. השטח מתחת לשיא תלוי בריכוז האנטיגן הנתון.

ב. אלקטרופרוגרמה המראה את ההמרה של רכיב המשלים C3 (C3 → C3c) בסרום. הג'ל צבוע בנוסף. במקרה זה, הקשתות מתמזגות זו עם זו, שכן לאנטיגנים יש דטרמיננטים משותפים.

V. "פנטזיה הר" - אלקטרופורגרם זה מדגים את האפשרויות המדהימות של אימונואלקטרופורזה צולבת להפריד בין תערובת מורכבת של אנטיגנים.

אימונופלואורסצנטי כרוך בהתקשרות של צבע ניאון, כגון נתרן איזותיוציאנט, למולקולת נוגדנים. חומר אנטיגני (חיידקים, תאים או מרכיביהם) שחיברו נוגדנים מסומנים הופכים גלויים באור אולטרה סגול. השיטה אינה כמותית, אך חשובה מאוד באימונומורפולוגיה לקביעת לוקליזציה מבנים אנטיגניםאו נוגדנים.

תחרות עם אנטיגן רדיואקטיבי(שיטה רדיואימונולוגית) - אחת מהן שיטות מודרניות. התחשבות בתגובת האנטיגן-נוגדן יכולה להתבצע באמצעות שיטות רדיואיזוטופיםבמקרה של שימוש בנוגדנים או אנטיגנים "מסומנים". מדידת הרדיואקטיביות של המשקע מאפשרת להעריך את כמות הנוגדנים או האנטיגן בדגימות הבדיקה. זה מגביר את האובייקטיביות של ההערכה, מאיץ את החשבונאות ומגביר את רגישות התגובה. השיטות הרגישות ביותר (קביעת 1 - 10 ננוגרם של חומר) לתחרות נוגדנים של אנטיגן לא מסומן עם אנטיגן מסומן. העיקרון של השיטה הוא כדלקמן. נעשה שימוש בכמות סטנדרטית של אנטי-סרום נגד האנטיגן הנבדק ובכמות סטנדרטית של אנטיגן זה המסומן ב-125 I, 131 I, 2 H או איזוטופ אחר. היחס שלהם הוא כזה ש-70-80% מהאנטיגן המסומן קשור בנוגדנים, ויוצרים משקע רדיואקטיבי עם ערך רדיואקטיביות של N. אם מצע שנבדק לנוכחות אנטיגן זה מוכנס למערכת המגיבה, אז בנוכחות של האנטיגן הוא מתחרה עם האנטיגן המסומן והרדיואקטיביות של המשקע יורדת. ככל שיש יותר אנטיגן בדגימת הבדיקה, כך פחות רדיואקטיביות של המשקע. בשיטה זו נקבע הריכוז בדם, בשתן ובשאר החומרים של חומרים כאלה, אשר בשל ריכוזים זניחים אינם מתגלים בשיטות ביוכימיות (הורמונים: אינסולין, הורמון גדילה, ACTH, גונדוטרופין, דיגוקסין, סומטוטרופין וכו' .).

אורז. 13. שיטה לבידוד אימונוגלובולין קרומי (IgM - 8S) מפני השטח של לימפוציטים B.

1. תיוג חלבוני פני השטח של לימפוציטים עם 125 I בנוכחות לקטופרוקסידאז (LP).

2. תמוגה של תאים ושחרור חלבוני פני השטח לתמיסה.

3. משקעים של אימונוגלובולינים מסומנים עם סרום אנטי-Ig ספציפי.

4. הלבנה ומשקעים של המשקעים.

5. הרס המשקע וניתוח אלקטרופורטי של שרשראות קלות וכבדות בג'ל פוליאקרילאמיד

שיטת ELISAמייצג את הפיתוח של הכי הרבה שנים האחרונות. מבחינת רגישות, זה לא נחות מהקודם, אבל הוא פשוט יותר בנוכחות ריאגנטים מסחריים. נוגדנים נגד אנטיגן מסוים נספגים על דפנות צינורות פוליסטירן. מצע הבדיקה מתווסף למבחנה זו. בנוכחות אנטיגן זה, הוא מתחבר עם נוגדנים. המצע מתנקז ונוגדנים נגד אותו אנטיגן מוכנסים למבחנה. נוגדנים אלה מסומנים באנזים, לרוב כרום פרוקסידאז. נוגדנים מסומנים נצמדים לקומפלקס הקודם וגם נשארים על דפנות הצינור. תכולת הצינור מוחלפת בתערובת של כרומוגן (אורתופנילנדיאמין) עם מצע לאנזים זה - H 2 0 2 . אם היה בנוזל הבדיקה את האנטיגן הרצוי, האנזים מקובע על דפנות המבחנה, מפרק H 2 0 2: החמצן המשוחרר יצבע את הכרומוגן בצהוב.

שיטת Wannierכרוך בשימוש בנפלומטר פוטו-אלקטרי כדי להסביר את המשקעים, שבאמצעותו נרשם השינוי בצפיפות האופטית של הסרום לאחר הוספת האנטיגן. כאשר סרום מדולל במים מזוקקים, הצפיפות האופטית יורדת. אם יש נוגדנים בסרום, וכמדלל, פתרון מיםאנטיגן, אז עקומת השינויים בצפיפות האופטית תהיה שונה. ראשית, יש ירידה בצפיפות האופטית, עם הצטברות של כמות מספקת של אנטיגן, הירידה נעצרת, ואז נצפית עלייה בצפיפות האופטית של תערובת האנטיגן-נוגדנים.

תופעת ליזה- יכולתם של נוגדנים מסוימים להמיס את התאים שנגדם הם התעוררו. נוגדנים אלו ביחס לחיידקים נקראים בקטריוליזינים, לאריתרוציטים – אריתרוליזינים, או המוליזינים. תגובות תמוגה חיסוניות מאופיינות בכך שהן אינן מתרחשות בנוכחות של שני מרכיבים בלבד - אנטיגן ונוגדן. מרכיב שלישי, הנקרא המשלים, חייב להיות נוכח. בכמויות שונות, משלים כלול בסרום הדם של בעלי חיים רבים; במיוחד הרבה ממנו בסרום הדם שרקנים. בתחילה, התגובה ממשיכה בהתאם לסוג האגלוטינציה, ואז משלים מצטרף לקומפלקס האנטיגן-נוגדנים ומתרחש פירוק מקומי של קרום החיידקים, אריתרוציטים או תאים אחרים.

תופעת הציטוטוקסיותנקבע על ידי נוגדנים הנקראים ציטוטוקסינים. פעולתם טמונה בעובדה שהם מפגינים השפעה רעילה, המונעת מהתאים את כדאיותם. התגובה לגילוי ציטוטוקסינים לשים עם תרחיף של תאים בתמיסת חיץ איזוטונית של נתרן כלורי. מוסיפים להם צבע, למשל, אאוזין או טריפן כחול. תאים חיים אינם מוכתמים, תאים מתים קולטים במהירות את הצבע (בתוך 30 שניות). אם מוסיפים לתרחיף התאים סרום חיסוני המכיל ציטוטוקסינים ומשלים, התאים ימותו ויהיו מוכתמים כאשר נבדקים בצבעים. אחוז התאים המתים מצביע על כמות הציטוטוקסינים בסרום הדם. התגובה דורשת נוכחות חובה של משלים.

תגובת קיבוע משלים (CFR)מבוסס על תכונת המשלים שתוארה לעיל להצטרף לקומפלקס האנטיגן-נוגדנים. ליתר דיוק, המשלים מקובע על קטע מיוחד של השרשרת הכבדה של מולקולת הנוגדנים. עם זאת, אתר זה הופך נגיש רק לאחר הצמדת הנוגדן לאנטיגן. לאחר חיבור עם קומפלקס אנטיגן-נוגדנים אחד, המשלים אינו יכול לעבור לקומפלקס אחר המוכנס למערכת המגיבה לאחר האינטראקציה של הקומפלקס הראשון והקומפלמנט שנוספו בכמות ידועה. בתור הקומפלקס השני, משתמשים בדרך כלל במה שנקרא מערכת המוליטית - תערובת של אריתרוציטים של ראם עם נוגדנים נגדם. אם הקומפלקס הראשון הוא קומפלקס אנטיגן-נוגדנים, אז לא יהיה משלים חופשי בתערובת התגובה; המוליזה של אריתרוציטים לא תתרחש. להיפך, אם אין נוגדנים לאנטיגנים המשמשים בחומר הבדיקה (למשל בסרום דם), אזי המשלים יישאר חופשי ויבטיח המוליזה של אריתרוציטים. RSK משמש באבחון של עגבת (תגובת ווסרמן), מחקרים של נוגדנים נגד רקמות ונוגדנים עצמיים; הוא נמצא בשימוש נרחב באבחון של מספר זיהומים ויראליים.

התופעה של עיכוב ספציפימשמש לעתים קרובות להשוואה בין שני אנטיגנים במחקר. לדוגמה, סמים חיסוניים מוכנים נגד אריתרוציטים של עכברים. כדי לקבוע אם הוא מכיל נוגדנים נגד אריתרוציטים של זן בעלי חיים קרובים (חולדה), הסרום מטופל באריתרוציטים של חולדה. אם רמת הנוגדנים בסרום יורדת, אז יש אנטיגנים קשורים, אם היא נופלת לחלוטין, אז האנטיגנים זהים. בעזרת תגובה זו, נותחו אנטיגנים והפטנים רבים הקשורים לזהות או אי-זהות.

תגובה לנטרול רעלנים. אנטי-רעלנים נקראים נוגדנים נגד חיידקים ועוד כמה רעלים (לדוגמה, ארס נחשים) בעלי אופי אנטיגני. נוגדי רעלים, בשילוב עם החומרים הרעילים המתאימים, מנטרלים אותם. ניתן לקחת בחשבון את מידת הנטרול על ידי מתן תערובת רעלן-אנטיטוקסין לבעל חיים רגיש. כמות האנטי-טוקסין בסרום החיסון מאופיינת במספר המנות הקטלניות המינימליות של הרעלן שניתן לנטרל על ידי כמות מסוימת של סרום. תגובת הנטרול משמשת לקביעת ריכוז הרעלים של פתוגנים של דיפתריה, טטנוס וכו '. לשם כך, נעשה שימוש בסרה אנטי-טוקסית סטנדרטית.

תופעת אופסוניזציהמורכב מכך שנוגדנים משפרים את הפעילות הפאגוציטית של נויטרופילים ומקרופאגים ביחס לאותם חומרים אנטיגנים או מיקרואורגניזמים שנגדם הם מתקבלים. לדוגמה, הפעילות של פגוציטים נגד סטפילוקוק מוגברת באופן משמעותי אם לוקוציטים או תורם לויקוציטים מטופלים בסרום אנטי-סטפילוקוקלי. פעולה זו הייתה קשורה בנוכחות של נוגדני אופסונין ספציפיים. עם זאת, יש לזכור כי אין נוגדנים מיוחדים של אופסונינים, המוליזינים, בקטריוליזינים או משקעים. אלו הם רק ביטויים של התפקיד העיקרי של מולקולות אימונוגלובולינים לתת קומפלקס אנטיגן-נוגדנים ספציפי.

ד. מובילים אפורים דוגמה טובהאחדות וגיוון של תפקיד זה. נוגדנים שהוכנו נגד פוליסכריד פנאומוקוק מסוג I יכולים:

1) לגרום לאגלוטינציה של פנאומוקוקים מסוג I ולנפיחות של הקפסולה שלהם;

2) לגרום למשקעים של תמצית מסיס מפנאומוקוקים מסוג I;

3) לצרף השלמה, כלומר לספק RSK;

4) יש השפעה אופסונית על לויקוציטים כנגד פנאומוקוקים מסוג I;

5) לבצע הגנה ספציפית על בעלי חיים מפני זיהום פנאומוקוק.

למרות זאת, במצבים ניסויים או קליניים ספציפיים שונים, ניתנת עדיפות לתגובות אנטיגן-נוגדנים ספציפיות. בעת אבחון קדחת טיפוסהשתמש בתגובת Vidal - צבירה של חיידקים, לניתוח רכיבים אנטיגנים של נוזלים ביולוגיים מורכבים או תמציות רקמות - תגובות משקעים באגר בצורה של אימונודיפוזיה או אימונואלקטרופורזה. כאשר עובדים עם רעלים ואנטיגנים מסיסים רבים משתמשים בשיטות המאגלוטינציה פסיבית. כדי לקבוע את רמת ההורמונים בדם, השיטה הרדיואימונולוגית מתאימה ביותר וכו'. מחלקות שונות של אימונוגלובולינים מראים את הפונקציה של שילוב עם אנטיגן בדרכים שונות.

עִקָרוֹן נגד אימונואלקטרופורזה(VIEF) מורכבת מתנועה בו זמנית של אנטיגנים ונוגדנים אחד כלפי השני בג'ל בהשפעת זרם חשמלי.

כתוצאה מהאינטראקציה הספציפית שלהם, נוצר קו משקעים. השיטה משלבת את הפשטות של תגובת המשקעים המפוזרת בג'ל עם הרזולוציה הגבוהה של אלקטרופורזה. אמנם שיטה זו נחותה ברגישות לשיטת הנוגדנים הפלורסנטים והתגובה המאגלוטינציה עקיפהעם זאת, הוא אינו דורש נוגדנים זוהרים, מיקרוסקופ זוהר ואבחון אריתרוציטים.

WIEF היא שיטה איכותית. זה מאוד ספציפי וקל ליישום. זה יכול לשמש כדי לזהות אנטיגנים חיידקיים או ויראליים בחומר פתולוגי, איברים של חיות מעבדה (ביוסאיות) או חפצים סביבתיים.

חומרים וציוד. 1. Agarose A ו-B. 2. 0.05M חציצה מדינאלית-HCl (pH 8.6). 3. נתרן כלורי. 4. נתרן פוספט מוחלף. 5. אשלגן פוספט חד תחליפי. 6. אשלגן כלורי. 7. אמוניום אוקסלט. 8. אנטיגן חיידקי או ויראלי ספציפי. 9. מצלמה לאלקטרופורזה. 10. מיישר DC 50 mA. 11. תרמוסטט חשמלי לאוויר יבש. 12. צנטריפוגה מעבדתית בנצ'טופ.

טכניקת הגדרה. על צלחת זכוכית, מותקנת אופקית, יוצקים 30 מ"ל של אגרוז מותך 1%, מוכן במאגר מדינל - HCl (pH 8.6). לאחר שהג'ל מתקשה, חותכים שתי שורות כפולות של חורים בקוטר 5 מ"מ בעזרת אגרוף (8 חורים בכל שורה); מרחק בין שורות כפולותהוא 30 מ"מ. הג'ל מוסר מהבארות, נאסף במבחנה, ממיס על להבת מבער ובעזרת פיפטת פסטר מובא לתחתית הבארות.

מהצד של הקתודה מניחים את חומר הבדיקה ומצד האנודה - סרום מונוספציפי, אך נוגדנים חד שבטיים טובים יותר (MAB) בנפח 0.035 מ"ל. למשל, לאיתור פנאומוקוק - סרום אנטפנאומוקוק, לגילוי האנטיגן של נגיף השפעת - אנטי שפעת וכו'.

הצלחת ממוקמת בתא האלקטרופורזה בצורה כזו שהקצף המשמש כגשר מקשר בין מערכת החיץ לג'ל הנשא נוגע באחרון. אלקטרופורזה מתבצעת בטמפרטורת החדר במתח של 140...150 וולט וזרם של 35 mA למשך 18...35 דקות.

לִשְׁלוֹט. המחקר של החומר ב-VIEF עבור נוכחות של אנטיגן ספציפי צריך להיות מלווה בבקרה עם חומר חיובי ידוע.

איתור הפתוגן בשילוב של VIEF עם גידול. יש להשתמש במדיה סלקטיבית לזריעת חומר מזוהם.

לאחר דגירה של 36 שעות ב-37 מעלות צלזיוס, 0.3 מ"ל של 0.85% תמיסת NaClעם 4% פורמלין, עושים שטיפה, שנשאבת למבחנה ולאחר חשיפה של שעה, נבדקת ב-VIEF.

התחשבנות בתוצאות. בְּ תוצאה חיוביתקו פרשיטאטה מופיע בין הבאר עם חומר הבדיקה לבאר עם סרום ספציפי. קו המשקעים, בהתאם לכמות האנטיגן בחומר הבדיקה, יכול להיות ממוקם באמצע המרחק בין הבארות, או קרוב יותר למאגר הסרום.

בדרך כלל, קווי משקעים נוצרים 18-35 דקות לאחר תחילת האלקטרופורזה.

אם אתה מוצא שגיאה, אנא סמן קטע טקסט ולחץ Ctrl+Enter.