Komplementin kiinnitysreaktio(RSK) on monimutkainen kaksivaiheinen serologinen reaktio. Se käyttää viittä ainesosaa, jotka muodostavat kaksi järjestelmää: antigeeni, vasta-aine, komplementti (ensimmäinen järjestelmä); lampaiden punasolut, jotka on herkistetty (käsitelty) hemolyyttisellä seerumilla, joka sisältää niille spesifisiä vasta-aineita (toinen eli indikaattori, hemijärjestelmä). Tässä tapauksessa vasta-aineen vuorovaikutus antigeenin kanssa reaktion ensimmäisessä vaiheessa johtaa immuunikompleksin muodostumiseen, joka adsorboi komplementtia, mutta tätä ei voida havaita visuaalisesti. Toisessa vaiheessa hemijärjestelmää käytetään indikaattorina komplementin sitoutumisesta antigeeni-vasta-ainekompleksiin, joka immuunikompleksina pystyy myös adsorboimaan sen. Loppujen lopuksi reaktiolla on kaksi mahdollista lopputulosta. Jos vasta-aine ja antigeeni vastaavat toisiaan ja muodostunut kompleksi adsorboi komplementin, hemijärjestelmän punasolujen hajoamista ei tapahdu. Jos vasta-aine ei täsmää antigeenin kanssa ja päinvastoin, vapaana jäänyt komplementti liittyy hemijärjestelmään ja aiheuttaa hemolyysin.

Kuten muitakin serologisia testejä, RSK:ta voidaan käyttää spesifisten vasta-aineiden havaitsemiseen tunnettua antigeeniä vastaan ​​tai antigeenin havaitsemiseen tunnettuja vasta-aineita vastaan.

Yleiset luonteenpiirteet RSC ainesosat.

1. TUTKIMUSSEERUMI ennen reaktion asettamista kuumennetaan vesihauteessa 30 minuuttia oman komplementtinsa inaktivoimiseksi ja laimennetaan suhteesta 1:5 alkaen.

2. ANTIGEENI voi olla bakteeriviljelmiä, niiden lysaatteja, viruksia ja viruksia sisältäviä materiaaleja, patologisesti muuttuneiden elinten uutteita ja kudoslipidejä.

3. KOMPLEMENTTI - koepäivänä saatu marsun seerumi. Tällä hetkellä käytetään teollista kuivakomplementtia.

4. HEMOLYYTTINEN JÄRJESTELMÄ koostuu hemolyyttisestä seerumista, joka on sekoitettu yhtä suuriksi tilavuuksiksi, ja 3 %:sta lampaan erytrosyyttien suspensiosta sedimentillä. Punasolujen herkistämistä varten hemolysiineillä seosta pidetään termostaatissa 37 °C:n lämpötilassa 30 minuuttia.

RSC:n pääkokeen lausunto. SERUMI, ANTIGEENI JA KOMPLEMENTTI lisätään 1 koeputkeen, seerumi, komplementti ja isotoninen natriumkloridiliuos antigeenin sijasta (SERUM CONTROL), antigeeni, komplementti ja sama natriumkloridiliuos (ANTIGEN CONTROL) lisätään kolmanteen putkeen. Koeputket asetetaan termostaattiin 37 °C:n lämpötilaan 1 tunniksi. Samalla valmistetaan hemolyyttinen järjestelmä, joka lisätään sitten kaikkiin kolmeen putkeen sen jälkeen, kun teline on poistettu termostaatista. Kun hemijärjestelmä on sekoitettu kolmen koeputken ainesosien kanssa, viimeksi mainitut asetetaan jälleen termostaattiin 1 tunniksi, ja tämän ajan jälkeen RSC:n tulokset otetaan huomioon.

Kun otetaan huomioon RSC, reaktion intensiteetti osoitetaan plussilla: "++++" - jyrkästi positiivinen reaktio hemolyysin täydellisellä viiveellä koeputkessa oleva neste on väritöntä, kaikki punasolut asettuvat pohjalle; "+++", "++" - positiivinen reaktio, jolle on tunnusomaista nesteen värin lisääntyminen hemolyysin vuoksi ja punasolujen määrän väheneminen sedimentissä; "+" - heikosti positiivinen reaktio, neste on voimakkaan värinen, putken pohjassa on pieni määrä punasoluja. Negatiivinen reaktio on merkitty merkillä "-", kun havaitaan täydellinen hemolyysi, koeputkessa olevalla nesteellä on voimakkaan vaaleanpunainen väri ("lakkaveri").

RSK on erittäin monimutkainen, mutta erittäin herkkä spesifinen reaktio. Käytetään laajalti kupan diagnosoinnissa, krooninen muoto gonorrea, hinkuyskä, aktinomykoosi, kaikki riketsioosi ja virusinfektiot.

Yhdistetty immunosorbenttimääritys.

Menetelmän kehitti 70-luvun alussa itsenäisesti kolme tutkijaryhmää. Menetelmä muistuttaa RIA:ta, mutta perustuu entsyymin kanssa reaktioon tulevan Ag:n tai Ab:n leimaamiseen. Vzd-merkintöihin substraatilla liittyy yleensä väliaineen värin muutos. Tällä hetkellä tästä menetelmästä on luotu lukuisia muunnelmia, mutta laajimmin käytetty on heterogeeninen ELISA kiinteässä faasissa (solid-phase). Erottaa:

1) SUORA KIINTEÄVAIHEEN ELISA. Tässä tapauksessa:

1. Ab:ta sisältävää seerumia inkuboidaan kiinteälle substraatille kiinnitetyn Ag:n kanssa (useimmiten se on muovinen mikrolevy).

2. Ab, jota Ag ei sido, poistetaan toistuvalla pesulla.

3. Entsyymileimattua seerumia lisätään Ab-sidottuun Ag:hen.

4. Määritä At:hon sitoutuneen markkerientsyymin lukumäärä.

2) KILPAILUKYKYINEN KIINTEÄVAIHEEN ELISA.

1. Seerumi lisätään. Jos se sisältää tiettyjä Ab:ita, ne sitoutuvat kiinteälle alustalle kiinnitettyyn Ag:hen. Jos spesifisiä Ab:ita ei ole, Ag ei ole sidottu.

2. Kun lisätään kiinnitetylle Ag:lle spesifisiä vasta-aineita, ensimmäisessä tapauksessa niillä ei ole mitään vuorovaikutusta (usein Ag on jo sitoutunut) Þ markkerin sisältö on alhainen. Toisessa tapauksessa tietyt Ab:t sitoutuvat Ag:hen, eivätkä ne huuhtoudu pois pesun aikana Þ korkea merkkiainepitoisuus.

Samoin ehkä. VASTA-AINEET ovat kiinteät, ja useat yritykset valmistavat täsmälleen tabletteja, joissa on jo kiinteä At.

Verrattuna klassisia menetelmiä antigeenien havaitsemisen, tämän menetelmän avulla voit rekisteröidä suoraan niiden vuorovaikutuksen vasta-aineiden kanssa, ei sekundaarisia ilmentymiä (agglutinaatio, saostuminen tai hemolyysi). Menetelmä on erittäin HERKKYINEN (1 ng/ml pitoisuus riittää).

Määritä: klamydia, klostridia, HIV jne.

8. Fagosytoosireaktio.

Mikrofagit ja makrofagit toteuttavat fagosytoosin. Fagosytoosin vaiheet: lähestyminen, tarttuminen, upottaminen, ruoansulatus.

Fagosyyttisolujen toiminnallisen aktiivisuuden arviointi.

Määrä granulosyyttien ja monosyyttien fagosyyttinen aktiivisuus määritetään kokoverestä, leukosyyttisuspensiosta tai fagosyyttisolujen rikastetuista fraktioista. Tavallisina fagosytoosin kohteina käytetään monodisperssiä lateksihiukkasia, joiden halkaisija on 1,0-2,0 μm, lämmöllä tapettujen bakteerien tai hiivan kaltaisten sienten suspensiota.

Fagosyytit sekoitetaan fagosytoidun materiaalin kanssa suhteessa 1:10 tai 1:100 ja inkuboidaan 37 °C:ssa 30 minuuttia jatkuvasti sekoittaen. Sen jälkeen putket sentrifugoidaan ja pelletti suspendoidaan uudelleen pisaralliseen veriseerumia sivelynäytteen valmistamiseksi. May-Chryunwald-värjäyksellä kiinnitetyissä ja Romanovsky-Giemsan mukaan värjätyissä sivelysoluissa lasketaan fagosyyttisolujen prosenttiosuus (FP - fagosyyttinen indeksi) ja absorboituneiden hiukkasten lukumäärä yhtä solua kohti (PF - fagosyyttiluku).

klo terve ihminen FP = 40-80%, PF = 1-5.

9. Diagnostiikka.

Diagnosticumit ovat tiettyjen kuumentamalla tai formaliinilla tapettujen mikrobisolujen suspensio, jonka solupitoisuus tilavuusyksikköä kohti tunnetaan. Elävien bakteerien suspensioita voidaan käyttää myös antigeeninä. Reaktioilmiö ilmenee etukäteen kahden tunnin kuluttua (37 0 C:ssa), lopputulos huomioidaan huoneenlämmössä 18-20 tunnin kuluttua. Diagnostiikassa positiivinen reaktio kiinnostaa vain tietyssä seerumitiitterissä, joka toimii diagnostisena. Joten luomistaudissa diagnostinen tiitteri on 1:200 ja tula-remialla -1:100. Vasta-aineiden havaitsemiseksi voidaan suorittaa e(laskenta-aika on useita minuutteja). Esimerkiksi: 1. Veripisarareaktio tularemiassa. Pisara tislattua vettä (hemolyysiä varten) ja pisara tularemia diagnosticum levitetään pisaralle potilaan kokoverta erityisellä lasilla. Reaktio tapahtuu 1-2 minuutissa, agglutinaatit ovat selvästi näkyvissä valkeahkoina kokkareina. 2. Heddelsonin mukainen ekspressoitu agglutinaatioreaktio suoritetaan lasille luomistaudin varalta.

Nämä reaktiot eivät mahdollista seerumin vasta-aineiden määrää b) infektiotautien patogeenien puhtaan viljelmän tunnistaminen. Tätä tarkoitusta varten immunodiagnostinen

rokote- ja seerumiinstituuttien tuottamat agglutinoivat seerumit immunisoimalla eläimiä kokonaisilla mikrobisoluilla. Luotettavuuden vuoksi on parempi käyttää adsorboituja seerumeita, jotta ne sisältävät vain vasta-aineita, jotka vastaavat tietyntyyppistä tai tyyppistä mikro-organismia.

Immuuniseerumien saamisen periaatteet.

Immuuniseerumi (antiserum) on veriseerumi, joka sisältää vasta-aineita tietylle antigeenille. Useimmissa tapauksissa immuuni- (diagnostiset) seerumit mikrobien, kudosten ja muiden antigeenien suhteen saadaan kokeellisesti immunisoimalla eläimiä sopivilla antigeeneillä.

Antiseerumien tärkeimpiä vaatimuksia ovat niiden korkea spesifisyys ja riittävä vasta-ainepitoisuus. Spesifisyyden mukaan erotetaan moniarvoiset (polyspesifiset) ja yksiarvoiset (monospesifiset) antiseerumit. Moniarvoiset seerumit sisältävät vasta-aineita monille antigeeneille, monospesifisiä - yhdelle tietylle antigeenille. Voit saada monospesifisiä seerumeja:

1) käyttämällä erittäin puhdistettuja antigeenejä eläinten immunisointiin,

2) natiiviseerumien puhdistaminen ei-toivotun spesifisyyden omaavista vasta-aineista.

Tähän käyttöön:

1) immunoaffiniteettimenetelmä, joka perustuu tietyn spesifisyyden omaavien vasta-aineiden sitoutumiseen kiinteän faasin kantajalle immobilisoituihin vastaaviin antigeeneihin, minkä jälkeen muodostuvat AG-AT-kompleksit erotetaan ja vasta-aineet eristetään;

2) Castellanin mukainen adsorptiomenetelmä. Tätä tarkoitusta varten mikro-organismit sisältävät kaikki ryhmän antigeenejä adsorboi siten homologisia anti-

kehon. Tällaiset adsorboidut monospesifiset antiseerumit sisältävät vasta-aineita antigeenimolekyylin erilaisille determinanteille, jotka ovat heterogeenisiä luokassaan (alaluokkaan)

Komplementin kiinnitysreaktio (RCC) koostuu siitä, että kun antigeenit ja vasta-aineet vastaavat toisiaan, ne muodostavat immuunikompleksin, johon komplementti (C) kiinnittyy vasta-aineiden Fc-fragmentin kautta eli komplementti sitoutuu antigeeniin. vasta-ainekompleksi. Jos antigeeni-vasta-ainekompleksia ei muodostu, komplementti pysyy vapaana.

AG:n ja AT:n spesifiseen vuorovaikutukseen liittyy komplementin adsorptio (sitoutuminen). Koska komplementin kiinnittymisprosessi ei näy visuaalisesti, J. Bordet ja O. Zhangu ehdottivat hemolyyttisen järjestelmän (lampaiden erytrosyytit + hemolyyttinen seerumi) käyttöä indikaattorina, joka osoittaa, onko komplementti kiinnittynyt AG-AT-kompleksilla. Jos AG ja AT vastaavat toisiaan, eli immuunikompleksi on muodostunut, niin komplementti sitoutuu tähän kompleksiin eikä hemolyysiä tapahdu. Jos AT ei vastaa AG:ta, kompleksia ei muodostu ja vapaana jäänyt komplementti kytkeytyy toiseen järjestelmään ja aiheuttaa hemolyysin.

Reaktion edistyminen

Reaktio etenee kahdessa vaiheessa, joissa on kaksi järjestelmää; bakteeri- ja hemolyyttinen. Ensimmäinen reaktio (spesifinen) sisältää antigeenin 4-+ vasta-aineen + komplementin. Reaktion positiiviselle tulokselle, joka tapahtuu, kun vasta-aineet vastaavat antigeeniä, on ominaista spesifisen bakteeri-antigeeni-vasta-ainekompleksin muodostuminen adsorboituneen tai, kuten sanotaan, "sidotun" komplementin kanssa. Näkymättömänä pysynyt kompleksi ei aiheuta mitään ulkoisia muutoksia ympäristöstä, jossa se muodostui. Negatiivinen CSC-tulos syntyy, kun antigeenin ja seerumin vasta-aineen välillä ei ole spesifistä affiniteettia ja sille on tunnusomaista vapaan aktiivisen komplementin retentio. RSC:n ensimmäinen vaihe voidaan suorittaa termostaatissa 37°C:ssa (1-2 tuntia) tai jääkaapissa 3-4°C:ssa (18-20 tuntia). Kun antigeeni-vasta-aine-immuunikompleksi muodostuu pitkään kylmässä, komplementin sitoutuminen tapahtuu täydellisemmin ja sen seurauksena reaktion herkkyys kasvaa. Asettaessaan vertailevia kokeita Neuvostoliiton immunologi Acad. V. I. Ioffe ja hänen oppilaansa osoittivat, että pitkäaikaisessa komplementin kiinnittymisessä kylmässä voi saada 100-500 kertaa pienempiä määriä antigeeniä ja saada positiivisia tuloksia immuuniseerumin korkeilla laimennoksilla kuin komplementin kiinnityskokeessa lämpötilassa 37 °C 1-2 tunnin sisällä Reaktion toinen vaihe (indikaattori) tapahtuu hemolyyttisen järjestelmän reagenssien välillä (seos 3 % erytrosyyttien suspensiota ja hemolyyttistä seerumia yhtäläisinä tilavuuksina) 37 °C:n lämpötilassa vain komplementin läsnä ollessa, joka jää vapaaksi reaktion ensimmäisestä vaiheesta (negatiivinen reaktio). Vapaan aktiivisen komplementin puuttuessa erytrosyyttien hemolyysiä ei tapahdu spesifisten hemolysiinien vaikutuksesta (reaktio on positiivinen).

Komponentit

Komplementin kiinnitystesti (RCC) on monimutkainen serologinen testi. Sen toteuttamiseen tarvitaan 5 ainesosaa, nimittäin: AG, AT ja komplementti (ensimmäinen järjestelmä), lampaiden punasolut ja hemolyyttinen seerumi (toinen järjestelmä).

CSC:n antigeeni voi olla erilaisten tapettujen mikro-organismien viljelmiä, niiden lysaatteja, bakteerikomponentteja, patologisesti muuttuneita ja normaaleja elimiä, kudoslipidejä, viruksia ja viruksia sisältäviä materiaaleja.

Täydennyksenä käytetään tuoretta tai kuivattua heraa. marsu.

reaktiomekanismi

RSK suoritetaan kahdessa vaiheessa: 1. vaihe - antigeenin + vasta-aineen + komplementin kolme komponenttia sisältävän seoksen inkubointi; 2. vaihe (indikaattori) - vapaan komplementin havaitseminen seoksessa lisäämällä siihen hemolyyttinen järjestelmä, joka koostuu lampaiden punasoluista ja hemolyyttisestä seerumista, joka sisältää vasta-aineita niille. Reaktion ensimmäisessä vaiheessa, antigeeni-vasta-ainekompleksin muodostumisen aikana, tapahtuu komplementin sitoutuminen, ja sitten 2. vaiheessa vasta-aineilla herkistettyjen erytrosyyttien hemolyysiä ei tapahdu; reaktio on positiivinen. Jos antigeeni ja vasta-aine eivät täsmää toistensa kanssa (testinäytteessä ei ole antigeeniä tai vasta-ainetta), komplementti pysyy vapaana ja 2. vaiheessa liittyy punasolu-antierytrosyytti-vasta-ainekompleksiin aiheuttaen hemolyysin; reaktio on negatiivinen.

Sovellus

Komplementtikiinnitystä voidaan käyttää:
1) spesifisten vasta-aineiden havaitseminen tuntemattomasta seerumista perustuen niiden vuorovaikutukseen tunnetun luonteen antigeenin kanssa;
2) antigeenin ominaisuuksien tutkiminen reaktiossa tunnetun spesifisen seerumin kanssa. Ainesosien valmistus RSK:n asettamiseen.

1. Tutkimusta varten saatua veriseerumia kuumennetaan ennen reaktion alkamista vesihauteessa 56 °C:ssa 30 minuuttia sen oman komplementin inaktivoimiseksi. Inaktivoitua seerumia voidaan säilyttää 3-4 °C:ssa 5-6 päivää. Koepäivänä seerumi laimennetaan isotonisella natriumkloridiliuoksella suhteessa 1:5 (0,1 ml testiseerumia + 0,4 ml isotonista natriumkloridiliuosta).

2. RSK:n lavastusantigeeni voi olla eri mikrobiviljelmiä, bakteeriproteiineja ja mikrobiviljelmistä saatuja uutteita, patologisesti muuttuneita ja normaaleja elimiä ja kudoksia. Antigeenin valmistuksen ominaisuudet määräytyvät luonteen mukaan tarttuva prosessi ja sen aiheuttajan ominaisuudet.

3. Komplementti on seerumiseos, joka on saatu 3-5 terveestä marsusta, tai kuiva komplementti ampulleissa.

Välittömästi ennen käyttöä marsun seerumi laimennetaan isotonisella atriumkloridiliuoksella suhteessa 1:10, jolloin saadaan kantaliuos.

4. Hemolyyttinen seerumi inaktivoidaan kuumentamalla 56 °C:n lämpötilassa 30 minuuttia ennen kokeen aloittamista. Kolminkertaista hemolyyttistä seerumia käytetään RSK:n peruskokemuksen vahvistamiseen sekä komplementin ja antigeenin titraamiseen. Esimerkiksi, jos hemolyyttisen seerumin tiitteri on 1:1800, reaktiossa käytetään seerumilaimennosta 1:600.

5. Punasoluja saadaan defibrinoidusta lampaan verestä. Veri fibriinikalvojen poistamiseksi suodatetaan kolmikerroksisen sideharsosuodattimen läpi. Saatu suodos sentrifugoidaan, seerumi imetään ja valutetaan pois, ja punasolut pestään 3-4 kertaa sentrifugoimalla isotooppisella natriumkloridiliuoksella. Punasolujen viimeisen pesun yhteydessä nesteen supernatanttikerroksen tulee olla täysin läpinäkyvä. Pestyistä punasoluista valmistetaan 3-prosenttinen suspensio isotoniseen natriumkloridiliuokseen. Valmistettuaan CSC:hen liittyvät aineosat edellä kuvatulla tavalla, ne alkavat titrata hemolyyttistä seerumia, komplementtia ja antigeeniä.



hemolyysireaktio.

Hemolyysireaktio (RG) - Tämä on punasolujen tuhoamista vasta-aineiden vaikutuksesta komplementin mukana.

RG komponentit.

1. Antigeeni- 3 % erytrosyyttien suspensio isotonisessa natriumkloridiliuoksessa;

2. Vasta-aine - hemolyyttinen seerumi- sisältää seerumia erytrosyyttien vasta-aineet (hemolysiinit); seerumi saadaan immunisoimalla kaneja pässin erytrosyyteillä;

3. Täydentää- veren proteiinien järjestelmä, joka adsorboituu antigeeni-vasta-aine-kompleksiin ja muodostaa kalvohyökkäyskompleksin, joka tuhoaa antigeenin, ts. tuhoaa punasoluja tai muuten aiheuttaa punasolujen hajoamista ( hemolyysi). Täydennyksenä juuri valmistettuna marsujen veriseerumi.

Jos erytrosyyttejä, hemolyyttistä seerumia ja komplementtia laitetaan koeputkeen tiettyinä määrinä, tapahtuu muutamassa minuutissa punasolujen tuhoutuminen (hemolyysi), jonka seurauksena tummanpunainen seos muuttuu vaaleanpunaiseksi ("lakkaveri") .

Hemolyysireaktiota käytetään indikaattorina määritettäessä komplementin kiinnitysreaktiota.

Komplementin kiinnitystesti (CFR) on monimutkainen serologinen reaktio, jossa on mukana kaksi antigeeni-vasta-ainejärjestelmää ja komplementti. 1. järjestelmä - erityisiä, 2. - hemolyyttinen järjestelmä.

Tämän reaktion kehittivät J. Bordet ja O. Zhangu, jotka havaitsivat, että antigeeni-vasta-ainekompleksin muodostumisen aikana komplementti sitoutuu tähän kompleksiin. Näkyvä vaikutus jossa ei näkyvä sen vuoksi komplementin sitoutumisen havaitsemiseksi (ja siten antigeeni-vasta-ainekompleksin muodostumisen havaitsemiseksi, kun ne vastaavat toisiaan), so. kuten indikaattori 2. - hemolyyttistä järjestelmää käytetään.

RSK:ta käytetään useammin serodiagnoosissa (sairauden aiheuttajan vasta-aineiden havaitseminen potilaan veriseerumista ) tippuri, kuppa, hinkuyskä, lavantauti ja muut riketsioosit sekä monet virustaudit. RSK:ta käytetään myös seridentifiointiin.

RSK komponentit.

1. Antigeeni- mikrobiuutteet, hapteenit, harvemmin - mikrobisuspensio, ts. antigeeni voi olla joko korpuskulaarinen (liukenematon) tai molekyylinen (liukoinen).

2 . Vasta-aine- sairaan henkilön veriseerumi (serodiagnostiikkaa varten) tai immuunidiagnostiikkaseerumi, joka sisältää tunnettuja vasta-aineita (seroidentifiointiin).

3. Lampaan punasolut – antigeenit hemolyyttinen reaktio.

4. Hemolyyttinen seerumi- sisältää seerumia vasta-aineita lampaiden punasoluille. Seerumi vastaanottaa immunisoimalla kani pässin erytrosyyteillä.

5. Täydentää– vasta valmistettu marsun seerumi (nestemäinen tai pakastekuivattu).

6. Elektrolyytti- isotoninen natriumkloridiliuos.

RSK-asetus.

Ennen kokeen asettamista antigeeni, potilaan seerumi, hemolyyttinen seerumi ja komplementti titrataan (niiden tiitteri määritetään). Potilaan seerumia kuumennetaan 56 °C:ssa 30 minuuttia.

RSC suoritetaan vuonna 2 vaihe.

I vaihe - erityisiä: yhteen koeputkeen valmistetaan spesifinen järjestelmä - samat määrät tunnettua antigeeniä, potilaan seerumia ja komplementtia sekoitetaan, toisessa koeputkessa valmistetaan hemolyyttinen järjestelmä - lampaan erytrosyyttien ja hemolyyttisen seerumin seos, putket asetetaan termostaatti 37 °C:ssa 30 minuuttia. Samalla valmistetaan kontrollit antigeenille, komplementille ja hemosysteemille, kontrollinäytteet tunnetun sairaan henkilön seerumilla (positiivinen seerumi) ja tunnetun terveen henkilön seerumilla (negatiivinen seerumi) ja asetetaan myös termostaattiin 30 minuutiksi.

II vaihe - indikaattori: sama määrä hemolyyttistä järjestelmää lisätään alkuseokseen ja kaikkiin kontrolliputkiin ja reaktion tulokset otetaan huomioon 30 minuutin termostaatissa pidennyksen jälkeen.

RSC-tulosten laskenta suoritettu täydellisin tuloksin kontrollissa .

positiivinen reaktio(ihminen on sairas ja hänen seeruminsa sisältää vastaavia vasta-aineita taudin aiheuttajalle - antigeenille): vaiheessa I muodostuu spesifisessä järjestelmässä antigeeni-vasta-ainekompleksit, joihin komplementti sitoutuu, kun hemolyyttinen järjestelmä on lisätty vaiheeseen II, hemolyysiä ei havaita, koska komplementti on sitoutunut 1. spesifiseen järjestelmään. Näkyvä vaikutus- koulutus erytrosyyttisedimenttiä.

Negatiivinen reaktio(ihminen on terve eikä hänen seerumissa ole vasta-aineita taudin aiheuttajalle): antigeeni-vasta-ainekomplekseja ei muodostu ja komplementti faasissa I pysyy vapaana; punasolujen vastaiset vasta-aineet) ja aiheuttaa punasolujen hemolyysiä. Näkyvä vaikutus- erytrosyyttien hemolyysi - "lakkaveri".

Tartuntatautien diagnosoinnissa käytetään myös toksiinin neutralointireaktio (RN) antitoksisen seerumin kanssa, immunofluoresenssireaktio (RIF), radioimmunomääritys (RIA), entsyymi-immunomääritys (ELISA).

SISÄÄN Reaktio perustuu kahteen ilmiöön - bakteriolyysiin ja hemolyysiin. Komplementti on mukana niiden ilmenemisessä. Siksi RSC:ssä käytetään kahta komponenttijärjestelmää: 1) tarjoaa bakteriolyysin ilmiön ja sitä käytetään diagnostisiin tarkoituksiin; 2) hemolyyttinen, indikaattori, apu; voit määrittää, onko komplementti sidottu vai ei sidottu ensimmäisessä järjestelmässä (katso värimalli kuvassa I). Aiemmin antigeeninä käytettiin bakteerisuspensiota, joten ensimmäistä järjestelmää kutsuttiin bakteriolyyttiseksi (positiivisissa tapauksissa tapahtui bakteerien hajoaminen).

RSC:n asetus tehdään kahdessa vaiheessa. Ensimmäisessä vaiheessa valmistetaan bakteriolyyttinen järjestelmä: 0,5 ml testiseerumia sekoitetaan antigeenin kanssa koeputkissa, lisätään komplementtia tiukasti määritellyssä annoksessa (tiitteri). Antigeenin ja seerumin komplementin seosta (bakteriolyyttinen järjestelmä) pidetään vesihauteessa (tai termostaatissa) 20 ... 40 minuuttia 37 ... 38 °C:ssa. Koeputkessa olevien komponenttien vuorovaikutuksen tulos. on näkymätön, neste pysyy läpinäkyvänä ja värittömänä Määrittäminen, kontakti Jos komplementti on bakteriolyyttisessä järjestelmässä, suoritetaan reaktion toinen vaihe: hemolyyttisen järjestelmän komponentit lisätään koeputkiin - pestyt lampaan punasolut ja inaktivoitu hemolyyttinen seerumi, kuten kaaviossa on esitetty. Kaikkia bakteriolyyttisen järjestelmän komponentteja ravistellaan sekoittumaan koeputkessa, asetetaan vesihauteeseen 37...38 °C 20...40 min. Sitten lisätään gemologisen järjestelmän komponentit, kaikkea ravistetaan toisen kerran ja asetetaan uudelleen vesihauteeseen 10–15 minuutiksi.

Alustava tulos. Jos seerumi on saatu sairaalta eläimeltä, se sisältää vasta-aineita, jotka yhdistyvät tietyn antigeenin kanssa. Komplementti sitoutuu tähän kompleksiin (antigeeni - vasta-aine) - hemolyysiä ei tapahdu, tulos on positiivinen.

Terveen eläimen seerumissa ei ole vasta-aineita: antigeeni-vasta-ainekompleksi ei muodostu, bakteriologisessa järjestelmässä oleva komplementti ei sitoudu. Kun erytrosyyttejä ja hemolysiiniä (tämä on antigeeni ja vasta-aine) lisätään, komplementti reagoi tämän kompleksin kanssa - hemolyysi tapahtuu, tulos on negatiivinen (katso väri kuva II).

Loppuselvitys tuloksesta. Putket jätetään huoneenlämpöön 15...20 tunniksi Jos bakteriolyyttisessä järjestelmässä oleva seerumi oli sairaalta eläimeltä, putkeen muodostuu spesifinen antigeeni-vasta-ainekompleksi, joka adsorboi (sitoutuu) kaiken lisätyn komplementin. Tämän seurauksena toisessa, hemolyyttisessä hemolyysijärjestelmässä ei tapahdu, punasolut asettuvat putken pohjalle, supernatantti on läpinäkyvää. RSC-tulos on positiivinen.

Jos testiseerumissa käytetylle antigeenille ei ole spesifisiä vasta-aineita (tapauksissa, joissa seerumi on terveestä eläimestä), antigeeni-vasta-ainekompleksi ei muodostu bakteriolyyttisessä järjestelmässä, ja siksi tämän järjestelmän komplementti ei ole adsorboituu, mutta pysyy vapaana. Kun hemolyyttisen järjestelmän komponentit lisätään (reaktion toisessa vaiheessa), komplementti on vuorovaikutuksessa toisen kompleksin kanssa (hemolysiini - erytrosyytit), punasolujen hemolyysi tapahtuu - ei muodostu sakkaa, koeputkessa oleva neste on lakanpunaista . RSK-tulos on negatiivinen.

RSK. käyttö: 1) spesifisten vasta-aineiden havaitsemiseen sairaan eläimen seerumista (lumistaudin, peripneumonian, räkätautien, leptospiroosin, trypanosomiaasin jne. diagnosoinnissa); 2) havaita spesifinen antigeeni (bakteeri- tai virusantigeeni) testimateriaalista spesifisen immuuniseerumin läsnä ollessa.

RSK:n määrittäminen edellyttää: tutkimukseen vastaanotettuja seeruminäytteitä; kaksi seerumia, joiden tiedetään olevan positiivisia (standardi, joka antaa positiivisen tuloksen) ja kaksi normaalia seerumia. Kaikki seerumit 1:10 laimennoksessa inaktivoidaan 56...58 °C:ssa 30 minuutin ajan; antigeeni laimennettuna tiitterin mukaan; komplementti laimennettuna vakiintuneen tiitterin mukaisesti titrauksen aikana bakteriolyyttisessä järjestelmässä; hemolysiini työtiitterissä; pässin punasolut (I: 40); fysiologinen suolaliuos, mittapipetit, koeputket, telineet, vesihaude 37...38 °C.

Ennen RSK-vaihetta lampaan veri defibrinoidaan, erytrosyytit pestään suolaliuosta sentrifugoimalla, kunnes supernatantti on täysin läpinäkyvä, joka poistetaan imulla ja saostuneet erytrosyytit laimennetaan suolaliuoksella 1:40 (2,5 %). Antigeeni laimennetaan biotehtaan etiketissä osoittaman tiitterin mukaisesti. Hemolysiini ja komplementti titrataan ennen RSK:n asettamista.

CSC:n antigeeni valmistetaan biotehtaissa. Yleensä nämä ovat uutteita tuhoutuneista mikrobisuspensioista (tai viruksia sisältävistä kudoksista). Antigeeneillä ei pitäisi olla hemolyyttistä vaikutusta, jota kontrolloidaan reaktion aikana (1 ... 2 annosta antigeeniä ja 0,5 ml punasolususpensiota kaadetaan koeputkeen: hemolyysiä ei pitäisi olla). Antigeenia sisältävässä ampullissa biotehdas ilmoittaa, että se on tarkoitettu RSK:lle (sapny, luomistauti tai muu). Pakkauslaatikossa näkyy eränumero, valmistuspäivämäärä, viimeinen käyttöpäivä, antigeeniaktiivisuus eli missä laimennuksessa sitä tulee käyttää RSK:n asettamisen yhteydessä (1:100, 1:150 jne.). Joissakin sairauksissa muut materiaalit toimivat antigeeneinä; esimerkiksi suuren peripneumonian diagnosointiin karjaa CSC:n antigeeni on ihonalaisesti tai intrapleuraalisesti kokeellisesti infektoidun vasikan imusolmuke. Antigeenien pitkäaikaisessa varastoinnissa niiden tiitteri tarkistetaan jälleen laboratoriossa erityisen titrausjärjestelmän mukaisesti.

Tutkimukseen saadut testiseerumit laimennetaan suolaliuoksella suhteessa 1:5 tai 1:10, inaktivoidaan kuumentamalla vesihauteessa oman komplementtinsa tuhoamiseksi 30 minuutin ajan 56...58 °C:ssa (aasien, muulien, hirven seerumit). - 61 °C:ssa).

Hemolysiini valmistetaan biotehtaissa hyperimmunisoimalla kaneja pestyillä pässin punasoluilla. Tätä varten kaneihin injektoidaan suonensisäisesti 4...5 kertaa 2...3 päivän välein 40...50 % erytrosyyttisuspensiota. Viikko viimeisen injektion jälkeen kaneista otetaan veri, seerumi imetään steriilisti, inaktivoidaan, säilötään glyserolilla 1:1 tai 0,5 % fenolilla, titrataan, kaadetaan ampulleihin. Laboratorioissa ne titrataan uudelleen ennen RSK:n asettamista.

Hemolysiinin titrausjärjestelmä. Valmista: i) Komplementtilaimennus 1:20; 2) hemolysiini 1:100 (0,2 ml hemolysiini + 9,8 ml suolaliuosta); 3) lampaan punasolujen suspensio 1:40; 4) fysiologinen NaCl-liuos.

Titrausreaktion asettamiseksi telineeseen asetetaan kaksi riviä koeputkia - yksi apuväline vain hemolysiinin laimennosten valmistamiseksi, toinen - itse titrausta varten. Hemolysiinin alkulaimennus 1:100 lisätään kunkin rivin ensimmäiseen putkeen, ja sitten tehdään sarjalaimennus. Kaikkia putkia ravistellaan ja asetetaan vesihauteeseen 37...38°C 10...15 minuutiksi. Tuloksen huomioiminen: tässä esimerkissä pienin määrä (tai sen suurin laimennus), joka antoi täydellisen hemolyysin, on 1:2000, eli tämä on sen todellinen tiitteri. Työtiitteri on 2 kertaa väkevämpi - 1:1000.

0,5 ml (merkitty nuolilla) kutakin ensimmäisen rivin koeputkien laimennosta siirretään toisen rivin erillisiin koeputkiin. Lisää 0,5 ml komplementtia (1:20), 0,5 ml punasoluja (2,5 % suspensio tai 1:40) ja 1 ml suolaliuosta kaikkiin toisen rivin putkiin niin, että nesteen tilavuus kussakin injektiopullossa on 2,5 ml.

Huomautus. Perustuen siihen tosiasiaan, että 5 0,5 ml:n komponenttia osallistuu RSC:n lopulliseen asettamiseen, mikä muodostaa 2,5 ml:n tilavuuden, tätä tilavuutta havaitaan koko työn ajan.

Putkia ravistellaan ja asetetaan vesihauteeseen 10-15 minuutiksi. Hemolyysi tapahtuu ensisijaisesti koeputkissa, joissa on korkea hemolysiinipitoisuus (sen pienin laimennus on 1:500, 1:1000...). Pienin määrä hemolysiiniä (sen suurin laimennus), joka aiheutti punasolujen täydellisen hemolyysin näissä olosuhteissa, on ns. rajoittava (todellinen) tiitteri hemolysiini. Jatkotyössä hemolysiiniä käytetään 2 kertaa väkevämpää, eli kaksinkertaisena määränä, kaksinkertainen tiitteri, jota kutsutaan ns. työnimi. Esimerkiksi, jos todellinen tiitteri on I:2500 (tai 1:2000), niin työtiitteri vastaa laimennusta 1:1250 (tai 1:W00).

K o m p l e m e n t is komponentti tuore seerumi, imusolmuke, kudosnesteet eri tyyppejä eläimet (ja ihmiset); löysi Buchner (1889). Hyönteisissä komplementti puuttuu. Komplementti on proteiiniluonteinen, monimutkaisen rakenteen omaava aine, joka inaktivoituu nopeasti kuumentamalla, pitkäaikaisesti varastoimalla, altistamalla ultraviolettisäteilylle, voimakkaasti ravistelemalla, suodattamalla keraamisten suodattimien läpi, lisäämällä kaoliinia, happoja, emäksiä, alkoholia, asetonia, kloroformia, tislattua vesi, bakteerisuspensio jne. Komplementti voidaan säilyttää lisäämällä 5 g natriumsulfaattia, 4 g per 100 ml marsun seerumia boorihappo. Täydennystoimintaa ylläpidetään jopa kuusi kuukautta. Paras tapa purkitus - kuivaus tyhjiössä alhaisessa lämpötilassa (lyofilisointi). Tässä tilassa suljetuissa ampulleissa sitä säilytetään kaksi vuotta. Ennen jokaista RSK:n tuotantoa komplementin aktiivisuus tarkistetaan titraamalla, eli sen tiitteri määritetään - tähän reaktioon vaadittava optimaalinen määrä. Komplementti titrataan kahdesti: hemolyyttisessä ja bakteriolyyttisessä järjestelmässä.

varten komplementtititraus hemolyyttisessä järjestelmässä komponentit valmistetaan: komplementti laimennoksessa 1:20 (1 ml komplementtia + 19 ml suolaliuosta); hemolysiini, laimennettuna työtiitterin mukaan; pestyjen lampaiden punasolujen suspensio (1:40), suolaliuos. Koeputket asetetaan jalustaan ​​ja niihin kaadetaan erilaisia ​​määriä komplementtia asteittaisella pipetillä 0,03 ml:n välein (0,13; 0,16; 0,19; 0,22 ...: 0,43 ml:aan asti). Lisää sitten loput komponentit (kuva 57). Kaikkia koeputkia ravistellaan ja asetetaan vesihauteeseen 37...38 °C:seen 10...15 minuutiksi ja tulos kirjataan.

Tuloksen huomioon ottaminen: komplementtiitteriksi otetaan pienin määrä komplementtia, joka sai aikaan täydellisen hemolyysin (tässä esimerkissä 0,25 ml).

Titrauksen tulos otetaan huomioon koeputkissa, joissa on eniten hienoa sisältöä komplementti, jossa hemolyysiä odotetaan ennen kaikkea. Pienintä komplementtimäärää, joka saa aikaan punasolujen täydellisen hemolyysin näissä olosuhteissa, kutsutaan komplementtiitteri hemolyyttisessä järjestelmässä.

varten komplementtititraus bakteriolyyttisessä järjestelmässä tarvitaan kaikki reaktion komponentit: komplementti (1:20), erytrosyytit (1:40), hemolysiini työtiitterissä, kaksi positiivista ja kaksi normaalia seerumia, spesifinen antigeeni. Seerumit laimennetaan suolaliuoksella 1:10, inaktivoidaan 30 minuuttia 56...58 X. Kukin seerumi kaadetaan kahteen riviin 0,5 ml:n koeputkia. Komplementtia lisätään kasvavina määrinä kunkin rivin putkiin, kuten titrattaessa hemolyyttisessä järjestelmässä; aloita hemolyyttisessä järjestelmässä tiitterinä otetusta määrästä, sitten jokaisessa seuraavassa koeputkessa annosta nostetaan 0,03 ml:lla ja tasoitetaan tilavuus 0,5 ml:aan suolaliuoksella.

Sen jälkeen 0,5 ml antigeenia lisätään yhteen koeputkiriviin, joissa on positiivinen ja normaali seerumi, ja 0,5 ml suolaliuosta lisätään kunkin seerumin toiseen riviin. Kaikkia koeputkia ravistellaan ja asetetaan vesihauteeseen 30–40 minuutiksi. Sitten kaikkiin koeputkiin lisätään 0,5 ml hemolysiiniä ja 0,5 ml punasoluja, ravistellaan ja asetetaan vesihauteeseen 10-15 minuutiksi. Pienin määrä komplementtia, joka varmisti punasolujen täydellisen hajoamisen molemmissa putkissa (antigeenin kanssa ja ilman antigeeniä) kahdessa normaalissa seerumissa, yhdessä rivissä (ilman antigeeniä) jokaisessa positiivisessa seerumissa ja hemolyysin täydellisellä viiveellä (poissa) Rivejä positiivisia seerumeita, joissa on antigeeni (niissä samoissa annoksissa komplementtia), kutsutaan täydentää tiitteriä, jota käytetään RSC:n pääkokemuksen muotoilussa diagnostisissa tutkimuksissa.

RSC:n pääkokemus (itse asiassa diagnostinen tutkimus). Kaksi riviä koeputkia asetetaan telineisiin tutkittavien seeruminäytteiden lukumäärän mukaan. 0,5 ml kutakin inaktivoitua seerumia kaadetaan kahteen koeputkeen: antigeeni - 0,5 ml lisätään toiseen, 0,5 ml suolaliuosta toiseen (ilman antigeeniä), ja komplementin lisäyksen jälkeen ne muodostavat bakternolyyttisen järjestelmän, ja lisää sitten hemolyyttinen järjestelmä.

Tarvittavat komponentit: 1) testiseerumi, inaktivoitu, laimennettu suolaliuoksella 1:10; 2) spesifinen antigeeni laimennettuna pakkauksen etiketissä biotehtaan ilmoittaman tiitterin mukaisesti; 3) komplementti vahvistetussa tiitterissä; 4) hemolysiini työtiitterinä; 5) pestyjen lampaiden punasolujen suspensio 1:40; 6) suolaliuos NaCl. Testiseerumit kaadetaan kahteen riviin koeputkia. Minkä tahansa määrän testattuja seerumeita varten kontrolleina käytetään tunnettuja positiivisia seerumeita (jotka antavat positiivisen tuloksen) ja normaaleja seerumeita (terveestä eläimestä, joka antaa negatiivisen tuloksen).

Putket, joissa on bakteriolyyttisen järjestelmän komponentteja, ravistellaan, asetetaan vesihauteeseen 20...40 minuutiksi 37...38°C:een. Toisen rivin bakteriolyyttisen järjestelmän putket ilman antigeeniä ravistellaan ja asetetaan vesihauteeseen samoissa olosuhteissa.

Sitten hemolyyttisen järjestelmän komponentit lisätään kaikkiin ensimmäisen ja toisen rivin koeputkiin ja asetetaan vesihauteeseen toisen kerran 10...15 minuutiksi. Kaikissa toisen rivin putkissa, joissa ei ole antigeeniä, tapahtuu täydellinen hemolyysi.

Kunnes lopullinen tulos saadaan, putket jätetään huoneenlämpöön 18 ... .

Viitteitä reaktiosta koeputkissa, joissa on testiseerumit, pidetään luotettavina, jos hemolyysiä ei ole koeputkissa, joissa on positiivinen seerumi ja antigeeni, täydellinen hemolyysi koeputkissa, joissa on positiivinen seerumi ilman antigeeniä, ja kaikissa koeputkissa, joissa on tunnettu normaali seerumi (kuva 1). 61).

Tähän reaktioon tulee liittää antigeenin, komplementin, hemolysiinin ja punasolujen kontrollit. Tätä varten antigeeni, jossa on lampaan punasoluja, kaadetaan erillisiin koeputkiin; komplementti punasoluilla ilman hemolysiiniä; hemolysiini erytrosyyttien kanssa ilman komplementtia; erytrosyytit ja suolaliuos. Jokaisen putken tilavuus säädetään suolaliuoksella 2,5 ml:ksi. Putkia ravistellaan ja asetetaan vesihauteeseen 37 °C:seen 20 minuutiksi. Kaikissa kontrolliputkissa ei saa olla hemolyysiä.

RSC tulos ilmaistaan ​​yleensä risteillä. Reaktion positiivisen tuloksen indikaattorit: + + + + (///) - erytrosyyttien täydellinen sedimentaatio (ei hemolyysiä), sedimentin yläpuolella oleva neste on väritöntä, + + + (///) - sedimentin yläpuolella oleva neste on hädin tuskin kellertävää. Reaktion epäilyttävä tulos: pohjalle laskeutuneiden erytrosyyttien läsnäolo ja supernatanttinesteen osittainen värjäytyminen erytrosyyttien jonkin osan hajoamisen vuoksi on merkitty + + - (++), eli kaksi ja kaksi ja a puolet ristit. Selkeä hemolyysi (ilman sedimenttiä) tai pienellä sedimentillä (+) on negatiivinen tulos.

Pitkäaikainen komplementin kiinnitysreaktio (RDSC). Herkkyydeltään tehokkaampi, toisin kuin tavallinen klassinen RSC. Reaktion ydin on, että bakteriolyyttistä järjestelmää ylläpidetään kolmessa eri tilassa lämpötilaolosuhteet: sen jälkeen, kun komponentteja on sekoitettu huoneenlämmössä 15 minuuttia, sitten matalassa lämpötilassa (4 °C) jääkaapissa 18 ... 20 tuntia ja vesihauteessa 15 minuuttia. Sen jälkeen hemolyyttinen järjestelmä lisätään, ravistellaan, asetetaan jälleen vesihauteeseen ja reaktio rekisteröidään, kuten RSC:ssä. RDSC:n tehokkuus useiden tartuntatautien (tuberkuloosi, vibrioosi, luomistaudi jne.) diagnosoinnissa on vahvistettu.

Komplementin sitoutumissuppressioreaktio (RPSK) tai estoreaktio, epäsuora RSK. Toinen komponentti on osallisena tässä reaktiossa - standardi immuuniseerumi, joka sisältää vasta-aineita antigeenille, jota tavallisesti käytetään diagnostiikassa ja joka siksi reagoi positiivisesti klassisessa CSC:ssä.

Testiseerumi sekoitetaan antigeenin kanssa ja säilytetään jonkin aikaa ilman komplementtia. Sitten lisätään komplementti ja standardiseerumi, putkia ravistellaan ja asetetaan vesihauteeseen 20...30 minuutiksi, minkä jälkeen hemolyyttinen järjestelmä lisätään ja laitetaan takaisin vesihauteeseen. Jos hemolyysiä ei tapahdu, tulos on negatiivinen, koska testiseerumi ei reagoinut antigeenin kanssa ja jälkimmäinen reagoi tavallinen seerumi sitomalla komplementin. Jos testiseerumi on sairaalta eläimeltä, se sisältää spesifisiä vasta-aineita suhteessa antigeeniin, eli antigeenin ja vasta-aineiden välillä tapahtuu reaktio ilman komplementin sitoutumista. Antigeeni, joka on vuorovaikutuksessa testiseerumin vasta-aineiden kanssa, ei reagoi (suppressoituu) standardin (ilmeisesti tunnetun spesifisen) seerumin kanssa, komplementti pysyy vapaana ja reagoi hemolyyttisessä järjestelmässä - hemolyysi tapahtuu, reaktion tulos on positiivinen suhteessa testiseerumiin.

Menetelmä fluoresoivat vasta-aineet (MFA). Tämän menetelmän mahdollisuudet johtuvat serologisten reaktioiden ensimmäisen vaiheen spesifisyydestä ja luminesenssianalyysin herkkyydestä. MFA:n toteuttamiseksi tarvitaan erittäin spesifisiä immuuniluminoivia seerumeita. Tiedetään, että mikrobiologisessa käytännössä käytetyissä erilaisissa serologisissa testeissä on pääasiassa kolme komponenttia: bakteeriantigeeni, vasta-aine ja komplementti. Kaikki kolme komponenttia ovat itse asiassa antigeenejä ja immuuniseerumia, ja vastaavasti luminoivia vasta-aineita voidaan saada kutakin vastaan. Riippuen siitä, minkä tyyppistä luminoivaa seerumia käytetään (bakteeriantigeeniä, antibakteerisia vasta-aineita, komplementtia vastaan), fluoresoivan vasta-ainemenetelmän kolme päävarianttia erotetaan: suorat (1) ja epäsuorat (2) variantit sekä epäsuoran muunnelman modifiointi komplementin avulla. Antigeenin ja vasta-aineen välinen immunologinen reaktio suoritetaan näissä modifikaatioissa suoraan lasilevyllä. Mikro-organismien kiinnittämiseen käytetään orgaanisia liuottimia: asetonia, etanolia, metanolia, dioksaania sekä tavanomaisia ​​mikrobiologisessa käytännössä käytettäviä kiinnitysaineita: formaliinia, Nikiforovin seosta, Carnoyn nestettä jne.

Suora vaihtoehto. Valmiille tuotteelle levitetään erityistä luminoivaa seerumia tietty aika, sitten ylimääräinen seerumi valutetaan pois, lääke pestään ja sitä tarkastellaan fluoresoivassa mikroskoopissa. Tätä menetelmää käytetään bakteerien havaitsemiseen patologisesta materiaalista, esineistä ulkoinen ympäristö sekä patogeenien tunnistamiseen viljelmistä.

Epäsuora (kaksivaiheinen) vaihtoehto. Ensimmäisessä vaiheessa tapahtuu antigeenin spesifinen yhteys vastaavan leimaamattoman seerumin vasta-aineen kanssa. Toisessa vaiheessa spesifinen leimaamaton vasta-aine sitoutuu anti-lajien luminoivaan vasta-aineeseen, joka on sen eläinlajin globuliineilla (tai kokoveriseerumilla) immunisoidun eläimen seerumissa, josta immuuniseerumia käytettiin.

Epäsuora antikomplementaarinen (kolmivaiheinen) variantti. Ensimmäinen vaihe: antigeenileimaamattoman vasta-ainekompleksin muodostuminen. Toinen vaihe: komplementtia sisältävän normaalin seerumin kerrostaminen. Kolmas vaihe: antigeeni-vasta-aine-komplementtikompleksi käsitellään luminoivalla antikomplementaarisella seerumilla, joka on valmistettu immunisoitaessa kaneja komplementin lähteenä toimineen eläinlajin seerumilla.

Epäsuoria MFA-variantteja voidaan käyttää sekä antigeenin havaitsemiseen että vasta-aineiden havaitsemiseen. Lisäksi kaksivaiheisen muunnelman määrittämiseksi tarvitset rajoitetun sarjan anti-lajien luminoivia seerumeita (härän, lampaan, hevosen, sian jne. globuliineja vastaan) ja anti-komplementaarisen muunnelman riittää vain yksi luminesoiva seerumi marsun globuliineja vastaan.

Tekniikka ja immunoluminesenssi ja mikroskopia. Eläinlääkintäbakteriologisten laboratorioiden käytännössä käytetään biotehtaan tuotannon luminoivia seerumeja. Fluorokromin tyypistä riippuen luminoivat seerumit saavat kohteen joko vihreän hehkun (fluoresoiva väriaine) tai punaisen (rodamiinipohjainen väriaine).

Immunoluminesenssimikroskopian suorittamiseksi testimateriaali tulee levittää rasvattomalle, ohuelle, naarmuuntumattomalle lasilevylle. Eläinten elinten ja kudosten tutkimuksessa valmisteet-jäljet ​​valmistetaan ohuella kerroksella. Valmisteet kuivataan ilmassa ja asetetaan kiinnitysnesteeseen (etanoli - 15 min, metanoli - 5 min, asetoni - 5 min). Tarvittaessa valmisteet voidaan säilyttää kiinnityksen jälkeen jääkaapissa jonkin aikaa. Järjestys ja muut toimenpiteet riippuvat käytetyn MFA:n tyypistä (yksivaiheinen, kaksivaiheinen, kolmivaiheinen). Valmisteiden käsittely luminoivilla seerumeilla sekä leimaamattomilla ensimmäisen vaiheen seerumeilla ja komplementilla suoritetaan 37 X kosteassa kammiossa (Petri-maljat kostutetulla suodatinpaperilla).

Yksivaiheinen vaihtoehto. Luminesoiva seerumi levitetään lasilevylle kiinteällä testimateriaalilla (ampullissa ilmoitetussa laimennuksessa). Lääke asetetaan kosteaan kammioon 15...20 minuutiksi 37 °C:ssa. Sitten se pestään puskuroidulla suolaliuoksella (pH 7,4) astiassa vaihtaen liuosta 5...10 minuutin kuluttua useita kertoja tai alle. juokseva vesijohtovettä 3...5 minuuttia Veden tulee olla neutraalia ja raudatonta. Sen jälkeen valmiste (yhdessä lasissa voi olla useita tahroja) kuivataan ilmassa tai suodatinpaperissa, minkä jälkeen tippa puskuroitua glyserolia pH 8,0 asetetaan ja peitetään peitinlasilla. Peitinlasille laitetaan upotusneste, joka ei ole fluoresoiva ja mikroskooppi suoritetaan.

Kaksivaiheinen vaihtoehto. Pisara ensimmäisen vaiheen immuuni-leimaamatonta seerumia levitetään testimateriaalin kanssa lasilevylle. Lääke asetetaan termostaattiin kosteassa kammiossa 15...20 minuutiksi. Sitten se pestään edellä kuvatulla tavalla, kuivataan ja pisara luminoivaa anti-lajien seerumia levitetään. Lääke asetetaan jälleen termostaattiin kosteassa kammiossa 15-20 minuutiksi. Toista pesu ja kuivaa suodatinpaperilla. Puskuroitu glyseroli levitetään, peitetään peitinlasilla, ei-fluoresoiva immersioneste levitetään ja mikroskooppi suoritetaan.

Kolmivaiheinen variantti (antikomplementaarinen). Pisara ensimmäisen vaiheen immuuni-leimaamatonta seerumia levitetään testimateriaalin kanssa lasilevylle. Lääke asetetaan termostaattiin, kuten edellä on kuvattu, kuivataan ja pisara komplementtia levitetään kokeeseen. Lääke asetetaan jälleen kosteaan kammioon ja termostaattiin 15...20 minuutiksi, minkä jälkeen se pestään ja levitetään luminoivaa antikomplementaarista seerumia. Seuraavat menettelyt ovat samanlaisia ​​kuin yksivaiheinen vaihtoehto.

Valvontavalmisteiden valmistus ja käsittely. 1. Suorassa vaihtoehdossa antigeenin ja luminoivan seerumin välisen reaktion spesifisyyden määrittämiseksi heterologisista mikrobilajeista peräisin olevia sivelyvalmisteita tulee käsitellä samalla seerumilla. Näiden lajien tulee olla antigeenisesti samanlaisia, mutta poikkeaa morfologialtaan tutkituista mikro-organismeista; antigeenisesti kaukana tutkituista mikro-organismeista, mutta morfologialtaan ja jakautumiselta samanlainen niiden kanssa. Jälkivalmisteet käsitellään luminoivalla normaaliseerumilla.

2. Epäsuoraa varianttia varten on tarpeen saada kolme kontrollivalmistetta, jotka on käsitelty normaalilla seerumilla, luminesoivalla anti-lajien seerumilla ilman immuuni-leimaamatonta seerumia ja luminesoivalla anti-lajien seerumilla tunnetulla ensimmäisen vaiheen immuuniseerumilla.

3. Epäsuoralle vaihtoehdolle komplementin kanssa tarvitaan kontrollivalmisteita, joiden käsittelyn aikana immuuniseerumi korvataan normaalilla samantyyppisellä ja samoissa laimennoksissa olevalla seerumilla sekä valmisteilla, jotka on käsitelty kaikilla ainesosilla paitsi immuuniseerumilla.

Tulosten arviointi. Hehkun kirkkaus, väri, sijainti ja rakenne otetaan huomioon. Fluoreseiini-isotiosyanaatilla leimatulla luminoivalla seerumilla värjättyjen bakteerien reunalla on kirkkaan vihreä hehku reunuksen tai halon muodossa, keskiosa hehkuu heikosti. Tällaista hehkua kutsutaan spesifiseksi, toisin kuin epäspesifiseksi, kun koko solurunko hehkuu tasaisesti. Mitä kuperampi bakteerisolu on valmisteessa, sitä terävämpi reuna. Tämä hehku voidaan selittää sillä, että tarkkailijan verkkokalvolle projisoituu useita kertoja enemmän vasta-aineita solun "reunan" yksikköalueelta kuin mikrobisolun keskiosasta. On syytä muistaa, että muovisoluissa (leptospira, vibrios) ei ole ääriviivaa tai se on tuskin havaittavissa. Kudosnesteeseen upotettuihin soluihin ja nuoriin basilleihin pernaruttoääriviivat ilmaistaan ​​yleensä epäterävästi.

Luminesenssin intensiteetti arvioidaan neljän ristin järjestelmän mukaisesti: + + + + - erittäin kirkas fluoresenssi mikrobisolun reunaa pitkin, selvästi kontrastina solun tumman rungon kanssa; + + + - solun reuna-alueen kirkas fluoresenssi; + + - solun reuna-alueen heikko hehku; + - ei kontrastihohtoa mikrobisolurungon reuna-alueilla. Tietyn hehkun puuttuminen ilmaistaan ​​merkillä "-" (mikro-organismien varjot ovat näkyvissä). Kun diagnosoidaan erilaisia ​​taudinaiheuttajia positiivinen tulos Useimmiten bakteerisolujen spesifisen luminesenssin katsotaan olevan vähintään neljä tai kolme risteystä.