يبدأ إجراء تحليل PCR (تشخيص PCR) بجمع المواد لفحصها من قبل طبيب أمراض النساء أو طبيب المسالك البولية أو طبيب الأمراض الجلدية والتناسلية. يتم ضمان جودة وموثوقية النتائج التي تم الحصول عليها لاحقًا من خلال أعلى المؤهلات والخبرة الواسعة لأطباء المركز الطبي Euromedprestige، الذين يلتزمون بجميع القواعد اللازمة إجراء PCR-التحليل: العقم الكامل، واستخدام المواد التي يمكن التخلص منها فقط.
توضع المادة المجمعة من الفرشاة في وعاء به محلول ملحي. بعد جمع العينات، ينبغي تسليمها إلى مختبر PCR في أقرب وقت ممكن.
يتم إجراء تحليل PCR في المختبر على ثلاث مراحل:
- استخراج الحمض النووي
- تضخيم شظايا الحمض النووي
- الكشف عن منتجات تضخيم الحمض النووي
استخراج الحمض النووي هو المرحلة الأولى من تشخيص PCR، وجوهرها هو كما يلي: يأخذ الطبيب مادة للبحث من المريض ويخضعها لمعالجة خاصة. أثناء المعالجة، يتم تقسيم الحلزون المزدوج للحمض النووي إلى خيوط فردية. تتم إضافة سائل خاص إلى مادة المريض، والذي يقوم بإذابة المواد العضوية التي تتعارض مع "نقاوة" التفاعل. هذا يزيل الدهون والأحماض الأمينية والببتيدات والكربوهيدرات والبروتينات والسكريات. ونتيجة لذلك، يتم تشكيل DNA أو RNA.
مبدأ طريقة PCR هو "بناء" عدوى DNA أو RNA جديدة. لا يمكن القيام بذلك دون إزالة المادة الخلوية.
يعتمد مقدار الوقت المستغرق في استخراج الحمض النووي على العامل المسبب للعدوى وعلى نوع المادة المستخدمة في أبحاث تفاعل البوليميراز المتسلسل. على سبيل المثال، يستغرق إعداد الدم للمرحلة التالية من 1.5 إلى 2 ساعة.
0Array ( => التحليلات) Array ( => 2) Array ( =>.html) 2
تضخيم الحمض النووي
لتنفيذ المرحلة التالية من تشخيص الحمض النووي - تضخيم الحمض النووي - يستخدم الأطباء ما يسمى بمصفوفات الحمض النووي - جزيئات الحمض النووي للعدوى، والتي سيتم "استنساخ" الحمض النووي عليها لاحقًا. لقد سبق أن ذكرنا أن وجود الحمض النووي الكامل للعدوى ليس ضروريا، ولتنفيذ هذه المرحلة، تكفي قطعة صغيرة من جزيء الحمض النووي، الذي يميز فقط ميكروب معين (العدوى).
أساس تضخيم الحمض النووي، وبالتالي أساس مبدأ تفاعل PCR بأكمله هو العملية الطبيعية لإكمال الحمض النووي لجميع الكائنات الحية - تكرار الحمض النووي، والذي يتم عن طريق مضاعفة سلسلة DNA واحدة.
بدءًا من قطعة واحدة من الحمض النووي، يقوم طبيب المختبر بنسخها وزيادة عدد النسخ في وضع التفاعل المتسلسل: بعد الدورة الأولى يكون لديك بالفعل شظيتين، بعد الدورة الثانية - 4، بعد الثالثة - 8، بعد الدورة الأولى - 8، بعد الدورة الثانية - 4، بعد الدورة الثالثة - 8، بعد الدورة الأولى - 2 جزء. الرابع - 16، ثم 32، 64، 128، 256... مع كل دورة يتضاعف عدد النسخ، وبعد عشرين دورة يصل العدد بالفعل إلى الملايين، وبعد ثلاثين إلى المليارات. تستمر الدورة بضع دقائق وتتلخص في تغير معين في درجة الحرارة في مفاعل كيميائي صغير جدًا. هنا، في المحلول، توجد جميع المكونات الضرورية للتوليف بكميات كافية، أولاً وقبل كل شيء، النيوكليوتيدات A وG وT وC، وكذلك يتم تنفيذ العمليات الكيميائية التحضيرية الدقيقة بحيث يتم أخذ نسخة طبق الأصل من كل منها على الفور قطعة الحمض النووي النهائية، ثم من هذه النسخة - مرة أخرى نسخة، هذا هو التفاعل المتسلسل المتفرع.
من خلال ربط البادئات بسلسلة الحمض النووي - "قطع" من الحمض النووي (أزواج النوكليوتيدات) مُصنَّعة بشكل مصطنع تشبه الحمض النووي للميكروبات (العدوى) - يتم تشكيل حلزونين قصيرين يتكونان من شريطين من أقسام الحمض النووي، وهما ضروريان لتخليق المستقبل. الحمض النووي.
يتم تصنيع سلسلة جديدة من خلال استكمال كل من شريطي الحمض النووي. تتم عملية التضخيم بمساعدة منطقة معينة - بوليميريز الحمض النووي، والتي تعطي الاسم للطريقة المختبرية. يعمل البوليميراز كمحفز للتفاعل ويراقب الارتباط المتسلسل لقواعد النيوكليوتيدات مع شريط الحمض النووي الجديد المتنامي.
وبالتالي، فإن تضخيم الحمض النووي هو زيادة متعددة في عدد نسخ الحمض النووي المحددة، أي المتأصلة فقط في كائن حي معين. ليست هناك حاجة لإكمال سلسلة الحمض النووي بأكملها لرؤية العامل المعدي. هناك حاجة فقط إلى المنطقة التي تتميز بها بكتيريا معينة كفرد.
5360 فرك. تكلفة البرنامج الشامل مع طبيب الجهاز الهضمي
خصم 25% في موعد مع طبيب القلب
- 25%أساسي
زيارة الطبيب
المعالج في عطلة نهاية الأسبوع
5160 روبل روسي بدلا من 5420 فرك. فحص الرجال لالتهابات المسالك البولية
الحساسية 5120 روبل روسي بدلا من 5590 فرك.
تحدث جميع خطوات التضخيم المتكررة للغاية عند درجات حرارة مختلفة. لإجراء تحليل PCR، يتم استخدام معدات قابلة للبرمجة خصيصا - PCR - ترموستات أو مكبر للصوت، والذي يغير درجات الحرارة تلقائيا. ويتم التضخيم وفق برنامج معين يتوافق مع نوع العدوى التي يتم اكتشافها. اعتمادًا على البرنامج ونوع العدوى التي يتم اكتشافها، تستغرق عملية PCR الآلية من 2 إلى 3 ساعات.
تلعب مؤهلات طبيب المختبر الذي يقوم بالتحليل دورًا مهمًا في تشخيص تفاعل البوليميراز المتسلسل، حيث تعتمد عليه الإعدادات الصحيحة لأجهزة تفاعل البوليميراز المتسلسل وتفسير النتائج. يتمتع الأطباء في مركز يوروميدبريستيج الطبي بخبرة واسعة في إجراء تشخيص الحمض النووي، مما يضمن موثوقية نتائج البحث ويضمن النجاح الإيجابي في العلاج أمراض معدية. لإجراء الفحص بطريقة وإجراءات PCR التشخيص الكاملوعلاج الأمراض المعدية في بلادنا مركز طبي"الهيبة الأوروبية المتوسطية".
أثناء الكشف عن منتجات التضخيم، يتم فصل الخليط الناتج من منتجات التضخيم. تتم إضافة محاليل خاصة إلى الخليط، مما يمنح أجزاء الحمض النووي القدرة على التألق - وهو ما ينعكس في خطوط برتقالية حمراء مضيئة. ويشير التوهج الناتج إلى وجود الحمض النووي للفيروسات أو الميكروبات أو البكتيريا في المادة المأخوذة من المريض لتحليل PCR.
GOU VPO "أكاديمية كراسنويارسك الطبية الحكومية"
سميت باسم وكالة ياسينيتسكي الفيدرالية للصحة والتنمية الاجتماعية »
قسم الوراثة الطبية والفيزيولوجيا العصبية السريرية IPO
المبادئ الأساسية للطريقة
تفاعل البوليميراز المتسلسل
أدواتللطلاب 3-4 سنوات
في تخصصات الطب العام (060101) و
كراسنويارسك - 2007
شنايدر، N. A.، بوتيانوف، R. A. المبادئ الأساسية لطريقة تفاعل البلمرة المتسلسل. الدليل المنهجي للعمل اللامنهجي لطلاب السنوات 3-4 في تخصصات الطب العام (060101) وطب الأطفال (060103). – كراسنويارسك: دار النشر التابعة للمؤسسة التعليمية الحكومية للتعليم المهني العالي KrasSMA، 2007. – 42 ص.
يتوافق الدليل المنهجي تمامًا مع متطلبات معيار الدولة (2000) ويعكس الجوانب الرئيسية الطريقة الحديثةالتشخيص الأمراض الوراثيةالإنسان - طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل، مادة تعليمية مكيفة التقنيات التعليميةمع مراعاة خصوصيات التدريب لمدة 3-4 سنوات في كليات الطب وطب الأطفال.
المراجعون:رئيس قسم الوراثة الطبية بالمؤسسة التعليمية الحكومية للتعليم المهني العالي
"جامعة نوفوسيبيرسك الطبية الحكومية التابعة للوكالة الفيدرالية للصحة و التنمية الاجتماعية"، دكتوراه في العلوم الطبية، أستاذ؛
تكرار الحمض النووي
الهدف من دراسة هذه الطريقة هو الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين (DNA). الحمض النووي هو الناقل العالمي للمعلومات الوراثية في جميع الكائنات الحية الموجودة على الأرض (باستثناء الكائنات الحية الدقيقة التي تحتوي على الحمض النووي الريبي). الحمض النووي عبارة عن شريط مزدوج ملتوي في شكل حلزون. يتكون كل شريط من النيوكليوتيدات المتصلة بالتسلسل. خيوط الحمض النووي لها اتجاهان متعاكسان: نهاية 5 بوصات من أحد الخيوط تتوافق مع نهاية 3 بوصات من السلسلة الثانية. خاصية فريدة من نوعهاالحمض النووي هو قدرته على مضاعفة نفسه. هذه العملية تسمى تكرار. يحدث تكرار جزيء الحمض النووي خلال الفترة الاصطناعية من الطور البيني. تعمل كل سلسلة من سلسلتي الجزيء "الأم" كقالب لـ "الابنة". بعد النسخ المتماثل، يحتوي جزيء الحمض النووي المركب حديثًا على شريط "أم" واحد، والثاني عبارة عن شريط "ابنة" مركب حديثًا (طريقة شبه محافظة). ل توليف المصفوفةلكي يتشكل جزيء DNA جديد، يجب أن يتم فك الجزيء القديم وتمديده. يبدأ النسخ المتماثل في عدة أماكن في جزيء الحمض النووي. يسمى الجزء من جزيء DNA من نقطة بداية أحد التضاعفات إلى نقطة بداية تضاعف آخر نسخة طبق الأصل.
تم تنشيط بدء النسخ المتماثل الاشعال(البادئات) تتكون من 100-200 زوج من النيوكليوتيدات. يتفكك إنزيم هيليكاز الحمض النووي ويقسم حلزون الحمض النووي الأم إلى شريطين، حيث يتم تجميع خيوط الحمض النووي "الابنة"، وفقًا لمبدأ التكامل، بمشاركة إنزيم بوليميريز الحمض النووي. لكي يبدأ الإنزيم عمله، يلزم وجود كتلة البداية - جزء أولي صغير مزدوج الجديلة. يتم تشكيل كتلة البداية من خلال تفاعل التمهيدي مع المنطقة التكميلية للشريط المقابل من الحمض النووي الأصلي. في كل نسخة متماثلة، يمكن أن يتحرك بوليميراز الحمض النووي على طول الشريط "الأم" في اتجاه واحد فقط (5`=>3`).
على الخصلة الرائدة، بينما تنحل النسخة المتماثلة، تنمو الخصلة "الابنة" تدريجيًا بشكل مستمر. على الشريط المتأخر، يتم تصنيع الشريط الابن أيضًا في الاتجاه (5`=>3`)، ولكن في أجزاء منفصلة عندما يتم فك النسخة المتماثلة.
وبالتالي، فإن إضافة النيوكليوتيدات التكميلية للخيوط "الابنة" تحدث في اتجاهين متعاكسين (مضاد للتوازي). النسخ المتماثل في كافة النسخ المتماثلة يحدث في وقت واحد. يتم خياطة شظايا وأجزاء من الخيوط "الابنة" التي تم تصنيعها في نسخ مختلفة في خيط واحد بواسطة إنزيم الليجاز. يتميز النسخ المتماثل بشبه المحافظة، وعدم التوازي، والانقطاع. يتم تكرار جينوم الخلية بأكمله مرة واحدة خلال فترة زمنية تقابل دورة انقسامية واحدة. نتيجة لعملية النسخ، يتم تشكيل جزيئين من الحمض النووي من جزيء DNA واحد، حيث يكون أحدهما من جزيء الحمض النووي الأم، والثاني من الابنة، تم تصنيعه حديثًا (الشكل 1).
أرز. 1. مخطط تكرار جزيء الحمض النووي.
وهكذا تشمل دورة تكرار الحمض النووي ثلاث مراحل رئيسية:
1. تفكيك حلزون الحمض النووي وتباعد الخيوط (تمسخها)؛
2. إرفاق الاشعال.
3. استكمال سلسلة الخيط الطفل.
مبدأ طريقة PCR
إن تكرار الحمض النووي هو الذي يشكل أساس تفاعل البوليميراز المتسلسل. في PCR، يتم تنفيذ العمليات المذكورة أعلاه في أنبوب اختبار في الوضع الدوري. يتم الانتقال من مرحلة تفاعل إلى أخرى عن طريق تغيير درجة حرارة خليط الحضانة. عندما يتم تسخين المحلول إلى 93-95 درجة مئوية، يحدث تمسخ الحمض النووي. للانتقال إلى المرحلة التالية - إضافة أو "تلدين" البادئات - يتم تبريد خليط الحضانة إلى 50-65 درجة مئوية. بعد ذلك، يتم تسخين الخليط إلى 70-72 درجة مئوية - وهي الدرجة المثالية لبوليميراز الحمض النووي - في هذه المرحلة يحدث بناء شريط DNA جديد. ثم تتكرر الدورة مرة أخرى. بعبارة أخرى طريقة PCR هي زيادة متعددة في رقم النسخة (التضخيم) جزء محدد من الحمض النووي يتم تحفيزه بواسطة إنزيم بوليميراز الحمض النووي.
يجب أن يحدث نمو خيوط الحمض النووي الابنة في وقت واحد على كلا شريطي الحمض النووي للأم، لذا فإن تكرار الشريط الثاني يتطلب أيضًا بادئًا خاصًا به. وهكذا، تتم إضافة بادئين إلى خليط التفاعل: أحدهما للسلسلة "+"، والثاني للسلسلة "-". بعد أن تعلق على الخيوط المقابلة لجزيء الحمض النووي، تقتصر البادئات على الجزء الذي سيتم تكراره أو تضخيمه عدة مرات لاحقًا. ويبلغ طول هذه القطعة، التي تسمى الأمبليكون، عادة عدة مئات من النيوكليوتيدات.
مراحل تفاعل البوليميراز المتسلسل
تتضمن كل دورة تضخيم 3 مراحل، تحدث في ظروف درجات حرارة مختلفة (الشكل 2).
· المرحلة 1:تمسخ الحمض النووي . يحدث عند 93-95 درجة لمدة 30-40 ثانية.
· المرحلة 2:الصلب التمهيدي . يحدث ارتباط البادئات بشكل مكمل للتسلسلات المقابلة على خيوط الحمض النووي المتقابلة عند حدود منطقة معينة. كل زوج من البادئات له درجة حرارة التلدين الخاصة به، والتي تتراوح قيمها بين 50-65 درجة مئوية. وقت التلدين 20-60 ثانية.
· المرحلة 3:إكمال سلاسل الحمض النووي: يحدث الإكمال التكميلي لسلاسل الحمض النووي من الطرف 5 بوصة إلى الطرف 3 بوصة من السلسلة في اتجاهين متعاكسين، بدءًا من مواقع الارتباط التمهيدي. المادة المستخدمة في تصنيع سلاسل الحمض النووي الجديدة هي ثلاثي فوسفات ديوكسي ريبونوكليوسيد المضاف إلى المحلول. يتم تحفيز عملية التوليف بواسطة إنزيم بوليميراز طق ويتم عند درجة حرارة 70-72 درجة مئوية. وقت التوليف هو 20-40 ثانية.
تعمل سلاسل الحمض النووي الجديدة التي تشكلت في دورة التضخيم الأولى كقوالب لدورة التضخيم الثانية، حيث يتم تشكيل جزء محدد من DNA amplicon (الشكل 3). في دورات التضخيم اللاحقة، تعمل الأمبليكونات كقالب لتركيب سلاسل جديدة.
وبالتالي، فإن تراكم الأمبليكونات في المحلول يحدث وفقًا للصيغة 2"، حيث n هو عدد دورات التضخيم. لذلك، حتى لو كان الحل الأولي يحتوي في البداية على جزيء DNA واحد مزدوج الجديلة، ثم في 30-40 دورة حول يتراكم في المحلول 108 جزيئات من الأمبليكون، وهذه الكمية كافية للكشف البصري الموثوق به عن هذه القطعة عن طريق الفصل الكهربائي لهلام الاغاروز.
تتم عملية التضخيم في منظم حرارة خاص قابل للبرمجة ( دورة حرارية)، والذي، وفقًا لبرنامج معين، يغير درجات الحرارة تلقائيًا وفقًا لعدد دورات التضخيم.
لتنفيذ التضخيم، المكونات التالية مطلوبة:
· مصفوفة الحمض النووي(الحمض النووي أو جزء منه يحتوي على الجزء المحدد المطلوب)؛
· الاشعال(أليغنوكليوتيدات صناعية (20-30 زوجًا من النيوكليوتيدات)، مكملة لتسلسلات الحمض النووي عند حدود الجزء المحدد الذي يتم تحديده). يلعب اختيار جزء محدد واختيار الاشعال دورًا حاسمًا في خصوصية التضخيم، مما يؤثر على جودة التحليل.
· خليط من ثلاثي فوسفات ديوكسينوكليوتيد (dNTPs)(خليط من أربعة dNTPs، وهي المادة اللازمة لتخليق سلاسل DNA التكميلية الجديدة بتركيزات مكافئة تبلغ 200-500 ميكرومتر)
· إنزيمطق-بوليميراز(بوليميريز الحمض النووي القابل للحرارة الذي يحفز استطالة السلاسل التمهيدية عن طريق الإضافة المتتابعة لقواعد النيوكليوتيدات إلى السلسلة المتنامية من الحمض النووي المركب، 2-3 ملم).
· محلول منظم(وسط التفاعل الذي يحتوي على أيونات Mg2+ الضرورية للحفاظ على نشاط الإنزيم، درجة الحموضة 6.8-7.8).
لتحديد مناطق محددة من جينوم فيروسات الحمض النووي الريبوزي (RNA)، يتم الحصول أولاً على نسخة الحمض النووي (DNA) من قالب الحمض النووي الريبي (RNA) باستخدام تفاعل النسخ العكسي (RT) المحفز بواسطة إنزيم الراجع (النسخ العكسي).
أرز. 2. التضخيم (الدورة الأولى).
أرز. 3. التضخيم (الدورة الثانية).
التطبيقات الرئيسية لـ PCR
· الطب السريري:
o تشخيص الالتهابات،
o تحديد الطفرات، بما في ذلك تشخيص الأمراض الوراثية،
o التنميط الجيني، بما في ذلك التنميط الجيني HLA،
o التقنيات الخلوية
· البيئة (كوسيلة لمراقبة حالة وجودة الأشياء البيئية والمنتجات الغذائية)
· تحديد الكائنات المعدلة وراثيا (GMOs)
تحديد الهوية الشخصية، إثبات الأبوة، الطب الشرعي
· علم الأحياء العام والخاص،
المبادئ الأساسية
تنظيم المختبرات التشخيصية
يتم العمل في مختبر PCR وفقًا لـ "قواعد التصميم واحتياطات السلامة والصرف الصحي الصناعي ونظام مكافحة الأوبئة والنظافة الشخصية عند العمل في المختبرات (الإدارات والأقسام) التابعة للمؤسسات الصحية والوبائية التابعة لنظام الرعاية الصحية.
تلوث عينات الحمض النووي
يرتبط إجراء تشخيص PCR بمشكلة بسبب الحساسية العالية للطريقة - الاحتمال تلوث اشعاعى. يؤدي إدخال كميات ضئيلة من الحمض النووي الإيجابي في أنبوب التفاعل (منتجات تضخيم الحمض النووي المحددة - الأمبليكونات؛ معيار الحمض النووي المستخدم كعنصر تحكم إيجابي؛ الحمض النووي الإيجابي من عينة سريرية) إلى تضخيم جزء معين من الحمض النووي أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل، ونتيجة لذلك ، لظهور نتائج إيجابية كاذبة.
في عملية العمل قد تواجهك نوعين من التلوث:
1. التلوث المتبادلمن عينة إلى أخرى (أثناء معالجة العينات السريرية أو عند إذابة خليط التفاعل)، مما يؤدي إلى نتائج إيجابية كاذبة متفرقة؛
2. التلوث بمنتجات التضخيم(amplicons) وجود أعلى قيمةلأنه أثناء عملية PCR، تتراكم الأمبليكونات بكميات هائلة وتعتبر منتجات مثالية لإعادة التضخيم.
يؤدي تلوث الأواني الزجاجية والماصات الأوتوماتيكية ومعدات المختبرات أو سطح مقاعد المختبر أو حتى سطح جلد العاملين في المختبر بكميات ضئيلة من الأمبليكون إلى نتائج إيجابية كاذبة منهجية. قد يكون تحديد مصدر التلوث أمرًا صعبًا للغاية ويتطلب استثمارًا كبيرًا للوقت والمال. تتيح لنا الخبرة المكتسبة حتى الآن في المختبرات التي تستخدم طريقة PCR للتشخيص صياغة المتطلبات الأساسية لتنظيم هذه المختبرات وإجراء التحليلات نفسها. الامتثال لهذه المتطلبات يلغي احتمال التلوث والنتائج الإيجابية الكاذبة.
مراحل تحليل PCR
ويتم فصلهما جغرافيًا عن طريق وضعهما في غرف منفصلة (الشكل 4، 5):
· غرفة ما قبل PCR،حيث تتم معالجة العينات السريرية، وعزل الحمض النووي، وإعداد خليط التفاعل لـ PCR، وإجراء PCR (في حالة توفر الظروف، يوصى أيضًا بتنفيذ المرحلتين الأخيرتين في غرفة منفصلة إضافية). في هذه المباني، يُحظر تنفيذ جميع أنواع العمل الأخرى باستخدام عوامل الاختبار، والتي يتم إجراء تشخيصات PCR لها في هذا المختبر.
· غرفة ما بعد PCR،حيث يتم الكشف عن منتجات التضخيم. يمكن استخدام طرق كشف أخرى في هذه الغرفة. يُنصح بتحديد موقع غرفة الكشف عن منتج التضخيم بعيدًا قدر الإمكان عن غرف ما قبل PCR.
تم تجهيز غرف العمل بمصابيح فوق بنفسجية بأقصى إشعاع في المنطقة 260 نانومتر (نوع DB-60) بمعدل 2.5 وات لكل 1 م3. توجد المصابيح بحيث تتعرض أسطح طاولات العمل والمعدات والمواد التي يتصل بها المشغل أثناء تحليل PCR للإشعاع المباشر. يتم إجراء التشعيع خلال ساعة واحدة قبل بدء العمل وخلال ساعة واحدة بعد الانتهاء من العمل.
يعمل أطباء المختبرات بملابس مختبرية خاصة، يتم تغييرها عند الانتقال من غرفة إلى أخرى، وقفازات يمكن التخلص منها. تتم معالجة الملابس من غرف مختلفة بشكل منفصل. يعمل موظفون مختلفون في مراحل مختلفة من تحليل PCR.
للعمل، يتم استخدام مجموعات منفصلة من الموزعات والأواني البلاستيكية والزجاجية ومعدات المختبرات والعباءات والقفازات، المخصصة لمراحل التحليل المختلفة وغير المحمولة من غرفة إلى أخرى. يتم وضع علامة مناسبة على المعدات والمواد والإمدادات في كل غرفة.
يتم تنفيذ جميع مراحل العمل فقط باستخدام المواد الاستهلاكية التي يمكن التخلص منها: أطراف الماصات الأوتوماتيكية، وأنابيب الاختبار، والقفازات، وما إلى ذلك. تأكد من تغيير النصائح عند الانتقال من عينة إلى أخرى. من الضروري استخدام الأطراف مع مرشح - حاجز الهباء الجوي لمنع قطرات المحلول الدقيقة من دخول الماصة. يتم التخلص من الأنابيب والنصائح المستخدمة في حاويات خاصة أو حاويات تحتوي على محلول مطهر. يتم تخزين العينات السريرية بشكل منفصل عن الكواشف.
لمعالجة وتنظيف مكان العمل، تم تجهيز كل غرفة بمسحات الشاش القطني (المناديل)، والملاقط، والمحاليل المطهرة والمعطلة.
يستثني المختبر التشخيصي PCR العمل المتعلق بإنتاج (الاستنساخ) وعزل البلازميدات المؤتلفة التي تحتوي على تسلسلات DNA أو أجزاء جينية من مسببات الأمراض التي يتم تشخيصها في هذا المختبر.
جمع المواد السريرية
يمكن أن تكون المواد التي سيتم دراستها من أجل PCR عبارة عن قصاصات من الخلايا الظهارية والدم والبلازما والمصل والسوائل الجنبية والدماغية الشوكية والبول والبلغم والمخاط والإفرازات البيولوجية الأخرى والخزعات.
يتم جمع المواد في غرفة معالجة ذات ملف تعريف مناسب. بعد جمع العينات، ينبغي تسليم العينات إلى مختبر التشخيص PCR في أقرب وقت ممكن.
يجب أخذ العينات باستخدام أدوات معقمة، ويفضل أن تكون قابلة للاستخدام مرة واحدة، فقط في أنابيب بلاستيكية أو أنابيب زجاجية معقمة يمكن التخلص منها، ومعالجتها مسبقًا لمدة ساعة بخليط الكروم، وغسلها جيدًا بالماء المقطر ومكلسها في خزانة تجفيف عند درجة حرارة 150 درجة مئوية. لمدة 1 ساعة.
منطقة الكشف (طابق آخر أو مبنى آخر).
أرز. 4. جهاز مختبر PCR مع الكشف بالرحلان الكهربائي.
|
منطقة الكشف (طابق آخر أو مبنى آخر)
أرز. 5. جهاز مختبر PCR مع كشف الفلورسنت (التحليل الكمي).
أرز. 6. غرفة استخراج الحمض النووي.يظهر في الصورة صندوق منضدية به مصباح مبيد للجراثيم.
أرز. 7. غرفة التضخيم.
أرز. 8. غرفة الكشف.
أرز. 9. عينات الدم لتشخيص الحمض النووي للأمراض الوراثية.
تخزين العينات ونقلها
لتشخيص الأمراض الوراثية، يتم تخزين عينات الدم في نماذج ورقية خاصة أو في إبيندورف (أنابيب بلاستيكية) في حالة مجمدة لفترة طويلة (الشكل 9).
لتشخيص الأمراض المعدية، يتم الاحتفاظ بالعينات في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تزيد عن ساعتين. إذا كانت هناك حاجة للتخزين لفترة أطول، يمكن وضع العينات في الثلاجة عند درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن يوم واحد. يُسمح بالتخزين الأطول (حتى أسبوعين) في الثلاجة عند درجة حرارة تقل عن 20 درجة مئوية. لا يسمح بالتجميد والذوبان المتكرر للعينات.
إذا كان مختبر التشخيص PCR وغرفة الإجراءات لأخذ العينات منفصلين جغرافياً، فيجب أن يتم نقل العينات في ترمس أو حاويات حرارية مع مراعاة قواعد تخزين العينات وقواعد نقل المواد المعدية.
استخراج الحمض النووي من العينات
أصبحت طريقة الامتصاص في الطور الصلب منتشرة على نطاق واسع، والتي تتكون من إضافة عامل تحلل يحتوي على محلول الجوانيدين، وامتصاص الحمض النووي على مادة ماصة، والغسيل المتكرر، وامتصاص الحمض النووي بمحلول منظم. عند معالجة المصل أو البلازما أو الدم الكامل، عادة ما يتم استخدام طريقة استخلاص الفينول. تتضمن الطريقة إزالة البروتين باستخدام الفينول/الكلوروفورم متبوعًا بترسيب الحمض النووي (أو الحمض النووي الريبي) باستخدام الإيثانول أو الأيزوبروبانول. تتم المعالجة في أنابيب الطرد المركزي الصغيرة Eppendor P بحجم 1.5 مل. وقت المعالجة هو 1.5-2 ساعة (الشكل 10).
أرز. 10. استخراج الحمض النووي.
إجراء PCR
يتم نقل كمية معينة من العينة من العينة السريرية المعالجة إلى أنبوب طرد مركزي صغير خاص من نوع إيبندورف بحجم 0.2 أو 0.5 مل، ويتم إضافة خليط تضخيم يتكون من الماء ومحلول PCR المؤقت ومحلول dNTP ومحلول التمهيدي والمحلول إلى نفس الأنبوبة طق بوليميريز (يضاف إلى الخليط أخيرا) وعادة يكون حجم خليط التفاعل 25 ميكرولتر ثم تضاف قطرة واحدة من الزيت المعدني إلى كل أنبوب لمنع تبخر خليط التفاعل أثناء عملية التضخيم. يتم نقل الأنابيب إلى منظم حرارة قابل للبرمجة (مضخم)، حيث يتم التضخيم تلقائيًا وفقًا لبرنامج معين (الشكل 11).
أرز. أحد عشر. المضخم " دراجة حرارية ».
وقت رد الفعل، اعتمادا على البرنامج المحدد، هو 2-3 ساعات. بالتوازي مع العينات التجريبية، يتم وضع عينات المراقبة: تشمل المراقبة الإيجابية جميع مكونات التفاعل، ولكن بدلاً من مادة العينة السريرية، تتم إضافة تحضير الحمض النووي للجين قيد الدراسة. تشمل المراقبة السلبية جميع مكونات التفاعل، ولكن بدلاً من المادة السريرية أو تحضير الحمض النووي، تتم إضافة كمية مناسبة من الماء منزوع الأيونات أو مستخلص لا يحتوي على الحمض النووي الذي يتم اختباره. السيطرة السلبية ضرورية للتحقق من مكونات التفاعل لعدم وجود الحمض النووي بسبب التلوث واستبعاد النتائج الإيجابية الكاذبة.
تسجيل النتائج
يتم الكشف عن جزء الحمض النووي المحدد المضخم عن طريق الفصل الكهربائي لهلام الاغاروز في وجود بروميد الإيثيديوم. يشكل بروميد الإيثيديوم مركبًا خلاليًا مستقرًا مع شظايا الحمض النووي، والذي يظهر على شكل أشرطة مضيئة عند تشعيع الجل بالأشعة فوق البنفسجية بطول موجة 290-330 نانومتر. اعتمادًا على حجم الأمبليكونات المتكونة نتيجة تفاعل البوليميراز المتسلسل، يتم استخدام هلام يحتوي على نسبة أغاروز تتراوح من 1.5% إلى 2.5%. لتحضير هلام الاغاروز، يتم إذابة خليط من الاغاروز والمحلول المنظم والماء في فرن ميكروويف أو في حمام مائي، ويضاف محلول بروميد الإيثيديوم. يُسكب الخليط، المبرد إلى 50-60 درجة مئوية، في القالب بطبقة بسمك 4-6 مم، وباستخدام أمشاط خاصة، يتم عمل جيوب في الجل لوضع العينة. يتم تثبيت الأمشاط بحيث تبقى طبقة من الاغاروز بسمك 0.5-1 مم بين قاع الآبار وقاعدة الجل. بعد أن يتصلب الجل، يتم تطبيق مكبر للصوت على الجيوب بمبلغ 5-15 ميكرولتر. من المستحسن إجراء الرحلان الكهربائي لخليط من علامات طول جزء الحمض النووي بالتوازي مع العينات الضابطة والتجريبية. عادة، يحتوي هذا الخليط على عشرة أجزاء من الحمض النووي بطول 100، 200، 300، إلخ. أزواج أساسية.
إن استخدام مثل هذا الاختبار يجعل من الممكن التحقق من طول الأمبليكونات في العينات الضابطة والتجريبية. يتم نقل الجل مع العينة المطبقة إلى غرفة الرحلان الكهربائي المملوءة بالمخزن المؤقت، ويتم توصيل الغرفة بمصدر طاقة ويتم إجراء الفصل الكهربي لمنتجات التضخيم لمدة 30-45 دقيقة عند شدة مجال كهربائي تبلغ 10-15 فولت/ سم. في هذه الحالة، يجب أن تتحرك مقدمة الصبغة الموجودة في خليط التفاعل مسافة 3 سم على الأقل.
بعد اكتمال الفصل الكهربائي، يتم نقل الجل إلى جهاز نقل زجاجي ومشاهدته تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. للتوثيق، يتم تصوير الجل على فيلم Micrat 300 أو تسجيله باستخدام نظام فيديو متصل بالكمبيوتر.
أولا وقبل كل شيء، يتم تقييم عينات المراقبة. يجب أن يكون هناك شريط متوهج برتقالي في المسار الكهربي المتوافق مع التحكم الإيجابي. يجب أن تتوافق حركتها الكهربية مع طول الأمبليكون المحدد في التعليمات.
في المسار الكهربي المطابق للتحكم السلبي، يجب أن يكون هذا النطاق غائبًا. يشير وجود مثل هذا النطاق في التحكم السلبي إلى التلوث - تلوث الكواشف المستخدمة في اختبار الحمض النووي أو الأمبليكون. يتم تقييم عينات الاختبار من خلال وجود نطاق في المسار المقابل، والذي يقع على نفس مستوى النطاق في عينة التحكم الإيجابية. تتوافق كثافة الفرقة مع كمية الحمض النووي التي يتم اختبارها في العينة، مما يسمح بإجراء تقييم شبه كمي لـ PCR. عادة، يتم تقييم النتائج الإيجابية على مقياس من أربع نقاط. إذا كان توهج النطاق في عينة الاختبار ضعيفًا جدًا، فيجب إعادة ترتيب هذه العينة (الشكل 12).
أرز. 12. الاغاروز الكهربائي للهلام.
تطبيقات PCR لتشخيص الطفرات النقطية وتعدد أشكال الجينات
أحد المجالات الرائدة لتطبيق تفاعل البوليميراز المتسلسل في الرعاية الصحية العملية هو تشخيص الطفرات النقطية وتعدد أشكال الجينات . هناك طرق مباشرة وغير مباشرة لتشخيص الحمض النووي. في الحالات التي يكون فيها الجين معروفًا، يؤدي تلفه إلى تطور مرض وراثي، ويمكن اكتشاف هذا الضرر بالطرق الوراثية الجزيئية. تسمى هذه الأساليب مباشرة. باستخدام الطرق المباشرة، يتم الكشف عن المخالفات في تسلسل النوكليوتيدات الأولية للحمض النووي (الطفرات وأنواعها). وتتميز الطرق المباشرة بالدقة التي تصل إلى 100% تقريبًا.
ومع ذلك، في الممارسة العملية، يمكن استخدام هذه الأساليب في ظل ظروف معينة:
· مع التوطين الخلوي المعروف للجين المسؤول عن تطور مرض وراثي.
· يجب استنساخ جين المرض ومعرفة تسلسله النوكليوتيدي.
الغرض من تشخيص الحمض النووي المباشر هو تحديد الأليلات الطافرة.
وبالتالي، في الحالات التي يكون فيها نوع تلف الحمض النووي معروفًا والذي يؤدي إلى مرض وراثي، يتم فحص جزء الحمض النووي الذي يحتوي على الضرر مباشرةً، أي يتم استخدام طريقة تشخيص الحمض النووي المباشر.
ومع ذلك، حتى الآن، لم يتم رسم خريطة لجينات العديد من الأمراض، كما أن تنظيم الإكسون والإنترون الخاص بها غير معروف، والعديد منها الأمراض الوراثيةتتميز بعدم التجانس الوراثي الواضح، والذي لا يسمح بالاستخدام الكامل لطرق تشخيص الحمض النووي المباشر. لذلك، في الحالات التي يكون فيها موضع الضرر غير معروف، يتم استخدام نهج آخر، يتعلق بدراسة محيط الجين المسؤول عن المرض الجيني، بالاشتراك مع التحليل العائلي، أي الطرق غير المباشرة للتشخيص الوراثي الجزيئي للمرض. تستخدم الأمراض الوراثية.
يمكن استخدامه للكشف عن الطفرات النقطية وعمليات الحذف الصغيرة طرق مختلفةومع ذلك، فهي جميعها تعتمد على استخدام طريقة PCR. يتيح لك هذا التفاعل مضاعفة تسلسل نيوكليوتيدات الحمض النووي عدة مرات ثم البحث عن الطفرات. تعتمد طرق البحث عن أجزاء الحمض النووي التي تحمل طفرات على تحليل مقارنتسلسلات نيوكليوتيدات الحمض النووي المتحولة والعادية.
تحليل منتجات PCR
في عملية تشخيص الحمض النووي المباشر
يتضمن دراسة السمات المحددة لمنطقة الجينات المتضخمة. وهكذا، في الأمراض الناجمة عن توسع تكرارات ثلاثي النوكليوتيد، تختلف منتجات التضخيم في طولها (مما يعكس العدد المختلف للثلاثية التوائم في منطقة الجينات المدروسة)، ونتيجة لذلك، في سرعة حركتها في الجل. بفضل هذا، يتم تحقيق فصل كهربي واضح للأليلات الطبيعية والمتحولة وتحديد دقيق للجزء الممدود من الناحية المرضية، أي تشخيص الحمض النووي للمرض (الشكل 13).
https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width = "417" height = "110 src = ">
أرز. 14. تشخيص الحذف أسكت في الجين DYT 1 في المرضى الذين يعانون من خلل التوتر العضلي المستقل عن دوبا (الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد). الممرات 2،3،6 – مريضة؛ المسارات 1،4،5 - التحكم. يشير السهم الرفيع إلى الأليل الطبيعي، ويشير السهم السميك إلى الأليل الأقصر المتحول (حذف ثلاث نيوكليوتيدات).
إذا كانت منطقة الحمض النووي بأكملها قيد الدراسة جزءًا من عملية حذف ممتدة، فلن يتم إجراء تضخيم الحمض النووي PCR من هذا الأليل المحذوف بسبب عدم وجود مواقع للتهجين التمهيدي. في هذه الحالة، سيتم تشخيص الحذف المتماثل على أساس الغياب الكامل لمنتج تفاعل PCR (تخليق الحمض النووي مستحيل من كلا نسختي الجين). من خلال الحذف المتغاير، من الممكن اكتشاف منتج PCR تم تصنيعه من أليل طبيعي (محتجز)؛ ومع ذلك، لتشخيص مثل هذه الطفرة بشكل موثوق، من الضروري استخدام طرق تصوير الحمض النووي الأكثر تعقيدًا التي تسمح بتقدير جرعة تفاعل البوليميراز المتسلسل النهائي منتج.
لتحديد الطفرات النقطية (في أغلب الأحيان بدائل النوكليوتيدات) في مواقع معينة، يتم استخدام طريقة PCR مع طرق أخرى للتحليل الوراثي الجزيئي. إذا كان موقع وطبيعة طفرة النقطة المفترضة معروفين بدقة، فإن تقييد النواة النووية (أنزيمات التقييد) هي إنزيمات خلوية خاصة معزولة من سلالات مختلفة من البكتيريا.
تتعرف هذه الإنزيمات على تسلسلات نيوكليوتيدات محددة يتراوح طولها من أربعة إلى عشرة نيوكليوتيدات. بعد ذلك، يتم تنفيذ تقييد (خط العرض (القطع)) لهذه التسلسلات كجزء من جزيء الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل. يتعرف كل إنزيم تقييد على تسلسل نيوكليوتيدات محدد ومحدد بدقة ويقطعه في مكان ثابت - موقع التقييد (موقع الاعتراف).
في الحالات التي تؤدي فيها طفرة نقطية إلى تغيير موقع التعرف الطبيعي لإنزيم تقييد معين، لن يتمكن هذا الإنزيم من قطع الجزء الطافر المضخم بواسطة PCR. في بعض الحالات، تؤدي الطفرة إلى ظهور موقع جديد للتعرف على إنزيم تقييد معين يكون غائبًا بشكل طبيعي.
في كلتا الحالتين، ستنتج منتجات PCR المتحولة والعادية المعالجة باستخدام إنزيم التقييد المحدد شظايا تقييد ذات أطوال مختلفة، والتي يمكن اكتشافها بسهولة عن طريق الرحلان الكهربائي (الشكل 15).
وبالتالي، إذا كان من الضروري اكتشاف أي طفرة نقطية محددة بسرعة، فسيتم تقليل المهمة إلى البحث عن إنزيم التقييد المقابل، والذي يتم تحديد موقع التعرف عليه في موقع تسلسل النيوكليوتيدات المعطل. إن معالجة منتجات PCR باستخدام إنزيم التقييد هذا سيجعل من الممكن التمييز بسهولة بين الأليلات الطبيعية والمتحولة. يبسط تحليل التقييد إلى حد كبير اكتشاف الطفرات النقطية المعروفة ويستخدم الآن على نطاق واسع لتشخيص الحمض النووي المباشر للأمراض الوراثية.
المرحلة النهائية التحليل الوراثي الجزيئي للطفراتهو تحديد تسلسل النيوكليوتيدات لجزء الحمض النووي قيد الدراسة (التسلسل)، والذي يتم مقارنته بالمعيار ويتم صياغة التشخيص الجيني النهائي. بفضل النجاحات التي حققها علم الوراثة الجزيئي، تم الآن تطوير طرق تشخيص الحمض النووي لأكثر من 400 مرض وراثي.
أرز. 15. الكشف عن طفرة النقطة باستخدام تحليل التقييد:أ - منطقة الجينات المتضخمة التي تحتوي على موقع تقييدAGCTلتقييد نوكليازألو أنا. طفرهز→ أيغير تسلسل النيوكليوتيدات هذا، مما يؤدي إلى إنزيم التقييدألويمحظور؛ ب – الرسم الكهربي لمنتجات التقييد: المسار 1 – التماثل الجيني للأليل الطبيعي؛ المسار 2 - تماثل الزيجوت للطفرة؛ المسار 3 - حالة متغايرة الزيجوت (أليل طبيعي + طفرة).
إن تشخيص الأمراض الوراثية، بناءً على الفحص المباشر للأليلات الطافرة لدى المرضى أو أفراد أسرهم أو الحاملين المتغايرين للطفرات المرضية، مناسب للتشخيص قبل ظهور الأعراض وقبل الولادة، والذي يمكن تطبيقه في المراحل الأولى من نمو الجنين، قبل أن يتم تشخيصه. ظهور أي أعراض سريرية أو بيوكيميائية للأمراض.
بغض النظر عن طريقة اكتشاف الطفرة، لا يمكن الحصول على الخصائص الجزيئية الدقيقة لكل طفرة إلا عن طريق التسلسل المباشر. لأتمتة هذه العملية، تم استخدام أجهزة خاصة على نطاق واسع في السنوات الأخيرة - أجهزة التسلسل، والتي تجعل من الممكن تسريع عملية قراءة معلومات الحمض النووي بشكل كبير.
يتم فتح الطريق إلى الاستخدام الأوسع للبحوث البيولوجية الجزيئية في مختبرات التشخيص السريري من خلال تسريع العملية التحليلية من خلال تنفيذ جميع الإجراءات في سلسلة واحدة متواصلة، دون نقل العينات، وتهيئة الظروف لمنع التلوث أثناء الاختبار المتوازي لعدد من التحاليل وتسجيل موضوعي النتائج في كل دورة.
التعديلات الرئيسية لطريقة PCR
يستخدم للمسح السريع والبحث عن الطفرات الجينية المعروفة.
متعدد (متعدد التمهيدي) PCR
تعتمد هذه الطريقة على التضخيم المتزامن لعدة إكسونات من الجين قيد الدراسة في تفاعل واحد. وهذا يسمح بإجراء فحص سريع وفعال من حيث التكلفة للطفرات الأكثر شيوعًا. على سبيل المثال، من أجل التشخيص السريع لحمل عمليات الحذف في جين الدستروفين لدى المرضى الذين يعانون من الحثل العضلي الدوشيني/بيكر التقدمي، يتم إجراء تضخيم متزامن لمجموعة من الإكسونات الأكثر تحورًا لهذا الجين. نظرًا لأن هذه الأمراض موروثة بطريقة متنحية مرتبطة بـ X وترتبط بتلف كروموسوم X الوحيد عند الأولاد، في حالة الحذف الممتد، سيكشف الترحيل الكهربائي لنواتج التفاعل عن عدم وجود جزء أو أكثر من أجزاء الحمض النووي (إكسونات) )، والتي يمكن أن تكون بمثابة تأكيد جزيئي للتشخيص. وبالإضافة إلى ذلك، من خلال اختيار أقسام الجينات المحددة لتضخيم PCR، من الممكن إجراء تقييم دقيق إلى حد ما للطول الإجمالي للحذف ونقاط توقف الجينات (وصولاً إلى إكسون).
إن الاستخدام المشترك للعديد من التفاعلات المتعددة يجعل من الممكن تشخيص ما يصل إلى 98٪ من جميع عمليات الحذف التي تحدث في المرضى الذين يعانون من الحثل العضلي الدوشيني / بيكر التدريجي. يمثل هذا ما يقرب من 60٪ من إجمالي عدد الطفرات المعروفة في جين الديستروفين ويشير إلى الكفاءة العالية جدًا لطريقة الفحص هذه لتشخيص الحمض النووي لاعتلالات الديستروفين (الشكل 16).
أرز. 16. التشخيص المباشر للحمض النووي لضمور العضلات الدوشيني باستخدام PCR المتعدد (الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز). في كل فرد من الأفراد الذين تم فحصهم، تم تضخيم أربعة إكسونات من جين الديستروفين في وقت واحد (إكسونات 17 و19 و44 و45؛ تشير الأسهم إلى منتجات التضخيم المقابلة). المسار 1 - التحكم، الممرات 2-5 - مرضى الحثل العضلي الدوشيني مع عمليات حذف مختلفة لجين الدستروفين (المساران 2 و 5 - حذف إكسون 45، المسار 3 - حذف إكسون 44، المسار 4 - حذف إكسون 17 و 19 ).
تضخيم أليل محدد
تعتمد الطريقة على استخدام زوجين مستقلين من البادئات لمنطقة جينية محددة: يكون البادئ واحد شائعًا في كلا الزوجين، والبادئ الثاني في كل زوج له بنية مختلفة ومكمل إما لتسلسل الحمض النووي الطبيعي أو المتحور. ونتيجة لهذا التفاعل، يمكن تصنيع نوعين من منتجات PCR في وقت واحد في المحلول - العادي والمتحول. علاوة على ذلك، فإن تصميم البادئات المستخدمة يجعل من الممكن التمييز بوضوح بين منتجات التضخيم الطبيعية والمتحولة حسب حجمها الجزيئي. هذه الطريقة مرئية للغاية وتسمح لك بالتحقق من النقل المتماثل والمتغاير للأليل المتحول.
طريقة التعديل الموجه للموقع للحمض النووي المضخم
تعتمد الطريقة على استخدام ما يسمى ببادئ عدم التطابق في تفاعل البوليميراز المتسلسل (ليس مكملاً تمامًا للقالب)، والذي يختلف عن تسلسل الحمض النووي للقالب بنيوكليوتيد واحد. نتيجة لإدراج التمهيدي المحدد في منتج PCR المتحول، يتم تشكيل موقع تقييد تم إنشاؤه بشكل مصطنع لأحد نوكليازات التقييد الداخلية، مما يسمح بتشخيص الحمض النووي المباشر لطفرة معينة معروفة باستخدام تحليل التقييد. ويعد إنشاء موقع التقييد الاصطناعي هذا ضروريا إذا لم يكشف البحث عن وجود إنزيم معروف ومتوفر، والذي يتأثر موقع التقييد "الطبيعي" الخاص به نتيجة ظهور الطفرة التي تتم دراستها في جزيء DNA .
طريقة النسخ العكسي PCR (ر.ت- تفاعل البوليميراز المتسلسل)
يتم استخدام هذه الطريقة في الحالات التي يكون فيها أكثر ملاءمة لاستخدام الحمض النووي الجينومي ليس كموضوع للدراسة، ولكن [كدنا] أكثر إحكاما وغنية بالمعلومات يتم الحصول عليها بعد المعالجة المناسبة لعينات الأنسجة، على سبيل المثال، مادة الخزعة أو خطوط الخلايا من الخلايا الليمفاوية، الخلايا الليفية، وما إلى ذلك. الشرط المهم هنا هو التعبير (على الأقل في الحد الأدنى) عن الجين المطلوب في الأنسجة قيد الدراسة.
في المرحلة الأولى، يتم إجراء النسخ العكسي للmRNA، وتكون جزيئات cDNA الناتجة بمثابة قالب لـ PCR. بعد ذلك، تخضع المنطقة الحرجة من [كدنا]، التي يتم تضخيمها بكمية كافية، للتسلسل وطرق أخرى لفحص الطفرات، أو الدراسة الكهربية المباشرة (الكشف عن عمليات الحذف، والإدراج، وما إلى ذلك) أو التكامل في نظام التعبير من أجل الحصول على منتج بروتيني. وتحليلها المباشر.
تعتبر هذه الطريقة فعالة بشكل خاص في اكتشاف الطفرات التي تؤدي إلى تخليق البروتين "المقطوع" (الطفرات الهراء، طفرات الربط، عمليات الحذف الكبيرة) - ما يسمى بتحليل PTT (اختبار اقتطاع البروتين). يُستخدم تحليل PTT بشكل شائع في دراسة الجينات الطويلة متعددة الإكسونات، مثل الحثل العضلي الدوشيني/بيكر، أو ترنح توسع الشعيرات، أو الورم الليفي العصبي من النوع 1.
في الوقت الحقيقي PCR(في الوقت الحقيقي PCR، الإنجليزية)
في كل عام، أصبح تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في الوقت الحقيقي وسيلة تشخيصية شائعة بشكل متزايد في مجال الرعاية الصحية العملية. وتتمثل ميزتها الأساسية في المراقبة والتحليل الكمي لتراكم منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل والتسجيل التلقائي وتفسير النتائج التي تم الحصول عليها. لا تتطلب هذه الطريقة مرحلة الرحلان الكهربائي، مما يقلل من متطلبات مختبر PCR. بفضل توفير مساحة الإنتاج، وتقليل عدد الموظفين والطلب على التحديد الكمي للحمض النووي/الحمض النووي الريبي (DNA)، تم استخدام هذه الطريقة بنجاح في السنوات الأخيرة في أكبر مراكز الصحة الوبائية والتشخيصية والبحثية في البلدان المتقدمة في العالم، لتحل محل PCR في شكله الحالي ("الكلاسيكي").
يستخدم PCR في الوقت الحقيقي تحقيقات قليل النوكليوتيد المسمى بالفلورسنت للكشف عن الحمض النووي أثناء تضخيمه. يسمح تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي بإجراء تحليل كامل للعينة خلال 20 إلى 60 دقيقة، وهو قادر نظريًا على اكتشاف حتى جزيء DNA أو RNA واحد في العينة.
أرز. 17. في الوقت الحقيقي PCR.
يستخدم PCR في الوقت الحقيقي نظام TaqMan الذي يتحكم في حركية PCR مباشرة أثناء التضخيم باستخدام إخماد مضان الرنين. للكشف، يتم استخدام مسبار يحمل فلوروفور ومخمد مكمل للجزء الأوسط من الجزء المضخم. عندما يرتبط الفلوروفور والمخمد بمسبار قليل النوكليوتيد، يتم ملاحظة انبعاث فلورسنت بسيط فقط. أثناء عملية التضخيم، بسبب نشاط نوكلياز خارجي 5 بوصات من بوليميراز طق، تدخل علامة الفلورسنت في المحلول، وتحرر من قربها من المخمد، وتولد إشارة فلورية تزداد في الوقت الفعلي بما يتناسب مع تراكم مكبر الصوت ( الشكل 17).
المزايا الرئيسية لـ PCR في الوقت الحقيقي مقارنة بـ PCR مع الفصل الكهربائي للهلام:
· تتم الطريقة بأكملها في أنبوب اختبار واحد؛
· تستغرق الطريقة ساعة واحدة.
· 1-2 غرف عمل كافية.
· إلى جانب التقييم النوعي للنتيجة، هناك إمكانية إجراء تقييم كمي (على سبيل المثال، عند وصف العلاج المضاد للفيروسات لمرض الإيدز أو التهاب الكبد الفيروسي، من الضروري معرفة الحمل الفيروسي، أي كمية الفيروس لكل وحدة، والتي يتم توفيرها بواسطة PCR في الوقت الحقيقي)؛
· يتم تقليل خطر التلوث بشكل حاد.
خاتمة
تعد طريقة PCR إحدى الطرق الأكثر شيوعًا للبحث البيولوجي الجزيئي. يجب أن يستخدم الأطباء هذه الطريقة بذكاء، ويجب أن يكون لدى الطبيب الذي يقرر استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في عمله معرفة معينة حول ميزات وإمكانيات هذه الطريقة. ثانياً، يجب أن يكون هناك تفاعل وثيق بين الطبيب ومختبر PCR، وهو أمر ضروري لتحليل الحالات المعقدة ووضع استراتيجية التشخيص الصحيحة. ثالثا، تحليل PCR ليس حلا سحريا في التشخيص (الأمراض المعدية في المقام الأول) ولا يحل محل طرق البحث الحالية، ولكنه يكملها فقط. والأهم من ذلك، لا يمكن لتفاعل البوليميراز المتسلسل أن يحل محل الحدس والتفكير التحليلي الذي يجب أن يتمتع به الطبيب الذي يتوقع النجاح.
ص . س . البحوث البيولوجية الجزيئية - تغيير المبادئ التوجيهية للتشخيص والعلاج. يرتبط استخدام الأساليب البيولوجية الجزيئية باحتمال حدوث تغيير جذري في التركيز على التشخيص المختبري. قد لا يتعلق الأمر فقط بالحصول على المعلومات في الوقت المناسب، بل يتعلق بتلقيها مسبقًا. إذا تم إجراء الاختبارات المعملية الآن في معظم الحالات بالفعل بعد تطور المرض وبدء العلاج، فمن المتوقع أن تتيح المعلومات المخبرية البيولوجية الجزيئية إمكانية تحديد ميل الشخص إلى أنواع معينة من الأمراض ودرجة الحساسية لبعض الأدوية ، والتي سوف تبرر طبيعة الطب المستقبلي التنبؤية والوقائية والشخصية.
تغيير التوجهات التشخيصية والعلاجية
الأمراض الوراثية
اليوم في المستقبل
تشخيص جواز السفر الوراثي
8. ما هو عدد غرف العمل اللازمة لتشغيل مختبر تفاعل البوليميراز المتسلسل مع الكشف الفلوريسنت (التحليل الكمي، تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي)؟
9. ما هو الكشف؟
10. ما هي طرق تشخيص الحمض النووي الموجودة؟
11. عمل أي إنزيم يقوم عليه PCR؟
12. لماذا يجب إزالة منطقة الكشف من مناطق العمل الأخرى؟
13. ما هو موقع التقييد؟
14. ما هي الاختلافات بين طرق تشخيص الحمض النووي المباشر وغير المباشر؟
15. ما هو التسلسل؟
16. ما هو PCR المتعدد؟
17. ما هي أنواع الطفرات التي يتم تحديدها باستخدام PCR؟
18. ما هو التلوث؟
19. ما هو جوهر طريقة التضخيم الخاصة بالأليل؟
20. شروط تخزين مادة PCR؟
21. في أي جهاز يتم التضخيم؟
22. ما هي طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR)؟
23. ما هي المواد المستخدمة في تشخيص PCR؟
24. اذكر أنواع التلوث؟
اختبارات الإعداد الذاتي
1. إنزيمات تقييد نوكلياز:
أ) الإنزيمات التي "تكسر" الحمض النووي في أماكن محددة بدقة؛
ب) الإنزيمات التي تترابط مع بعضها البعض تتكسر في جزيء الحمض النووي؛
ج) الإنزيمات التي توفر المركبات التي تقوم بإصلاح الحمض النووي.
2. تضخيم الجينات:
3. ما هي طريقة علم الوراثة الجزيئية المستخدمة لتشخيص الأمراض التي تسببها جينة متحورة ذات تسلسل معروف؟
أ) استخدام إنزيم تقييد محدد؛
ب) الكشف المباشر باستخدام مجسات جزيئية محددة؛
الخامس) تحليل الأسرةتوزيعات الأشكال المتعددة لطول جزء التقييد الطبيعي.
4. تسلسل الحمض النووي:
أ) تحديد تسلسل قاعدة الحمض النووي؛
ب) التكرار المتعدد لأي قسم من الحمض النووي؛
ج) عزل جزء من الحمض النووي يحتوي على الجين قيد الدراسة.
5. للحصول على عينات الحمض النووي يمكنك استخدامها :
ب) الزغابات المشيمية.
ج) السائل الأمنيوسي.
د) خلايا السائل الأمنيوسي.
ه) عينات خزعة من الجلد والعضلات والكبد،
هـ) كل شيء صحيح باستثناء النقطة "ج"،
ز) كل شيء صحيح باستثناء النقطة "د"،
ح) كل ما سبق صحيح.
6. لتشخيص الطفرات التي يتم استخدام طريقة PCR:
أ) الجينومية؛
ب) الكروموسومات.
ج) الجين (نقطة).
7. التمهيدي هو:
أ) القسم التكميلي من الحمض النووي؛
ب) تسلسل قليل النوكليوتيد الاصطناعي المسمى (بنشاط إشعاعي أو فلورسنتي) مكمل لجين متحول أو طبيعي؛
ج) قليل النوكليوتيد الذي يعمل بمثابة "تمهيد" ويبدأ في تصنيع سلسلة متعدد النوكليوتيد على مصفوفة DNA أو RNA.
8. من الذي طور مبدأ طريقة PCR؟
ب) ك. موليس
9. هل يتم استخدام طريقة PCR لتشخيص توسع تكرارات ثلاثي النوكليوتيد (نوع ديناميكي من الطفرات)؟
10. في أي المجالات يتم استخدام PCR؟
أ) الطب السريري؛
ب) تحديد الكائنات المعدلة وراثيا (GMOs)
ج) تحديد الهوية الشخصية، وإثبات الأبوة، والطب الشرعي
د. كل ما ورداعلاه،
ه) لا شيء مما سبق..
الإجابات النموذجية: 1 - أ؛ 2 - ب؛ 3 - ب؛ 4 ا؛ 5 - ه؛ 6 - في؛ 7 - في؛ 8 - ب؛ 9 – أ، 10 – ز.
رئيسي
1. وراثة بوشكوف. موسكو. جوتار، 2002.
إضافي
1. بالخاريف وعلاج الأمراض الخلقية والوراثية عند الأطفال. – موسكو، 2004.
2. تشخيص الحمض النووي والاستشارات الوراثية الطبية. – موسكو، 2004.
3. جينتر الوراثة. – موسكو، 2003.
4. أساسيات جوربونوف في علم الوراثة الطبية. – سانت بطرسبرغ: إنترميديكا، 1999.
5. جي ماكجي. جزيئي التشخيص السريري. - العالم، 1999.
6. مينشيكوف - البحث البيولوجي في التشخيص المختبري السريري: إمكانيات المشكلة (محاضرات). التشخيص المختبري السريري، رقم 3، 2006.
7. عمل كورنينكو في مختبر PCR أثناء التحليل المباشر للمواد البيولوجية. التشخيص المختبري السريري، رقم 10، 2006.
8. تنظيم العمل المعملي PCR. تعليمات منهجية. مو 1.3.1794-03. كبير أطباء الصحة في الاتحاد الروسي، 2003.
9. تقنية Erlich H. A. PCR. – بيرسين إلمر سيتوس، 1993.
10. هيد C. A.، ستيفنز J. في الوقت الحقيقي PCR الكمي. دقة الجينوم. - العدد 6، 1996.
المبادئ الأساسية للطريقة
تفاعل البوليميراز المتسلسل
الدليل المنهجي للعمل اللامنهجي لطلاب السنوات 3-4 في تخصصات الطب العام (060101) وطب الأطفال (060103).
المؤسسة التعليمية الحكومية للتعليم المهني العالي "أكاديمية كراسنويارسك الطبية الحكومية التابعة للوكالة الفيدرالية للصحة والتنمية الاجتماعية"
روسيا، كراسنويارسك،
الوكالة الفيدرالية للتعليم
ولاية مؤسسة تعليمية
أعلى التعليم المهني
"أكاديمية ولاية كاريليان التربوية"
الدورات الدراسية حول الموضوع:
تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتطبيقاته
أكملتها: الطالبة كورياجينا فاليريا ألكساندروفنا
فحص بواسطة: كاربيكوفا ناتاليا ميخائيلوفنا
بتروزافودسك 2013
مقدمة
الفصل 1. مراجعة الأدبيات
1.5.4 تأثير الهضبة
1.5.6 التضخيم
خاتمة
مقدمة
تميزت السنوات العشرين الماضية بالإدخال الواسع النطاق للطرق الوراثية الجزيئية في العلوم البيولوجية والطبية والزراعية.
وبحلول أوائل السبعينيات، بدا أن البيولوجيا الجزيئية قد وصلت إلى درجة معينة من النضج. خلال هذه الفترة، كان الهدف الرئيسي للبحث الوراثي الجزيئي هو الكائنات الحية الدقيقة. قدم الانتقال إلى حقيقيات النوى للباحثين مشاكل جديدة تمامًا لا يمكن حلها باستخدام طرق التحليل الجيني الموجودة في ذلك الوقت. أصبح تحقيق اختراق في تطوير علم الوراثة الجزيئي ممكنا بفضل ظهور أداة تجريبية جديدة - تقييد النواة النووية. وفي السنوات اللاحقة، بدأ عدد طرق التحليل المباشر للحمض النووي، استنادًا إلى أساليب مختلفة نوعيًا، في الزيادة بسرعة.
أتاحت التقنيات الحديثة في كثير من الحالات البدء في دراسة التنظيم الهيكلي والوظيفي الدقيق للجينومات النووية وغير النووية للكائنات الحية المختلفة على مستوى أعمق. وكان لهذا أهمية خاصة لتطوير طرق التشخيص والعلاج الجديدة امراض عديدة. ولم يكن أقل أهمية هو إمكانية استخدام إنجازات علم الوراثة الجزيئية في بيولوجيا السكان وتربيتهم لتحديد وتحليل التباين الوراثي للمجموعات والأصناف والسلالات، وتحديد واعتماد الأفراد ذوي القيمة الاقتصادية، وإنشاء كائنات معدلة وراثيا وحل القضايا الأخرى.
كل أسلوب له مزاياه وعيوبه. لا توجد طريقة عالمية يمكنها حل جميع المشاكل التي تنشأ. ولذلك فإن اختيار طريقة معينة للبحث الذي يتم إجراؤه يعد من أهم مراحل أي عمل علمي.
الفصل 1. مراجعة الأدبيات
1.1 تاريخ اكتشاف تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)
في عام 1983 ك. نشر موليس وآخرون وحصلوا على براءة اختراع طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، والتي كان من المقرر أن يكون لها تأثير عميق على جميع مجالات البحث وتطبيق الأحماض النووية. قيمة هذه الطريقة ل البيولوجيا الجزيئيةوتبين أن علم الوراثة كان عظيماً وواضحاً لدرجة أنه بعد سبع سنوات تم منح المؤلف جائزة جائزة نوبلفي الكيمياء.
في بداية استخدام الطريقة، بعد كل دورة تسخين وتبريد، كان من الضروري إضافة بوليميراز الحمض النووي إلى خليط التفاعل، حيث تم تعطيله عند درجة الحرارة العالية اللازمة لفصل خيوط حلزون الحمض النووي. كان إجراء التفاعل غير فعال نسبيًا ويتطلب الكثير من الوقت والإنزيم. وفي عام 1986، تم تحسين طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل بشكل ملحوظ. لقد تم اقتراح استخدام بوليميرات الحمض النووي من البكتيريا المحبة للحرارة. وتبين أن هذه الإنزيمات قابلة للحرارة وكانت قادرة على تحمل العديد من دورات التفاعل. وقد أتاح استخدامها إمكانية تبسيط وأتمتة تفاعل البوليميراز المتسلسل. تم عزل واحدة من أولى بوليميرات الحمض النووي القابلة للحرارة من البكتيريا ثيرموس المائيواسمه طق-بوليميراز.
إن القدرة على تضخيم أي قطعة من الحمض النووي يعرف تسلسلها النيوكليوتيدي، والحصول عليها في شكل متجانس وكمية تحضيرية عند الانتهاء من تفاعل البوليميراز المتسلسل، تجعل من تفاعل البوليميراز المتسلسل طريقة بديلة للاستنساخ الجزيئي لأجزاء الحمض النووي القصيرة. في هذه الحالة، ليست هناك حاجة لاستخدام التقنيات المنهجية المعقدة المستخدمة في الهندسة الوراثيةمع الاستنساخ التقليدي. لقد أدى تطوير طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى توسيع القدرات المنهجية لعلم الوراثة الجزيئية، وخاصة الهندسة الوراثية، إلى حد كبير، حتى أنها غيرت بشكل جذري وعززت الإمكانات العلمية في العديد من مجالاتها.
1.2 أنواع تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)
· PCR متداخل- يستخدم لتقليل عدد المنتجات الثانوية للتفاعل. يتم استخدام زوجين من البادئات ويتم تنفيذ تفاعلين متسلسلين. يقوم الزوج الثاني من البادئات بتضخيم منطقة من الحمض النووي داخل منتج التفاعل الأول.
· PCR مقلوب- يستخدم عند معرفة منطقة صغيرة فقط ضمن التسلسل المطلوب. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص عندما يتعلق الأمر بتحديد التسلسلات المجاورة بعد إدخال الحمض النووي في الجينوم. لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل المقلوب، يتم إجراء سلسلة من عمليات قطع الحمض النووي باستخدام إنزيمات التقييد<#"justify">التمهيدي لتفاعل البوليميراز المتسلسل
· مجموعة محددة PCR- PCR للأقارب<#"center">1.3 تفاعل البلمرة المتسلسل
تم اكتشاف تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في منتصف الثمانينات، ويمكنه مضاعفة عدد نسخ العينة الأصلية ملايين المرات في غضون ساعات قليلة. خلال كل دورة تفاعل، يتم تشكيل نسختين من الجزيء الأصلي. يمكن لكل نسخة من النسخ المركبة من الحمض النووي أن تكون بمثابة قالب لتركيب نسخ جديدة من الحمض النووي في الدورة التالية. وبالتالي فإن تكرار الدورات يؤدي إلى زيادة عدد النسخ فيها المتوالية الهندسية. ويترتب على الحسابات أنه حتى مع 30 دورة، سيكون عدد نسخ الجزيء الأصلي أكثر من مليار نسخة. حتى لو أخذنا في الاعتبار أنه لا يتم تكرار جميع الأمبليكونات خلال كل دورة، فإن العدد الإجمالي للنسخ، على الرغم من ذلك، يعد رقمًا كبيرًا جدًا.
تتكون كل دورة تفاعل سلسلة البوليميراز (PCR) من الخطوات التالية:
· تمسخ الطبيعة - تؤدي الزيادة في درجة الحرارة إلى تفكيك جزيء الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل والانقسام إلى جزأين مفردين تقطعت بهم السبل.
· التلدين - خفض درجة الحرارة يسمح للبادئات بالارتباط بالمناطق التكميلية لجزيء الحمض النووي؛
· الاستطالة - يكمل إنزيم بوليميريز الحمض النووي السلسلة التكميلية.
لتضخيم جزء محدد، يتم استخدام اثنين من بادئات قليل النوكليوتيد (البادئات) المحيطة بمنطقة معينة من الحمض النووي. الاشعال الموجهة 3 - تنتهي تجاه بعضها البعض وباتجاه التسلسل الذي يحتاج إلى تضخيم. يقوم بوليميريز الحمض النووي بتركيب (إكمال) سلاسل الحمض النووي التكميلية، بدءًا من البادئات. أثناء تخليق الحمض النووي، يتم دمج البادئات فعليًا في سلسلة جزيئات الحمض النووي المركبة حديثًا. كل خيط من جزيء الحمض النووي المتكون باستخدام أحد البادئات يمكن أن يكون بمثابة قالب لتخليق خيط الحمض النووي التكميلي باستخدام بادئ آخر.
1.4 تنفيذ تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)
يتم تنفيذ تفاعل البوليميراز المتسلسل في أنابيب خاصة من مادة البولي بروبيلين رقيقة الجدران، متوافقة في الحجم مع جهاز التدوير الحراري (مكبر الصوت) المستخدم - وهو جهاز يتحكم في خصائص درجة الحرارة والوقت لمراحل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
1.5 مبدأ طريقة تفاعل البلمرة المتسلسل
تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) هو طريقة لتضخيم الحمض النووي في المختبر والتي يمكن استخدامها لعزل ومضاعفة تسلسل معين من الحمض النووي مليارات المرات في غضون ساعات قليلة. إمكانية الحصول على عدد هائل من النسخ الواحدة بدقة منطقة معينةالجينوم يبسط إلى حد كبير دراسة عينة الحمض النووي الموجودة.
لإجراء تفاعل البلمرة المتسلسل، يجب استيفاء عدد من الشروط:
1.5.1 وجود عدد من المكونات في خليط التفاعل
المكونات الرئيسية لخليط التفاعل (PCR) هي: Tris-HCl، KCl، MgCl 2، خليط من نيوكليوتيد ثلاثي الفوسفات (ATP، GTP، CTP، TTP)، الاشعال (أليغنوكليوتيدات)، تحضير عينة الحمض النووي، بوليميريز الحمض النووي القابل للحرارة. ويشارك كل مكون من مكونات خليط التفاعل بشكل مباشر في تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، ويؤثر تركيز الكواشف بشكل مباشر على مسار التضخيم.
· Tris-HCl - يحدد الرقم الهيدروجيني لخليط التفاعل، ويخلق سعة عازلة. يعتمد نشاط بوليميراز الحمض النووي على الرقم الهيدروجيني للبيئة، وبالتالي فإن قيمة الرقم الهيدروجيني تؤثر بشكل مباشر على مسار تفاعل سلسلة البوليميراز. عادة ما تكون قيمة الرقم الهيدروجيني بين 8 و 9.5. يتم أخذ قيمة الرقم الهيدروجيني العالية لأن الرقم الهيدروجيني للمحلول المنظم Tril-HCl ينخفض مع زيادة درجة الحرارة.
· KCl - يؤثر تركيز كلوريد البوتاسيوم حتى 50 ملي مولار على سير عمليات تمسخ الطبيعة والتليين؛ التركيزات التي تزيد عن 50 ملي مولار تمنع بوليميراز الحمض النووي.
· ملغكل 2- بما أن بوليميريز DNA هو Mg 2+- الإنزيم المعتمد فإن تركيز أيونات المغنسيوم يؤثر على نشاط الإنزيم (Mg 2+يشكل مجمعات مع NTP - هذه المجمعات هي الركيزة للبوليميراز). يؤدي التركيز العالي إلى زيادة في التضخيم غير النوعي، ويؤدي التركيز المنخفض إلى تثبيط التفاعل؛ ويكون الحد الأمثل (للبوليميرات المختلفة) في حدود 0.5 - 5 ملم. بالإضافة إلى ذلك، يؤثر تركيز أملاح المغنيسيوم على مسار عمليات تمسخ الطبيعة والتليين - زيادة في تركيز المغنيسيوم 2+يسبب زيادة في درجة حرارة انصهار الحمض النووي (أي درجة الحرارة التي يتم عندها فصل 50٪ من خيوط الحمض النووي المزدوجة الجديلة إلى خيوط مفردة).
· NTP - ثلاثي فوسفات النيوكليوتيدات عبارة عن مونومرات مباشرة للأحماض النووية. لمنع إنهاء السلسلة، يوصى بنسبة متساوية من جميع نيوكليوتيدات ثلاثي الفوسفات الأربعة. يزيد التركيز المنخفض لهذه المكونات في خليط التفاعل من احتمالية حدوث أخطاء عند بناء سلسلة DNA التكميلية.
· الاشعال - الأكثر مثالية هو استخدام الاشعال مع اختلاف في درجة حرارة الانصهار لا يزيد عن 2 - 4 س ج. في بعض الأحيان أثناء التخزين طويل الأمد عند درجة حرارة 4 س C، أو بعد عدد كبير من التجميد والذوبان، تشكل البادئات هياكل ثانوية - خافتة، مما يقلل من كفاءة PCR. يتم القضاء على هذه المشكلة عن طريق الحضانة في حمام مائي (T = 95 س ج) لمدة 3 دقائق ثم التبريد السريع إلى 0 درجة مئوية مع.
· تحضيرات الحمض النووي - تؤثر كمية ونوعية تحضير الحمض النووي (المصفوفة) بشكل مباشر على مسار ومعايير تفاعل البلمرة المتسلسل. الكميات الزائدة من عينة الحمض النووي تمنع تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). الشوائب مواد مختلفةيمكن أن يقلل تحضير الحمض النووي أيضًا من فعالية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR): أسيتات الصوديوم، كلوريد الصوديوم، الأيزوبروبانول، الإيثانول، الهيبارين، الفينول، اليوريا، الهيموجلوبين، إلخ.
· بوليميريز الحمض النووي - عند استخدام كمية صغيرة من بوليميريز الحمض النووي، لوحظ انخفاض في تخليق المنتج النهائي بما يتناسب بشكل مباشر مع حجم الأجزاء. تؤدي زيادة البوليميراز بمقدار 2-4 مرات إلى ظهور أطياف منتشرة، وبنسبة 4-16 مرة - أطياف غير محددة منخفضة الجزيئية. نطاق التركيزات المستخدمة هو 0.5 - 1.5 وحدة نشاط لكل 25 ميكرولتر من خليط PCR.
بالإضافة إلى المكونات الرئيسية لخليط PCR، يتم استخدام عدد من المواد الإضافية التي تعمل على تحسين المؤشرات النوعية والكمية لـ PCR: الأسيتاميد (5٪) - يزيد من قابلية ذوبان المكونات الرئيسية؛ البيتين ( ملح الصوديوم) - تثبيت بوليميريز الحمض النووي، وخفض درجة حرارة انصهار الحمض النووي، ومعادلة درجة حرارة الانصهار؛ الألبومين البقري (10-100 ميكروغرام/مل) - تثبيت بوليميراز الحمض النووي؛ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (1-10%) - زيادة ذوبان المكونات الرئيسية؛ فورماميد (2-10%) - يزيد من خصوصية التلدين؛ الجلسرين (15-20%) - زيادة الثبات الحراري للإنزيم، وخفض درجة حرارة تمسخ عينة الحمض النووي؛ كبريتات الأمونيوم - خفض درجة حرارة التسخين والتليين.
1.5.2 الوضع الدوري ودرجة الحرارة
المظهر العام لبرنامج تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) هو كما يلي:
منصة. تمسخ أولي طويل الأمد لتحضير الحمض النووي، الدورة الأولى
منصة. تمسخ سريع لإعداد الحمض النووي. الصلب من الاشعال. استطالة.30 - 45 دورة.
منصة. استطالة طويلة. تبريد خليط التفاعل الدورة الأولى.
كل عنصر من عناصر المرحلة - تمسخ الطبيعة، التلدين، الاستطالة - له درجة حرارة وخصائص زمنية فردية. يتم اختيار معلمات درجة الحرارة والوقت لكل عنصر بشكل تجريبي، وفقًا للمؤشرات النوعية والكمية لمنتجات التضخيم.
تمسخ. خلال هذا العنصر من تفاعل سلسلة البوليميراز، يتم تقسيم جزيء DNA المزدوج إلى جزأين منفردين. تتراوح معلمات درجة حرارة تمسخ الطبيعة بين 90 - 95 س ج، ولكن في حالة عينة الحمض النووي التي تحتوي على نسبة عالية من الجوانين والسيتوزين، يجب رفع درجة الحرارة إلى 98 درجة. س ج. يجب أن تكون درجة حرارة التسخين كافية لتشويه سلاسل الحمض النووي تمامًا وتجنب "التبريد السريع" أو التلدين السريع، ومع ذلك، فإن بوليميراز الحمض النووي القابل للحرارة يكون أقل استقرارًا عند درجات الحرارة المرتفعة. وبالتالي، فإن اختيار معلمات درجة حرارة تمسخ الأمثل لنسبة التمهيدي/العينة (إعداد الحمض النووي) هو شرط مهم عند إجراء التضخيم. إذا كانت درجة حرارة تمسخ الطبيعة في المرحلة الأولى أعلى من 95 س C، فمن المستحسن إضافة بوليميريز الحمض النووي إلى خليط التفاعل بعد تمسخ الأولي. يجب أن تكون مدة هذا العنصر من المرحلة أثناء تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) كافية لتشويه الحمض النووي تمامًا، ولكن في نفس الوقت لا يكون لها تأثير كبير على نشاط بوليميريز الحمض النووي عند درجة حرارة معينة.
التلدين. درجة حرارة التلدين (T أ ) هي واحدة من أهم معلمات تفاعل البوليميراز المتسلسل. يتم تحديد درجة حرارة التلدين لكل جهاز تمهيدي محدد على حدة. ذلك يعتمد على طول وتكوين النوكليوتيدات من التمهيدي. عادة ما يكون أقل بنسبة 2 - 4 س من قيمة نقطة الانصهار (T م ) التمهيدي. إذا كانت درجة حرارة التلدين للنظام أقل من المستوى الأمثل، فإن عدد الأجزاء المضخمة غير المحددة يزداد، وعلى العكس من ذلك، أكثر حرارةيقلل من كمية المنتجات المضخمة. في هذه الحالة، يمكن أن ينخفض تركيز الأمبليكونات المحددة بشكل حاد، حتى تثبيط تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). تؤدي زيادة وقت التلدين أيضًا إلى زيادة عدد الأمبليكونات غير المحددة.
استطالة. عادة، كل نوع من بوليميراز الحمض النووي القابل للحرارة له درجة حرارة فردية مثالية للنشاط. معدل تخليق خيط الحمض النووي التكميلي بواسطة الإنزيم خاص أيضًا بكل بوليميراز (في المتوسط هو 30 - 60 نيوكليوتيدات في الثانية، أو 1 - 2 ألف قاعدة في الدقيقة)، وبالتالي يتم تحديد وقت الاستطالة اعتمادًا على النوع بوليميريز الحمض النووي وطول المنطقة المتضخمة.
1.5.3 المبادئ الأساسية لاختيار الاشعال
عند إنشاء نظام اختبار PCR، إحدى المهام الرئيسية هي الاختيار الصحيح للبادئات، والتي يجب أن تستوفي عددًا من المعايير:
يجب أن تكون الاشعال محددة. انتباه خاصدفع 3 - نهايات البادئات، لأنه منها يبدأ بوليميراز طق في استكمال شريط الحمض النووي التكميلي. إذا كانت خصوصيتها غير كافية، فمن المحتمل أن تحدث عمليات غير مرغوب فيها في أنبوب الاختبار مع خليط التفاعل، أي تخليق الحمض النووي غير المحدد (شظايا قصيرة أو طويلة). ويمكن رؤيته على الرحلان الكهربائي على شكل أشرطة إضافية ثقيلة أو خفيفة. وهذا يتعارض مع تقييم نتائج التفاعل، حيث أنه من السهل الخلط بين منتج تضخيم معين والحمض النووي الأجنبي المركب. يتم استهلاك بعض البادئات وdNTPs لتخليق الحمض النووي غير النوعي، مما يؤدي إلى فقدان كبير للحساسية.
لا ينبغي أن تشكل الاشعال خافتات وحلقات، أي. لا ينبغي أن تتشكل خيوط مزدوجة مستقرة نتيجة للتصلب الأولي لنفسها أو لبعضها البعض.
1.5.4 تأثير الهضبة
تجدر الإشارة إلى أن عملية تراكم منتجات تضخيم محددة في تقدم هندسي لا تستمر إلا لفترة محدودة، ثم تنخفض كفاءتها بشكل خطير. ويرجع ذلك إلى ما يسمى بتأثير الهضبة.
تأثير المدى هضبة يستخدم لوصف عملية تراكم منتجات PCR في دورات التضخيم الأخيرة.
اعتمادًا على الظروف وعدد دورات تفاعل التضخيم، يتم تحقيق التأثير في الوقت الذي يتم فيه ذلك هضبة تتأثر باستخدام الركائز (dNTPs والبادئات)، واستقرار المواد المتفاعلة (dNTPs والإنزيم)، وكمية المثبطات، بما في ذلك البيروفوسفات وثنائيات الحمض النووي، والتنافس على المواد المتفاعلة بواسطة منتجات غير محددة أو ثنايا التمهيدي، وتركيز منتج معين وتمسخ غير كامل عند تركيزات عالية من منتجات التضخيم.
كلما انخفض التركيز الأولي للحمض النووي المستهدف، زاد خطر فشل التفاعل. الهضبة." قد تحدث هذه النقطة قبل أن يكون هناك ما يكفي من منتجات التضخيم المحددة لتحليلها. فقط أنظمة الاختبار المحسنة جيدًا هي التي يمكنها تجنب ذلك.
1.5.5 تحضير العينة البيولوجية
لعزل الحمض النووي، يتم استخدام تقنيات مختلفة اعتمادًا على المهام المطروحة. يكمن جوهرها في استخلاص (استخراج) الحمض النووي من مستحضر بيولوجي وإزالة أو تحييد الشوائب الأجنبية للحصول على محضر DNA بنقاء مناسب لـ PCR.
تعتبر طريقة الحصول على تحضير الحمض النووي النقي الذي وصفه مارمور معيارًا وقد أصبحت كلاسيكية بالفعل. ويشمل التحلل البروتيني الأنزيمي يليه إزالة البروتين وتكرار الحمض النووي بالكحول. تسمح لك هذه الطريقة بالحصول على تحضير DNA نقي. ومع ذلك، فهي تتطلب عمالة كثيفة وتتضمن العمل مع مواد عدوانية وقوية الرائحة مثل الفينول والكلوروفورم.
إحدى الطرق الشائعة حاليًا هي طريقة استخراج الحمض النووي التي اقترحها Boom et al. تعتمد هذه الطريقة على استخدام عامل فوضوي قوي، جوانيدين ثيوسيانات (GuSCN)، لتحلل الخلايا وامتصاص الحمض النووي لاحقًا على حامل (خرز زجاجي، تراب دياتومي، حليب زجاجي، إلخ). بعد الغسيل، يبقى الحمض النووي في العينة، ويتم امتصاصه على الناقل، والذي يمكن إزالته منه بسهولة باستخدام محلول شطف. هذه الطريقة مريحة ومتقدمة تقنيًا ومناسبة لإعداد عينة للتضخيم. ومع ذلك، فإن فقدان الحمض النووي ممكن بسبب الامتصاص الذي لا رجعة فيه على الناقل، وكذلك أثناء عمليات الغسيل العديدة. وهذا مهم بشكل خاص عند العمل مع كميات صغيرة من الحمض النووي في العينة. بالإضافة إلى ذلك، حتى الكميات الضئيلة من GuSCN يمكن أن تمنع PCR. ولذلك، عند استخدام هذه الطريقة فمن المهم جدا الاختيار الصحيحالالتزام الماص والدقيق بالفروق التكنولوجية.
وتعتمد مجموعة أخرى من طرق تحضير العينات على استخدام المبادلات الأيونية من نوع تشيليكس، والتي، على عكس الزجاج، لا تمتص الحمض النووي، بل الشوائب التي تتداخل مع التفاعل. كقاعدة عامة، تتضمن هذه التقنية مرحلتين: غليان العينة وامتصاص الشوائب في مبادل أيوني. هذه الطريقة جذابة للغاية بسبب بساطتها في التنفيذ. في معظم الحالات يكون مناسبًا للعمل مع المواد السريرية. لسوء الحظ، في بعض الأحيان توجد عينات بها شوائب لا يمكن إزالتها باستخدام المبادلات الأيونية. بالإضافة إلى ذلك، لا يمكن تدمير بعض الكائنات الحية الدقيقة عن طريق الغليان البسيط. وفي هذه الحالات، من الضروري إدخال مراحل إضافية لمعالجة العينات.
وبالتالي، ينبغي أن يؤخذ في الاعتبار اختيار طريقة تحضير العينة مع فهم أغراض التحليل المقصود.
1.5.6 التضخيم
لإجراء تفاعل التضخيم، من الضروري تحضير خليط التفاعل وإضافة عينة الحمض النووي التي تم تحليلها إليه. من المهم أن تأخذ في الاعتبار بعض ميزات التلدين التمهيدي. والحقيقة هي أنه، كقاعدة عامة، تحتوي العينة البيولوجية التي تم تحليلها على جزيئات مختلفة من الحمض النووي، والتي يكون للبادئات المستخدمة في التفاعل تماثل جزئي، وفي بعض الحالات مهم. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تصلب البادئات مع بعضها البعض، وتشكل ديمرزات تمهيدية. كلاهما يؤدي إلى استهلاك كبير من الاشعال لتوليف منتجات التفاعل الثانوية (غير المحددة)، ونتيجة لذلك، يقلل بشكل كبير من حساسية النظام. وهذا يجعل من الصعب أو المستحيل قراءة نتائج التفاعل أثناء الرحلان الكهربائي.
1.6 تكوين خليط تفاعل PCR القياسي
x PCR المخزن المؤقت (100 ملي مولار من محلول Tris-HCl، درجة الحموضة 9.0، 500 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 25 ملي مولار من محلول MgCl2 ) …….2.5 ميكرولتر
الماء (MilliQ) ……………………………………………………….18.8 ميكرولتر
خليط من نيوكليوتيد ثلاثي الفوسفات (dNTPs)
محلول ملم من كل ........................ 0.5 ميكرولتر
التمهيدي 1 (محلول 10 ملم) ……………………………………….1 ميكرولتر
التمهيدي 2 (محلول 10 ملم) ……………………………………….1 ميكرولتر
بوليميريز الحمض النووي (5 وحدات / ميكرولتر) ………………………………… 0.2 ميكرولتر
عينة الحمض النووي (20 نانوغرام/ميكرولتر) ………………………………………..1 ميكرولتر
1.7 تقييم نتائج التفاعل
لتقييم نتائج PCR بشكل صحيح، من المهم أن نفهم أن هذه الطريقة ليست كمية. من الناحية النظرية، يمكن اكتشاف منتجات التضخيم لجزيئات الحمض النووي المستهدفة باستخدام الرحلان الكهربائي بعد 30-35 دورة. ومع ذلك، من الناحية العملية، يتم ذلك فقط في الحالات التي يحدث فيها رد الفعل في ظل ظروف قريبة من المثالية، وهو ما لا يحدث غالبًا في الحياة. درجة نقاء إعداد الحمض النووي لها تأثير كبير بشكل خاص على كفاءة التضخيم، أي. وجود مثبطات معينة في خليط التفاعل، والتي قد يكون من الصعب للغاية التخلص منها في بعض الحالات. في بعض الأحيان، بسبب وجودها، حتى عشرات الآلاف من جزيئات الحمض النووي المستهدفة لا يمكن تضخيمها. وبالتالي، غالبًا لا توجد علاقة مباشرة بين الكمية الأولية من الحمض النووي المستهدف والكمية النهائية لمنتجات التضخيم.
الفصل الثاني: تطبيقات تفاعل البوليميراز المتسلسل
يستخدم PCR في العديد من المجالات للاختبار والتجارب العلمية.
التحاليل الجنائية
يُستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لمقارنة ما يسمى بـ "البصمات الجينية". مطلوب عينة من المادة الوراثية من مسرح الجريمة - الدم، اللعاب، السائل المنوي، الشعر، الخ. تتم مقارنتها بالمادة الوراثية للمشتبه به. كمية صغيرة جدًا من الحمض النووي تكفي نظريًا، نسخة واحدة. يتم تقسيم الحمض النووي إلى أجزاء ثم يتم تضخيمه باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل. يتم فصل الأجزاء باستخدام الرحلان الكهربائي للحمض النووي. ويسمى النمط الناتج لترتيب نطاقات الحمض النووي بالبصمة الجينية.
إثبات الأبوة
نتائج الرحلان الكهربي لشظايا الحمض النووي المضخمة بواسطة PCR. أب. طفل. الأم. يرث الطفل بعض سمات البصمة الجينية لكلا الوالدين، مما ينتج عنه بصمة جديدة وفريدة من نوعها.
على الرغم من أن البصمات الجينية فريدة من نوعها، إلا أنه لا يزال من الممكن إنشاء العلاقات الأسرية عن طريق عمل عدة بصمات أصابع. ويمكن تطبيق نفس الطريقة، مع تعديل طفيف، لإثبات الارتباط التطوري بين الكائنات الحية.
يجعل PCR من الممكن تسريع وتسهيل تشخيص الأمراض الوراثية والفيروسية بشكل كبير. يتم تضخيم الجين محل الاهتمام بواسطة PCR باستخدام الاشعال المناسبة ومن ثم تسلسله لتحديد الطفرات. يمكن اكتشاف العدوى الفيروسية مباشرة بعد الإصابة، قبل أسابيع أو أشهر من ظهور الأعراض.
طب شخصي
في بعض الأحيان يتبين أن الأدوية سامة أو مسببة للحساسية بالنسبة لبعض المرضى. ترجع أسباب ذلك جزئيًا إلى الاختلافات الفردية في قابلية التأثر واستقلاب الأدوية ومشتقاتها. يتم تحديد هذه الاختلافات على المستوى الجيني. على سبيل المثال، في مريض واحد قد يكون السيتوكروم أكثر نشاطا، في مريض آخر - أقل. من أجل تحديد نوع السيتوكروم لدى مريض معين، يقترح إجراء تحليل PCR قبل استخدام الدواء. ويسمى هذا التحليل التنميط الجيني الأولي.
استنساخ الجينات
استنساخ الجينات هو عملية عزل الجينات، ونتيجة لتلاعب الهندسة الوراثية، يتم الحصول على كمية كبيرة من منتج جين معين. يُستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم الجين، ثم يتم إدخاله بعد ذلك في ناقل - قطعة من الحمض النووي تنقل جينًا غريبًا إلى نفس الكائن أو إلى كائن آخر مناسب للنمو. على سبيل المثال، يتم استخدام البلازميدات أو الحمض النووي الفيروسي كنواقل. عادة ما يتم استخدام إدخال الجينات في كائن غريب لإنتاج منتج ذلك الجين - RNA أو البروتين في أغلب الأحيان. وبهذه الطريقة يتم الحصول على العديد من البروتينات بكميات صناعية لاستخدامها في زراعة، الطب، الخ.
تسلسل الحمض النووي
في طريقة التسلسل باستخدام الديديوكسينوكليوتيدات الموسومة بعلامة الفلورسنت أو النظائر المشعة، يعد PCR جزءًا لا يتجزأ، لأنه أثناء البلمرة يتم إدراج مشتقات النيوكليوتيدات الموسومة بعلامة الفلورسنت أو المشعة في سلسلة الحمض النووي. يؤدي هذا إلى إيقاف التفاعل، مما يسمح بتحديد مواقع نيوكليوتيدات معينة بعد فصل السلاسل المركبة في الجل.
الطفرات
حاليا، أصبح PCR الطريقة الرئيسية لتنفيذ الطفرات. لقد أتاح استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) تبسيط وتسريع إجراء الطفرات، فضلاً عن جعله أكثر موثوقية وقابلية للتكرار.
أتاحت طريقة PCR تحليل وجود تسلسلات فيروس الورم الحليمي البشري في أقسام الخزعة المضمنة بالبرافين لأورام عنق الرحم البشرية قبل 40 عامًا من هذه الدراسة. علاوة على ذلك، باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل، كان من الممكن تضخيم واستنساخ أجزاء من الحمض النووي للميتوكوندريا من البقايا الأحفورية لدماغ بشري عمره 7 آلاف عام!
باستخدام ليساتيس الحيوانات المنوية البشرية الفردية، تم إثبات القدرة على تحليل موقعين يقعان على كروموسومات مختلفة غير متجانسة في وقت واحد. يوفر هذا النهج فرصة فريدة للتحليل الجيني الدقيق ودراسة إعادة تركيب الكروموسومات، وتعدد أشكال الحمض النووي، وما إلى ذلك. وقد تم العثور على طريقة تحليل الحيوانات المنوية الفردية على الفور الاستخدام العمليفي الطب الشرعي، نظرًا لأن كتابة HLA للخلايا الأحادية الصيغة الصبغية يجعل من الممكن تحديد الأبوة أو التعرف على المجرم (مجمع HLA عبارة عن مجموعة من جينات مجمع التوافق النسيجي الرئيسي البشري؛ ومواقع مجمع HLA هي الأكثر تعدد الأشكال على الإطلاق في الطب الشرعي) الفقاريات الأعلى: داخل النوع الواحد، يوجد في كل موضع عدد كبير غير عادي من الأليلات المختلفة - أشكال بديلة لنفس الجين).
باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل، من الممكن تحديد التكامل الصحيح للهياكل الجينية الأجنبية في منطقة محددة مسبقًا من جينوم الخلايا قيد الدراسة. يتم تلدين إجمالي الحمض النووي الخلوي إلى اثنين من بادئات قليل النوكليوتيد، أحدهما مكمل لجزء من الحمض النووي المضيف بالقرب من نقطة الإدراج، والآخر مكمل لتسلسل الجزء المدمج في شريط الحمض النووي المضاد للتوازي. يؤدي تفاعل البوليميراز المتسلسل، في حالة وجود بنية DNA كروموسومية غير متغيرة في موقع الإدخال المقصود، إلى تكوين شظايا DNA مفردة الجديلة ذات حجم غير معروف، وفي حالة الإدخال المخطط له، شظايا DNA مزدوجة الجديلة من الحجم المعروف، الذي تحدده المسافة بين مواقع التلدين لاثنين من البادئات. علاوة على ذلك، فإن درجة تضخيم منطقة الجينوم التي تم تحليلها في الحالة الأولى سوف تعتمد خطيا على عدد الدورات، وفي الحالة الثانية ستكون أسية. يسمح لنا التراكم الأسي لجزء مضخم بحجم محدد مسبقًا أثناء PCR بمراقبته بصريًا بعد التجزئة الكهربية لإعداد الحمض النووي والتوصل إلى نتيجة لا لبس فيها حول إدخال تسلسل أجنبي في منطقة معينة من الحمض النووي الصبغي.
خاتمة
تُستخدم طريقة PCR حاليًا على نطاق واسع كوسيلة لتشخيص الأمراض المعدية المختلفة. يسمح لك تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بتحديد مسببات العدوى حتى لو كانت العينة المأخوذة للتحليل تحتوي فقط على عدد قليل من جزيئات الحمض النووي للعامل الممرض. يستخدم PCR على نطاق واسع في التشخيص المبكر لعدوى فيروس نقص المناعة البشرية والتهاب الكبد الفيروسي وما إلى ذلك. اليوم لا يوجد تقريبًا أي عامل معدي لا يمكن اكتشافه باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل.
قائمة الأدب المستخدم
1.Padutov V.E.، Baranov O.Yu.، Voropaev E.V. طرق التحليل الوراثي الجزيئي. - مينيسوتا: يونيبول، 2007. - 176 ص.
2.PCR "في الوقت الحقيقي" / ريبريكوف دي في، ساماتوف جي إيه، تروفيموف دي يو. وإلخ.؛ حررت بواسطة ديسيبل. ن. د.ف. ريبريكوفا. مقدمة لوس أنجلوس أوسترمان والأكاديمي RAS وRAAS E.D. سفيردلوف؛ الطبعة الثانية، مراجعة. وإضافية - م: بينوم. مختبر المعرفة، 2009. - 223 ص.
.باتروشيف إل. النظم الجينية الاصطناعية. - م: نوكا، 2005. - في مجلدين.
.B. غليك، J. باسترناك التكنولوجيا الحيوية الجزيئية. المبادئ والتطبيقات 589 ص، 2002
5.ششيلكونوف إس.إن.
تحرير أ.أ. فوربييفا
http://ru. wikipedia.org
http://scholar. google.ru
.
.
http://www.med2000.ru/n1/n12. هتم
12.http://بريزفاني. سو/
التدريس
هل تحتاج إلى مساعدة في دراسة موضوع ما؟
سيقوم المتخصصون لدينا بتقديم المشورة أو تقديم خدمات التدريس حول الموضوعات التي تهمك.
تقديم طلبكمع الإشارة إلى الموضوع الآن للتعرف على إمكانية الحصول على استشارة.
ل كافية و علاج فعالتتطلب العديد من الأمراض المعدية التعرف عليها في الوقت المناسب تشخيص دقيق. في حل هذه المشكلة اليوم، يتم استخدام أساليب التشخيص عالية التقنية القائمة على أساليب البيولوجيا الجزيئية. في الوقت الحالي، يُستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على نطاق واسع في الطب العملي باعتباره أداة التشخيص المختبري الأكثر موثوقية.
ما الذي يفسر شعبية PCR في الوقت الحاضر؟
أولاً، يتم استخدام هذه الطريقة بدقة عالية لتحديد مسببات الأمراض لمختلف الأمراض المعدية.ثانيا، لمراقبة فعالية العلاج.
في العديد من الأدلة والكتيبات والمقالات، وكذلك التفسيرات المقدمة من المتخصصين الطبيين، غالبا ما نواجه استخدام مصطلحات وكلمات غير مفهومة. من الصعب حقًا التحدث عن منتجات العلوم عالية التقنية بكلمات يومية.
ما هو جوهر وآليات تشخيص PCR؟
كل كائن حي لديه جيناته الفريدة. توجد الجينات في جزيء الحمض النووي، وهو في الواقع "بطاقة الاتصال" لكل كائن حي على حدة. الحمض النووي (المادة الوراثية) هو جزيء طويل جدًا يتكون من وحدات بناء تسمى النيوكليوتيدات. لكل مسبب للأمراض المعدية، فهي تقع بشكل صارم على وجه التحديد، أي في تسلسل معين ومجموعة معينة. عندما يكون من الضروري فهم ما إذا كان لدى الشخص ممرض معين، يتم أخذ مادة بيولوجية (الدم والبول واللعاب والمسحة) التي تحتوي على الحمض النووي أو شظايا الحمض النووي للميكروب. لكن كمية المادة الوراثية للعامل الممرض صغيرة جدًا، ومن المستحيل تحديد الكائنات الحية الدقيقة التي تنتمي إليها. ويستخدم PCR لحل هذه المشكلة. جوهر تفاعل البوليميراز المتسلسل هو أنه يتم أخذ كمية صغيرة من المادة المخصصة للبحث التي تحتوي على الحمض النووي، وأثناء عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، تزداد كمية المادة الوراثية التي تنتمي إلى مسبب مرضي معين، وبالتالي يمكن التعرف عليها.تشخيص PCR – الدراسة الجينية للمواد الحيوية.
تعود فكرة طريقة PCR إلى العالم الأمريكي ك. مولينز، والتي اقترحها في عام 1983. ومع ذلك، لم يتلق استخدامًا سريريًا واسع النطاق إلا في منتصف التسعينيات من القرن العشرين. دعونا نفهم المصطلحات، ما هو - الحمض النووي، وما إلى ذلك. تحتوي كل خلية في أي كائن حي (حيوان، نبات، إنسان، بكتيريا، فيروس) على كروموسومات. الكروموسومات هي حارسة المعلومات الوراثية التي تحتوي على التسلسل الجيني الكامل لكل كائن حي محدد.
يتكون كل كروموسوم من شريطين من الحمض النووي ملتويين في شكل حلزوني بالنسبة لبعضهما البعض. الحمض النووي هو حمض ديوكسي ريبونوكلييك كيميائيا، والذي يتكون من مكونات هيكلية - النيوكليوتيدات. هناك 5 أنواع من النيوكليوتيدات - الثيمين (T)، الأدينوزين (A)، الجوانين (G)، السيتوزين (C) واليوراسيل (U). يتم ترتيب النيوكليوتيدات واحدة تلو الأخرى في تسلسل فردي صارم، وتشكل الجينات. يمكن أن يتكون الجين الواحد من 20-200 نيوكليوتيدات من هذا القبيل. على سبيل المثال، يتكون الجين الذي يشفر إنتاج الأنسولين من 60 زوجًا من النيوكليوتيدات.
النيوكليوتيدات لها خاصية التكامل. وهذا يعني أن مقابل الأدينين (A) في إحدى سلسلة DNA يوجد بالضرورة الثيمين (T) في سلسلة أخرى، ومقابل الجوانين (G) يوجد السيتوزين (C). تخطيطيا يبدو مثل هذا:
ز - ج
ت - أ
في
خاصية التكامل هذه هي المفتاح لـ PCR.
بالإضافة إلى الحمض النووي، فإن الحمض النووي الريبي (RNA) له نفس البنية - حمض الريبونوكليك، والذي يختلف عن الحمض النووي لأنه يستخدم اليوراسيل بدلاً من الثيمين. الحمض النووي الريبي (RNA) هو حارس المعلومات الجينية في بعض الفيروسات التي تسمى الفيروسات القهقرية (على سبيل المثال، فيروس نقص المناعة البشرية).
يمكن لجزيئات الحمض النووي الريبي (DNA) والحمض النووي الريبي (RNA) أن "تتضاعف" (تُستخدم هذه الخاصية في تفاعل البوليميراز المتسلسل). يحدث هذا على النحو التالي: يتحرك شريطان من الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي (RNA) بعيدًا عن بعضهما البعض، ويوجد إنزيم خاص على كل شريط، والذي يقوم بتوليف سلسلة جديدة. يستمر التوليف وفقًا لمبدأ التكامل، أي إذا كانت سلسلة الحمض النووي الأصلية تحتوي على النوكليوتيدات A، فإن السلسلة المركبة حديثًا ستحتوي على T، وإذا كانت G، ثم C، وما إلى ذلك. لبدء عملية التوليف، يحتاج هذا الإنزيم "الباني" الخاص إلى "بذرة" - سلسلة من 5-15 نيوكليوتيدات. يتم تعريف هذا "التمهيدي" لكل جين (جين الكلاميديا، الميكوبلازماوالفيروسات) تجريبيا.
لذلك، كل دورة PCR تتكون من ثلاث مراحل. في المرحلة الأولى، يحدث ما يسمى بتفكيك الحمض النووي - أي فصل شريطي الحمض النووي المتصلين ببعضهما البعض. وفي الحالة الثانية، يتم ربط "البذرة" بجزء من شريط الحمض النووي. وأخيرًا، استطالة خيوط الحمض النووي هذه، والتي ينتجها إنزيم "باني". حاليا كل هذا عملية صعبةيحدث في أنبوب اختبار واحد ويتكون من دورات متكررة من مضاعفة الحمض النووي القابل للاكتشاف من أجل الحصول على عدد كبير من النسخ، والتي يمكن اكتشافها بعد ذلك بالطرق التقليدية. أي أننا نحصل من شريط واحد من الحمض النووي على مئات أو آلاف.
مراحل بحث PCR
جمع المواد البيولوجية للبحث
يتم استخدام مواد بيولوجية مختلفة كعينة: الدم ومكوناته، البول، اللعاب، إفرازات الأغشية المخاطية، السائل النخاعي، إفرازات أسطح الجرحمحتويات تجاويف الجسم. يتم جمع جميع العينات الحيوية بأدوات يمكن التخلص منها، وتوضع المواد المجمعة في أنابيب بلاستيكية معقمة أو توضع على وسائط الثقافة، مع نقلها لاحقًا إلى المختبر.تتم إضافة الكواشف اللازمة إلى العينات المجمعة ووضعها في منظم حرارة قابل للبرمجة - جهاز تدوير حراري (مضخم). في مكبر الصوت، تتكرر دورة PCR، المكونة من ثلاث مراحل (تمسخ الطبيعة، التلدين والتمديد)، 30-50 مرة. ماذا يعني هذا؟ دعونا نلقي نظرة فاحصة.
مراحل تفاعل PCR المباشر ونسخ المادة الوراثية
أنامرحلة PCR - تحضير المادة الوراثية للنسخ.ويحدث عند درجة حرارة 95 درجة مئوية، بينما تنفصل خيوط الحمض النووي، ويمكن أن تهبط "البذور" عليها.
يتم إنتاج “البذور” صناعياً من قبل جمعيات بحثية وإنتاجية مختلفة، وتقوم المعامل بشراء البذور الجاهزة. في الوقت نفسه، فإن "التمهيدي" لتحديد، على سبيل المثال، الكلاميديا، يعمل فقط مع الكلاميديا، إلخ. وبالتالي، إذا تم اختبار مادة حيوية للتأكد من وجود عدوى الكلاميديا، فسيتم وضع "تمهيد" للكلاميديا في خليط التفاعل؛ إذا تم اختبار المادة الحيوية بحثًا عن فيروس إبشتاين-بار، فهي أيضًا "بذرة" لفيروس إبشتاين-بار.
ثانياالمرحلة – الجمع بين المادة الوراثية للعامل المعدي و"البذرة".
إذا كان هناك حمض نووي لفيروس أو بكتيريا يمكن اكتشافه، فإن "التمهيد" يقع على هذا الحمض النووي. إن عملية إضافة "التمهيدي" هي المرحلة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل. تتم هذه المرحلة عند درجة حرارة 75 درجة مئوية.
ثالثاالمرحلة - نسخ المادة الوراثية للعامل المعدي.
هذه هي عملية استطالة أو تكاثر المادة الوراثية فعليًا، والتي تحدث عند درجة حرارة 72 درجة مئوية. يقترب إنزيم "الباني" من "البذور" ويصنع سلسلة جديدة من الحمض النووي. ومع انتهاء تصنيع سلسلة الحمض النووي الجديدة، تنتهي دورة PCR. أي أنه في دورة PCR واحدة تتضاعف كمية المادة الوراثية. على سبيل المثال، تحتوي العينة الأولية على 100 جزيء DNA للفيروس، وبعد دورة PCR الأولى، ستحتوي العينة بالفعل على 200 جزيء DNA للفيروس الذي يتم اختباره. دورة واحدة تستمر 2-3 دقائق.
لتوليد كمية كافية من المادة الوراثية لتحديد الهوية، يتم عادة إجراء 30-50 دورة PCR، والتي تستغرق 2-3 ساعات.
مرحلة تحديد المادة الوراثية المتكاثرة
في الواقع، ينتهي تفاعل البوليميراز المتسلسل هنا، ثم تأتي مرحلة تحديد الهوية التي لا تقل أهمية. لتحديد الهوية، يتم استخدام طريقة الرحلان الكهربائي أو "البذور" المسمى. عند استخدام الرحلان الكهربائي، يتم فصل خيوط الحمض النووي الناتجة حسب الحجم، ويشير وجود شظايا الحمض النووي ذات الأطوال المختلفة إلى نتيجة اختبار إيجابية (أي وجود فيروس معين أو بكتيريا أو ما إلى ذلك). عند استخدام "البذور" المسمى، تتم إضافة كروموجين (صبغة) إلى منتج التفاعل النهائي، ونتيجة لذلك يصاحب التفاعل الأنزيمي تكوين اللون. يشير تطور اللون بشكل مباشر إلى وجود فيروس أو أي عامل آخر يمكن اكتشافه في العينة الأصلية. اليوم، باستخدام "البذور" الموسومة، بالإضافة إلى البرامج المناسبة، من الممكن "قراءة" نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل على الفور. هذا هو ما يسمى PCR في الوقت الحقيقي.
لماذا تعتبر تشخيصات PCR ذات قيمة كبيرة؟
إحدى المزايا المهمة لطريقة PCR هي حساسيتها العالية - من 95 إلى 100%. ومع ذلك، يجب أن تستند هذه الفوائد إلى التقيد الصارم بالشروط التالية:
- جمع ونقل المواد البيولوجية بشكل صحيح؛
- توافر الأدوات المعقمة التي تستخدم لمرة واحدة والمختبرات الخاصة والموظفين المدربين؛
- الالتزام الصارم بالمنهجية والعقم أثناء التحليل
تسمح القدرات الكامنة في تحليل PCR بخصوصية تحليلية لا مثيل لها. وهذا يعني تحديد الكائن الدقيق المطلوب البحث عنه بالضبط، وليس كائنًا مشابهًا أو وثيق الصلة به.
الحساسية التشخيصيةوغالبًا ما تتفوق خصوصية طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل على تلك الخاصة بطريقة الاستزراع، والتي تسمى "المعيار الذهبي" للكشف عن الأمراض المعدية. وبالنظر إلى مدة زراعة الثقافة (من عدة أيام إلى عدة أسابيع)، تصبح ميزة طريقة PCR واضحة.
PCR في تشخيص الالتهابات
تحدد مزايا طريقة PCR (الحساسية والنوعية) مجموعة واسعة من التطبيقات في الطب الحديث.
المجالات الرئيسية لتطبيق تشخيص PCR:
- تشخيص الأمراض المعدية الحادة والمزمنة من مختلف التوطين
- مراقبة فعالية العلاج
- توضيح نوع الممرض
يتم استخدام تشخيص PCR بالتزامن مع طرق البحث الأخرى (ELISA، PIF، RIF، وما إلى ذلك). يتم تحديد مزيجها ومدى ملاءمتها من قبل الطبيب المعالج.
العوامل المعدية المكتشفة بواسطة PCR
الفيروسات:
- الفيروسات القهقرية فيروس نقص المناعة البشرية -1 وفيروس نقص المناعة البشرية -2
- الفيروسات الهربسية الشكل
- فايروس الهربس البسيط 1 و 2 أنواع
في الآونة الأخيرة، موثوقة وحساسة للغاية و طريقة سريعةتشخيص الأمراض المعدية البشرية المختلفة. وتسمى هذه الطريقة "تحليل PCR". ما هو، ما هو جوهره، ما هي الكائنات الحية الدقيقة التي يمكن تحديدها وكيفية تناولها بشكل صحيح، سنخبرك في مقالتنا.
تاريخ الاكتشاف
تُستخدم طرق PCR أيضًا في تشخيص السرطان.
مزايا الطريقة
يتميز تشخيص PCR بعدد من المزايا:
- حساسية عالية. حتى لو كان هناك عدد قليل فقط من جزيئات الحمض النووي للكائنات الحية الدقيقة، فإن تحليل PCR يحدد وجود العدوى. هذه الطريقة سوف تساعد في الأمراض المزمنة والكامنة. في كثير من الأحيان في مثل هذه الحالات لا تكون الكائنات الحية الدقيقة قابلة للاستزراع.
- أي مادة مناسبة للبحث، على سبيل المثال، اللعاب، الدم، الإفرازات التناسلية، الشعر، الخلايا الظهارية. الأكثر شيوعًا هو اختبار PCR للدم ولطاخة الجهاز البولي التناسلي.
- ليست هناك حاجة لزراعة المحاصيل على المدى الطويل. تتيح لك عملية التشخيص الآلي الحصول على نتائج البحث بعد 4-5 ساعات.
- هذه الطريقة موثوقة بنسبة مائة بالمائة تقريبًا. تم تسجيل حالات معزولة فقط من النتائج السلبية الكاذبة.
- القدرة على التعرف على عدة أنواع من مسببات الأمراض من عينة واحدة من المادة. وهذا لا يؤدي إلى تسريع عملية تشخيص المرض فحسب، بل يقلل أيضًا من تكاليف المواد بشكل كبير. في كثير من الأحيان، يصف الطبيب اختبار PCR معقد. تبلغ تكلفة الفحص الذي يتكون من تحديد ستة مسببات الأمراض حوالي 1500 روبل.
- قبل التبرع باللعاب يجب الامتناع عن الأكل وتناول الأدوية قبل 4 ساعات من جمع المادة. مباشرة قبل الإجراء، اشطف فمك بالماء المغلي.
- وينبغي أيضًا اتباع القواعد المذكورة أعلاه عند أخذ عينة من السطح الداخلي للخد. بعد الشطف ينصح بإجراء تدليك خفيف للبشرة لتحرير إفرازات الغدة.
- عادة ما يتم جمع البول في المنزل. للقيام بذلك، تحتاج إلى تنظيف الأعضاء التناسلية جيدا. يجب جمع 50-60 مل من البول في وعاء بلاستيكي معقم. وللتأكد من نقاء المادة، ينصح للنساء بإدخال سدادة قطنية في المهبل، وللرجال أن يقوموا بسحب ثنية الجلد إلى الخلف قدر الإمكان. لا يمكنك التبرع بالمواد خلال فترة الحيض.
- للتبرع بالحيوانات المنوية، يجب الامتناع عن الجماع لمدة 3 أيام قبل جمع المادة. كما ينصح الأطباء بتجنب زيارة الساونا وأخذ حمام ساخن وشرب الكحول والأطعمة الحارة. يجب عليك الامتناع عن التبول قبل 3 ساعات من الاختبار.
- على سبيل المثال، إذا تم إجراء اختبار PCR للكلاميديا، فيُنصح كل من النساء والرجال بالحصول على راحة جنسية لمدة 3 أيام. قبل أسبوعين من الاختبار، يجب ألا تتناول الأدوية المضادة للبكتيريا. لمدة أسبوع، تحتاج إلى التوقف عن استخدام المواد الهلامية الحميمة والمراهم والتحاميل المهبلية والغسل. قبل 3 ساعات من الاختبار يجب عليك الامتناع عن التبول. أثناء فترة الحيض، لا يتم جمع المواد، ولكن بعد 3 أيام فقط من توقف النزيف، يمكن أخذ مسحة من الجهاز البولي التناسلي.
لكي تكون النتائج موثوقة عند إجراء دراسة PCR، تحتاج إلى إجراء الاختبار، باتباع توصيات الإعداد الأولي للتشخيص:
PCR أثناء الحمل
أثناء انتظار الطفل، فإن العديد من الأمراض المعدية التي تنتقل عن طريق الاتصال الجنسي تكون خطيرة للغاية التطور الطبيعيالجنين يمكن أن تسبب الأمراض المنقولة جنسيًا تأخر النمو داخل الرحم أو الإجهاض أو الولادة المبكرة والعيوب الخلقية للطفل. ولذلك، فمن المهم للغاية أن تذهب إلى المراحل الأولىفحص الحمل بطريقة PCR. يجب إجراء الاختبار عند التسجيل - لمدة تصل إلى 12 أسبوعًا.
يتم جمع المادة من قناة عنق الرحم باستخدام فرشاة خاصة. الإجراء غير مؤلم ولا يشكل خطرا على الطفل. عادة، أثناء الحمل، يتم إجراء تحليل الكلاميديا باستخدام طريقة PCR، وكذلك ureaplasmosis، mycoplasmosis، الفيروس المضخم للخلايا، الهربس، وفيروس الورم الحليمي البشري. تسمى هذه المجموعة من الفحوصات PCR-6.
PCR لتشخيص فيروس نقص المناعة البشرية
نظرا لأن الطريقة حساسة للغاية للتغيرات في الجسم والظروف التشخيصية، يمكن أن تؤثر العديد من العوامل على النتيجة. ولذلك، فإن تحليل PCR لعدوى فيروس نقص المناعة البشرية ليس طريقة موثوقة؛ فعاليته هي 96-98٪. وفي 2-4% المتبقية من الحالات، يعطي الاختبار نتائج إيجابية كاذبة.
ولكن في بعض الحالات، لا يمكنك الاستغناء عن تشخيص فيروس نقص المناعة البشرية PCR. يتم إجراؤه عادةً على الأشخاص الذين لديهم نتيجة ELISA سلبية كاذبة. تشير مثل هذه المؤشرات إلى أن الشخص لم يطور بعد أجسامًا مضادة للفيروس ولا يمكن اكتشافها دون زيادة عددها عدة مرات. وهذا هو بالضبط ما يمكن تحقيقه عن طريق إجراء فحص الدم باستخدام طريقة PCR.
مثل هذا التشخيص ضروري أيضًا للأطفال في السنة الأولى من العمر المولودين من أم مصابة بفيروس نقص المناعة البشرية. الطريقة هي الطريقة الوحيدةتحديد موثوق لحالة الطفل.
PCR لتشخيص التهاب الكبد
تتيح لك طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل اكتشاف الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد A، B، C قبل فترة طويلة من تكوين الأجسام المضادة للعدوى أو ظهور أعراض المرض. يعتبر اختبار PCR لالتهاب الكبد C فعالا بشكل خاص، لأنه في 85٪ من الحالات يكون هذا المرض بدون أعراض وبدون علاج في الوقت المناسب يصبح مزمنا.
سيساعد الكشف عن العامل الممرض في الوقت المناسب على تجنب المضاعفات والعلاج على المدى الطويل.
فحص PCR الشامل
تحليل PCR الشامل: الفحص باستخدام طريقة التفاعل المتسلسل البوليميسي، والذي يتضمن التحديد المتزامن لعدة أنواع من العدوى: الميكوبلازما التناسلية، الميكوبلازما البشرية، الغاردنريلة المهبلية، المبيضات، المشعرة، الفيروس المضخم للخلايا، الهربس من النوع 1 و 2، السيلان، فيروس الورم الحليمي البشري. يتراوح سعر هذه التشخيصات من 2000 إلى 3500 روبل. اعتمادًا على العيادة والمواد والمعدات المستخدمة وكذلك نوع التحليل: نوعي أو كمي. سيقرر الطبيب أيهما ضروري في حالتك. في بعض الحالات، يكفي تحديد وجود العامل الممرض، وفي حالات أخرى، على سبيل المثال، في حالة الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية، يلعب العيار الكمي دورًا مهمًا. عند تشخيص جميع مسببات الأمراض المذكورة أعلاه، يسمى الفحص “تحليل PCR-12”.
فك نتائج التحليل
فك رموز تحليل PCR ليس بالأمر الصعب. لا يوجد سوى مقياسين للمؤشر - " نتيجة ايجابية"و"النتيجة السلبية". إذا تم الكشف عن العامل الممرض، يمكن للأطباء تأكيد وجود المرض بثقة بنسبة 99٪ والبدء في علاج المريض. مع الطريقة الكمية لتحديد العدوى، سيتم الإشارة إلى المؤشر الرقمي للبكتيريا المكتشفة في العمود المقابل. يمكن للطبيب فقط تحديد مدى المرض ووصف العلاج اللازم.
في بعض الحالات، على سبيل المثال، عند تحديد الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية باستخدام طريقة PCR، إذا كانت النتيجة سلبية، يصبح من الضروري إجراء فحوصات إضافية للتأكد من المؤشرات التي تم الحصول عليها.
أين يمكنني إجراء الاختبار؟
أين يتم إجراء اختبار PCR: في عيادة عامة أم في مختبر خاص؟ لسوء الحظ، في المؤسسات الطبية البلدية، غالبا ما تكون المعدات والأساليب قديمة. ولذلك فمن الأفضل إعطاء الأفضلية للمختبرات الخاصة المجهزة بالمعدات الحديثة والموظفين المؤهلين تأهيلا عاليا. بالإضافة إلى ذلك، في العيادة الخاصة سوف تحصل على النتائج بشكل أسرع بكثير.
في موسكو، تقدم العديد من المختبرات الخاصة اختبار PCR لمختلف أنواع العدوى. على سبيل المثال، في عيادات مثل "Vita"، "Complex Clinic"، "Happy Family"، "Uro-Pro"، يتم إجراء تحليل PCR. سعر الفحص من 200 روبل. لتحديد مسبب مرض واحد.
يمكن أن نستنتج أن تشخيص الأمراض المعدية باستخدام طريقة PCR في معظم الحالات هو وسيلة سريعة وموثوقة للكشف عن العامل الممرض في الجسم في المراحل المبكرة من الإصابة. ولكن لا يزال، في بعض الحالات، يستحق اختيار طرق التشخيص الأخرى. يمكن للأخصائي فقط تحديد الحاجة لمثل هذه الدراسة. يتطلب فك رموز تحليل PCR أيضًا اتباع نهج احترافي. اتبع توصيات طبيبك ولا تقم بإجراء اختبارات غير ضرورية بنفسك.
