Reakcija fiksacije komplementa(RSK) je složena dvostupanjska serološka reakcija. Koristi pet sastojaka koji čine dva sustava: antigen, antitijelo, komplement (prvi sustav); ovčji eritrociti senzibilizirani (tretirani) hemolitičkim serumom koji sadrži za njih specifična protutijela (drugi, ili indikatorski, hem sustav). U ovom slučaju, interakcija antitijela s antigenom u prvoj fazi reakcije dovodi do stvaranja imunološkog kompleksa koji adsorbira komplement, ali to se ne može vizualno otkriti. U drugoj fazi, hemski sustav se koristi kao indikator vezanja komplementa na kompleks antigen-antitijelo, koji je, budući da je imunološki kompleks, također sposoban adsorbirati ga. U konačnici, dva su moguća ishoda reakcije. Ako protutijelo i antigen odgovaraju jedno drugom i komplement je adsorbiran formiranim kompleksom, neće doći do lize eritrocita hemskog sustava. Ako se antitijelo ne podudara s antigenom, i obrnuto, komplement će se, ostajući slobodan, pridružiti hemskom sustavu i izazvati hemolizu.

Kao i drugi serološki testovi, RSK se može koristiti za otkrivanje specifičnih protutijela protiv poznatog antigena ili za otkrivanje antigena protiv poznatih protutijela.

opće karakteristike RSC sastojci.

1. ISPITIVANI SERUM prije postavljanja reakcije zagrijava se u vodenoj kupelji 30 minuta kako bi se inaktivirao vlastiti komplement te se razrijedi počevši od 1:5.

2. ANTIGEN mogu biti kulture bakterija, njihovi lizati, virusi i materijali koji sadrže viruse, ekstrakti patološki promijenjenih organa i tkivni lipidi.

3. KOMPLEMENT - serum zamorca dobiven na dan pokusa. Trenutno se koristi industrijski suhi komplement.

4. HEMOLITIČKI SUSTAV sastoji se od hemolitičkog seruma pomiješanog u jednakim volumenima i 3% suspenzije ovčjih eritrocita po sedimentu. Za senzibilizaciju eritrocita hemolizinom, smjesa se drži u termostatu na temperaturi od 37°C 30 minuta.

Izjava o glavnom eksperimentu RSC-a. U 1 epruvetu dodaju se SERUM, ANTIGEN I KOMPLEMENT, u treću epruvetu dodaju se serum, komplement i izotonična otopina natrijevog klorida umjesto antigena (KONTROLA SERUMA), u treću epruvetu dodaju se antigen, komplement i ista otopina natrijevog klorida (KONTROLA ANTIGENA). Epruvete se stave u termostat na temperaturu od 37°C na 1 sat. Istodobno se priprema hemolitički sustav koji se zatim dodaje u sve tri epruvete nakon skidanja stalka s termostata. Nakon miješanja hemskog sustava sa sastojcima triju epruveta, potonje se ponovno stavljaju u termostat na 1 sat, a nakon tog vremena uzimaju se u obzir rezultati RSC.

Kada se uzme u obzir RSC, intenzitet reakcije označen je plusevima: "++++" - oštro pozitivna reakcija s potpunim kašnjenjem hemolize, tekućina u epruveti je bezbojna, svi eritrociti su se slegli na dno; "+++", "++" - pozitivna reakcija, karakterizirana povećanjem boje tekućine zbog hemolize i smanjenjem broja eritrocita u sedimentu; "+" - slabo pozitivna reakcija, tekućina je intenzivno obojena, na dnu epruvete nalazi se mala količina crvenih krvnih zrnaca. Negativna reakcija označen je znakom "-", dok se uočava potpuna hemoliza, tekućina u epruveti ima intenzivnu ružičastu boju ("lak krv").

RSK je vrlo složena, ali vrlo osjetljiva specifična reakcija. Široko se koristi u dijagnostici sifilisa, kronični oblik gonoreja, hripavac, aktinomikoza, sve rikecioze i virusne infekcije.

Vezani imunosorbentni test.

Metodu su ranih 70-ih neovisno razvile tri skupine znanstvenika. Metoda je slična RIA, ali se temelji na označavanju Ag ili Ab koji ulazi u reakciju s enzimom. Vzd oznake s podlogom obično prati promjena boje medija. Trenutno su stvorene brojne modifikacije ove metode, ali najraširenija je heterogena ELISA na čvrstoj fazi (solid-phase). razlikovati:

1) IZRAVNA ELISA KRUTE FAZE. U ovom slučaju:

1. Serum s Ab inkubira se s Ag fiksiranim na čvrstu podlogu (najčešće je to plastična mikropločica).

2. Ab koji nije vezan Ag uklanja se ponovljenim pranjem.

3. Enzimom obilježeni serum dodaje se Ag vezanom za Ab.

4. Odredite broj enzima markera vezanog na At.

2) KOMPETITIVNA ELISA KRUTE FAZE.

1. Dodan je serum. Ako sadrži specifične Abs, onda se oni vežu na Ag fiksiran na čvrstu podlogu. Ako nema specifičnih Abs, tada Ag nije vezan.

2. Kada se dodaju antitijela specifična za fiksirani Ag, u prvom slučaju, ona neće imati s čime komunicirati (većina Ag je već vezana) Þ sadržaj markera je nizak. U drugom slučaju, specifični Abs će se vezati na Ag, i neće biti isprani tijekom pranja Þ visok sadržaj markera.

Slično, možda. ANTITIJELA su fiksirana, a razne tvrtke proizvode upravo tablete s već fiksiranim Atom.

U usporedbi sa klasične metode otkrivanje antigena, ova metoda omogućuje izravno registriranje njihove interakcije s protutijelima, a ne sekundarne manifestacije (aglutinacija, precipitacija ili hemoliza). Metoda je vrlo OSJETLJIVA (dovoljna je koncentracija od 1ng/ml).

Odrediti: Klamidija, klostridija, HIV itd.

8. Reakcija fagocitoze.

Fagocitozu provode mikrofagi i makrofagi. Stadiji fagocitoze: približavanje, lijepljenje, uranjanje, probava.

Procjena funkcionalne aktivnosti fagocitnih stanica.

Količina fagocitna aktivnost granulocita i monocita procjenjuje se u punoj krvi, u suspenziji leukocita ili u obogaćenim frakcijama fagocitnih stanica. Kao standardni objekti fagocitoze koriste se monodisperzne čestice lateksa promjera 1,0-2,0 μm, suspenzija toplinski ubijenih bakterija ili gljivica sličnih kvascima.

Fagociti se pomiješaju s fagocitiranim materijalom u omjeru 1:10 ili 1:100 i inkubiraju na 37°C 30 minuta uz stalno miješanje. Epruvete se zatim centrifugiraju i talog se resuspendira u kapi krvnog seruma da se pripremi razmaz. U razmazima fiksiranim bojom May-Chryunwald i obojenim prema Romanovsky-Giemsi izračunava se postotak fagocitnih stanica (FP - fagocitni indeks) i broj apsorbiranih čestica po 1 stanici (PF - fagocitni broj).

Na zdrava osoba FP=40-80%, PF=1-5.

9. Dijagnostikumi.

Dijagnostikumi su suspenzija određenih mikrobnih stanica ubijenih zagrijavanjem ili formalinom s poznatim sadržajem stanica po jedinici volumena. Suspenzije živih bakterija također se mogu koristiti kao antigen. Fenomen reakcije javlja se unaprijed nakon dva sata (na 37 0 C), konačni rezultat se uzima u obzir na sobnoj temperaturi nakon 18-20 sati. Za dijagnostiku je pozitivna reakcija od interesa samo u određenom titru seruma, koji služi kao dijagnostika. Dakle, s brucelozom, dijagnostički titar je 1: 200, a s tula-remijom -1: 100. Za otkrivanje protutijela mogu se provesti ekspresne reakcije aglutinacije (vrijeme obračuna je nekoliko minuta). Na primjer: 1. Reakcija kapi krvi kod tularemije. Na kap pune krvi bolesnika na posebnom staklu stavi se kap destilirane vode (za hemolizu) i kap tularemijskog dijagnostikuma. Reakcija se javlja unutar 1-2 minute, aglutinati su jasno vidljivi u obliku bjelkastih grudica. 2. Na staklu za brucelozu provodi se ekspresna reakcija aglutinacije po Heddelsonu.

Ove reakcije ne dopuštaju određivanje količine protutijela u serumu.b) identificirati čistu kulturu uzročnika zaraznih bolesti. U tu svrhu, imunodijagnostički

aglutinirajući serumi koje proizvode cjepiva i instituti za serume imuniziranjem životinja cijelim mikrobnim stanicama. Radi pouzdanosti, bolje je koristiti adsorbirane serume, tako da sadrže samo antitijela koja odgovaraju određenoj vrsti ili tipu mikroorganizama.

Principi dobivanja imunoloških seruma.

Imunološki serum (antiserum) je krvni serum koji sadrži antitijela na određeni antigen. U većini slučajeva imunosni (dijagnostički) serumi na mikrobne, tkivne i druge antigene dobivaju se eksperimentalno imunizacijom životinja odgovarajućim antigenima.

Među glavnim zahtjevima za antiserume su njihova visoka specifičnost i dovoljan sadržaj protutijela. Prema specifičnosti razlikuju se polivalentni (polispecifični) i monovalentni (monospecifični) antiserumi. Polivalentni serumi sadrže protutijela na mnoge antigene, monospecifična - na jedan specifičan antigen. Monospecifične serume možete dobiti:

1) korištenje visoko pročišćenih antigena za imunizaciju životinja,

2) čišćenje nativnih seruma od protutijela nepoželjne specifičnosti.

Za ovu upotrebu:

1) imunoafinitetna metoda, koja se temelji na vezanju protutijela određene specifičnosti na odgovarajuće antigene imobilizirane na čvrstom nosaču, nakon čega slijedi odvajanje nastalih kompleksa AG-AT i izolacija protutijela;

2) metoda adsorpcije po Castellaniju. U tu svrhu koriste se mikroorganizmi koji sadrže sve skupni antigeni, adsorbirajući tako homologne anti-

tijelo. Takvi adsorbirani monospecifični antiserumi sadrže protutijela na različite determinante molekule antigena, koja su heterogena u klasi (podklasi)

Reakcija fiksacije komplementa (RCC) sastoji se u tome da, kada antigeni i antitijela odgovaraju jedno drugom, tvore imunološki kompleks na koji je preko Fc fragmenta antitijela vezan komplement (C), tj. komplement je vezan za antigen- kompleks antitijela. Ako se kompleks antigen-antitijelo ne formira, tada komplement ostaje slobodan.

Specifična interakcija AG i AT praćena je adsorpcijom (vezivanjem) komplementa. Budući da se proces fiksacije komplementa ne vidi vizualno, J. Bordet i O. Zhangu predložili su da se kao indikator koristi hemolitički sustav (ovčji eritrociti + hemolitički serum), koji pokazuje je li komplement fiksiran kompleksom AG-AT. Ako AG i AT odgovaraju jedan drugome, tj. formiran je imunološki kompleks, tada se komplement veže na taj kompleks i ne dolazi do hemolize. Ako AT ne odgovara AG, tada se kompleks ne formira, a komplement, ostajući slobodan, povezuje se s drugim sustavom i uzrokuje hemolizu.

Napredak reakcije

Reakcija se odvija u dvije faze koje uključuju dva sustava; bakterijske i hemolitičke. Prva reakcija (specifična) uključuje antigen 4-+ antitijelo + komplement. Pozitivan rezultat reakcije, koji se javlja kada antitijela odgovaraju antigenu, karakterizira stvaranje specifičnog bakterijskog kompleksa antigen-antitijelo s adsorbiranim ili, kako kažu, "vezanim" komplementom. Ostajući nevidljiv, kompleks ne uzrokuje nikakve vanjske promjene sredine u kojoj je nastala. Negativan rezultat CSC javlja se kada nema specifičnog afiniteta između antigena i serumskog protutijela i karakterizira ga zadržavanje slobodnog aktivnog komplementa. Prva faza RSC može se provesti u termostatu na 37°C (1-2 sata) ili u hladnjaku na 3-4°C (18-20 sati). S produljenim stvaranjem imunološkog kompleksa antigen-antitijelo na hladnoći, dolazi do potpunijeg vezanja komplementa i, kao rezultat toga, povećava se osjetljivost reakcije. Prilikom postavljanja usporednih pokusa sovjetski imunolog akad. V. I. Ioffe i njegovi studenti pokazali su da se u uvjetima dugotrajne fiksacije komplementa na hladnoći mogu uhvatiti 100-500 puta manje količine antigena i dobiti pozitivni rezultati pri visokim razrjeđenjima imunološkog seruma nego u eksperimentu fiksacije komplementa na temperaturi od 37 ° C u unutar 1-2 sata Druga faza reakcije (indikator) javlja se između reagensa hemolitičkog sustava (smjesa 3% suspenzije eritrocita i hemolitičkog seruma u jednakim volumenima) pri temperaturi od 37 ° C samo u prisutnosti komplementa koji ostaje slobodan od prve faze reakcije (negativna reakcija) . U nedostatku slobodnog aktivnog komplementa ne dolazi do hemolize eritrocita pod djelovanjem specifičnih hemolizina (reakcija je pozitivna).

Komponente

Test vezanja komplementa (RCC) je složeni serološki test. Za njegovu provedbu potrebno je 5 sastojaka i to: AG, AT i komplement (prvi sustav), ovčji eritrociti i hemolitički serum (drugi sustav).

Antigen za CSC mogu biti kulture raznih ubijenih mikroorganizama, njihovi lizati, komponente bakterija, patološki promijenjeni i normalni organi, tkivni lipidi, virusi i materijali koji sadrže virus.

Kao dodatak koristi se svježa ili suha sirutka. zamorac.

mehanizam reakcije

RSK se provodi u dvije faze: 1. faza - inkubacija smjese koja sadrži tri komponente antigen + antitijelo + komplement; 2. faza (indikator) - detekcija slobodnog komplementa u smjesi dodavanjem hemolitičkog sustava koji se sastoji od ovčjih eritrocita i hemolitičkog seruma koji sadrži protutijela na njih. U 1. fazi reakcije, tijekom stvaranja kompleksa antigen-antitijelo, dolazi do vezanja komplementa, a zatim u 2. fazi neće doći do hemolize eritrocita senzibiliziranih protutijelima; reakcija je pozitivna. Ako antigen i antitijelo ne odgovaraju jedno drugome (nema antigena ili antitijela u ispitivanom uzorku), komplement ostaje slobodan i u 2. fazi će se pridružiti kompleksu eritrocit-antieritrocitno antitijelo, uzrokujući hemolizu; reakcija je negativna.

Primjena

Fiksacija komplementa može se koristiti za:
1) otkrivanje specifičnih protutijela u nepoznatom serumu na temelju njihove interakcije s antigenom poznate prirode;
2) proučavanje svojstava antigena u reakciji s poznatim specifičnim serumom. Priprema sastojaka za postavljanje RSK.

1. Krvni serum dobiven za studiju, uoči postavljanja reakcije, zagrijava se u vodenoj kupelji na 56°C 30 minuta kako bi se inaktivirao vlastiti komplement. Inaktivirani serum može se čuvati na 3-4°C 5-6 dana. Na dan pokusa serum se razrijedi izotoničnom otopinom natrijevog klorida u omjeru 1:5 (0,1 ml ispitivanog seruma + 0,4 ml izotonične otopine natrijevog klorida).

2. Antigen za postavljanje RSK mogu biti kulture različitih mikroba, bakterijski proteini i ekstrakti dobiveni iz mikrobnih kultura, patološki promijenjenih i normalnih organa i tkiva. Značajke pripreme antigena određene su prirodom infektivni proces i karakteristike njegovog uzročnika.

3. Komplement je mješavina seruma dobivena od 3-5 zdravih zamorčića, ili suhi komplement u ampulama.

Neposredno prije upotrebe serum zamorca razrijedi se izotoničnom otopinom atrijevog klorida u omjeru 1:10, čime se dobije osnovna otopina.

4. Hemolitički serum inaktivira se zagrijavanjem na temperaturi od 56 °C tijekom 30 minuta prije postavljanja pokusa. Trostruki titar hemolitičkog seruma koristi se za utvrđivanje osnovnog iskustva RSK, kao i za titraciju komplementa i antigena. Na primjer, ako je titar hemolitičkog seruma 1:1800, u reakciji se koristi razrjeđenje seruma od 1:600.

5. Eritrociti se dobivaju iz defibrinirane krvi ovaca. Krv za uklanjanje fibrinskih filmova filtrira se kroz troslojni filter od gaze. Dobiveni filtrat se centrifugira, serum se aspirira i ocijedi, a eritrociti se 3-4 puta isperu centrifugiranjem izotopnom otopinom natrijevog klorida. Pri posljednjem ispiranju eritrocita sloj supernatanta tekućine treba biti potpuno proziran. Od ispranih eritrocita priprema se 3% suspenzija u izotoničnoj otopini natrijevog klorida. Nakon što su sastojci uključeni u CSC pripremljeni na gore navedeni način, počinju titrirati hemolitički serum, komplement i antigen.



reakcija hemolize.

Reakcija hemolize (RG) - Ovo je uništavanje crvenih krvnih stanica djelovanjem protutijela uz sudjelovanje komplementa.

RG komponente.

1. Antigen- 3% suspenzija eritrocita u izotoničnoj otopini natrijevog klorida;

2. Antitijelo - hemolitički serum- serum koji sadrži antitijela na eritrocite (hemolizini); serum se dobiva imunizacijom kunića eritrocitima ovna;

3. Upotpuniti, dopuna- sustav krvnih proteina koji se adsorbiraju na kompleksu antigen-antitijelo i tvore membranski napadni kompleks koji uništava antigen, tj. uništava eritrocite ili na drugi način uzrokuje lizu eritrocita ( hemoliza). Kao dodatak, svježe pripremljeno krvni serum zamoraca.

Ako se u epruvetu stave eritrociti, hemolitički serum i komplement u određenim količinama, tada će za nekoliko minuta doći do razaranja (hemolize) eritrocita, uslijed čega će tamnocrvena smjesa poprimiti ružičastu boju ("lakirana krv") .

Reakcija hemolize se koristi kao indikator pri postavljanju reakcije vezanja komplementa.

Test vezanja komplementa (CFR) je složena serološka reakcija koja uključuje 2 sustava antigen-antitijelo i komplement. 1. sustav - specifično, 2. - hemolitička sustav.

Ovu su reakciju razvili J. Bordet i O. Zhangu, koji su otkrili da se tijekom formiranja kompleksa antigen-antitijelo na ovaj kompleks veže komplement. Vidljiv učinak pri čemu nije vidljiv, dakle, za otkrivanje vezanja komplementa (i, posljedično, za otkrivanje formiranja kompleksa antigen-antitijelo kada odgovaraju jedno drugom), i.e. kao indikator 2. - koristi se hemolitički sustav.

RSK se češće koristi za serodijagnostiku (dokazivanje protutijela na uzročnika bolesti u krvnom serumu bolesnika). ) gonoreja, sifilis, veliki kašalj, tifus i druge rikecioze i mnoge virusne bolesti. RSK se također koristi za identifikaciju seroida.

komponente RSK.

1. Antigen- ekstrakti mikroba, hapteni, rjeđe - suspenzija mikroba, tj. antigen može biti ili korpuskularni (netopljiv) ili molekularni (topljiv).

2 . Antitijelo- krvni serum bolesne osobe (za serodijagnostiku) ili imunološki dijagnostički serum koji sadrži poznata protutijela (za seroidentifikaciju).

3. Ovčji eritrociti – antigeni hemolitička reakcija.

4. Hemolitički serum- serum koji sadrži protutijela na ovčje eritrocite. Serum primiti imunizacijom kunića eritrocitima ovna.

5. Upotpuniti, dopuna– svježe pripremljeni serum zamorca (tekući ili liofilizirani).

6. elektrolit- izotonična otopina natrijeva klorida.

RSK postavka.

Prije postavljanja pokusa titrira se antigen, bolesnikov serum, hemolitički serum i komplement (određuje im se titar). Bolesnikov serum se zagrijava na 56°C 30 minuta.

RSC se provodi u 2 faza.

I faza - specifično: u jednoj epruveti priprema se određeni sustav - pomiješaju se jednake količine poznatog antigena, seruma bolesnika i komplementa, u drugoj epruveti priprema se hemolitički sustav - mješavina ovčjih eritrocita i hemolitičkog seruma, epruvete se stavljaju u termostat na 37 °C 30 minuta. Istovremeno se pripremaju kontrole za antigen, komplement i hemosustav, kontrolni uzorci sa serumom poznato bolesne osobe (pozitivan serum) i poznato zdrave osobe (negativan serum) te se također stavljaju u termostat na 30 minuta.

II faza - indikator: ista količina hemolitičkog sustava dodaje se početnoj smjesi i svim kontrolnim epruvetama, a rezultati reakcije se uzimaju u obzir nakon držanja u termostatu 30 minuta.

Računovodstvo za rezultate RSC provedeno sa savršenim rezultatima u kontrolama .

pozitivna reakcija(osoba je bolesna i njen serum sadrži odgovarajuća protutijela na uzročnika bolesti – antigen): u fazi I nastaju kompleksi antigen-antitijelo u specifičnom sustavu, s kojim se veže komplement, nakon dodavanja hemolitičkog sustava u fazi. II, hemoliza se ne opaža, budući da je komplement vezan za 1. specifični sustav. Vidljiv učinak- obrazovanje sediment eritrocita.

Negativna reakcija(osoba je zdrava iu serumu nema protutijela na uzročnika bolesti): ne stvaraju se kompleksi antigen-antitijelo i komplement u fazi I ostaje slobodan, nakon dodavanja hemolitičkog sustava u fazi II, komplement se veže na komplekse antigen-antitijelo koji su ovdje nužno prisutni (to su eritrocit- antieritrocitna antitijela) i izaziva hemolizu eritrocita. Vidljiv učinak- hemoliza eritrocita, "lak krvi".

U dijagnostici zaraznih bolesti također se koriste reakcija neutralizacije (RN) toksina s antitoksičnim serumom, reakcija imunofluorescencije (RIF), radioimunotest (RIA), enzimski imunotest (ELISA).

U Reakcija se temelji na dva fenomena - bakteriolizi i hemolizi. Komplement je uključen u njihovu manifestaciju. Stoga se u RSC koriste dva sustava komponenti: 1) osigurava fenomen bakteriolize i koristi se u dijagnostičke svrhe; 2) hemolitička, indikatorska, pomoćna; omogućuje vam da ustanovite je li komplement vezan ili nije vezan u prvom sustavu (vidi shemu boja na slici I). Prethodno se kao antigen koristila suspenzija bakterija, pa je prvi sustav nazvan bakteriolitički (u pozitivnim slučajevima dolazi do lize bakterija).

Postavljanje RSC-a provodi se u dvije faze. U prvoj fazi priprema se bakteriolitički sustav: 0,5 ml ispitivanog seruma pomiješa se s antigenom u epruvetama, dodaje se komplement u strogo određenoj dozi (titru). Mješavina antigen - serum-komplement (bakteriolitički sustav) drži se u vodenoj kupelji (ili termostatu) 20 ... 40 minuta na 37 ... 38 "C. Rezultat interakcije komponenata u epruveti je nevidljiv, tekućina ostaje prozirna i bezbojna.Za određivanje, kontaktirali Ako je komplement u bakteriolitičkom sustavu, provodi se drugi stupanj reakcije: u epruvete se dodaju komponente hemolitičkog sustava – isprani ovčji eritrociti i inaktivirani hemolitički serum, kao što je prikazano na shemi.Sve komponente bakteriolitičkog sustava se protresu da se pomiješaju u epruveti, stave u vodenu kupelj na 37... 38 "C 20...40 min. Zatim se dodaju komponente gemološkog sustava, sve se drugi put protrese i ponovno stavi u vodenu kupelj 10-15 minuta.

Preliminarni rezultat. Ako je serum dobiven od bolesne životinje, tada sadrži antitijela koja se spajaju sa specifičnim antigenom. Na taj kompleks (antigen – antitijelo) veže se komplement – ​​ne dolazi do hemolize, nalaz je pozitivan.

U serumu zdrave životinje nema antitijela: kompleks antigen-antitijelo nije formiran, komplement u bakteriološkom sustavu se ne veže. Kada se dodaju eritrociti i hemolizin (ovo je antigen i antitijelo), komplement reagira s ovim kompleksom - doći će do hemolize, rezultat je negativan (vidi sliku II u boji).

Završni račun rezultata. Epruvete se ostavljaju na sobnoj temperaturi 15...20 sati.Ako je serum u bakteriolitičkom sustavu bio od bolesne životinje, u epruveti se stvara specifični kompleks antigen-antitijelo, koji adsorbira (veže) sav dodani komplement. Posljedično, u drugom, hemolitičkom, sustavu hemolize neće doći, eritrociti će se taložiti na dno epruvete, supernatant je proziran. RSC nalaz je pozitivan.

Ako u ispitivanom serumu nema specifičnih protutijela na korišteni antigen (u slučajevima kada je serum zdrave životinje), kompleks antigen-protutijelo ne nastaje u bakteriolitičkom sustavu i stoga se komplement u ovom sustavu ne stvara. adsorbira, ali ostaje slobodan. Dodavanjem komponenti hemolitičkog sustava (u drugoj fazi reakcije) dolazi do interakcije komplementa s drugim kompleksom (hemolizin – eritrociti), dolazi do hemolize eritrocita – ne stvara se talog, tekućina u epruveti je lakirano crvena. . Nalaz RSK je negativan.

RSK. koristiti: 1) za otkrivanje specifičnih protutijela u serumu bolesne životinje (u dijagnozi bruceloze, peripneumonije, sakazije, leptospiroze, tripanosomijaze itd.); 2) za otkrivanje specifičnog antigena (bakterijskog ili virusnog) u ispitivanom materijalu u prisutnosti specifičnog imunološkog seruma.

Da biste postavili RSK, morate imati: uzorke seruma primljene za istraživanje; dva seruma, poznata pozitivna (standard, daje pozitivan rezultat), i dva normalna seruma. Svi serumi u razrjeđenju 1:10 inaktiviraju se na 56...58 °C 30 minuta; antigen u razrjeđenju prema titru; komplement razrijeđen u skladu s utvrđenim titrom tijekom titracije u bakteriolitičkom sustavu; hemolizin u radnom titru; eritrociti ovna (I: 40); fiziološka otopina, graduirane pipete, epruvete, stalci, vodena kupelj na 37...38 °C.

Prije postavljanja RSK, ovčja krv se defibrinira, eritrociti se ispiru fiziološka otopina centrifugiranjem dok supernatant ne postane potpuno proziran, koji se odsisa, a istaloženi eritrociti se razrijede u fiziološkoj otopini 1:40 (2,5%). Antigen se razrjeđuje prema titru navedenom na etiketi od strane biotvornice. Hemolizin i komplement se titriraju prije postavljanja RSK.

Antigen za CSC priprema se u biotvornicama. Obično su to ekstrakti uništenih mikrobnih suspenzija (ili tkiva koja sadrže virus). Antigeni ne bi trebali imati hemolitički učinak, što se kontrolira tijekom reakcije (1 ... 2 doze antigena i 0,5 ml suspenzije eritrocita ulije se u epruvetu: ne bi trebalo biti hemolize). Na ampuli s antigenom biotvornica označava da je namijenjen za RSK (sapny, bruceloza ili drugo). Na kutiji za pakiranje je naznačen broj serije, datum proizvodnje, rok valjanosti, aktivnost antigena, odnosno u kojem razrjeđenju treba koristiti pri postavljanju RSK (1:100, 1:150 itd.). U nekim bolestima drugi materijali služe kao antigeni; primjerice za dijagnozu peripneumonije velikog goveda antigen za CSC je limfa teleta eksperimentalno zaraženog supkutano ili intrapleuralno. Uz dugotrajno skladištenje antigena, njihov se titar ponovno provjerava u laboratoriju prema posebnoj shemi titracije.

Testni serumi primljeni za studiju razrijede se fiziološkom otopinom 1: 5 ili 1: 10, inaktiviraju se zagrijavanjem u vodenoj kupelji kako bi se uništio vlastiti komplement tijekom 30 minuta na 56 ... 58 "C (serumi magaraca, mazgi, mazgi - na 61°C).

Hemolizin se priprema u biotvornicama hiperimunizacijom kunića ispranim eritrocitima ovna. Da bi se to učinilo, kunići se ubrizgavaju intravenski 4 ... 5 puta u intervalima od 2 ... 3 dana s 40 ... 50% suspenzijom eritrocita. Tjedan dana nakon zadnje injekcije uzima se krv kunića, serum se sterilno aspirira, inaktivira, konzervira glicerolom 1:1 ili 0,5% fenolom, titrira, ulije u ampule. U laboratorijima se prije postavljanja RSK ponovno titriraju.

Shema titracije hemolizina. Pripremite: i) razrjeđenje komplementa 1:20; 2) hemolizin 1:100 (0,2 ml hemolizina + 9,8 ml fiziološke otopine); 3) suspenzija ovčjih eritrocita 1:40; 4) fiziološka otopina NaCl.

Za postavljanje reakcije titracije, dva reda epruveta stavljaju se u stalak - jedan pomoćni samo za pripremu razrjeđenja hemolizina, drugi - za samu titraciju. Početno razrjeđenje hemolizina 1:100 dodaje se u prvu epruvetu svakog reda, a zatim se radi serijsko razrjeđenje. Sve epruvete se protresu i stave u vodenu kupelj na 37...38°C 10...15 minuta. Uzimajući u obzir rezultat: u ovom primjeru, najmanja količina (ili njezino najveće razrjeđenje) koja je dala potpunu hemolizu je 1: 2000, tj. ovo je njezin stvarni titar. Radni titar je 2 puta koncentriraniji - 1:1000.

0,5 ml (označeno strelicama) svakog razrjeđenja iz epruveta prvog reda prenese se u zasebne epruvete drugog reda. U sve epruvete drugog reda dodajte 0,5 ml komplementa (1:20), 0,5 ml eritrocita ovna (2,5% suspenzija ili 1:40) i 1 ml fiziološke otopine, tako da volumen tekućine u svakoj bočici bude 2,5 ml.

Bilješka. S obzirom na to da će u konačnom stvrdnjavanju RSC sudjelovati 5 komponenti od po 0,5 ml, koje će činiti volumen od 2,5 ml, taj se volumen promatra tijekom cijelog rada.

Epruvete se protresu i stave u vodenu kupelj 10-15 minuta. Do hemolize će prvenstveno doći u epruvetama s visokim sadržajem hemolizina (najmanje razrjeđenje mu je 1:500, 1:1000...). Najmanja količina hemolizina (njegovo najveće razrjeđenje), koja je u ovim uvjetima izazvala potpunu hemolizu eritrocita, naziva se ograničavajući (stvarni) titar hemolizin. Za daljnji rad koristi se hemolizin 2 puta koncentriraniji, odnosno u dvostrukoj količini, dvostruki titar, što je tzv. radni naslov. Na primjer, ako je stvarni titar I:2500 (ili 1:2000), tada radni titar odgovara razrjeđenju od 1:1250 (ili 1:W00).

K o m p l e m e n t je komponenta svježi serum, limfa, tkivne tekućine različiti tipoviživotinje (i ljudi); otkrio Buchner (1889). Kod insekata komplement je odsutan. Komplement je tvar proteinske prirode, složene strukture, brzo se inaktivira zagrijavanjem, duljim skladištenjem, izlaganjem ultraljubičastom zračenju, jakim mućkanjem, filtracijom kroz keramičke filtre, dodatkom kaolina, kiselina, lužina, alkohola, acetona, kloroforma, destilirane voda, suspenzija bakterija itd. Komplement se može konzervirati dodavanjem 5 g natrijevog sulfata, 4 g na 100 ml seruma zamorca. Borna kiselina. Aktivnost komplementa održava se do šest mjeseci. Najbolji način konzerviranje - sušenje pod vakuumom na niskoj temperaturi (liofilizacija). U zatvorenim ampulama u ovom stanju, čuva se dvije godine. Prije svake proizvodnje RSK titracijom se provjerava aktivnost komplementa, odnosno određuje se njegov titar - optimalna količina potrebna za ovu reakciju. Komplement se titrira dvostruko: u hemolitičkom i bakteriolitičkom sustavu.

Za titracija komplementa u hemolitičkom sustavu pripremaju se komponente: komplement u razrjeđenju 1: 20 (1 ml komplementa + 19 ml fiziološke otopine); hemolizin, razrijeđen prema radnom titru; suspenzija ispranih ovčjih eritrocita (1:40), fiziološka otopina. Epruvete se stavljaju u stativ i u njih se graduiranom pipetom ulijevaju različite količine komplementa u razmacima od 0,03 ml (0,13; 0,16; 0,19; 0,22 ..: do 0,43 ml). Zatim dodajte preostale komponente (Sl. 57). Sve epruvete se protresu i stave u vodenu kupelj na 37...38°C 10...15 minuta i rezultat se zabilježi.

Uzimajući u obzir rezultat: kao titar komplementa uzima se najmanja količina komplementa koja je omogućila potpunu hemolizu (u ovom primjeru 0,25 ml).

Rezultat titracije uzima se u obzir u epruvetama s najviše odličan sadržaj komplementa, gdje se prije svega očekuje hemoliza. Najmanja količina komplementa koja osigurava potpunu hemolizu eritrocita u tim uvjetima naziva se titar komplementa u hemolitičkom sustavu.

Za titracija komplementa u bakteriolitičkom sustavu potrebno je imati sve komponente reakcije: komplement (1:20), eritrocite (1:40), hemolizin u radnom titru, dva pozitivna i dva normalna seruma, specifični antigen. Serumi se razrijede fiziološkom otopinom 1:10, inaktiviraju 30 minuta na 56...58 X. Svaki serum se izlije u dva reda epruveta od 0,5 ml. Komplement se dodaje u sve većim količinama u epruvete svakog reda, kao kod titracije u hemolitičkom sustavu; započeti s količinom koja se uzima kao titar u hemolitičkom sustavu, zatim se u svakoj sljedećoj epruveti doza povećava za 0,03 ml, izjednačujući volumen na 0,5 ml fiziološkom otopinom.

Nakon toga se u jedan red epruveta s pozitivnim i normalnim serumom dodaje 0,5 ml antigena, a u drugi red svakog seruma dodaje se 0,5 ml fiziološke otopine. Sve epruvete se protresu i stave u vodenu kupelj 30-40 minuta. Zatim se u sve epruvete doda po 0,5 ml hemolizina i 0,5 ml eritrocita, protrese i stavi u vodenu kupelj 10-15 minuta. Najmanja količina komplementa koja je osigurala potpunu lizu eritrocita u oba reda epruveta (s antigenom i bez antigena) dva normalna seruma, u jednom redu (bez antigena) svakog pozitivnog seruma i uz potpunu odgodu (izostanak) hemolize u redovi pozitivnih seruma s antigenom (u tim istim dozama komplementa), nazivaju se titar komplementa, koji se koristi u formuliranju glavnog iskustva RSC u dijagnostičkim studijama.

Glavno iskustvo RSC-a (zapravo dijagnostička studija). Dva reda epruveta stavljaju se u police prema broju uzoraka seruma koji se proučavaju. 0,5 ml svakog inaktiviranog seruma ulije se u dvije epruvete: u jednu se doda antigen - 0,5 ml, u drugu (bez antigena) 0,5 ml fiziološke otopine i, dodajući komplement, formiraju bakternolitički sustav, a zatim dodati hemolitički sustav.

Potrebne komponente: 1) testni serum, inaktiviran, razrijeđen fiziološkom otopinom 1:10; 2) specifični antigen razrijeđen prema titru koji je biotvornica označila na etiketi pakiranja; 3) komplement u utvrđenom titru; 4) hemolizin u radnom titru; 5) suspenzija ispranih ovčjih eritrocita 1:40; 6) fiziološka otopina NaCl. Ispitni serumi se sipaju u dva reda epruveta. Za bilo koji broj testiranih seruma, poznati pozitivni serumi (koji daju pozitivan rezultat) i normalni serumi (od zdrave životinje, daju negativan rezultat) koriste se kao kontrole.

Epruvete s komponentama bakteriolitičkog sustava se protresu, stave u vodenu kupelj 20...40 min na 37...38°C. Epruvete bakteriolitičkog sustava drugog reda bez antigena se protresu, stave u vodenu kupelj pod istim uvjetima.

Zatim se u sve epruvete prvog i drugog reda dodaju komponente hemolitičkog sustava i po drugi put stave u vodenu kupelj 10..15 minuta. U svim epruvetama drugog reda bez antigena dolazi do potpune hemolize.

Do dobivanja konačnog rezultata epruvete se ostave na sobnoj temperaturi 18 ... .

Indikacije reakcije u epruvetama s ispitivanim serumima smatraju se pouzdanima ako nema hemolize u epruvetama s pozitivnim serumom i antigenom, uz potpunu hemolizu u epruvetama s pozitivnim serumom bez antigena i u svim epruvetama s poznatim normalnim serumom (sl. 61).

Ovu reakciju treba pratiti kontrola antigena, komplementa, hemolizina, eritrocita. Da biste to učinili, antigen s ovčjim eritrocitima ulijeva se u zasebne epruvete; komplement s eritrocitima bez hemolizina; hemolizin s eritrocitima bez komplementa; eritrocita i fiziološke otopine. Volumen u svakoj epruveti se namjesti fiziološkom otopinom na 2,5 ml. Epruvete se protresu i stave u vodenu kupelj na 37°C 20 minuta. Sve kontrolne epruvete ne bi trebale imati hemolizu.

RSC rezultat obično se izražava u križićima. Pokazatelji pozitivnog rezultata reakcije: + + + + (///) - potpuna sedimentacija eritrocita (nema hemolize), tekućina iznad sedimenta je bezbojna, + + + (///) - tekućina iznad taloga je jedva primjetno žućkasto obojena. Sumnjivi rezultat reakcije: prisutnost eritrocita spuštenih na dno i djelomično bojenje supernatanta zbog lize dijela eritrocita označava se sa + + - (++), odnosno dva i dva i a pola križeva. Izražena hemoliza (bez sedimenta) ili s malim sedimentom (+) je negativan nalaz.

Dugotrajna reakcija vezanja komplementa (RDSC). Učinkovitiji u osjetljivosti, za razliku od uobičajenog klasičnog RSC. Bit reakcije je da se bakteriolitički sustav održava na tri različita temperaturni uvjeti: nakon miješanja komponenti na sobnoj temperaturi 15 minuta, zatim na niskoj temperaturi (4 ° C) u hladnjaku 18 ... 20 sati iu vodenoj kupelji 15 minuta. Nakon toga se doda hemolitički sustav, protrese, ponovno stavi u vodenu kupelj i zabilježi reakcija kao kod RSC. Potvrđena je učinkovitost RDSC u dijagnostici niza zaraznih bolesti (tuberkuloza, vibrioza, bruceloza i dr.).

Reakcija supresije vezanja komplementa (RPSK), ili reakcija inhibicije, neizravna RSK. U ovu reakciju uključena je još jedna komponenta - standardni imunološki serum koji sadrži antitijela na antigen koji se obično koristi za dijagnostiku i stoga pozitivno reagira u klasičnom CSC-u.

Ispitivani serum se pomiješa s antigenom i čuva neko vrijeme bez komplementa. Zatim se dodaju komplement i standardni serum, epruvete se protresu i stave u vodenu kupelj 20...30 minuta, nakon čega se doda hemolitički sustav i vrati u vodenu kupelj. Ako nema hemolize, rezultat je negativan, jer ispitivani serum nije reagirao s antigenom, a ovaj je reagirao s standardni serum vezanjem komplementa. Ako je ispitivani serum bolesne životinje, on sadrži specifična protutijela u odnosu na antigen, tj. dolazi do reakcije između antigena i protutijela bez vezanja komplementa. Antigen, u interakciji s antitijelima ispitivanog seruma, ne reagira (suprimira se) sa standardnim (očito poznatim specifičnim) serumom, komplement ostaje slobodan i reagira u hemolitičkom sustavu - dolazi do hemolize, rezultat reakcije je pozitivan. u odnosu na ispitivani serum.

metoda fluorescentna antitijela (MFA). Mogućnosti ove metode su zbog specifičnosti prve faze seroloških reakcija s visokom osjetljivošću luminiscentne analize. Za provedbu MFA potrebno je imati visokospecifične imunološke luminiscentne serume. Poznato je da različiti serološki testovi koji se koriste u mikrobiološkoj praksi uglavnom uključuju tri komponente: bakterijski antigen, antitijelo i komplement. Sve su tri komponente zapravo antigeni, a protiv svake od njih mogu se dobiti imunološki serumi i prema tome luminiscentna protutijela. Ovisno o tome koja se vrsta luminiscentnog seruma koristi (protiv bakterijskog antigena, antibakterijska protutijela, komplement), razlikuju se tri glavne varijante metode fluorescentnih protutijela: izravna (1) i neizravna (2) varijanta te modifikacija neizravne varijante pomoću komplementa. Imunološka reakcija između antigena i protutijela provodi se u ovim modifikacijama izravno na stakalcu. Za fiksiranje mikroorganizama koriste se organska otapala: aceton, etanol, metanol, dioksan, kao i uobičajeni fiksativi koji se koriste u mikrobiološkoj praksi: formalin, Nikiforova smjesa, Carnoyeva tekućina i dr.

Izravna opcija. Specifični luminescentni serum nanosi se na gotov proizvod Određeno vrijeme, zatim se višak seruma ocijedi, lijek se ispere i pregleda pod fluorescentnim mikroskopom. Ova metoda se koristi za otkrivanje bakterija u patološkom materijalu, predmetima vanjsko okruženje, kao i za identifikaciju patogena u kulturama.

Neizravna (dvostupanjska) opcija. U prvoj fazi dolazi do specifične veze antigena s odgovarajućim antitijelom neobilježenog seruma. U drugoj fazi, specifično neobilježeno antitijelo veže se za anti-specijsko luminiscentno antitijelo koje se nalazi u serumu životinje imunizirane globulinima (ili serumom cijele krvi) životinjske vrste iz koje je korišten imunološki serum.

Indirektna antikomplementarna (tri koraka) varijanta. Prva faza: stvaranje kompleksa antigen-neobilježeno protutijelo. Drugi korak: nanošenje slojeva normalnog seruma koji sadrži komplement. Treća faza: kompleks antigen-protutijelo-komplement tretira se luminiscentnim antikomplementarnim serumom pripremljenim tijekom imunizacije kunića serumom životinjske vrste koja je poslužila kao izvor komplementa.

Neizravne MFA varijante mogu se koristiti i za detekciju antigena i za detekciju antitijela. Osim toga, za postavljanje dvostupanjske varijante potrebno je imati ograničen set antispecijskih luminiscentnih seruma (protiv globulina bika, ovce, konja, svinje itd.), a za antikomplementarnu varijantu dovoljno je imati samo jedan luminiscentni serum protiv globulina zamorčića.

Tehnika i imunoluminiscencija i mikroskopija. U praksi veterinarskih bakterioloških laboratorija koriste se luminiscentni serumi biotvorničke proizvodnje. Ovisno o vrsti fluorokroma, luminiscentni serumi daju ili zeleni sjaj objekta (boja na bazi fluorescentne boje) ili crveni (boja na bazi rodamina).

Za provođenje imunoluminiscentne mikroskopije, ispitni materijal treba nanijeti na odmašćeno, tanko stakalce bez ogrebotina. U proučavanju organa i tkiva životinja preparati-otisci se pripremaju u tankom sloju. Preparati se suše na zraku i stavljaju u tekućinu za fiksiranje (etanol - 15 min, metanol - 5 min, aceton - 5 min). Po potrebi, nakon fiksiranja, pripravci se mogu neko vrijeme čuvati u hladnjaku. Slijed i daljnji postupci ovise o vrsti MFA koja se koristi (jednostupanjski, dvostupanjski, trostupanjski). Obrada preparata luminescentnim serumima, kao i neobilježenim serumima prvog stupnja i komplementom, provodi se na 37 X u vlažnoj komori (Petrijeve zdjelice s navlaženim filter papirom).

Jednostupanjska opcija. Luminescentni serum nanosi se na predmetno staklo s fiksiranim ispitnim materijalom (u razrjeđenju naznačenom na ampuli). Lijek se stavlja u vlažnu komoru 15...20 minuta na 37 "C. Zatim se ispere puferiranom fiziološkom otopinom (pH 7,4) u posudi, mijenjajući otopinu nakon 5...10 minuta nekoliko puta, ili pod tekućom vodom iz slavine 3...5 minuta Voda treba biti neutralna i bez željeza. Zatim se preparat (može biti nekoliko mrlja na jednom staklu) suši na zraku ili filter papiru, nakon čega se doda kap puferiranog glicerola s Nanese se pH od 8,0 i pokrije pokrovnim stakalcem. Imerzijska nefluorescentna tekućina nanese se na pokrovno stakalce i mikroskopira.

Dvostupanjska opcija. Kap imunološkog neobilježenog seruma prve faze nanosi se na predmetno staklo s ispitivanim materijalom. Lijek se stavlja u termostat u vlažnu komoru 15...20 minuta. Zatim se opere kako je gore opisano, osuši i nanese kap luminescentnog seruma protiv vrsta. Lijek se ponovno stavlja u termostat u vlažnu komoru na 15-20 minuta. Ponoviti postupak pranja i osušiti filter papirom. Nanosi se puferirani glicerol, pokriva pokrovnim stakalcem, nanosi se nefluorescentna tekućina za uranjanje i mikroskopira se.

Trostupanjska varijanta (anti-komplementarna). Kap imunološkog neobilježenog seruma prve faze nanosi se na predmetno staklo s ispitivanim materijalom. Lijek se stavi u termostat, kako je gore opisano, osuši i kap komplementa se nanese na razmaz. Lijek se ponovno stavlja u vlažnu komoru i u termostat na 15...20 minuta, nakon čega se ispere i aplicira luminiscentni antikomplementarni serum. Daljnji postupci slični su jednostupanjskoj opciji.

Priprema i obrada kontrolnih pripravaka. 1. Za izravnu opciju, kako bi se odredila specifičnost reakcije između antigena i luminiscentnog seruma, preparate razmaza heterolognih mikrobnih vrsta treba tretirati istim serumom. Te bi vrste trebale biti antigenski slične, ali se morfološki razlikuju od proučavanih mikroorganizama; daleki u antigenskom odnosu na proučavane mikroorganizme, ali slični po morfologiji i distribuciji s njima. Preparati otisaka tretiraju se luminiscentnim normalnim serumom.

2. Za neizravnu varijantu potrebno je imati tri kontrolna preparata tretirana normalnim serumom, luminescentni antispecies serum bez imunološkog neobilježenog seruma i luminiscentni antispecies serum s poznatim imunosnim serumom prve faze.

3. Za neizravnu opciju s dopunom potrebni su kontrolni pripravci u čijoj se obradi imunološki serum zamjenjuje normalnim serumom iste vrste i u istim razrjeđenjima, kao i pripravci tretirani svim sastojcima osim imunološkog seruma.

Evaluacija rezultata. Uzimaju se u obzir svjetlina, boja, lokalizacija i struktura sjaja. Bakterije obojene luminescentnim serumom obilježenim fluorescein izotiocijanatom imaju jarko zeleni sjaj oko periferije u obliku ruba ili aureole, središnji dio svijetli slabo. Takav sjaj nazivamo specifičnim, za razliku od nespecifičnog, kada cijelo tijelo stanice svijetli ravnomjerno. Što je bakterijska stanica konveksnija u preparatu, to je rub oštriji. Ovaj sjaj se može objasniti činjenicom da se nekoliko puta više protutijela projicira na mrežnicu promatrača s jedinice površine "periferije" stanice nego iz središnjeg dijela mikrobne stanice. Treba imati na umu da plastične stanice (leptospira, vibriosi) nemaju konturu ili je ona jedva primjetna. U stanicama uronjenim u tkivnu tekućinu i u mladim bacilima antraks kontura je obično izražena neoštro.

Intenzitet luminiscencije procjenjuje se prema sustavu četiri križa: + + + + - vrlo svijetla fluorescencija duž periferije mikrobne stanice, jasno kontrastna s tamnim tijelom stanice; + + + - svijetla fluorescencija periferije stanice; + + - slab sjaj periferije stanice; + - bez kontrastnog sjaja periferije tijela mikrobne stanice. Odsutnost specifičnog sjaja označena je "-" (vidljive su sjene mikroorganizama). Prilikom dijagnosticiranja raznih uzročnika pozitivan rezultat najčešće se smatra da specifična luminiscencija bakterijskih stanica nije manja od četiri ili tri križa.