תגובת קיבוע משלים(RSC) היא תגובה סרולוגית דו-שלבית מורכבת. הוא משתמש בחמישה מרכיבים המרכיבים שתי מערכות: אנטיגן, נוגדן, משלים (מערכת ראשונה); אריתרוציטים של כבשים, רגישים (מטופלים) בסרום המוליטי המכיל נוגדנים ספציפיים להם (מערכת שנייה, או אינדיקטור, heme). במקרה זה, האינטראקציה של הנוגדן עם האנטיגן בשלב הראשון של התגובה מובילה ליצירת קומפלקס חיסוני שסופח משלים, אך לא ניתן לזהות זאת חזותית. בשלב השני, מערכת ההמה משמשת כאינדיקטור לקיבוע משלים על קומפלקס אנטיגן-נוגדנים, אשר בהיותו קומפלקס חיסוני מסוגל גם לספוח אותו. בסופו של דבר, יש שתי תוצאות אפשריות של התגובה. אם הנוגדן והאנטיגן תואמים זה לזה והמשלים נספג על ידי הקומפלקס שנוצר, לא תתרחש תמוגה של האריתרוציטים של מערכת ההמה. אם הנוגדן אינו תואם לאנטיגן, ולהיפך, המשלים, שנותר חופשי, יצטרף למערכת ההמה ויגרום להמוליזה.

כמו בדיקות סרולוגיות אחרות, ניתן להשתמש ב-RSA לאיתור נוגדנים ספציפיים מנוגדנים ידועים או לגילוי אנטיגן מנוגדנים ידועים.

מאפיינים כללייםמרכיבי RSK.

1. לפני ביצוע התגובה, ה-SERUM הנבדק מחומם באמבט מים למשך 30 דקות כדי להשבית את המשלים שלו ומדולל החל מ-1:5.

2. ANTIGENE יכול להיות תרביות חיידקים, הליסאטים שלהם, וירוסים וחומרים המכילים וירוסים, תמציות של איברים שעברו שינוי פתולוגי ושומני רקמה.

3. COMPLEMENT – סרום שפן ניסיונות המתקבל ביום הניסוי. נכון לעכשיו, נעשה שימוש בהשלמה יבשה תעשייתית.

4. מערכת HEMOLYTIC מורכבת מסרום המוליטי ו-3% תרחיף של תאי דם אדומים של כבשים מעורבבים בנפחים שווים. כדי לעשות רגישות לאריתרוציטים עם המוליזינים, התערובת נשמרת בתרמוסטט בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

הגדרת הניסוי הראשי של ה-RSC. SERUM, ANTIGEN AND COMPLEMENT מוסיפים לצינורית 1, סרום, משלים ובמקום אנטיגן מוסיפים לשפופרת השנייה תמיסת נתרן כלוריד איזוטונית (SERUM CONTROL), אנטיגן, משלים ואותה תמיסת נתרן כלורי מוסיפים לשפופרת השלישית ( בקרת אנטיגנים). המבחנות ממוקמות בתרמוסטט בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. במקביל, מכינים מערכת המוליטית, אשר מתווספת לאחר מכן לכל שלושת הצינורות לאחר הוצאת המתלה מהתרמוסטט. לאחר ערבוב מערכת החן עם המרכיבים של שלוש מבחנות, האחרונות ממוקמות שוב בתרמוסטט למשך שעה, ולאחר זמן זה נלקחות בחשבון תוצאות ה-RSK.

כאשר לוקחים בחשבון RSC, עוצמת התגובה מסומנת באמצעות סימנים: "++++" - בחדות תגובה חיוביתעם עיכוב מוחלט של המוליזה, הנוזל במבחנה חסר צבע, כל תאי הדם האדומים התיישבו לתחתית; "+++", "++" - תגובה חיובית, המאופיינת בעלייה בצבע הנוזל עקב המוליזה וירידה במספר תאי הדם האדומים במשקעים; "+" - תגובה חיובית חלשה, הנוזל בצבע עז, יש כמות קטנה של כדוריות דם אדומות בתחתית הצינור. תגובה שליליתמסומן על ידי הסימן "-", במקרה זה נצפתה המוליזה מלאה, לנוזל במבחנה יש צבע ורוד עז ("דם לכה").

RSC היא תגובה ספציפית מאוד מורכבת, אבל מאוד רגישה. בשימוש נרחב באבחון של עגבת, צורה כרוניתזיבה, שעלת, אקטינומיקוזיס, כל ריקטציוזיות וזיהומים ויראליים.

בדיקת אימונוסורבנט מקושר.

השיטה פותחה בתחילת שנות ה-70 ללא תלות זו בזו על ידי שלוש קבוצות של מדענים. השיטה דומה ל-RIA, אך היא מבוססת על סימון ה-Ag או Ab הנכנסים לתגובה עם אנזים. תנועת התווית עם המצע מלווה בדרך כלל בשינוי בצבע המדיום. נכון לעכשיו, נוצרו שינויים רבים של שיטה זו, אך השימוש הנרחב ביותר הוא ELISA הטרוגני פאזה מוצקה (פאזה מוצקה). יש:

1) אליסה ישירה בשלב מוצק. במקרה הזה:

1. סרום עם Ab מודגרת עם Ag קבוע על מצע מוצק (לרוב מדובר במיקרו-פלטה מפלסטיק).

2. שרירי בטן שלא קשרו Ag מוסרים בכביסה חוזרת.

3. ל- Abs שקשרו Ag מתווסף סרום מסומן אנזים.

4. קבע את מספר אנזימי הסמן הקשורים ל-At.

2) אליסה תחרותית מוצק פאזה.

1. מוסיפים מי גבינה. אם הוא מכיל Abs ספציפי, אז הם נקשרים ל-Ags קבועים על מצע מוצק. אם אין Abs ספציפי, אז ה-Ag נראה לא קשור.

2. כאשר מוסיפים נוגדנים ספציפיים ל-Ag קבוע, במקרה הראשון לא יהיה להם עם מה לקיים אינטראקציה (רוב ה-Ags כבר קשורים) Þ תוכן הסמן נמוך. במקרה השני, Abs ספציפי ייקשר ל-Ag ובמהלך הכביסה הם לא יישטפו Þ תכולת סמנים גבוהה.

בדומה למ.ב. נוגדנים קבועים, וחברות שונות מייצרות טבליות עם נוגדנים שכבר קבועים.

לעומת שיטות קלאסיותזיהוי Ag, שיטה זו מאפשרת לך לתעד ישירות את האינטראקציה שלהם עם Ab, ולא ביטויים משניים (אגלוטינציה, משקעים או המוליזה). השיטה מאוד רגישה (מספיק ריכוז של 1ng/ml).

קבעו: כלמידיה, קלוסטרידיה, HIV וכו'.

8. תגובת פגוציטוזיס.

פגוציטוזה מתבצעת על ידי מיקרופגים ומקרופאגים. שלבי פגוציטוזיס: התקרבות, הידבקות, טבילה, עיכול.

הערכת הפעילות התפקודית של תאים פגוציטים.

כַּמוּת הפעילות הפגוציטית של גרנולוציטים ומונוציטים מוערכת בדם מלא, בתרחיף לויקוציטים או בשברים מועשרים של תאים פגוציטים. חלקיקי לטקס חד מפוזרים בקוטר של 1.0-2.0 מיקרון, תרחיף של חיידקים מומתים בחום או פטריות דמויי שמרים משמשים כאובייקטים סטנדרטיים של phagocytosis.

פגוציטים מעורבבים עם חומר פגוציט ביחס של 1:10 או 1:100 ומודגרים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות תוך ערבוב מתמיד. לאחר מכן, הצינורות עוברים צנטריפוגה והמשקעים מוחלפים מחדש בטיפת סרום דם להכנת מריחה. במריחות המקובעות בכתם May-Chrunwald ומוכתמות לפי רומנובסקי-גימסה, מחושבים אחוז התאים הפאגוציטים (FP - phagocytic indicator) ומספר החלקיקים הנספגים לתא 1 (PF - מספר phagocytic).

U אדם בריא FP=40-80%, FP=1-5.

9. אבחונים.

דיאגנוסטיקים הם תרחיף של תאים מיקרוביאליים מסוימים שנהרגים על ידי חום או פורמלין עם תכולת תאים ידועה ליחידת נפח. תרחיפים של חיידקים חיים יכולים לשמש גם כאנטיגן. תופעת התגובה מופיעה ראשונית לאחר שעתיים (ב-37 0 C), התוצאה הסופית נלקחת בחשבון בטמפרטורת החדר לאחר 18-20 שעות. לאבחון, תגובה חיובית מעניינת רק בטיטר סרום מסוים, המשמש כאבחון. לפיכך, עבור ברוצלוזיס הטיטר האבחוני הוא 1:200, ועבור tula-remia -1:100. כדי לזהות נוגדנים, ניתן לבצע בדיקות אגרולציה אקספרס (זמן החשבון הוא מספר דקות). לדוגמה: 1. תגובה לטיפות דם בטולרמיה. טיפת מים מזוקקים (להמוליזה) וטיפה של tularemia diagnosticum מורחים על טיפת דמו המלא של המטופל על כוס מיוחדת. התגובה מתרחשת תוך 1-2 דקות, אגרלוטינים נראים בבירור בצורה של גושים לבנבן. 2. תגובת אגלוטינציה מפורשת של הדלסון מתבצעת על זכוכית עבור ברוצלוזיס.

תגובות אלו אינן מאפשרות לקבוע את כמות הנוגדנים בסרום ב) לזהות תרבית טהורה של פתוגנים של מחלות זיהומיות. לשם כך, נעשה שימוש בבדיקות אבחון חיסוניות.

סרה צבירה המיוצרת על ידי מכוני חיסונים וסרום על ידי חיסון בעלי חיים בתאים מיקרוביאליים שלמים. כדי להבטיח את האותנטיות של הסרום, עדיף להשתמש בסרום ספוג כך שיכילו רק נוגדנים המתאימים למין או סוג מסוים של מיקרואורגניזם.

עקרונות השגת סרה חיסונית.

סרום חיסון (אנטיסרום) הוא סרום דם המכיל נוגדנים לאנטיגן נתון. ברוב המקרים, סרה חיסונית (אבחונית) לאנטיגנים של חיידקים, רקמות ואנטיגנים אחרים מתקבלים בניסוי על ידי חיסון בעלי חיים באנטיגנים המתאימים.

בין הדרישות העיקריות לאנטי-סרה הן הספציפיות הגבוהה שלהם ותכולת נוגדנים מספקת. בהתבסס על הספציפיות, מבדילים אנטי-סראים בין אנטיסרים רב-ערכיים (רב-ספציפיים) ואנטיסרים חד-ערכיים (מונו-ספציפיים). סרה רב ערכית מכילה נוגדנים לאנטיגנים רבים, מונוספציפיים - לאנטיגן ספציפי אחד. אתה יכול להשיג סרומים מונוספציפיים:

1) שימוש באנטיגנים מטוהרים במיוחד כדי לחסן בעלי חיים,

2) טיהור סמים מקומיים מנוגדנים בעלי סגוליות לא רצויה.

לשימוש זה:

1) שיטת זיקה חיסונית, המבוססת על קשירת נוגדנים בספציפיות מסוימת על ידי האנטיגנים המתאימים המקובעים על נשא מוצק, ולאחר מכן הפרדה של קומפלקסים אנטיגן-AB שנוצרו ובידוד נוגדנים;

2) שיטת ספיחה של Castellani. למטרה זו, מיקרואורגניזמים, הכוללים את כל אנטיגנים קבוצתייםובכך סופגים אנטי-הומולוגיים

גופים. אנטיסרים מונוספציפיים נספגים כאלה מכילים נוגדנים לקובעים שונים של מולקולת האנטיגן, שהם הטרוגניים לפי מעמד (תת-מעמד)

תגובת קיבוע המשלים (CFR) היא שכאשר אנטיגנים ונוגדנים תואמים זה לזה, הם יוצרים קומפלקס חיסוני שאליו מחובר קומפלמנט (C) דרך מקטע Fc של הנוגדנים, כלומר, המשלים נקשר על ידי קומפלקס אנטיגן-נוגדנים. אם לא נוצר קומפלקס אנטיגן-נוגדנים, המשלים נשאר חופשי.

האינטראקציה הספציפית של AG ו-AT מלווה בספיחה (כריכה) של המשלים. מאחר שתהליך קיבוע המשלים אינו ברור חזותית, הציעו J. Bordet ו-O. Zhangu להשתמש במערכת ההמוליטית (כדוריות דם אדומות של כבשים + סרום המוליטי) כאינדיקטור, המראה האם משלים מקובע על ידי קומפלקס AG-AT. אם AG ו-AT תואמים זה לזה, כלומר נוצר קומפלקס חיסוני, אז המשלים נקשר לקומפלקס הזה והמוליזה לא מתרחשת. אם AT לא מתאים ל-AG, אז הקומפלקס לא נוצר ומשלים, נשאר חופשי, מתחבר עם המערכת השנייה וגורם להמוליזה.

התקדמות התגובה

התגובה מתרחשת בשני שלבים הכוללים שתי מערכות; חיידקי והמוליטי. התגובה הראשונה (ספציפית) כוללת אנטיגן 4-+ נוגדן + משלים. תוצאת תגובה חיובית, המתרחשת כאשר נוגדנים תואמים לאנטיגן, מאופיינת ביצירת קומפלקס אנטיגן-נוגדנים חיידקי ספציפי עם משלים ספוג, או, כפי שאומרים, "קשור". נותר בלתי נראה, המתחם אינו גורם לכך שינויים חיצונייםהסביבה בה הוא נוצר. תוצאת RSC שלילית מתרחשת בהיעדר זיקה ספציפית בין האנטיגן לנוגדן הסרום ומאופיינת בשימור של משלים פעיל חופשי. השלב הראשון של RSC יכול להתבצע בתרמוסטט ב-37°C (1-2 שעות) או במקרר ב-3-4°C (18-20 שעות). עם היווצרות ממושכת של קומפלקס החיסון של אנטיגן-נוגדנים בקור, מתרחשת קישור מלא יותר של המשלים וכתוצאה מכך, רגישות התגובה עולה. בעת עריכת ניסויים השוואתיים, האימונולוג הסובייטי אקדמי. V.I. Ioffe ותלמידיו הראו כי בתנאים של קיבוע משלים ממושך בקור, ניתן ללכוד כמויות קטנות פי 100-500 של אנטיגן ולקבל תוצאות חיוביות עם דילולים גדולים יותר של סרום חיסון מאשר בניסוי קיבוע המשלים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 1-2 שעות. השלב השני של התגובה (אינדיקטיבי) מתרחש בין הריאגנטים של המערכת ההמוליטית (תערובת של 3% השעיה של אריתרוציטים וסרום המוליטי בנפחים שווים) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס רק בנוכחות משלים שנותר חופשי מהשלב הראשון של התגובה (תגובה שלילית). בהיעדר משלים פעיל חופשי, המוליזה של תאי דם אדומים בהשפעת המוליזינים ספציפיים אינה מתרחשת (התגובה חיובית).

רכיבים

תגובת קיבוע המשלים (CFR) היא תגובה סרולוגית מורכבת. כדי לבצע אותו, יש צורך ב-5 מרכיבים, כלומר: AG, AT ומשלים (מערכת ראשונה), אריתרוציטים של כבשים וסרום המוליטי (מערכת שנייה).

האנטיגן ל-CSC יכול להיות תרביות של מיקרואורגניזמים מומתים שונים, הליסאטים שלהם, מרכיבי חיידקים, איברים שהשתנו פתולוגית ותקינה, שומני רקמה, וירוסים וחומרים המכילים וירוסים.

מי גבינה טרי או יבש משמש כתוספת חֲזִיר יָם.

מנגנון תגובה

RSK מתבצע בשני שלבים: שלב 1 - דגירה של תערובת המכילה שלושה מרכיבים אנטיגן + נוגדן + משלים; שלב 2 (אינדיקטור) - זיהוי של משלים חופשי בתערובת על ידי הוספת לו מערכת המוליטית המורכבת מאריתרוציטים של כבשים וסרום המוליטי המכיל נוגדנים אליהם. בשלב הראשון של התגובה, כאשר נוצר קומפלקס אנטיגן-נוגדנים, המשלים נקשר, ולאחר מכן בשלב השני, המוליזה של אריתרוציטים הרגישים על ידי נוגדנים לא תתרחש; התגובה חיובית. אם האנטיגן והנוגדן אינם תואמים זה לזה (אין אנטיגן או נוגדן בדגימת הבדיקה), המשלים נשאר חופשי ובשלב ה-2 יצטרף לקומפלקס הנוגדנים אנטי-אריתרוציטים, מה שגורם להמוליזה; התגובה שלילית.

יישום

ניתן להשתמש בתגובת קיבוע המשלים כדי:
1) זיהוי של נוגדנים ספציפיים בסרום לא ידוע על סמך האינטראקציה שלהם עם אנטיגן בעל אופי ידוע;
2) לימוד תכונות האנטיגן בתגובה עם סרום ספציפי ידוע. הכנת מרכיבים לבימוי RSC.

1. סרום הדם המתקבל למחקר, ערב התגובה, מחומם באמבט מים ב-56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להשבית את המשלים שלו. ניתן לאחסן סרום מומת בטמפרטורה של 3-4 מעלות צלזיוס למשך 5-6 ימים. ביום הניסוי מדללים את הסרום בתמיסת נתרן כלוריד איזוטונית ביחס של 1:5 (0.1 מ"ל סרום בדיקה + 0.4 מ"ל תמיסת נתרן כלוריד איזוטונית).

2. האנטיגן לייצור CSC יכול להיות תרביות של חיידקים שונים, חלבונים חיידקיים ותמציות המתקבלות מתרביות מיקרוביאליות, איברים ורקמות שעברו שינוי פתולוגי ותקינים. תכונות הכנת אנטיגן נקבעות על פי הטבע תהליך זיהומיוהמאפיינים של הפתוגן שלו.

3. משלים הוא תערובת של סרומים המתקבלים מ-3-5 שפני ניסיונות בריאים, או משלים יבש באמפולות.

מיד לפני השימוש, סרום שפן ניסיונות מדולל בתמיסה איזוטונית של נתרן כלורי ביחס של 1:10 לקבלת תמיסה.

4. לפני ביצוע הניסוי, הסרום ההמוליטי מושבת על ידי חימום בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לביצוע ניסוי ה-RSC הראשי, כמו גם לטיטרציה של משלים ואנטיגן, נעשה שימוש בסרום המוליטי בטיטר משולש. לדוגמה, אם הטיטר של סרום המוליטי הוא 1:1800, נעשה שימוש בדילול סרום של 1:600 ​​בתגובה.

5. אריתרוציטים מתקבלים מדם כבשים דפיברין. כדי להסיר סרטי פיברין, הדם מסונן דרך מסנן גזה תלת שכבתי. התסנין המתקבל עובר צנטריפוגה, הסרום נשאב ומנקז, והאריתרוציטים נשטפים בצנטריפוגה של 3-4 פעמים בתמיסת נתרן כלוריד איזוטונית. כאשר תאי הדם האדומים נשטפים בפעם האחרונה, שכבת הנוזל העליונה צריכה להיות שקופה לחלוטין. מכינים תרחיף 3% מתאי דם אדומים שטופים בתמיסת נתרן כלוריד איזוטונית. לאחר הכנת המרכיבים המעורבים ב-RSC באופן הנ"ל, המשך לטיטרציה של סרום המוליטי, משלים ואנטיגן.



תגובת המוליזה.

תגובה המוליזה (HR) -זהו הרס של תאי דם אדומים על ידי פעולת נוגדנים בהשתתפות משלים.

רכיבי RG.

1. אַנְטִיגֵן- השעיה 3% של תאי דם אדומים בתמיסת נתרן כלוריד איזוטונית;

2. נוֹגְדָן - סרום המוליטי- מכיל סרום נוגדנים לתאי דם אדומים (המוליזינים);סרום מתקבל על ידי חיסון ארנבות עם אריתרוציטים של כבשים;

3. מַשׁלִים– מערכת חלבוני דם הנספגים על קומפלקס אנטיגן-נוגדנים ויוצרים קומפלקס התקפי ממברנה שהורס את האנטיגן, כלומר. הורס תאי דם אדומים או, במילים אחרות, גורם לתמוטטות של תאי דם אדומים ( המוליזה). מוכן טרי סרום דם חזיר ניסיונות.

אם שמים כדוריות דם אדומות, סרום המוליטי ומשלים במבחנה בכמויות מסוימות, אז תוך מספר דקות יתרחש הרס (המוליזה) של כדוריות הדם האדומות, וכתוצאה מכך התערובת מאדום כהה תהפוך לורודת. ("דם לכה").

תגובת המוליזה משמשת כאינדיקטור בעת ביצוע תגובת קיבוע המשלים.

תגובת קיבוע המשלים (CFR) היא תגובה סרולוגית מורכבת הכוללת 2 מערכות אנטיגן-נוגדנים ומערכות משלים. מערכת 1 - ספֵּצִיפִי, 2 - המוליטימערכת.

תגובה זו פותחה על ידי J. Bordet ו-O. Zhangou, אשר קבעו כי במהלך היווצרות קומפלקס אנטיגן-נוגדנים, משלים נקשר לקומפלקס זה. אפקט גלוישבו בלתי נראהלפיכך, לזהות קישור משלים (וכתוצאה מכך, לזהות היווצרות של קומפלקס אנטיגן-נוגדנים כשהם תואמים זה לזה), כלומר. כפי ש אינדיקטורנעשה שימוש בשיטה השנייה - המערכת ההמוליטית.

RSC משמש לעתים קרובות יותר עבור serodiagnosis (זיהוי של נוגדנים לפתוגן בסרום הדם של המטופל ) זיבה, עגבת, שעלת, טיפוס וריקטסיוזיות אחרות ומחלות ויראליות רבות. RSC משמש גם לזיהוי סירו.

רכיבי RSK.

1. אנטיגן- תמציות מיקרוביאליות, הפטנים, לעתים רחוקות יותר - השעיה של חיידקים, כלומר. האנטיגן יכול להיות גופי (לא מסיס) או מולקולרי (מסיס).

2 . נוֹגְדָן- נסיוב דם של אדם חולה (לסרואיגנוזיס) או סרום אבחון חיסוני המכיל נוגדנים ידועים (לזיהוי סרו).

3. תאי דם אדומים של כבשים – אנטיגניםתגובה המוליטית.

4. סרום המוליטי- מכיל סרום נוגדניםלאריתרוציטים של כבשים. נַסיוֹב לקבלעל ידי חיסון ארנב עם אריתרוציטים של כבשים.

5. מַשׁלִים– סרום דם חזירי ניסיונות שהוכן טרי (נוזלי או מיובש בהקפאה).

6. אלקטרוליט- תמיסת נתרן כלוריד איזוטונית.

מבוים על ידי RSK.

לפני הניסוי עוברים טיטרציה של האנטיגן, סרום החולה, הסרום ההמוליטי והמשלים (הטיטר שלהם נקבע). הסרום של המטופל מחומם ל-56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

RSK מתבצע ב 2 שלבים.

שלב I - ספֵּצִיפִי: במבחנה אחת מכינים מערכת ספציפית - מערבבים כמויות שוות של אנטיגן ידוע, סרום מטופל ומשלים, במבחנה אחרת מכינים מערכת המוליטית - תערובת של אריתרוציטים של כבשים וסרום המוליטי, המבחנות מונחות במבחנה. תרמוסטט ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. במקביל מכינים בקרות לאנטיגן, משלים והמוסיסטם, דגימות בקרה עם נסיוב של אדם חולה ידוע (סרום חיובי) ואדם בריא ידוע (סרום שלילי) וכן מניחים בטרמוסטט למשך 30 דקות.

שלב ב' - אינדיקטור: כמויות שוות של המערכת המוליטית מתווספות לתערובת הראשונית ולכל צינורות הבקרה ותוצאות התגובה נלקחות בחשבון לאחר שמירה בתרמוסטט למשך 30 דקות.

התחשבנות בתוצאות DSCמבוצע עם תוצאות מושלמות בבקרות .

תגובה חיובית(אדם חולה והסרום שלו מכיל את הנוגדנים המתאימים לגורם הגורם למחלה - אנטיגן): בשלב I נוצרים קומפלקסים של אנטיגן-נוגדנים במערכת ספציפית, שאליה נקשר המשלים; לאחר הוספת המערכת ההמוליטית, ב שלב II, המוליזה אינה נצפתה, שכן המשלים קשור למערכת הספציפית הראשונה. אפקט גלוי- חינוך משקע אריתרוציטים.

תגובה שלילית(אדם בריא ואין נוגדנים לגורם הגורם בסרום שלו): לא נוצרים קומפלקסים של אנטיגן-נוגדנים ומשלים בשלב I נשאר חופשי; לאחר הוספת המערכת ההמוליטית בשלב II, הקומפלמנט נקשר לאנטיגן-נוגדן קומפלקסים שקיימים כאן בהכרח (אלו קומפלקסים של אריתרוציטים-נוגדנים) נוגדנים נגד אריתרוציטים) וגורמים להמוליזה של כדוריות דם אדומות. אפקט גלוי- המוליזה של תאי דם אדומים - "דם לכה"

הם משמשים גם לאבחון של מחלות זיהומיות. תגובת נטרול (RN) של הרעלן עם סרום אנטי רעיל, תגובת אימונופלואורסצנציה (RIF), בדיקת רדיואימונית (RIA), בדיקת אימונוסורבנטית מקושרת אנזים (ELISA).

INהתגובה מבוססת על שתי תופעות - בקטריוליזה והמוליזה. השלמה מעורבת בביטוי שלהם. לכן, שתי מערכות של רכיבים משמשות ב-RSC: 1) מספקת את התופעה של בקטריוליזה ומשמשת למטרות אבחון; 2) המוליטי, אינדיקטור, עזר; מאפשר לך לקבוע אם המשלים קשור או לא קשור במערכת הראשונה (ראה ערכת צבעים, איור I). בעבר, השעיה של חיידקים שימשה כאנטיגן, ולכן המערכת הראשונה נקראה בקטריוליטית (במקרים חיוביים התרחשה תמוגה של חיידקים).

הקמת ה-RSC מתבצעת בשני שלבים. בשלב הראשון מכינים מערכת בקטריוליטית: 0.5 מ"ל סרום בדיקה עם אנטיגן מערבבים במבחנות, מוסיפים משלים במינון מוגדר בהחלט (טיטר). תערובת האנטיגן-סרום-משלים (מערכת בקטריוליטית) נשמרת באמבט מים (או תרמוסטט) למשך 20...40 דקות ב-37...38 "C. תוצאת האינטראקציה של הרכיבים במבחנה היא בלתי נראה, הנוזל נשאר שקוף וחסר צבע. כדי לקבוע, צור קשר אם המשלים נמצא במערכת הבקטריאלית, השלב השני של התגובה מתבצע: מרכיבים של המערכת ההמוליטית מוסיפים למבחנות - אריתרוציטים כבשים שטופים וסרום המוליטי מומת. , כפי שמוצג בתרשים. כל מרכיבי המערכת הבקטריאלית מנערים כדי לערבב במבחנה, מניחים באמבט מים ב-37...38 "C למשך 20...40 דקות. לאחר מכן מוסיפים את מרכיבי המערכת ההמולוגית, הכל מנער שוב ושוב מניחים באמבט מים למשך 10...15 דקות.

חשבונאות ראשונית של התוצאה. אם הסרום מתקבל מחיה חולה, אז הוא מכיל נוגדנים שמתחברים עם אנטיגן ספציפי. קומפלמנט נקשר לקומפלקס הזה (אנטיגן - נוגדן) - המוליזה לא מתרחשת, התוצאה חיובית.

אין נוגדנים בסרום מחיה בריאה: קומפלקס אנטיגן-נוגדנים אינו נוצר, המשלים אינו נקשר במערכת הבקטריולוגית. כאשר מוסיפים אריתרוציטים והמוליזין (זה בין אנטיגן לנוגדן), משלים מגיב עם הקומפלקס הזה - מתרחש המוליזה, התוצאה שלילית (ראה צבע איור II).

חשבונאות סופית של התוצאה. את המבחנות משאירים בטמפרטורת החדר למשך 15...20 שעות אם הסרום במערכת הבקטריאלית היה מחיה חולה, נוצר במבחנה קומפלקס אנטיגן-נוגדנים ספציפי שסופח (קושר) את כל הנוספים. מַשׁלִים. כתוצאה מכך, במערכת השנייה, המוליטית, המוליזה לא תתרחש, תאי הדם האדומים ישקעו בתחתית המבחנה, והנוזל הסופרנטנט יהיה שקוף. תוצאת RSC חיובית.

אם סרום הבדיקה אינו מכיל נוגדנים ספציפיים לאנטיגן בו נעשה שימוש (במקרים בהם הסרום הוא מחיה בריאה), קומפלקס האנטיגן-נוגדנים אינו נוצר במערכת הבקטריאליטית ולכן המשלים אינו נספג במערכת זו. אבל נשאר חופשי. כאשר מוסיפים רכיבים של המערכת ההמוליטית (בשלב השני של התגובה), משלים מקיים אינטראקציה עם הקומפלקס השני (המוליזין - כדוריות דם אדומות), מתרחשת המוליזה של כדוריות דם אדומות - לא נוצר משקעים, הנוזל במבחנה הוא צבע לכה-אדום. תוצאת RSC שלילית.

RSK. משמש: 1) לאיתור נוגדנים ספציפיים בסרום של חיה חולה (לאבחון של ברוצלוזיס, דלקת קרום הרחם, בלוטות, לפטוספירוזיס, טריפנוזומוזה וכו'); 2) לזהות אנטיגן ספציפי (חיידקי או ויראלי) בחומר הבדיקה בנוכחות סרום חיסוני ספציפי.

כדי לבצע RSC יש צורך ב: דגימות סרום שהתקבלו למחקר; שני סראים ידועים כחיוביים (סטנדרטיים, מספקים תוצאה חיובית), ושני סראים רגילים. כל הסרומים מדולל 1:10 מושבתים ב-56...58 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות; אנטיגן מדולל לפי טיטר; משלים מדולל בהתאם לטיטר שנקבע במהלך טיטרציה במערכת בקטריוליטית; המוליזין בטיטר עבודה; תאי דם אדומים של כבשים (I: 40); תמיסת מלח, פיפטות מדורגות, מבחנות, מתלים, אמבט מים ב-37...38 מעלות צלזיוס.

לפני ביצוע RSC, דם הכבשה עובר דפיברין ותאי הדם האדומים נשטפים תמיסת מלחעל ידי צנטריפוגה עד שהסופרנטנט שקוף לחלוטין, אשר מוסר בשאיבה, ותאי הדם האדומים המשקעים מדוללים בתמיסה פיזיולוגית 1:40 (2.5%). האנטיגן מדולל בהתאם לטיטר המצוין על התווית על ידי המפעל הביולוגי. המוליזין והקומפלמנט עוברים טיטרציה לפני מיקום RSC.

האנטיגן ל-RSC מוכן במפעלים ביולוגיים. בדרך כלל מדובר בתמציות של תרחיפים מיקרוביאליים שנהרסו (או רקמה המכילה וירוסים). לאנטיגנים לא אמורים להיות אפקט המוליזה, אשר נשלט במהלך תהליך התגובה (1...2 מנות של אנטיגן ו-0.5 מ"ל תרחיף תאי דם אדומים מוזגים למבחנה: לא אמורה להיות המוליזה). על האמפולה עם האנטיגן, הביופקטורה מציינת שהיא מיועדת ל-RSC (sapnaya, brucellosis או אחר). קופסת האריזה מציינת את מספר האצווה, תאריך הייצור, תאריך התפוגה, פעילות האנטיגן, כלומר באיזה דילול יש להשתמש בו בעת ביצוע RSC (1:100, 1:150 וכו'). במחלות מסוימות, חומרים אחרים משמשים כאנטיגנים; למשל, לאבחון של דלקת מפרקים של גדול בקרהאנטיגן ל-CSC הוא הלימפה של עגל שנדבק בניסוי תת עורי או תוך פלאוראלי. במהלך אחסון ארוך טווח של אנטיגנים, הטיטר שלהם נבדק שוב במעבדה באמצעות ערכת טיטרציה מיוחדת.

סרחי בדיקה שהתקבלו למחקר מדוללים בתמיסה פיזיולוגית 1: 5 או 1: 10, מושבתים על ידי חימום באמבט מים כדי להרוס את המשלים שלהם במשך 30 דקות ב-56...58 מעלות צלזיוס (סרה של חמורים, פרדות, חיניות - ב-61 מעלות צלזיוס).

המוליזין מוכן במפעלים ביולוגיים על ידי חיסון יתר של ארנבות עם תאי דם אדומים של כבשים שטופות. לשם כך, ארנבות מוזרקות לווריד עם השעיה של 40...50% של תאי דם אדומים 4...5 פעמים במרווחים של 2...3 ימים. שבוע לאחר ההזרקה האחרונה, לוקחים דם מהארנבים, הסרום נשאבים בצורה סטרילית, מושבת, נשמר בגליצרול 1:1 או 0.5% פנול, מטיטר ויוצק לאמפולות. במעבדות, לפני הבמה, ה-RSC עובר טיטרציה שוב.

ערכת טיטרציה של המוליזין.יש צורך להכין: i) דילול משלים 1: 20; 2) המוליזין 1:100 (0.2 מ"ל המוליזין + 9.8 מ"ל מי מלח); 3) השעיה של אריתרוציטים של כבשים 1:40; 4) תמיסת NaCl פיזיולוגית.

כדי להגדיר תגובת טיטרציה, מניחים שתי שורות של מבחנות במעמד - אחת עזר רק להכנת דילול המוליזין, השנייה לטיטרציה עצמה. דילול ראשוני של המוליזין של 1:100 מתווסף לצינור הראשון של כל שורה, ולאחר מכן מתבצע דילול סדרתי. כל המבחנות מנערות ומניחות באמבט מים ב-37...38 מעלות צלזיוס למשך 10...15 דקות. התחשבות בתוצאה: בדוגמה זו, הכמות הקטנה ביותר (או הדילול הגבוה ביותר שלה) שנתנה המוליזה מלאה היא 1: 2000, כלומר זהו הטיטר האמיתי שלו. טיטר העבודה מרוכז פי 2 - 1:1000.

0.5 מ"ל (מסומן בחצים) מכל דילול מהמבחנות של השורה הראשונה מועבר למבחנות נפרדות מהשורה השנייה. הוסף 0.5 מ"ל של משלים (1:20), 0.5 מ"ל של תאי דם אדומים של כבשה (2.5% תרחיף, או 1:40) ו-1 מ"ל של תמיסת מלח לכל המבחנות בשורה השנייה, כך שנפח הנוזל ב כל מבחנה היה 2.5 מ"ל.

הערה. בהתבסס על העובדה שהניסוח הסופי של ה-RSC יכלול 5 רכיבים של 0.5 מ"ל כל אחד, שיסתכמו בנפח של 2.5 מ"ל, נפח זה נשמר לאורך כל העבודה.

המבחנות מנערות ומכניסות לאמבט מים למשך 10...15 דקות. המוליזה תתרחש בעיקר במבחנות עם תכולה גבוהה של המוליזין (הדילול הנמוך ביותר שלה הוא 1:500, 1:1000...). הכמות הקטנה ביותר של המוליזין (הדילול הגדול ביותר שלו) שגרמה להמוליזה מלאה של תאי דם אדומים בתנאים נתונים נקראת הגבלת טיטר (בפועל).המוליזין. לעבודה נוספת, המוליזין משמש פי 2 יותר מרוכז, כלומר, בכמות כפולה, כפול הטיטר, שנקרא כותרת עבודה.לדוגמה, אם הטיטר בפועל הוא I: 2500 (או 1: 2000), אז טיטר העבודה מתאים לדילול של 1:1250 (או 1: W00).

COMPLEMENT הוא רְכִיבסרום טרי, לימפה, נוזלי רקמות סוגים שוניםבעלי חיים (ובני אדם); התגלה על ידי בוכנר (1889). בחרקים אין השלמה. משלים הוא חומר חלבוני בעל מבנה מורכב המושבת במהירות על ידי חימום, אחסון לטווח ארוך, חשיפה לקרינה אולטרה סגולה, ניעור חזק, סינון דרך מסננים קרמיים, הוספת קאולין, חומצות, אלקליות, אלכוהול, אצטון, כלורופורם, מזוקקים מים, חיידקים מרחפים וכו'. ניתן לשמר את המשלים על ידי הוספת 5 גרם נתרן גופרתי ל-100 מ"ל סרום חזיר ניסיונות, 4 גרם חומצה בורית. פעילות המשלים נמשכת עד שישה חודשים. הדרך הכי טובהשימורים - ייבוש בוואקום בטמפרטורה נמוכה (ליאופיליזציה). באמפולות אטומות במצב זה זה מחזיק מעמד שנתיים. לפני כל הליך RSC, פעילות המשלים נבדקת על ידי טיטרציה, כלומר נקבע הטיטר שלו - הכמות האופטימלית הנדרשת לתגובה נתונה. המשלים עובר טיטרציה פעמיים: במערכות המוליטיות ובקטריאליטיות.

ל טיטרציה של משלים במערכת ההמוליטיתלהכין את הרכיבים: משלים בדילול של 1:20 (1 מ"ל של משלים + 19 מ"ל של מי מלח); המוליזין, מדולל לפי טיטר העבודה; תרחיף של אריתרוציטים של כבשים שטופות (1:40), תמיסה פיזיולוגית. מבחנות מונחות במעמד ויוצקים אליהן כמויות שונות של משלים בעזרת פיפטה מדורגת במרווחים של 0.03 מ"ל (0.13; 0.16; 0.19; 0.22..: עד 0.43 מ"ל). לאחר מכן הוסף את שאר הרכיבים (איור 57). כל המבחנות מנערות ומניחות באמבט מים ב-37...38 מעלות צלזיוס למשך 10...15 דקות והתוצאה מתועדת.

התחשבות בתוצאה: כמות המשלים הקטנה ביותר שמבטיחה המוליזה מלאה (בדוגמה זו - 0.25 מ"ל) נלקחת כטיטר המשלים.

תוצאת הטיטרציה מתחילה להילקח בחשבון במבחנות עם הגבוהות ביותר תוכן גבוהמשלים, כאשר המוליזה צפויה בעיקר. הכמות הקטנה ביותר של המשלים המבטיחה המוליזה מלאה של תאי דם אדומים בתנאים נתונים נקראת טיטר משלים במערכת ההמוליטית.

ל טיטרציה של משלים במערכת הבקטריאליטיתהכרחי שיהיו כל מרכיבי התגובה: משלים (1:20), תאי דם אדומים (1:40), המוליזין בטיטר העבודה, שני סראים חיוביים ושני נורמליים, אנטיגן ספציפי. סרום מדולל בתמיסת מלח 1:10, מושבת למשך 30 דקות ב-56...58 X. כל סרום נשפך לשתי שורות של צינורות של 0.5 מ"ל. משלים מתווסף למבחנות של כל שורה בכמויות הולכות וגדלות, כמו בעת טיטרציה במערכת המוליטית; התחל עם הכמות שנלקחה עבור הטיטר במערכת ההמוליטית, ואז בכל מבחנה שלאחר מכן גדל המינון ב-0.03 מ"ל, תוך פילוס הנפח ל-0.5 מ"ל עם תמיסה פיזיולוגית.

לאחר מכן מוסיפים 0.5 מ"ל אנטיגן לשורה אחת של מבחנות עם סרום חיובי ונורמלי, ולשורה השנייה של כל סרום מוסיפים 0.5 מ"ל של תמיסה פיזיולוגית. כל המבחנות מנערות ומכניסות לאמבט מים למשך 30...40 דקות. לאחר מכן מוסיפים 0.5 מ"ל המוליזין ו-0.5 מ"ל אריתרוציטים לכל המבחנות, מנערים ומניחים שוב באמבט מים למשך 10...15 דקות. הכמות הקטנה ביותר של המשלים שהבטיחה תמוגה מלאה של תאי דם אדומים בשתי שורות המבחנות (עם אנטיגן וללא אנטיגן) של שני סרומים נורמליים, בשורה אחת (ללא אנטיגן) של כל סרום חיובי ועם עיכוב מוחלט (היעדר) של המוליזה בשורות של סרה חיובית עם אנטיגן (באותן מינונים של משלים), הנקראת טיטר משלים,אשר משמש בהגדרת החוויה העיקרית של ה-RSC במחקרי אבחון.

החוויה העיקרית של RSK (למעשה מבחן דיאגנוסטי). שתי שורות של מבחנות מונחות במדפים בהתאם למספר דגימות הסרום הנבדקות. 0.5 מ"ל מכל סרום מומת מוזגים לשתי מבחנות: אנטיגן מתווסף לאחת - 0.5 מ"ל, לשניה (ללא אנטיגן) 0.5 מ"ל של תמיסת מלח ובתוספת השלמה נוצרת מערכת בקטרוליטית, ולאחר מכן מוליטית. הוסיף.

רכיבים נחוצים: 1) סרום בדיקה, מושבת, מדולל בתמיסה פיזיולוגית 1:10; 2) אנטיגן ספציפי, מדולל לפי הטיטר המצוין על ידי המפעל הביולוגי על תווית האריזה; 3) משלים בטיטר שנקבע; 4) המוליזין בטיטר העבודה; 5) השעיה של אריתרוציטים של כבשים שטופות 1: 40; 6) תמיסת NaCl פיזיולוגית. את סרום הבדיקה יוצקים לשתי שורות של צינורות. עבור כל מספר של סרום בדיקה, סרום חיובי ידוע (נותן תוצאה חיובית) וסרום תקין (מחיה בריאה, נותן תוצאה שלילית) משמשים כביקורת.

הצינורות עם מרכיבי המערכת הבקטריאלית מנערים ומניחים באמבט מים למשך 20...40 דקות ב-37...38 מעלות צלזיוס. מבחנות של המערכת הבקטריאלית בשורה השנייה ללא אנטיגן מנערות ומניחות באמבט מים באותם תנאים.

לאחר מכן מוסיפים את מרכיבי המערכת ההמוליטית לכל המבחנות של השורה הראשונה והשנייה ומניחים בפעם השנייה באמבט מים למשך 10..15 דקות. בכל הצינורות של השורה השנייה ללא אנטיגן מתרחשת המוליזה מלאה.

לפני קבלת התוצאה הסופית משאירים את המבחנות בטמפרטורת החדר למשך 18...24 שעות.בכל המבחנות ללא אנטיגן, ללא קשר אם הנסיוב התקבל מחיה חולה או בריאה, צריכה להתרחש המוליזה;בראשון. שורה מבחנות עם אנטיגן, תוצאה ברורה יותר מתבטאת בעמידה.

קריאות התגובה במבחנות עם סרום בדיקה נחשבות אמינות אם אין המוליזה במבחנות עם סרום ואנטיגן חיוביים, עם המוליזה מלאה במבחנות עם סרום חיובי ללא אנטיגן ובכל המבחנות עם סרום תקין בעליל (איור 61 ).

תגובה זו חייבת להיות מלווה בבקרות של אנטיגן, משלים, המוליזין ואריתרוציטים. כדי לעשות זאת, אנטיגן עם תאי דם אדומים של כבשים מוזגים לתוך מבחנות נפרדות; משלים עם תאי דם אדומים ללא המוליזין; המוליזין עם תאי דם אדומים ללא השלמה; תאי דם אדומים ותמיסת מלח. הנפח בכל מבחנה מותאם ל-2.5 מ"ל עם תמיסת מלח. המבחנות מנערות ומניחות באמבט מים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לא אמורה להיות המוליזה בכל צינורות הבקרה.

תוצאת RSKנהוג לבטא זאת ב"צלבים". אינדיקטורים לתוצאת תגובה חיובית: + + + + (///) - שקיעה מלאה של כדוריות דם אדומות (ללא המוליזה), הנוזל מעל המשקע חסר צבע, + + + (///) - הנוזל שמעל המשקע בקושי צהבהב ניכר. תוצאה מפוקפקת של התגובה: נוכחות אריתרוציטים שהתיישבו בתחתית וצביעה חלקית של הסופרנטנט עקב תמוגה של חלק מהאריתרוציטים מסומנת + + - (++), כלומר, שניים ושתיים וחצי צלבים. . המוליזה חמורה (ללא משקעים) או עם משקעים קטנים (+) היא תוצאה שלילית.

תגובה ארוכת טווח לקיבוע משלים (LDCR).יעיל יותר ברגישות בניגוד ל-RSK הקלאסי הרגיל. המהות של התגובה היא שהמערכת הבקטריאליטית נשמרת בשלושה שונות תנאי טמפרטורה: לאחר ערבוב הרכיבים בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, לאחר מכן בטמפרטורה נמוכה (4 מעלות צלזיוס) במקרר למשך 18...20 שעות ובאמבט מים למשך 15 דקות. לאחר מכן, המערכת המוליטית מתווספת, מנערת, מכניסה שוב לאמבט מים והתגובה נרשמת, כמו עם RSC. היעילות של RDSC אושרה באבחון של מספר מחלות זיהומיות (שחפת, ויבריוזיס, ברוצלוזיס וכו').

תגובת דיכוי קיבוע משלים (CPF), או תגובת עיכוב, FCC עקיפה.מרכיב נוסף מעורב בתגובה זו - סרום חיסוני סטנדרטי המכיל נוגדנים לאנטיגן המשמש בדרך כלל לאבחון ולכן מגיב באופן חיובי ב-CSC קלאסי.

סרום הבדיקה מעורבב עם האנטיגן ונשאר למשך זמן מה ללא השלמה. לאחר מכן מוסיפים משלים וסרום סטנדרטי, מנערים את הצינורות ומכניסים לאמבט מים למשך 20...30 דקות, לאחר מכן מוסיפים את המערכת ההמוליטית ומכניסים שוב לאמבט המים. אם אין המוליזה, התוצאה היא שלילית, מכיוון שסרום הבדיקה לא הגיב עם האנטיגן והאחרון הגיב עם סרום סטנדרטי, השלמה מחייבת. אם סרום הבדיקה הוא מחיה חולה, הוא מכיל נוגדנים ספציפיים ביחס לאנטיגן, כלומר מתרחשת תגובה בין האנטיגן לנוגדנים ללא משלים מקבע. האנטיגן, באינטראקציה עם הנוגדנים של סרום הבדיקה, אינו מגיב (מדוכא) עם הסרום הסטנדרטי (הספציפי הידוע), המשלים נשאר חופשי ומגיב במערכת ההמוליטית - מתרחש המוליזה, תוצאת התגובה חיובית ביחס לסרום הבדיקה.

שיטה נוגדנים פלורסנטים (MFA).היכולות של שיטה זו נובעות מהספציפיות של השלב הראשון של תגובות סרולוגיות עם הרגישות הגבוהה של ניתוח זוהר. כדי לבצע MFA, יש צורך בסרה חיסונית זוהרת מאוד ספציפית. ידוע כי בתגובות סרולוגיות שונות המשמשות בפרקטיקה המיקרוביולוגית מעורבים בעיקר שלושה מרכיבים: אנטיגן חיידקי, נוגדן ומשלים. כל שלושת המרכיבים, למעשה, הם אנטיגנים, וכנגד כל אחד מהם ניתן לקבל סרה חיסונית ובהתאם לכך נוגדנים זוהרים. תלוי באיזה סוג של סרום ניאון נעשה שימוש (נגד אנטיגן חיידקי, נוגדנים אנטיבקטריאליים, משלים), קיימות שלוש גרסאות עיקריות של שיטת הנוגדנים הפלורסנטיים: גרסאות ישירה (1) ועקיפה (2) ושינוי של הווריאנט העקיף באמצעות משלים. התגובה האימונולוגית בין אנטיגן לנוגדן מתבצעת בשינויים אלה ישירות על שקף הזכוכית. כדי לתקן מיקרואורגניזמים, משתמשים בממיסים אורגניים: אצטון, אתנול, מתנול, דיוקסן, כמו גם מקבעים קונבנציונליים המשמשים בתרגול מיקרוביולוגי: פורמלין, תערובת Nikiforov, נוזל קרנוי וכו '.

אפשרות ישירה. סרום זוהר ספציפי נמרח על התכשיר המוגמר זמן מסוייםלאחר מכן, הסרום העודף מרוקן, התכשיר נשטף ונצפה במיקרוסקופ פלואורסצנטי. שיטה זו משמשת לאיתור חיידקים בחומר פתולוגי, חפצים סביבה חיצונית, וכן לזיהוי פתוגנים בגידולים.

אפשרות עקיפה (דו-שלבית). בשלב הראשון, מתרחש שילוב ספציפי של האנטיגן עם הנוגדן המתאים של סרום לא מסומן. בשלב השני, נוגדן ספציפי לא מסומן נקשר לנוגדן זוהר אנטי-מינים הכלול בסרום של בעל חיים מחוסן בגלובולינים (או בסרום דם מלא) מהמין שממנו נעשה שימוש בסרום החיסון.

אפשרות אנטי-משלימה עקיפה (תלת שלבים). שלב ראשון: יצירת קומפלקס הנוגדנים ללא אנטיגן. שלב שני: שכבות של סרום רגיל המכיל משלים. השלב השלישי: קומפלקס אנטיגן-נוגדן-משלים מטופל בסרום אנטי-משלים זוהר שהוכן על ידי חיסון ארנבות בסרום של מיני החי ששימש כמקור המשלים.

ניתן להשתמש בגרסאות עקיפות של MFA הן לגילוי אנטיגנים והן לגילוי נוגדנים. בנוסף, כדי להגדיר אפשרות דו-שלבית, עליך להצטייד בסט מצומצם של סרומים זוהרים נגד מינים (נגד גלובולינים של בקר, איל, סוס, חזיר וכו'), ולאפשרות האנטי-משלימה, זה מספיק כדי שיהיה רק ​​סרום זוהר אחד נגד גלובולינים של שפן ניסיונות.

שיטות של אימונולומינסנציה ומיקרוסקופיה. בתרגול של מעבדות בקטריולוגיות וטרינריות, נעשה שימוש בסרה זוהרת ביולוגית. בהתאם לסוג הפלואורוכרום, סרומים זוהרים מספקים זוהר ירוק לאובייקט (צבע על בסיס פלורסנט) או זוהר אדום (צבע על בסיס רודמין).

כדי לבצע מיקרוסקופ חיסוני, יש למרוח את החומר שייבדק על משטח זכוכית ללא שומן, דק וללא שריטות. כאשר לומדים איברים ורקמות של בעלי חיים, מכינים תכשירים לטביעת אצבע בשכבה דקה. את התכשירים מייבשים באוויר ומכניסים לנוזל מקבע (אתנול - 15 דקות, מתנול - 5 דקות, אצטון - 5 דקות). במידת הצורך, לאחר הקיבוע, ניתן לשמור את התכשירים במקרר למשך זמן מה. הרצף והנהלים נוספים תלויים בגרסת ה-MFA המשמשת (חד-שלבי, דו-שלבי, תלת-שלבי). טיפול בתכשירים עם סרה זוהרת, כמו גם סרה והשלמה שלב ראשון ללא תווית, מתבצע ב-37 מעלות צלזיוס בתא לח (צלחות פטרי עם נייר סינון לח).

אפשרות שלב בודד.סרום זוהר נמרח על שקף זכוכית עם חומר בדיקה קבוע (בדילול המצוין על האמפולה). התרופה ממוקמת בתא לח למשך 15...20 דקות ב-37 "C. לאחר מכן היא נשטפת עם תמיסת מלח מאוחסנת (pH 7.4) בכלי, תוך שינוי התמיסה לאחר 5...10 דקות מספר פעמים, או תחת מי ברז זורמים פנימה למשך 3...5 דקות המים צריכים להיות ניטרליים וללא ברזל. לאחר מכן התכשיר (ייתכן שיהיו מספר מריחות על כוס אחת) מיובשים באוויר או בנייר סינון, ולאחר מכן טיפה של גליצרול מבוצר עם pH 8.0 נמרח ומכוסה בכיסוי. נוזל טבילה לא פלואורסצנטי נמרח על כיסוי כיסוי ונבדק במיקרוסקופ.

אפשרות דו-שלבית.טיפה של סרום חיסוני ללא תווית בשלב ראשון מונחת על שקף זכוכית עם חומר הבדיקה. התרופה ממוקמת בתרמוסטט בתא לח למשך 15...20 דקות. לאחר מכן הוא נשטף כמתואר לעיל, מיובש וטיפה של סרום זוהר נגד מינים מונחת. התרופה מונחת שוב בתרמוסטט בתא לח למשך 15...20 דקות. חזור על הליך הכביסה וייבש בנייר סינון. מורחים גליצרול מפוצץ, מכוסים בכיסוי, מורחים נוזל טבילה לא פלואורסצנטי ונבדק מיקרוסקופית.

אפשרות תלת-שלבית (אנטי משלימה).טיפה של סרום חיסוני ללא תווית בשלב ראשון מונחת על שקף זכוכית עם חומר הבדיקה. התרופה מונחת בתרמוסטט כמתואר לעיל, מיובשת וטיפה של משלים מונחת על המריחה. התרופה מונחת שוב בתא לח ובתרמוסטט למשך 15...20 דקות, לאחר מכן היא נשטפת ומורחת סרום אנטי משלים זוהר. ההליכים הבאים דומים לאפשרות החד-שלבית.

הכנה ועיבוד של תכשירי בקרה. 1. עבור האפשרות הישירה, על מנת לקבוע את הספציפיות של התגובה בין האנטיגן לסרום זוהר, יש לטפל באותו סרום בתכשירי מריחה ממינים הטרולוגיים של חיידקים. מינים אלה חייבים להיות דומים מבחינה אנטיגני, אך שונים במורפולוגיה מהמיקרואורגניזמים הנחקרים; רחוקים מבחינה אנטיגני מהמיקרואורגניזמים הנבדקים, אך דומים במורפולוגיה ובתפוצה אליהם. תכשירי Imprint מטופלים בסרום נורמלי זוהר.

2. לאפשרות העקיפה, יש צורך בשלוש תכשירי בקרה המטופלים בסרום רגיל, סרום אנטי-מינים זוהר ללא סרום חיסוני לא מסומן וסרום אנטי-מינים זוהר עם סרום חיסוני ידוע מהשלב הראשון.

3. לאפשרות העקיפה עם השלמהנדרשים תכשירי בקרה, שבמהלכו מוחלף הסרום החיסוני בסרום רגיל מאותו סוג ובאותם דילולים וכן תכשירים המטופלים בכל המרכיבים מלבד הסרום החיסוני.

הערכת תוצאות. הבהירות, הצבע, הלוקליזציה והמבנה של הזוהר נלקחים בחשבון. לחיידקים המוכתמים בסרום זוהר המסומן ב-fluorescein isothiocyanate יש זוהר ירוק עז לאורך הפריפריה בצורת שפה או הילה, החלק המרכזי זוהר חלש. זוהר זה נקרא ספציפי, בניגוד לא ספציפי, כאשר כל גוף התא זוהר באופן שווה. ככל שתא החיידק נמצא בולט יותר בתכשיר, כך השפה חדה יותר. זוהר זה יכול להיות מוסבר על ידי העובדה כי מיחידת שטח של "הפריפריה" של התא מוקרנים פי כמה יותר נוגדנים על הרשתית של העין של הצופה מאשר מהחלק המרכזי של התא המיקרוביאלי. יש לזכור כי לתאי פלסטיק (לפטוספירים, ויבריוס) אין קו מתאר או שהוא מורגש מעט. בתאים הטבולים בנוזל רקמה ובבצילים צעירים גַחֶלֶתקווי המתאר בדרך כלל מטושטשים.

עוצמת הזוהר מוערכת באמצעות מערכת ארבע הצלבות: + + + + - פלואורסצנטיות בהירות מאוד לאורך הפריפריה של התא המיקרוביאלי, בניגוד ברור לגוף הכהה של התא; + + + - הקרינה בהירה של פריפריית התא; + + - זוהר חלש של פריפריית התא; + - אין זוהר ניגודיות של הפריפריה של גוף התא המיקרוביאלי. היעדר זוהר ספציפי מסומן על ידי "-" (צללים של מיקרואורגניזמים גלויים). בעת אבחון פתוגנים שונים תוצאה חיוביתלרוב, הארה הספציפית של תאי חיידקים נחשבת ללא פחות מארבעה או שלושה צלבים.