Sākums → Analīzes → Imunoloģiskā metode → Hemaglutinācijas reakcijas (imunoloģiskā metode)

Aglutinācijas reakcijas ir balstīti uz reaģenta (antivielu) mijiedarbību ar antigēniem, kas atrodas uz šūnu virsmas vai svešām daļiņām. Rezultātā veidojas lieli agregāti, kas izgulsnējas un ir redzami pat ar neapbruņotu aci. Tādā veidā tiek noteikta asins grupa pēc ABO sistēmas, Rh faktora klātbūtnes tajā utt. Šī ir jutīgāka diagnostikas metode, salīdzinot ar nokrišņu reakcijām, jo ​​nogulšņu (aglutināta) tilpums pārsniedz nogulsnes.

Tieša hemaglutinācija

Tiešā hemaglutinācijas reakcija (DHR) tiek izmantota, lai noteiktu mikroorganismu un sarkano asins šūnu virsmas antigēnus, kā arī antivielas pret tiem.
UZ standarta serumi satur antivielas, pievieno testa materiālu (asinis). Tiešās aglutinācijas reakcijas ātrums ir saistīts ar pārbaudāmā materiāla daudzumu, seruma daudzumu un koncentrāciju, kā arī apkārtējās vides temperatūru.

Netiešā hemaglutinācija

Reakcija netiešā hemaglutinācija veic, lai noteiktu antivielas pacienta asinīs, izmantojot eritrocītu diagnostikas testu. Reaģents sastāv no sarkanajām asins šūnām, uz kuru virsmas ir antigēns (mikroorganismu olbaltumvielas, toksīni, alergēni utt.).
Pacienta asins serumu atšķaida ar 0,9% nātrija hlorīda šķīdumu, pēc tam pievieno eritrocītu diagnostiku un uzrauga rezultātu. Šī ļoti jutīgā diagnostikas metode atklāj antigēnus pat nelielās koncentrācijās.

Hemaglutinācijas reakcija (HRA).

Laboratorijā tiek izmantotas divas hemaglutinācijas reakcijas ar dažādiem darbības mehānismiem.

Pirmā RGA ir seroloģiskā. Šajā reakcijā sarkanās asins šūnas tiek aglutinētas, mijiedarbojoties ar atbilstošām antivielām (hemaglutinīniem). Reakciju plaši izmanto asins grupu noteikšanai.

Otrais RGA nav seroloģisks. Tajā sarkano asins šūnu saķeri neizraisa

antivielas, bet īpašas vielas, ko veido vīrusi. Piemēram, gripas vīruss aglutinē vistas sarkanās asins šūnas un jūrascūciņas, poliomielīta vīruss – aitas sarkanās asins šūnas. Šī reakcija ļauj spriest par konkrēta vīrusa klātbūtni pētāmajā materiālā.

Reakciju veic mēģenēs vai uz īpašām plāksnēm ar iedobēm. Materiālu, kas pārbaudīts uz vīrusa klātbūtni, atšķaida ar izotonisku šķīdumu no 1:10 līdz 1:1280; 0,5 ml katra atšķaidījuma sajauc ar vienādu tilpumu 1-2% sarkano asins šūnu suspensijas. Kontrolē 0,5 ml eritrocītu sajauc ar 0,5 ml izotoniskā šķīduma. Mēģenes ievieto termostatā uz 30 minūtēm, un plāksnes atstāj istabas temperatūrā 45 minūtes.

Rezultātu uzskaite. Plkst pozitīvs rezultāts reakcijas rezultātā mēģenes vai iedobes apakšā parādās sarkano asinsķermenīšu nogulsnes ar izgrieztām malām (“lietussargs”), kas aptver visu iedobes dibenu. Ja rezultāts ir negatīvs, sarkanās asins šūnas veido blīvas nogulsnes ar gludām malām (“poga”). Kontrolē jābūt tiem pašiem nogulsnēm. Reakcijas intensitāti izsaka ar “+” zīmēm.

Hemaglutinācijas reakcija

Vīrusa titrs ir materiāla maksimālais atšķaidījums, kurā notiek aglutinācija.

Hemaglutinācijas inhibīcijas reakcija

Šī ir seroloģiska reakcija, kurā specifiski pretvīrusu antivielas, mijiedarbojoties ar vīrusu (antigēnu), neitralizē to un atņem spēju aglutinēt sarkanās asins šūnas, t.i., kavē hemaglutinācijas reakciju. Šī reakcija ļauj noteikt vīrusu veidu un veidu.

Reakcijas iestatīšana. 0,25 ml pretvīrusu seruma sajauc ar vienādu daudzumu materiāla, kas satur vīrusu. Maisījumu sakrata un ievieto termostatā uz 30 minūtēm, pēc tam pievieno 0,5 ml 1-2% sarkano asins šūnu suspensijas.

Rezultātu uzskaite. Ja eksperiments tiek veikts pareizi, seruma un eritrocītu kontrolē jāizveido “poga” - nav eritrocītus aglutinējoša faktora; antigēnu kontrolē veidojas “lietussargs” - vīruss izraisīja sarkano asins šūnu aglutināciju. Ja serums ir homologs ar pētāmo vīrusu, veidojas “poga” – serums vīrusu neitralizē.

Netiešā hemaglutinācijas reakcija

Netiešās (pasīvās) hemaglutinācijas reakcijas (RIHA) pamatā ir tas, ka sarkanās asins šūnas, ja uz to virsmas adsorbējas šķīstošs antigēns, mijiedarbojoties ar antivielām pret adsorbēto antigēnu, iegūst aglutinācijas spēju.

Reakcijas iestatīšana. Serumu karsē 30 minūtes 56 °C temperatūrā, secīgi atšķaida proporcijā 1:10 - 1:1280 un 0,25 ml ielej mēģenēs vai iedobēs, kur pēc tam tiek ievietoti 2 pilieni sarkano asins šūnu ar uz tiem adsorbētiem antigēniem. pievienots.

Vadības ierīces: eritrocītu suspensija ar uz tiem adsorbētiem antigēniem ar acīmredzami imūnserumu, eritrocītu suspensija ar uz tiem adsorbētiem antigēniem ar normālu serumu; normālu sarkano asins šūnu suspensija ar testa serumu. Pirmajā kontrolē jānotiek aglutinācijai, otrajā un trešajā tā nedrīkst notikt.

Kontroles jautājumi.

1. Ko liecina pozitīvs rentgena analīzes rezultāts starp sarkanajām asins šūnām un materiālu, kas tiek pārbaudīts attiecībā uz vīrusa klātbūtni?

2. Vai, ja tiem pievienos vīrusu un tam atbilstošu serumu, notiks sarkano asins šūnu aglutinācijas reakcija? Kā sauc reakciju, kas atklāj šo parādību?

PRAKTISKAIS DARBS Nr.12.

Komplementa fiksācijas reakcija.

Komplementa saistīšanās reakcija (FFR) ir balstīta uz faktu, ka specifisks antigēna-antivielu komplekss vienmēr adsorbē (saista) komplementu ar sevi.

Šo reakciju plaši izmanto antigēnu identificēšanā un infekciju, īpaši spirohetu (Vasermana reakcija), riketsijas un vīrusu izraisītu slimību, serodiagnozē.

RKS ir sarežģīta seroloģiska reakcija. Tas ietver komplementu un divas antigēnu-antivielu sistēmas. Būtībā tās ir divas seroloģiskas reakcijas.

Labā galvenā sistēma sastāv no antigēna un antivielas (viena ir zināma, otra nav). Tam tiek pievienots zināms daudzums komplementa. Ja šīs sistēmas antigēns un antiviela sakrīt, tie savienos un sasaistīs komplimentu. Iegūtais komplekss ir smalki izkliedēts un nav redzams.

Šī kompleksa veidošanos nosaka, izmantojot otru hemolītisko vai indikatoru sistēmu. Tajā ietilpst aitu sarkanās asins šūnas (antigēns) un atbilstošs hemolītiskais serums (antiviela), t.i. gatavs imūnkomplekss. Šajā sistēmā sarkano asins šūnu līze var notikt tikai komplementa klātbūtnē. Ja komplementu saista pirmā sistēma, tad otrajā sistēmā hemolīzes nebūs, jo nav bezmaksas papildinājuma. Hemolīzes neesamība (mēģenes saturs ir duļķains vai apakšā ir eritrocītu nogulsnes) tiek reģistrēts kā pozitīvs RSC rezultāts.

Ja pirmajā sistēmā antigēns neatbilst antivielai, tad imūnkomplekss neveidosies un komplements paliks brīvs. Paliekot brīvs, kompliments piedalās otrajā sistēmā, izraisot hemolīzi, RSC rezultāts ir negatīvs (caurules saturs ir caurspīdīgs - “lakotas asinis”).

Sastāvdaļas, komplementa fiksācijas reakcijas:

1. Antigēns – parasti lizāts, ekstrakts, haptēns,

retāk mikroorganismu suspensija.

2. Antiviela – pacienta serums.

3. Komplements - jūrascūciņas serums.

4. Antigēns – aitas eritrocīti.

5. Antiviela - hemolizīns pret aitu eritrocītiem.

6. Izotoniskais šķīdums.

Sakarā ar to, ka piedalās RSK liels skaits sarežģītas sastāvdaļas,

tie vispirms jātitrē un jāieņem reakcijā precīzos daudzumos un vienādos tilpumos: 0,5 vai 0,25, retāk 0,2, 1,25 vai 1,0 ml (lielāks tilpums dod precīzāku rezultātu). Reakcijas komponentu titrēšana tiek veikta tādā pašā tilpumā kā eksperiments, aizstājot trūkstošās sastāvdaļas ar izotonisku šķīdumu.

Saistītā informācija:

Meklēt vietnē:

Netiešā vai pasīvā hemaglutinācijas tests (IRHA vai RPHA) ir jutīgāks un specifiskāks nekā aglutinācijas tests. Šo reakciju izmanto arī divos virzienos.

1) Antivielu noteikšanai pacienta asins serumā tiek izmantota eritrocītu diagnostika, kurā antigēns tiek adsorbēts uz ar tanīnu apstrādātu eritrocītu virsmas. Saistībā ar šo reakciju biežāk tiek lietots termins RPGA.

Testa serumu atšķaida plastmasas plākšņu iedobēs un pievieno eritrocītu diagnostiku. Ja reakcija ir pozitīva, gar cauruma sienām parādās plāna plēve “mežģīņu lietussarga” formā; negatīva reakcija- blīvs eritrocītu nogulsnes “pogas” formā.

2) Toksīnu un baktēriju antigēnu noteikšanai pētāmajā materiālā tiek izmantota antivielu eritrocītu diagnostika, kas iegūta, adsorbējot antivielas uz eritrocītiem. Saistībā ar šo reakciju biežāk tiek lietots termins RNGA. Piemēram, ar antivielu diagnostikas palīdzību tiek konstatēts mēra baciļu antigēns, difterijas eksotoksīns, botulīna eksotoksīns.

Kas ir eritrocītu diagnostika? Kas ir antivielu eritrocītu diagnostika?

Eritrocītu diagnostikas ir sarkanās asins šūnas (apstrādātas ar tanīnu vai formalīnu) ar antigēniem, kas ekstrahētas no baktērijām, kas uz tām ir adsorbētas, un tiek izmantotas RPHA (pasīvās hemaglutinācijas reakcijas). Gadījumā, ja RPGA tiek izmantota antigēna noteikšanai pacientu sekrēcijās, audos utt., tiek izmantota “antivielu diagnostika”, t.i., ar antivielām sensibilizētas sarkanās asins šūnas.

RNGA asins seruma antivielas nosaka, izmantojot antigēnu eritrocītu diagnostiku, kas ir eritrocīti ar uz tiem adsorbētiem antigēniem.

Reakciju iestatīšanas metodika. Koaglutinācijas reakcija.

- sarkano asins šūnu fiksācija ar formaldehīdu vai glutārā vai akrila aldehīdiem. Šādas apstrādātas sarkanās asins šūnas tiek uzglabātas ilgu laiku. Biežāk šim nolūkam izmanto eritrocītus no aitām, cilvēkiem, cāļiem u.c.;
— fiksētu eritrocītu apstrāde ar tanīna šķīdumu. Tā rezultātā sarkanās asins šūnas iegūst spēju neatgriezeniski adsorbēt olbaltumvielas (vīrusus un antivielas) uz to virsmas;
- tanizētu eritrocītu sensibilizācija ar vīrusiem vai antivielām.

Koaglutinācijas reakcija (CAR)

Koaglutinācijas reakciju izmanto, lai noteiktu antigēnus, izmantojot antivielas, kas adsorbētas uz stafilokoku šūnu proteīna A (antibody diagnosticum).
Proteīnam A ir afinitāte pret imūnglobulīnu Fc fragmentu, tāpēc šādas baktērijas, kas apstrādātas ar imūndiagnostikas serumu, nespecifiski adsorbē seruma antivielas, kuras pēc tam mijiedarbojas ar aktīvajiem centriem ar atbilstošajiem no pacientiem izolētajiem mikrobiem. Koaglutinācijas rezultātā veidojas pārslas, kas sastāv no stafilokokiem, diagnostiskajām seruma antivielām un konstatētā mikroba.

Aglutinējošie serumi: ko tie satur; kā tās iegūtas, kam tās tiek izmantotas; Kāds ir aglutinējošā seruma titrs?

Aglutinējošu serumu iegūst, imunizējot trušus (intravenozi, subkutāni vai intraperitoneāli) ar nogalinātu baktēriju suspensiju, sākot ar 200 miljonu, pēc tam 500 miljonu, 1 miljardu, 2 miljardu mikrobu ķermeņu devu 1 ml, ar intervālu 5 dienas. 7-8 dienas pēc pēdējās imunizācijas tiek ņemtas asinis un tiek noteikts antivielu titrs.

Aglutinējošā seruma titrs ir maksimālais seruma atšķaidījums, pie kura notiek aglutinācija ar attiecīgo mikroorganismu.

Aglutinācijas serumus izmanto, lai identificētu mikrobus pilna mēroga aglutinācijas reakcijā.

Hemaglutinācijas reakcija (HRA)

Ja pētāmais mikroorganisms ar serumu ir aglutinēts līdz titram vai pusei no titra vērtības, var uzskatīt, ka tas pieder pie sugas, kuras nosaukums norādīts uz ampulas etiķetes.

Kādas ir atšķirības starp polivalentiem un monovalentiem (monoreceptoru) aglutinējošiem serumiem; Kāpēc truša imunizācija ar viena veida mikrobiem rada serumu, kas satur antivielas pret vairākiem antigēniem?

Monoreceptoru serumi ir serumi, kas satur antivielas tikai pret vienu antigēnu, un polivalentie serumi, kas rada aglutinācijas reakcijas ar divām vai trim radniecīgām baktērijām, kurām ir kopīgs antigēns. Aglutinācijas serumus izmanto, lai identificētu mikroorganismus aglutinācijas reakcijā. Šādu serumu trūkums ir tāds, ka tie spēj izraisīt grupu aglutinācijas reakcijas, jo tie satur antivielas pret baktērijām, kurām ir kopīgi antigēni.

Hemaglutinācijas reakcija. Apraksts un pielietojums

Tas ir balstīts uz faktu, ka sarkanās asins šūnas, uz kurām iepriekš ir adsorbēti antigēni, iegūst spēju aglutinēties homologu serumu (antivielu) klātbūtnē.

Šajā gadījumā sarkanās asins šūnas darbojas kā nesēji ar specifiskiem determinantiem, kuru aglutinācija notiek antigēna + antivielu reakcijas rezultātā.

Sarkanās asins šūnas, kurām antigēni ir stingri piesaistīti, sauc par eritrocītu antigēna diagnostiku jeb eritrocītiem, kas sensibilizēti ar antigēnu.

Cits RNGA veids – antivielas tiek adsorbētas uz eritrocītu virsmas un to sekojošā aglutinācija notiek homologa antigēna klātbūtnē. Šajā gadījumā šādus eritrocītus sauc par eritrocītu antivielu diagnostiku jeb eritrocītiem, kas sensibilizēti ar antivielām.

Pamatojoties uz šīm divām fundamentālajām metodoloģiskajām pieejām, ir izstrādātas un izmantotas daudzas RNGA modifikācijas. Tādējādi mazas standarta lateksa daļiņas tiek izmantotas kā nesēji. Šajā gadījumā reakciju sauc par lateksa aglutinācijas reakciju (RLA) vai arī to izmanto Staphylococcus aureus- koagulācijas reakcija uc Parasti eritrocītu diagnostikas tiek gatavotas bioloģiskās rūpniecības uzņēmumos, un galvenā RNGA pieredze tiek veikta diagnostikas laboratorijās.

Eritrocītu diagnostikas sagatavošana ietver šādas darbības:

• sarkano asins šūnu fiksācija ar formaldehīdu vai glutārā vai akrila aldehīdiem. Šādas apstrādātas sarkanās asins šūnas tiek uzglabātas ilgu laiku. Biežāk šim nolūkam izmanto eritrocītus no aitām, cilvēkiem, cāļiem u.c.;
• fiksētu eritrocītu apstrāde ar tanīna šķīdumu. Tā rezultātā sarkanās asins šūnas iegūst spēju neatgriezeniski adsorbēt olbaltumvielas (vīrusus un antivielas) uz to virsmas;
• tanizētu eritrocītu sensibilizācija ar vīrusiem vai antivielām.

Jāņem vērā, ka eritrocītu diagnostikas sagatavošanas metodes priekš vīrusu infekcijas savādāk.

Procedūra RNGA veikšanai, lai noteiktu un noteiktu antivielu titru, ir šāda:

• vienādas ar antigēnu sensibilizētu eritrocītu devas pievieno secīgiem 2-kārtīgiem seruma atšķaidījumiem;
• maisījumu atstāj 2-3 stundas istabas temperatūrā vai 16-18 stundas 4 °C temperatūrā;
• ņemt vērā rezultātus. Ja serumā ir antivielas pret vīrusu, ar kuru tika sensibilizētas sarkanās asins šūnas, tiek novērota hemaglutinācija, ko novērtē krustojumos.

Antivielu titrs serumā tiek uzskatīts par augstāko seruma atšķaidījumu, kas joprojām nodrošina hemaglutināciju ar vismaz diviem krustojumiem.

RNGA ir pievienotas visas atbilstošās vadīklas. Parasti reakciju veic, izmantojot mikrometodi.

RNGA ļauj atrisināt šādas diagnostikas problēmas:

• nosaka antivielas un nosaka to titru asins serumā, izmantojot zināmu eritrocītu antigēna diagnostiku;
• atklāt un identificēt nezināmu vīrusu, izmantojot zināmu eritrocītu antivielu diagnostiku.

RNGA priekšrocības: augsta jutība, izvietošanas tehnikas vienkāršība un reakcijas ātrums. Tomēr ir svarīgi atzīmēt, ka lielas grūtības rodas stabilas eritrocītu diagnostikas sagatavošanā (liela atkarība no izmantoto komponentu tīrības, nepieciešamība izvēlēties eritrocītu fiksācijas, tanizācijas un sensibilizācijas veidu katram vīrusa veidam).

Ja atrodat kļūdu, lūdzu, atlasiet teksta daļu un nospiediet Ctrl+Enter.

Saskarsmē ar

NETIEŠĀ HEMAGLUTINĀCIJAS REAKCIJA, RNGA
(Netiešās hemaglutinācijas tests)

Antigēnu un antivielu noteikšanas metode, kuras pamatā ir sarkano asins šūnu, uz kuru virsmas ir iepriekš adsorbēti antigēni vai antivielas, spēju aglutinēties homologu serumu vai atbilstošu antigēnu klātbūtnē.

Ja tiek atklāti antigēni, reakciju norāda ar reverso pasīvo hemaglutinācijas testu, un, ja tiek noteiktas antivielas, ar pasīvās hemaglutinācijas testu. RNGA ir atradusi plašu pielietojumu B hepatīta vīrusa infekcijas seroloģisko marķieru identificēšanai, īpaši HBsAg un antivielām pret to.

Pašlaik izstrādāts dažādas metodes eritrocītu diagnostikas līdzekļu ražošana, kas atšķiras ar eritrocītu sensibilizācijas metodēm (izmantojot tanīnu, glutaraldehīdu, hroma hlorīdu, rivanolu u.c.), to sugu (cilvēks, aita, vistas, tītara u.c.), reakcijas inscenēšanas iespējas (mikrotitrā). plāksnes, mēģenes, kapilāri utt.) un rezultātu reģistrēšana (vizuālā un instrumentālā). Eritrocītu diagnostikas komplektus HBsAg un anti-HB noteikšanai ražo daudzi uzņēmumi un firmas gan mūsu valstī, gan ārvalstīs.

Biežāk RNGA tiek veikta mikrotitra plāksnēs, kurās tiek iepriekš sagatavoti testa seruma un kontroles paraugu atšķaidījumi. Pēc eritrocītu diagnostikas pievienošanas un inkubācijas tiek reģistrēti reakcijas rezultāti. Paraugi, kuros notiek sarkano asins šūnu aglutinācija, kas izskatās kā apgriezts “lietussargs”, tiek uzskatīti par pozitīviem. Ja reakcija ir negatīva, sarkanās asins šūnas nogulsnējas cauruma apakšā gredzena vai diska veidā.

Lai apstiprinātu iegūto rezultātu specifiku, reakcija tiek veikta gan ar “eksperimentālo” eritrocītu diagnostiku (t.i., eritrocītiem, kas sensibilizēti ar antigēnu vai antivielām), gan ar “kontroles” diagnostiku (t.i., eritrocītiem, kas nav sensibilizēti ar antigēnu vai antivielām). Pozitīvas reakcijas klātbūtne ar “kontroles” diagnostikas zālēm norāda uz viltus pozitīvu reakciju. Lai novērstu nespecifiskas reakcijas, testa serumu apstrādā ar nesensibilizētiem eritrocītiem. Priekšnoteikums RNGA veikšanai ir neitralizācijas reakcija, t.i., apstiprinājuma tests.

Salīdzinot ar tādām metodēm kā RPG, VIEF un RSK, netiešajai hemaglutinācijas reakcijai ir augstāka jutība (200 - 400 reizes). Tādējādi HBsAg RPHA var noteikt 6-10 ng/ml koncentrācijā. Reakcijas vienkāršība un ātrums (20 - 30 minūtes) ir noteicis tās plašu izmantošanu šī metode asins pārliešanas dienestā, lai noteiktu HBsAg.

Papildus eritrocītu diagnostikai HBsAg un anti-HB noteikšanai ir izstrādāti arī diagnostikas preparāti identifikācija anti-HBc, anti-HBc klases IgM (cietās fāzes versija), HBeAg, A hepatīta vīrusa antigēns un antivielas pret to, tomēr tie visi nav atraduši pielietojumu praktiskajā veselības aprūpē.

Netiešā hemaglutinācijas reakcija (RIHA).

RIGA tiek izmantots divās versijās: ar zināmām antivielām, lai noteiktu antivielas ar zināmām antivielām, lai noteiktu antivielas. Šī reakcija ir specifiska, un to izmanto baktēriju un riketsijas izraisītu slimību diagnosticēšanai. RĪGA veikšanai tiek izmantota eritrocītu diagnostika, kas sagatavota, adsorbējot AG vai AT uz eritrocītiem, atkarībā no pētījuma mērķa (10.3. att.). Pozitīvos gadījumos eritrocītu aglutinācijas pakāpe tiek atzīmēta ar plusiem. Četri plusi novērtē reakciju, kas ir plānas adhezīvu sarkano asins šūnu plēves (lietussarga) formā, kas pārklāj mēģenes dibenu; par plēves esamību ar izlobītām mežģīņu malām norāda divi plusi. Titrs tiek uzskatīts par testa materiāla maksimālo atšķaidījumu, kas izraisīja eritrocītu aglutināciju par diviem plusiem.

Rīsi. 10.3.

1 - sarkanās asins šūnas, 2 - eritrocītu AG, 3 - konjugēts AG, 4-AT

RHA un hemaglutinācijas inhibīcijas reakcija (HAI).

Kā jau minēts, RHA pamatā ir eritrocītu spēja salipt kopā, kad uz tiem tiek adsorbēti noteikti antigēni. Par hemaglutinācijas testa materiālu izmanto alantoīdu un amnija šķidrumu, vistu embriju horiona-alanto membrānu suspensiju, suspensijas un ekstraktus no ar vīrusiem inficētu dzīvnieku kultūrām vai orgāniem, kā arī vietējo infekcijas materiālu. RGA nav seroloģiska reakcija, jo tā notiek bez imūnseruma līdzdalības un tiek izmantota, lai izvēlētos antigēna darba atšķaidījumu RGA stadijas noteikšanai vai antigēna (vīrusa) klātbūtni testa materiālā (piemēram, gripai). ). Reakcijā tiek izmantotas sarkanās asins šūnas no dzīvniekiem, putniem un cilvēkiem ar I asins grupu (0). Lai izveidotu aptuvenu RGA, uz stikla priekšmetstikliņa uzklāj pilienu 5% eritrocītu suspensijas un pilienu testa materiāla un rūpīgi samaisa. Ja rezultāts ir pozitīvs, pēc 1-2 minūtēm makroskopiski tiek novērota eritrocītu flokulējoša aglutinācija. Lai uzstādītu RGA nesalocītā rindā polistirola plākšņu iedobēs, sagatavo divreiz pieaugošus testa materiāla atšķaidījumus sāls šķīdums 0,5 ml tilpumā. Visām mēģenēm pievieno 0,5 ml 0,25-1% sarkano asins šūnu suspensijas. Rezultāti tiek ņemti vērā pēc pilnīgas eritrocītu sedimentācijas kontroles (sarkanās asins šūnas + sāls šķīdums). Reakciju ņem vērā eritrocītu nogulumu raksturs. Pozitīvos gadījumos aglutinācijas pakāpe tiek atzīmēta ar plusiem. Reakcija, kas izskatās pēc plānas lipīgu sarkano asins šūnu plēves, kas nosedz mēģenes (lietussarga) dibenu, tiek novērtēta ar četriem plusiem; reakcija ar spraugām plēvē tiek atzīmēta ar trim plusiem; plēves klātbūtne ar mežģīnēm. lipīgo sarkano asinsķermenīšu malas atzīmētas ar diviem plusiem, vienam plusam atbilst flokulentas sarkano asinsķermenīšu nogulsnes, ko ieskauj aglutinētu eritrocītu kunkuļu zona. Strauji izteikti eritrocītu nogulumi, kas neatšķiras no kontroles, norāda uz aglutinācijas neesamību. Titrs tiek uzskatīts par testa materiāla maksimālo atšķaidījumu, kas izraisīja eritrocītu aglutināciju par diviem plusiem. Ja RGA rezultāts ir pozitīvs, pētījums tiek turpināts, nosakot izolētā vīrusa veidu, izmantojot RT GA ar tipam specifiskiem serumiem. RTGA pamatā ir antiseruma īpašība nomākt vīrusu hemaglutināciju, jo vīruss, ko neitralizē specifiskas antivielas, zaudē spēju aglutinēt sarkanās asins šūnas. Provizoriskai vīrusu tipizēšanai tiek izmantota pilienu metode uz stikla. Lai galīgi noteiktu izolētā vīrusa veidu un titrētu antivielas serumā, mēģenēs vai iedobēs ievieto paplašinātu rentgena testu. Šim nolūkam fizioloģiskā šķīdumā sagatavo divkāršus seruma atšķaidījumus un izdala 0,25 ml. Seruma atšķaidījumiem pievieno vienu pilienu vīrusa saturoša materiāla un vienu pilienu 1% sarkano asins šūnu suspensijas. Izmantojot RTGA vīrusa veida noteikšanai, tiek izmantoti tipam specifiski serumi, kurus pievieno vienādam tilpumam AG darba atšķaidījumam. Izolētā vīrusa veidu nosaka specifiskais imūnserums, kas uzrādīja augstāko antivielu titru pret šo vīrusu. RGA un RTGA plaši izmanto vīrusu infekciju diagnosticēšanai ( ērču encefalīts, gripa utt.), lai noteiktu specifiskas antivielas un pēc to antivielām identificētu daudzus vīrusus.

Netiešā hemaglutinācijas reakcija (IRHA)

Sorbēto diagnostikas zāļu lietošana balstās uz virsmas struktūru imunoloģiskās atpazīšanas principu, kas pastāvīgi tiek realizēts dabā. No šī viedokļa nav būtisku atšķirību starp, piemēram, mikrobu šūnas vai mākslīgā nesēja, kas ir piekrauts ar antigēnu (antivielām), izmantošanu. Par pamatu sorbētajām zālēm tiek izmantoti dažādi nesēji - mikrobu šūnas, eritrocīti, latekss, bentonīns, holesterīns, Sephadex, dermatols, Aktivētā ogle, sēnīšu sporas utt.

Pēc A.T.Kravčenko (1945) darba eritrocīti, kuriem bija atņemta dzīvotspēja un fiksēti ar dažādiem ķīmiskiem reaģentiem, kļuva visplašāk izplatīti kā antigēnu vai antivielu nesēji. Pamatojoties uz eritrocītu (gan dabisko, gan fiksēto) izmantošanas principu kā antigēna nesēju, plaši izplatīta ir netiešā (pasīvā) hemaglutinācijas reakcija.

Priekšlikums izmantot netiešo hemaglutinācijas reakciju (IRHA) diagnostikas nolūkos radās, pamatojoties uz iepriekš iegūtajām zināšanām par eritrocītu augsto sorbcijas aktivitāti. Salīdzinot ar daudziem citiem antigēnu un antivielu nesējiem, eritrocītiem ir noteiktas priekšrocības netiešajā hemaglutinācijas reakcijā. Pirmkārt, izotoniski sāls šķīdumi tie veido diezgan stabilu saķeri un nenosēžas aiz muguras īsu laiku. Otrkārt, vienas un tās pašas dzīvnieku sugas sarkanās asins šūnas ir vienāda izmēra. Un visbeidzot, eritrocītiem ir salīdzinoši viegli tieši vai īpašas apstrādes rezultātā piesaistīt dažādus seroloģiski aktīvus komponentus.

Eritrocītu diagnostikas izveide no stabilizētiem eritrocītiem ļauj pārvarēt grūtības, kas rodas, izmantojot native eritrocītus.

Pētot eritrocītus, kas apstrādāti ar dažādām fiksējošām vielām, tika konstatētas dažas to kopīgās īpašības:

Morfoloģijas ziņā tie praktiski neatšķiras no svaigiem;

Nehemolizēt hipotoniskos šķīdumos, ūdenī un pēc sasaldēšanas-atkausēšanas;

Var liofilizēt;

To virsmas struktūras saglabā spēju tikt ķīmiski modificētas (piemēram, tanīns, diazo savienojumi) un reaģē ar antigēniem un antivielām.

Galvenais fiksēto eritrocītu kvalitātes kritērijs ir iespēja tos izmantot sensibilizētu zāļu iegūšanai, ja stabilizējošos šķidrumos nav nespecifiskas līmēšanas.

Diagnostikas zāļu izstrādē svarīga ir eritrocītu virsmas sagatavošana, lai palielinātu antigēnu sorbcijas spēju. Īpaši izplatīta ir kļuvusi sarkano asins šūnu apstrāde ar tanīnu.

Tās ietekmē tie mainās antigēnas īpašības eritrocīti (caurlaidība, sedimentācijas ātrums), to izturība pret dažu hemolītisko iedarbību taukskābes. Tomēr galvenais tiek panākts – tanizētajiem eritrocītiem ir ievērojami lielāka proteīnu sorbcijas spēja, kas šobrīd tiek plaši izmantota kvalitatīvas antigēnu un antivielu diagnostikas ražošanā.

Līdztekus iedeguma eritrocītiem eritrocītu diagnostikas un antigēnu nesēju sagatavošanai tiek izmantoti ķīmiskie reaģenti, piemēram, bromelīns, tripsīns, kālija perjodāts, kas arī modificē eritrocītu membrānas.

Pēc sarkano asins šūnu virsmas sagatavošanas, visvairāk svarīgs process- hemosensibilizācijas process, pēdējais posms eritrocītu diagnostikas izgatavošana.

Lai stiprinātu saikni starp nesēju un antigēnu, tiek izmantotas dažādas konjugējošas vielas - bisdiazobenzidīns, difluorodinitrobenzīns, ciānhlorīds, kadmija hlorīds un acetāts, broma hlorīds, formaldehīds, glutaraldehīds, ciānbromīds, rivanols, amidols u.c.

Konjugējošu vielu izmantošana palīdz novērst trūkumus, kas piemīt tanizētajiem eritrocītiem, kurus izmanto sensibilizācijai bez konjugējošām vielām.

Visplašāk izmantotās konjugējošās vielas ir hroma hlorīds, glutaraldehīds, melnais diazols C un amidols. Sensibilizācijas process ar hroma hlorīdu notiek ļoti ātri - no 4 līdz 10 minūtēm, kas piesaista pētnieku uzmanību. Šajā gadījumā tiek izmantota hroma hlorīda koncentrācija no 0,05 līdz 2%, pH nav zemāks par 5,0 pie reakcijas maisījuma temperatūras 20-250 C. Sensibilizācijas procesā ar hroma hlorīdu tiek aktivizētas eritrocītu membrānas proteīnu karboksilgrupas. . Tā rezultātā starp sarkano asins šūnu membrānu un sensitīnu veidojas kovalentā saite.

Netiešā hemaglutinācijas reakcija ir ļoti specifiska, jo eritrocītu adhēzija notiek antigēna mijiedarbības rezultātā ar antivielām, kas adsorbētas uz eritrocītiem. Tās atšķirīgā iezīme ir tā augstā jutība: tā nosaka 0,02-0,05 μg antivielu proteīna. Jutības ziņā tas ir ievērojami pārāks par imūndifūzijas, imunofluorescences, radiālās imūndifūzijas, komplementa fiksācijas un neitralizācijas reakcijām. RNGA ir mazāk jutīga nekā radioimūnelektroforēzes metodes, radioaktīvo antivielu proteīna daudzuma noteikšana imūnsorbentā un enzīmu imūntests.

RNGA priekšrocības ietver diezgan augstu reproducējamību, ieviešanas vienkāršību un nepieciešamību pēc minimāla sastāvdaļu daudzuma, it īpaši, izmantojot mikrometodi.

RNGA iekšā pēdējie gadi ir plaši izmantots infekciozā rinotraheīta, caurejas, adenovīrusa infekcija, rota un koronavīrusu infekcijas, paragripas - 3 un elpceļu sincitiāla infekcija.

Mēs sniedzam piemēru par eritrocītu diagnostikas līdzekļu ražošanu un izmantošanu, lai noteiktu antivielas pret rotas un koronavīrusu infekcijām.

Antivielu diagnostikas sagatavošanas metode rota un koronavīrusa antigēnu identificēšanai RNGA ir šāda: eritrocītu suspensijas iegūšana; to akroleīnu fiksācija; tanizācija, kas ļauj iegūt stabilu nepieciešamā proteīna sorbciju uz sarkanajām asins šūnām; tanizētu eritrocītu sensibilizācija ar imūnglobulīniem; sagatavotās diagnostikas specifikas noteikšana. Eritrocītu suspensijas pagatavošana tiek veikta, savācot klīniski veselīgas aitas asinis kolbā ar stikla pērlītēm. Pēc asiņu defibrinēšanas sarkanās asins šūnas 3-5 reizes jāmazgā ar izotonisku (0,9%) nātrija hlorīda šķīdumu, centrifugējot 15-20 minūtes ar 400 g.

Lai stabilizētu sarkanās asins šūnas, tās apstrādā ar akroleīnu. Kā zināms, tā darbība ir nedaudz maigāka nekā formaldehīda darbība un nodrošina stabilitāti un daudz ko citu augsta aktivitāte sarkanās asins šūnas Lai to izdarītu, vienādus tilpumus 10% eritrocītu suspensijas sajauc ar 0,2% akroleīna šķīdumu, kas sagatavots fosfāta buferšķīdumā (PBS) ar pH 7,2. Iegūto suspensiju 30 minūtes tur 37°C temperatūrā, rūpīgi maisot, pēc tam atdala akroleīnu, atkārtoti centrifugējot 5 minūtes pie 600-800g, līdz specifiskā smaka pilnībā izzūd. Šādi sagatavotu sarkano asins šūnu priekšrocība ir tā, ka tās tiek uzglabātas turpmākai lietošanai un var ilgu laiku saglabājas bez hemolīzes.

Pēc tam stabilizētās sarkanās asins šūnas 10% koncentrācijā divus mēnešus tiek turētas 2–4 °C temperatūrā PBS ar pH 7,2.

Lai palielinātu sarkano asins šūnu sorbcijas spēju un sedimentāciju, nepieciešams tos miecēt, sajaucot vienādās daļās 10% nomazgātu sarkano asins šūnu suspensiju un tanīna šķīdumu PBS un pH 7,2 atšķaidījumā 1:30 000. Maisījumu rūpīgi samaisa un tur 370 C temperatūrā 15 minūtes, pēc tam sarkanās asins šūnas rūpīgi nomazgā no tanīna divas reizes PBS ar pH 7,2 un trīs reizes ar izotonisku nātrija hlorīda šķīdumu ar pH 7,2-7,4.

Optimālais periods, lai garantētu kvalitatīvu eritrocītu diagnostikas līdzekļu saņemšanu, ir to sensibilizācija 24-48 stundu laikā pēc apstrādes ar tanīnu.

Diagnostikas ražošanas procesā kā šķīdinātājs un konservants tiek izmantots 0,3% fenolizēts izotonisks nātrija hlorīda šķīdums ar 0,1% normālu truša vai zirga serumu, kas iepriekš inaktivēts 56°C 30 minūtes un adsorbēts ar normāliem aitas eritrocītiem. 37°C uz 30 minūtēm.

Tanizēto eritrocītu sensibilizācija jāveic ar hiperimūno serumu, attiecīgi pret rota un lielajiem koronavīrusiem liellopi(ražots Viskrievijas Eksperimentālās veterinārmedicīnas pētniecības institūtā, kas nosaukts J. R. Kovaļenko vārdā). Šajā gadījumā antirotavīrusa imūnseruma sensibilizējošā deva (olbaltumvielu koncentrācija) ir 280 μg/ml, bet imūnseruma pret koronavīrusu – 260 μg/ml.

Sensibilizāciju veic, sajaucot vienādos daudzumos iedegušos eritrocītus un imūnserumu, kas iepriekš uzsildīts 30 minūtes 560C temperatūrā optimālā koncentrācijā. Papildus pievienojiet 3 daļas izotoniskā nātrija hlorīda šķīduma ar pH 7,2 un 5 daļas 0,1% hroma hlorīda šķīduma. Maisījumu, laiku pa laikam maisot, 5 minūtes notur istabas temperatūrā. Pēc noteiktā laika maisījumu rūpīgi nomazgā, izmantojot PBS ar pH 7,2, un pēc tam sagatavotos eritrocītu diagnostikas līdzekļus atkārtoti suspendē konservantā līdz 1% koncentrācijai. Sagatavotais diagnostikas līdzeklis savas pamatīpašības saglabā 8 mēnešus, ja to uzglabā 4°C.

Visos diagnostikas ražošanas posmos tiek uzraudzīta pašsaglutinācija. Sagatavoto diagnostiku specifika tiek noteikta, stadējot RNGA, kur kā antigēni tika izmantoti IRT vīrusu, AI - 3, adenovīrusu, vīrusu caurejas, kā arī rota un koronavīrusa antigēnu standarta diagnostikas.

Veicot RNGA, tiek sagatavoti secīgi testa vīrusu saturoša materiāla dubulti atšķaidījumi (20-50% fekāliju paraugu suspensija), un pēc tam katrā iedobē tiek pievienots vienāds tilpums eritrocītu diagnostikas šķidruma. Plāksnes vairākas reizes rūpīgi jāsakrata un jāatstāj istabas temperatūrā, līdz kontroles eritrocīti pilnībā nosēžas. Rādītājs pozitīva reakcija- eritrocītu diagnostikas aglutinācija ar aglutinācijas intensitāti 2+ titrā 1:4 un augstāk.

Pasīvā hemaglutinācijas reakcija)

metode antigēnu vai antivielu noteikšanai un identificēšanai, pamatojoties uz to klātbūtnē notiekošo sarkano asinsķermenīšu aglutinācijas fenomenu, uz kura virsmas iepriekš adsorbēts attiecīgais specifiskais vai antigēni.

1. Mazā medicīnas enciklopēdija. - M.: Medicīnas enciklopēdija. 1991-96 2. Pirmkārt veselības aprūpe. - M.: Lielā krievu enciklopēdija. 1994 3. Enciklopēdiskā vārdnīca medicīniskie termini. - M.: Padomju enciklopēdija. - 1982-1984.

Skatiet, kas ir “Netiešā hemaglutinācijas reakcija” citās vārdnīcās:

netiešā hemaglutinācijas reakcija- RNGA Laboratorijas tests, izmantojot eritrocītu diagnostiku. [Vakcinoloģijas un imunizācijas pamatterminu angļu-krievu vārdnīca. Pasaules Veselības organizācija, 2009] Tēmas vakcinācija, imunizācija Sinonīmi RNGA EN... ... Tehniskā tulkotāja rokasgrāmata

- (RNHA; pasīvās hemaglutinācijas reakcijas sinonīms) metode antigēnu vai antivielu noteikšanai un identificēšanai, kuras pamatā ir eritrocītu aglutinācijas parādība, kas notiek to klātbūtnē, uz kuras virsmas tie iepriekš tika adsorbēti... .. . Liels medicīnas vārdnīca

- (RPHA) skatiet Netiešā hemaglutinācijas reakcija... Liela medicīniskā vārdnīca

Šī lapa ir glosārijs. # A... Vikipēdija

Veterinārajā enciklopēdiskajā vārdnīcā pieņemtie pamata saīsinājumi- a., aa, artena, arteriae aa ana (vienlīdzīgi) PSRS Medicīnas zinātņu akadēmija akadēmija medicīnas zinātnes PSRS Zinātņu akadēmija PSRS Zinātņu akadēmija PSRS Bac. Bacillus Bact. Baktērija BSSR Baltkrievijas PSR gadsimts, gadsimts gadsimts, gadsimtu v., v. vena, venae VASKHNIL Vissavienības Ļeņina ordenis un... ...

Šim terminam ir arī citas nozīmes, skatiet Mēris. Gaļēdāju mēris (Kares slimība) akūta vai subakūta lipīga vīrusu slimība, kas izpaužas kā drudzis, katarāls gļotādu iekaisums, ādas bojājumi, centrālās ... ... Wikipedia

- (renes) sapārots ekskrēcijas un endokrīnais orgāns, kas regulē ķermeņa ķīmisko homeostāzi, izmantojot urīna veidošanās funkciju. ANATOMISKĀ FIZIOLOĢISKĀ SKICE Nieres atrodas retroperitoneālajā telpā (retroperitoneālajā telpā) uz... ... Medicīnas enciklopēdija

I (trihineloze; sinonīms: trihineloze, “piepūsts”) helmintoze no nematožu grupas, ko raksturo drudzis, mialģija, sejas pietūkums, ādas izsitumi, asins eozinofilija un smagos gadījumos bojājumi iekšējie orgāni un centrālais...... Medicīnas enciklopēdija

- (nematodozes) helmintiāzes, ko izraisa nematodes, Nematoda klases apaļtārpi. Citu helmintiāžu vidū N. ir augstākā vērtība cilvēka patoloģijā lielākā daļa no tām ir ģeohelmintoze (sk. Helminthiasis); olu vai kāpuru attīstība...... Medicīnas enciklopēdija

infekciozais epididimīts- Rīsi. 1. Kreisās sēklinieku palielināšanās aitai ar infekciozu epididimītu. Rīsi. 1. Kreisās sēklinieku palielināšanās aitai ar infekciozu epididimītu. aitu infekciozais epididimīts (Epididymitis infectiosa arietum), hronisks infekciozs... Veterinārā enciklopēdiskā vārdnīca

Skatīt Netiešā hemaglutinācijas reakcija... Liela medicīniskā vārdnīca