SPLOŠNO FARMAKOPEJSKO DOVOLJENJE

Uvedeno namesto metode, določene v FS 42-3874-99

Ta monografija Splošne farmakopeje je namenjena preučevanju antigenske sestave biološki materiali, kot tudi za določanje čistosti, kvalitativne in kvantitativne sestave imunobioloških zdravila(ILP) z metodo imunoelektroforeze (IEF) v agarskem gelu, ki združuje metode conske elektroforeze in imunodifuzije.

V procesu imunoelektroforeze v gelih ali na filmih celuloznega acetata z uporabo preprostih ali dvojnih imunodifuzijskih metod pride do reakcije med topnimi beljakovinami in obarjanjem specifičnih protiteles. Kvantitativno določanje beljakovin lahko izvedemo z elektroforezo v mediju, ki vsebuje protitelesa (elektroimunski test, elektroimunodifuzija, raketna imunoelektroforeza). Antigensko naravo beljakovinskih komponent lahko raziščemo tako, da jih primerjamo z znanimi markerji.

Učinkovitost imunokemijskih testov je odvisna od specifičnosti uporabljenih antiserumov, pa tudi od njihovega titra in afinitete za antigene.

Običajno je imunoelektroforeza kombinacija elektroforeze v agarskem (ali agaroznem) gelu, ki ji sledi dvojna imunodifuzija v istem mediju. Pri dvodimenzionalni dvojni imunodifuziji se antigen in protitelesa, nameščena v okroglih ali pravokotnih vdolbinah v gelu, premikajo drug proti drugemu, zaradi česar nastanejo precipitacijske črte (loki), ko se srečajo. Položaj precipitacijskih trakov je odvisen od difuzijskega koeficienta antigena, njegove koncentracije glede na protitelesa (hitrost difuzije protitelesa se lahko šteje za konstantno). Določeno razmerje koncentracij antigena in protiteles, ki je optimalno za nastanek oborine, imenujemo ekvivalenčna cona. Posledica tega so jasne meje padavin.

Tudi koncentracija (titer) protiteles v imunskem serumu lahko močno variira. Možno je, da se ekvivalenčna območja za različne sestavine zmesi ne bodo prekrivala. Za izbiro enakovrednega razmerja antigen-protitelo je priporočljivo izvajati imunoelektroforezo večkomponentnih mešanic pri več relativnih koncentracijah antigen-protitelo, saj pri uporabi samo ene takšne koncentracije ena ali druga komponenta morda ne bo zaznana.

Metoda imunoelektroforeze v agar gelu

Steklena plošča 90x120 mm, obdelana z alkoholom, je postavljena na oder strogo vodoravno. Ohlajen na temperaturo (45±5) 0 C agar gel nanesemo na stekleno ploščo v količini 18,0-20,0 ml. Po strjevanju pri sobni temperaturi se po 20-30 minutah na plošči oblikuje plast agarja debeline 2,0-2,5 mm.

Ko se gel strdi, se v njem s posebno šablono izreže 6-7 lukenj s premerom 1-2 mm. Vdolbinice se napolnijo s preskusnim vzorcem v volumnu, ki ne presega prostornine vdolbinice (2 vdolbinici za vsak preskusni vzorec). Hkrati se v zgornje in spodnje jamice steklene plošče z gelom vnese kontrolni vzorec - normalni človeški krvni serum ("Standardni vzorec testnega sistema za določanje frakcijske (antigenske) sestave pripravkov iz človeškega krvnega seruma. z imunoelektroforezo" ali drugega kontrolnega vzorca v skladu z navodili v monografski ali normativni dokumentaciji), obarvan s pironinom B (ali drugim barvilom, navedenim v monografski ali normativni dokumentaciji).

V merilni valj s prostornino 1000 ml dodamo 500 ml raztopine veronal-medinala ali boratnega pufra, dopolnimo prostornino raztopine s prečiščeno vodo do oznake in premešamo. Nastala raztopina (ali druga puferska raztopina, navedena v monografiji ali regulativni dokumentaciji) se vlije v elektrodne odseke komore naprave za elektroforezo.

Ploščo s pripravljenim gelom postavimo v napravo za elektroforezo in združimo s pufersko raztopino v elektrodnih komorah naprave z uporabo več plasti filtrirnega papirja. Pri napravi za elektroforezo, ki omogoča povezavo agarja na plošči z elektrodnim pufrom s pomočjo kolon agarja, ploščo namestimo v uravnoteženo napravo in prelijemo s staljenim agarjem, dokler se ne poveže s kolonami agarja in gela. nastane sloj debeline 1–2 mm.

Napravo za elektroforezo pokrijemo s pokrovom in vključimo vir napajanja (napetost 70-200 V, tok 10-40 mA). Elektroforezo izvajamo 1,5-3 ure, dokler mesto pironina B, ki ustreza migraciji albumina, ni na razdalji 20-25 mm od vdolbinice.

Po elektroforezi se s posebno šablono izrežejo vzdolžni »žlebovi« (vzporedni s smerjo migracije) med vdolbinice v agar gelu. V "žlebove" dodamo 0,25 ml obarjalnega antiseruma: proti beljakovinam človeškega seruma (pri testiranju frakcijske sestave) ali polivalentnega seruma proti beljakovinam človeškega seruma, velik govedo, konji in prašiči (za potrditev pristnosti).

Ploščo z agar gelom postavimo v vlažno komoro in hranimo pri temperaturi (5 ± 3) 0 C 24-48 ur.

Za pranje beljakovin, ki niso vstopile v reakcijo obarjanja, agarsko ploščo postavimo v kivete, prelijemo z 0,9% raztopino natrijevega klorida in inkubiramo 16-18 ur.Raztopino zamenjamo 3-4 krat. Nato ploščo odstranimo iz 0,9% raztopine natrijevega klorida, prekrijemo s filtrirnim papirjem, namočenim v 0,9% raztopino natrijevega klorida, in sušimo na zraku, dokler se agarjev gel ne spremeni v tanek film. Po tem ploščo s posušenim gelom prekrijemo s filtrirnim papirjem, namočenim v 0,9% raztopino natrijevega klorida, brez zračnih mehurčkov, in posušimo pri sobni temperaturi ali v sušilniku pri temperaturi, ki ne presega 40 °C. Po sušenju plošč se filtrirni papir navlaži z vodo in previdno odstrani.

Za barvanje beljakovin se uporablja barvilo amido black 10B ali drugo primerno barvilo (v skladu z navodili v monografiji ali regulativni dokumentaciji), tako da se plošča postavi v kiveto z raztopino barvila za 30-40 minut. Nato ploščo speremo v raztopini za pranje agarja (2% raztopina ocetne kisline ali druga raztopina, v skladu z navodili v regulativni dokumentaciji) 15-40 minut, dokler barvno ozadje popolnoma ne izgine, in ponovno posušimo pri sobni temperaturi ali v v pečici pri temperaturi, ki ne presega 40 °C.

Lipoproteine ​​obarvamo s sudansko črno B. Za barvanje popolnoma posušene plošče damo za 3 ure v raztopino barvila, nato jih razbarvamo s 50% etanolom, dokler ozadje ni popolnoma jasno. Lipoproteini se obarvajo temno modro. Barvati je treba popolnoma posušen preparat, ker je Sudan black B netopen v vodi in obarva moker gel.

Računanje rezultatov pri študiji frakcijske sestave pripravkov humanega imunoglobulina se izvaja vizualno s primerjavo elektroforegrama testnega vzorca z elektroforegramom kontrolnega vzorca - normalnega seruma človeške krvi ("Standardni vzorec testnega sistema za določanje frakcijska (antigenska) sestava pripravkov iz človeškega krvnega seruma z imunoelektroforezo" ali drugega kontrolnega vzorca v skladu z navodili v regulativni dokumentaciji), ki mora pokazati predpisano število precipitacijskih črt s serumom proti humanim serumskim beljakovinam (najmanj 15 precipitacijskih linij). pri uporabi " standardni vzorec testni sistemi za določanje frakcijske (antigenske) sestave pripravkov iz človeškega krvnega seruma z imunoelektroforezo). Glavna sestavina pripravka humanega imunoglobulina mora ustrezati imunoglobulinu G (Ig G) normalnega človeškega krvnega seruma.

Obračunavanje rezultatov pri izvajanju študij za potrditev pristnosti produktov človeške krvi se izvaja vizualno z identifikacijo precipitacijskih linij s serumom proti serumskim beljakovinam človeške, goveje, konjske in prašičje krvi. Precipitacijske črte je treba zaznati samo s serumom proti človeškim serumskim beljakovinam.

Opombe

1. Priprava 0,05 M pufrske raztopine veronal-medinal(pH 8,6±0,1). V merilno bučko prostornine 1000 ml dodamo 1,38 g veronala, 8,76 g medinala, dolijemo prečiščeno vodo do oznake in mešamo, dokler se popolnoma ne raztopi.

1. Priprava 0,05 M raztopine boratnega pufra(pH 8,6±0,1). V merilno bučko s prostornino 1000 ml dodamo 6,7 g Borova kislina, 13,4 g 10-vodnega natrijevega tetraborata, dodamo prečiščeno vodo do oznake in premešamo.
2. Priprava 1,25% agar gela. Priprava agar gela poteka na enega od naslednjih načinov:
3. Za pripravo 1,25% agar gela uporabimo 0,05 M veronal-medinalni pufer (pH 8,6 ± 0,1) z dvojno koncentracijo soli (2,76 g veronala in 17,52 g medinala na 1000 ml prečiščene vode).
4. Za pripravo 1,25% agar gela se uporablja raztopina boratnega pufra (pH 8,6 ± 0,1) z dvojno koncentracijo soli (v tem zaporedju: 13,4 g borove kisline in 26,8 g natrijevega tetraborata 10-vodnega na 1000 ml prečiščene vode).

V kemično čašo s prostornino 1000 ml dodamo 12,5 g agarja, dodamo 500 ml prečiščene vode in pustimo gel eno uro nabrekati pri temperaturi (20 ± 1) 0 C. Čaša z vsebino damo v vrelo vodno kopel in inkubiramo, dokler se agar popolnoma ne stopi. Volumen raztopine gela naravnamo z vodo na 500 ml, nato dodamo enako količino veronal-medinske ali boratne puferske raztopine (ali druge puferske raztopine, navedene v monografiji ali normativni dokumentaciji). Raztopino agarja filtriramo skozi 2-3 plasti gaze, dodamo tiomersal do koncentracije 100 μg / ml in vlijemo v 40-50 ml viale (potrebna količina za dve plošči). Stopljeni agar mora biti bister.

1. Priprava barvne raztopine amido črnega 10B. Priprava raztopine barvila se izvede na enega od naslednjih načinov:
2. V merilno bučko s prostornino 1000 ml dodamo 1,0 g amidne črne 10B, 450 ml 0,1 M raztopine ocetne kisline, 550 ml 0,1 M raztopine natrijevega acetata in premešamo.
3. V merilno bučko s prostornino 1000 ml dodamo 1,0 g amino črnila 10B, 100 ml ledocetne kisline, s prečiščeno vodo dopolnimo prostornino do oznake in premešamo. Po 12 urah filtriramo skozi papirnati filter.
4. Priprava barvne raztopine Sudan black B. V merilno bučko s prostornino 1000 ml dodamo 1,2 g črnega Sudana B, 20 ml 1 M raztopine natrijevega hidroksida, 380 ml prečiščene vode in z absolutnim etanolom dopolnimo volumen raztopine do oznake in premešamo. Mešanico za kratek čas prevremo, ohladimo na sobno temperaturo in po ohlajanju barvilo prelijemo v temno steklenico z brušenim zamaškom. Reagent hranimo pri sobni temperaturi 3 mesece.
5. Priprava 2% raztopine ocetne kisline za izpiranje agarja. V merilno bučko s prostornino 1000 ml dodamo 20,0 ml ledocetne kisline, dovedemo volumen raztopine s prečiščeno vodo do oznake in premešamo. Reagent hranimo pri sobni temperaturi 3 mesece.

Izum se nanaša na laboratorijsko opremo. Namen izuma je skrajšati čas raziskovanja in zmanjšati porabo gela. Naprava vsebuje kiveto 1, pregrado 2, pufersko raztopino 3, držalo 4 gela s pokrovom 11 in elektrode 12. V držalu 4 na delovni površini so vodoravni utori, povezani s kanali z votlinami na nasprotnih straneh. particije. Pokrov 11 ima vrsti lukenj 7 in 8, razporejenih v parih nad vsakim utorom. Nosilec in pokrov sta iz prozornega materiala. Serumi se namestijo v luknjici 7 in 8 in vklopi se napajanje. Kot rezultat reakcije nastane oborina, po kateri se oceni prisotnost ali odsotnost antigena. Reakcija poteka v zaprtem bloku, gel ne zapolni celotnega držala, temveč samo utore, kar omogoča manjšo porabo. 1 z.p. f-ly, 3 ilustr.

ZVEZA SOVJET

SOCIALISTIČNA

REPUBLIKA

OPIS IZUMA

DO CERTIFIKATA BTOPCKOMY

DRŽAVNI ODBOR

ZA IZUME IN ODKRITJA

NA SCST ZSSR

1 2)11 4)6111(1>(-1-1 (221 1(1.(n>.X7)

I 4t> I; 3 (I. I (j.> Ü. I ">. i X 4 (1 (711 Veeeon) zn>> n (e. (b (ni in lbor> trojni technpki (721 V. () !. (:obole(3, . 3. V. bap (tano> 3, V.. 1. Won, iüåv in 3. V. (; g3 IIHh (> v)

N ()6)7471), kl. A 6! V 5i ():), 1(177.

1541 Y(. E C3(r1(:Th() L, 15(!! P()BE:., ((.1!1! SI)

1! Y:) (Y ((OE.1 () .. (; TR (.) ZA! .3> "3 V (l, 1 (. (571 In (obreT (ni (od nouite> 1 do 1 "l)) ()()j) ()),"(onwin) I I(.lb tt 3(>()e l (. niya okrap (epis časovne tančice. i ne.> elova1eni)<.>„„SU„„15179 8 A 1 (5() 4 A b (V 5/04, C (01 3 33) 48

2 eo i (1.11 hv>ttl g „(, pregrada -”, b 1), (, terzh "te.> 4 gel e pokrov 11 II s. (ektrols 12. V držalu 4 na njegovem

Raen> in ll HIGH EVENT EXP.> N kibl G) RIZONT; 1.> ьHl, i (113> bi, povezan (kanali s poloetkami vzdolž E); t 1 p (> pogl., ((narejeni sosednji in pokrov) od h;>ts rial. Sy(>s>rotki ps>m"n11>n>t v geretia 7 in 8 in incln)11)n>t blok mola. V re T 3T (. reakcija ((ii obrdz3e1 u; i.t (> h, in kT () I) "% ted e) lyat o n,), (in" Hll lt, lit o ": an". l (ll "n in ll. k (). 1it 13 3 1 kE>tT(>M (<.1>h(, Г(. l b 3 ,!v

tl >t(ll a.(b1, in T(>novo>;o 1,1() 3 b1eHbllll(Tb (th P;t 1 3, in

Zahtevek

Izum se nanaša na medicinsko opremo in se lahko uporablja v krvni službi, oddelkih za nalezljive bolezni

6 bolnišnicah, v kliničnih diagnostičnih laboratorijih zdravstvenih ustanov.

Namen izuma je skrajšati čas izvajanja raziskav in zmanjšati porabo gela.

Na sl. 1 prikazuje napravo za

II!)()k3Deniss Red)I(HI(; nosilec kid Fig. 2, cut, Fig. 3 enako, pogled od zgoraj.

Naprava za imunoelektroforezo je sestavljena iz vetu 1, ki je po celotni dolžini razdeljen s pregrado 2 na dva dela, ki tvorita pufrsko-elektrodne prostore, napolnjene s pufersko raztopino 3.

111k particija 2, nameščen je nosilec 4 gs I) I, ki je prozoren in

6 1()k, ki vsebuje vrsto rež 5, cat()!)bl(. imageK)T avtonomnih kanalov, ki povezujejo medpomnilnik 3 na obeh straneh particije 2. Vsak kanal ima dva ()Tk3cpcTkIkI b za njihovo izdelavo sonor () tkivo 7 in serum 8. Kanali so med seboj ločeni s tanko steno 9.

Za elektroforezo v aparatu pripravimo veronal-medinalni pufer iz barbita l I natrij (medinal 17,5 g in barG> in I I.ld Be!) he 1) l) 2,7 g B 1000 ml dis1 in, s , l )11)()k)k)IIII()II Voll.

Cilj r () govyaz iz 1) gara fi pmi>

k.("I1kckIT1), 1 g agarja na 100 ml pufrske raztopine.

11re.l noča) ohm žlebovi za elektroforezo 5 zai (.) nyak) 1 nosilec 0 (agar gel), 3dT (I v dslak gel) t vdolbine, v enem

1 I 3), r)) pufer 3, nosilec B.II)k)dk()T skozi septum 2. Cuvée Tv

3dk!)I l«d l() l pokrij 11 z elektrodama 2.

Naprava deluje na naslednji način.

Komora se napaja s konstantno napetostjo. S prehodom enosmernega toka skozi pufersko vezje elektrode - nosilec - pufer - elektroda se antigeni in protitelesa premikajo drug proti drugemu in medsebojno delujejo, tvorijo oborino, vidno s prostim očesom. Sediment omogoča presojo prisotnosti ali odsotnosti

1O antigen v proučevanih serumih. Tako je mogoče identificirati bolnike s klopnim k3blM encefalitisom, meningitisom, serumskim hepatitisom in drugimi imunološkimi boleznimi.

V predlagani napravi za vodenje -! 5 elektroforeza, tehnologija izdelave je močno poenostavljena, držalo je odpravljeno kompleksna zasnova, ampak zaradi dejstva, da reakcija poteka v zaprti enoti, in izhlapevanje in drugo zunanji dejavniki ne more vplivati ​​na serum in nosilec, nameščen v utore 5, je pokrov lahko raven. Tako se izboljšajo kazalniki kakovosti.

1. Naprava za izvajanje imunoelektroforeze v gelu, ki vsebuje kiveto, elektrode, predelno steno, ki deli komorno kiveto na dve votlini, in držalo za gel, nameščeno na predelni steni, značilna po tem, da je za zmanjšanje časa preučevanje in zmanjšanje porabe gela, držalo izdelano z vodoravnimi utori na delovni površini, ki so povezani s kanali z različnimi tlemi (kivetami), in opremljeno s ploščo Ç5 v stiku z njegovo delovno površino in ima vrste lukenj, ki se nahajajo v parih nad vsakim utorom .

Imunoelektroforeza- ena izmed najbolj razširjenih metod kvalitativne analize antigenov. Z ustreznim obarjalnim AS se lahko uporablja za preiskavo katere koli antigenske mešanice. Zlasti se uspešno analizirajo beljakovine krvnega seruma, cerebrospinalne tekočine, urina, mleka, izvlečki iz organov, pa tudi beljakovine rastlinskega in bakterijskega izvora. V kliniki se ta metoda najpogosteje uporablja pri diagnozi paraproteinemije in stanja imunske pomanjkljivosti. IN sodna medicina uporablja se za analizo sistemov haptoglobina in skupinsko specifične komponente Gc.

V raziskovalnem delu je imunoelektroforeza glavna metoda za identifikacijo beljakovin v kompleksnih mešanicah. Nepogrešljiv je kot metoda za dosledno spremljanje procesa čiščenja beljakovinskih pripravkov. Pogosto se uporablja tudi za nadzor pristnosti in čistosti teh pripravkov. Seveda je bilo treba metodo, ki ima tako široko uporabo, spreminjati in izboljševati v različnih smereh. Predlagani so bili novi nosilci: agarozni gel, PAAG, filmi celuloznega acetata.

Hkrati se je IEF začel kombinirati z različne metode specifično barvanje in fluorokromizacija za odkrivanje encimov, ogljikovih hidratov, lipoproteinov, nukleoproteinov. Kot rezultat kombinacije z drugimi metodami analize so se pojavile disk imunoelektroforeza, imunoelektrofokusiranje, radioimunoelektroforeza itd.. Za kvantitativno določanje z uporabo polispecifične AS je bil nedavno predlagan dvodimenzionalni IEF. Posebna modifikacija dvodimenzionalnega IEF lahko poveča njegovo občutljivost na raven RIA. To dosežemo z elektroforetično eluacijo antigena iz majhnih steklenih posod s prostornino 0,1-10 ml. Za IEF s hlajenjem je Wimet zasnoval napravo, ki med postopkom ločevanja samodejno vzdržuje konstantno temperaturo in tok.

Ta naprava je zelo priročna za določanje elektroforetske mobilnosti različnih snovi. Uporaba termoelektričnega hlajenja (Peltier baterija) v tej napravi je še posebej priporočljiva pri delu z encimi in drugimi termolabilnimi snovmi. Pred kratkim je bila predlagana preprosta metoda za ločevanje beljakovin v dvodimenzionalni elektroforezi. Znana je občutljiva metoda za določanje neobarjajočih sistemov antigen-protitelo na podlagi uporabe MAb, tako imenovani kaskadni IEF, ki vključuje fiksacijo AG po elektroforezi, pritrditev protiteles na antigene, odstranitev vezanih protiteles in njihovo kvantifikacijo.

Pri imunofiksacijski elektroforezi ločujemo protitelesa in ne antigena. Je hitra in ekonomična metoda, posebej primerna za množično presejanje za odkrivanje paraproteinemije in za pridobivanje beljakovinskih pripravkov. Pri IEF pogosto opazimo motnje v normalnem poteku procesa in ni vedno mogoče takoj odkriti njihovega vzroka. Če na primer uporabimo nezadostno prečiščen agar, pa to najpogosteje vodi do treh kršitev: slaba tvorba gela, močna elektrosmoza, slaba obarvanost preparatov. Nezadostno čist agar je treba vedno prečistiti. Ko začnete z novo porcijo agarja, morate najprej preizkusiti njegovo primernost. Pogosto se ugotovi, da imajo isti antigeni različno elektroforetično mobilnost in se različno obarvajo pri uporabi različnih serij agarja. Motnje IEF lahko povzroči hidroliza agarja zaradi ponavljajočega ali predolgega segrevanja.

Hidrolizo dokazuje oslabitev lastnosti tvorjenja gela in pojav nepravilnosti na površini gela. Elektroforetsko ločevanje je lahko oslabljeno, če uporabite napačno pufersko raztopino. Večina pufrov služi kot dobro gojišče za bakterije in plesni. Zato je treba pufersko zalogo hraniti v hladilniku ali pa ji dodati konzervans. Pufer, ki polni elektroforetično komoro, je treba zamenjati vsaj enkrat na teden. Pri večkratni uporabi elektrodnega pufra je treba po vsaki ločitvi zamenjati poli elektrod. Velikost napetosti na sponkah kamere običajno ne omogoča presoje fizična moč tok, ki teče skozi gel, zato mora biti miliampermeter zaporedno povezan v tokokrog. Med ločitvijo se tok skoraj vedno poveča. Ta pojav je posledica segrevanja gela, ki se povečuje s trajanjem elektroforeze.

Vendar pa lahko po začetnem dvigu tok v tokokrogu pade. Pogosto je to posledica sušenja trakov filtrirnega papirja, ki povezujejo gel s pufrom, ali celo zaradi sušenja samega gela. V tem primeru zmanjšajte ionsko moč pufra ali napetost na sponkah komore. Poleg tega lahko preprečite sušenje tako, da gelsko ploščo in papirnate trakove pred elektroforezo ovijete s polimernim filmom. Najbolj priročno je delati z virom, ki zagotavlja stalna sila tok (tokovna stabilizacija). Samoumevno je, da so rezultati IEF odvisni od kakovosti antigenov in antiserumov.

riž. 8. Princip imunoelektroforeze.

1. stopnja: elektroforeza antigena v agar gelu. Antigen migrira na neko hipotetično razdaljo.

2. stopnja: tok je izklopljen. V agarju se izreže utor, ki se napolni s protitelesi. Nastane padavinski lok. Teoretično antigen difundira radialno iz točkovnega vira, protitelesa pa difundirajo iz utora v enakomerni sprednji strani. Precipitati, ki nastanejo na mestih optimalnega razmerja antigena in protiteles, tvorijo lok. Lok se nahaja najbližje žlebu, kjer je koncentracija antigena največja.

Imunoelektroforeza pomaga identificirati antigene z elektroforetično mobilnostjo, zlasti kadar so v vzorcu prisotni drugi antigeni.

S to metodo v klinični imunologiji polkvantitativno določimo koncentracijo imunoglobulinov in identificiramo mielomske proteine ​​(slika 9).

riž. 9. Glavni razredi človeških imunoglobulinov v krvnem serumu, odkriti z imunoelektroforezo. V utor smo dodali kunčji antiserum. Prikazana je lokacija glavnih globulinskih frakcij. Ugotovljeni so bili trije od petih glavnih razredov človeških imunoglobulinov: IgG, IgA in IgM. Precipitacijski lok IgG se razteza od γ-regije do ά 2-globulinske regije, kar odraža izjemno heterogenost populacije protiteles tako v aminokislinski sestavi kot v skupnem naboju.

Na podlagi kombinacije elektroforeze z imunoprecipitacijo je bilo razvitih več uspešnih metod, pri vsaki od katerih gibanje antigena v električnem polju povzroči njegov stik s protitelesi. Protiimunoelektroforezo lahko uporabimo za odkrivanje antigenov, ki migrirajo v agarju na pozitivno nabito elektrodo.

Sl.10. Protiimunoelektroforeza. Zaradi endosmoze se protitelesa v gelu premikajo »nazaj«; antigen, ki je pri danem pH negativno nabit, se premakne na pozitivno elektrodo in ob stiku s protitelesi tvori oborino.

Ta metoda traja manj časa in je bolj občutljiv kot Uchterlonyjeva dvojna difuzija. Uporablja se za identifikacijo antigenov virusa hepatitisa B in ustreznih protiteles, protiteles proti DNA pri sistemskem eritematoznem lupusu, avtoprotiteles proti topnim jedrnim antigenom pri kolagenozah in protiteles (precipitinov) proti Asperqillusu pri alergijski bronhopulmonalni aspergilozi.

Raketna elektroforeza je kvantitativna metoda, ki vključuje vnos antigena v gel, ki vsebuje protitelesa. Padavinska linija ima obliko rakete, katere dolžina je določena s koncentracijo antigena.

Sl.11. raketna elektroforeza. Antigen, v tem primeru humani serumski albumin, je podvržen elektroforezi v gelu, ki vsebuje protitelesa. Razdalja med začetno luknjo in vodilnim robom loka, oblikovanega kot raketa, je odvisna od koncentracije antigena. V tem primeru so relativne koncentracije humanega serumskega albumina (od leve proti desni) 3, 2 in 1.

Tako kot nasprotna elektroforeza je hitra metoda, vendar se mora tudi tu antigen premakniti do pozitivno nabite elektrode. Tako je raketna elektroforeza primerna za proteine, kot so albumin, transferin in ceruloplazmin, medtem ko koncentracijo imunoglobulinov običajno določimo z enostavno radialno imunodifuzijo.

Ena najuspešnejših variant raketne elektroforeze je Laurellova dvodimenzionalna ali križna imunoelektroforeza. Hkrati se na prvi stopnji zmes antigenov elektroforetično loči v agaroznem gelu. Ločeni proteini so nato ponovno prisiljeni difundirati skozi gel pod vplivom električnega polja v drugo smer, pravokotno na prvo. Tako je mogoče količinsko opredeliti vsakega od antigenov mešanice. Najbolj impresiven primer je ocena stopnje pretvorbe C3 v inaktivirano obliko C3c, ki se pogosto pojavi med poslabšanjem v serumu bolnikov s sistemskim eritematoznim lupusom ali v sinovialni tekočini prizadetih sklepov v akutni fazi. revmatoidni artritis, kot tudi v drugih primerih.

Slika 12. Navzkrižna imunoelektroforeza.

A. Antigene ločimo z elektroforetično mobilnostjo v agarjevem gelu. Ozek vzdolžni trak (omejen s prekinjeno črto), ki vsebuje ločene antigene, se izreže iz gela in nanese na drug gel, ki vsebuje antiserum. Nato se elektroforeza izvede v smeri, ki je pravokotna na prvo; medtem ko antigeni reagirajo z antiserumom, ki ga vsebuje gel, s tvorbo precipitacijskih vrhov. Površina pod vrhom je odvisna od koncentracije danega antigena.

b. Elektroferogram, ki prikazuje pretvorbo komponente komplementa C3 (C3 → C3c) v serumu. Gel je dodatno obarvan. V tem primeru se loki združijo med seboj, saj imajo antigeni skupne determinante.

V. "Mountain Fantasy" - ta elektroforegram prikazuje neverjetne možnosti navzkrižno povezane imunoelektroforeze za ločevanje kompleksne mešanice antigenov.

Imunofluorescenca vključuje pritrditev fluorescentnega barvila, kot je natrijev izotiocianat, na molekulo protitelesa. Antigenski material (bakterije, celice ali njihove komponente), na katerega so pritrjena označena protitelesa, postane viden v ultravijolični svetlobi. Metoda ni kvantitativna, je pa v imunomorfologiji zelo pomembna za določanje lokalizacije antigenske strukture ali protitelesa.

Konkurenca z radioaktivnim antigenom(radioimunološka metoda) - ena najbolj sodobne metode. Obračunavanje reakcije antigen-protitelo se lahko izvede z uporabo radioizotopske metode v primeru uporabe "označenih" protiteles ali antigenov. Merjenje radioaktivnosti oborine omogoča oceno količine protiteles ali antigena v testnih vzorcih. S tem se poveča objektivnost ocene, pospeši obračun in poveča občutljivost reakcije. Najbolj občutljive (določitev 1-10 ng snovi) metode tekmovanja za protitelesa neoznačenega antigena z označenim. Načelo metode je naslednje. Uporabimo standardno količino antiseruma proti proučevanemu antigenu in standardno količino tega antigena, označenega z radioaktivnim 125 I, 131 I, 2 H ali drugim izotopom. Njihovo razmerje je takšno, da 70-80% označenega antigena vežejo protitelesa in tvorijo radioaktivno oborino z vrednostjo radioaktivnosti N. Če substrat, testiran na prisotnost tega antigena, vnesemo v reakcijski sistem, potem v prisotnosti antigena tekmuje z označenim antigenom in radioaktivnost oborine se zmanjša. Več kot je antigena v testnem vzorcu, manjša je radioaktivnost oborine. S to metodo se določa koncentracija v krvi, urinu in drugih snoveh tistih snovi, ki jih zaradi zanemarljivih koncentracij z biokemičnimi metodami ne zaznamo (hormoni: inzulin, rastni hormon, ACTH, gonadotropin, digoksin, somatotropin itd.). .).

riž. 13. Metoda za izolacijo membranskega imunoglobulina (IgM - 8S) s površine B-limfocitov.

1. Označevanje površinskih proteinov limfocitov s 125 I v prisotnosti laktoperoksidaze (LP).

2. Celična liza in sprostitev površinskih proteinov v raztopino.

3. Precipitacija označenih imunoglobulinov s specifičnim anti-Ig serumom.

4. Pranje in obarjanje oborine.

5. Uničenje oborine in elektroforetska analiza lahkih in težkih verig v poliakrilamidnem gelu

ELISA metoda predstavlja razvoj najbolj V zadnjih letih. Glede na občutljivost ni slabši od prejšnjega, vendar je enostavnejši v prisotnosti komercialnih reagentov. Protitelesa proti določenemu antigenu se adsorbirajo na stene polistirenskih epruvet. V to epruveto se doda preskusni substrat. V prisotnosti tega antigena se združi s protitelesi. Substrat odcedimo in v epruveto vnesemo protitelesa proti istemu antigenu. Ta protitelesa so označena z encimom, najpogosteje s kromovo peroksidazo. Označena protitelesa se pritrdijo na prejšnji kompleks in tudi ostanejo na stenah epruvete. Vsebino epruvete nadomestimo z mešanico kromogena (ortofenilendiamina) s substratom za ta encim - H 2 0 2 . Če je bil v testni tekočini želeni antigen, se encim fiksira na stene epruvete, razgradi H 2 0 2: sproščeni kisik obarva kromogen rumeno.

Wannierjeva metoda vključuje uporabo fotoelektričnega nefelometra za upoštevanje precipitacije, s katerim se beleži sprememba optične gostote seruma po dodatku antigena. Ko serum razredčimo z destilirano vodo, se optična gostota zmanjša. Če so v serumu protitelesa in kot razredčilo, vodna raztopina antigena, potem bo krivulja sprememb optične gostote drugačna. Najprej pride do zmanjšanja optične gostote, ko se kopiči zadostna količina antigena, se zmanjšanje ustavi, nato opazimo povečanje optične gostote mešanice antigen-protitelo.

Pojav lize- sposobnost nekaterih protiteles, da raztopijo celice, proti katerim so nastala. Ta protitelesa proti bakterijam se imenujejo bakteriolizini, proti eritrocitom - eritrolizini ali hemolizini. Za reakcije imunske lize je značilno, da se ne pojavijo v prisotnosti samo dveh sestavin – antigena in protitelesa. Prisotna mora biti še tretja komponenta, imenovana komplement. V različnih količinah je komplement v krvnem serumu mnogih živali; še posebej veliko ga je v krvnem serumu morski prašički. Sprva reakcija poteka po vrsti aglutinacije, nato se kompleksu antigen-protitelo pridruži komplement in pride do lokalnega raztapljanja membrane bakterij, eritrocitov ali drugih celic.

Pojav citotoksičnosti določajo protitelesa, imenovana citotoksini. Njihovo delovanje je v dejstvu, da imajo toksičen učinek in celicam odvzamejo sposobnost preživetja. Reakcijo za odkrivanje citotoksinov damo s suspenzijo celic v izotonični pufrski raztopini natrijevega klorida. Doda se jim barvilo, na primer eozin ali tripan modro. Žive celice niso obarvane, odmrle celice hitro zaznajo barvilo (v 30 s). Če celični suspenziji dodamo imunski serum, ki vsebuje citotoksine in komplement, celice pri testiranju z barvili odmrejo in se obarvajo. Odstotek odmrlih celic kaže na količino citotoksinov v krvnem serumu. Reakcija zahteva obvezno prisotnost komplementa.

Reakcija vezave komplementa (CFR) temelji na zgoraj opisani lastnosti komplementa, da se pridruži kompleksu antigen-protitelo. Natančneje, komplement je fiksiran na posebnem delu težke verige molekule protitelesa. Vendar postane to mesto dostopno šele po pritrditvi protitelesa na antigen. Ko se poveže z enim kompleksom antigen-protitelo, komplement ne more preiti na drug kompleks, ki se vnese v reakcijski sistem po interakciji prvega kompleksa in komplementa, dodanega v znani količini. Kot drugi kompleks se običajno uporablja tako imenovani hemolitični sistem - mešanica ovčjih eritrocitov s protitelesi proti njim. Če je prvi kompleks kompleks antigen-protitelo, potem v reakcijski mešanici ne bo prostega komplementa; ne bo prišlo do hemolize eritrocitov. Nasprotno, če v testnem materialu ni protiteles proti uporabljenim antigenom (na primer v krvnem serumu), bo komplement ostal prost in zagotovil hemolizo eritrocitov. RSK se uporablja pri diagnostiki sifilisa (Wassermanova reakcija), študijah protitkivnih protiteles in avtoprotiteles; pogosto se uporablja pri diagnozi številnih virusnih okužb.

Fenomen specifične zamude se pogosto uporablja za primerjavo dveh proučevanih antigenov. Na primer, imunske serume pripravimo proti mišjim eritrocitom. Da bi ugotovili, ali vsebuje protitelesa proti eritrocitom sorodne živalske vrste (podgane), serum obdelamo z eritrociti podgan. Če se raven protiteles v serumu zmanjša, potem obstajajo sorodni antigeni, če popolnoma pade, potem so antigeni enaki. S pomočjo te reakcije so bili številni sorodni antigeni in hapteni analizirani glede identitete ali neidentitete.

Reakcija nevtralizacije toksinov. Antitoksini se imenujejo protitelesa proti bakterijskim in nekaterim drugim (na primer kačji strup) toksinom antigenske narave. Antitoksini jih v kombinaciji z ustreznimi strupenimi snovmi nevtralizirajo. Stopnjo nevtralizacije je mogoče upoštevati z dajanjem mešanice toksina in antitoksina dovzetni živali. Količina antitoksina v imunskem serumu je označena s številom minimalnih letalnih odmerkov toksina, ki jih lahko nevtralizira določena količina seruma. Reakcija nevtralizacije se uporablja za določanje koncentracije toksinov povzročiteljev davice, tetanusa itd. Za to se uporabljajo standardizirani antitoksični serumi.

Fenomen opsonizacije sestoji iz dejstva, da protitelesa povečajo fagocitno aktivnost nevtrofilcev in makrofagov v zvezi s tistimi antigenskimi snovmi ali mikroorganizmi, proti katerim so pridobljena. Na primer, aktivnost fagocitov proti stafilokokom se znatno poveča, če levkocite ali darovalca levkocitov zdravimo z antistafilokoknim serumom. To delovanje je bilo povezano s prisotnostjo specifičnih protiteles proti opsoninu. Vendar je treba upoštevati, da ni posebnih protiteles opsoninov, hemolizinov, bakteriolizinov ali precipitinov. To so samo manifestacije glavne funkcije imunoglobulinskih molekul, da tvorijo specifičen kompleks antigen-protitelo.

D. Grey vodi dober primer enotnost in raznolikost te funkcije. Protitelesa, pripravljena proti pnevmokoknemu polisaharidu tipa I, lahko:

1) povzročajo aglutinacijo pnevmokokov tipa I in otekanje njihove kapsule;

2) povzročajo obarjanje topnega ekstrakta iz pnevmokokov tipa I;

3) priložite dopolnilo, tj. zagotovite RSK;

4) imeti opsonizacijski učinek na levkocite proti pnevmokokom tipa I;

5) izvaja specifično zaščito živali pred pnevmokokno okužbo.

Kljub temu se v različnih specifičnih eksperimentalnih ali kliničnih situacijah daje prednost specifičnim reakcijam antigen-protitelo. Pri diagnosticiranju tifus uporabite Vidalovo reakcijo - aglutinacijo bakterij, za analizo antigenskih komponent kompleksnih bioloških tekočin ali tkivnih izvlečkov - precipitacijske reakcije v agarju v obliki imunodifuzije ali imunoelektroforeze. Pri delu s toksini in številnimi topnimi antigeni se uporabljajo metode pasivna hemaglutinacija. Za določanje ravni hormonov v krvi je najbolj primerna radioimunološka metoda itd. Različni razredi imunoglobulinov na različne načine kažejo funkcijo povezovanja z antigenom.

Načelo protiimunoelektroforeza(VIEF) je sestavljen iz hkratnega gibanja antigenov in protiteles drug proti drugemu v gelu pod vplivom električnega toka.

Kot rezultat njune specifične interakcije nastane črta oborine. Metoda združuje preprostost gelske difuzne precipitacijske reakcije z visoko ločljivostjo elektroforeze. Čeprav je ta metoda slabša glede občutljivosti na metodo fluorescentnih protiteles in reakcijo posredna hemaglutinacija, vendar ne zahteva luminiscenčnih protiteles, luminiscenčnega mikroskopa in eritrocitnega diagnostika.

WIEF je kvalitativna metoda. Je zelo specifičen in enostaven za izvedbo. Uporablja se lahko za odkrivanje bakterijskih ali virusnih antigenov v patološkem materialu, organih laboratorijskih (bioloških) živali ali predmetih iz okolja.

Materiali in oprema. 1. Agaroza A in B. 2. 0,05 M medinalni HCl pufer (pH 8,6). 3. Natrijev klorid. 4. Disubstituirani natrijev fosfat. 5. monosubstituiran kalijev fosfat. 6. Kalijev klorid. 7. Amonijev oksalat. 8. Specifični bakterijski ali virusni antigen. 9. Kamera za elektroforezo. 10. DC usmernik 50 mA. 11. Električni termostat za suhi zrak. 12. Namizna laboratorijska centrifuga.

Tehnika nastavitve. Na vodoravno nameščeno stekleno ploščo vlijemo 30 ml staljene 1% agaroze, pripravljene v pufru Medinal - HCl (pH 8,6). Ko se gel strdi, z luknjačem izrežemo dve dvojni vrsti lukenj s premerom 5 mm (8 lukenj v vsaki vrsti); razdalja med dvojne vrste je 30 mm. Gel vzamemo iz vdolbinic, zberemo v epruveto, stopimo nad plamenom gorilnika in s pomočjo Pasteurjeve pipete prenesemo na dno vdolbinic.

S strani katode je postavljen testni material, s strani anode pa monospecifični serum, vendar bolje monoklonska protitelesa (MAB) v volumnu 0,035 ml. Na primer za odkrivanje pnevmokoka - antapnevmokokni serum, za odkrivanje antigena virusa influence - antiinfluenca itd.

Ploščo postavimo v elektroforezno komoro tako, da se pena, ki se uporablja kot povezovalni most med pufrskim sistemom in nosilnim gelom, dotika slednjega. Elektroforezo izvajamo pri sobni temperaturi pri napetosti 140...150 V in toku 35 mA 18...35 minut.

Nadzor. Študijo materiala v VIEF za prisotnost specifičnega antigena mora spremljati kontrola z znanim pozitivnim materialom.

Odkrivanje povzročitelja v kombinaciji VIEF z rejo. Za sejanje kontaminiranega materiala je treba uporabiti selektivna gojišča.

Po 36-urni inkubaciji pri 37 °C dodamo 0,3 ml 0,85 % raztopina NaCl s 4% formalinom se naredi izpiranje, ki se posesa v epruveto in po izpostavitvi 1 uro pregleda na VIEF.

Računovodstvo rezultatov. pri pozitiven rezultat med vdolbinico s testnim materialom in vdolbinico s specifičnim serumom se pojavi preščitata črta. Črta oborine, odvisno od količine antigena v testnem materialu, se lahko nahaja na sredini razdalje med vdolbinicami ali bližje rezervoarju seruma.

Običajno se črte oborine oblikujejo 18–35 minut po začetku elektroforeze.

Če najdete napako, označite del besedila in kliknite Ctrl+Enter.