Domov → Analize → Imunološka metoda → Hemaglutinacijske reakcije (imunološka metoda)

Aglutinacijske reakcije temelji na interakciji reagenta (protiteles) z antigeni, ki se nahajajo na površini celic ali tujih delcev. Posledično nastanejo veliki agregati, ki se izločajo in jih lahko vidimo tudi s prostim očesom. Tako se krvna skupina določi glede na sistem ABO, prisotnost Rh faktorja v njem itd. To je bolj občutljiva diagnostična metoda v primerjavi z reakcijami padavin, saj volumen usedline (aglutinata) presega volumen oborine.

Neposredna hemaglutinacija

Test neposredne hemaglutinacije (RPHA) se uporablja za odkrivanje površinskih antigenov mikroorganizmov in eritrocitov ter protiteles proti njim.
TO standardni serumi ki vsebujejo protitelesa, dodajte testni material (kri). Hitrost neposredne aglutinacijske reakcije je odvisna od količine testnega materiala, količine in koncentracije seruma ter temperature okolja.

Posredna hemaglutinacija

reakcija posredna hemaglutinacija izvaja se za odkrivanje protiteles v pacientovi krvi z diagnostikom eritrocitov. Reagent so eritrociti, na površini katerih se nahaja antigen (proteini mikroorganizmov, toksini, alergeni itd.).
Krvni serum bolnika razredčimo z 0,9 % raztopino natrijevega klorida, nato dodamo eritrocitni diagnostik in spremljamo rezultat. Ta zelo občutljiva diagnostična metoda zazna antigene tudi pri nizkih koncentracijah.

Hemaglutinacijska reakcija (RGA).

V laboratoriju se uporabljata dve različni reakciji hemaglutinacije.

Prvi RGA se nanaša na serološke. Pri tej reakciji pride do aglutinacije eritrocitov pri interakciji z ustreznimi protitelesi (hemaglutinini). Reakcija se pogosto uporablja za določanje krvnih skupin.

Drugi RHA ni serološki. V tem primeru ne pride do aglutinacije eritrocitov

protitelesa, temveč posebne snovi, ki jih tvorijo virusi. Na primer, virus gripe aglutinira piščančje eritrocite in morski prašički, virus poliomielitisa - ovčji eritrociti. Ta reakcija omogoča presojo prisotnosti določenega virusa v testnem materialu.

Reakcijo izvajamo v epruvetah ali na posebnih ploščah z vdolbinicami. Material, ki ga testiramo na prisotnost virusa, razredčimo z izotonično raztopino od 1:10 do 1:1280; 0,5 ml vsake razredčitve zmešamo z enakim volumnom 1-2% suspenzije eritrocitov. V kontroli 0,5 ml eritrocitov zmešamo z 0,5 ml izotonične raztopine. Epruvete za 30 minut postavimo v termostat, plošče pa pustimo 45 minut pri sobni temperaturi.

Računovodstvo rezultatov. pri pozitiven rezultat reakcijo na dno epruvete ali vdolbinice pade oborina eritrocitov z nazobčanimi robovi (»dežnik«), ki prekrije celotno dno vdolbinice. Če je rezultat negativen, eritrociti tvorijo gosto oborino z gladkimi robovi ("gumb"). Enako oborino je treba nadzorovati. Intenzivnost reakcije je izražena z znaki "+".

Hemaglutinacijska reakcija

Titer virusa je največja razredčitev materiala, v katerem pride do aglutinacije.

Reakcija inhibicije hemaglutinacije

To je serološka reakcija, pri kateri je specifična protivirusna protitelesa, ki medsebojno delujejo z virusom (antigen), ga nevtralizirajo in odvzamejo sposobnost aglutinacije eritrocitov, t.j. zavirajo reakcijo hemaglutinacije. Ta reakcija vam omogoča, da določite vrsto in vrsto virusov.

Nastavitev reakcije. 0,25 ml protivirusnega seruma zmešamo z enako količino materiala, ki vsebuje virus. Zmes stresamo in postavimo v termostat za 30 minut, nato dodamo 0,5 ml 1-2% suspenzije eritrocitov.

Računovodstvo rezultatov. Pri pravilni nastavitvi poskusa pri kontroli seruma in eritrocitov bi moral nastati "gumb" - ni dejavnika, ki aglutinira eritrocite; pri antigenski kontroli nastane »dežnik« – virus je povzročil aglutinacijo eritrocitov. Če je serum homologen virusu, ki ga preučujemo, se oblikuje "gumb" - serum je nevtraliziral virus.

Reakcija posredne hemaglutinacije

Reakcija indirektne (pasivne) hemaglutinacije (RIHA) temelji na dejstvu, da eritrociti, če se na njihovi površini adsorbira topni antigen, pridobijo sposobnost aglutinacije pri interakciji s protitelesi proti adsorbiranemu antigenu.

Nastavitev reakcije. Serum segrevamo 30 minut pri 56 ° C, zaporedno razredčimo v razmerju 1:10 - 1:1280 in vlijemo v epruvete ali vdolbinice po 0,25 ml, kjer nato dodamo 2 kapljici eritrocitov z adsorbiranimi antigeni na njih.

Kontrole: suspenzija eritrocitov z antigeni, adsorbiranimi na njih z očitno imunskim serumom, suspenzija eritrocitov z antigeni, adsorbiranimi na njih z normalnim serumom; suspenzija normalnih eritrocitov s testiranim serumom. Pri prvi kontroli naj pride do aglutinacije, pri drugi in tretji pa je ne sme biti.

Kontrolna vprašanja.

1. Kaj pomeni pozitiven rezultat RGA med eritrociti in testiranim materialom na prisotnost virusa?

2. Ali pride do reakcije aglutinacije eritrocitov, če jim dodamo virus in njemu ustrezen serum? Kako se imenuje reakcija, ki razkrije ta pojav?

PRAKTIČNO DELO №12.

Reakcija vezave komplementa.

Reakcija vezave komplementa (RCT) temelji na dejstvu, da specifičen kompleks antigen-protitelo vedno adsorbira (veže) komplement nase.

Ta reakcija se pogosto uporablja pri identifikaciji antigenov in serodiagnostiki okužb, zlasti bolezni, ki jih povzročajo spirohete (Wassermannova reakcija), rikecije in virusi.

PCS je kompleksna serološka reakcija. Vključuje komplement in dva sistema antigen-protitelo. V bistvu gre za dve serološki reakciji.

Desni bazični sistem je sestavljen iz antigena in protitelesa (enega poznamo, drugega ne). Dodana mu je določena količina komplementa. Če se antigen in protitelo tega sistema ujemata, se bosta povezala in povezala kompliment. Nastali kompleks je fino razpršen in ni viden.

Tvorbo tega kompleksa poznamo s pomočjo drugega hemolitičnega ali indikatorskega sistema. Vključuje ovčje eritrocite (antigen) in njim ustrezen hemolitični serum (protitelesa), tj. že pripravljen imunski kompleks. V tem sistemu lahko pride do lize eritrocitov le v prisotnosti komplementa. Če je komplement vezan na prvi sistem, potem v drugem sistemu ne bo hemolize; brez prostega dopolnila. Odsotnost hemolize (vsebina epruvete je motna ali je na dnu epruvete sediment eritrocitov) se zabeleži kot pozitiven rezultat RSK.

Če v prvem sistemu antigen ne ustreza protitelesu, potem imunski kompleks ne nastane in kompliment bo ostal prost. Ko ostane prost, kompliment sodeluje v drugem sistemu, kar povzroči hemolizo, rezultat RSK je negativen (vsebina epruvet je prozorna - "lak kri").

Komponente, reakcije fiksacije komplementa:

1. Antigen - običajno lizat, ekstrakt, hapten,

manj pogosto suspenzija mikroorganizmov.

2. Protitelesa - bolnikov serum.

3. Komplement - serum morskega prašička.

4. Antigen - ovčji eritrociti.

5. Protitelesa - hemolizin na ovčje eritrocite.

6. Izotonična raztopina.

Glede na to, da RSC sodeluje veliko število kompleksne komponente,

jih je treba predhodno titrirati in vzeti v reakcijo v natančnih količinah in v enakih volumnih: 0,5 ali 0,25 ml, redkeje 0,2,1,25 ali 1,0 ml (večji volumni dajo natančnejši rezultat). Titracijo reakcijskih komponent izvedemo v enakem volumnu kot poskus, pri čemer manjkajoče sestavine nadomestimo z izotonično raztopino.

Povezane informacije:

Iskanje po spletnem mestu:

Reakcija posredne ali pasivne hemaglutinacije (RNHA ali RPHA) je bolj občutljiva in specifična od reakcije aglutinacije. Tudi ta reakcija se uporablja na dva načina.

1) Za odkrivanje protiteles v bolnikovem krvnem serumu se uporabljajo eritrocitni diagnostiki, pri katerih se antigen adsorbira na površini eritrocitov, obdelanih s taninom. V zvezi s to reakcijo se pogosteje uporablja izraz RPHA.

Testni serum razredčimo v vdolbinicah plastičnih ploščic in dodamo eritrocitni diagnostik. S pozitivno reakcijo se vzdolž sten luknje pojavi tanek film v obliki "čipkastega dežnika", s povratni udarec- gosta usedlina eritrocitov v obliki "gumba".

2) Za odkrivanje toksinov in bakterijskih antigenov v proučevanem materialu se uporabljajo protitelesni eritrocitni diagnostiki, pridobljeni z adsorpcijo protiteles na eritrocitih. V zvezi s to reakcijo se pogosteje uporablja izraz RNGA. Na primer, s pomočjo diagnostičnih protiteles se odkrije antigen bacila kuge, eksotoksin davice, eksotoksin botulina.

Kaj je eritrocitni diagnostik? Kaj je protitelesni eritrocitni diagnostik?

Eritrocitni diagnostiki so eritrociti (obdelani s taninom ali formalinom) z adsorbiranimi antigeni, ekstrahiranimi iz bakterij, in se uporabljajo pri RPHA (reakcija pasivne hemaglutinacije). V primeru, da RPGA uporabljamo za odkrivanje antigena v izločkih bolnikov, v tkivih itd., Uporabljamo "protitelesne diagnostike", to je eritrocite, senzibilizirane s protitelesi.

Pri RNGA se protitelesa v krvnem serumu odkrijejo z antigenskim diagnostikom eritrocitov, ki so eritrociti z adsorbiranimi antigeni.

Tehnika postavljanja reakcij. Reakcija koaglutinacije.

- fiksacija eritrocitov s formaldehidom ali glutarnimi ali akrilnimi aldehidi. Tako obdelani eritrociti so dolgotrajno shranjeni. Pogosteje se v ta namen uporabljajo eritrociti ovac, ljudi, kokoši itd.;
— obdelava fiksnih eritrocitov z raztopino tanina. Zaradi tega eritrociti pridobijo lastnost ireverzibilne adsorpcije beljakovin (virusov in protiteles) na svoji površini;
- preobčutljivost taniziranih eritrocitov z virusi ali protitelesi.

Reakcija koaglutinacije (RCA)

Reakcija koaglutinacije se uporablja za določanje antigenov z uporabo protiteles, adsorbiranih na proteinu A celic stafilokoka (protitelesni diagnostik).
Protein A ima afiniteto do Fc fragmenta imunoglobulinov, zato takšne bakterije, obdelane z imunodiagnostičnim serumom, nespecifično adsorbirajo serumska protitelesa, ki nato sodelujejo z aktivnimi centri z ustreznimi mikrobi, izoliranimi od bolnikov. Kot posledica koaglutinacije nastanejo kosmiči, sestavljeni iz stafilokokov, diagnostičnih serumskih protiteles in določenega mikroba.

Aglutinacijski serumi: kaj vsebujejo; kako se pridobivajo, za kaj se uporabljajo; kakšen je titer aglutinacijskega seruma?

Aglutinacijski serum dobimo z imunizacijo kuncev (intravenozno, subkutano ali intraperitonealno) s suspenzijo ubitih bakterij, začenši z odmerkom 200 milijonov, nato 500 milijonov, 1 milijardo, 2 milijardi mikrobnih teles v 1 ml, v intervalih 5 dni. 7-8 dni po zadnji imunizaciji vzamemo kri in določimo titer protiteles.

Titer aglutinacijskega seruma je največja razredčitev seruma, pri kateri pride do aglutinacije z ustreznim mikroorganizmom.

Aglutinacijski serumi se uporabljajo za identifikacijo mikrobov v podaljšani reakciji aglutinacije.

Hemaglutinacijska reakcija (RHA)

Če je proučevani mikroorganizem aglutiniran s serumom na titer ali na polovico vrednosti titra, se lahko šteje, da pripada vrsti, katere ime je navedeno na nalepki ampule.

Kakšne so razlike med polivalentnimi in monovalentnimi (monoreceptorskimi) aglutinacijskimi serumi; Zakaj pri imunizaciji zajca z mikrobi ene vrste nastane serum, ki vsebuje protitelesa proti več antigenom?

Monoreceptorski serumi - serumi, ki vsebujejo protitelesa samo proti enemu antigenu, in polivalentni serumi, ki dajejo aglutinacijske reakcije z dvema ali tremi sorodnimi bakterijami, ki imajo skupni antigen. Za identifikacijo mikroorganizmov v reakciji aglutinacije se uporabljajo aglutinacijski serumi. Pomanjkljivost takih serumov je, da lahko dajejo skupinske aglutinacijske reakcije, tk. vsebujejo protitelesa proti bakterijam, ki imajo skupne antigene.

Hemaglutinacijska reakcija. Opis in uporaba

Temelji na dejstvu, da eritrociti, na katerih so predhodno adsorbirani antigeni, pridobijo sposobnost aglutinacije v prisotnosti homolognih serumov (protiteles).

V tem primeru imajo eritrociti vlogo nosilcev s specifičnimi determinantami, katerih aglutinacija se pojavi kot posledica reakcije antigen + protitelo.

Eritrocite, na površino katerih so antigeni trdno pritrjeni, imenujemo eritrocitni antigenski diagnostik ali eritrociti, senzibilizirani z antigenom.

Druga vrsta RNHA - protitelesa se adsorbirajo na površini eritrocitov in njihova kasnejša aglutinacija se pojavi v prisotnosti homolognega antigena. V tem primeru se takšni eritrociti imenujejo eritrocitni protitelesni diagnostikum ali eritrociti, senzibilizirani s protitelesi.

Na podlagi teh dveh temeljnih metodoloških pristopov so bile razvite in v uporabi številne modifikacije RNGA. Tako se kot nosilci uporabljajo majhni standardni delci lateksa. V tem primeru se reakcija imenuje reakcija aglutinacije lateksa (RLA) ali se uporablja zlati stafilokok- reakcija koaglutinacije itd. Običajno se diagnostiki eritrocitov pripravljajo v podjetjih biološke industrije, glavna izkušnja RNGA pa je že nameščena v diagnostičnih laboratorijih.

Priprava diagnostike eritrocitov vključuje naslednje korake:

• fiksacija eritrocitov s formaldehidom ali glutarnimi ali akrilnimi aldehidi. Tako obdelani eritrociti so dolgotrajno shranjeni. Pogosteje se v ta namen uporabljajo eritrociti ovac, ljudi, kokoši itd.;
• obdelava fiksnih eritrocitov z raztopino tanina. Zaradi tega eritrociti pridobijo lastnost ireverzibilne adsorpcije beljakovin (virusov in protiteles) na svoji površini;
• preobčutljivost taniziranih eritrocitov z virusi ali protitelesi.

Treba je opozoriti, da so metode priprave diagnostike eritrocitov za virusne okužbe drugačen.

Tehnika za nastavitev RNHA za odkrivanje in določanje titra protiteles je naslednja:

• zaporednim 2-kratnim razredčitvam seruma dodamo enake odmerke eritrocitov, senzibiliziranih z antigenom;
• zmes pustimo 2-3 ure pri sobni temperaturi ali 16-18 ur pri 4 °C;
• upoštevati rezultate. Če serum vsebuje protitelesa proti virusu, s katerim so bili eritrociti senzibilizirani, opazimo hemaglutinacijo, ki jo ocenimo v križnicah.

Serumski titer protiteles se vzame kot najvišja razredčina seruma, ki še zagotavlja hemaglutinacijo z vsaj dvema križanjema.

RNGA spremljajo vse ustrezne kontrole. Običajno postavijo reakcijo z mikrometodo.

RNHA omogoča reševanje naslednjih diagnostičnih nalog:

• odkrivanje protiteles in določanje njihovega titra v krvnem serumu z znanim eritrocitnim antigenskim diagnostikom;
• odkrivanje in identifikacijo neznanega virusa z uporabo znanega diagnostika protiteles proti eritrocitom.

Prednosti RNGA: visoka občutljivost, enostavnost nastavitve in hitra odzivnost. Vendar je pomembno opozoriti, da obstajajo velike težave pri pripravi stabilnih eritrocitnih diagnostikov (velika odvisnost od čistosti uporabljenih komponent, potreba po izbiri načina fiksacije, tanizacije in senzibilizacije eritrocitov za vsako vrsto virusa) .

Če najdete napako, izberite del besedila in pritisnite Ctrl+Enter.

V stiku z

REAKCIJA POSREDNE HEMAGLUTINACIJE, RNGA
(posredni hemaglutinacijski test)

Metoda za odkrivanje antigenov in protiteles, ki temelji na sposobnosti eritrocitov, na površini katerih so antigeni ali protitelesa predhodno adsorbirani, da aglutinirajo v prisotnosti homolognih serumov ali ustreznih antigenov.

Ko se odkrijejo antigeni, je reakcija indicirana z reverzno pasivno hemaglutinacijo - ROPHA (test obrnjene pasivne hemaglutinacije), in ko se odkrijejo protitelesa - s pasivno hemaglutinacijo - RPHA (test pasivne hemaglutinacije). RNHA je našel široko uporabo za odkrivanje seroloških markerjev okužbe z virusom hepatitisa B, zlasti HBsAg in protiteles proti njemu.

Trenutno razvito različne metode proizvodnja eritrocitnih diagnostikov, ki se razlikujejo po metodah senzibilizacije eritrocitov (z uporabo tanina, glutaraldehida, kromovega klorida, rivanola itd.), Njihovih vrst (človek, oven, piščanec, puran itd.), Možnosti za postavitev reakcije ( v mikrotitrskih ploščah, epruvetah, kapilarah itd.) in zapisovanje rezultatov (vizualno in instrumentalno). Eritrocitne diagnostike za odkrivanje HBsAg in anti-HBs proizvajajo številna podjetja in podjetja doma in v tujini.

Pogosteje se RNHA izvaja v mikrotitrskih ploščah, v katerih so predhodno pripravljene razredčine testnega seruma in kontrolni vzorci. Po uvedbi eritrocitnega diagnostika in inkubacije zabeležimo rezultate reakcije. Vzorci, v katerih pride do aglutinacije eritrocitov v obliki obrnjenega "dežnika", se štejejo za pozitivne. Z negativno reakcijo se eritrociti usedejo na dno jamice v obliki obroča ali diska.

Za potrditev specifičnosti dobljenih rezultatov se reakcija izvede tako z "eksperimentalnim" eritrocitnim diagnostikom (tj. eritrociti, senzibilizirani z antigenom ali protitelesi) kot s "kontrolnim" diagnostikom (tj. eritrociti niso senzibilizirani z antigenom ali protitelesi) . Prisotnost pozitivne reakcije s "kontrolnim" diagnostičnim izdelkom kaže na lažno pozitivno reakcijo. Za odpravo nespecifičnih reakcij testirani serum obdelamo z nesenzibiliziranimi eritrociti. Predpogoj za izvedbo RNGA je nevtralizacijska reakcija, to je potrditveni test.

V primerjavi z metodami, kot so RPG, VIEF in RSK, ima reakcija indirektne hemaglutinacije večjo občutljivost (200-400-krat). Tako lahko HBsAg v TPHA zaznamo pri koncentracijah 6-10 ng/ml. Enostavnost reakcije in hitrost (20 - 30 minut) sta določili široko uporabo ta metoda v službi za transfuzijo krvi za odkrivanje HBsAg.

Poleg diagnostike eritrocitov so razvili diagnostične pripravke za dokazovanje HBsAg in anti-HBs ter za manifestacije anti-HBs, anti-HBs razreda IgM (različica trdne faze), HBeAg, antigen virusa hepatitisa A in protitelesa proti njemu, vendar vsi niso našli uporabe v praktičnem javnem zdravju.

Reakcija indirektne hemaglutinacije (RIGA).

RIGA se uporablja v dveh različicah: z znanimi antigeni za dokazovanje protiteles z znanimi protitelesi za dokazovanje hipertenzije. Ta reakcija je specifična in se uporablja za diagnosticiranje bolezni, ki jih povzročajo bakterije in rikecije. Za izvedbo RIGA se uporabljajo diagnostiki eritrocitov, pripravljeni z adsorpcijo AG ali AT na eritrocitih, odvisno od namena študije (slika 10.3). V pozitivnih primerih je stopnja aglutinacije eritrocitov označena s plusi. Štirje plusi ocenjujejo reakcijo, ki ima obliko tankega filma zlepljenih eritrocitov (dežnik), ki prekriva dno epruvete; prisotnost filma z nazobčanimi čipkastimi robovi je označena z dvema plusoma. Titer se vzame kot mejna razredčitev testnega materiala, ki je povzročila aglutinacijo eritrocitov z dvema plusoma.

riž. 10.3.

1 - eritrociti, 2 - eritrocitni AG, 3 - konjugiran AG, 4-AT

RGA in reakcija inhibicije hemaglutinacije (RTGA).

Kot smo že omenili, RGA temelji na sposobnosti eritrocitov, da se držijo skupaj, ko se na njih adsorbirajo določeni antigeni. Kot testni material za hemaglutinacijo se uporabljajo alantoična amnijska tekočina, suspenzija horionsko-alantoičnih membran piščančjih zarodkov, suspenzije in izvlečki iz kultur ali organov živali, okuženih z virusi, naravni infektivni material. RGA ni serološka reakcija, saj se pojavi brez sodelovanja imunskega seruma in se uporablja za izbiro delovne razredčitve AG za nastavitev RTGA ali prisotnosti AG (virusa) v testnem materialu (na primer pri gripi). Pri reakciji se uporabljajo eritrociti živali, ptic, ljudi s krvno skupino I (0). Za nastavitev približne RGA se na predmetno stekelce nanese kapljica 5% suspenzije eritrocitov in kapljica testnega materiala, ki se temeljito premeša. S pozitivnim rezultatom po 1-2 minutah makroskopsko opazimo pojav flokulentne aglutinacije eritrocitov. Za nastavitev RHA v podaljšani vrsti v vdolbinicah polistirenskih plošč pripravimo dvakrat večje razredčitve preskusnega materiala na fiziološka raztopina v prostornini 0,5 ml. V vse epruvete dodamo 0,5 ml 0,25-1% suspenzije eritrocitov. Rezultate upoštevamo po popolni sedimentaciji eritrocitov v kontroli (eritrociti + fiziološka raztopina). Reakcija se upošteva glede na naravo sedimenta eritrocitov. V pozitivnih primerih je stopnja aglutinacije označena s plusi. Štirje plusi ocenjujejo reakcijo, ki ima obliko tankega filma zlepljenih eritrocitov, ki prekriva dno epruvete (dežnika), reakcija z vrzelmi v filmu je označena s tremi plusi, prisotnost filma z nazobčanimi čipkastimi robovi zlepljenih eritrocitov označujeta dva plusa, kosmičasta usedlina eritrocitov, obdana s cono aglutiniranih grudic eritrocitov, ustreza enemu plusu. Ostro izražen sediment eritrocitov, ki se ne razlikuje od kontrolnega, kaže na odsotnost aglutinacije. Titer se vzame kot mejna razredčitev testnega materiala, ki je povzročila aglutinacijo eritrocitov z dvema plusoma. Če je rezultat RHA pozitiven, se študija nadaljuje z določanjem vrste izoliranega virusa z uporabo HA RT s tipsko specifičnimi serumi. RTGA temelji na sposobnosti antiseruma, da zavira virusno hemaglutinacijo, saj virus, nevtraliziran s specifičnimi protitelesi, izgubi sposobnost aglutinacije rdečih krvničk. Za približno tipizacijo virusov se uporablja metoda kapljice na steklo. Za dokončno določitev tipske pripadnosti izoliranega virusa in titracijo protiteles v serumih se v epruvete ali v jamice vstavi ekspandirana RTHA. V ta namen pripravimo dvakratne razredčitve serumov v fiziološki raztopini in jih vlijemo v 0,25 ml. Razredčinam seruma dodamo eno kapljico materiala, ki vsebuje virus, in eno kapljico 1% suspenzije eritrocitov. Pri uporabi RTGA za določanje tipa virusa uporabimo tipospecifične serume, ki jih dodamo enakemu volumnu delovne razredčine AG. Tipsko pripadnost izoliranega virusa ugotavljamo s specifičnim imunskim serumom, ki je pokazal najvišji titer protiteles proti temu virusu. RGA in RTGA se pogosto uporabljata za diagnosticiranje virusnih okužb ( klopni encefalitis, gripa itd.), da bi odkrili specifična protitelesa in identificirali številne viruse po njihovih antigenih.

Reakcija indirektne hemaglutinacije (RIHA)

Uporaba adsorbiranih diagnostičnih pripravkov temelji na principu imunološkega prepoznavanja površinskih struktur, ki se nenehno izvaja v naravi. S tega vidika ni bistvenih razlik med uporabo na primer mikrobne celice ali umetnega nosilca, obremenjenega z antigenom (protitelesi). Kot osnova sorbiranih pripravkov se uporabljajo različni nosilci - mikrobne celice, eritrociti, lateks, bentonin, holesterol, Sephadex, dermatol, Aktivno oglje, spore gliv itd.

Po delu A. T. Kravčenka (1945) so se eritrociti, ki jim je bila odvzeta sposobnost preživetja in fiksirani z različnimi kemičnimi reagenti, postali najbolj razširjeni kot nosilci antigena ali protiteles. Na principu uporabe eritrocitov (tako domačih kot fiksnih) kot nosilca antigena je reakcija posredne (pasivne) hemaglutinacije postala zelo razširjena.

Predlog za uporabo posredne hemaglutinacijske reakcije (IHA) za diagnostične namene je nastal na podlagi predhodno razvitih spoznanj o visoki sorpcijski aktivnosti eritrocitov. V primerjavi z mnogimi drugimi nosilci antigenov in protiteles imajo eritrociti določene prednosti pri reakciji indirektne hemaglutinacije. Najprej v izotonični obliki solne raztopine tvorijo precej stabilen oprijem in se ne zadovoljijo kratek čas. Drugič, rdeče krvne celice iste živalske vrste so enake velikosti. In končno, eritrociti relativno enostavno neposredno ali kot posledica posebne obdelave pritrdijo različne serološko aktivne komponente.

Izdelava eritrocitnih diagnostikov iz stabiliziranih eritrocitov omogoča premagovanje težav, ki nastanejo pri uporabi nativnih eritrocitov.

Pri preučevanju eritrocitov, obdelanih z različnimi fiksativi, so bile ugotovljene nekatere njihove skupne lastnosti:

V morfologiji se praktično ne razlikujejo od svežih;

Ni hemoliziran v hipotoničnih raztopinah, v vodi in po zamrzovanju-odmrzovanju;

Lahko se posuši z zamrzovanjem;

Njihove površinske strukture ohranjajo sposobnost kemijske modifikacije (npr. tanin, diazo spojine) in reagirajo z antigeni in protitelesi.

Glavno merilo za kakovost fiksnih eritrocitov je možnost njihove uporabe za pridobivanje senzibiliziranih pripravkov v odsotnosti nespecifične aglutinacije v stabilizacijskih tekočinah.

Pri oblikovanju diagnostičnih pripravkov je pomembna priprava površine eritrocitov za povečanje sorpcijske sposobnosti antigenov. Še posebej razširjena je obdelava eritrocitov s taninom.

Pod njegovim vplivom se spremeni antigenske lastnosti eritrocitov (prepustnost, hitrost sedimentacije), njihova odpornost na hemolitične učinke nekaterih maščobne kisline. Vendar pa je glavna stvar dosežena - tanizirani eritrociti imajo veliko večjo sorpcijsko sposobnost beljakovin, kar se trenutno pogosto uporablja pri izdelavi visokokakovostnih antigenskih in protitelesnih diagnostikov.

Poleg tanizacije eritrocitov se za izdelavo eritrocitnih diagnostikov in pripravo antigenskega nosilca uporabljajo kemični reagenti, kot so bromelain, triopsin in kalijev perjodat, ki modificirajo tudi membrane eritrocitov.

Po pripravi površine eritrocitov največ pomemben proces- proces hemosenzibilizacije - končna faza izdelava eritrocitnih diagnostikov.

Za krepitev povezave med nosilcem in antigenom se uporabljajo različne konjugacijske snovi - bisdiazobenzidin, difluorodinitrobenzin, cianid klorid, kadmijev klorid in ocetna kislina, bromov klorid, formaldehid, glutaraldehid, cianogen bromid, rivanol, amidol itd.

Uporaba konjugantov pomaga odpraviti pomanjkljivosti, ki jih imajo tanizirani eritrociti, ki se uporabljajo za senzibilizacijo brez konjugatorjev.

Najpogosteje uporabljene konjugacijske snovi so kromov klorid, glutaraldehid, diazolno črno C in amidol. Proces senzibilizacije s kromovim kloridom poteka zelo hitro - od 4 do 10 minut, kar pritegne pozornost raziskovalcev. V tem primeru se uporabljajo koncentracije kromovega klorida od 0,05 do 2%, pH ni nižji od 5,0 pri temperaturi reakcijske mešanice 20-250 C. V procesu senzibilizacije s kromovim kloridom karboksilne skupine proteinov membrane eritrocitov so aktivirani. Posledično nastane kovalentna vez med membrano eritrocita in senzitinom.

Reakcija indirektne hemaglutinacije ima visoko specifičnost, saj se aglutinacija eritrocitov pojavi kot posledica interakcije antigena s protitelesi, adsorbiranimi na eritrocitih. Njegova značilnost je visoka občutljivost: v njem se odkrije 0,02-0,05 μg protitelesnega proteina. Po občutljivosti bistveno presega reakcije imunodifuzije, imunofluorescence, radialne imunodifuzije, fiksacije komplementa in nevtralizacije. RNGA je manj občutljiva kot metode radioimunoelektroforeze, določanje količine beljakovin radioaktivnih protiteles v imunosorbentu, encimski imunski test.

Prednosti RNGA so dovolj visoka ponovljivost, enostavnost izvedbe in potreba po minimalnih količinah sestavin, zlasti pri uporabi mikrometode.

RNGA v Zadnja leta je našel široko uporabo pri diagnozi infekcijskega rinotraheitisa, driske, adenovirusna okužba, rota- in koronavirusna okužba, parainfluenca - 3 in respiratorna sincicijska okužba.

Navajamo primer izdelave in uporabe eritrocitnega diagnostika za dokazovanje protiteles proti rota- in koronavirusnim okužbam.

Metoda priprave protitelesnih diagnostikov za odkrivanje antigenov rota- in koronavirusa v RNGA je naslednja: pridobivanje suspenzije eritrocitov; fiksiranje njihovih akroleinov; tanizacija, ki omogoča stabilno sorpcijo potrebnega proteina na eritrocitih; senzibilizacija taniziranih eritrocitov z imunoglobulini; določitev specifičnosti pripravljenega diagnostikuma. Priprava suspenzije eritrocitov poteka tako, da se kri klinično zdravega ovna odvzame v bučko s steklenimi kroglicami. Po defibrinaciji krvi je treba eritrocite 3-5 krat sprati z izotonično (0,9%) raztopino natrijevega klorida s centrifugiranjem 15-20 minut pri 400 g.

Za stabilizacijo rdečih krvničk jih obdelamo z akroleinom. Kot veste, je njegovo delovanje nekoliko blažje od formaldehida, zagotavlja stabilnost in še več visoka aktivnost eritrocitov. Za to zmešamo enake količine 10% suspenzije eritrocitov z 0,2% raztopino akroleina, pripravljeno v raztopini fosfatnega pufra (PBS) s pH 7,2. Nastalo suspenzijo hranimo 30 minut pri 37 °C, temeljito premešamo, čemur sledi sproščanje akroleina s ponovnim centrifugiranjem 5 minut pri 600-800 g, dokler specifičen vonj popolnoma ne izgine. Prednost tako pripravljenih eritrocitov je, da se nabirajo za prihodnost, lahko dolgo časa vztrajati brez hemolize.

Nato stabilizirane eritrocite v 10 % koncentraciji dva meseca hranimo pri 2-4 °C v PBS s pH 7,2.

Za povečanje sorpcijske sposobnosti in sedimentacije eritrocitov jih je treba tanizirati z mešanjem enakih delov 10% suspenzije opranih eritrocitov in raztopine tanina v PBS in pH 7,2 v razredčitvi 1:30.000. Zmes temeljito premešamo in vzdržujemo pri 370 C 15 minut, nato pa eritrocite temeljito speremo s tanina dvakrat v PBS s pH 7,2 in trikrat z izotonično raztopino natrijevega klorida s pH 7,2-7,4.

Optimalen čas za zagotovitev prejema visokokakovostnih diagnostičnih eritrocitov je njihova senzibilizacija v 24-48 urah po obdelavi s taninom.

Pri izdelavi diagnostikumov kot topilo in konzervans uporabljamo 0,3% fenolizirano izotonično raztopino natrijevega klorida z 0,1% normalnim kunčjim ali konjskim serumom, ki smo ga predhodno 30 minut inaktivirali pri 56°C in adsorbirali normalni ovčji eritrociti.37°C za 30 min.

Senzibilizacijo taniziranih eritrocitov je treba izvajati s hiperimunim serumom proti rota- oziroma velikim koronavirusom. govedo(izdelano na All-Russian Research Institute of Experimental Veterinary Medicine Ya.R. Kovalenko). Hkrati je senzibilizacijski odmerek (koncentracija beljakovin) protirotavirusnega imunskega seruma 280 μg/ml, imunskega seruma proti koronavirusu pa 260 μg/ml.

Senzibilizacijo izvedemo z mešanjem enakih volumnov taniziranih eritrocitov in imunskega seruma, predgretega 30 minut pri 560C v optimalni koncentraciji. Poleg tega dodamo 3 dele izotonične raztopine natrijevega klorida s pH 7,2 in 5 delov 0,1 % raztopine kromovega klorida. Zmes ob občasnem mešanju pustimo pri sobni temperaturi 5 minut. Po določenem času zmes temeljito speremo s PBS s pH 7,2, nato pa pripravljene eritrocitne diagnostike resuspendiramo v konzervansu do 1% koncentracije. Pripravljen diagnostik obdrži osnovne lastnosti 8 mesecev, če ga hranimo pri 4°C.

Na vseh stopnjah izdelave diagnostikov se spremlja samoaglutinacija. Specifičnost pripravljenih diagnostik je določena s staging RNGA, kjer so bili kot antigeni uporabljeni standardni diagnostiki virusov RTI, PG-3, adenovirusov, virusne diareje ter antigenov rota- in koronavirusa.

Pri nastavitvi RNHA pripravimo serijske dvojne razredčitve proučevanega materiala, ki vsebuje virus (20-50% suspenzija fekalnih vzorcev), nato pa v vsako vdolbinico dodamo enako količino eritrocitnega diagnostika. Plošče večkrat temeljito pretresemo in pustimo na sobni temperaturi, dokler se eritrociti v kontroli popolnoma ne usedejo. Kazalo pozitivna reakcija- aglutinacija eritrocitnega diagnostika z intenzivnostjo aglutinacije 2+ v titru 1:4 in več.

reakcija pasivne hemaglutinacije)

metoda za odkrivanje in identifikacijo antigenov ali protiteles, ki temelji na pojavu aglutinacije eritrocitov, ki se pojavi v njihovi prisotnosti, na površini katere so bili predhodno adsorbirani ustrezni specifični ali antigeni.

1. Mala medicinska enciklopedija. - M.: Medicinska enciklopedija. 1991-96 2. Prvič skrb za zdravje. - M.: Velika ruska enciklopedija. 1994 3. Enciklopedični slovar medicinski izrazi. - M.: Sovjetska enciklopedija. - 1982-1984.

Oglejte si, kaj je "reakcija posredne hemaglutinacije" v drugih slovarjih:

reakcija posredne hemaglutinacije- Laboratorijski test RNGA z diagnostiko eritrocitov. [Angleško-ruski glosar osnovnih pojmov o vakcinologiji in imunizaciji. Svetovna zdravstvena organizacija, 2009] Teme vakcinologija, imunizacija Sinonimi RNGA EN ... ... Priročnik tehničnega prevajalca

- (RNGA; sinonim za reakcijo pasivne hemaglutinacije) metoda za odkrivanje in identifikacijo antigenov ali protiteles, ki temelji na pojavu aglutinacije eritrocitov, ki se pojavi v njihovi prisotnosti, na površini katere so bili predhodno adsorbirani ... ... Velik medicinski slovar

- (RPHA) glej Reakcija indirektne hemaglutinacije ... Veliki medicinski slovar

Ta stran je glosar. # A ... Wikipedia

Glavne okrajšave, sprejete v Veterinarskem enciklopedičnem slovarju- a., aa, artena, arteriae aa ana (enako) Akademija medicinskih znanosti ZSSR medicinske vede Akademija znanosti ZSSR Akademije znanosti ZSSR Bac. bacilne bakterije. Bakterija BSSR Beloruska SSR v., vv. stoletje, stoletje v., vv. vena, venae VASKHNIL Vsezvezni red Lenina in ... ...

Ta izraz ima druge pomene, glej Kuga. Pasja kuga (Karejeva bolezen), akutna ali subakutna nalezljiva virusna bolezen, ki se kaže s povišano telesno temperaturo, katarjem sluznice, kožnimi lezijami, centralno ... ... Wikipedia

- (renes) parni izločevalni in endokrini organ, ki s funkcijo uriniranja uravnava kemično homeostazo telesa. ANATOMO FIZIOLOŠKI ORIS Ledvice se nahajajo v retroperitonealnem prostoru (Retroperitoneal space) na ... ... Medicinska enciklopedija

I (trihineloza; sinonim: trihineloza, "zabuhlost") helminthiasis iz skupine nematodoz, za katero so značilni vročina, mialgija, otekanje obraza, kožni izpuščaji eozinofilija v krvi in ​​pri hudih notranji organi in centralno..... Medicinska enciklopedija

- (nematodoze) helmintoze, ki jih povzročajo nematode iz razreda Nematoda. Med drugimi helminthiases, N. imajo najvišjo vrednost v človeški patologiji so večinoma geohelmintiaze (glej Helmintoze); razvoj njihovih jajčec ali ličink ... ... Medicinska enciklopedija

infekcijski epididimitis- Riž. 1. Povečanje levega moda pri ovnu z infekcijskim epididimitisom. riž. 1. Povečanje levega moda pri ovnu z infekcijskim epididimitisom. kužni epididimitis ovc (Epididymitis infectiosa arietum), kronični kužni ... ... Veterinarski enciklopedični slovar

Glej Reakcija indirektne hemaglutinacije... Veliki medicinski slovar