Temelji na dejstvu, da eritrociti, na katerih so predhodno adsorbirani antigeni, pridobijo sposobnost aglutinacije v prisotnosti homolognih serumov (protiteles).

V tem primeru imajo eritrociti vlogo nosilcev s specifičnimi determinantami, katerih aglutinacija se pojavi kot posledica reakcije antigen + protitelo.

Eritrocite, na površino katerih so antigeni trdno pritrjeni, imenujemo eritrocitni antigenski diagnostik ali eritrociti, senzibilizirani z antigenom.

Druga vrsta RNHA - protitelesa se adsorbirajo na površini eritrocitov in njihova kasnejša aglutinacija se pojavi v prisotnosti homolognega antigena. V tem primeru se takšni eritrociti imenujejo eritrocitni protitelesni diagnostikum ali eritrociti, senzibilizirani s protitelesi.

Na podlagi teh dveh temeljnih metodoloških pristopov je bilo razvitih in se uporabljajo številne modifikacije RNGA. Tako se kot nosilci uporabljajo majhni standardni delci lateksa. V tem primeru se reakcija imenuje reakcija aglutinacije lateksa (RLA) ali se uporablja zlati stafilokok- reakcija koaglutinacije itd. Običajno se diagnostiki eritrocitov pripravljajo v podjetjih biološke industrije, glavna izkušnja RNGA pa je že nameščena v diagnostičnih laboratorijih.

Priprava diagnostike eritrocitov vključuje naslednje korake:

fiksacija eritrocitov s formaldehidom ali glutarnimi ali akrilnimi aldehidi. Tako obdelani eritrociti so dolgotrajno shranjeni. Pogosteje se v ta namen uporabljajo eritrociti ovac, ljudi, kokoši itd.;
obdelava fiksnih eritrocitov z raztopino tanina. Zaradi tega eritrociti pridobijo lastnost ireverzibilne adsorpcije beljakovin (virusov in protiteles) na svoji površini;
preobčutljivost taniziranih eritrocitov z virusi ali protitelesi.

Treba je opozoriti, da so metode priprave diagnostike eritrocitov za virusne okužbe drugačen.

Tehnika za nastavitev RNHA za odkrivanje in določanje titra protiteles je naslednja:

zaporednim 2-kratnim razredčitvam seruma dodamo enake odmerke eritrocitov, senzibiliziranih z antigenom;
zmes pustimo 2-3 ure pri sobni temperaturi ali 16-18 ur pri 4 °C;
upoštevati rezultate. Če serum vsebuje protitelesa proti virusu, s katerim so bili eritrociti senzibilizirani, opazimo hemaglutinacijo, ki jo ocenimo v križnicah.

Serumski titer protiteles se vzame kot najvišja razredčina seruma, ki še zagotavlja hemaglutinacijo z vsaj dvema križanjema.

RNGA spremljajo vse ustrezne kontrole. Običajno postavijo reakcijo z mikrometodo.

RNHA omogoča reševanje naslednjih diagnostičnih nalog:

odkrivanje protiteles in določanje njihovega titra v krvnem serumu z znanim eritrocitnim antigenskim diagnostikom;
odkrivanje in identifikacijo neznanega virusa z uporabo znanega diagnostika protiteles proti eritrocitom.

Prednosti RNGA: visoka občutljivost, enostavnost nastavitve in hitra odzivnost. Vendar je pomembno opozoriti, da obstajajo velike težave pri pripravi stabilnih eritrocitnih diagnostikov (velika odvisnost od čistosti uporabljenih komponent, potreba po izbiri načina fiksacije, tanizacije in senzibilizacije eritrocitov za vsako vrsto virusa) .

RTGA princip je v tem, da se v epruveti zmešajo enaki volumni krvnega seruma in suspenzije virusa, po izpostavitvi pa se z dodajanjem suspenzije eritrocitov ugotovi, ali je virus v mešanici ohranjen. Aglutinacija eritrocitov kaže na prisotnost, odsotnost hemaglutinacije pa na odsotnost virusa v mešanici. Izginotje virusa iz mešanice virus + serum velja za znak interakcije seruma in virusnih protiteles.

Toda protitelesa medsebojno delujejo z antigeni v strogo določenih količinskih razmerjih. Da bi torej določeni količini virusa odvzeli sposobnost hemaglutinacije, je potreben določen minimum protiteles, in ker je ena od komponent RTGA vedno neznana, je treba reakcijo postaviti v vrsto epruvet. z različnimi odmerki protiteles in enakimi odmerki virusa ali obratno. To dosežemo z jemanjem različnih razredčin seruma in enake razredčine virusa ali različnih razredčin virusa in enake razredčine seruma.

RTGA vam omogoča reševanje naslednjih nalog: določitev titra protiteles proti hemaglutinacijskemu virusu v serumu; identificirati neznani hemaglutinacijski virus iz znanih serumov; ugotoviti stopnjo antigenske povezanosti obeh virusov.

Prednosti RTGA: enostavnost tehnike, hitrost, ni potrebno sterilno delo, specifičnost, nizki stroški. Slabost: RTGA je možna le pri hemaglutinacijskih virusih.

Princip titracije protiteles pri RTGA sestoji iz naslednjega:

- pripravite vrsto zaporednih (običajno 2-kratnih) razredčitev testnega seruma v enakih volumnih (običajno 0,25 ali 0,2 ml);

– vsaki razredčitvi dodajte enake količine homolognega virusa v titru 4 HAU;

- mešanice zdržijo določen čas pri določeni temperaturi (za virus atipične kokošje kuge 40-60 minut pri sobni temperaturi);

– vsem mešanicam dodamo enake količine 1 % suspenzije opranih eritrocitov;

- po izpostavljenosti se hemaglutinacija v vsaki zmesi oceni v križnicah.

Reakcija vključuje kontrole seruma, virusa in eritrocitov.

Tisto največjo razredčitev seruma, ki še popolnoma zavre hemaglutinacijo, jemljemo kot indikator titra protiteles v tem serumu.

Uporaba v virologiji hemadsorpcijske reakcije.

RGAd. Hemadsorpcijo - povezavo eritrocitov s površino celic, prizadetih z virusom - sta prva odkrila Vogel in Ščelokov (1957) na tkivni kulturi, okuženi z virusom influence. Ta pojav temelji na afiniteti receptorjev virusa, ki se nahajajo na površini prizadete celice, z receptorji eritrocitov, kar povzroči njihovo medsebojno povezavo, podobno reakciji hemaglutinacije. Prednost te reakcije je, da postane pozitivna še preden se pojavijo izrazite citopatske spremembe v okuženih celicah.

Metodologija RGAd sestoji iz naslednjega. 3.–4. dan po okužbi celic vzamemo dve epruveti z isto celično kulturo, od katerih je ena okužena z materialom, ki vsebuje virus, druga pa je kontrolna. Kulturno tekočino odlijemo iz obeh epruvet in v obe epruveti dodamo 2–3 kapljice 0,5 % suspenzije opranih eritrocitov. Obe epruveti pustimo 5-10 minut, da so eritrociti na površini celic (postavljene vodoravno na mizo), nato pa rahlo speremo s fiziološko raztopino in pregledamo pod mikroskopom (majhna povečava). V kontrolni epruveti so rdeče krvne celice popolnoma odstranjene s fiziološko raztopino, nekaj preostalih pa lebdi s tekočino. Če eritrociti v okuženi epruveti niso odstranjeni s fiziološko raztopino in ne lebdijo, ampak so pritrjeni na površino celic, je treba RHAd šteti za pozitivnega.

Razporeditev rdečih krvnih celic je lahko trojna, odvisno od virusa in vrste celic:

- eritrociti se adsorbirajo samo na obrobju celične plasti v obliki "ogrlice" (virus afriške prašičje kuge);

- eritrociti se nahajajo na celični plasti v žariščih ali skupkih (virus gripe);

- eritrociti so difuzno locirani na celični plasti (virus parainfluence).

Vsak virus je sposoben adsorbirati rdeče krvne celice določenih živalskih vrst.

Serološka diagnoza virusnih bolezni s povečanjem titra protiteles v parnih krvnih serumih.

Reakcija hemaglutinacije (RGA) in reakcija inhibicije hemaglutinacije (HITA), mehanizem, sestavine in uporaba reakcij.

Osnova hemaglutinacijske reakcije je pojav aglutinacije eritrocitov, ki se pojavi pod vplivom različni dejavniki. Razlikujemo neposredno in posredno hemaglutinacijo.

Najprej eritrocite speremo z izotonično raztopino natrijevega klorida, nato pa po potrebi (pri uporabi antigenov beljakovinske narave) obdelamo z raztopino tanina 1: 20.000 in senzibiliziramo s topnimi antigeni. Po izpiranju s pufrano izotonično raztopino natrijevega klorida je eritrocitni antigen pripravljen za uporabo.

Testne serume razredčimo z izotonično raztopino natrijevega klorida v epruvetah ali posebnih plastičnih ploščah z luknjami, nato vsaki razredčini seruma dodamo eritrocitni diagnostik. Rezultati reakcije posredna hemaglutinacija upoštevajo narava sedimenta eritrocitov, ki nastane na dnu epruvete. Rezultat reakcije se šteje za pozitiven, pri katerem eritrociti enakomerno pokrivajo celotno dno epruvete. Z negativno reakcijo se rdeče krvne celice v obliki majhnega diska ali "gumba" nahajajo na sredini dna epruvete.

Glavne komponente RP:

A) topni antigen

B) Specifična protitelesa (serum)

(RTGA) je metoda za identifikacijo virusa ali odkrivanje protivirusnih protiteles v bolnikovem krvnem serumu, ki temelji na pojavu odsotnosti aglutinacije eritrocitov z zdravilom, ki vsebuje virus, v prisotnosti krvnega seruma, imunega nanj.
temelji na blokadi, zatiranju antigenov virusov s protitelesi imunskega seruma, zaradi česar virusi izgubijo sposobnost aglutinacije rdečih krvnih celic.

RTHA se uporablja za diagnosticiranje številnih virusnih bolezni, katerih povzročitelji (gripa, ošpice, rdečke, klopni encefalitis itd.) Lahko aglutinirajo eritrocite različnih živali.
Mehanizem. Tipizacijo virusa izvajamo s testom inhibicije hemaglutinacije (HITA) z nizom za tip specifičnih serumov. Rezultati reakcije se upoštevajo z odsotnostjo hemaglutinacije. Podtipi virusa A z antigeni H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 itd.

je mogoče razlikovati v RTGA z nizom homolognih za tip specifičnih serumov.

V jedru hemaglutinacijske reakcije leži pojav aglutinacije eritrocitov, ki se pojavi pod vplivom različnih dejavnikov.

Razlikujemo neposredno in posredno hemaglutinacijo.
Pri neposredni reakciji hemaglutinacije se eritrociti zlepijo, ko se nanje adsorbirajo določeni antigeni, na primer virusi.
V seroloških študijah se uporablja reakcija inhibicije neposredne hemaglutinacije, ko virus, izoliran od bolnika, nevtraliziramo s specifičnim imunskim serumom in nato kombiniramo z rdečimi krvničkami.

Odsotnost hemaglutinacije kaže na ujemanje virusa in uporabljenega imunskega seruma.

Posredno hemaglutinacijsko reakcijo (pasivno hemaglutinacijo) opazimo, ko eritrocitom, predhodno obdelanim (senzibiliziranim) z različnimi antigeni, dodamo imunski serum ali pacientov serum, ki ima ustrezna protitelesa.

Obstaja specifična vezava eritrocitov, njihova pasivna hemaglutinacija.

Reakcija indirektne ali pasivne hemaglutinacije je po občutljivosti in specifičnosti boljša od drugih seroloških metod in se uporablja pri diagnozi okužb, ki jih povzročajo bakterije, rikecije in protozoji.

Metoda določanja reakcije indirektne hemaglutinacije je sestavljena iz več stopenj.

Po izpiranju s pufrano izotonično raztopino natrijevega klorida je eritrocitni antigen pripravljen za uporabo. Testne serume razredčimo z izotonično raztopino natrijevega klorida v epruvetah ali posebnih plastičnih ploščah z luknjami, nato vsaki razredčini seruma dodamo eritrocitni diagnostik.

Rezultati reakcije indirektne hemaglutinacije se upoštevajo glede na naravo usedline eritrocitov, ki nastane na dnu epruvete. Rezultat reakcije se šteje za pozitiven, pri katerem eritrociti enakomerno pokrivajo celotno dno epruvete. Z negativno reakcijo se eritrociti v obliki majhnega diska ali "gumba" nahajajo na sredini dna epruvete.

Reakcija inhibicije hemaglutinacije- serološka reakcija, ki temelji na sposobnosti protiteles, da preprečijo aglutinacijo eritrocitov s hemaglutinacijskimi vrstami virusov (adenovirusi, arbovirusi, nekateri enterovirusi, virusi influence in parainfluence, ošpic, reovirusi).

Specifična protivirusna protitelesa sodelujejo s površinskimi molekulami hemaglutininov virionov teh virusov in blokirajo njihovo vezavo na komplementarne molekule membrane eritrocitov.

IN Zadnje čase reakcija se pogosto uporablja v laboratorijih klinične virologije za določanje titrov specifičnih protiteles proti določenim virusom, pa tudi za serološko identifikacijo in tipizacijo virusnih izolatov iz kliničnega materiala bolnikov.

Uporaba je nekoliko omejena zaradi prisotnosti v krvnem serumu ljudi nespecifičnih zaviralcev virusov, pa tudi naravnih protiteles - aglutininov.

Reakcija nevtralizacije - reakcija inhibicije hemaglutinacije (RTGA).

RTGA se uporablja:
-za serotipizacijo virusa;
- za serodiagnostiko okužb.
Obstajata dva načina nastavitve:
- metoda kapljanja na steklo ( orientacijska reakcija), ki se uporablja za serokopiranje virusov;
- razporejeni v epruvete.

Mehanizem.

Nekateri virusi (na primer gripe) imajo hemaglutinin, ki povzroča aglutinacijo eritrocitov različnih živali, odvisno od vrste virusa.

Ob prisotnosti protiteles v serumu - antihemaglutininov opazimo zaviranje aktivnosti virusov.
RTGA.
Namen: serotipizacija virusa influence A

Sestavine:
1. Material, ki se preučuje, je alantoična tekočina piščančjega zarodka,
2. Diagnostični tipospecifični serumi proti gripi,
3. 5% suspenzija piščančjih eritrocitov.
4.

Fiziološka raztopina.

Reakcijo postavimo na steklo s kapljično metodo. Na steklo nanesemo 1 kapljico diagnostičnih serumov in testnega materiala, premešamo, nato dodamo 1 kapljico suspenzije eritrocitov. Pri pozitivni reakciji opazimo homogeno pordelost, pri negativni reakciji pa se pojavijo rdeči kosmiči (hemaglutinacija).

Prejšnji31323334353637383940414243444546Naslednji

značilnosti virusov gripe. Epidemiologija in diagnostika gripe. Uporaba RTGA za serotipizacijo virusa influence. Pripravki za specifično profilakso in zdravljenje.

Gripa ali gripa - akutna okužba za katero so značilne lezije sluznice zgornjega dela dihalni trakt, zvišana telesna temperatura, splošna zastrupitev, motnje srčno-žilnega in živčnega sistema.

Za gripo je značilna nagnjenost k epidemiji in pandemiji zaradi visoke nalezljivosti in variabilnosti povzročitelja.

značilnosti patogenov. Patogeni - virusi gripe spadajo v družino. Orthomyxoviridae, rodovi Influenzavirus A, B in Influenzavirus C. Virusi influence so virusi RNA. Virus gripe tipa A so leta 1933 izolirali W. Smith, K. Andrews, P. Laidlaw. Leta 1940 je T.

Uporaba metode hemaglutinacije v virologiji.

Francis in R. Medzhill sta izolirala viruse gripe tipa B, leta 1949 R. Taylor - tip C. V Rusiji je prve viruse influence leta 1936 izoliral A. A. Smorodintsev in jih uvrstil v tip A. Morfologija. Virusi gripe imajo sferično obliko (oblika krogle) - 80 - 120 nm, manj pogosto imajo nitasto obliko. Sestavljeni so iz: 1) jedra - nukleokapsida spiralne vrste simetrije (enoverižna linearna "-" -veriga RNA + proteinska kapsida); 2) bazalna membrana- zunanja lipoproteinska ovojnica - superkapsid.

Na površini membrane so glikoproteini (v obliki konic in resic) dveh vrst: 1) hemaglutinin - spodbuja pritrditev na celične receptorje; 2) nevraminidaza - spodbuja sproščanje virusa iz celice. Gojenje. Za gojenje se uporabljajo piščančji zarodki, primarne tripsinizirane celične kulture in včasih laboratorijske živali.

Najprimernejši model so piščančji zarodki 10-12 - dan star. Omogoča vam pridobivanje velikih količin virusa, ki je potreben pri proizvodnji cepiv in bakterijskih pripravkov.

Okužba se izvaja v alontoični votlini, na horionsko-alontoični membrani, v amnijski votlini, v amnionu. Prisotnost virusa v piščančjem zarodku se odkrije s hemaglutinacijskim testom. Antigenska struktura. Virusi imajo notranji antigen – S in površinska antigena: HA-hemaglutinin in NA-nevraminidaza. S-antigen - skupinsko specifičen, skupen celotnemu tipu, glede na ta antigen so virusi gripe razdeljeni na tipe A, B in C. To je stabilen (nespremenljiv) antigen, ki veže komplement.

Antigeni HA in NA so specifični antigeni. Antigen HA povzroči nastanek protiteles, ki nevtralizirajo virus, in aglutinacijo rdečih krvničk.

Antigen NA povzroči nastanek protiteles, ki delno nevtralizirajo viruse.

Virus tipa B je manj spremenljiv, medtem ko je tip C zelo stabilen.

toksične lastnosti. Toksični učinek virusa na telo ( glavobol, bolečine v mišicah, temperatura, kataralni pojavi) je posledica proteinov virusa (samega virusnega delca). To delovanje je strogo specifično in se nevtralizira le z imunskim serumom ustreznega tipa ali podtipa ali s serumom prebolelih. odpornost. Virusi gripe so občutljivi na UV žarke, razkužila (formalin, alkohol, fenol, kloramin) in maščobna topila.

V tekočem mediju umrejo pri temperaturi 50 - 60 ° C nekaj minut. Pri sobni temperaturi v zraku ostanejo virusi kužni več ur. V posušeni obliki se dolgo hranijo, v zamrznjenem stanju (-70 ° C) pa ne le dolgo ostanejo, ampak tudi ne izgubijo virulence.

dovzetnost za živali. Virusi tipa A v naravnih razmerah okužijo ljudi in živali (zbolijo konji in prašiči), virusi tipa B in C pa samo ljudi. Med laboratorijskimi živalmi so za viruse dovzetne bele miši, afriški dihurji, sirski hrčki in opice.

Za bolezen pri živalih so značilne poškodbe pljuč, vročina in lahko povzročijo smrt živali. Epidemiologija bolezni. Vir okužbe je bolna oseba s klinično izraženo ali asimptomatsko obliko. Bolna oseba prenaša virus okolju pri kašljanju, govorjenju, kihanju s kapljicami sline, sluzi, izpljunka že v inkubacijski dobi.

Bolnik postane kužen 24 ur pred pojavom glavnih simptomov in predstavlja epidemijsko nevarnost v 48 urah po njihovem izginotju.

Prenosni mehanizem je aerogeni. Pot prenosa je po zraku. Človeška dovzetnost za gripo je zelo visoka. Vsi zbolijo starostne skupine, predvsem v zimski čas. Najbolj dovzetni so otroci in starejši. Ime bolezni odraža značilnosti epidemiologije: gripa iz Francije. gripper - zgrabi, gripa - iz ital. Influenza di freddo - vpliv prehlada.

Od vseh ostrih bolezni dihal gripa je najbolj razširjena in resna bolezen. Pandemije in epidemije gripe zajamejo do 30-50% ali več prebivalstva globus povzročajo ogromno škodo zdravju in gospodarstvu držav. Prvi opisi epidemij gripe segajo v 12.-14. Pojav pandemije in večjih epidemij povzroča virus influence tipa A, kar je posledica velike variabilnosti virusa in je povezano s pojavom novega podtipa kot posledice antigenskega premika.

Med pandemijami se vsakih 1,5-2 leti pojavijo epidemije, kar je povezano z antigenskim odnašanjem virusov. Leta 1918 je pandemijo španske gripe (zbolelo je 1,5 milijarde ljudi, umrlo 20 milijonov ljudi) povzročil virus gripe A1.Prvična registrirana v Španiji je ta pandemija zajela skoraj celotno prebivalstvo Zemlje; za bolezen je bil značilen razvoj izjemno hude hemoragične pljučnice z rekordno smrtnostjo (do 1% vseh primerov).

Leta 1957 je "azijsko" pandemijo (zbolelo je 2 milijardi ljudi) povzročil nov podtip - podtip A2. Leta 1968 je "hongkonško" pandemijo (zbolela 1 milijarda ljudi) povzročil novonastali podtip - podtip A3. običajno, nova različica virusa izpodriva prej krožečo sorto iz človeške populacije.

Toda leta 1977 se je po 20-letnem premoru tip A1 nepričakovano "vrnil", kar je povzročilo veliko epidemijo. Posledično potlačene različice virusa gripe vztrajajo in v določenih časovnih presledkih lahko ponovno povzročijo epidemijo. Virus tipa B povzroča lokalne epidemije, medtem ko virus tipa C ne povzroča epidemij. Patogeneza in klinika bolezni. Vhodna vrata so zgornji dihalni trakt. Virus prodre v epitelijske celice sluznice in se v njih razmnoži.

Vpliv virusa na epitelijske celice povzroči njihovo nekrozo in deskvamacijo (zavrnitev) epitelija, zaradi česar postane sluznica prepustna za viruse in bakterije. Prodrejo v kri in se razširijo po telesu.« Viremijo spremljajo večkratne lezije endotelija kapilar s povečanjem njihove prepustnosti.

IN hudi primeri obstajajo obsežne krvavitve v pljučih, miokardu, parenhimskih organih. Razpadni produkti poškodovanih celic in virusne beljakovine imajo toksični učinek na različne organe in organske sisteme. Toksini virusa močno zavirajo centralni živčni sistem, in čeprav proces ne traja dolgo (3-5 dni), je bolna oseba dolgo časa oslabljena in vsaka sekundarna okužba se pridruži oslabljenemu telesu in nastanejo zapleti: influenčna pljučnica. , akutni pljučni edem, poškodbe ledvic, srca, bronhijev.

Pogost zaplet gripe bakterijska pljučnica(streptokoki skupine B). Med pandemijo španske gripe so ljudje umirali predvsem zaradi sekundarne bakterijske pljučnice.

V patogenezi gripe ni pomembna le zastrupitev, ampak tudi alergija, pa tudi kršitev funkcionalnih lastnosti imunokompetentnih celic z razvojem imunske pomanjkljivosti. Inkubacijska doba- več ur - 1-3 dni. Zanj je značilen akuten začetek, zvišanje temperature na 37,5 - 38 ° C, splošna zastrupitev se izraža v slabem počutju, glavobolu, bolečinah v zrkla, vnetni procesi dihalnih poti različne resnosti (rinitis, laringitis, traheitis, faringitis).

Vročinsko stanje pri gripi brez zapletov traja 5-6 dni. Imuniteta. Po bolezni se oblikuje tipsko specifična in sevospecifična imunost, ki jo zagotavljajo specifični in nespecifični celični in humoralni dejavniki. Velik pomen imate protitelesa Ig A. Navzkrižna imunost se ne razvije, po preboleli gripi tipa A1 lahko zbolite za gripo tipa A2 itd. Po virusu tipa imunost - 1-2 leti, po virusu tipa B - 3-5 let.

Pasivna naravna imunost - pri otrocih do 8 - 11 mesecev. Zaradi visoke antigenske variabilnosti virusa okrevanje ne vodi do razvoja obstojne imunosti na ponovno okužbo.

Laboratorijska diagnostika. Material, ki se preučuje: brisi-odtisi iz sluznice nosne votline, izcedek iz nazofarinksa, koščki pljuč, možgani v primeru smrtnih izidov.

Diagnostične metode: 1) metoda citorhinoskopije - odkrivanje intracelularnih vključkov, specifičnih za virus - pri barvanju s pioktaninom pod mikroskopom so v celicah ciliarnega epitelija vidne svetlo rdeče vključke virusa influence; 2) virološka metoda- izolacija virusa gripe iz človeškega telesa z okužbo piščančjih zarodkov z izpiranjem iz bolnikovega nazofarinksa; indikacijo (prisotnost) virusa izvajamo z RGA (virusi gripe aglutinirajo eritrocite ljudi in različnih živali), identifikacijo virusa izvajamo stopenjsko: v RSC določimo tip, v RTGA določimo podtip hemaglutinina in podtip nevraminidaze se določi v reakciji inhibicije encimske aktivnosti; 3) serološka metoda - odkrivanje povečanja titra (4-krat) specifičnih protiteles v bolnikovem krvnem serumu z uporabo RSK, RTGA, PH v celični kulturi, reakcija obarjanja v gelu, ELISA; 4) biološka metoda- intranazalna okužba miši - vnos materiala v pljuča pod etrska anestezija; miši poginejo po 2-3 dneh zaradi pljučnice; 5) ekspresna diagnostika - odkrivanje virusnega antigena z uporabo RIF.

Zdravljenje in preprečevanje.

Za preprečevanje in zdravljenje v prvih dneh bolezni se uporablja humani levkocitni interferon (intranazalno). IN zdravilne namene uporaba protivirusna zdravila- rimantadin (influenca tipa A), adapromin, virazol in imunomodulatorna zdravila - dibazol, prodigiosan, levomizol.

Pri hudi gripi, zlasti pri otrocih, se uporabljajo donorski imunoglobulini proti gripi, pa tudi zdravila - zaviralci celičnih proteaz (gordox, contrical, aminokaprojska kislina).

Posebna preventiva. Uporabljajo se naslednja protivirusna zdravila in imunomodulatorji ter živa in inaktivirana cepiva: 1) živa monocepiva za peroralno uporabo - oslabljeni sevi trenutno krožečih virusov (A1, A3 in B); kažejo največjo imunogenost; 2) cepiva s celim virionom iz virulentnih sevov, inaktiviranih s formaldehidom ali UV žarki; 3) podenotna cepiva proti gripi samo iz površinskih antigenov - antigenov HA in NA (imajo minimalno reaktogenost).

Za pridobivanje cepiv se virusi gojijo v piščančjih zarodkih in v celični kulturi piščančjih zarodkov.

Z uvedbo cepiv se oblikuje lokalna in humoralna imunost. Cepljenje se izvaja v obdobjih največjega tveganja za razvoj epidemij. Primernejša je za mlade in starejše. Uporaba mrtvih cepiv zahteva letno ponovno cepljenje; njihova učinkovitost ne presega 60-70%.

Ker Ker pogosto opazimo antigenske variacije povzročitelja, je nabor antigenov ustreznega virusa za imunizacijo mogoče določiti šele po začetku izbruha.

Vstopnica 15.

Hemaglutinacijska reakcija (RGA).

V laboratoriju se uporabljata dve različni reakciji hemaglutinacije.

Prvi RGA se nanaša na serološke. Pri tej reakciji pride do aglutinacije eritrocitov pri interakciji z ustreznimi protitelesi (hemaglutinini).

Reakcija se pogosto uporablja za določanje krvnih skupin.

Drugi RHA ni serološki. V tem primeru ne pride do aglutinacije eritrocitov

protitelesa, temveč posebne snovi, ki jih tvorijo virusi. Na primer, virus gripe aglutinira piščančje eritrocite in morski prašički, virus poliomielitisa - ovčji eritrociti. Ta reakcija omogoča presojo prisotnosti določenega virusa v testnem materialu.

Reakcijo izvajamo v epruvetah ali na posebnih ploščah z vdolbinicami.

Material, ki ga testiramo na prisotnost virusa, razredčimo z izotonično raztopino od 1:10 do 1:1280; 0,5 ml vsake razredčitve zmešamo z enakim volumnom 1-2% suspenzije eritrocitov. V kontroli 0,5 ml eritrocitov zmešamo z 0,5 ml izotonične raztopine. Epruvete za 30 minut postavimo v termostat, plošče pa pustimo 45 minut pri sobni temperaturi.

Računovodstvo rezultatov. S pozitivnim rezultatom reakcije na dnu epruvete ali vdolbinice pade oborina eritrocitov z nazobčanimi robovi ("dežnik"), ki pokriva celotno dno vdolbinice.

Reakcija inhibicije hemaglutinacije

Če je rezultat negativen, eritrociti tvorijo gosto oborino z gladkimi robovi ("gumb"). Enako oborino je treba nadzorovati.

Intenzivnost reakcije je izražena z znaki "+". Titer virusa je največja razredčitev materiala, v katerem pride do aglutinacije.

Reakcija inhibicije hemaglutinacije

To je serološka reakcija, pri kateri specifična protivirusna protitelesa v interakciji z virusom (antigenom) nevtralizirajo virus in mu odvzamejo sposobnost aglutinacije rdečih krvničk, tj.

e) zavira hemaglutinacijsko reakcijo. Ta reakcija vam omogoča, da določite vrsto in vrsto virusov.

Nastavitev reakcije. 0,25 ml protivirusni serum pomešan z enako količino materiala, ki vsebuje virus. Zmes stresamo in postavimo v termostat za 30 minut, nato dodamo 0,5 ml 1-2% suspenzije eritrocitov.

Računovodstvo rezultatov. Pri pravilni nastavitvi poskusa pri kontroli seruma in eritrocitov bi moral nastati "gumb" - ni dejavnika, ki aglutinira eritrocite; pri antigenski kontroli nastane »dežnik« – virus je povzročil aglutinacijo eritrocitov.

Če je serum homologen virusu, ki ga preučujemo, se oblikuje "gumb" - serum je nevtraliziral virus.

Reakcija posredne hemaglutinacije

Reakcija indirektne (pasivne) hemaglutinacije (RIHA) temelji na dejstvu, da eritrociti, če se na njihovi površini adsorbira topni antigen, pridobijo sposobnost aglutinacije pri interakciji s protitelesi proti adsorbiranemu antigenu.

Nastavitev reakcije.

Serum segrevamo 30 minut pri 56 ° C, zaporedno razredčimo v razmerju 1:10 - 1:1280 in vlijemo v epruvete ali vdolbinice po 0,25 ml, kjer nato dodamo 2 kapljici eritrocitov z adsorbiranimi antigeni na njih.

Kontrole: suspenzija eritrocitov z antigeni, adsorbiranimi na njih z očitno imunskim serumom, suspenzija eritrocitov z antigeni, adsorbiranimi na njih z normalnim serumom; suspenzija normalnih eritrocitov s testiranim serumom.

Pri prvi kontroli naj pride do aglutinacije, pri drugi in tretji pa je ne sme biti.

Kontrolna vprašanja.

1. Kaj pomeni pozitiven rezultat RGA med eritrociti in testiranim materialom na prisotnost virusa?

2. Ali pride do reakcije aglutinacije eritrocitov, če jim dodamo virus in njemu ustrezen serum?

Kako se imenuje reakcija, ki razkrije ta pojav?

PRAKTIČNO DELO №12.

Reakcija vezave komplementa.

Reakcija vezave komplementa (RCT) temelji na dejstvu, da specifičen kompleks antigen-protitelo vedno adsorbira (veže) komplement nase.

Ta reakcija se pogosto uporablja pri identifikaciji antigenov in serodiagnostiki okužb, zlasti bolezni, ki jih povzročajo spirohete (Wassermannova reakcija), rikecije in virusi.

PCS je kompleksna serološka reakcija.

Vključuje komplement in dva sistema antigen-protitelo. V bistvu gre za dve serološki reakciji.

Desni bazični sistem je sestavljen iz antigena in protitelesa (enega poznamo, drugega ne). Dodana mu je določena količina komplementa. Ko se antigen in protitelo tega sistema ujemata, se bosta povezala in povezala kompliment. Nastali kompleks je fino razpršen in ni viden.

Tvorbo tega kompleksa poznamo s pomočjo drugega hemolitičnega ali indikatorskega sistema.

Vključuje ovčje eritrocite (antigen) in njim ustrezen hemolitični serum (protitelesa), tj. že pripravljen imunski kompleks. V tem sistemu lahko pride do lize eritrocitov le v prisotnosti komplementa. Če je komplement vezan na prvi sistem, potem v drugem sistemu ne bo hemolize;

brez prostega dopolnila. Odsotnost hemolize (vsebina epruvete je motna ali je na dnu epruvete sediment eritrocitov) se zabeleži kot pozitiven rezultat RSK.

Če v prvem sistemu antigen ne ustreza protitelesu, potem imunski kompleks ne nastane in kompliment bo ostal prost. Ko ostane prost, kompliment sodeluje v drugem sistemu, kar povzroči hemolizo, rezultat RSK je negativen (vsebina epruvet je prozorna - "lak kri").

Komponente, reakcije fiksacije komplementa:

Antigen - običajno lizat, ekstrakt, hapten,

manj pogosto suspenzija mikroorganizmov.

2. Protitelesa - bolnikov serum.

3. Komplement - serum morskega prašička.

Antigen - ovčji eritrociti.

5. Protitelesa - hemolizin na ovčje eritrocite.

6. Izotonična raztopina.

Glede na to, da RSC sodeluje veliko število kompleksne komponente,

jih je treba predhodno titrirati in vzeti v reakcijo v natančnih količinah in v enakih volumnih: 0,5 ali 0,25 ml, redkeje 0,2,1,25 ali 1,0 ml (večji volumni dajo natančnejši rezultat). Titracijo reakcijskih komponent izvedemo v enakem volumnu kot poskus, pri čemer manjkajoče sestavine nadomestimo z izotonično raztopino.

Povezane informacije:

Iskanje po spletnem mestu:

Temelji na dejstvu, da eritrociti, na katerih so predhodno adsorbirani antigeni, pridobijo sposobnost aglutinacije v prisotnosti homolognih serumov (protiteles).

V tem primeru imajo eritrociti vlogo nosilcev s specifičnimi determinantami, katerih aglutinacija se pojavi kot posledica reakcije antigen + protitelo.

Eritrocite, na površino katerih so antigeni trdno pritrjeni, imenujemo eritrocitni antigenski diagnostik ali eritrociti, senzibilizirani z antigenom.

Druga vrsta RNHA - protitelesa se adsorbirajo na površini eritrocitov in njihova kasnejša aglutinacija se pojavi v prisotnosti homolognega antigena.

V tem primeru se takšni eritrociti imenujejo eritrocitni protitelesni diagnostikum ali eritrociti, senzibilizirani s protitelesi.

Na podlagi teh dveh temeljnih metodoloških pristopov je bilo razvitih in se uporabljajo številne modifikacije RNGA. Tako se kot nosilci uporabljajo majhni standardni delci lateksa.

Reakcija inhibicije hemaglutinacije (HITA)

V tem primeru se reakcija imenuje reakcija aglutinacije lateksa (RLA) ali se uporablja Staphylococcus aureus - reakcija koaglutinacije itd. Običajno se diagnostiki eritrocitov pripravijo v podjetjih biološke industrije, glavna izkušnja RNGA pa je že nastavljena v diagnostičnih laboratorijih.

Priprava diagnostike eritrocitov vključuje naslednje korake:

fiksacija eritrocitov s formaldehidom ali glutarnimi ali akrilnimi aldehidi.
Tako obdelani eritrociti so dolgotrajno shranjeni. Pogosteje se v ta namen uporabljajo eritrociti ovac, ljudi, kokoši itd.;
obdelava fiksnih eritrocitov z raztopino tanina. Zaradi tega eritrociti pridobijo lastnost ireverzibilne adsorpcije beljakovin (virusov in protiteles) na svoji površini;
preobčutljivost taniziranih eritrocitov z virusi ali protitelesi.

Treba je opozoriti, da so metode za pripravo eritrocitnih diagnostikov za virusne okužbe različne.

Tehnika za nastavitev RNHA za odkrivanje in določanje titra protiteles je naslednja:

zaporednim 2-kratnim razredčitvam seruma dodamo enake odmerke eritrocitov, senzibiliziranih z antigenom;
zmes pustimo 2-3 ure pri sobni temperaturi ali 16-18 ur pri 4 °C;
upoštevati rezultate.
Če serum vsebuje protitelesa proti virusu, s katerim so bili eritrociti senzibilizirani, opazimo hemaglutinacijo, ki jo ocenimo v križnicah.

Serumski titer protiteles se vzame kot najvišja razredčina seruma, ki še zagotavlja hemaglutinacijo z vsaj dvema križanjema.

RNGA spremljajo vse ustrezne kontrole. Običajno postavijo reakcijo z mikrometodo.

RNHA omogoča reševanje naslednjih diagnostičnih nalog:

odkrivanje protiteles in določanje njihovega titra v krvnem serumu z znanim eritrocitnim antigenskim diagnostikom;
odkrivanje in identifikacijo neznanega virusa z uporabo znanega diagnostika protiteles proti eritrocitom.

Prednosti RNGA: visoka občutljivost, enostavnost nastavitve in hitra odzivnost.

Vendar je pomembno opozoriti, da obstajajo velike težave pri pripravi stabilnih eritrocitnih diagnostikov (velika odvisnost od čistosti uporabljenih komponent, potreba po izbiri načina fiksacije, tanizacije in senzibilizacije eritrocitov za vsako vrsto virusa) .

Če najdete napako, izberite del besedila in pritisnite Ctrl+Enter.

V stiku z

Sošolci

Uporablja eritrocite ali nevtralne sintetične materiale (na primer delce lateksa), na površini katerih so adsorbirani antigeni (bakterijski, virusni, tkivni) ali protitelesa.

Do njihove aglutinacije pride, ko dodamo ustrezne serume ali antigene. RBC, senzibilizirane z antigeni, se imenujejo antigenski eritrocitni diagnostik in se uporabljajo za odkrivanje in titriranje protiteles. Eritrociti, senzibilizirani s protitelesi. se imenujejo imunoglobulinski eritrocitni diagnostiki in se uporabljajo za odkrivanje antigenov.

Reakcija pasivne hemaglutinacije se uporablja za diagnosticiranje bolezni, ki jih povzročajo bakterije (tifus in paratifus, dizenterija, bruceloza, kuga, kolera itd.), praživali (malarija) in virusi (gripa, adenovirusne okužbe, virusni hepatitis B, ošpice, klopni encefalitis, krimsko hemoragična vročica itd.), pa tudi za določitev nekaterih hormonov, identifikacijo preobčutljivost bolan za zdravila in hormoni, kot sta penicilin in insulin.

Reakcija pasivne hemaglutinacije (RPHA).

Pasivni hemaglutinacijski test je občutljiva metoda serološke diagnostike in se uporablja tako za zgodnjo in retrospektivno diagnostiko kot tudi za ugotavljanje imunološkega stanja cepljenih oseb. Pri bolnikih s tularemijo se protitelesa običajno odkrijejo ob koncu 1. ali 2. tedna bolezni, po 1-1,5 mesecih titri TPHA dosežejo največje vrednosti (1: 100.000-1: 20.000, manj pogosto višje), po ki se zmanjšajo na ravni 1: 100-1: 200, vztrajajo dolgo časa.

Pri cepljenih se protitelesa stalno odkrijejo, vendar v nižjih titrih, ki ne presegajo 1: 2000-1: 5000 1-1,5 meseca po cepljenju, ostanejo več let na nizki ravni 1: 20-1: 80.

Tularemični eritrocitni diagnostik (antigen) služi kot antigen za nastavitev RPHA.

Zdravilo je formaliziran ovnov eritrocit, senzibiliziran s tularemijskim antigenom, na voljo v tekoči in suhi obliki. Tekoči pripravek - 10% suspenzija eritrocitov v raztopini formalina 10% koncentracije. Suh liofiliziran pripravek - vakuumsko sušena 10% suspenzija eritrocitov brez konzervansa. Pred uporabo ga razredčimo v skladu z navodili na etiketi. Za postavitev reakcije v polistirenskih ploščah uporabljamo oba pripravka v 2,5 % koncentraciji, pri postavitev reakcije v mikrovolumenih pa v 0,5 % koncentraciji.

Tehnika nastavitve RPGA.

Testne serume razredčimo fiziološka raztopina 1:5 (1:10) in segrevamo pri 56 stopinjah C 30 minut.

Reakcija hemaglutinacije (RHA) in

Nato za odstranitev heterogenih protiteles proti ovčjim eritrocitom serume obdelamo s 50 % suspenzijo formaliziranih ovčjih eritrocitov. Da bi to naredili, dodamo eritrocite s hitrostjo 2 kapljic (0,05 ml) na 1 ml seruma in temeljito premešamo s stresanjem.

Serum pustimo do popolne sedimentacije eritrocitov ali centrifugiramo po eni uri pri sobni temperaturi, nato pa je pripravljen za raziskavo.

Tekočino za redčenje vlijemo v prostornini 0,5 ml v več vdolbinic polistirenske plošče.

Pri predhodni študiji serumov je priporočljivo, da jih testirate tako, da nastavite reakcijo v kratki vrsti plošče (6 lukenj). V primeru odkritja protiteles v kratki seriji serumov se serume ponovno pregleda v dolgi seriji razredčin (12 vdolbinic).

Po razlitju tekočine za redčenje dodamo 0,5 ml testnih serumov v razredčitvi 1:5 v prvo vdolbinico vsake vrste (kratke ali dolge). Nato v istih volumnih titriramo serum z dvakratnimi razredčinami. Tako dobimo razredčitve seruma v kratkih serijah od 1:10 do 1:320 in v dolgih serijah - od 1:10 do 1:20480. Po titraciji serumov v vsako jamico dodamo eno kapljico (0,05 ml) delovne 2,5 % suspenzije senzibiliziranih eritrocitov.

Vsebino plošč temeljito pretresemo, dokler ne dobimo homogene suspenzije. Krožnike pustimo pri sobni temperaturi na nepremični površini mize. Predhodna registracija reakcije se izvede po 2-3 urah, končna določitev titra se izvede po popolni sedimentaciji eritrocitov v vdolbinicah. Za reakcijo so predvidene naslednje kontrole: 1) testni serum v razredčini 1:10 v volumnu 0,5 ml + 1 kapljica 2,5% suspenzije nesenzibiliziranih eritrocitov; 2) tekočina za redčenje v prostornini 0,5 ml + 1 kapljica 2,5% suspenzije nesenzibiliziranih eritrocitov; 3) tekočina za redčenje v prostornini 0,5 ml + 1 kapljica 2,5% suspenzije senzibiliziranih eritrocitov.

Vse kontrole morajo dati jasno negativno reakcijo.

Računovodstvo in vrednotenje RPGA. Reakcija se oceni po naslednji shemi:

1) izrazito pozitivna reakcija (++++) - eritrociti padejo na dno vdolbinice v enakomerni plasti v obliki "dežnika", ki ima pogosto nazobčane robove;

2) pozitivna reakcija (+++) - eritrociti pokrivajo vsaj 2/3 dna luknje;

3) šibko pozitivna reakcija (++) - aglutinat je majhen in se nahaja v samem središču luknje;

4) dvomljiva reakcija (+) - okoli eritrocitnega sedimenta v samem središču luknje so ločena zrna aglutinata;

5) negativno (-) - na dnu luknje se eritrociti naselijo v obliki "gumba" ali majhnega obroča z gladkimi, ostro definiranimi robovi.

Titer seruma upoštevamo glede na zadnjo razredčitev seruma, ki je dala zelo jasno reakcijo (vsaj tri pluse).

Redčenje 1:100 in več velja za diagnostični titer, vendar je treba, tako kot pri RA, spremljati njegovo povečanje.

TPHA pri tularemiji je precej specifičen in odkrije nekatere navzkrižne reakcije samo s serumi bruceloze. Diferencialna diagnoza mogoče z višino titrov v TPHA, ki so veliko višji pri homolognem antigenu.

Tehnika določanja RPHA v mikrovolumenih.

RPHA je mogoče izvesti v mikrovolumnih z uporabo mikrotitra tipa Takachi (ali mikrotitrskih plošč z okroglim dnom z mikropipetami), ki omogoča titracijo materiala v volumnih 25 µl in 50 µl. Tehnika postavljanja reakcij, zaporedje vseh operacij je enako kot pri študiji na polistirenskih ploščah. Vendar je treba upoštevati, da je občutljivost mikro metode običajno na razredčitev (tj.

2-krat) nižja od makrometode.

Za postavitev reakcije v mikrotitru s pipeto-kapalko v vsako vdolbinico vnesemo tekočino za redčenje v volumnu 50 µl. Nato s titratorji s 50 μl glavo odvzamemo testni serum tako, da vanj potopimo glavo.

Prepričajte se, da je tekočina napolnila glavo titratorja. Titrator s serumom prenesemo v prvo vdolbino in ga držimo v pokončnem položaju, naredimo več rotacijski gibi povratno potovanje. Nato se titrator prenese v naslednjo vdolbino in manipulacija se ponovi. Titracijo lahko izvajamo hkrati v več vrstah. Po titraciji celotne vrste titrator z rotacijskimi gibi speremo z destilirano vodo (z menjavo 2 obrokov), vodo odstranimo iz glave z brisom in sežgemo na plamenu gorilnika.

Po titraciji dodamo v jamice 25 μl diagnostikuma eritrocitov.

Koncentracija diagnostikuma za RPHA v mikrovolumenih mora biti 0,5% (tj. 2,5% suspenzijo eritrocitov dodatno razredčimo 5-krat). Po dodatku eritrocitov je treba plošče rahlo stresati, dokler ne dobimo homogene suspenzije. Rezultate lahko zabeležimo že po 1-1,5 urah, kar je bistvena prednost RPHA v mikrotitru.

Poleg tega ta metoda zahteva majhno količino vseh sestavin reakcije in testnih serumov.

Reakcija se upošteva na naslednji način:

1) "+" - popolna hemaglutinacija, pri kateri eritrociti padejo na dno vdolbinice v enakomerni plasti v obliki "dežnika", ki zaseda vsaj 2/3 dna;

2) "+ -" - delna hemaglutinacija, pri kateri eritrociti padejo na dno v obliki ohlapnega obroča majhne velikosti;

3) "-" - odsotnost hemaglutinacije, ko eritrociti padejo na dno v obliki majhnega gumba ali obroča z gladkim robom.

Specifičnost pozitiven rezultat pridobljeno v TPHA lahko preverimo s pomočjo trikomponentne reakcije – reakcije inhibicije pasivne hemaglutinacije (RPHA).

Tehnika nastavitve RTPGA.

Ta reakcija je nastavljena tako, da potrdi specifičnost pozitivnega rezultata RPHA, kadar je dvomljiv ali je posebnega epidemiološkega pomena. Reakcijski mehanizem je sestavljen iz specifične inhibicije hemaglutinacije, ko se testnemu serumu doda suspenzija ubitih bakterij tularemije. V reakciji medsebojno delujejo tri komponente: testni serum, specifični tularemični antigen in antigenski eritrocitni diagnostik RTPGA so običajno postavljeni v vrsto 7-8 vdolbinic.

Priporočljivo je, da vzporedno z RTPGA namestite drugo RPGA. V dve vrsti vdolbinic vlijemo 0,25 ml tekočine za redčenje, nato pa v prve vdolbinice obeh vrst dodamo testni serum v volumnu 0,25 ml in titriramo, tako da dobimo dve enaki vrsti razredčin seruma. V vse vdolbinice druge vrste dodamo 0,25 ml tekočine za redčenje, v vdolbinice prve vrste pa 0,25 ml suspenzije bakterij tularemije.

Uporabimo Tularemia diagnosticum (vsebuje 25 milijard bakterij tularemije na 1 ml), predhodno 50-krat razredčeno.

Takšna suspenzija vsebuje 500 milijonov bakterij v 1 ml ali 125 milijonov v volumnu 0,25 ml. Po dodajanju antigena ploščo pustimo 1 uro pri sobni temperaturi, nato dodamo eno kapljico (0,05 ml) diagnostikuma eritrocitov v vse vdolbinice obeh vrst, ploščo pretresemo in pustimo na ravni površini mize.

Obračun je narejen v 2-3 urah.

Računovodstvo in vrednotenje RTPGA. Če testni serum vsebuje specifična protitelesa proti tularemiji, jih dodani antigen nevtralizira in do hemaglutinacije ne bo prišlo v prvi vrsti vdolbinic ali pa bo pri visokem serumskem titru hemaglutinacija opažena v manj (2-4) vdolbinicah kot v vrstico s TPHA. V tem primeru je specifičnost rezultatov potrjena.

Če opazimo hemaglutinacijo v obeh vrstah, tj. rezultati RTHA in RPHA sovpadajo, to kaže na odsotnost protiteles proti tularemiji v testnem serumu. V tem primeru se primarni rezultat RPHA šteje za nespecifičnega.

Tehnika za nastavitev RTPGA v mikrovolumenih. RTHA in RPHA se lahko izvajata v mikrovolumnih z uporabo mikrotitra tipa Takachi.

Da bi to naredili, dodamo 0,25 μl tekočine za redčenje v vdolbinice mikroplošč v dveh vrstah po 7-8 vdolbinic. Nato se s pomočjo titratorja zareže 0,25 μl testnega seruma in titrira v obeh vrstah. Nato dodamo 25 μl tularemijskega antigena (katerega koncentracija je 500 milijonov bakterij tularemije v 1 ml) v vsako vdolbinico v prvi vrsti in 25 μl tekočine za redčenje v drugi vrsti.

Plošče pustimo 1 uro pri sobni temperaturi, nato pa dodamo 25 μl antigenskega eritrocitnega diagnostikuma (koncentracija 0,5 %) v vse vdolbinice obeh vrst.

Obračunavanje in vrednotenje rezultatov poteka podobno kot reakcija v makrovolumnih.

Datum objave: 2015-02-03; Prebrano: 3176 | Kršitev avtorskih pravic strani

studopedia.org - Studopedia.Org - 2014-2018 (0,003 s) ...

Vidalova reakcija. Od drugega tedna bolezni se v krvi bolnikov kopičijo protitelesa proti povzročitelju okužbe. Za njihovo identifikacijo se v reakciji aglutinacije pregleda bolnikov krvni serum. Kot antigen se uporabljajo usmrčene kulture salmonele – diagnostikumi.

Za vzpostavitev Vidalove reakcije se uporablja bolnikov serum, komplet diagnostičnih kompletov in izotonična raztopina natrijevega klorida.

Kri (2-3 ml) iz pulpe prsta ali kubitalne vene se zbere v sterilno epruveto in dostavi v laboratorij. V laboratoriju postavimo epruveto za 20-30 minut v termostat, da nastane strdek, nato strdek obkrožimo s Pasteurjevo pipeto, da se loči od stene epruvete, in postavimo na hladno za 30- 40 minut. Izločen serum odsesamo in uporabimo za postavitev aglutinacijske reakcije z diagnostikom salmonele tifusa in paratifusa. Za pridobitev seruma lahko kri centrifugiramo.

Kdaj infekcijski proces- trebušni tifus ali paratifus - v telesu nastajajo O- in H-protitelesa proti istoimenskim antigenom povzročitelja.

O-protitelesa se najprej pojavijo in precej hitro izginejo. H-protitelesa vztrajajo dolgo časa. Enako se zgodi med cepljenjem, torej pozitivna Vidalova reakcija z O- in H-antigeni kaže na prisotnost bolezni, reakcija samo s H-antigeni pa je lahko tako pri prebolelih (anamnestična reakcija) kot pri tisti, ki so bili cepljeni (cepljenje). Na podlagi tega se Vidalova reakcija postavi ločeno z O- in H-antigeni (diagnostikumi).

Ker sta si tifusna mrzlica in paratifusna mrzlica A in B klinično podobna, se za ugotavljanje narave bolezni bolnikov serum testira sočasno z diagnostičnimi testi za salmonelo tifusa in paratifusa A in B.

Vidalova reakcija se pogosto uporablja, ker je preprosta in ne zahteva posebnih pogojev.

Obstajata dva načina za nastavitev reakcije: kapljanje in prostornina (glejte 12. poglavje). V praksi se pogosteje uporablja volumetrična metoda. Pri nastavitvi linearne aglutinacijske reakcije mora število vrstic ustrezati številu antigenov (diagnostikum). Povzročitelj bolezni se šteje za mikroorganizem, katerega diagnostika je bila aglutinirana s serumom bolnika. Včasih opazimo skupinsko aglutinacijo, saj imajo povzročitelji tifusa in paratifusa skupne skupinske antigene. V tem primeru se šteje, da je rezultat reakcije v seriji, v kateri je aglutinacija opažena v večji razredčitvi seruma, pozitiven (tabela 36).

Tabela 36. Možen rezultat reakcije aglutinacije

Opomba. V praksi se Vidalova reakcija postavi s štirimi diagnostiki: tifusno vročico "O" in "H", paratifus A in B - z diagnostiko "OH".

Če se aglutinacija pojavi le v majhnih razredčinah seruma - 1: 100, 1: 200, se za razlikovanje reakcije v primeru bolezni od cepljenja ali anamneze zatečejo k ponovni postavitvi aglutinacijske reakcije po 5-7 dneh. Pri bolniku se titer protiteles poveča, pri cepljenem ali prebolevniku pa se ne spremeni. Tako povečanje titra protiteles v krvnem serumu služi kot pokazatelj bolezni.

Vi-aglutinini se pojavijo v pacientovi krvi kot odgovor na vnos tifusnih patogenov, ki imajo v telesu Vi-antigen. Določeni so od 2. tedna bolezni, vendar njihov titer običajno ne presega 1:10. Odkrivanje Vi-protiteles je povezano s prisotnostjo povzročiteljev tifusa v telesu, zato je določanje teh protiteles velikega epidemiološkega pomena, saj omogoča identifikacijo bakterijskih nosilcev.

Vi-hemaglutinacijska reakcija. To je najbolj občutljiva reakcija za odkrivanje protiteles.

Načelo reakcije je, da lahko človeški (skupina I) ali ovčji eritrociti po posebni obdelavi adsorbirajo Vi-antigen na svoji površini in pridobijo sposobnost aglutinacije z ustreznimi Vi-protitelesi.

Eritrocite z adsorbiranimi antigeni na površini imenujemo eritrocitni diagnostiki.

Za nastavitev Vi-hemaglutinacijske reakcije vzemite:

1) pacientov krvni serum (1-2 ml); 2) eritrocitni Salmonella Vi diagnosticum; H) Vi-serum; 4) O-serum; 5) izotonična raztopina natrijevega klorida.

Reakcijo damo v aglutinacijske epruvete ali v plastične plošče z vdolbinicami.

Bolniku odvzamemo kri na enak način kot pri Vidalovi reakciji. Pridobite serum. Iz seruma pripravimo dvakratne serijske razredčitve, začenši od 1:10 do 1:160.

V vdolbinico dodamo 0,5 ml vsake razredčine in dodamo 0,25 ml eritrocitnega diagnostika. Reakcijo damo v prostornino 0,75 ml.

Kontrole so: 1) standardni aglutinacijski monoreceptorski serum + diagnostikum - reakcija mora biti pozitivna do serumskega titra; 2) diagnostikum v izotonični raztopini natrijevega klorida (kontrola) - reakcija mora biti negativna.

Vsebino vdolbinic temeljito premešamo, postavimo v termostat za 2 uri in pustimo pri sobni temperaturi do naslednjega dne (18-24 ur).

Računovodstvo se začne z nadzorom. Reakcija se ocenjuje glede na stopnjo aglutinacije diagnostikuma.

Rezultati se upoštevajo po sistemu štirih križev:

Eritrociti so popolnoma aglutinirani - usedlina na dnu luknje v obliki "dežnika";

+++ "dežnik" je manjši, vsi eritrociti niso bili aglutinirani;

++ "dežnik" je majhen, na dnu luknje je usedlina neaglutiniranih eritrocitov;

Reakcija je negativna; eritrociti niso aglutinirali in so se usedli na dno jamice v obliki gumba.

Kontrolna vprašanja

1. V katerem obdobju bolezni je diagnosticirana Vidalova reakcija?

2. Katere sestavine so potrebne za izvedbo Vidalove reakcije?

3. Katere diagnostike uporabljamo pri Vidalovi reakciji?

4. Katera od seroloških reakcij je najbolj občutljiva pri diagnosticiranju okužb s tifusom in paratifusom?

5. Kateri diagnostik se uporablja pri oblikovanju reakcije Vi-hemaglutinacije?

6. S katerim serumom ugotavljamo prisotnost Vi-antigena v proučevani kulturi?

7. Kakšen je pomen definicije Vi-fagnega tipa?

Od učitelja vzemite O- in H-diagnostikume salmonele tifusa, paratifusa A in paratifusa B ter bolnikov serum. Povej Vidalov odziv.

Hranilni mediji

Medicinska industrija proizvaja okolja EMS, Ploskirev, bizmut-sulfitni agar v obliki suhega prahu. Pripravimo jih po navodilih na etiketi: določeno količino praška stehtamo, prelijemo z ustrezno količino vode, zavremo in vlijemo v sterilne petrijevke.

Sreda Russell. V 950 ml destilirane vode dodamo 40 g suhega hranilnega medija in dodamo 5 g hranilnega agarja. Segrejte, da zavre in raztopi praške. 1 g x raztopite v 50 ml destilirane vode. ure glukoze in dodamo pripravljeni mešanici. Medij vlijemo v sterilne epruvete po 5-7 ml, steriliziramo s tekočo paro (2 dni po 2 minuti) in poševno zarežemo, da ostane kolona. Na enak način pripravimo Russellov gojišče z manitolom in saharozo.

Olkenitskyjev medij iz suhega agarja. 2,5 g suhega hranilnega agarja stopimo v 100 ml destilirane vode. Vse sestavine, navedene v receptu (etiketi), dodamo v agar, ohlajen na 50 ° C. Medij, vlit v epruvete, steriliziramo s tekočo paro (3 dni po 20 minut) in nato poševno odrežemo. Končni medij mora biti bledo rožnate barve.

Reakcija inhibicije hemaglutinacije

Hemaglutinacijska reakcija

Reakcija aglutinacije

Reakcija aglutinacije (RA) je aglutinacija in obarjanje mikrobov ali drugih celic pod delovanjem protiteles v prisotnosti elektrolita (izotonične raztopine natrijevega klorida). Nastalo oborino imenujemo aglutinirati.

Za reakcijo potrebujete:

1. Protitelesa (aglutinini) – so v serumu bolnika ali v imunskem serumu.

2. Antigen - suspenzija živih ali mrtvih mikroorganizmov, eritrocitov ali drugih celic.

3. Izotonična raztopina.

Aglutinacijski test za serodiagnozo se pogosto uporablja v tifus, paratifus (Vidalova reakcija), bruceloza (Wrightova reakcija) itd. V tem primeru je protitelo pacientov serum, antigen pa je znan mikrob.

Ko so mikrobi ali druge celice identificirani, njihova suspenzija služi kot antigen, znani imunski serum pa kot protitelo. Ta reakcija se pogosto uporablja pri diagnozi črevesne okužbe, oslovski kašelj itd.

V laboratorijski praksi se uporabljata dve hemaglutinacijski reakciji (RHA), ki se razlikujeta po mehanizmu delovanja.

Prvi RGA se nanaša na serologijo. Pri tej reakciji pride do aglutinacije eritrocitov pri interakciji z ustreznimi protitelesi (hemaglutinini). Reakcija se pogosto uporablja za določanje krvnih skupin.

Drugi RGA ni serološki. V njej lepljenje rdečih krvnih celic ne povzročajo protitelesa, temveč posebne snovi, ki jih tvorijo virusi. Na primer, virus gripe aglutinira eritrocite kokoši in morskih prašičkov, virus otroške paralize aglutinira eritrocite ovac. Ta reakcija omogoča presojo prisotnosti določenega virusa v testnem materialu.

To je serološka reakcija, pri kateri specifična protivirusna protitelesa, ki medsebojno delujejo z virusom (antigenom), ga nevtralizirajo in mu odvzamejo sposobnost aglutinacije rdečih krvničk, tj. Zavirajo reakcijo hemaglutinacije. Visoka specifičnost reakcije inhibicije hemaglutinacije (HITA) omogoča njeno uporabo za določanje vrste in celo vrste virusov, odkritih med HA.

riž. Shema reakcije pasivne hemaglutinacije (RPHA). A - pridobitev diagnostike eritrocitov; B - RNGA: 1-eritrocit: 2 - proučevani antigen; 3 - diagnostika eritrocitov; 4 - protitelo proti preučevanemu antigenu: 5 - aglutinat.

S pomočjo RNHA lahko določimo neznani antigen, če so znana protitelesa adsorbirana na eritrocitih.

Hemaglutinacijska reakcija (RHA)

RGA temelji na dejstvu, da se nekatere vrste bakterij in virusov lahko adsorbirajo na površini rdečih krvničk. različni tipiživali (in ptice), zaradi česar se zlepijo in tvorijo aglutinacijo (neposredno RGA).

Adsorpcija antigena (bakterije, virusi) na površini eritrocitov se ne kaže vedno s tvorbo vidne oborine; poleg tega je RGA nespecifičen, ker lahko eritrociti iste živalske vrste adsorbirajo različne antigene.

Reakcija pasivne (posredne) hemaglutinacije (RPHA) je specifična. Za njegovo nastavitev se predhodno pripravi eritrocitni diagnostik (eritrociti, na katerih je adsorbiran antigen). V ta namen sterilno odvzamemo ovnovo (ali petelinovo) kri, jo defibriniramo in s 3-5-kratnim centrifugiranjem večkrat speremo v raztopini fosfatnega pufra (pH 7,2). Supernatant odstranimo, koncentracijo eritrocitov uravnamo na 2,5 % (1:40). 2,5% suspenziji eritrocitov dodamo v enakem volumnu (1 ml ali 0,5 ml) suspenzijo bakterij proučevane mikrobne vrste v koncentraciji 5-10 milijard celic na 1 ml. Eritrociti zlahka adsorbirajo antigen polisaharidne narave. Za adsorpcijo antigena beljakovinske narave eritrocite predhodno obdelamo s taninom v razredčitvi 1: 20 000. Eritrocite v kombinaciji z dodanim antigenom pustimo za senzibilizacijo (adsorpcijo) 2 uri v termostatu (37 ° C) , nato ponovno centrifugiramo pri 3-4 tisoč obratih / min 5 minut z raztopino fosfatnega pufra (slika 9.13).

Nastali eritrocitni diagnostikum damo v epruvete (ali vdolbinice v ploščo iz pleksi stekla) in mu dodamo standardni imunski serum.

V pozitivnih primerih pride do RGA - izgube eritrocitov v obliki značilne kosmičaste ali zrnate usedline, razporejene po celotni površini dna epruvete (hemaglutinat). To pomeni, da je preučevana vrsta mikroba (antigena) specifična za protitelesa imunskega seruma. V negativnih primerih se nezlepljene rdeče krvničke usedejo na dno v obliki majhnega enakomernega kroga.

Za večjo zanesljivost rezultatov RPGA, zakasnitev reakcije(zaviranje) pojav hemaglutinacije(RZGA) ali njena modifikacija - reakcija nevtralizacije protiteles(RIA).

riž. 9.13. Reakcija pasivne hemaglutinacije (shema): Er - eritrociti: AG - antigen: AT - protitelo

Bistvo RZGA sestoji iz dejstva, da se reakcija aglutinacije nastavi s specifičnim diagnostičnim serumom in testiranim antigenom (kot antigen se uporablja proučevana vrsta mikroba). To zmes hranimo 1-2 uri pri 37°C, nato dodamo eritrocite. Če je testni antigen homologen diagnostičnim serumskim protitelesom, medsebojno delujejo in dodani eritrociti ne aglutinirajo – rezultat reakcije je pozitiven. Če testni antigen ni homologen s serumskimi protitelesi ali ga material ne vsebuje, potem dodani eritrociti adsorbirajo antigen in pride do RHA - izvid RHA je negativen, vrsta mikroba (antigena), ki se testira, ni ugotovljena.

Način nastavitve PH A je, da vzamejo enake količine in zmešajo diagnostični imunski serum z različne razredčitve materiala, ki ga preučujemo (želeni antigen), pustimo v stiku 1-2 uri, nato dodamo eritrocite, senzibilizirane z določenim (znanim) antigenom, specifičnim za serumska protitelesa (eritrocitni diagnostik). Ko želeni antigen reagira s serumskimi protitelesi, se ta nevtralizirajo in dodani eritrociti ne pride do aglutinacije, RHA ne pride – rezultat PHA je pozitiven. Če testni material ne vsebuje antigena, specifičnega za protitelesa uporabljenega seruma, protitelesa ne bodo nevtralizirana. Zato se ob dodajanju eritrocitnega diagnostika pojavi aglutinacija (hemaglutinacija) eritrocitov, rezultat RHA pa je negativen. Nevtralizacijski test protiteles je zelo občutljiva metoda za dokazovanje antigena ne samo v suspenziji živih (ali ubitih) bakterij, ampak tudi v suspenziji zmletega tkiva različnih organov, nativnih in segretih izločkov ter izločkov obolelega organizma.

Na kratko reakcija hemaglutinacije. Reakcija posredne hemaglutinacije (rnga) ali reakcija pasivne hemaglutinacije (rpga). Čas analize