Cilj: Obvladati tehniko izvajanja reakcij aglutinacije in reakcij precipitacije za diagnosticiranje nalezljivih bolezni.
Modul 1. Morfologija in fiziologija mikroorganizmov. Okužba. Imuniteta.
Tema 16: Reakcija aglutinacije. Reakcija padavin.
Relevantnost teme. Spodaj imunost pomenijo odpornost telesa na infekcijske in neinfekcijske povzročitelje ( patogeni mikroorganizmi, tuje beljakovine in druge snovi). Te snovi se imenujejo antigeni. Imunost je lahko prirojena ali pridobljena. Prirojena– ko se oblikujejo tkivne in humoralne zaščitne naprave, ki povzročajo imunost na nalezljive bolezni, ki se prenašajo z dedovanjem.
Pridobiti– ki jih izvaja imunski sistem telesa v obliki proizvodnje protiteles ali kopičenja senzibiliziranih limfocitov. Razdeljen je na naravnega in umetnega. Glede na mehanizem delovanja je razdeljen na aktivni in pasivni. V vseh imunoloških reakcijah je glavna sestavina antigen.
Glavna funkcija imunski sistem, ki je sestavljen iz limfoidnega tkiva, je prepoznati tujke (antigene) in jih nevtralizirati.
Antigeni lahko vstopijo v telo skozi Airways, prebavni trakt, skozi kožo in sluznico. Vsak antigen spodbuja tvorbo posebnih beljakovinskih snovi - protiteles.
Antigeni delimo na popolne in manjvredne (haptene). Popolni antigeni sproži popoln imunski odziv. Okvarjeni antigeni Sami ne povzročijo imunskega odziva, včasih pa pridobijo to sposobnost, ko so konjugirani z visokomolekularnimi proteinskimi nosilci. Poleg tega obstajajo antigeni: hemihapteni, proantigeni, heteroantigeni in izoantigeni.
Protitelesa so imunoglobulini iz človeškega ali živalskega krvnega seruma. Protitelesa se tvorijo po okužbi in kot posledica imunizacije z oslabljenimi ali ubitimi bakterijami, rikecijami, virusi, toksini in drugimi povzročitelji. Protitelesa– imunoglobulinske beljakovine kemična sestava spadajo med glikoproteine. Glede na zgradbo in imunobiološke lastnosti delimo imunoglobuline na 5 razredov IgM, IgG, IgA, IgE, IgD.
Normalna protitelesa najdemo pri ljudeh in živalih, ki niso cepljeni. Specifična protitelesa nastanejo kot posledica okužbe ali imunizacije.
Reakcija med protitelesom in antigenom se imenuje serološke. Serološki testi so zelo specifični in se uporabljajo pri diagnosticiranju številnih nalezljivih bolezni. Razlikujemo med reakcijo aglutinacije in reakcijo obarjanja.
1. Aglutinacijska reakcija (RA) temelji na medsebojnem delovanju antigena (aglutinogena) in protitelesa (aglutinina), pri čemer se mikrobna telesca zlepijo in precipitirajo v prisotnosti elektrolita. Obstajajo različne modifikacije reakcije aglutinacije.
Najvišja vrednost imeti:
- Makroskopska (razširjena) aglutinacija v epruvetah. V pacientov serum dodamo suspenzijo mikrobov (diagnostikum) in po 1 uri v termostatu pri temperaturi 37 stopinj zabeležimo razredčitev (titer) seruma, pri kateri je prišlo do reakcije. Reakcija aglutinacije se šteje za pozitivno, če se na dnu epruvete tvori oborina z izrazitim bistrenjem supernatanta. Ta oborina se imenuje aglutinat.
Glede na naravo aglutinata ločimo drobnozrnato (O) in grobozrnato (H) aglutinacijo. Za identifikacijo drobnozrnatega aglutinata se uporablja aglutinoskop. Zapisovanje rezultatov se začne s kontrolnimi epruvetami. Zadnja razredčitev seruma, v kateri opazimo aglutinacijo, se šteje za njegov titer.
Namen reakcije: odkrivanje protiteles v bolnikovem serumu.
- Mikroskopsko (pospešeno ) približna aglutinacija na steklu. Kapljico bakterijske kulture dodamo kapljici diagnostičnega imunskega seruma in enakomerno premešamo. Reakcija poteka pri sobni temperaturi v 5-10 minutah. Nato se opravi računovodstvo. Če je reakcija pozitivna, opazimo v kapljici seruma kopičenje bakterij v obliki zrn ali kosmičev. Namen reakcije: določitev vrste povzročitelja z uporabo znanega diagnostičnega seruma.
- Indirektna (pasivna) reakcija hemaglutinacije (IRHA). Bistvo te reakcije je, da so ovčje rdeče krvničke sposobne adsorbirati antigene na svoji površini. Pod vplivom specifičnih protiteles se rdeče krvne celice zlepijo in precipitirajo, na dnu pa nastane hemaglutinat. Reakcija je zelo občutljiva in specifična. RNGA vam omogoča odkrivanje minimalne količine protiteles in okvarjenih antigenov polisaharidne narave. Ta reakcija se uporablja pri diagnozi številnih nalezljivih bolezni (tifus in tifus, paratifus, tuberkuloza itd.).
2. Reakcija obarjanja (RP ) – precipitacijo kompleksa antigen-protitelo. Glavna razlika med RP in RA je v tem, da se pri RA uporablja korpuskularni antigen, pri RP pa je antigen koloidna snov beljakovinske ali polisaharidne narave. Pri tej reakciji se antigen imenuje precipitinogen, protitelesa pa precipitini. Reakcijo izvedemo v epruvetah z nanosom raztopine antigena na imunski serum. Z optimalnim razmerjem antigena in protiteles na meji
Te raztopine tvorijo obroč oborine. Če kot antigen uporabimo prekuhane in filtrirane izvlečke organov in tkiv, reakcijo imenujemo reakcija termoprecipitacije (Ascolijeva reakcija, ki se uporablja pri diagnozi antraks, kuga, tularemija itd.).
Reakcije obarjanja v agarju so postale zelo razširjene: metoda enostavne difuzije, metoda dvojne difuzije.
Vrsta padavin je reakcija flokulacije– za določanje aktivnosti toksoida ali antitoksičnega seruma. Poleg tega se lahko ta reakcija uporabi za določanje toksigenosti sevov Corynebacterium diphtheriae.
Posebni cilji:
· Pojasni vlogo antigenov kot induktorjev imunskega odziva;
· Opiše zgradbo antigenov, vključno z antigeni mikroorganizmov;
· Opišite mehanizem reakcije aglutinacije;
· Opišite mehanizem reakcije obarjanja.
Biti sposoben:
· Pojasni vlogo antigenov kot induktorjev imunskega odziva;
· Opiše zgradbo protiteles (različni razredi imunoglobulinov);
· Analizirati mehanizem interakcije protiteles z antigeni;
· Interpretirati rezultate aglutinacijske reakcije;
· Interpretirati rezultate padavinske reakcije;
· Analizirajte dobljene rezultate.
1. Opredelitev pojma "antigeni", "protitelesa".
2. Vloga antigenov kot induktorjev imunskega odziva.
3. Zgradba protiteles (različni razredi imunoglobulinov).
4. Mehanizem interakcije protiteles z antigeni.
5. Imunske reakcije, njihova vloga pri imunskem odzivu in diagnostiki nalezljivih bolezni.
6. Mehanizem reakcije aglutinacije.
7. Mehanizem padavinske reakcije.
Praktične naloge pri pouku:
1. Izvedba aglutinacijske reakcije za odkrivanje protiteles v pacientovem serumu.
2. Postavitev mikroaglutinacijske reakcije na steklu z diagnostičnimi serumi za identifikacijo čiste kulture bakterij.
3. Vrednotenje rezultatov reakcije aglutinacije.
4. Nastavitev precipitacijske reakcije za odkrivanje bakterijskega antigena.
5. Vrednotenje rezultatov reakcije obarjanja.
6. Vrednotenje rezultatov reakcije indirektne hemaglutinacije.
7. Sestava protokola.
Literatura:
1. Pyatkin K.D., Krivoshein Yu.S. Mikrobiologija z virologijo in imunologijo.- Kijev: Višja šola, 1992.- 431 str.
2. Vorobyov A.V., Bykov A.S., Pashkov E.P., Rybakova A.M. Mikrobiologija.- M.: Medicina, 1998.- 336 str.
3. Medicinska mikrobiologija /Uredil V.P. Pokrovsky – M.: GEOTAR-MED, 2001. – 768 str.
4. Korotyaev A.I., Babichev S.A. Medicinska mikrobiologija, imunologija in virologija / Učbenik za medicinske univerze, St. Petersburg: "Posebna literatura", 1998.- 592 str.
5. Timakov V.D., Levashev V.S., Borisov L.B. Mikrobiologija / Učbenik - 2. izd., prenovljena. in dodatno - M.: Medicina, 1983.- 512 str.
6. Zapiski predavanj.
1. Titov M.V. Nalezljive bolezni.- K., 1995.– 321 str.
2. Shuvalova E.P. Nalezljive bolezni - M.: Medicina, 1990. - 559 str.
Reakcija aglutinacije temelji na specifični interakciji protiteles (aglutininov) s celimi mikrobnimi ali drugimi celicami. Zaradi te interakcije nastanejo aglomeratni delci, ki se oborijo (aglutinirajo). V reakciji aglutinacije lahko sodelujejo bakterije, protozoji, glive, kvasovke, rikecije, eritrociti in druge celice, tako žive kot mrtve. Reakcija poteka v dveh fazah: prva je specifična kombinacija antigena in protitelesa, druga je nespecifična, to je tvorba vidnega aglutinata. Precipitacija aglutinata se pojavi v prisotnosti elektrolitov, kot je natrijev klorid. Mikroorganizmi v aglutinatu ostanejo živi, vendar izgubijo mobilnost.
Reakcija aglutinacije se pogosto uporablja za serološko diagnozo nalezljivih bolezni in določanje antigenske strukture izoliranih mikrobov. Za določitev antigenske strukture patogena, izoliranega iz telesa bolnika ali nosilca, se uporablja specifičen imunski serum, pridobljen z imunizacijo živali (zajec, osel, ovca) z določenimi mikroorganizmi. Identifikacija mikroba se izvede v reakciji aglutinacije na steklu z adsorbiranimi ali monoreceptorskimi serumi ali v epruvetah s specifičnimi aglutinacijskimi serumi. Adsorbirani serumi vsebujejo protitelesa samo proti antigenom, specifičnim za določen mikrob, monoreceptorski serumi pa vsebujejo protitelesa samo proti enemu specifičnemu antigenu povzročitelja.
Vrstni serumi vsebujejo protitelesa proti vsem antigenom določenega mikroba.
Ali izolirana kultura mikroorganizma pripada te vrste določeno z aglutinacijo z znanim serumom do titra protiteles, navedenega na nalepki ampule seruma. Titer protiteles v serumu se šteje za njegovo zadnjo razredčitev, v kateri je še vedno opazna aglutinacija kulture mikrobov, uporabljenih za imunizacijo živali. Adsorbirani in monoreceptorski serumi se običajno uporabljajo nerazredčeni v reakciji aglutinacije stekla.
Pri določanju prisotnosti protiteles v bolnikovem krvnem serumu ga razredčimo z izotonično raztopino natrijevega klorida, začenši z razredčino 1: 50 do 1: 800 ali več. Vsaki razredčitvi se doda suspenzija živih ali ubitih mikrobov. Pripravki, ki vsebujejo mikrobe, uničene s toploto ali formaldehidom, se imenujejo diagnostiki. Diagnostikumi, pridobljeni s segrevanjem kultur mikroorganizmov, vsebujejo le somatske antigene. Pri uporabi samo formaldehida mikrobi ohranijo svoje flagelarne antigene.
V primeru prisotnosti protiteles v pacientovi krvi se diagnostični test, vzet v reakciji, zlepi in na dveh epruvetah nastane oborina (aglutinat). V tem primeru se rezultati aglutinacijske reakcije štejejo za pozitivne. V kontrolni epruveti, v katero dodamo izotonično raztopino natrijevega klorida in diagnostikum, mora biti suspenzija mikrobov homogena ( negativna reakcija aglutinacija).
Rezultate aglutinacijske reakcije pri nekaterih boleznih, kot je leptospiroza, upoštevamo samo mikroskopsko v temnem vidnem polju mikroskopa (mikroaglutinacija). Za postavitev serološke diagnoze bolezni se upošteva diagnostična bolezen. Običajno ustreza razredčini seruma 1:100 ali 1:200.
Protitelesa v bolnikovem krvnem serumu lahko odkrijemo z aglutinacijsko reakcijo pri tifusu in paratifusu (Vidalova reakcija), brucelozi (Wrightova reakcija), tularemiji itd.
Castellanijeva reakcija. Za nekatere nalezljive bolezni ali imunizacijo z mikroorganizmi, ki vsebujejo skupinski antigeni, v krvnem serumu se poleg protiteles, specifičnih za to vrsto, pojavijo tudi skupinska protitelesa. V tem primeru bodo sorodne bakterijske vrste aglutinirane z dobljenimi serumi.
Castellani je predlagal metodo za adsorpcijo skupinskih protiteles iz imunskih serumov, ki temelji na njihovi odstranitvi s pomočjo mikroorganizmov sorodnih vrst, ki imajo skupinske antigene, vendar nimajo specifičnih. Serumu dodana kultura takih mikroorganizmov adsorbira protitelesa nespecifične skupine in po odstranitvi kompleksa antigen-protitelo s centrifugiranjem ostanejo v serumu samo specifični imunoglobulini. Serumi, obdelani po metodi Castellani, se lahko uporabijo v reakciji aglutinacije kot visoko specifični.
Imunodiagnostične reakcije. Reakcije antigen-protitelo in reakcije z označenimi komponentami. Uporaba za identifikacijo mikroorganizmov in diagnozo nalezljivih bolezni.
Imunske reakcije se uporabljajo v diagnostičnih in imunoloških študijah pri bolnikih in zdravi ljudje. V ta namen uporabljajo serološke metode (iz lat. serum - sirotka in logotipi - poučevanje), tj. metode za preučevanje protiteles in antigenov z uporabo reakcij antigen-protitelo, določenih v krvnem serumu in drugih tekočinah ter telesnih tkivih.
Odkrivanje protiteles proti antigenom patogena v bolnikovem krvnem serumu omogoča postavitev diagnoze bolezni. Serološke študije se uporabljajo tudi za identifikacijo mikrobnih antigenov, različnih biološko aktivnih snovi, krvnih skupin, tkivnih in tumorskih antigenov, imunskih kompleksov, celičnih receptorjev itd.
Ko je mikrob izoliran od pacienta, se povzročitelj identificira s preučevanjem antigenske lastnosti z uporabo imunskih diagnostičnih serumov, to je krvnih serumov hiperimuniziranih živali, ki vsebujejo specifična protitelesa. To je t.i serološka identifikacija mikroorganizmi.
V mikrobiologiji in imunologiji se pogosto uporabljajo reakcije aglutinacije, precipitacije, nevtralizacijske reakcije, reakcije, ki vključujejo komplement, z uporabo označenih protiteles in antigenov (radioimunološki, encimski imunski test, imunofluorescentne metode). Naštete reakcije se razlikujejo po registriranem učinku in tehniki izdelave, vendar so vse bazične. temeljijo na reakciji interakcije antigena s protitelesom in se uporabljajo za odkrivanje tako protiteles kot antigenov. Za imunske reakcije je značilna visoka občutljivost in specifičnost.
Spodaj so načela in diagrami glavnih imunodiagnostičnih reakcij. Podrobna tehnika za nastavitev reakcij je podana v. praktične smernice za imunodiagnostiko.
Aglutinacijska reakcija - RA(iz lat. agluti- natio- adhezija) je enostavna reakcija, pri kateri protitelesa vežejo korpuskularne antigene (bakterije, eritrocite ali druge celice, netopne delce z adsorbiranimi antigeni, pa tudi makromolekularne agregate). Pojavi se v prisotnosti elektrolitov, na primer, ko dodamo izotonično raztopino natrijevega klorida.
Uporabljajo se različne možnosti za reakcijo aglutinacije: obsežna, indikativna, posredna itd. Reakcija aglutinacije se kaže v tvorbi kosmičev ali usedlin
RA se uporablja za:
določanje protiteles v krvnem serumu bolnikov, na primer z brucelozo (Wrightova, Heddelsonova reakcija), tifusno vročino in paratifusno vročino (Vidalova reakcija) in druge nalezljive bolezni;
določitev patogena, izoliranega od bolnika;
določanje krvnih skupin z uporabo monoklonskih protiteles proti aloantigenom eritrocitov.
Za določitev protiteles pri bolniku postavitipodrobna reakcija aglutinacije: dodajte razredčitvam bolnikovega krvnega seruma diagnosticum(suspenzija ubitih mikrobov) in po večurni inkubaciji pri 37 °C opazimo največjo razredčitev seruma (serumski titer), pri kateri je prišlo do aglutinacije, tj. do nastanka oborine.
Narava in hitrost aglutinacije sta odvisni od vrste antigena in protiteles. Primer so posebnosti interakcije diagnostičnih (O- in R-antigenov) s specifičnimi protitelesi. Aglutinacijska reakcija z O-diagnostikum(bakterije, ki jih ubije toplota, ostanejo toplotno stabilne O-antigen) poteka v obliki drobnozrnate aglutinacije. Reakcija aglutinacije s H-diagnosticumom (bakterije, ki jih ubije formaldehid, obdrži termolabilni flagelarni H-antigen) je groba in poteka hitreje.
Če je treba določiti patogen, izoliran od pacienta, postavite indikativna reakcija aglutinacije, z uporabo diagnostičnih protiteles (aglutinacijski serum), tj. Izvede se serotipizacija patogena. Indikativno reakcijo izvedemo na stekelcu. Kapljici diagnostičnega aglutinacijskega seruma dodamo čisto kulturo povzročitelja, izolirano od bolnika, v razredčitvi 1:10 ali 1:20. V bližini je postavljena kontrola: namesto seruma se nanese kapljica raztopine natrijevega klorida. Ko se v kapljici, ki vsebuje serum in mikrobe, pojavi kosmičasta usedlina, a obsežna reakcija aglutinacije v epruvetah z naraščajočimi razredčinami aglutinacijskega seruma, ki mu dodamo 2-3 kapljice suspenzije patogena. Aglutinacija se upošteva glede na količino usedline in stopnjo bistrosti tekočine. Reakcija se šteje za pozitivno, če opazimo aglutinacijo v razredčitvi blizu titra diagnostičnega seruma. Hkrati se upoštevajo kontrole: serum, razredčen z izotonično raztopino natrijevega klorida, mora biti prozoren, suspenzija mikrobov v isti raztopini mora biti enakomerno motna, brez usedline.
Različne sorodne bakterije lahko aglutiniramo z istim diagnostičnim aglutinacijskim serumom, kar oteži njihovo identifikacijo. Zato uporabljajo adsorbirani aglutinacijski serumi, iz katerih so bila navzkrižno reagirajoča protitelesa odstranjena z adsorpcijo na sorodne bakterije. Takšni serumi zadržijo protitelesa, ki so specifična samo za določeno bakterijo. Proizvodnja posebnih monoreceptorskih diagnostičnih aglutinacijskih serumov je predlagal A. Castellani (1902).
Posredna (pasivna) reakcija hemaglutinacije (RNGA, RPGA) temelji na uporabi eritrocitov z adsorbiranimi antigeni ali protitelesi na njihovi površini, katerih interakcija z ustreznimi protitelesi ali antigeni krvnega seruma povzroči, da se eritrociti zlepijo in izpadejo na dno testa. cev ali celica V v obliki nazobčanega sedimenta (slika 13.2). V primeru negativne reakcije se rdeče krvničke usedejo ■ v obliki »gumba«. Običajno se protitelesa odkrijejo v RNGA z uporabo antigenskega eritrocitnega diagnostika, ki je eritrocit z adsorbirano na jih z antigeni. Včasih se uporablja protitelesna eritrocitna diagnostika, na kateri se adsorbirajo protitelesa. Na primer, botulinski toksin lahko odkrijemo tako, da mu dodamo eritrocitno protitelo botulinskega toksina (to reakcijo imenujemo reakcija povratne indirektne hemaglutinacije- RONG). RNGA se uporablja za diagnosticiranje nalezljivih bolezni, določanje gonadotropni hormon V urina pri ugotavljanju nosečnosti, za odkrivanje preobčutljivost Za zdravila, hormoni in v nekaterih drugih primerih.
Reakcija koaglutinacije . Patogene celice se določijo s pomočjo stafilokokov, predhodno obdelanih z imunskim diagnostičnim serumom. Stafilokoki, ki vsebujejo beljakovine A, imeti afiniteto do Fc - fragment imunoglobulinov, nespecifično adsorbira protimikrobna protitelesa, ki nato sodelujejo z aktivnimi centri z ustreznimi mikrobi, izoliranimi od bolnikov. Kot posledica koaglutinacije nastanejo kosmiči, ki so sestavljeni iz stafilokokov, diagnostičnih serumskih protiteles in odkritega mikroba.
Reakcija inhibicije hemaglutinacije (RTGA) temelji na blokadi, supresiji virusnih antigenov z imunskimi serumskimi protitelesi, zaradi česar virusi izgubijo sposobnost aglutinacije rdečih krvnih celic (slika 13.3). RTGA se uporablja za diagnosticiranje številnih virusnih bolezni, katerih povzročitelji (virusi gripe, ošpic, rdečk, klopnega encefalitisa itd.) lahko aglutinirajo rdeče krvničke različnih živali.
Aglutinacijska reakcija za določanje krvnih skupin uporablja se za vzpostavitev sistema ABO (glejte poglavje 10.1.4.1) z uporabo aglutinacije rdečih krvnih celic z imunskimi serumskimi protitelesi proti antigenom krvne skupine A (II), B (III). Kontrola je: serum, ki ne vsebuje protiteles, tj AB (GU) krvne skupine; antigeni, ki jih vsebujejo rdeče krvne celice skupin A (II), B (III). Negativna kontrola ne vsebuje antigenov, tj. uporabljeni so eritrociti skupine 0 (I).
IN aglutinacijske reakcije za določanje Rh faktorja(glejte poglavje 10.1.4.1) uporabite anti-Rhesus serume (vsaj dve različni seriji). Če je na membrani proučevanih eritrocitov antigen Rh, pride do aglutinacije teh celic. Za kontrolo služijo standardni Rh pozitivni in Rh negativni eritrociti vseh krvnih skupin.
Aglutinacijska reakcija za določanje protiteles proti rezusu ( posredna reakcija Coombs)uporablja pri bolnikih z intravaskularna hemoliza. Pri nekaterih od teh bolnikov se odkrijejo protitelesa proti Rhesusu, ki so nepopolna in monovalentna. Posebej interagirajo z Rh-pozitivnimi eritrociti, vendar ne povzročajo njihove aglutinacije. Prisotnost takih nepopolnih protiteles ugotavljamo z indirektnim Coombsovim testom. Da bi to naredili, sistemu anti-Rh protiteles + Rh-pozitivnih eritrocitov dodamo antiglobulinski serum (protitelesa proti človeškim imunoglobulinom), kar povzroči aglutinacijo eritrocitov (slika 13.4). Z uporabo Coombsove reakcije se diagnosticirajo patološka stanja, povezana z intravaskularno lizo eritrocitov imunskega izvora, na primer hemolitična bolezen novorojenčka: eritrociti Rh-pozitivnega ploda se združijo z nepopolnimi protitelesi proti Rh faktorju, ki krožijo v krvi, ki imajo skozi placento od Rh-negativne matere.
Precipitacijske reakcije
Reakcija padavin - RP (izlat. praecipito- precipitat) - gre za tvorbo in obarjanje kompleksa topnega molekularnega antigena s protitelesi v obliki motnosti, t.i. oborina. Nastane z mešanjem antigenov in protiteles v enakovrednih količinah; presežek enega od njih zmanjša raven tvorbe imunskega kompleksa.
Reakcije obarjanja izvajamo v epruvetah (reakcija obarjanja obroča), v gelih, hranilnih medijih itd. Razširjene so bile različne reakcije obarjanja v poltekočih gelih agarja ali agaroze: dvojna imunodifuzija po Ouchterlonyju. radialna imunodifuzija, imunoelektroforeza in itd.
Obročna precipitacijska reakcija . Reakcijo izvajamo v ozkih precipitacijskih epruvetah z imunskim serumom, na katerega je nanesen topni antigen. Z optimalnim razmerjem antigena in protiteles se na meji teh dveh raztopin oblikuje neprozoren obroč oborine (slika 13.5). Presežek antigena ne vpliva na rezultat reakcije obarjanja obroča zaradi postopne difuzije reagentov do tekoče meje. Če kot antigene v reakciji obarjanja obroča uporabimo kuhane in filtrirane vodne izvlečke organov ali tkiv, potem to reakcijo imenujemo reakcija termoprecipitacije (Ascolijeva reakcija, z antraksom/
Dvojna imunodifuzijska reakcija po Ouchterunyju . Za postavitev reakcije stopljeno agar gel tanek sloj vlijemo na stekleno ploščo in ko se strdi, v njej izrežemo luknje velikosti 2-3 mm. Antigeni in imunski serumi so nameščeni ločeno v te vdolbinice, ki difundirajo druga proti drugi. Na stičnem mestu v enakih razmerjih tvorijo oborino v obliki bele črte. V večkomponentnih sistemih se med vdolbinicami z različnimi antigeni in serumskimi protitelesi pojavi več linij oborine; pri enakih antigenih se precipitatne črte združijo; pri neenakih se sekajo (slika 13.6).
Radialna imunodifuzijska reakcija . Imunski serum s staljenim agar gelom enakomerno vlijemo na kozarec. Po strjevanju v gelu naredimo vdolbinice, v katere damo antigen različne razredčitve. Antigen, ki difundira v gel, tvori obročaste precipitacijske cone okoli vdolbinic s protitelesi (slika 13.7). Premer precipitacijskega obroča je sorazmeren s koncentracijo antigena. Reakcija se uporablja za določanje vsebnosti imunoglobulinov različnih razredov, komponent sistema komplementa itd. V krvi.
Imunoelektroforeza- kombinacija elektroforeze in imunoprecipitacije: zmes antigenov vnesemo v vdolbinice gela in jih z elektroforezo ločimo v gelu. Nato se imunski serum vnese v žleb, vzporeden z elektroforeznimi conami, protitelesa, ki difundirajo v gel, tvorijo precipitacijske črte na mestu srečanja z antigenom.
Reakcija flokulacije(po Ramonu) (iz lat. kosmiči - volneni kosmiči) - pojav opalescence ali flokulentne mase (imunoprecipitacija) v epruveti med reakcijo toksin-antitoksin ali toksoid-antitoksin. Uporablja se za določanje aktivnosti antitoksičnega seruma ali toksoida.
imunski elektronska mikroskopija - elektronska mikroskopija mikrobov, pogosto virusov, tretiranih z ustreznimi protitelesi. Virusi, tretirani z imunskim serumom, tvorijo imunske agregate (mikroprecipitate). Okoli virionov se oblikuje "venček" protiteles, v nasprotju s fosfovolframovo kislino ali drugimi elektronsko optično gostimi pripravki.
Reakcije, ki vključujejo komplement
Reakcije, ki vključujejo komplementtemeljijo na aktivaciji komplementa s kompleksom antigen-protitelo (reakcija fiksacije komplementa, radialna hemoliza itd.).
Reakcija fiksacije komplementa (RSK) je, da ko antigeni in protitelesa ustrezajo drug drugemu, tvorijo imunski kompleks, na katerega preko Fc -fragment protitelesa je vezan na komplement (C), kar pomeni, da je komplement vezan na kompleks antigen-protitelo. Če kompleks antigen-protitelo ne nastane, ostane komplement prost (slika 13.8). RSK poteka v dveh fazah: 1. faza - inkubacija mešanice treh komponent antigen + protitelo + komplement; 2. faza (indikator) - odkrivanje prostega komplementa v mešanici z dodajanjem hemolitičnega sistema, sestavljenega iz ovčjih eritrocitov in hemolitičnega seruma, ki vsebuje protitelesa proti njim. V 1. fazi reakcije, ko nastane kompleks antigen-protitelo, se komplement veže, nato pa v 2. fazi ne bo prišlo do hemolize eritrocitov, senzibiliziranih s protitelesi; reakcija je pozitivna. Če se antigen in protitelo med seboj ne ujemata (v testnem vzorcu ni antigena ali protitelesa), ostane komplement prost in se v 2. fazi pridruži kompleksu eritrocit - antieritrocitno protitelo, kar povzroči hemolizo; reakcija je negativna.
RSC se uporablja za diagnosticiranje številnih nalezljivih bolezni, zlasti sifilisa (Wassermannova reakcija).
Reakcija radialne hemolize (RRH) ) damo v jamice agar gela, ki vsebuje ovčje rdeče krvne celice in komplement. Po vnosu hemolitičnega seruma (protitelesa proti ovčjim rdečim krvnim celicam) v jamice gela se okoli njih oblikuje cona hemolize (kot posledica radialne difuzije protiteles). Na ta način je mogoče določiti aktivnost komplementa in hemolitičnega seruma ter protiteles v krvnem serumu bolnikov z gripo, rdečkami, klopni encefalitis. Da bi to naredili, se ustrezni antigeni virusa adsorbirajo na eritrocitih, pacientov krvni serum pa se doda v jamice gela, ki vsebuje te eritrocite. Protivirusna protitelesa medsebojno delujejo z virusnimi antigeni, adsorbiranimi na eritrocitih, po čemer
Temu kompleksu se nato pridružijo komponente komplementa, kar povzroči hemolizo.
Reakcija imunske adherence (IAR) ) temelji na aktivaciji sistema komplementa s korpuskularnimi antigeni (bakterije, virusi), obdelanimi z imunskim serumom. Posledično nastane aktivirana tretja komponenta komplementa (C3b), ki se kot del imunskega kompleksa veže na korpuskularni antigen. Eritrociti, trombociti in makrofagi imajo receptorje za C3b, zaradi česar, ko se te celice pomešajo z imunskimi kompleksi, ki nosijo C3b, pride do njihove kombinacije in aglutinacije.
Reakcija nevtralizacije
Protitelesa imunskega seruma so sposobna nevtralizirati škodljiv učinek mikrobov ali njihovih toksinov na občutljive celice in tkiva, kar je povezano z blokado mikrobnih antigenov s protitelesi, tj. nevtralizacija. Reakcija nevtralizacije(RN) se izvede z vnosom mešanice antigen-protitelo v živali ali v občutljive testne predmete (celična kultura, zarodki). V odsotnosti škodljivih učinkov mikroorganizmov ali njihovih antigenov ali toksinov pri živalih in testnih predmetih govorijo o nevtralizirajočem učinku imunskega seruma in s tem o specifičnosti interakcije kompleksa antigen-protitelo (slika 13.9).
Imunofluorescenčna reakcija - RIF (metoda Coons)
Obstajajo tri glavne vrste metode: neposredna, posredna (slika 13.10), s komplementom. Koonsova reakcija je hitra diagnostična metoda za identifikacijo mikrobnih antigenov ali določanje protiteles.
Neposredna metoda RIF temelji na dejstvu, da lahko tkivni antigeni ali mikrobi, obdelani z imunskimi serumi s protitelesi, označenimi s fluorokromi, svetijo v UV žarkih fluorescentnega mikroskopa.
Bakterije v brisu, tretiranem s takšnim luminiscenčnim serumom, svetijo po obodu celice v obliki zelene obrobe.
Posredna metoda RIF sestoji iz identifikacije kompleksa antigen-protitelo z uporabo seruma antiglobulina (protitelesa), označenega s fluorokromom. Da bi to naredili, brise iz suspenzije mikrobov obdelamo s protitelesi iz protimikrobnega kunčjega diagnostičnega seruma. Nato protitelesa, ki jih mikrobni antigeni ne vežejo, speremo, protitelesa, ki ostanejo na mikrobih, pa odkrijemo z obdelavo brisa z antiglobulinskim (anti-kunčjim) serumom, označenim s fluorokromi. Posledično nastane kompleks mikroba + protimikrobna kunčja protitelesa + antikunčja protitelesa, označena s fluorokromom. Ta kompleks opazujemo s fluorescenčnim mikroskopom, kot pri direktni metodi.
Encimska imunosorbentna metoda ali analiza (ELISA)
ELISA -odkrivanje antigenov z uporabo ustreznih protiteles, konjugiranih z označevalnim encimom (hrenova peroksidaza, beta-galaktozidaza ali alkalna fosfataza). Po kombinaciji antigena z encimsko označenim imunskim serumom se mešanici doda substrat/kromogen. Substrat se z encimom razcepi, barva reakcijskega produkta pa se spremeni – intenzivnost barve je premo sorazmerna s številom vezanih molekul antigena in protiteles.
ELISA v trdni fazi - najpogostejša različica imunološkega testa, ko je ena od komponent imunske reakcije (antigen ali protitelesa) sorbirana na trdnem nosilcu, na primer v vdolbinicah polistirenskih plošč.
Pri določanju protiteles se v vdolbinice plošč z sorbiranim antigenom zaporedno dodaja bolnikov krvni serum, antiglobulinski serum, označen z encimom, in substrat (kromogen) za encim.
Vsakič po dodajanju druge komponente se nevezani reagenti odstranijo iz vdolbinic s temeljitim izpiranjem. pri pozitiven rezultat Barva raztopine kromogena se spremeni. Trdnofazni nosilec lahko senzibiliziramo ne le z antigenom, ampak tudi s protitelesi. Nato v vdolbinice s sorbiranimi protitelesi dodamo želeni antigen, z encimom označenim imunski serum proti antigenu in nato še substrat za encim.
Konkurenčna možnost ELISA . tarčni antigen in z encimom označeni antigen tekmujeta med seboj, da bi vezala omejeno količino protiteles v imunskem serumu. Še en test - protitelesa, ki jih iščete
in označena protitelesa tekmujejo med seboj za antigene.
Radioimunološka metoda ali analiza (RIA)
Zelo občutljiva metoda, ki temelji na reakciji antigen-protitelo z uporabo antigenov ali protiteles, označenih z radionuklidom (125 J, 14 C, 3 H, 51 Cr itd.). Po njunem medsebojnem delovanju se nastali radioaktivni imunski kompleks loči in določi njegova radioaktivnost v ustreznem števcu (beta ali gama sevanje):
jakost sevanja je premosorazmerna s številom vezanih molekul antigena in protiteles.
pri trdnofazna različica RIA ena od reakcijskih komponent (antigen ali protitelesa) se sorbira na trdnem nosilcu, na primer v jamicah polistirenskih mikropanelov. Druga možnost metode je konkurenčni RIA.želeni antigen in z radionuklidi označeni antigen tekmujeta med seboj za vezavo omejene količine protiteles v imunskem serumu. Ta možnost se uporablja za določanje količine antigena v testnem materialu.
RIA se uporablja za identifikacijo mikrobnih antigenov, določanje hormonov, encimov, zdravilne snovi in imunoglobulini ter druge snovi, ki jih testni material vsebuje v manjših koncentracijah - 10~ |0 -I0~ 12 g/l. Metoda predstavlja določeno nevarnost za okolje.
Imunobloting
Imunobloting (IB)- zelo občutljiva metoda, ki temelji na kombinaciji elektroforeze in ELISA ali RIA.
Antigen izoliramo z elektroforezo v poliakrilamidnem gelu, nato prenesemo (blotiranje - iz angleščine. madež, madež) iz gela na aktiviran papir ali nitrocelulozno membrano in razvit z uporabo ELISA. Podjetja proizvajajo takšne trakove z "blots"
antigeni. Na te trakove se nanese bolnikov serum. Nato po inkubaciji bolnika speremo z nevezanih protiteles in nanesemo serum proti humanim imunoglobulinom, označenim z encimom. Kompleks antigen + pacientovo protitelo + protitelo proti humanemu Ig, ki nastane na traku, se odkrije z dodatkom substrata/kromogena, ki spremeni barvo pod delovanjem encima (slika 13.12).
IB se uporablja kot diagnostična metoda za okužbo s HIV itd.
Aglutinacija je lepljenje bakterij kot posledica interakcije specifičnih AT z njimi. Za izvedbo RA so potrebne tri komponente: 1) AG (aglutinogen); 2) AT (aglutinin); 3) raztopina elektrolitov (izotonična raztopina natrijevega klorida). V reakciji aglutinacije sodelujejo samo korpuskularni antigeni (bakterije, rdeče krvničke, z antigenom obremenjeni delci lateksa).
Reakcija aglutinacije na steklu. Na nemastno predmetno stekelce s pipeto nanesemo kapljico diagnostičnega seruma (razredčitev seruma 1:10 - 1:20). Z bakteriološko zanko se s površine poševnega agarja vzame čista kultura proučevanega mikroorganizma, prenese v kapljico seruma in premeša. Rezultat reakcije se upošteva s prostim očesom po 3-5 minutah. Če je reakcija pozitivna, se v kapljici seruma pojavijo kosmiči (veliki ali majhni), ki so jasno vidni na temnem ozadju, ko stekelce stresemo. V primeru negativne reakcije ostane tekočina enakomerno motna.
Reakcija aglutinacije v epruvetah. V vrsto epruvet dodamo 1 ml fiziološke raztopine. V prvo epruveto dodamo enako količino testiranega krvnega seruma. Pripravimo serijske dvakratne razredčitve seruma (serumska titracija), nato pa v vsako epruveto dodamo 2 kapljici suspenzije inaktiviranih bakterij (diagnostikum). Epruvete postavimo v termostat pri 37 °C za 2 uri. Reakcija poteka s tvorbo majhnih kosmičev, nevidnih s prostim očesom, zato se rezultati zabeležijo pod rahlo povečavo v posebni napravi - aglutinoskopu. Intenzivnost aglutinacije se upošteva po sistemu "štiri plus": popolna aglutinacija - 4+, delna aglutinacija - 3+ ali 2+, vprašljiv rezultat - +. Zadnja razredčitev, pri kateri opazimo aglutinacijo 2+, se vzame kot titer protiteles v testnem serumu.
Za določitev titra protiteles proti patogenom se izvede reakcija aglutinacije v epruvetah (obsežna reakcija aglutinacije). tifus in paratifus (Vidalova reakcija), bruceloza (Wrightova reakcija), tifus (Weiglova reakcija).
Aglutinacija (iz latinščine agglutinatio - lepljenje) je lepljenje (povezava) korpuskularnih delcev, ki vsebujejo antigen (celih celic, delcev lateksa itd.), z molekulami specifičnih protiteles v prisotnosti elektrolitov, ki se konča s tvorbo kosmičev ali usedlin. (aglutinirati) viden s prostim očesom. Narava usedline je odvisna od narave antigena: bičkove bakterije proizvajajo grobo kosmičasto usedlino, bičkove in nekapsularne bakterije proizvajajo drobnozrnato usedlino, kapsularne bakterije pa nitasto usedlino. Ločimo neposredno aglutinacijo, pri kateri lastni antigeni bakterijske ali katere druge celice, na primer eritrocitov, neposredno sodelujejo pri interakciji s specifičnimi protitelesi; in posredno ali pasivno, pri kateri so bakterijske celice ali eritrociti ali delci lateksa nosilci ne lastnih, ampak tujih antigenov (ali protiteles), sorbiranih na njih, da identificirajo protitelesa (ali antigene), ki so zanje specifična. Aglutinacijska reakcija vključuje predvsem protitelesa iz razredov IgG in IgM. Poteka v dveh fazah: najprej pride do specifične interakcije med aktivnim središčem protiteles in determinanto antigena; ta stopnja se lahko pojavi v odsotnosti elektrolitov in je ne spremljajo vidne spremembe v reakcijskem sistemu. Za drugo stopnjo - nastanek aglutinata - je potrebna prisotnost elektrolitov, ki reducirajo električni naboj komplekse antigen + protitelo in pospešijo proces njihovega lepljenja. Ta faza se konča s tvorbo aglutinata.
Aglutinacijske reakcije izvajamo na steklenih ali gladkih kartonskih ploščah ali v sterilnih aglutinacijskih epruvetah. Običajno se uporabljajo reakcije aglutinacije (neposredne in pasivne) na steklu pospešeno metodo odkrivanje specifičnih protiteles v bolnikovem serumu (na primer z brucelozo) ali za serološko identifikacijo patogena. V slednjem primeru se običajno uporabljajo dobro prečiščeni (adsorbirani) diagnostični serumi, ki vsebujejo samo monoreceptorska protitelesa ali njihov niz proti različnim antigenom. Nedvomna prednost reakcije aglutinacije na steklu je preprostost njene izvedbe in dejstvo, da traja nekaj minut ali celo sekund, saj se obe komponenti uporabljata v koncentrirani obliki. Vendar ima le kvalitativno vrednost in je manj občutljiv kot epruveta. Obsežna reakcija aglutinacije v epruvetah daje natančnejše rezultate, saj vam omogoča, da določite kvantitativno vsebnost protiteles v serumu (določite njegov titer) in po potrebi registrirate dejstvo povečanja titra protiteles, ki ima diagnostično vrednost. . Za postavitev reakcije dodamo razredčeno 0,85% raztopino v aglutinacijske epruvete na določen način. raztopina NaCl seruma in enako količino (običajno 0,5 ml) suspenzije standardnega diagnostikuma (ali testne kulture), ki vsebuje 1 milijardo bakterij v 1 ml. Rezultati reakcije aglutinacije se zabeležijo najprej po 2 urah inkubacije epruvet pri 37 °C in končno po 20-24 urah glede na dva merila: prisotnost in velikost oborine ter stopnjo prosojnosti supernatanta. Ocenjevanje poteka po sistemu štirih križcev. Reakcijo nujno spremlja kontrola seruma in antigena. V primerih, ko se za serološko identifikacijo povzročitelja izvede podrobna aglutinacijska reakcija v epruveti, ima diagnostično vrednost, če je reakcija ocenjena kot pozitivna, ko je diagnostični serum razredčen na vsaj polovico titra.
Upoštevati je treba, da pri mešanju raztopin homolognih antigenov in protiteles ni vedno opaziti vidnih manifestacij aglutinacijske reakcije. Oborina nastane le pri določenih optimalnih razmerjih obeh reakcijskih komponent. Izven teh meja, z znatnim presežkom antigena ali protiteles, reakcije ni opaziti. Ta pojav se imenuje "prozonski fenomen". Opazimo ga tako pri reakciji aglutinacije kot pri reakciji obarjanja. Pojav prozona v imunskih reakcijah je razložen z dejstvom, da so antigeni, vključeni v njih, praviloma polideterminantni in molekule protitelesa IgG imajo dva aktivna centra. Pri presežku protiteles je površina vsakega delca antigena prekrita z molekulami protiteles, tako da ni več prostih determinantnih skupin, zato drugo, nevezano aktivno središče protiteles ne more interagirati z drugim delcem antigena in ju povezati med seboj. Tvorba vidnega aglutinata ali precipitata je potlačena tudi pri presežku antigena, ko ne ostane niti eno prosto aktivno središče protiteles, zato se kompleksi antigen + protitelo + antigen ne morejo več povečevati.
Možnosti pospešenih reakcij aglutinacije. Reakcija pasivna hemaglutinacija in njegove različice
Klasična reakcija aglutinacije vključuje uporabo korpuskularnih antigenov. Lahko pa so vpleteni tudi topni antigeni. Da bi to omogočili, so taki antigeni adsorbirani na imunološko inertne delce. Kot nosilec se lahko uporabijo delci lateksa ali bentonita, trenutno pa se najpogosteje uporabljajo živalski ali človeški eritrociti, ki izboljšajo svoje adsorpcijske lastnosti z obdelavo z raztopinami tanina, formalina ali benzidina. Rdeče krvne celice, ki so adsorbirale antigen na sebi, se imenujejo senzibilizirane s tem antigenom in imunska reakcija pri kateri sodelujejo, je posredna ali pasivna hemaglutinacijska reakcija (IRHA ali RPHA), saj pri njej rdeče krvničke sodelujejo pasivno.
RPGA je nameščen v posebnih polistirenskih ploščah z luknjami, ki imajo polkroglo dno. Pri uporabi za serološko diagnostiko se v teh vdolbinicah pripravijo dvakratne razredčine fiziološka raztopina testni serum, nato pa mu kot diagnostično sredstvo dodamo suspenzijo senzibiliziranih eritrocitov. Rezultati se zabeležijo po 2 urah inkubacije pri 37 °C z uporabo sistema štirih križcev. S pozitivno reakcijo se aglutinirane rdeče krvne celice usedejo na dno luknje in jo enakomerno prekrijejo v obliki obrnjenega dežnika. Če je reakcija negativna, se tudi rdeče krvne celice usedejo, tekočina postane bistra, usedlina pa je videti kot majhen "disk" v središču jamice. Titer seruma v RPHA velja za njegovo zadnjo razredčitev, ki še vedno daje izrazito hemaglutinacijo brez pomembni znaki prisotnost "diska".
RPGA se lahko uporablja tudi kot pospešena metoda bakteriološke diagnostike za odkrivanje neposredno v testnem materialu neznanih bakterij, virusov, toksinov, na primer povzročiteljev kuge, stafilokoknih enterotoksinov itd. S to različico RPGA adsorbirane eritrocite, znane po specifičnosti se uporabljajo kot znana sestavina reakcije protitelesa - protitelesni eritrocitni diagnostikum. Če testni material vsebuje zadostno količino znanega antigena, bo RPGA pozitiven.
Možnosti uporabe RPHA so: reakcija nevtralizacije antigena (RNAg), reakcija nevtralizacije protiteles (RNAb), reakcija inhibicije pasivne hemaglutinacije (PHA). Za te reakcije se uporablja diagnostika eritrocitov z antigenom in protitelesom. Istočasno lahko uporabimo dve medsebojno nadzorovani enosmerni reakciji, na primer RPHA z antigenskim diagnostikom in RNAg z protitelesnim eritrocitnim diagnostikom.
Reakcija nevtralizacije protiteles (RNAb) je sestavljena iz mešanja suspenzije, ki vsebuje želeni antigen, s specifičnim imunskim serumom, ki vsebuje znana protitelesa v ustreznih volumnih, in inkubacije pri 37 °C dve uri. Po tem dodamo antigenski diagnostik eritrocitov. Mešanico pretresemo in pustimo pri sobni temperaturi. Rezultate upoštevamo po 3-4 urah in končno po 18-24 urah.Če testni material vsebuje antigen, bo ta vezal protitelesa (jih nevtraliziral), zato ne bo prišlo do hemaglutinacije.
Reakcija nevtralizacije antigena (RNAg) poteka po istem principu. Samo v tem primeru se v testnem materialu odkrijejo protitelesa. Specifični antigen, dodan takšnemu testnemu materialu, se bo vezal na protitelesa, ki jih vsebuje, to pomeni, da bo prišlo do nevtralizacije antigena s protitelesi, zato pri dodajanju protitelesnega eritrocitnega diagnostika ne bo prišlo do hemaglutinacije.
Reakcija koaglutinacije. Je ena od možnosti za pasivno, to je pospešeno reakcijo aglutinacije na steklu, ki jo posredujejo celice nosilke protiteles. Ta reakcija temelji na edinstvena lastnina zlati stafilokok, ki vsebuje protein A v svoji celični steni, se veže na Fc fragmente IgG in IgM. V tem primeru aktivni centri protiteles ostanejo prosti in lahko komunicirajo s specifičnimi determinantami antigenov. Na predmetno stekelce nanesemo kapljico 2% suspenzije stafilokokov, senzibiliziranih z ustreznimi protitelesi, in dodamo kapljico suspenzije proučevane bakterije. Če se antigen ujema s protitelesi, pride do jasne aglutinacije stafilokokov, obremenjenih s protitelesi, v 30-60 s.
Reakcija aglutinacije lateksa (LAR). Nosilec protiteles v tem diagnostičnem sistemu so majhni standardni delci lateksa. Reakcijo izvajamo z mikrometodo v jamicah na steklu. Glavni pogoj za uspešno določanje stopnje PAH je strogo upoštevanje kvantitativnih razmerij komponent sistema: 10 μl pripravka iz lateksa, senzibiliziranega s protitelesi, dodamo 50 μl testnega materiala. Specifičnost PAH je nadzorovana s tremi kontrolnimi testi, ki jih vsebujejo komercialni testni sistemi: znana pozitivna reakcija, znana negativna reakcija in kontrola kakovosti suspenzij lateksa z uporabo lateksov, neobčutljivih na PAH (ki ne prenašajo protiteles) s testnim materialom. Pri nas se kot nosilci specifičnih protiteles uporabljajo polistirenski monodisperzni lateksi z različnimi premeri delcev (0,3; 0,66; 0,75; 0,8 μm). LAG se uporablja za hitro detekcijo mikroorganizmov ali njihovih antigenov v testnem materialu.
Imunomagnetna detekcija antigenov. Ena od možnosti pospešene reakcije aglutinacije na steklu je povezana z uporabo supermagnetnih polimernih delcev, prevlečenih s specifičnimi protitelesi. En tak delec veže do 107-108 celic mikroorganizmov, zaradi česar občutljivost ta metoda doseže 5 CFU/ml. Imunomagnetna detekcija mikroorganizmov se lahko uporablja v kombinaciji s CPR.
Reakcija agregatne hemaglutinacije (AHA). Omogoča hitro odkrivanje v krvi bolnikov tako prosto krožečih antigenov (antigenemija) kot antigenov, povezanih s protitelesi - krožečimi imunskimi kompleksi (CIC). Za RAHA se uporabljajo rdeče krvničke, senzibilizirane z ustreznimi protitelesi. Dodajanje bolnikovega krvnega seruma, ki vsebuje antigene, na senzibilizirane eritrocite, na katere so fiksirana protitelesa, vodi do lepljenja (aglutinacije) eritrocitov in imunskih kompleksov.
Antiglobulinski Coombsov test (R. Coombsova reakcija). Polna (dvovalentna) protitelesa se določijo z direktno in pasivno aglutinacijsko reakcijo. Nepopolnih (monovalentnih, blokirajočih) protiteles s temi metodami ne zaznamo, saj ko se združijo z antigenom, ga blokirajo, ne morejo pa povzročiti agregacije antigena v velike konglomerate. Nepopolna (blokirna) protitelesa so tista, pri katerih deluje samo en aktivni center; drugi aktivni center ne deluje iz neznanega razloga. Za odkrivanje nepopolnih protiteles se uporablja posebna Coombsova reakcija (slika 72). V reakcijo so vključeni: bolnikov serum, v katerem so določena nepopolna protitelesa, korpuskularni antigen-diagnostikum, antiglobulinski serum, ki vsebuje protitelesa proti humanemu globulinu. Reakcija poteka v dveh fazah:
Interakcija antigena z nepopolnimi protitelesi. Ni vidnih manifestacij. Prva stopnja se zaključi z izpiranjem antigena iz preostalega seruma bolnika.
Interakcija antiglobulinskega seruma, pridobljenega kot rezultat imunizacije živali s humanim globulinom z nepopolnimi protitelesi, adsorbiranimi na antigen. Ker so antiglobulinska protitelesa bivalentna, vežejo dve monovalentni protitelesi ločenih kompleksov AG + nepopolno protitelo, kar vodi do njihovega lepljenja in pojava vidne usedline.
Kazalo teme "Imunomodulatorji. Imunodiagnostika nalezljivih bolezni.":Podrobna reakcija aglutinacije (RA). Za določitev AT v bolnikovem krvnem serumu, a obsežna reakcija aglutinacije (RA). Da bi to naredili, se nizu razredčin krvnega seruma doda diagnostik - suspenzija ubitih mikroorganizmov ali delcev s sorbiranim Ag. Največja razredčitev aglutinacija Ag se imenuje serumski titer.
Vrste aglutinacijske reakcije (RA) za odkrivanje AT - kapljični test krvi za tularemijo (z nanosom diagnostikuma na kapljico krvi in pojavom vidnih belkastih aglutinatov) in Huddlesonov test za brucelozo (z nanosom diagnostikuma, obarvanega z encijanovo vijolico na kapljico krvi). serum).
Približna reakcija aglutinacije (RA)
Za identifikacijo izoliranih mikroorganizmov se na stekelca namesti približen RA. Da bi to naredili, se kulturi patogena doda kapljica standardnega diagnostičnega antiseruma (razredčenega 1:10, 1:20). Če je rezultat pozitiven, se izvede podrobna reakcija z naraščajočimi razredčinami antiseruma.
Reakcijašteje za pozitivno, če opazimo aglutinacijo v razredčinah, ki so blizu titru diagnostičnega seruma.
OAS. Somatski O-Ags so toplotno stabilni in lahko prenesejo vrenje 2 uri.Pri interakciji z AT tvorijo drobnozrnate agregate.
N-Ag. N-Ag (flagelati) so termolabilni in hitro razpadejo pri 100 °C, pa tudi pod vplivom etanola. Pri reakcijah s H-antiserumom po 2 urah inkubacije nastanejo ohlapni veliki kosmiči (ki jih tvorijo bakterije, ki se zlepijo z bički).
Vi-Ar tifusna bakterija je relativno toplotno stabilna (zdrži temperature 60-62 °C 2 uri); Pri inkubaciji z antiserumom Vi nastane drobnozrnat aglutinat.
Reakcije neposredne hemaglutinacije
Najenostavnejši od teh reakcije - aglutinacija rdečih krvničk ali hemaglutinacija, ki se uporablja za določanje krvnih skupin v sistemu ABO. Za določitev aglutinacija(ali pomanjkanje le-teh) uporabite standardne antiserume z aglutinini anti-A in anti-B. Reakcijo imenujemo neposredna, saj so Ag, ki se preučujejo, naravne sestavine rdečih krvnih celic.
Skupno z neposredna hemaglutinacija virusna hemaglutinacija ima mehanizme. Številni virusi so sposobni spontano aglutinirati eritrocite ptic in sesalcev, njihov dodatek v suspenzijo eritrocitov povzroči nastanek agregatov iz njih.
