imunske reakcije. Uporaba imunskih odzivov v diagnostiki nalezljive bolezni.
NAČRT:
Vrste imunskih reakcij.
Pogoji za izvedbo seroloških reakcij.
Zahteve za serum.
Koncept pozitivnih in negativnih rezultatov.
GLAVNA VSEBINA:
Vrste imunskih reakcij.
Imunološka reakcija – to je interakcija antigena s protitelesom, ki je določena s specifično interakcijo aktivnih centrov protitelesa (paratopa) z antigenskimi epitopi.
Splošna klasifikacija imunoloških reakcij:
serološke reakcije – reakcije med antigeni (Ag) in protitelesi (Ig)
in vitro ;
celične reakcije s sodelovanjem imunokompetentnih celic;
alergijski testi - odkrivanje preobčutljivosti.
Serološke reakcije: 1) definicija, 2) faze, 3) postavljanje ciljev, 4) splošna klasifikacija.
1) Opredelitev
Serološke metode raziskave (iz lat. Serum - serum in logos - poučevanje) z uporabo reakcije antigen-protitelo.
2) Faze
2 fazi interakcije:
JAZ. Specifično (vidno) - pride hitro, protitelesa se povežejo s svojimi ustreznimi antigeni. V tej fazi medsebojno delujejo determinantne skupine antigenov (AG) in aktivni centri protiteles (AT).
Sile, ki sodelujejo pri tvorbi kompleksa AG + AT, so:
Coulomb;
Van der Waals
Vodikove vezi.
V tej fazi ni vidnih sprememb. Pod elektronsko mikroskopijo kompleks AG + AT v obliki mreže.
II. Nespecifično - prihaja počasi, nastali kompleks antigen-protitelo reagira z dodatnim nespecifičnim dejavnikom okolja, v katerem se reakcija pojavi, kar je vidno očesu - lepljenje, raztapljanje, izločanje kosmičev itd. elektrolita, naboj se zmanjša, topnost se zmanjša, vidni konglomerati nastanejo oborijo (aglutinirajo).
3) Postavljanje ciljev :
a) za identifikacijo antigena (znan diagnostični serum protiteles):
serološka identifikacija (identifikacija vrste);
serotipizacija (določitev serovarja) - določitev seva;
v patološkem materialu (ekspresna diagnostika);
v čisti kulturi:
b) za odkrivanje protiteles (Ig) (antigen znan-diagnosticum):
prisotnost (kvalitativne reakcije);
količina (povečanje titra - metoda "parnih serumov").
4) Splošna razvrstitev serološke reakcije :
a) preprost (2-komponentni: Ag + Ig):
RA aglutinacijske reakcije (s korpuskularnim antigenom);
reakcije obarjanja RP (s topnim antigenom);
b) kompleksna (3-komponentna: Ag + Ig + C);
c) z uporabo oznake.
Različice reakcije aglutinacije in precipitacije
Reakcija aglutinacije :
Aglutinacijska reakcija (RA) - imunski odziv interakcija suspenzije AG (eritrocitov, bakterij) z AT v fiziološka raztopina.
Med aglutinacijo se delci AT zlepijo in nastane kosmičasta oborina.
Reakcija pasivna hemaglutinacija(RPHA) je vrsta aglutinacijske reakcije, pri kateri se uporablja protitelo ali antigenski eritrocitni diagnostik (eritrociti z adsorbiranim AT ali AG na njihovi površini).
Eritrociti v tej reakciji delujejo kot pasivni nosilci.
Vrednotenje rezultatov RPGA poteka na naslednji način:
- pri pozitivna reakcija pasivno zlepljeni eritrociti pokrivajo dno luknje v obliki črke U ali V z enakomerno plastjo z nazobčanimi robovi ("dežnik");
- pri povratni udarec (pomanjkanje aglutinacije) se eritrociti kopičijo v osrednji vdolbini luknje in tvorijo kompakten "gumb" z ostro definiranimi robovi.
Pri diagnozi se uporablja test inhibicije hemaglutinacije (RTGA). virusne okužbe. Nekateri virusi vsebujejo na svoji površini beljakovino hemaglutinin, ki zlepi rdeče krvničke. Dodatek specifičnih protivirusnih protiteles blokira virusni hemaglutinin – hemaglutinacije ni.
Za določanje nepopolnih protiteles se uporablja reakcija indirektne hemaglutinacije (RIHA) ali Coombsova reakcija. Dodatek antiglobulinskega seruma (AT proti humanemu Ig) okrepi rezultate reakcije. RNGA se uporablja za določanje Rh faktorja.
Za vzpostavitev reakcije aglutinacije (RA) so potrebne tri komponente:
1) antigen (aglutinogen) AG;
2) protitelesa(aglutinin) AT;
3)
elektrolit
(izotonična raztopina natrijevega klorida).
Ag + AT + elektrolit = aglutinat
Aglutinacija (iz latinščine agglutinatio - lepljenje) - lepljenje telesc (bakterij, eritrocitov itd.) S protitelesi v prisotnosti elektrolitov - natrijevega klorida.
RA se kaže v obliki kosmičev ali usedlin, sestavljenih iz teles (na primer bakterij, eritrocitov), ki jih "zlepijo" protitelesa.
RA se uporablja za:
Reakcija neposredne aglutinacije mikrobov (RA).
Pri tej reakciji protitelesa (aglutinini) neposredno aglutinirajo korpuskularne antigene (aglutinogene).
Običajno so predstavljeni s suspenzijo inaktiviranih mikroorganizmov (mikrobna reakcija aglutinacije).
Uporablja se za določitev vrste mikroorganizmastandardna diagnostična aglutinacija serum ( znan AT ).
Najpogostejši sta lamelarni (indikativni) in razporejeni RA.
Lamelni RA se namesti na steklo. Uporablja se kot pospešena metoda za odkrivanje protiteles ali identifikacijo mikroorganizmov.
Sestavine:
1. standardni diagnostični aglutinacijski serumi (AT);
2. testirati čisto kulturo pacienta;
3. fiziološka raztopina.
V proučevani čisti kulturi so antigeni (AG) v obliki delcev (mikrobne celice, eritrociti in drugi korpuskularni antigeni), ki jih protitelesa zlepijo in se oborijo.
primer:
uprizoritev okvirno aglutinacijske reakcije (RA ) na steklu za identifikacijo bakterij črevesne skupine.
Kapljice nanesemo na predmetno stekelce:
1
dizenterija
;
2
-ta kapljica: - aglutinacijski serum na patogenetifus
;
(1-2 diagnostična seruma)
3
-ta kapljica: - fiziološka raztopina (kontrola).
Vsaki kapljici dodamo testirano čisto bakterijsko kulturo. Mešajte.
Rezultat
:
pozitivno
- prisotnost aglutinatnih kosmičev,
negativno
- brez aglutiniranih kosmičev
Zaključek:Proučevane bakterije so povzročitelji trebušnega tifusa (določeni so bili antigeni).
Za določitev protiteles v bolnikovem serumu (serološka diagnoza) standardna mikrobnadiagnosticum ki vsebuje suspenzijoslavni mikrobov ali njihovih antigenovAG .
Določanje krvnih skupin po sistemu ABO (reakcija hemaglutinacije (RHA)) – aglutinirajo eritrocite.
Reakcijske komponente:
1. AG (rdeče krvne celice) test krvi
2. AT (eritrotesti - tsolikloni)
Zoliclone set:
Reagent Tsoliklon anti-A (roza)
Reagent Tsoliklon anti-B (moder)
Zoliklon anti-AB reagent (brezbarven)
3. elektrolit (fiziološka raztopina)
Tehnika definicije:
1
.
Ena kapljica (0,1 ml) anti-A, anti-B in anti-AB tsoliklona (za kontrolo) se nanese v vdolbinice tablete.
2.
Poleg vsake kapljice reagenta se nanese majhna (0,05-0,01 ml) kapljica testirane krvi.
Nato kapljico tsoliklona zmešamo s kapljico krvi s posamezno čisto stekleno paličico.
3.
Reakcija aglutinacije se razvije v prvih 3-5 sekundah, ko ploščo rahlo zazibamo.
Rezultati reakcije se upoštevajo 2,5 - 3 minute po mešanju kapljic. Od leve proti desni v vdolbinicah anti-A, anti-B, anti-AB.
Pozitiven rezultat je pojav zrnate oborine (aglutinata).
pozitiven RA (+)
Negativno - brez usedline.
negativni RA(-)
4.
Analiza rezultatov.
O(jaz) α β – ni aglutinacije
A(II) β – aglutinacija z anti-A
B(III) α – aglutinacija z anti-B
AB(IV)O - aglutinacija z anti-A, z anti-B
Shematski prikaz aglutinacije.
AH antigeni na eritrocitih (ugotovljeni) + protitelesaAT(tsoliklon) diagnostični serum
Upoštevanje aglutinacije v ploščah
Reakcija padavin:
Precipitacijska reakcija je imunska reakcija interakcije AG v topnem stanju z AT v fiziološki raztopini.
Med obarjanjem pride do tvorbe makromolekularnega imunskega kompleksa, ki se kaže s prehodom prozorne koloidne raztopine v neprozorno suspenzijo ali oborino.
Količina obeh reagentov mora biti v strogo določenih razmerjih, saj presežek enega od njiju zmanjša rezultat.
obstajati različne načine nastavitev padavinske reakcije.
1. Reakcijo obarjanja obroča damo v obarjalne cevi z majhnim premerom. V epruveto dodamo imunski serum in topni antigen previdno nanesemo po plasteh. AG in AT se mešata zaradi toplotnega gibanja molekul in medsebojno delujeta. pri pozitiven rezultat na meji obeh raztopin nastane obroč neprozorne oborine.
2. Reakcijo dvojne imunodifuzije po Ouchterlonyju izvedemo v agarjevem gelu, v vdolbinice katerega dodamo raztopino AG ali raztopino AT po shemi. AG in AT difundirata v gel drug proti drugemu in, če je reakcija pozitivna, tvorita imunske komplekse, vidne kot precipitacijske črte.
Reakcija padavine -ta formacijain obarjanje kompleksa topnega molekularnega antigena s protitelesi v obliki motnosti, imenovane oborina. Nastane z mešanjem antigenov in protiteles v enakih količinah.
Komponente RA:
obarjajoči serum (znan kot AT-precipitin);
testni serum (neznan AG-precipitinogen);
fizično rešitev.
Obarjalno reakcijo postavimo v ali v posebne ozke epruvete (obarjalna reakcija obroča) ali v petrijevke v gelih, hranilnih gojiščih itd.
Obročna precipitacijska reakcija
Izjava in obračun rezultatov reakcijeobročaste padavineza odkrivanje patogena antraks(Ascolijeva reakcija).
uprizoritev .
1. Testni material (usnje, volna, klobučevina, ščetine, blago, meso, zemlja, živalski iztrebki itd.) kuhamo v fiziološki raztopini 5-45 minut. da dobimo izotonični ekstrakt (ekstrakt). Filter.
2. V epruveto nalijte oborjeni serum proti antraksu.
3. Nanj previdno položite testni material (izvleček).
Računovodstvo .
V naslednjih 10 min. na meji med serumom in izvlečkom se v pozitivnih primerih pojavi motni obroč (precipitacija obroča). Ascolijeva reakcija je zelo občutljiva in specifična
Z njegovo pomočjo je mogoče hitro prepoznati materiale, okužene z antraksom.
Reakcija obarjanja v agarju
Izkaz in obračun rezultatovreakcije obarjanja agarjaza ugotavljanje toksigenosti korinebakterij (povzročiteljev davice)
uprizoritev
Postavljen na fosfat-peptonski agar v petrijevko.
1. Trak sterilnega filtrirnega papirja, navlaženega zantitoksični serum.
2. Po sušenju se na razdalji 1 cm od roba traku posejejo plošče s premerom 10 mmizolirani pridelki.
V eno skodelico lahko posejete od 3 do 10 poljščin, od katerih je ena,nadzor, je treba poznatitoksigeni.
Posevki so postavljeni v termostat.
Računovodstvo
Analiza se izvede po 24-48-72 urah.
Pozitiven rezultat - (kulturatoksigeni) - na določeni razdalji od traku papirja nastanejooborinske črte, « vitice puščice”, ki so jasno vidne v presvetljeni svetlobi.
Slika prikazuje reakcijo precipitacije v agarju za določanje toksigenosti bacila davice. Srednje kulture niso tvorile "puščice-antene", to niso toksikogeni patogeni.
Sevi povzročitelja davice so lahko toksigeni (proizvajajo eksotoksin) in netoksigeni. Tvorba eksotoksina je odvisna od prisotnosti v bakterijah profaga, ki nosi gen tox, ki kodira tvorbo eksotoksina.
V primeru bolezni vse povzročitelje davice testiramo na toksigenost - proizvodnjo eksotoksina davice z reakcijo obarjanja v agarju.
Kompleksne serološke reakcije ( 3-komponentni: Ag + Ig + C):
Reakcija fiksacije komplementa (RSC).
Reakcija poteka v dveh stopnjah.
Na prvi stopnji protitelesa interagirajo z AG in komplementom, na drugi stopnji se doda indikator - hemolitični sistem (mešanica eritrocitov in antieritrocitnega seruma).
S pozitivnim rezultatom na prvi stopnji AT tvori imunski kompleks z AG, ki veže komplement reakcijske mešanice.
V tem primeru se eritrociti hemolitičnega sistema, dodani v drugi fazi, ne uničijo.
V nasprotnem primeru nevezani komplement povzroči lizo indikatorskih rdečih krvničk.
Potrebuje pet sestavin: AG, AT in komplement (prvi sistem), ovnove eritrocite in hemolitični serum (drugi sistem) (slika 1).
Reakcija poteka v dveh fazah (slika 3).
Prva faza - interakcija antigena in protiteles z obvezno udeležbo komplementa.
drugič - ugotavljanje rezultatov reakcije z indikatorskim hemolitičnim sistemom (ovčji eritrociti in hemolitični serum). Uničenje eritrocitov s hemolitičnim serumom se pojavi le v primeru vezave komplementa na hemolitični sistem. Če je bil komplement prej adsorbiran na kompleksu antigen-protitelo, potem ne pride do hemolize eritrocitov (slika).
Rezultat izkušenj
ocenite (slika 2), pri čemer upoštevajte prisotnost ali odsotnost hemolize v vseh epruvetah. Reakcija se šteje za pozitivno s popolno zamudo hemolize, ko je tekočina v epruveti brezbarvna in se eritrociti usedejo na dno, negativno - s popolno lizo eritrocitov, ko je tekočina intenzivno obarvana ("lak" kri) .
Stopnjo zakasnitve hemolize ocenimo glede na intenzivnost barve tekočine in količino sedimenta eritrocitov na dnu (++++, +++, ++, +).
riž. 4. Izjava in rezultat RSC.
Zaključek:V preiskovanem serumu so odkrili protitelesa.
RSK vam omogoča odkrivanje protiteles proti kateremu koli sevu istega serotipa virusa.
Diagnostična vrednost je:
štirikratno povečanje titra protiteles v parnih serumih (med epidemijo gripe);
dvakratno povečanje krvnega seruma bolnikov z značilno klinično sliko.
Reakcije etikete :
Te metode so zelo občutljive. Kot oznake za antigene ali protitelesa se uporabljajo barvila, radioaktivni izotopi, encimi itd.
RIF - imunofluorescenčna reakcija
Imunofluorescenčna reakcija temelji na svetlobni indikaciji kompleksa antigen-protitelo
Povezani imunosorbentni test.
Sodobna laboratorijske raziskave, med katerim se iščejo specifična protitelesa v krvi ali antigeni za določene bolezni, da se ugotovi ne le etiologija, ampak tudi stadij bolezni.
Rezultati ELISA se lahko izdajo kvalitativno in kvantitativno.
Trenutno se ELISA uporablja v naslednjih primerih:
1) iskanje specifičnih protiteles proti kateri koli nalezljivi bolezni;
2) iskanje antigenov katere koli bolezni (nalezljive, spolne bolezni);
3) študija hormonskega statusa bolnika;
4) pregled tumorskih markerjev;
5) pregled za prisotnost avtoimunskih bolezni.
Na sliki trdnofazni ELISA - znani antigeni (levo) so adsorbirani na vdolbino plošče, (desno) na vdolbinice plošče so znana protitelesa
Prednosti metode ELISA:
1) Visoka specifičnost in občutljivost metode ELISA (več kot 90%).
2) Sposobnost določanja bolezni in sledenja dinamiki procesa, to je primerjave količine protiteles v različnih časovnih intervalih.
3) Razpoložljivost diagnostike ELISA v kateri koli zdravstveni ustanovi.
Relativna pomanjkljivost: odkrivanje imunskega odziva (protiteles), ne pa tudi samega patogena, konjugiranega z encimsko oznako.
Nastavitev ELISA (splošen mehanizem):
Osnova encimsko vezanega imunskega testa je imunska reakcija antigena in protitelesa s tvorbo imunskega kompleksa: antigen-protitelo, zaradi česar pride do spremembe encimsko aktivnost specifične oznake na površini protiteles.
Reakcijske komponente:
1. AG(AT) znan - na vdolbinici tablice.
2. AT (AG) preiskano.
3. AT z encimom, specifičnim za kompleks AT(AG)-AG(AT).
4.kromogeni substrat v interakciji z encimom
5. stop rešitev
Glavne faze ELISA
1. Na površini vdolbinic tablete je očiščen antigen specifičnega patogena. Dodani so biološki material bolniku pride do specifične reakcije med tem antigenom in želenim protitelesom (imunoglobulinom). Nastane kompleks.
2. Doda se konjugat - AT z encimom. Konjugant je specifičen za kompleks AT-AG prve stopnje. Encim se aktivira.
3. Doda se substrat in aktivni encim sodeluje z njim ter spremeni brezbarvno barvo raztopine.
4. Doda se raztopina za zaustavitev interakcije encim-substrat.
Računovodstvo.
Pozitiven rezultat je sprememba barve, na sliki - rumena.
Imunokromatografska analiza
Metoda imunokromatografske analize (ICA, hitri testi) je kvalitativna presejalna preliminarna metoda, ki vam omogoča hitro, v nekaj minutah, analizo v vseh pogojih, vklj. "polje".
Prednosti ICA vključujejo:
Hitrost in enostavnost uporabe;
Majhne količine vzorcev, brez priprave vzorcev;
Poceni za proizvajalca in potrošnika;
Sposobnost izdelave testov v velikih količinah;
enostavnost branja in interpretacije rezultata;
Visoka občutljivost in ponovljivost;
Možnost kvantitativnega določanja;
Sposobnost uporabe prenosnih čitalnikov, združljivih z računalnikom;
Možnost multianalize.
Komponente (nanesene na testni listič):
1. Konjugat označen s koloidnim zlatom – specifično za določeno AG.
2. AT testne linije - specifično za kompleks AT-AG
3. Trebušnjaki kontrolne linije so specifični za konjugat.
Nastavitev IHA:
1. Nanos vzorca na določeno začetno območje traku.
2. Pridobitev rezultata v obliki videza barvnih trakov namesto testnih in kontrolnih črt.
Računovodstvo
Pozitivno - pri barvanju testne linije.
Negativno - v odsotnosti obarvanja testne linije.
Neveljavno - v odsotnosti obarvanja kontrolne črte.
Splošni mehanizem IHA:
1. Vzorec se položi na začetno polje (vzorčna blazinica) in se veže na konjugat (specifično telo z barvno oznako), ki se nahaja na konjugatni blazinici. Posledično nastane barvni kompleks.
2. Nastali obarvani imunski kompleks se premika pod delovanjem kapilarnih sil vzdolž nitrocelulozne membrane in sodelujes testno linijo AT.Rezultat je enobarvna roza-rdeča črta.
3. Trebušnjaki niso vezani na testni trak (konjugat)premakne naprej in doseže kontrolno linijo, se veže na AT kontrolne črte.Posledično se pojavi drugi barvni pas.Če je analiza pravilno opravljena, se mora vedno pojaviti kontrolna črta, ne glede na prisotnost preiskovanega antigena (protitelesa) v vzorcu biološke tekočine.
2. Pogoji za izvedbo seroloških reakcij.
1. Prisotnost homolognega - medsebojno ustreznega antigena in protitelesa.
2. Čista, suha posoda.
3. Določeno razmerje zdravil (najpogosteje enako).
4. Obvezna prisotnost elektrolita (izotonična raztopina NaCl).
5. pH nevtralen ali blizu rahlo alkalnemu.
6. Temperatura + 37 ° C ali sobna temperatura (nujno pozitivna).
7. Izvede se kontrola antigena in kontrola seruma (protiteles).
3 Zahteve za serum
Serum mora biti popolnoma bister brez primesi celic.
Običajno dobimo v 2. tednu bolezni, ko so protitelesa že prisotna.
Krv se odvzame v količini 3-5 ml na prazen želodec ali 6 ur po obroku.
Za pridobitev seruma kri pustimo 1 uro pri sobni temperaturi ali centrifugiramo. Serum se izsesa zelo previdno, da ne zajame oblikovanih elementov.
Imunski serumi so pridobljeni iz krvi ljudi ali živali (običajno kuncev in konjev), imuniziranih po določeni shemi z ustreznim antigenom (cepivo). Sirotko običajno pripravimo v proizvodnji.
4. Koncept pozitivnih in negativnih rezultatov.
RA.
S pozitivno reakcijo pasivno zlepljeni eritrociti prekrijejo dno jamice z enakomerno plastjo z nazobčanimi robovi ("dežnik"); v odsotnosti aglutinacije se eritrociti kopičijo v osrednji vdolbini jamice in tvorijo kompakten "gumb" z ostro definiranimi robovi (glej slike zgoraj).
RP.
Pri pozitivnem rezultatu se na meji obeh raztopin oblikuje mlečni obroč (glej zgornje slike).
ELISA.
Ob pozitivni reakciji pride do spremembe barve raztopine.
RSK.
Zakasnitev hemolize - reakcija je pozitivna; če je komplement prost opazimo hemolizo – reakcija je negativna(glej slike zgoraj).
Rezultati Wassermanove reakcije:
a - popolna zamuda hemolize (+ + ++);
b - izrazita zamuda pri hemolizi (+ ++);
c - delna zamuda hemolize (++);
d - šibka zamuda hemolize (+);
e - popolna hemoliza (-).
Reakcija je pozitivna z delno, izrazito in popolno zamudo pri hemolizi, določeno s stopnjo obarvanja vsebine epruvet od svetlo rožnate do svetlo rdeče, nehemolizirani eritrociti nato tvorijo rdečo oborino.
Domača naloga:
1. Preučite gradivo
Naredite 3 opombe na videu
Št. 29 Reakcija aglutinacije. Sestavni deli, mehanizem, načini nastavitve. Aplikacija.
Reakcija aglutinacije- enostavna reakcija, pri kateri protitelesa vežejo korpuskularne antigene (bakterije, eritrocite ali druge celice, netopne delce z adsorbiranimi antigeni, pa tudi makromolekularne agregate). Pojavi se v prisotnosti elektrolitov, na primer, ko dodamo izotonično raztopino natrijevega klorida.
Uporabljajo se različne različice reakcije aglutinacije: razširjena, približna, posredna itd. Reakcija aglutinacije se kaže v tvorbi kosmičev ali usedlin (celice, "zlepljene" s protitelesi, ki imajo dva ali več centrov za vezavo antigena - sl. 13.1) . RA se uporablja za:
1) odkrivanje protiteles v krvnem serumu bolnikov, na primer z brucelozo (reakcije Wright, Heddelson), tifus in paratifus (Vidalova reakcija) in druge nalezljive bolezni;
2) opredelitev patogena izoliran od bolnika;
3) določanje krvnih skupin z uporabo monoklonskih protiteles proti aloantigenom eritrocitov.
Za določitev bolnikovih protiteles navedite podrobno reakcijo aglutinacije: razredčitvam bolnikovega krvnega seruma dodamo diagnostikum (suspenzijo ubitih mikrobov) in po nekaj urah inkubacije pri 37 °C opazimo najvišjo razredčino seruma (serumski titer), pri kateri je prišlo do aglutinacije, tj. nastala oborina.
Narava in hitrost aglutinacije sta odvisni od vrste antigena in protiteles. Primer so značilnosti interakcije diagnostičnih (O- in H-antigenov) s specifičnimi protitelesi. Aglutinacijska reakcija z O-diagnosticumom (bakterije, ubite s segrevanjem, ohranijo termostabilen O-antigen) poteka v obliki drobnozrnate aglutinacije. Aglutinacijska reakcija s H-diagnosticumom (bakterije, ki jih ubije formalin, obdrži toplotno labilen flagelarni H-antigen) je grobozrnata in poteka hitreje. Če je treba določiti patogen, izoliran od pacienta, postavite orientacijska reakcija aglutinacije, z uporabo diagnostičnih protiteles (aglutinacijski serum), tj. Izvede se serotipizacija patogena. Približno reakcijo izvedemo na stekelcu. Kapljici diagnostičnega aglutinacijskega seruma v razredčini 1:10 ali 1:20 dodamo čisto kulturo povzročitelja, izoliranega od bolnika. V bližini je postavljena kontrola: namesto seruma se nanese kapljica raztopine natrijevega klorida. Ko se v kapljici s serumom in mikrobi pojavi kosmičasta usedlina, izvedemo podrobno reakcijo aglutinacije v epruvetah z naraščajočimi razredčinami aglutinacijskega seruma, ki mu dodamo 2-3 kapljice suspenzije povzročitelja. Aglutinacija se upošteva glede na količino usedline in stopnjo zbistrenosti tekočine. Reakcija se šteje za pozitivno, če opazimo aglutinacijo v razredčitvi blizu titra diagnostičnega seruma. Hkrati se upoštevajo kontrole: serum, razredčen z izotonično raztopino natrijevega klorida, mora biti prozoren, suspenzija mikrobov v isti raztopini mora biti enakomerno motna, brez usedline.
Različne sorodne bakterije lahko aglutiniramo z istim diagnostičnim aglutinacijskim serumom, ki
jih je težko prepoznati. Zato se uporabljajo adsorbirani aglutinacijski serumi, iz katerih
navzkrižno reagirajoča protitelesa z adsorpcijo na njim sorodne bakterije. Ti serumi vsebujejo protitelesa
specifične za to bakterijo.
Aglutinacija se imenuje aglutinacija bakterij kot posledica interakcije z njimi specifičnih AT. RA zahteva tri komponente: 1) AG (aglutinogen); 2) AT (aglutinin); 3) raztopina elektrolitov (izotonična raztopina natrijevega klorida). V reakciji aglutinacije sodelujejo samo korpuskularni antigeni (bakterije, eritrociti, z antigenom obremenjeni delci lateksa).
Reakcija aglutinacije na steklu. Na nemastno predmetno stekelce s pipeto nanesemo kapljico diagnostičnega seruma (razredčitev seruma 1:10 - 1:20). S površine poševnega agarja z bakteriološko zanko vzamemo čisto kulturo proučevanega mikroorganizma, prenesemo v kapljico seruma in premešamo. Rezultat reakcije se upošteva s prostim očesom po 3-5 minutah. Pri pozitivni reakciji v kapljici seruma opazimo pojav kosmičev (velikih ali majhnih), ki so jasno vidni na temnem ozadju, ko stekelno stekelce stresemo. V primeru negativne reakcije ostane tekočina enakomerno motna.
Reakcija aglutinacije v epruvetah. V več epruvet dodajte 1 ml fiziološke raztopine. V prvo epruveto dodajte enako količino testiranega krvnega seruma. Pripravimo zaporedne dvakratne razredčitve seruma (serumska titracija), nato pa v vsako epruveto dodamo 2 kapljici suspenzije inaktiviranih bakterij (diagnostikum). Epruvete postavimo za 2 uri v termostat pri 37 °C. Reakcija poteka s tvorbo majhnih kosmičev, nevidnih s prostim očesom, zato se rezultati zabeležijo pod rahlim povečanjem v posebni napravi - aglutinoskopu. Intenzivnost aglutinacije se upošteva po sistemu "štiri pluse": popolna aglutinacija - 4+, delna aglutinacija - 3+ ali 2+, dvomljiv rezultat - +. Zadnja razredčitev, pri kateri opazimo aglutinacijo pri 2+, se vzame kot titer protiteles v testnem serumu.
Reakcija aglutinacije v epruvetah (razširjena reakcija aglutinacije) se izvaja za določitev titra protiteles proti povzročiteljem tifusa in paratifusa (Vidalova reakcija), bruceloze (Wrightova reakcija), tifusa (Weiglova reakcija).
Aglutinacija (iz latinščine agglutinatio - vezava) - vezava (povezava) korpuskularnih delcev, ki vsebujejo antigen (celih celic, delcev lateksa itd.), S specifičnimi molekulami protiteles v prisotnosti elektrolitov, ki se konča s tvorbo kosmičev ali usedline (aglutinata). ) vidna s prostim očesom. Narava usedline je odvisna od narave antigena: bičkove bakterije dajejo usedlino velikih kosmičev, flagelarne in brez kapsule - drobnozrnate, kapsularne - nitaste. Razlikovati neposredno aglutinacijo, pri kateri interakcija s specifičnimi protitelesi neposredno vključuje lastne antigene bakterijske ali katere koli druge celice, na primer eritrocitov; in posredno ali pasivno, pri kateri bakterijske celice ali eritrociti ali delci lateksa niso nosilci lastnih, ampak tujih antigenov (ali protiteles), adsorbiranih na njih, da zaznajo protitelesa (ali antigene), ki so specifična zanje. Aglutinacijska reakcija vključuje predvsem protitelesa iz razredov IgG in IgM. Poteka v dveh fazah: najprej pride do specifične interakcije aktivnega središča protiteles z determinanto antigena, ta stopnja se lahko pojavi v odsotnosti elektrolitov in je ne spremljajo vidne spremembe v reakcijskem sistemu. Za drugo stopnjo - nastanek aglutinata - je potrebna prisotnost elektrolitov, ki reducirajo električni naboj kompleksov antigen + protitelo in pospešijo proces njihovega vezanja. Ta faza se konča s tvorbo aglutinata.
Aglutinacijske reakcije postavimo na steklene ali gladke kartonske plošče ali v sterilne aglutinacijske epruvete. Običajno se uporabljajo reakcije aglutinacije (neposredne in pasivne) na steklu pospešeno metodo odkrivanje specifičnih protiteles v bolnikovem serumu (na primer z brucelozo) ali za serološko identifikacijo patogena. V slednjem primeru se običajno uporabljajo dobro prečiščeni (adsorbirani) diagnostični serumi, ki vsebujejo samo monoreceptorska protitelesa ali njihov nabor za različne antigene. Nedvomna prednost reakcije aglutinacije na steklu je preprostost njene formulacije in dejstvo, da traja nekaj minut ali celo sekund, saj se obe komponenti v njej uporabljata v koncentrirani obliki. Vendar ima le kvalitativno vrednost in je manj občutljiv kot epruveta. Razširjeni test aglutinacije v epruvetah daje natančnejše rezultate, saj vam omogoča, da določite kvantitativno vsebnost protiteles v serumu (nastavite njegov titer) in po potrebi registrirate dejstvo povečanja titra protiteles, kar je diagnostično. vrednost. Za postavitev reakcije v aglutinacijske epruvete dodajte na določen način razredčeno z 0,85% raztopina NaCl seruma in enako količino (običajno 0,5 ml) suspenzije standardnega diagnostikuma (ali testne kulture), ki vsebuje 1 milijardo bakterij v 1 ml. Upoštevanje rezultatov reakcije aglutinacije se izvede predhodno po 2 urah inkubacije epruvet pri 37 ° C in končno po 20-24 urah v skladu z dvema meriloma: prisotnostjo in velikostjo oborine ter stopnjo preglednosti epruvete. supernatant. Ocenjevanje poteka po sistemu štirih križcev. Reakcijo nujno spremlja kontrola seruma in antigena. V primerih, ko se za serološko identifikacijo povzročitelja uporablja natančen aglutinacijski test v epruveti, ima diagnostično vrednost, če je reakcija ocenjena kot pozitivna, ko je diagnostični serum razredčen z vsaj polovico svojega titra.
Upoštevati je treba, da pri mešanju raztopin homolognih antigenov in protiteles ni vedno opaziti vidnih manifestacij aglutinacijske reakcije. Oborina nastane le pri določenih optimalnih razmerjih obeh reakcijskih komponent. Izven teh meja, z znatnim presežkom antigena ali protiteles, reakcije ni opaziti. Ta pojav se imenuje "prozonski fenomen". Opazimo ga tako pri reakciji aglutinacije kot pri reakciji obarjanja. Pojav prozona v imunskih reakcijah je razložen z dejstvom, da so v njih vključeni antigeni praviloma polideterminantni in molekule protitelesa IgG imajo dva aktivna centra. Pri presežku protiteles se površina vsakega delca antigena prekrije z molekulami protiteles, tako da ne ostane nobena prosta determinantna skupina, zato drugo, nevezano aktivno središče protiteles ne more interagirati z drugim antigenskim delcem in ju povezati med seboj. Tvorba vidnega aglutinata ali precipitata je potlačena tudi pri presežku antigena, ko ni več niti enega prostega aktivnega mesta protiteles in zato kompleksov antigen + protitelo + antigen ni več mogoče povečevati.
Možnosti pospešenih reakcij aglutinacije. Reakcija pasivne hemaglutinacije in njene različice
Klasična reakcija aglutinacije vključuje uporabo korpuskularnih antigenov. Lahko pa so vpleteni tudi topni antigeni. Da bi to omogočili, se takšni antigeni adsorbirajo na imunološko inertne delce. Kot nosilec lahko uporabimo delce lateksa ali bentonita, vendar se trenutno najpogosteje uporabljajo eritrociti živali ali ljudi, ki izboljšajo svoje adsorpcijske lastnosti z obdelavo z raztopinami tanina, formalina ali benzidina. Eritrociti, ki nase adsorbirajo antigen, se imenujejo senzibilizirani s tem antigenom, imunska reakcija, v kateri sodelujejo, pa je posredna ali pasivna hemaglutinacijska reakcija (RNHA ali RPHA), saj eritrociti v njej sodelujejo pasivno.
RPGA je nameščen v posebnih polistirenskih ploščah z luknjami, ki imajo polkroglo dno. Pri serološki diagnostiki se v teh luknjah pripravi dvakratna razredčitev v fiziološki raztopini testiranega seruma, nato pa se mu kot diagnostično sredstvo doda suspenzija senzibiliziranih eritrocitov. Rezultate zabeležimo po 2 urah inkubacije pri 37 °C po sistemu štirih križcev. S pozitivno reakcijo se aglutinirani eritrociti usedejo na dno luknje in ga enakomerno prekrijejo v obliki obrnjenega dežnika. Z negativno reakcijo se tudi eritrociti usedejo, tekočina postane prozorna, oborina je videti kot majhen "disk" v središču luknje. Serumski titer pri RPHA velja za njegovo zadnjo razredčitev, ki še daje izrazito hemaglutinacijo brez pomembni znaki imeti disk.
RPHA se lahko uporablja tudi kot pospešena metoda bakteriološke diagnostike za odkrivanje neznanih bakterij, virusov, toksinov, kot so povzročitelji kuge, stafilokokni enterotoksini itd., neposredno v testnem materialu protitelesa - protitelesni eritrocitni diagnostikum. Če testni material vsebuje zadostno količino znanega antigena, bo TPHA pozitiven.
Možnosti uporabe RPGA so: reakcija nevtralizacije antigena (RNAg), reakcija nevtralizacije protiteles (RNAt), reakcija inhibicije pasivne hemaglutinacije (RPHA). Za te reakcije se uporabljajo antigenski in protitelesni eritrocitni diagnostiki. Hkrati lahko uporabimo dve medsebojno nadzorovani enosmerni reakciji, na primer RPHA z antigenskim diagnostikom in RNAg z protitelesnim eritrocitnim diagnostikom.
Reakcija nevtralizacije protiteles (RNAt) je sestavljena iz dejstva, da se suspenzija, ki vsebuje želeni antigen, zmeša s specifičnim imunskim serumom, ki vsebuje znana protitelesa v ustreznih količinah, in inkubira pri 37 ° C dve uri. Nato dodamo antigenski diagnostik eritrocitov. Mešanico pretresemo in pustimo pri sobni temperaturi. Rezultati se upoštevajo po 3-4 urah in končno - po 18-24 urah.Če je v testnem materialu antigen, bo vezal protitelesa (jih nevtraliziral), zato ne bo prišlo do hemaglutinacije.
Po istem principu poteka reakcija nevtralizacije antigena (RNAg). Samo v tem primeru se v testnem materialu odkrijejo protitelesa. Specifični antigen, dodan takemu testnemu materialu, se bo vezal na protitelesa v njem, to pomeni, da bodo protitelesa nevtralizirala antigen in zato ob dodajanju protitelesnega eritrocitnega diagnostika ne bo prišlo do hemaglutinacije.
Reakcija koaglutinacije. Je ena od možnosti za pasivno, tj. celično posredovano reakcijo aglutinacije na steklu s protitelesom in nosilcem. Ta reakcija temelji na edinstvena lastnina zlati stafilokok, ki ima v celični steni protein A, se vežejo na Fc fragmente IgG in IgM. Hkrati aktivni centri protiteles ostanejo prosti in lahko komunicirajo s specifičnimi determinantami antigenov. Na predmetno stekelce nanesemo kapljico 2% suspenzije stafilokokov, senzibiliziranih z ustreznimi protitelesi, in dodamo kapljico suspenzije proučevanih bakterij. Ko se antigen ujema s protitelesi, po 30-60 sekundah pride do jasne aglutinacije stafilokokov, obremenjenih s protitelesi.
Reakcija aglutinacije lateksa (LAH). Nosilec protiteles v tem diagnostičnem sistemu so majhni standardni delci lateksa. Reakcijo izvajamo z mikrometodo v jamicah na steklu. Glavni pogoj za uspešno določitev PAH je dosledno upoštevanje količinskih razmerij komponent sistema: 10 µl pripravka iz lateksa, senzibiliziranega s protitelesi, dodamo 50 µl testnega materiala. Specifičnost PAH je nadzorovana s tremi kontrolnimi testi, ki jih vsebujejo komercialni testni sistemi: znani pozitivna reakcija, očitno povratni udarec in kontrola kakovosti suspenzije lateksa za latekse, ki niso občutljivi na PAH (ki ne vsebujejo protiteles) s testnim materialom. Pri nas se kot nosilci specifičnih protiteles uporabljajo monodisperzni polistirenski lateksi z različnimi premeri delcev (0,3; 0,66; 0,75; 0,8 μm). PAH se uporablja za hitro detekcijo mikroorganizmov ali njihovih antigenov v testnem materialu.
Imunomagnetna detekcija antigenov. Ena od možnosti za pospešeno reakcijo aglutinacije na steklu je povezana z uporabo supermagnetnih polimernih delcev, prevlečenih s specifičnimi protitelesi. En tak delec veže do 107-108 celic mikroorganizmov, zaradi česar je občutljivost ta metoda doseže 5 CFU / ml. Imunomagnetna detekcija mikroorganizmov se lahko uporablja v kombinaciji s CPR.
Reakcija agregatno-hemaglutinacije (RAGA). Omogoča vam hitro odkrivanje v krvi bolnikov tako prosto krožečih antigenov (antigenemija) kot antigenov, povezanih s protitelesi - krožečimi imunskimi kompleksi (CIC). Za RAGA uporabimo eritrocite, senzibilizirane z ustreznimi protitelesi. Dodajanje bolnikovega krvnega seruma, ki vsebuje antigene, na senzibilizirane eritrocite, na katere so fiksirana protitelesa, vodi do lepljenja (aglutinacije) eritrocitov in imunskih kompleksov.
Antiglobulinski Coombsov test (R. Coombsova reakcija). S pomočjo neposrednih in pasivnih reakcij aglutinacije se določijo popolna (bivalentna) protitelesa. Nepopolna (monovalentna, blokirajoča) protitelesa s temi metodami ne odkrijejo, saj ga v kombinaciji z antigenom blokirajo, vendar ne morejo povzročiti agregacije antigena v velike konglomerate. Nepopolna (blokirna) protitelesa so tista, pri katerih deluje samo en aktivni center; drugi aktivni center ne deluje iz neznanega razloga. Za identifikacijo nepopolnih protiteles se uporablja posebna Coombsova reakcija (slika 72). V reakciji sodelujejo: pacientov serum, v katerem določajo nepopolna protitelesa, corpuscular antigen diagnosticum, antiglobulinski serum, ki vsebuje protitelesa proti humanemu globulinu. Reakcija poteka v dveh fazah:
Interakcija antigena z nepopolnimi protitelesi. Ni vidnih manifestacij. Prva stopnja se zaključi z izpiranjem antigena iz ostankov bolnikovega seruma.
Interakcija antiglobulinskega seruma, pridobljenega kot rezultat imunizacije živali s humanim globulinom, z nepopolnimi protitelesi, adsorbiranimi na antigen. Ker so antiglobulinska protitelesa dvovalentna, vežejo dve monovalentni protitelesi ločenih antigenskih kompleksov + nepopolno protitelo, kar vodi do njihovega zlepljenja in pojava vidne oborine.
13.1. Reakcije antigen-protitelo in njihova uporaba
Ko se antigen vbrizga, se v telesu tvorijo protitelesa. Protitelesa so komplementarna antigenu, ki je povzročil njihovo sintezo, in se lahko nanj vežejo. Vezava antigenov na protitelesa je sestavljena iz dveh faz. Prva faza je specifična, v kateri pride do hitre vezave antigenske determinante na aktivno središče Fab fragmenta protiteles. Opozoriti je treba, da je vezava posledica van der Waalsovih sil, vodika in hidrofobnih interakcij. Moč vezi je določena s stopnjo prostorske korespondence med aktivnim mestom protitelesa in epitopom antigena. Po specifični fazi se začne počasnejša – nespecifična, ki se kaže z vidnim fizikalnim pojavom (npr. nastajanje kosmičev pri aglutinaciji ipd.).
Imunske reakcije so interakcije med protitelesi in antigeni, te reakcije pa so specifične in zelo občutljive. Široko se uporabljajo v zdravniška praksa. S pomočjo imunskih reakcij je mogoče rešiti naslednje naloge:
Določanje neznanih protiteles z znanimi antigeni (antigenski diagnostikum). Takšna naloga je, ko je treba določiti protitelesa proti povzročitelju v bolnikovem krvnem serumu (serodiagnostika). Iskanje protiteles vam omogoča potrditev diagnoze;
Določanje neznanih antigenov z znanimi protitelesi (diagnostični serum). Ta študija se izvaja pri identifikaciji kulture patogena, izoliranega iz pacientovega materiala (serotipizacija), kot tudi pri odkrivanju
antigeni mikrobov in njihovi toksini v krvi in drugih bioloških tekočinah. Obstaja veliko vrst imunskih reakcij, ki se razlikujejo po tehniki nastavitve in zabeleženem učinku. To so reakcije aglutinacije (RA), precipitacije (RP), reakcije s komplementom (RCC), reakcije z uporabo označenih komponent (RIF, ELISA, RIA).
13.2. Reakcija aglutinacije
Aglutinacijska reakcija (RA) je imunska reakcija interakcije antigena s protitelesi v prisotnosti elektrolitov, antigen pa je v korpuskularnem stanju (eritrociti, bakterije, delci lateksa z adsorbiranimi antigeni). Med aglutinacijo se korpuskularni antigeni zlepijo s protitelesi, kar se kaže s tvorbo kosmičaste oborine. Nastanek kosmičev nastane zaradi dejstva, da imajo protitelesa dva aktivna centra, antigeni pa so polivalentni, tj. imajo več antigenskih determinant. RA se uporablja za identifikacijo patogena, izoliranega iz pacientovega materiala, kot tudi za odkrivanje protiteles proti patogenu v bolnikovem krvnem serumu (na primer reakcije Wright in Huddleson pri brucelozi, Vidalova reakcija pri tifusu in paratifusu). ).
Najlažji način za postavitev RA je reakcija na steklu, to je približna RA, s katero določimo povzročitelja, izoliranega od bolnika. Pri nastavitvi reakcije na stekelcu se nanese diagnostični aglutinacijski serum (v razredčini 1:10 ali 1:20), nato pa se uvede kultura bolnika. Reakcija je pozitivna, če se v kapljici pojavi kosmičasta oborina. V bližini je postavljena kontrola: namesto seruma se nanese kapljica raztopine natrijevega klorida. Če je diagnostični aglutinacijski serum neadsorbiran 1, potem ga razredčimo (na titer – razredčino, do katere naj pride do aglutinacije), t.j. dajte razširjeno RA v epruvete z naraščajočim
1 Neadsorbirani aglutinacijski serum lahko aglutinira sorodne bakterije, ki imajo skupne (navzkrižno reagirajoče) antigene. Zato, uživajteadsorbirani aglutinacijski serumi, iz katerih so bila navzkrižno reaktivna protitelesa odstranjena z adsorpcijo sorodnih bakterij. V takih serumih ostanejo protitelesa, specifična samo za to bakterijo.
razredčine aglutinacijskega seruma, ki mu dodamo 2-3 kapljice suspenzije povzročitelja, izoliranega od bolnika. Aglutinacija se upošteva glede na količino usedline in stopnjo zbistrenosti tekočine v epruvetah. Reakcija se šteje za pozitivno, če opazimo aglutinacijo v razredčitvi blizu titra diagnostičnega seruma. Reakcijo spremljajo kontrole: serum, razredčen z izotonično raztopino natrijevega klorida, mora biti prozoren, suspenzija mikrobov v isti raztopini mora biti enakomerno motna, brez usedline.
Za določitev protiteles proti patogenu v bolnikovem krvnem serumu se uporablja razširjena RA. Ko ga damo v epruvete, pacientov krvni serum razredčimo in v epruvete dodamo enako količino suspenzije diagnosticuma (suspenzijo ubitih mikrobov). Po inkubaciji določimo največjo razredčino seruma, pri kateri je prišlo do aglutinacije, t.j. nastane oborina (serumski titer). V tem primeru pride do reakcije aglutinacije z O-diagnosticumom (bakterije, ubite s segrevanjem, ki zadržijo termostabilen O-antigen) v obliki drobnozrnate aglutinacije. Aglutinacijska reakcija s H-diagnosticumom (bakterije, ki jih ubije formalin, obdrži toplotno labilen flagelarni H-antigen) je grobozrnata in poteka hitreje.
Reakcija indirektne (pasivne) hemaglutinacije(RNGA ali RPGA) je vrsta RA. Ta metoda je zelo občutljiva. S pomočjo RNGA je mogoče rešiti dve nalogi: določiti protitelesa v bolnikovem krvnem serumu, ki mu je dodan antigenski eritrocitni diagnostik, to so eritrociti, na katerih so adsorbirani znani antigeni; določiti prisotnost antigenov v testnem materialu. V tem primeru se reakcija včasih imenuje reakcija povratne indirektne hemaglutinacije (RONGA). Pri določanju stopnje se testnemu materialu doda protitelesni eritrocitni diagnostik (eritrociti, na površini katerih so adsorbirana protitelesa). Eritrociti v tej reakciji delujejo kot nosilci in so pasivno vključeni v tvorbo imunskih agregatov. S pozitivno reakcijo pasivno zlepljeni eritrociti prekrijejo dno jamice z enakomerno plastjo z nazobčanimi robovi ("dežnik"); v odsotnosti aglutinacije se eritrociti kopičijo v osrednji vdolbini luknje in tvorijo kompakten "gumb" z ostro definiranimi robovi.
Reakcija koaglutinacije uporablja se za odkrivanje patogenih celic (antigenov) z uporabo protiteles, adsorbiranih na Zlati stafilokok, ki vsebuje protein A. Protein A ima afiniteto do Fc fragmenta imunoglobulinov. Zaradi tega se protitelesa vežejo na stafilokok posredno preko fragmenta Fc, fragmenti Fab pa so usmerjeni navzven in lahko interagirajo z ustreznimi mikrobi, izoliranimi od bolnikov. V tem primeru se oblikujejo kosmiči.
Reakcija inhibicije hemaglutinacije (HITA) uporablja se pri diagnozi virusnih okužb in samo okužb, ki jih povzročajo hemaglutinacijski virusi. Ti virusi vsebujejo na svoji površini beljakovino - hemaglutinin, ki je odgovoren za reakcijo hemaglutinacije (RHA), če jo dodamo eritrocitnim virusom. RTGA je blokiranje virusnih antigenov s protitelesi, zaradi česar virusi izgubijo sposobnost aglutinacije rdečih krvnih celic.
Coombsova reakcija - RA za odkrivanje nepopolnih protiteles. Pri nekaterih nalezljivih boleznih, kot je bruceloza, v krvnem serumu bolnika krožijo nepopolna protitelesa proti povzročitelju. Nepopolna protitelesa imenujemo blokiranje, ker imajo eno mesto za vezavo antigena in ne dveh, kot polna protitelesa. Zato se ob dodajanju antigenskega diagnostika nepopolna protitelesa vežejo na antigene, vendar jih ne zlepijo. Za manifestacijo reakcije dodamo antiglobulinski serum (protitelesa proti človeškim imunoglobulinom), kar bo povzročilo aglutinacijo imunskih kompleksov (antigenski diagnostik + nepopolna protitelesa), ki nastanejo v prvi fazi reakcije.
Indirektna Coombsova reakcija se uporablja pri bolnikih z intravaskularna hemoliza. Pri nekaterih od teh bolnikov najdemo nepopolna monovalentna protitelesa proti rezusu. Posebej interagirajo z Rh-pozitivnimi eritrociti, vendar ne povzročajo njihove aglutinacije. Zato sistemu anti-Rh protitelesa + Rh-pozitivni eritrociti dodamo antiglobulinski serum, ki povzroči aglutinacijo eritrocitov. Za diagnozo se uporablja Coombsova reakcija patološka stanja povezana z intravaskularno lizo eritrocitov imunskega izvora, na primer hemolitična bolezen novorojenčka zaradi Rhesus konflikta.
RA za določanje krvnih skupin temelji na aglutinaciji eritrocitov s protitelesi imunskega seruma proti antigenom krvnih skupin A (II), B (III). Kontrola je serum, ki ne vsebuje protiteles, t.j. serumske krvne skupine AB (IV) in antigeni eritrocitov skupin A (P) in B (III). Kot negativno kontrolo se uporabljajo eritrociti skupine 0(I), ker nimajo antigenov.
Za določitev Rh faktorja se uporabljajo anti-Rh serumi (vsaj dve različni seriji). V prisotnosti antigena Rh na membrani proučevanih eritrocitov pride do aglutinacije teh celic.
13.3. reakcija padavin
RP je imunska reakcija interakcije protiteles z antigeni v prisotnosti elektrolitov, antigen pa je v topnem stanju. Med obarjanjem se topni antigeni oborijo s protitelesi, kar se kaže z motnostjo v obliki precipitacijskih trakov. Pri mešanju obeh reagentov v enakih razmerjih opazimo nastanek vidne oborine. Presežek enega od njih zmanjša količino oborjenih imunskih kompleksov. Obstajajo različni načini za nastavitev reakcije padavin.
Obročna precipitacijska reakcija v precipitacijskih ceveh majhnega premera. V epruveto dodamo imunski serum in topni antigen previdno nanesemo po plasteh. Pri pozitivnem rezultatu se na meji obeh raztopin oblikuje mlečni obroč. Obročasto precipitacijsko reakcijo, s katero ugotavljamo prisotnost antigenov v organih in tkivih, katerih izvlečke prekuhamo in filtriramo, imenujemo termoprecipitacijska reakcija (Ascolijeva reakcija za določanje termostabilnega antraksnega antigena).
Ouchterlonyjeva dvojna imunodifuzijska reakcija. To reakcijo izvajamo na agarjevem gelu. Vdolbinice so izrezane v sloju gela enakomerne debeline na določeni medsebojni razdalji in napolnjene z antigenom oziroma imunskim serumom. Po tem antigeni in protitelesa difundirajo v gel, se srečajo in tvorijo imunske komplekse, ki se oborijo v gelu in postanejo vidni kot precipitacijske črte.
prehrana. To reakcijo lahko uporabimo za odkrivanje neznanih antigenov ali protiteles, pa tudi za preverjanje podobnosti med različnimi antigeni: če so antigeni enaki, se precipitacijske črte združijo; če antigeni niso enaki, se precipitacijske črte sekajo; če so antigeni delno enaka, nastane ostroga.
Radialna imunodifuzijska reakcija. V staljeno agar gel dodajte protitelesa in nanesite gel v enakomerni plasti na steklo. V gelu izrežemo vdolbinice in vanje vnesemo standardni volumen raztopin antigena različnih koncentracij. Med inkubacijo antigeni radialno difundirajo iz jamice in ob srečanju s protitelesi tvorijo precipitacijski obroč. Dokler je v vdolbinici presežek antigena, prihaja do postopnega povečevanja premera precipitacijskega obroča. Ta metoda se uporablja za določanje antigenov ali protiteles v testni raztopini (na primer za določanje koncentracije imunoglobulinov različnih razredov v krvnem serumu).
Imunoelektroforeza. Mešanico antigenov predhodno ločimo z elektroforezo, nato pa v utor, ki poteka vzdolž smeri gibanja beljakovin, vnesemo obarjeni antiserum. Antigeni in protitelesa difundirajo v gel drug proti drugemu; medsebojno delujejo, tvorijo obokane linije padavin.
reakcija flokulacije(po Ramonu) - nekakšna precipitacijska reakcija, ki se uporablja za določanje aktivnosti antitoksičnega seruma ali toksoida. Reakcijo izvajamo v epruvetah. V epruveti, kjer sta toksoid in antitoksin v enakem razmerju, opazimo motnost.
13.4. Reakcija fiksacije komplementa
Protitelesa v interakciji z ustreznim antigenom vežejo dodani komplement (1. sistem). Indikator fiksacije komplementa so eritrociti, senzibilizirani s hemolitičnim serumom, tj. protitelesa proti eritrocitom (2. sistem). Če komplement ni fiksen v 1. sistemu, tj. ne pride do reakcije antigen-protitelo, potem se senzibilizirane rdeče krvne celice popolnoma lizirajo (negativna reakcija). Ko se komplement veže z imunskimi kompleksi 1. sistema, po dodatku senzibiliziranih eritrocitov pride do hemolize.
odsoten (pozitivna reakcija). Reakcija fiksacije komplementa se uporablja za diagnosticiranje nalezljivih bolezni (gonoreja, sifilis, gripa itd.).
13.5. Reakcija nevtralizacije
Mikrobi in njihovi toksini škodljivo vplivajo na organe in tkiva človeškega telesa. Protitelesa se lahko vežejo na te škodljive dejavnike in jih blokirajo, tj. nevtralizirati. Ta lastnost protiteles temelji diagnostična reakcija nevtralizacija. Izvaja se z vnosom mešanice antigen-protitelo v živali ali v občutljive testne predmete (celična kultura, zarodki). Na primer, za odkrivanje toksinov v pacientovem materialu se živalim 1. skupine injicira pacientov material. Živalim 2. skupine se vbrizga podoben material, predhodno obdelan z ustreznim antiserumom. Živali 1. skupine poginejo ob prisotnosti toksina v materialu. Druga skupina živali preživi, škodljiv učinek toksina se ne manifestira, saj je nevtraliziran.
13.6. Reakcije z uporabo označenih protiteles ali antigenov
13.6.1. Imunofluorescenčna reakcija (RIF, Koonsova metoda)
Ta metoda se uporablja za hitro diagnostiko. Zazna lahko tako mikrobne antigene kot protitelesa.
Neposredna metoda RIF- imunska reakcija interakcije protiteles z antigeni, protitelesa pa so označena s fluorokromom - snovjo, ki je sposobna oddajati kvante svetlobe določene valovne dolžine, ko jih zadene svetloba določene valovne dolžine. Posebnost nastavitve te metode je potreba po odstranitvi nereagiranih komponent, da se izključi zaznavanje nespecifične luminiscence. Če želite to narediti, izvedite pranje nereagiranih protiteles. Rezultate ocenimo s fluorescenčnim mikroskopom. Bakterije v razmazu, obdelanem s takšnim luminiscenčnim serumom, svetijo na temnem ozadju po obodu celice.
Posredna metoda RIF uporabljal več kot prejšnji. Ta reakcija poteka v dveh korakih. Na prvi stopnji antigeni medsebojno
sodelujejo z ustreznimi protitelesi in tvorijo imunske komplekse. Vse sestavine, ki niso reagirale (tj. niso del imunskih kompleksov), je treba odstraniti s pranjem. Na drugi stopnji se nastali kompleks antigen-protitelo odkrije s fluorokromnim antiglobulinskim serumom. Posledično nastane kompleks mikroba + protimikrobna zajčja protitelesa + protitelesa proti kunčjim imunoglobulinom, označenim s fluorokromom. Rezultate ocenimo s fluorescenčnim mikroskopom.
13.6.2. Imunski test ali test
ELISA je najpogostejši sodobna metoda uporablja se za diagnosticiranje virusnih, bakterijskih, protozojskih okužb, zlasti za diagnozo okužbe s HIV, virusni hepatitis in itd.
Obstaja veliko modifikacij ELISA. Nekompetitivni test ELISA v trdni fazi se pogosto uporablja. Izvaja se v polistirenskih ploščah s 96 jamicami (trdna faza). Med reakcijo je potrebno na vsaki stopnji sprati nezreagirane komponente. Pri določanju protiteles se vdolbinice, na katerih so adsorbirani antigeni, napolnijo s preiskovanim krvnim serumom, nato pa z encimom označenim antiglobulinskim serumom. Pokažite reakcijo z dodajanjem substrata za encim. V prisotnosti encima se substrat spremeni, kompleks encim-substrat pa se izbere tako, da se pri reakciji nastali produkt obarva. Tako s pozitivno reakcijo opazimo spremembo barve raztopine. Za določanje antigenov se trdnofazni nosilec senzibilizira s protitelesi, nato se zaporedno doda testni material (antigeni) in encimsko označen antigenski serum. Za manifestacijo reakcije se uvede substrat za encim. Ob pozitivni reakciji pride do spremembe barve raztopine.
13.6.3. Imunobloting
Ta metoda temelji na kombinaciji elektroforeze in ELISA. Pri izvajanju imunoblotinga (blotiranje iz angleščine. madež- spot) kompleksno mešanico antigenov najprej podvržemo elektroforezi v poliakrilamidnem gelu. Nastali frakcionirani anti-
genski peptidi se prenesejo na nitrocelulozno membrano. Blote nato obdelamo z encimsko označenimi protitelesi proti specifičnemu antigenu, tj. opravite ELISA blot. Imunobloting se uporablja pri diagnozi okužb, kot je HIV.
13.6.4. Imunska elektronska mikroskopija
Metoda je mikroskopiranje v elektronskem mikroskopu virusov (redkeje drugih mikrobov), predhodno obdelanih z ustreznim imunskim serumom, označenim z elektronsko optično gostimi pripravki, na primer feritinom, beljakovino, ki vsebuje železo.
13.7. pretočna citometrija
Krvne celice se razlikujejo na podlagi laserske citofluorometrije. Za to so želene celice obarvane s fluorescentnimi monoklonskimi protitelesi proti antigenom CD. Vzorec krvi po obdelavi z označenimi protitelesi spustimo skozi tanko cevko in skozi njo spustimo laserski žarek, ki vzbudi luminiscenco fluorokroma. Intenzivnost fluorescence je v korelaciji z gostoto antigenov na celični površini in jo je mogoče kvantificirati s fotopomnoževalnikom. Dobljeni rezultati se pretvorijo v histogram.
Za določanje se uporablja pretočna citometrija imunski status(vsebnost glavnih populacij limfocitov, vsebnost intracelularnih in zunajceličnih citokinov, funkcionalna aktivnost NK celic, aktivnost fagocitoze itd.).
Razširjena reakcija aglutinacije (RA). Za določitev AT v bolnikovem krvnem serumu dajte podaljšana reakcija aglutinacije (RA). Da bi to naredili, se nizu razredčin krvnega seruma doda diagnostik - suspenzija ubitih mikroorganizmov ali delcev z adsorbiranim Ag. Največja razredčitev aglutinacija Ag, imenovan titer krvnega seruma.
Različice aglutinacijske reakcije (RA) za odkrivanje AT - krvni test za tularemijo (z nanosom diagnostikuma na kapljico krvi in pojavom vidnih belkastih aglutinatov) in Huddlesonovo reakcijo za brucelozo (z diagnostikom, obarvanim z encijanovo vijolico, naneseno na kapljico krvnega seruma).
Približna reakcija aglutinacije (RA)
Za identifikacijo izoliranih mikroorganizmov se na stekelca namesti približen RA. Da bi to naredili, kulturo patogena dodamo kapljici standardnega diagnostičnega antiseruma (v razredčitvi 1:10, 1:20). Če je rezultat pozitiven, dajo podrobno reakcijo z naraščajočimi razredčinami antiseruma.
reakcijašteje za pozitivno, če opazimo aglutinacijo v razredčinah, ki so blizu titru diagnostičnega seruma.
OAS. Somatski O-Ag so toplotno stabilni in vzdržijo vrenje 2 uri, pri interakciji z AT tvorijo drobnozrnate agregate.
N-Ag. H-Ag (flagelat) termolabilen in hitro uničen pri 100 °C, pa tudi pod delovanjem etanola. Pri reakcijah s H-antiserumom po 2 urah inkubacije nastanejo ohlapni veliki kosmiči (tvorijo jih bakterije, ki se zlepijo z bički).
Vi Ar tifusna bakterija je relativno termostabilna (vzdrži temperaturo 60-62 ° C 2 uri); pri inkubaciji z Vi-antiserumom nastane drobnozrnat aglutinat.
Reakcije neposredne hemaglutinacije
Najenostavnejši od teh reakcije - aglutinacija eritrocitov ali hemaglutinacijo, ki se uporablja za določanje krvnih skupin v sistemu AB0. Za določitev aglutinacija(ali njegove odsotnosti) se uporabljajo standardni antiserumi z aglutinini anti-A in anti-B. Reakcija se imenuje neposredna, saj so proučevani antigeni naravne sestavine eritrocitov.
V skupni rabi z neposredna hemaglutinacija ima virusno hemaglutinacijo. Mnogi virusi so sposobni spontano aglutinirati eritrocite ptic in sesalcev, njihov dodatek v suspenzijo eritrocitov pa povzroči nastanek agregatov iz njih.
