Virološke študije so študije, namenjene izolaciji virusov in preučevanju njihovih lastnosti ter ugotavljanju etiološke povezave virusov z določenimi boleznimi.

Material za raziskave se vzame glede na mesto prevladujočih virusov v bolnikovem telesu in na poti njihovega sproščanja med zunanje okolje. Material zberemo v sterilne posode, čim prej dostavimo v laboratorij in do preiskave shranimo zamrznjenega ali na ledu. Pred uporabo se material za izolacijo virusa obdela (in) za zatiranje tuje mikroflore in obdela za odstranitev velikih delcev.

Virusi se izolirajo z okužbo laboratorijskih živali, piščančjih zarodkov in tkivnih kultur z materialom, ki vsebuje virus. Izbira metode izolacije je odvisna od domnevnega povzročitelja bolezni. Tako se tkivne kulture (glej) uporabljajo pri delu z virusi, ki niso patogeni za laboratorijske živali, ali ko jih odkrijejo v tkivni kulturi prej kot pri okužbi živali. Piščančji zarodki so okuženi, da se izolirajo patogeni, infektivni mumps (v amnijski in alantoični votlini), (v rumenjakovi vrečki), črne koze (v horioalantoični membrani).

Med laboratorijskimi živalmi se za izolacijo virusov najpogosteje uporabljajo bele miši, sledijo kunci, podgane, morski prašički, opice. Pri arbovirusih je najučinkovitejši vnos materiala, ki vsebuje viruse, v glavo ali pri pnevmotropnih virusih na sluznico. dihalni trakt, za viruse črnih koz, - na scarificirano roženico.

Izolacija virusa je najučinkovitejša v akutnem obdobju bolezni. Bistvena točka pri ugotavljanju virusne narave bolezni so rezultati serološke študije serumi, večkrat odvzeti istemu bolniku na začetku bolezni in med obdobjem okrevanja. Odkrivanje protiteles proti izoliranim virusom v drugem serumu v titru, ki je 4 ali večkrat večji kot v prvem serumu, kaže na etiološko povezavo virusov s to boleznijo.

Zgodaj in hitra metoda detekcija virusnih antigenov je metoda fluorescentnih protiteles, ki temelji na specifični fiksaciji protiteles, označenih s fluorokromom, na površini antigena. Antigen je zlahka zaznan s fluorescenčno mikroskopijo (glej) zaradi svetle fluorescence protiteles, adsorbiranih na antigenu. Metoda fluorescentnih protiteles se uporablja za pregled brisov bolnikov, histoloških rezov prizadetih tkiv in pripravkov tkivnih kultur. Uporabljajo se tudi za odkrivanje elementarnih teles (virionov) (glej). Med drugimi morfološkimi metodami se uporabljajo tiste, ki odkrivajo intracelularne virusne vključke v odsekih prizadetih organov in tkiv. Odkrivanje vključkov kaže na okužbo in v nekaterih primerih prispeva k diagnozi virusne bolezni. Za odkrivanje virusnih protiteles v krvi bolnikov in za študij antigenska struktura Uporabljajo se različni virusi. Reakcija nevtralizacije se uporablja pri skoraj vseh virusnih okužbah. Temelji na sposobnosti imunskih protiteles, da nevtralizirajo nalezljive lastnosti virusov, ko se mešanica vnese v telo dovzetnih živali ali v tkivno kulturo. Za določitev nevtralizacijskega indeksa se stalni odmerek seruma zmeša z različnimi razredčinami virusov in za določitev titra protiteles - različne razredčitve serum s stalnim odmerkom virusov. Kontrola je okužba živali (ali tkivne kulture) z mešanico virusov z normalnim serumom ali z fiziološka raztopina. Reakcija nevtralizacije se izvaja ne samo za odkrivanje protiteles, temveč tudi za določanje vrste in vrste virusov.

Reakcija fiksacije komplementa (na primer reakcija Bordet-Giangou (glej)) se uporablja za odkrivanje tako virusnih antigenov kot protiteles. V prvem primeru reakcija vključuje interakcijo znanega imunskega seruma in materiala, v katerem se domneva prisotnost antigenov: krvni serum, nazofaringealni brisi, tkivni izvlečki okuženega organizma. V drugem primeru - znani antigen (diagnostikum) in serum bolnika ali rekonvalescenta.

RSK se uporablja za diagnosticiranje bolezni, ki jih povzročajo virusi gripe, črnih koz, adenovirusi in arbovirusi.

Tečajna naloga

"Metode klinične virologije"

Uvod

Laboratorijska diagnostika virusne okužbe izvajajo predvsem z uporabo elektronske mikroskopije, občutljivih celičnih kultur in imunoloških metod. Za postavitev diagnoze se praviloma izbere ena metoda glede na stopnjo virusne okužbe. Na primer, vsi trije pristopi so lahko uporabni pri diagnosticiranju noric, vendar je uspešna uporaba tehnik mikroskopije in celične kulture odvisna od zmožnosti zbiranja zadovoljivih vzorcev relativno zgodaj v bolezni.

V veliki meri uspeh virusna diagnostika odvisno od kakovosti prejetih vzorcev. Zaradi tega mora laboratorijsko osebje samo neposredno sodelovati pri zbiranju potrebnih vzorcev. Lastnosti vzorcev in metode za njihovo dostavo v laboratorij opisujejo Lennett, Schmidt, Christ et al.

Večino reagentov in instrumentov, ki se uporabljajo v laboratorijski diagnostiki, je mogoče kupiti pri različnih podjetjih. V večini primerov isti reagent hkrati proizvaja več podjetij. Zato nismo navedli posameznih podjetij, razen če reagent dobavlja le eno podjetje. V vseh drugih primerih se morate obrniti splošni seznam dobavitelji navedeni v tabeli. 1.

Naš cilj ni bil zagotoviti celovitega opisa vseh trenutno razpoložljivih metod za diagnosticiranje virusnih okužb pri ljudeh. Najprej smo opisali glavne metode. Ko pridobite izkušnje samostojno delo te osnovne tehnike je mogoče uporabiti za reševanje bolj zapletenih problemov.

1. Elektronska mikroskopija

Za elektronsko mikroskopsko diagnozo virusnih okužb se lahko uporabijo tanki rezi prizadetega tkiva. Najpogostejši material, ki se uporablja za elektronsko mikroskopijo, je blato ali tekočina.

Tabela 1. Seznam podjetij, ki dobavljajo reagente in opremo

mehurčki, ki so značilni za nekatere bolezni, kot so norice. Pri analizi takšnega materiala je mogoče viruse odkriti z negativnim barvanjem, kar ima za posledico material z elektronsko gostoto, ki razmejuje komponente viriona. Metoda je učinkovita, kadar je koncentracija virusa v testnih vzorcih visoka, na primer v blatu ali vezikularni tekočini. V primerih, ko je vsebnost virusnih delcev v vzorcih nizka, lahko verjetnost odkrivanja virusa povečamo s koncentriranjem virusa z ultracentrifugiranjem ali z agregacijo s specifičnimi protitelesi. Slednja metoda je primerna tudi za prepoznavanje virusov. Tukaj opisujemo elektronsko mikroskopsko diagnostično metodo rotavirusna okužba in metoda imunoelektronske mikroskopije na primeru detekcije specifičnih protiteles proti parvovirusom. Metode elektronske mikroskopije je podrobneje opisal Field.

2.1 Direktna elektronsko mikroskopska preiskava blata

1. Konico Pasteurjeve pipete potopite v blato in potegnite dovolj materiala, da dobite 1 cm razmaz.

2. Resuspendirajte razmaz blata v elektronsko mikroskopsko negativnem kontrastnem barvilu, dokler ne dobite prosojne suspenzije. Negativno kontrastno barvilo je 2% raztopina fosfovolframove kisline v destilirani vodi.

3. Za pridobitev elektronskega mikroskopskega vzorca se kapljica suspenzije nanese na elektronsko mikroskopsko mrežo, prevlečeno s filmom iz ogljika. Med tem postopkom mrežico držimo s tanko pinceto.

4. Zdravilo pustimo na zraku 30 s.

5. Odvečno tekočino odstranimo tako, da se s filtrirnim papirjem dotaknemo roba kozarca.

6. Drogo sušimo na zraku.

7. Po potrebi se živi virus inaktivira z obsevanjem obeh strani mreže z ultravijolično svetlobo z intenzivnostjo 440.000 μW-s/cm2. V tem primeru se uporablja kratkovalovna ultravijolična svetilka s filtrom. Svetilka mora biti na razdalji 15 cm od mreže; Čas obsevanja za vsako stran je 5 minut.

8. Virione rotavirusov je mogoče karakterizirati pod transmisijskim elektronskim mikroskopom s povečavo od 30.000 do 50.000.

2.2 Imunoelektronska mikroskopija

Spodaj opisana metoda imunoelektronske mikroskopije je le ena izmed mnogih podobnih imunoloških metod. Za preučevanje protiteles, specifičnih za virus, se poleg tega uporablja metoda, ki vključuje vezavo na mikroskopsko mrežo proteina A. Delovno koncentracijo protivirusnih protiteles določimo s poskusi in napakami v območju od 1/10 do 1/1000. Koncentracija, ki jo navedemo, se običajno uporablja pri rutinskem delu. Za optimalne rezultate interakcije protiteles z virusom titriramo serum, ki vsebuje parvovirus, na enak način.

1. 10 µl antiseruma proti humanemu parvovirusu 100-krat razredčimo s PBS. Raztopino segrejemo v vodni kopeli na 56 °C.

2. Stopite 10 ml 2 % agaroze v PBS na običajen način in ohladite na 56 °C v vodni kopeli.

3. Pri 56 °C zmešajte 1 ml razredčenega antiseruma z 1 ml 2 % agaroze.

4. Prenesite 200 µl nastale mešanice v dve vdolbinici mikrotitrske plošče s 96 vdolbinicami.

5. Pustimo, da se agaroza strdi pri sobni temperaturi. Tableto lahko shranite pri 4 °C več tednov, če jo zalepite z lepilnim trakom.

6. V jamico z mešanico agaroze in antiseruma dodajte 10 µl seruma, ki vsebuje parvovirus.

7. Na kapljico seruma na manj sijočo stran položimo elektronsko mikroskopsko mrežo s predhodno pripravljeno prevleko iz ogljika-formvarja.

8. Mreža se hrani 2 uri pri 37 °C v vlažni komori.

9. S tanko pinceto vzemite mrežico in nanesite kapljico 2% fosfovolframove kisline na površino mrežice, ki je bila v stiku s serumom.

10. Po 30 s odvečno barvo speremo, preparat posušimo in virus inaktiviramo.

Zbrane virusne delce pregledamo pod transmisijskim elektronskim mikroskopom pri povečavi od 30.000 do 50.000.

3. Identifikacija virusnih antigenov

Viruse, ki jih najdemo v tkivih ali tkivnih tekočinah, lahko identificiramo z virusno specifičnimi beljakovinami z uporabo reakcije antigen-protitelo. Produkt reakcije antigen-protitelo se testira glede na oznako, ki se vnese neposredno v protivirusna protitelesa ali v protitelesa, usmerjena proti protitelesom, specifičnim za virus. Protitelesa lahko označimo s fluoresceinom, radioaktivnim jodom ali encimom, ki cepi substrat in povzroči spremembo barve. Poleg tega se za identifikacijo virusa uporablja reakcija hemaglutinacije. V vsakdanji praksi se opisane metode uporabljajo predvsem za dokazovanje antigenov virusa hepatitisa B v krvi in ​​iskanje antigenov različnih virusov, ki povzročajo različne bolezni dihal.

Trenutno veliko podjetij proizvaja eritrocitne, radioaktivne in encimske diagnostike, vključno s tistimi za odkrivanje virusa hepatitisa B. Menimo, da ni priporočljivo opisati metod za delo s to diagnostiko: dovolj je, da sledite priloženim navodilom. V nadaljevanju se bomo osredotočili na imunofluorescenčno metodo za identifikacijo respiratornega sincicijskega virusa v nazofaringealnem izločku.

3.1 Identifikacija respiratornega sincicijskega virusa v nazofaringealnih izločkih z imunofluorescenco

Metodo za pridobivanje pripravkov iz nazofaringealnih izločkov sta opisala Gardner in McQuillin. IN laboratorijske razmere ta operacija se izvaja v dveh fazah. Najprej pripravimo razmaz nazofaringealne sluzi na predmetnem stekelcu. Dobljene razmaze lahko več mesecev hranite pri -20°C. V drugi fazi se brisi obarvajo za odkrivanje antigena respiratornega sincicijskega virusa. V ta namen se uporablja metoda indirektne imunofluorescence.

3.1.1 Priprava pripravkov iz nazofaringealnih izločkov

1. Sluz iz posebnih klešč speremo z 1-2 ml PBS in prenesemo v epruveto za centrifugo.

2. Centrifugirajte 10 minut pri 1500 obratih na minuto v namizni centrifugi.

3. Supernatant se odcedi.

4. Celično peleto previdno resuspendiramo v 2-3 ml PBS, dokler ne dobimo homogene suspenzije. Za to uporabite Pasteurjevo pipeto s širokim vratom.

5. Nastalo suspenzijo prenesemo v epruveto.

6. V suspenzijo dodajte še 2-4 ml PBS in premešajte s pipetiranjem. Odstranijo se veliki strdki sluzi.

7. Centrifugirajte 10 minut pri 1500 obratih na minuto v namizni centrifugi.

8. Supernatant zavržemo, usedlino resuspendiramo v tolikšni prostornini PBS, da se nastala suspenzija zlahka loči od sten epruvete.

9. Nastalo suspenzijo nanesemo na označeno stekelce.

10. Steklo sušimo na zraku.

Fiksiramo v acetonu 10 minut pri 4 °C.

12. Po fiksiranju se steklo ponovno posuši na zraku.

13. Dobljene preparate takoj obarvamo ali shranimo pri -20 °C.

3.1.2. Tehnika barvanja

1. Natisnite in razredčite komercialni antiserum RSV v PBS na priporočeno delovno koncentracijo.

2. S Pasteurjevo pipeto nanesite eno kapljico antiseruma na pripravljen preparat.

3. Zdravilo se postavi v vlažno komoro.

4. Zdravilo inkubiramo 30 minut pri 37 °C.

5. Vzorce previdno speremo s PBS, da odstranimo odvečna protitelesa v posebnem rezervoarju.

6. Vzorci se izperejo v treh izmenah PBS, vsaka po 10 minut.

7. Vzorce posušite, odstranite presežek PBS s filtrirnim papirjem in posušite na zraku.

Raziskave za diagnozo bolezni virusne narave. To je potrebno za identifikacijo virusa, preučevanje njegove biologije in sposobnosti vpliva na živalske in človeške celice. Tako postane mogoče razumeti patogenezo virusne bolezni in v skladu s tem izbrati pravo metodo zdravljenja.

Kakšna je diagnoza?

V živih celicah. Da bi ga preučili, ga je potrebno gojiti na ravni poskusnega organizma ali v ta namen v zdravniška praksa in mikrobiologije na splošno se izvajajo virološke raziskovalne metode, ki imajo naslednje glavne pristope:

• naravnost;
• posredno;
• serološke.

Material lahko neposredno pregledamo na prisotnost nukleinskih kislin, virusnega antigena ali pa na primer virus izoliramo in identificiramo iz kliničnega materiala.

Poleg možnosti ugotavljanja etiologije bolezni spremljanje terapevtski učinek Virološke raziskovalne metode igrajo veliko vlogo pri protiepidemičnih ukrepih. Za izolacijo se uporabljajo piščančji zarodki, laboratorijske živali ali celične kulture.

Kako se raziskuje?

Najhitrejša je direktna metoda. Omogoča odkrivanje virusa, antigena ali NA (nukleinske kisline) v samem kliničnem materialu. Traja od dveh ur do enega dneva.

1. EM - elektronska mikroskopija. Neposredno zazna virus.
2. IEM - imunska elektronska mikroskopija. Uporablja specifična protitelesa proti virusom.
3. RIF - imunofluorescenčna reakcija. Uporablja protitelesa, vezana na barvilo. Takšne virološke raziskovalne metode se pogosto uporabljajo za hitro dešifriranje etiologije ARVI (akutne respiratorne virusne okužbe), ko se brisi prstnih odtisov vzamejo iz sluznice zgornjih dihalnih poti.
4. ELISA - encimski imunski test - določanje virusnih antigenov, podoben RIF, vendar temelji na označevanju protiteles z encimi.
5. RIA - radioimunski test. Uporablja radioaktivno označevanje protiteles za zagotavljanje visoke občutljivosti pri odkrivanju virusnega antigena.
6. Molekularna - NK hibridizacija ali izolacija virusnih genomov s PCR (polimerazo) verižna reakcija).
7. Citologija se redko uporablja, vendar so pri nekaterih okužbah te virološke raziskovalne metode zelo učinkovite. Pregledajo se biopsijski materiali, obdukcije in brisi, obdelani za barvanje in analizo pod mikroskopom.

Kaj je smisel raziskovanja?

Za uspešno izolacijo virusov jemljemo klinični material v skladu s patogenezo in čim prej. Pogosto ta proces zahteva več prehodov pred uporabo določenih viroloških raziskovalnih metod.

Mikrobiologija je preučevanje mikroskopskih bitij. In njeno področje ni le medicina. Je temeljna znanost za Kmetijstvo, veterina, vesoljska in tehnična industrija, geologija.

Seveda pa je vse ustvarjeno za človeka in njegov razvoj na tem čudovitem planetu. Zato je zelo pomembno, da nevarnost pravočasno odkrijemo in jo nevtraliziramo. Virusi se razlikujejo od bakterij. To so strukture, ki vstopijo v telo in povzročijo nastanek nove generacije. Izgledajo kot kristali in so namenjeni nadzoru procesa njihovega razmnoževanja, čeprav se sami ne hranijo, ne rastejo in ne izločajo presnovnih produktov.

Virus lahko povzroči resna bolezen v katerem koli živem organizmu, v katerega vstopi. Poleg tega se lahko razvija. Zato je treba virološke raziskovalne metode v mikrobiologiji razvijati in izboljševati, saj je lahko ogrožena človeška civilizacija kot celota.

Materiali

Za odkrivanje in identifikacijo virusov v medicini se praviloma uporabljajo:

• izpiranje nazofarinksa ( okužbe dihal);
• izpiranje in blato ( enterovirusne okužbe);
• ostružki, vsebina mehurjev (kožne lezije, sluznice, kot je herpes, norice);
• zardevanje (eksantemske okužbe, kot so ošpice, rdečke);
• kri, cerebrospinalna tekočina(arbovirusne okužbe).

Faze

Vse faze virološke raziskovalne metode vključujejo:

• zbiranje gradiva;
• izbira, pridobitev testnega sistema, ugotavljanje njegove sposobnosti preživetja;
• okužba testnega sistema;
• indikacija virusa;
• določitev vrste virusa.

V bistvu se patogeni virusi razlikujejo po prisotnosti tkivne in tipske specifičnosti. Vzemimo za primer poliovirus, ki se razmnožuje samo v primatih (v njihovih celicah). V skladu s tem se za izolacijo določenega virusa uporablja posebna tkivna kultura. če govorimo o o neznanem povzročitelju, bi bilo priporočljivo sočasno okužiti tri ali še bolje štiri celične kulture.

Tako bo morda eden od njih občutljiv. Za ugotavljanje prisotnosti virusa v okuženih kulturah opazujejo razvoj specifične celične degeneracije, intracelularne vključke, identifikacijo specifičnega antigena, pozitivne hemaglutinacijske in hemadsorpcijske reakcije.

Vse virološke raziskovalne metode (neposredne in posredne, serološke) je treba izbrati kot najprimernejše za posamezen primer suma okužbe.

Posredne metode temeljijo na izolaciji in identifikaciji virusa. So delovno intenzivni, zamudni, a natančni.

Serodiagnostika

Ta diagnoza se nanaša na metodo, ki temelji na reakciji antigen-protitelo. Najpogosteje se uporabljajo seznanjeni krvni serumi, odvzeti v nekajtedenskih intervalih. Če se titer protiteles poveča 4-krat ali več, se reakcija šteje za pozitivno. Za določitev tipske specifičnosti virusa se uporablja reakcija nevtralizacije virusa. Za določitev skupinske specifičnosti je potrebno pridobiti reakcijo fiksacije komplementa.

Različne različice encimskega imunskega testa, reakcije inhibicije hemaglutinacije, pasivna hemaglutinacija, reverzna pasivna hemaglutinacija, RIF. Tudi v genski inženiring je bila razvita metoda za proizvodnjo monoklonskih protiteles. Ozko specifičnost monoklonov je mogoče premagati z uporabo več monoklonskih protiteles proti različnim virusnim determinantam. Tako se je povečala specifičnost in občutljivost testa za odkrivanje antigena.

Nekatere funkcije

Danes je bilo ustvarjenih veliko različnih testnih sistemov za imunološko diagnostiko okužb, ki so posledica vstopa virusa v živ organizem.

Tako so virološke raziskovalne metode metode za izolacijo virusov, preučevanje njihovih lastnosti in ugotavljanje njihove etiološke povezave z določenimi boleznimi.

Virološke raziskave vključujejo dve glavni fazi: izolacijo virusov in njihovo identifikacijo. Material za virološke raziskave je lahko kri, druge biološke in patološke tekočine, biopsije organov in tkiv.

Virološke krvne preiskave se pogosto izvajajo za diagnosticiranje arbovirusnih okužb. Virus stekline je mogoče najti v slini, mumps, herpes simpleks, Nazofaringealni brisi se uporabljajo za izolacijo povzročiteljev gripe in drugih akutnih respiratornih virusnih okužb, ošpic. Adenovirusi se odkrijejo v brisih veznice. Iz blata izoliramo različne entero-, adno-, pso-, nora- in rotaviruse.

Za izolacijo virusov se uporabljajo celične kulture, piščančji zarodki in včasih laboratorijske živali.

Večino patogenih virusov odlikuje prisotnost tkivne in tipske specifičnosti; poliovirus se na primer razmnožuje le v celicah primatov, zato se za izolacijo specifičnega virusa uporablja ustrezna tkivna kultura. Za izolacijo neznanega patogena je priporočljivo hkrati okužiti 3-4 celične kulture, ob predpostavki, da je ena od njih občutljiva. Prisotnost virusa v okuženih celičnih kulturah določa razvoj specifične celične degeneracije, tj. citopatogenega delovanja, odkrivanje intracelularnih vključkov, kot tudi na podlagi odkrivanja specifičnega antigena z imunofluorescenco, pozitivnimi reakcijami hemadsorpcije in hemaglutinacije.

Ptičji zarodki so s svojimi slabo diferenciranimi tkivi primerni za gojenje številnih virusov. Največkrat se uporabljajo piščančji zarodki. Pri razmnoževanju v zarodkih lahko virusi povzročijo njihovo smrt (arbovirusi), pojav sprememb v horionsko-alantoični membrani (virusi črnih koz) ali v telesu zarodka, kopičenje glutena v embrionalnih tekočinah (virusi gripe, mumpsa). ) in virusni antigen , ki veže komplement .

Identifikacija virusov se izvaja z imunološkimi metodami: reakcija inhibicije hemaglutinacije, fiksacija komplementa, nevtralizacija, obarjanje v gelu, imunofluorescenca.

Več o temi Virološka metoda:

1. Ocena osnovnih antropometričnih podatkov s parametrično metodo (sigma metoda)
2. Zdravljenje z metodo izumrtja pogojne komunikacije in metodo prisilnega treninga
3. 2. Primerjalnopravna metoda - zasebnoznanstvena metoda pravne znanosti
4. SODOBNE METODE DIAGNOSTIKE IN IZBIRA METODE ZDRAVLJENJA SUBMUKOZNIH MATERNIČNIH FIBROMOV
5. 5.4. Koncept in struktura splošne raziskovalne metode kot metode praktične dejavnosti
6. Tema 8. MIKROBIOLOŠKE METODE ZA PREUČEVANJE VARIABILNOSTI IN MEHANIZMOV PRENOSA DEDNIH INFORMACIJ. UPORABA GENETSKIH METOD ZA STVARANJE NOVIH ZDRAVIL
7. Tema 15. PATOGENECNOST IN VIRULENCA MIKROORGANIZMOV. DEJAVNIKI VIRULENCE. NAČINI OKUŽBE LABORATORIJSKIH ŽIVALI. ANTIGENI, METODE NJIHOVEGA PRIDOBIVANJA. PROTITELESA. IMUNITETNE REAKCIJE IN NJIHOVA PRAKTIČNA UPORABA. FAGOCITOZA

Virološke raziskovalne metode

metode za proučevanje biologije virusov in njihovo identifikacijo. Metode se pogosto uporabljajo v virologiji molekularna biologija, s pomočjo katerega je bilo mogoče ugotoviti molekularno strukturo virusnih delcev, metode njihovega prodiranja v celico in značilnosti virusne reprodukcije, primarno strukturo virusnih nukleinskih kislin in proteinov. Razvijajo se metode za določanje zaporedja sestavnih elementov virusnih nukleinskih kislin in beljakovinskih aminokislin. Funkcije nukleinskih kislin in proteinov, ki jih kodirajo, postane mogoče povezati z nukleotidnim zaporedjem in ugotoviti vzroke znotrajceličnih procesov, ki igrajo pomembno vlogo v patogenezi virusne okužbe.

Virološke raziskovalne metode temeljijo tudi na imunoloških procesih (interakcija antigena s protitelesi), bioloških lastnostih virusa (sposobnost hemaglutinacije, hemolize, encimsko aktivnost), značilnosti interakcije virusa z gostiteljsko celico (narava citopatskega učinka, tvorba znotrajceličnih vključkov itd.).

Pri diagnostiki virusnih okužb, pri gojenju, izolaciji in identifikaciji virusov ter pri izdelavi pripravkov cepiva se široko uporablja metoda tkivnih in celičnih kultur. Uporabljajo se primarne, sekundarne, stabilne kontinuirane in diploidne celične kulture. Primarne kulture dobimo z dispergiranjem tkiva s proteolitičnimi encimi (tripsin, kolagenaza). Vir celic so lahko tkiva in organi (običajno ledvice) človeških in živalskih zarodkov. Suspenzijo celic v hranilnem mediju namestimo v tako imenovane vzmetnice, stekleničke ali petrijevke, kjer se celice po pritrditvi na površino posode začnejo razmnoževati. Za virusno okužbo se običajno uporablja celični monosloj. Hranilno tekočino odlijemo, dodamo virusno suspenzijo v določenih razredčinah in po stiku s celicami dodamo svež hranilni medij, običajno brez seruma.

Celice večine primarnih kultur je mogoče subkultivirati; takšno kulturo imenujemo sekundarna kultura. Z nadaljnjim prehodom celic nastane populacija fibroblastom podobnih celic, ki so sposobne hitrega razmnoževanja, večina ki ohranja originalni nabor kromosomov. To so tako imenovane diploidne celice. S serijskim gojenjem celic dobimo stabilne kontinuirane celične kulture. Med prehodi se pojavijo hitro deleče se homogene celice s heteroploidnim nizom kromosomov. Stabilne celične linije so lahko enoslojne ali suspenzijske. Enoslojne kulture rastejo v obliki neprekinjenega sloja na stekleni površini, medtem ko suspenzijske kulture rastejo v obliki suspenzij v različnih posodah z uporabo mešalnih naprav. Obstaja več kot 400 celičnih linij, pridobljenih iz 40 različne vrsteživali (vključno s primati, pticami, plazilci, dvoživkami, ribami, žuželkami) in ljudje.

Kosi se lahko gojijo v umetnih hranilnih medijih posamezne organe in tkiva (organske kulture). Tovrstne kulture ohranjajo tkivno strukturo, kar je še posebej pomembno za izolacijo in prehod virusov, ki se v nediferenciranih tkivnih kulturah ne razmnožujejo (na primer koronavirusi).

V okuženih celičnih kulturah lahko viruse odkrijemo s spremembami morfologije celic, citopatskimi učinki, ki so lahko specifični, pojavom vključkov, z določanjem virusnih antigenov v celici in v tekočini kulture; ugotavljanje bioloških lastnosti virusnih potomcev v kulturni tekočini in titriranje virusov v tkivni kulturi, piščančjih zarodkih ali občutljivih živalih; z identifikacijo posameznih virusnih nukleinskih kislin v celicah z molekularno hibridizacijo ali akumulacijami nukleinskih kislin s citokemično metodo s fluorescentno mikroskopijo.

Izolacija virusov je delovno intenziven in dolgotrajen proces. Izvaja se za določitev vrste ali različice virusa, ki kroži med populacijo (na primer za identifikacijo serovariant virusa gripe, divjega ali cepnega seva virusa otroške paralize itd.); v primerih, ko je treba izvesti nujne epidemiološke ukrepe; ko se pojavijo nove vrste ali različice virusov; če je potrebno, potrdite predhodno diagnozo; za označevanje virusov v predmetih okolju. Pri izolaciji virusov se upošteva možnost njihove obstojnosti v človeškem telesu, pa tudi pojav mešane okužbe, ki jo povzročata dva ali več virusov. Genetsko homogeno populacijo virusa, pridobljeno iz enega viriona, imenujemo virusni klon, postopek pridobivanja pa kloniranje.

Za izolacijo virusov se uporablja okužba dovzetnih laboratorijskih živali in piščančjih zarodkov, najpogosteje pa se uporablja tkivna kultura. Prisotnost virusa se običajno določi s specifično celično degeneracijo (citopatski učinek), tvorbo simplastov in sincitijev, detekcijo znotrajceličnih vključkov, pa tudi s specifičnim antigenom, odkritim z imunofluorescenco, hemadsorpcijo, hemaglutinacijo (pri hemaglutinirajočih virusih) itd. . Te znake je mogoče odkriti šele po 2-3 prehodih virusa.

Za izolacijo številnih virusov, kot so virusi influence, se uporabljajo piščančji zarodki, za izolacijo nekaterih virusov Coxsackie in številnih arbovirusov pa se uporabljajo novorojene miši. Identifikacija izoliranih virusov se izvaja s serološkimi reakcijami in drugimi metodami.

Pri delu z virusi se določi njihov titer. Titracija virusov se običajno izvaja v tkivni kulturi, pri čemer se določi največja razredčitev tekočine, ki vsebuje virus, pri kateri pride do degeneracije tkiva, nastanejo vključki in virusno specifični antigeni. Metodo s plaki lahko uporabimo za titriranje številnih virusov. Plaki ali negativne kolonije virusov so žarišča celic, ki jih virus uniči v enoslojni tkivni kulturi pod agarsko prevleko. Štetje kolonij omogoča kvantitativno analizo infekcijske aktivnosti virusov na podlagi tega, da en delec kužnega virusa tvori en plak. Plake odkrijemo z barvanjem kulture z intravitalnimi barvili, običajno nevtralno rdečimi; plaki ne adsorbirajo barvila in so zato vidni kot svetle lise na ozadju obarvanih živih celic. Titer virusa je izražen kot število enot, ki tvorijo plak, na 1 ml.

Čiščenje in koncentracija virusov se običajno izvede z diferencialnim ultracentrifugiranjem, ki mu sledi koncentracijsko ali centrifugiranje z gradientom gostote. Za čiščenje virusov se uporabljajo imunološke metode, ionsko izmenjevalna kromatografija, imunosorbenti itd.

Laboratorijska diagnostika virusnih okužb vključuje odkrivanje povzročitelja ali njegovih sestavin v kliničnem materialu; izolacijo virusa iz tega materiala; serodiagnoza. Izbira metode laboratorijska diagnostika v vsakem posameznem primeru odvisno od narave bolezni, obdobja bolezni in zmožnosti laboratorija. Sodobna diagnostika virusnih okužb temelji na ekspresnih metodah, ki vam omogočajo, da dobite odgovor nekaj ur po odvzemu kliničnega materiala zgodnji datumi po bolezni, Sem spadajo elektronska in imunska elektronska mikroskopija, pa tudi imunofluorescenca, metoda molekularne hibridizacije, odkrivanje protiteles razreda IgM itd.

Elektronska mikroskopija negativno obarvanih virusov omogoča razlikovanje virusov in določanje njihove koncentracije. Uporaba elektronske mikroskopije pri diagnostiki virusnih okužb je omejena na tiste primere, kjer je koncentracija virusnih delcev v kliničnem materialu precej visoka (10 5 v 1). ml in višje). Pomanjkljivost metode je nezmožnost razlikovanja virusov, ki pripadajo isti taksonomski skupini. To pomanjkljivost odpravimo z uporabo imunske elektronske mikroskopije. Metoda temelji na tvorbi imunskih kompleksov z dodajanjem specifičnega seruma virusnim delcem ob hkratni koncentraciji virusnih delcev, kar omogoča njihovo identifikacijo. Metoda se uporablja tudi za odkrivanje protiteles. Za ekspresne diagnostične namene se izvaja elektronsko mikroskopski pregled tkivnih izvlečkov, blata, tekočine iz veziklov in izločkov iz nazofarinksa. Elektronska mikroskopija ki se pogosto uporablja za preučevanje morfogeneze virusa, se njegove zmogljivosti razširijo z uporabo označenih protiteles.

Metoda molekularne hibridizacije, ki temelji na detekciji virusno specifičnih nukleinskih kislin, omogoča detekcijo posameznih kopij genov in ji ni para v občutljivosti. Reakcija temelji na hibridizaciji komplementarnih DNK ali RNK verig (sond) in nastanku dvoverižnih struktur. Najcenejša sonda je klonirana rekombinantna DNK. Sonda je označena z radioaktivnimi prekurzorji (običajno radioaktivnim fosforjem). Obetavna je uporaba kolorimetričnih reakcij. Obstaja več možnosti za molekularno hibridizacijo: točkovna hibridizacija, blot hibridizacija, sendvič hibridizacija, in situ hibridizacija itd.

Protitelesa razreda IgM se pojavijo prej kot protitelesa razreda G (3.-5. dan bolezni) in izginejo po nekaj tednih, zato njihovo odkritje kaže na nedavno okužbo. Protitelesa razreda lgM odkrijemo z imunofluorescenco ali z encimskim imunskim testom z uporabo anti-μ antiserumov (serumi proti težkim verigam lgM).

Serološke metode v virologiji temeljijo na klasičnih imunoloških reakcijah (glej Imunološke raziskovalne metode). : reakcije vezave komplementa, inhibicija hemaglutinacije, biološka nevtralizacija, imunodifuzija, posredna hemaglutinacija, radialna hemoliza, imunofluorescenca, encimski imunski test, radioimunski test. Razvite so bile mikrometode za številne reakcije, njihove tehnike pa se nenehno izboljšujejo. Te metode se uporabljajo za identifikacijo virusov z uporabo niza znanih serumov in za serodiagnostiko za določitev povečanja protiteles v drugem serumu v primerjavi s prvim (prvi serum se vzame v prvih dneh po bolezni, drugi - po 2- 3 tedne). Diagnostična vrednost ima vsaj štirikratno povečanje protiteles v drugem serumu. Če odkrivanje protiteles razreda IgM kaže na nedavno okužbo, potem protitelesa razreda IgC vztrajajo več let, včasih pa celo življenje.

Za identifikacijo posameznih antigenov virusov in protiteles proti njim v kompleksnih mešanicah brez predhodnega čiščenja beljakovin se uporablja imunobloting. Metoda združuje frakcioniranje proteinov z elektroforezo v poliakrilamidnem gelu in kasnejšo imunoindikacijo proteinov z metodo encimskega imunskega testa. Ločevanje proteinov zmanjša zahteve po kemijski čistosti antigena in omogoča identifikacijo posameznih parov antigen-protitelo. Ta naloga je pomembna na primer pri serodiagnostiki okužbe s HIV, kjer so lažno pozitivne reakcije encimskega imunskega testa posledica prisotnosti protiteles proti celičnim antigenom, ki so prisotna zaradi nezadostnega čiščenja virusnih proteinov. Identifikacija protiteles v bolnikovih serumih proti notranjim in zunanjim virusnim antigenom omogoča določitev stadija bolezni, pri analizi populacij pa variabilnost virusnih proteinov. Imunobloting za okužbo s HIV se uporablja kot potrditveni test za identifikacijo posameznih virusnih antigenov in protiteles proti njim. Pri analizi populacij se metoda uporablja za ugotavljanje variabilnosti virusnih proteinov. Velika vrednost metode je v možnosti analize antigenov, sintetiziranih s tehnologijo rekombinantne DNK, ugotavljanju njihove velikosti in prisotnosti antigenskih determinant.