Izvajanje PCR analize (PCR diagnostika) se začne z zbiranjem materiala za pregled pri ginekologu, urologu ali dermatovenereologu. Kakovost in zanesljivost naknadno pridobljenih rezultatov zagotavljajo najvišja usposobljenost in bogate izkušnje zdravnikov Medicinskega centra Euromedprestige, ki upoštevajo vsa potrebna pravila. PCR-analiza: popolna sterilnost, uporaba izključno materialov za enkratno uporabo.

Zbrani material s čopiča damo v posodo s fiziološko raztopino. Po vzorčenju je treba vzorce čim prej dostaviti v PCR laboratorij.

Analiza PCR v laboratoriju poteka v treh fazah:

1. izolacija DNK
2. Pomnoževanje fragmentov DNA
3. Detekcija produktov pomnoževanja DNA

Ekstrakcija DNK je začetna faza diagnostike PCR, katere bistvo je naslednje: zdravnik od pacienta vzame material za raziskavo in ga podvrže posebni obdelavi. Med obdelavo se dvojna vijačnica DNK razdeli na ločene verige. Pacientovemu materialu se doda posebna tekočina, ki raztopi organske snovi, ki motijo ​​"čistost" reakcije. S tem odstranimo lipide, aminokisline, peptide, ogljikove hidrate, beljakovine in polisaharide. Rezultat je DNK ali RNK.

Načelo metode PCR je »zgradnja« novih okužb z DNK ali RNK. Tega ni mogoče storiti brez odstranitve celičnega materiala.

Čas, porabljen za ekstrakcijo DNK, je odvisen od povzročitelja okužbe in vrste materiala, uporabljenega za PCR testiranje. Na primer, priprava krvi za naslednji korak traja 1,5-2 uri.

0Array ( => Analize) Array ( => 2) Array ( =>.html) 2

pomnoževanje DNK

Za izvedbo naslednje stopnje DNK diagnostike - pomnožitve DNK - zdravniki uporabljajo tako imenovane DNK matrice - DNK molekule okužb, na katerih bo nato potekalo "kloniranje" DNK. Omenjeno je bilo že, da ni nujna prisotnost celotne DNK okužbe, za to stopnjo zadostuje majhen delček molekule DNK, ki je značilen samo za ta mikrob (okužbo).

V središču pomnoževanja DNK in s tem v središču celotnega principa reakcije PCR je naravni proces dokončanja DNK za vsa živa bitja - replikacija DNK, ki se izvaja s podvojitvijo ene same verige DNK.

Začenši z enim fragmentom DNK, ga laboratorijski zdravnik kopira in poveča število kopij v verižni reakciji: po prvem ciklu imate že 2 fragmenta, po drugem ciklu - 4, po tretjem - 8, po četrtem - 16, nato 32, 64, 128, 256 ... Z vsakim ciklom se število kopij podvoji, po dvajsetih ciklih gre število v milijone, po tridesetih pa v milijarde. Cikel traja nekaj minut in se zmanjša na določeno spremembo temperaturnega režima v zelo majhnem kemičnem reaktorju. Tukaj so v raztopini v zadostnih količinah vse potrebne sestavine sinteze, najprej nukleotidi A, G, T in C, izvedene pa so bile tudi fine pripravljalne kemične operacije, tako da je bila takoj narejena natančna kopija iz vsak končni segment DNK, nato iz te kopije - spet kopija, to je razvejana verižna reakcija.

S pritrjevanjem primerjev na verigo DNK - umetno sintetiziranih "koščkov" DNK (nukleotidnih parov), podobnih DNK mikrobov (okužba) - nastaneta dve kratki, sestavljeni iz dveh verig odsekov DNK, vijačnici, ki sta potrebni za sintezo prihodnje DNK.

Sinteza nove verige se pojavi z dokončanjem vsake od dveh verig DNK. Postopek pomnoževanja poteka s pomočjo določenega mesta - DNA polimeraze, ki je dala ime laboratorijski metodi. Polimeraza deluje kot katalizator za reakcijo in spremlja zaporedno pritrjevanje nukleotidnih baz na rastočo novo verigo DNK.

Pomnoževanje DNK je torej večkratno povečanje števila kopij DNK, ki so specifične, tj. lastne le določenemu organizmu. Da bi videli povzročitelja okužbe, ni treba dokončati celotne verige DNK. Potreben je samo predel, ki je značilen za to bakterijo kot posameznika.

5360 rubljev. Stroški celovitega programa z gastroenterologom

25% CENEJE NA SPREJEMU KARDIOLOGA

- 25%primarni
Obisk zdravnika
vikend terapevt

5160 rubljev. namesto 5.420 rubljev. Pregled moških za urološke okužbe

ALERGOLOGIJA 5120 rubljev. namesto 5.590 rubljev.

Vsi večkrat ponavljajoči se koraki ojačanja potekajo pri različnih temperaturah. Za analizo PCR se uporablja posebej programabilna oprema - PCR - termostat ali ojačevalnik, ki samodejno spreminja temperature. Pomnoževanje se izvaja po vnaprej določenem programu, ki ustreza vrsti zaznane okužbe. Postopek avtomatske PCR traja od 2 do 3 ure, odvisno od programa in vrste zaznane okužbe.

Pri diagnostiki PCR igra pomembno vlogo usposobljenost laboratorijskega pomočnika, ki izvaja analizo, od tega je odvisna pravilna nastavitev opreme PCR in interpretacija rezultatov. Zdravniki medicinskega centra Euromedprestige imajo bogate izkušnje pri izvajanju DNK diagnostike, kar zagotavlja zanesljivost rezultatov študije in zagotavlja pozitiven uspeh pri zdravljenju. nalezljive bolezni. Opraviti in opraviti PCR teste popolna diagnostika in zdravljenje nalezljivih bolezni pri nas zdravstveni dom Euromedprestige.

Med detekcijo produktov pomnoževanja se nastala mešanica produktov pomnoževanja loči. Mešanici so dodane posebne raztopine, ki fragmentom DNK podelijo sposobnost fluorescence – odboja oranžno-rdečih svetlečih trakov. Nastali sij kaže na prisotnost DNK virusov, mikrobov ali bakterij v materialu, odvzetem pacientu za analizo PCR.

SEI HPE "Krasnoyarsk State Medical Academy

po imenu Yasenetsky Zvezna agencija za zdravje in socialni razvoj »

Oddelek za medicinsko genetiko in klinično nevrofiziologijo IPO

GLAVNA NAČELA METODE

VERIŽNA REAKCIJA POLIMERAZE

Komplet orodij za študente 3-4 tečajev

specialnosti splošna medicina (060101) in

Krasnojarsk - 2007

Shnaider, N. A., Butyanov, R. A. Osnovna načela metode verižne reakcije s polimerazo. Metodološki priročnik za obštudijsko delo študentov 3-4 tečajev specialnosti splošne medicine (060101) in pediatrije (060103). - Krasnojarsk: Založba GOU VPO KrasGMA, 2007. - 42 str.

Metodološki priročnik je v celoti v skladu z zahtevami državnega standarda (2000) in odraža glavne vidike sodobna metoda diagnostiko dedne bolezničlovek - metoda verižne reakcije s polimerazo, temu je prilagojeno učno gradivo izobraževalne tehnologije ob upoštevanju posebnosti usposabljanja v 3-4 tečajih medicinskih in pediatričnih fakultet.

Recenzenti: Vodja oddelka za medicinsko genetiko Državnega izobraževalnega zavoda za visoko strokovno izobraževanje

"Novosibirska državna medicinska univerza Zvezne agencije za zdravje in družbeni razvoj”, doktor medicinskih znanosti, profesor;

replikacija DNK

Predmet študije te metode je deoksiribonukleinska kislina (DNK). DNK je univerzalni nosilec genetske informacije v vseh organizmih, ki obstajajo na Zemlji (z izjemo mikroorganizmov, ki vsebujejo RNA). DNK je dvojna veriga, zvita v vijačnico. Vsaka veriga je sestavljena iz zaporedno povezanih nukleotidov. DNA verige imajo nasprotno smer: 5'-konec ene verige ustreza 3'-koncu druge verige. Edinstvena lastnina DNK je njena sposobnost, da se podvoji. Ta proces se imenuje podvajanje. Replikacija molekule DNA se pojavi v sintetičnem obdobju interfaze. Vsaka od obeh verig "starševske" molekule služi kot predloga za "hčerinsko". Po replikaciji na novo sintetizirana molekula DNA vsebuje eno "materinsko" verigo in drugo - "hčerinsko", na novo sintetizirano (polkonzervativna metoda). Za matrična sinteza za novo molekulo DNK je treba staro molekulo despiralizirati in raztegniti. Replikacija se začne na več mestih v molekuli DNA. Odsek molekule DNA od začetka ene replikacije do začetka druge se imenuje replikon.

Aktiviran je začetek replikacije primerji(semena), sestavljena iz 100-200 baznih parov. Encim DNK helikaza odvije in loči matično vijačnico DNK na dve verigi, na kateri se po principu komplementarnosti s sodelovanjem encima DNK polimeraza sestavijo "hčerinske" verige DNK. Da bi encim začel delovati, je potrebna prisotnost začetnega bloka - majhnega začetnega dvoverižnega fragmenta. Začetni blok nastane, ko oligonukleroza interagira s komplementarno regijo ustrezne verige starševske DNA. V vsakem replikonu se lahko DNA polimeraza premika vzdolž "materne" verige samo v eno smer (5`=>3`).

Na vodilni verigi, ko se replikon odvija, postopoma neprekinjeno raste "hčerinska" veriga. Na zaostali verigi se sintetizira tudi hčerinska veriga v smeri (5`=>3`), vendar v ločenih fragmentih, ko se replikon odvija.

Tako gre pritrditev komplementarnih nukleotidov "hčerinskih" verig v nasprotnih smereh (antiparalelno). Replikacija v vseh replikonih poteka istočasno. Fragmenti in deli "hčerinskih" verig, sintetiziranih v različnih replikonih, so vezani v eno samo verigo z encimsko ligazo. Za replikacijo so značilni polkonzervacija, antiparalelizem in diskontinuiteta. Celoten genom celice se podvoji enkrat na časovno obdobje, ki ustreza enemu mitotičnemu ciklu. Kot rezultat procesa replikacije nastaneta dve molekuli DNK iz ene molekule DNK, pri čemer je ena veriga iz matične molekule DNK, druga, hčerinska, pa je na novo sintetizirana (slika 1).

riž. 1. Diagram replikacije molekule DNA.

Tako cikel replikacije DNK vključuje tri glavne stopnje:

1. odvijanje vijačnice DNA in razhajanje verig (denaturacija);

2. pritrditev temeljnih premazov;

3. zaključek verige podrejene niti.

Princip metode PCR

Osnova PCR je bila replikacija DNK. Pri PCR se zgoraj našteti procesi izvajajo v epruveti v cikličnem načinu. Prehod iz ene stopnje reakcije v drugo se doseže s spreminjanjem temperature inkubacijske mešanice. Ko se raztopina segreje na 93-95°C, pride do denaturacije DNK. Za nadaljevanje naslednjega koraka - dodajanje ali "žarjenje" primerjev - inkubacijsko mešanico ohladimo na 50-65 °C. Nato se mešanica segreje na 70-72°C - optimalno delovanje taq-DNA polimeraze - na tej stopnji je nova veriga DNA dokončana. Nato se cikel znova ponovi. Z drugimi besedami Metoda PCR je večkratno povečanje števila kopij (ojačanje) specifičen del DNA, ki ga katalizira encim DNA polimeraza.

Podaljšanje hčerinskih verig DNK mora potekati istočasno na obeh verigah materine DNK, zato replikacija druge verige prav tako zahteva svoj začetni primer. Tako v reakcijsko zmes vnesemo dva primerja: enega za "+"-verigo, drugega za "-"-verigo. Po združitvi nasprotnih verig molekule DNA se primerji omejijo na njen del, ki se bo nato večkrat podvojil ali pomnožil. Dolžina takega fragmenta, ki ga imenujemo amplikon, je običajno nekaj sto nukleotidov.

koraki PCR

Vsak cikel ojačanja vključuje 3 stopnje, ki se pojavljajo pri različnih temperaturnih pogojih (slika 2).

· 1. stopnja: denaturacija DNK . Teče pri 93-95° 30-40 sekund.

· 2. stopnja: temeljno žarjenje . Pritrditev primerja se pojavi komplementarno ustreznim zaporedjem na nasprotnih verigah DNA na mejah določenega mesta. Vsak par primerjev ima svojo temperaturo žarjenja, katere vrednosti so v območju 50-65°C. Čas žarjenja 20-60 sek.

· 3. stopnja: podaljševanje verig DNA. Komplementarno podaljševanje verig DNA se pojavi od 5" konca do 3" konca verige v nasprotnih smereh, začenši od pritrdilnih mest primerja. Material za sintezo novih verig DNK so deoksiribonukleozid trifosfati, dodani raztopini. Proces sinteze katalizira encim taq-polimeraza in poteka pri temperaturi 70-72°C. Čas sinteze - 20-40 sek.

Nove verige DNA, ki nastanejo v prvem ciklu pomnoževanja, služijo kot predloge za drugi cikel pomnoževanja, v katerem nastane specifičen fragment pomnoževanja DNA (slika 3). V naslednjih ciklih pomnoževanja služijo amplikoni kot predloga za sintezo novih verig.

Tako pride do kopičenja amplikonov v raztopini v skladu s formulo 2", kjer je n število ciklov pomnoževanja. Torej, tudi če je bila na začetku v začetni raztopini samo ena dvoverižna molekula DNA, potem približno 108 molekul pomnožev v raztopini se kopiči v 30-40 ciklih.Ta količina zadošča za zanesljivo vizualno detekcijo tega fragmenta z elektroforezo v agaroznem gelu.

Postopek ojačanja se izvaja v posebnem programabilnem termostatu ( kolesar), ki glede na dani program samodejno spreminja temperature glede na število ciklov ojačanja.

Za ojačanje so potrebne naslednje komponente:

· DNK šablona(DNK ali njen del, ki vsebuje želeni specifični fragment);

· Primerji(sintetični oligonukleotidi (20-30 nukleotidnih parov) komplementarni zaporedjem DNA na mejah določenega fragmenta, ki ga določamo). Izbira specifičnega fragmenta in izbor primerjev igrata pomembno vlogo pri specifičnosti pomnoževanja, kar vpliva na kakovost analize.

· Mešanica deoksinukleotid trifosfatov (dNTP)(mešanica štirih dNTP, ki so material za sintezo novih komplementarnih verig DNK v ekvivalentnih koncentracijah 200-500 mikronov)

· EncimTaq- polimeraza(termostabilna DNA polimeraza, katalizira podaljševanje začetnih verig z zaporednim dodajanjem nukleotidnih baz v rastočo verigo sintetizirane DNA, 2-3 mm).

· puferska raztopina(reakcijski medij, ki vsebuje Mg2+ ione, potrebne za vzdrževanje encimske aktivnosti, PH 6,8-7,8).

Za določitev specifičnih regij genoma virusov RNA se najprej pridobi kopija DNA iz predloge RNA z reakcijo reverzne transkripcije (RT), ki jo katalizira encim reverzna transkriptaza (reverzna transkriptaza).

riž. 2. Ojačitev (1. cikel).

riž. 3. Ojačitev (2. cikel).

Glavne uporabe PCR

klinična medicina:

o diagnoza okužb,

o odkrivanje mutacij, vključno z diagnozo dednih bolezni,

o genotipizacija, vključno z genotipizacijo HLA,

o celične tehnologije

ekologija (kot način spremljanja stanja in kakovosti okoljskih predmetov in hrane)

definicija transgenih organizmov (GSO)

Osebna identifikacija, očetovstvo, forenzika

splošna in posebna biologija,

Osnovna načela

organizacija diagnostičnih laboratorijev

Delo v laboratoriju PCR poteka v skladu s "Pravili za načrtovanje, varnost, industrijsko sanitarijo, protiepidemični režim in osebno higieno pri delu v laboratorijih (oddelkih, oddelkih) sanitarnih in epidemioloških ustanov zdravstvenega sistema.

Kontaminacija vzorcev DNK

Izvajanje PCR diagnostike je povezano s težavo, ki jo povzroča visoka občutljivost metode – možnost kontaminacija. Če v reakcijsko epruveto pridejo sledi pozitivne DNA (specifični produkti pomnoževanja DNA – amplikoni; standard DNA, ki se uporablja kot pozitivna kontrola; pozitivna DNA kliničnega vzorca), pride do pomnoževanja specifičnega fragmenta DNA med PCR in posledično do pojav lažno pozitivnih rezultatov.

Med delom se lahko srečate dve vrsti kontaminacije:

1. navzkrižna kontaminacija od vzorca do vzorca (med obdelavo kliničnih vzorcev ali pri izkopavanju reakcijske zmesi), kar vodi do pojava občasnih lažno pozitivnih rezultatov;

2. kontaminacija produkta ojačanja(amplikoni), ki imajo najvišjo vrednost, saj se med PCR postopkom pomnoži kopičijo v ogromnih količinah in so idealni produkti za ponovno pomnoževanje.

Kontaminacija posod, avtomatskih pipet in laboratorijske opreme, površine laboratorijskih miz ali celo površine kože laboratorijskih delavcev s sledovi pomnožev povzroči pojav sistematičnih lažno pozitivnih rezultatov. Določitev vira kontaminacije je lahko zelo težavna in zahteva veliko časa in denarja. Dosedanje izkušnje z delom laboratorijev, ki uporabljajo diagnostično metodo PCR, nam omogočajo oblikovanje osnovnih zahtev za organizacijo takih laboratorijev in izvajanje samih analiz. Skladnost s temi zahtevami odpravlja možnost kontaminacije in pridobitev lažno pozitivnih rezultatov.

Faze analize PCR

Geografsko ločeni in postavljeni v ločene prostore (slika 4.5):

· Pre-PCR soba, kjer se izvaja obdelava kliničnih vzorcev, ekstrakcija DNA, priprava reakcijske zmesi za PCR in PCR (če so na voljo pogoji, je tudi zadnja dva koraka priporočljivo izvesti v dodatnem ločenem prostoru). V teh prostorih je prepovedano izvajati vse druge vrste dela s proučevanimi povzročitelji, katerih PCR diagnostika se izvaja v tem laboratoriju.

· Post-PCR soba, kjer se izvaja detekcija produktov pomnoževanja. V tej sobi se lahko uporabljajo druge metode odkrivanja. Zaželeno je, da se prostor za detekcijo produktov pomnoževanja nahaja čim dlje od prostorov pred PCR.

Delovne sobe so opremljene z ultravijoličnimi žarnicami z maksimalnim sevanjem v območju 260 nm (tip DB-60) s hitrostjo 2,5 W na 1 m3. Svetilke so nameščene tako, da so površine delovnih miz, opreme in materialov, s katerimi pride operater v stik med analizo PCR, izpostavljene neposrednemu sevanju. Obsevanje se izvaja 1 uro pred začetkom dela in 1 uro po koncu dela.

Laboratorijski zdravniki delajo v posebnih laboratorijskih oblačilih, ki se menjajo ob prehodu iz enega prostora v drugega, in v rokavicah za enkratno uporabo. Obdelava oblačil iz različnih prostorov poteka ločeno. Na različnih stopnjah analize PCR delajo različni zaposleni.

Za delo se uporabljajo ločeni kompleti dozatorjev, plastična in steklena posoda, laboratorijska oprema, halje in rokavice, ki so namenjeni za različne faze analize in niso prenosljivi iz enega prostora v drugega. Oprema, materiali in inventar v vsaki sobi so ustrezno označeni.

Vse faze dela se izvajajo samo z uporabo potrošnega materiala za enkratno uporabo: konice za avtomatske pipete, epruvete, rokavice itd. Pri prehodu od vzorca do vzorca obvezno zamenjajte konice. Da bi preprečili vstop mikrokapljic raztopine v pipeto, je treba uporabiti konice z aerosolnim pregradnim filtrom. Uporabljene tube in konice odvržemo v posebne zabojnike ali zabojnike, ki vsebujejo razkužilna raztopina. Klinični vzorci so shranjeni ločeno od reagentov.

Za obdelavo in čiščenje delovnega mesta ima vsaka soba bombažne gaze (serviete), pincete, razkužila in inaktivacijske raztopine.

V PCR diagnostičnem laboratoriju je izključeno delo v zvezi s proizvodnjo (kloniranjem) in izolacijo rekombinantnih plazmidov, ki vsebujejo zaporedja DNA ali genske fragmente patogenov, ki se diagnosticirajo v tem laboratoriju.

Zbiranje kliničnega materiala

Študirani material za PCR so lahko ostanki epitelijskih celic, kri, plazma, serum, plevralna in cerebrospinalna tekočina, urin, sputum, sluz in drugi biološki izločki, vzorci biopsije.

Vzorčenje materiala se izvaja v pogojih sobe za zdravljenje ustreznega profila. Po vzorčenju je treba vzorce čim prej odnesti v PCR diagnostični laboratorij.

Vzorčenje je treba opraviti s sterilnimi, po možnosti za enkratno uporabo, instrumenti samo v sterilnih plastičnih ali steklenih epruvetah za enkratno uporabo, predhodno eno uro obdelanih z mešanico kroma, temeljito opranih z destilirano vodo in kalciniranih v pečici pri temperaturi 150 ° C za 1 uro.

Območje zaznavanja (drugo nadstropje ali druga zgradba).

riž. 4. Laboratorijska naprava PCR z detekcijo z elektroforezo.

Območje zaznavanja (različno nadstropje ali stavba)

riž. 5. PCR laboratorijska naprava s fluorescentno detekcijo (kvantitativna analiza).

riž. 6. Soba za ekstrakcijo DNK. Prikazana je namizna škatla z baktericidno svetilko.

riž. 7. ojačitvena soba.

riž. 8. Soba za odkrivanje.

riž. 9. Vzorci krvi za DNK diagnostiko dednih bolezni.

Shranjevanje in transport vzorcev

Za diagnostiko dednih bolezni se vzorci krvi dlje časa hranijo na posebnih papirnatih obrazcih ali v epindorfih (plastičnih epruvetah) v zamrznjenem stanju (slika 9).

Za diagnozo nalezljivih bolezni se vzorci hranijo pri sobni temperaturi največ 2 uri. Če je potrebno daljše shranjevanje, lahko vzorce postavite v hladilnik pri temperaturi 2-8 °C za največ 24 ur. Daljše skladiščenje (do 2 tedna) je sprejemljivo pri zamrzovanju v zamrzovalniku pri temperaturi minus 20°C. Ponavljajoče zamrzovanje-odmrzovanje vzorcev ni dovoljeno.

Če sta diagnostični laboratorij PCR in prostor za vzorčenje teritorialno ločena, je treba vzorce prevažati v termosih ali termičnih posodah v skladu s pravili za shranjevanje vzorcev in pravili za prevoz kužnega materiala.

Ekstrakcija DNK iz vzorcev

Metoda trdne faze sorpcije, ki je sestavljena iz dodajanja lizirnega sredstva, ki vsebuje raztopino gvanidina, sorpcije DNA na sorbentu, ponavljajočega izpiranja in resorpcije DNA s pufrsko raztopino, je postala razširjena. V primeru obdelave seruma, plazme ali polne krvi se običajno uporablja metoda fenolne ekstrakcije. Metoda vključuje deproteinizacijo s fenolom/kloroformom, ki ji sledi obarjanje DNK (ali RNK) z etanolom ali izopropanolom. Obdelava poteka v mikrocentrifugiranih epruvetah tipa Eppendor P s prostornino 1,5 ml. Čas obdelave je 1,5-2 uri (slika 10).

riž. 10. Izolacija DNK.

Izvajanje PCR

Določeno količino vzorca iz obdelanega kliničnega vzorca prenesemo v posebno mikrocentrifugirno epruveto tipa Eppendorf s prostornino 0,2 ali 0,5 ml, dodamo mešanico za pomnoževanje, ki jo sestavljajo voda, PCR pufer, raztopina dNTP, raztopina primerja in raztopina. ista epruveta Taq-polimeraza (mešanici dodana zadnja) Običajno je volumen reakcijske zmesi 25 µl Nato se v vsako epruveto doda ena kapljica mineralnega olja, da se prepreči izhlapevanje reakcijske zmesi med pomnoževanjem Epruvete se prenesejo v programabilni termostat (ojačevalnik), kjer se ojačanje izvaja v avtomatskem načinu po danem programu (slika 11).

riž. enajst. ojačevalnik" Termociklist ».

Reakcijski čas, odvisno od danega programa, je 2-3 ure. Vzporedno z eksperimentalnimi vzorci so postavljeni kontrolni vzorci: pozitivna kontrola vključuje vse sestavine reakcije, vendar namesto materiala kliničnega vzorca uvedemo kontrolni pripravek DNK proučevanega gena. Negativna kontrola vključuje vse sestavine reakcije, le da se namesto kliničnega materiala ali preparata DNK doda ustrezna količina deionizirane vode ali ekstrakta, ki ne vsebuje preučevane DNK. Negativna kontrola je potrebna za preverjanje komponent reakcije glede odsotnosti DNK zaradi kontaminacije in za izključitev lažno pozitivnih rezultatov.

Registracija rezultatov

Pomnoženi specifični fragment DNA zaznamo z elektroforezo v agaroznem gelu v prisotnosti etidijevega bromida. Etidijev bromid tvori stabilno intersticijsko spojino s fragmenti DNA, ki se pokažejo kot svetleči trakovi, ko gel obsevamo z UV sevanjem z valovno dolžino 290-330 nm. Odvisno od velikosti nastalih amplikonov PCR se uporabi gel, ki vsebuje 1,5 % do 2,5 % agaroze. Za pripravo agaroznega gela v mikrovalovni pečici ali vodni kopeli stopimo mešanico agaroze, pufra in vode ter dodamo raztopino etidijevega bromida. Ohlajeno na 50-60°C zmes vlijemo v kalup s plastjo 4-6 mm debelo in s posebnimi glavniki naredimo v gelu žepke za nanos vzorca. Glavniki so nastavljeni tako, da med dnom vdolbinic in osnovo gela ostane plast agaroze 0,5-1 mm. Ko se gel strdi, se na žepke nanese amplifikat v količini 5-15 µl. Priporočljivo je izvajati elektroforezo mešanice označevalcev dolžin fragmentov DNA vzporedno s kontrolnimi in poskusnimi vzorci. Običajno taka mešanica vsebuje deset fragmentov DNK s 100, 200, 300 itd. dolgimi baznimi pari.

Nastavitev takega vzorca vam omogoča preverjanje dolžine amplikonov v kontrolnih in poskusnih vzorcih. Gel z nanešenim vzorcem prenesemo v komoro za elektroforezo, napolnjeno s pufrom, komoro priključimo na vir napajanja in izvajamo elektroforetsko ločevanje produktov pomnoževanja 30-45 minut pri električni poljski jakosti 10-15 V/cm. V tem primeru mora sprednji del barvila, ki je del reakcijske mešanice, preiti vsaj 3 cm.

Po končani elektroforezi gel prenesemo v steklo transiluminatorja in ga opazujemo v ultravijolični svetlobi. Za dokumentacijo gel fotografiramo na film Mikrat 300 ali posnamemo z video sistemom, povezanim z računalnikom.

Najprej se ocenijo kontrolni vzorci. V elektroforetskem pasu, ki ustreza pozitivni kontroli, mora biti prisoten oranžen svetleč pas. Njegova elektroforetska mobilnost mora ustrezati dolžini amplikona, ki je navedena v navodilih.

V elektroforetski sledi, ki ustreza negativni kontroli, ne sme biti takega pasu. Prisotnost takega pasu v negativni kontroli kaže na kontaminacijo – kontaminacijo uporabljenih reagentov s proučevano DNK ali pomnožekom. Preskusni vzorci se ocenjujejo glede na prisotnost traku na ustreznem pasu, ki se nahaja na isti ravni kot trak v vzorcu pozitivne kontrole. Intenzivnost sijaja pasu ustreza količini proučevane DNK v vzorcu, kar omogoča polkvantitativno oceno PCR. Običajno se pozitivni rezultati ocenjujejo na štiristopenjski lestvici. Če je sij traku v poskusnem vzorcu zelo šibek, je treba tak vzorec preurediti (slika 12).

riž. 12. Elektroforeza v agaroznem gelu.

Vloge PCR zadiagnostika točkastih mutacij in genskih polimorfizmov

Eno vodilnih področij uporabe PCR v praktičnem zdravstvu je diagnostika točkovnih mutacij in genskih polimorfizmov. . Obstajajo neposredne in posredne metode diagnostike DNK. V primerih, ko je znan gen, katerega poškodba vodi v nastanek dedne bolezni, je to poškodbo mogoče odkriti z molekularno genetskimi metodami. Takšne metode se imenujejo neposredne. Z neposrednimi metodami ugotavljamo motnje v primarnem nukleotidnem zaporedju DNK (mutacije in njihove vrste). Za neposredne metode je značilna natančnost, ki doseže skoraj 100%.

Vendar pa je v praksi te metode mogoče uporabiti pod določenimi pogoji.:

z znano citogenetsko lokalizacijo gena, odgovornega za nastanek dedne bolezni;

Gen bolezni je treba klonirati in poznati njegovo nukleotidno zaporedje.

Cilj neposredne diagnostike DNK je identificirati mutirane alele.

Tako se v tistih situacijah, ko je znano, kakšna poškodba DNK vodi v dedno bolezen, neposredno pregleda fragment DNK, ki vsebuje poškodbo, torej se uporabi neposredna metoda DNK diagnostike.

Vendar do danes geni številnih bolezni niso bili preslikani, njihova ekson-intronska organizacija ni znana in številne dedne bolezni značilna izrazita genetska heterogenost, ki ne omogoča popolne uporabe neposrednih metod diagnostike DNK. Zato se v primerih, ko lokalizacija poškodbe ni znana, uporablja drugačen pristop, povezan s preučevanjem bližine gena, odgovornega za gensko bolezen, v kombinaciji z družinsko analizo, to je posrednimi metodami molekularno genetske diagnoze. dednih bolezni uporabljajo.

Uporablja se lahko za odkrivanje točkovnih mutacij in majhnih izbrisov različne načine, vendar vse temeljijo na uporabi metode PCR. Ta reakcija vam omogoča, da večkrat pomnožite nukleotidno zaporedje DNA in nato poiščete mutacije. Metode za iskanje fragmentov DNK, ki nosijo mutacije, temeljijo na primerjalna analiza mutantnih in normalnih nukleotidnih sekvenc DNA.

Analiza produktov PCR

v procesu neposredne DNK diagnostike

Vključuje preučevanje posebnih značilnosti pomnožene regije gena. Tako se pri boleznih, ki jih povzroča ekspanzija trinukleotidnih ponovitev, produkti pomnoževanja razlikujejo po dolžini (kar odraža različno število trojčkov v proučevanem genskem območju) in posledično po hitrosti gibanja v gelu. Zaradi tega je dosežena jasna elektroforetska ločitev normalnih in mutantnih alelov ter natančna določitev patološko podaljšanega fragmenta, tj. DNK diagnoza bolezni (slika 13).

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width="417" height="110 src=">

riž. 14. Diagnoza izbrisa GAG v genu DYT 1 pri bolnikih z od dope neodvisno distonijo (elektroforeza v poliakrilamidnem gelu). Skladbe 2,3,6 - bolan; pasovi 1,4,5 - nadzor. Tanka puščica označuje normalni alel, krepka puščica označuje mutantni krajši alel (delecija treh nukleotidov).

Če je proučevana regija DNA v celoti vključena v razširjeno delecijo, potem PCR pomnoževanje DNA iz tega izbrisanega alela ne bo izvedeno zaradi pomanjkanja mest za hibridizacijo primerjev. V tem primeru bo homozigotna delecija diagnosticirana na podlagi popolne odsotnosti PCR produkta reakcije (sinteza DNK je nemogoča iz obeh kopij gena). S heterozigotno delecijo je mogoče zaznati produkt PCR, sintetiziran iz normalnega (varnega) alela, vendar je za zanesljivo diagnozo takšne mutacije potrebna uporaba bolj sofisticiranih metod vizualizacije DNA, ki omogočajo oceno odmerka končnega alela. PCR produkt.

Za odkrivanje točkovnih mutacij (najpogosteje nukleotidnih substitucij) na določenih mestih se metoda PCR uporablja v kombinaciji z drugimi metodami molekularno genetske analize. Če sta lokacija in narava predlagane točkovne mutacije natančno znani, potem za namensko odkrivanje takšne mutacije, restrikcijske endonukleaze (restriktaze) so posebni celični encimi, izolirani iz različnih sevov bakterij.

Ti encimi prepoznajo specifična nukleotidna zaporedja, dolga od štiri do deset nukleotidov. Nato izvedejo restrikcijo (lat. (rezanje) teh zaporedij kot del dvoverižne molekule DNK. Vsak restrikcijski encim prepozna in na določenem mestu prereže strogo določeno, specifično nukleotidno zaporedje – restrikcijsko mesto (prepoznavno mesto).

V primerih, ko točkovna mutacija spremeni naravno mesto prepoznave za določen restrikcijski encim, ta encim ne bo mogel odcepiti mutantnega fragmenta, pomnoženega s PCR. V nekaterih primerih mutacija vodi do pojava novega prepoznavnega mesta za določen restrikcijski encim, ki ga v normi ni.

V obeh primerih bodo mutirani in normalni produkti PCR, obdelani z izbranim restrikcijskim encimom, dali restrikcijske fragmente različnih dolžin, ki jih je mogoče zlahka zaznati z elektroforezo (slika 15).

Če je torej treba hitro zaznati katero koli točkovno mutacijo, se naloga zmanjša na iskanje ustreznega restrikcijskega encima, katerega prepoznavno mesto je lokalizirano na mestu motenega nukleotidnega zaporedja. Obdelava produktov PCR s tem restrikcijskim encimom bo omogočila enostavno diferenciacijo normalnih in mutantnih alelov. Restrikcijska analiza močno poenostavi odkrivanje znanih točkovnih mutacij in se trenutno pogosto uporablja za neposredno diagnozo DNK dednih bolezni.

končna faza molekularno genetska analiza mutacij je določitev nukleotidnega zaporedja proučevanega fragmenta DNA (sekvenciranje), ki se primerja z normo in se oblikuje končna genetska diagnoza. Zahvaljujoč napredku v molekularni genetiki so bile razvite DNK diagnostične metode za več kot 400 dednih bolezni.

riž. 15. Odkrivanje točkovne mutacije z uporabo restrikcijske analize: A - območje gena, ki ga je mogoče pomnožiti in vsebuje restrikcijsko mestoAGCTza restrikcijsko endonukleazoAlu jaz. MutacijaG→ Aspremeni to nukleotidno zaporedje, kar povzroči restrikcijski encimAluiblokiran; B - elektroferogram restrikcijskih produktov: steza 1 - homozigotnost za normalni alel; pas 2, homozigotnost za mutacijo; pas 3 - heterozigotno stanje (normalen alel + mutacija).

Diagnostika dednih bolezni, ki temelji na neposrednem pregledu mutantnih alelov pri bolnikih, njihovih družinskih članih ali domnevnih heterozigotnih nosilcih patoloških mutacij, je primerna za predsimptomatsko in prenatalno diagnostiko, ki jo lahko uporabimo že v najzgodnejših fazah razvoja ploda, pred pojavom kakršne koli klinične ali biokemične simptome.

Ne glede na metodo odkrivanja mutacij je natančno molekularno karakterizacijo vsake mutacije mogoče dobiti le z neposrednim sekvenciranjem. Za avtomatizacijo tega procesa se v zadnjih letih pogosto uporabljajo posebne naprave - sekvencerji, ki omogočajo znatno pospešitev procesa branja informacij o DNK.

Pot za širšo uporabo molekularno bioloških raziskav v kliničnih diagnostičnih laboratorijih odpira pospešitev analiznega procesa z izvajanjem vseh postopkov v enem kontinuumu, brez prenosa vzorca, ustvarjanjem pogojev za preprečevanje kontaminacije pri vzporednem testiranju več analitov in z objektivno registracijo. rezultatov v vsakem ciklu.

Glavne modifikacije metode PCR

Uporablja se za hitro skeniranje in iskanje znanih genskih mutacij.

Multipleks (multiprimer) PCR

Ta metoda temelji na hkratnem pomnoževanju več eksonov proučevanega gena v eni reakciji. To omogoča ekonomično hitro presejanje najpogostejših mutacij. Na primer, za hitro diagnosticiranje prenašanja delecij v genu za distrofin pri bolnikih s progresivno Duchenne/Beckerjevo mišično distrofijo se izvede sočasno pomnoževanje niza najpogosteje mutirajočih eksonov tega gena. Ker so te bolezni podedovane recesivno vezano na X in so povezane s poškodbo edinega kromosoma X pri dečkih, bo v primeru podaljšane delecije elektroforeza produktov reakcije pokazala odsotnost enega ali več fragmentov DNA (eksonov). ), kar lahko služi kot molekularna potrditev diagnoze. Poleg tega je z izbiro specifičnih genskih regij za pomnoževanje PCR možna dokaj natančna ocena celotne dolžine delecije in prelomnih točk gena (do eksona).

Kombinirana uporaba več multipleksnih reakcij omogoča diagnosticiranje do 98 % vseh izbrisov, ki se pojavijo pri bolnikih s progresivno Duchenne/Beckerjevo mišično distrofijo. To je približno 60 % celotnega števila znanih mutacij v genu za distrofin in kaže na zelo visoko učinkovitost te presejalne metode za DNK diagnozo distrofinopatije (slika 16).

riž. 16. Direktna DNK diagnostika Duchennove mišične distrofije z uporabo multipleks PCR (elektroforeza v agaroznem gelu). Pri vsakem od pregledanih posameznikov so bili hkrati pomnoženi štirje eksoni gena za distrofin (eksoni 17, 19, 44 in 45; puščice označujejo ustrezne produkte pomnoževanja). Proga 1 - kontrola, steza 2-5 - bolniki z Duchennovo mišično distrofijo z različnimi delecijami gena za distrofin (proga 2 in 5 - delecija eksona 45, steza 3 - delecija eksona 44, steza 4 - delecija eksona 17 in 19 ).

Alel specifično pomnoževanje

Metoda temelji na uporabi dveh neodvisnih parov primerjev za določeno regijo gena: en primer v obeh parih je skupen, drugi primer v vsakem paru pa ima drugačno strukturo in je komplementaren normalni ali mutirani DNA. zaporedje. Kot rezultat takšne reakcije v raztopini se lahko hkrati sintetizirata dve vrsti produktov PCR - normalni in mutirani. Poleg tega zasnova uporabljenih primerjev omogoča jasno razlikovanje normalnih in mutantnih produktov pomnoževanja glede na njihovo molekularno velikost. Ta metoda je zelo jasna in vam omogoča preverjanje homo- in heterozigotnega nosilca mutantnega alela.

Metoda za na mesto usmerjeno modifikacijo pomnožene DNA

Metoda temelji na uporabi v PCR tako imenovanega mismatch primerja (ki ni popolnoma komplementaren matrici), ki se od matričnega zaporedja DNA razlikuje za en nukleotid. Zaradi vključitve navedenega primerja v sestavo mutantnega produkta PCR se v njem oblikuje umetno ustvarjeno restrikcijsko mesto za eno od restrikcijskih endonukleaz, kar omogoča neposredno diagnozo DNK določene znane mutacije z uporabo restrikcijske analize. Ustvarjanje takšnega umetnega restrikcijskega mesta je lahko potrebno, če iskanje ni razkrilo obstoja znanega in dostopnega encima, katerega "naravno" restrikcijsko mesto je prizadeto zaradi pojava proučevane mutacije v molekuli DNA. .

Metoda PCR z reverzno transkriptazo (RT- PCR)

Ta metoda se uporablja v primerih, ko je bolj priročno uporabiti ne genomsko DNA kot predmet študije, temveč bolj kompaktno in informacijsko bogato cDNA, pridobljeno po ustrezni obdelavi vzorcev tkiv, kot je biopsijski material ali celične linije limfocitov, fibroblastov. , itd. Pri tem je pomemben pogoj izražanje (vsaj minimalno) želenega gena v tkivu, ki ga proučujemo.

Na prvi stopnji se izvede reverzna transkripcija mRNA, nastale molekule cDNA pa služijo kot matrica za PCR. Nato se kritična regija cDNA, pomnožena v zadostni količini, podvrže sekvenciranju in drugim metodam presejanja mutacij, neposredni elektroforetski študiji (odkrivanje izbrisov, vstavkov itd.) ali integraciji v ekspresijski sistem, da se pridobi proteinski produkt in njegova neposredna analiza .

Ta metoda je še posebej učinkovita za detekcijo mutacij, ki vodijo v sintezo "okrnjenega" proteina (nonsense mutacije, splicing mutacije, velike delecije) - tako imenovana PTT analiza (Protein Truncation Test). Analiza PTT se običajno uporablja pri preučevanju razširjenih genov z več eksoni, kot je gen za Duchenne/Beckerjevo mišično distrofijo, ataksijo-telangiektazijo ali nevrofibromatozo tipa 1.

PCR v realnem času(PCR v realnem času)

V praktičnem zdravstvu PCR v realnem času postaja vsako leto vse bolj priljubljena diagnostična metoda. Njegova temeljna značilnost je spremljanje in kvantitativna analiza kopičenja produktov verižne reakcije polimeraze ter avtomatska registracija in interpretacija rezultatov. Ta metoda ne zahteva koraka elektroforeze, kar zmanjšuje zahteve za laboratorij PCR. Zaradi prihrankov v proizvodnem prostoru, zmanjšanja števila osebja in povpraševanja po kvantifikaciji DNA/RNA se ta metoda v zadnjih letih uspešno uporablja v največjih sanitarno-epidemičnih, diagnostičnih in raziskovalnih centrih v razvitih državah sveta, zamenjava PCR v sedanji (»klasični«) obliki.

PCR v realnem času uporablja fluorescentno označene oligonukleotidne sonde za odkrivanje DNK med pomnoževanjem. PCR v realnem času omogoča popolno analizo vzorca v 20-60 minutah in je teoretično sposoben zaznati celo eno samo molekulo DNA ali RNA v vzorcu.

riž. 17. PCR v realnem času.

PCR v realnem času uporablja sistem TaqMan za nadzor kinetike PCR neposredno med pomnoževanjem z uporabo resonančnega dušenja fluorescence. Za detekcijo se uporablja sonda, ki nosi fluorofor in dušilec, ki je komplementaren srednjemu delu pomnoženega fragmenta. Ko sta fluorofor in dušilec vezana na oligonukleotidno sondo, opazimo le majhno količino fluorescentne emisije. Med postopkom pomnoževanja zaradi 5'-eksonukleazne aktivnosti polimeraze Taq fluorescentna oznaka preide v raztopino, se sprosti iz bližine dušilnika in ustvari fluorescenčni signal, ki se povečuje v realnem času sorazmerno s kopičenjem ojačati (slika 17).

Glavne prednosti PCR-Real-Time pred PCR z gelsko elektroforezo:

Celotna metoda poteka v eni epruveti;

· Metoda traja 1 uro;

Dovolj 1-2 delovnih sob;

Skupaj s kvalitativno oceno rezultata ga je mogoče kvantificirati (na primer pri predpisovanju protivirusne terapije za aids ali virusni hepatitis je treba poznati virusno obremenitev, tj. količino virusa na 1 enoto, ki zagotavlja resnično -čas PCR);

· Dramatično zmanjša tveganje kontaminacije.

Zaključek

Metoda PCR je ena najpogostejših metod molekularno bioloških raziskav. To metodo bi morali klinični zdravniki smiselno uporabljati, zdravnik, ki se odloči za uporabo PCR pri svojem delu, pa mora imeti določeno znanje o lastnostih in zmožnostih te metode. Drugič, med klinikom in laboratorijem za PCR mora obstajati tesna povratna informacija, ki je potrebna za analizo kompleksnih primerov in razvoj pravilne diagnostične strategije. Tretjič, analiza PCR ni zdravilo za diagnozo (predvsem nalezljivih bolezni) in ne nadomešča obstoječih raziskovalnih metod, ampak jih le dopolnjuje. In kar je najpomembneje, PCR ne more nadomestiti intuicije in analitičnega razmišljanja, ki ju mora imeti zdravnik, ki pričakuje uspeh.

p . S . Molekularno-biološke raziskave - sprememba referenčnih točk diagnostike in zdravljenja. Uporaba molekularno bioloških metod je povezana z možnostjo korenite spremembe poudarkov v laboratorijski diagnostiki. Ne moremo govoriti le o pravočasni informaciji, ampak o njenem vnaprejšnjem prejemu. Če se zdaj laboratorijske študije v večini primerov izvajajo že z napredovalo boleznijo in začetim zdravljenjem, se pričakuje, da bodo podatki molekularno-biološkega laboratorija omogočili prepoznavanje nagnjenosti osebe k določenim vrstam patologije in stopnje občutljivosti na določena zdravila, kar bo omogočila utemeljitev napovednega, preventivnega in personaliziranega značaja medicine prihodnosti.

SPREMEMBA DIAGNOZE IN ŽARIŠČA ZDRAVLJENJA

DEDNE BOLEZNI

Danes V prihodnosti

Diagnoza Genetski potni list

8. Koliko delovnih prostorov je potrebnih za PCR laboratorij s fluorescenčno detekcijo (kvantitativna analiza, Real-Time PCR)?

9. Kaj je odkrivanje?

10. Katere metode DNK diagnostike ločimo?

11. Kateri encim deluje na osnovi PCR?

12. Zakaj mora biti območje zaznavanja ločeno od drugih delovnih območij?

13. Kaj je mesto omejitev?

14. Kakšna je razlika med neposredno metodo DNK diagnostike in posredno?

15. Kaj je sekvenciranje?

16. Kaj je multipleks PCR?

17. Katere vrste mutacij določa PCR?

18. Kaj je kontaminacija?

19. Kaj je bistvo alelno specifične metode pomnoževanja?

20. Pogoji shranjevanja PCR materiala?

21. Katera naprava se uporablja za ojačanje?

22. Kakšna je metoda PCR z reverzno transkriptazo (RT-PCR)?

23. Kaj je material za PCR diagnostiko?

24. Naštejte vrste kontaminacije?

Testi za samostojno učenje

1. Restrikcijske endonukleaze:

a) encimi, ki "razbijejo" DNK na točno določenih mestih;

b) encimi, ki šivajo prelome v molekuli DNA;

c) encimi, ki zagotavljajo spojine, ki izvajajo popravilo DNK.

2. Gensko pomnoževanje:

3. Katera od metod molekularne genetike se uporablja za diagnosticiranje bolezni, ki jih povzroča mutirani gen znanega zaporedja?

a) uporaba specifične restriktaze;

b) neposredno detekcijo z uporabo specifičnih molekularnih sond;

V) analiza družine porazdelitev normalnega polimorfizma dolžine restrikcijskih fragmentov.

4. Sekvenciranje DNK:

a) identifikacijo baznega zaporedja DNA;

b) ponavljajoče se ponavljanje katerega koli segmenta DNK;

c) izolacija fragmenta DNA, ki vsebuje proučevani gen.

5. Vzorce DNK je mogoče pridobiti z uporabo :

b) horionske resice;

c) amnijska tekočina;

d) celice amnijske tekočine;

e) biopsije kože, mišic, jeter,

e) vse je pravilno, razen točke "c",

g) vse je pravilno, razen točke "d",

h) Vse zgoraj navedeno drži.

6. Katere mutacije se diagnosticirajo s PCR?

a) genomski;

b) kromosomski;

c) gen (točka).

7. Primer je:

a) komplementarni del DNK;

b) s sintetičnim oligonukleotidom označeno (radioaktivno ali fluorescentno) zaporedje, ki je komplementarno mutantnemu ali normalnemu genu;

c) oligonukleotid, ki deluje kot "seme" in sproži sintezo polinukleotidne verige na predlogi DNA ali RNA.

8. Kdo je razvil princip metode PCR?

b) K. Mullis

9. Ali se za diagnosticiranje ekspanzije trinukleotidnih ponovitev (dinamični tip mutacij) uporablja metoda PCR?

10. Na katerih področjih se uporablja PCR?

a) klinična medicina;

b) definicija transgenih organizmov (GSO)

c) identifikacija osebe, ugotavljanje očetovstva, kriminalistika

d) vse našteto

d) nič od naštetega.

Primeri odgovorov: 1 - a; 2 - b; 3 - b; 4 - a; 5 - e; 6 - v; 7 - v; 8 - b; 9 – a, 10 – d.

Glavni

1. Bočkova genetika. Moskva. GEOTAR, 2002.

Dodatno

1., Bakharev in zdravljenje prirojenih in dednih bolezni pri otrocih. - Moskva, 2004.

2. DNK diagnostika in medicinsko genetsko svetovanje. - Moskva, 2004.

3. Ginterjeva genetika. - Moskva, 2003.

4. Gorbunov osnove medicinske genetike. - Sankt Peterburg: Intermedica, 1999.

5. J. McGee. Molekularno klinična diagnostika. – Svet, 1999.

6. Menshikov - biološke raziskave v klinični laboratorijski diagnostiki: možnosti problema (predavanja). Klinična laboratorijska diagnostika, št. 3, 2006.

7. Kornienko o delu laboratorija PCR med in-line analizo biološkega materiala. Klinična laboratorijska diagnostika, št. 10, 2006.

8. Organizacija dela PCR laboratorija. Metodična navodila. MU 1.3.1794-03. Glavni sanitarni zdravnik Ruske federacije, 2003.

9. Erlich H. A. PCR tehnologija. – Percin-Elmer Cetus, 1993.

10. Heid C. A., Stevens J. Kvantitativna PCR v realnem času. Genome Res. - št. 6, 1996.

GLAVNA NAČELA METODE

VERIŽNA REAKCIJA POLIMERAZE

Metodološki priročnik za obštudijsko delo študentov 3-4 tečajev specialnosti splošne medicine (060101) in pediatrije (060103).

SEI HPE "Krasnojarska državna medicinska akademija Zvezne agencije za zdravje in socialni razvoj"

Rusija, Krasnojarsk,

Zvezna agencija za izobraževanje

Država izobraževalna ustanova

Vrhovno poklicno izobraževanje

"Karelijska državna pedagoška akademija"

Tečajna naloga na temo:

Verižna reakcija s polimerazo (PCR) in njena uporaba

Izpolnila: študentka Koryagina Valeria Aleksandrovna

Preverila: Karpikova Natalya Mikhailovna

Petrozavodsk 2013

Uvod

1. poglavje Pregled literature

1.5.4 Učinek platoja

1.5.6 Ojačitev

Zaključek

Uvod

Zadnjih dvajset let je zaznamovalo široko uvajanje molekularno genetskih metod v biološke, medicinske in kmetijske vede.

Do začetka sedemdesetih let se je zdelo, da je molekularna biologija dosegla določeno stopnjo popolnosti. V tem obdobju so bili mikroorganizmi glavni predmet molekularno genetskih raziskav. Prehod na evkarionte je raziskovalcem postavil povsem nove probleme, ki jih ni bilo mogoče rešiti z metodami genetske analize, ki so obstajale v tistem času. Preboj v razvoju molekularne genetike je postal mogoč zaradi pojava novega eksperimentalnega orodja - restrikcijskih endonukleaz. V naslednjih letih se je število metod neposredne analize DNK, ki temeljijo na kvalitativno drugačnih pristopih, začelo hitro povečevati.

Sodobne tehnologije so v mnogih primerih omogočile globlje preučevanje fine strukturne in funkcionalne organizacije jedrskih in ekstranuklearnih genomov različnih organizmov. To je bilo še posebej pomembno za razvoj novih metod diagnostike in zdravljenja. razne bolezni. Nič manj pomembna ni bila možnost uporabe dosežkov molekularne genetike v populacijski biologiji in žlahtnjenju za identifikacijo in analizo genetske variabilnosti populacij, sort in sevov, identifikacijo in certificiranje gospodarsko vrednih osebkov, ustvarjanje gensko spremenjenih organizmov in reševanje drugih vprašanj.

Vsaka metoda ima svoje prednosti in slabosti. Univerzalne metode, ki bi rešila vse težave, ki se pojavljajo, ni. Zato je izbira posebne metode za tekoče raziskave ena najpomembnejših faz vsakega znanstvenega dela.

1. poglavje Pregled literature

1.1 Zgodovina odkritja verižne reakcije s polimerazo (PCR)

Leta 1983 je K.B. Mullis in drugi so objavili in patentirali metodo verižne reakcije s polimerazo (PCR), ki naj bi močno vplivala na vsa področja raziskovanja in uporabe nukleinskih kislin. Vrednost te metode za molekularna biologija in genetika se je izkazala za tako veliko in očitno, da je bil avtor po sedmih letih nagrajen Nobelova nagrada v kemiji.

Na začetku uporabe metode, po vsakem ciklu segrevanja-hlajenja, je bilo treba reakcijski mešanici dodati DNA polimerazo, saj je bila inaktivirana pri visoki temperaturi, ki je potrebna za ločevanje verig DNA vijačnice. Reakcijski postopek je bil relativno neučinkovit, zahteval je veliko časa in encimov. Leta 1986 je bila metoda verižne reakcije s polimerazo bistveno izboljšana. Predlagana je bila uporaba DNA polimeraz iz termofilnih bakterij. Ti encimi so se izkazali za termostabilne in so lahko vzdržali številne reakcijske cikle. Njihova uporaba je omogočila poenostavitev in avtomatizacijo PCR. Ena prvih termostabilnih DNA polimeraz je bila izolirana iz bakterij Thermus aquaticusin imenovan Taq- polimeraza.

Možnost pomnoževanja katerega koli segmenta DNA, katerega nukleotidno zaporedje je znano, in pridobivanje le-tega po PCR v homogeni obliki in preparativni količini, naredi PCR alternativno metodo za molekularno kloniranje kratkih fragmentov DNA. Ni treba uporabljati zapletenih metodoloških tehnik, ki se uporabljajo v genski inženiring s konvencionalnim kloniranjem. Razvoj metode PCR je tako močno razširil metodološke možnosti molekularne genetike, še posebej genskega inženiringa, da je korenito spremenil in okrepil znanstveni potencial mnogih njenih področij.

1.2 Različice verižne reakcije s polimerazo (PCR)

· Ugnezdeni PCR- uporablja se za zmanjšanje števila stranskih produktov reakcije. Uporabite dva para primerjev in izvedite dve zaporedni reakciji. Drugi par primerjev pomnoži regijo DNK znotraj produkta prve reakcije.

· Invertirana PCR- se uporablja, ko je znano le majhno območje znotraj želenega zaporedja. Ta metoda je še posebej uporabna, ko je treba po vstavitvi DNK v genom določiti sosednje sekvence. Za izvedbo invertne PCR se izvede serija rezov DNK z restrikcijskimi encimi<#"justify">primer za verižno reakcijo s polimerazo

· Skupinsko specifična PCR- PCR za svojce<#"center">1.3 Verižna reakcija s polimerazo

Verižna reakcija s polimerazo (PCR), ki so jo odkrili sredi osemdesetih let prejšnjega stoletja, lahko v nekaj urah večmilijonsko poveča število kopij izvirnega vzorca. Med vsakim ciklom reakcije se iz originalne molekule tvorita dve kopiji. Vsaka od sintetiziranih kopij DNK lahko služi kot predloga za sintezo novih kopij DNK v naslednjem ciklu. Tako ponavljajoče se ponavljanje ciklov vodi do povečanja števila kopij v geometrijsko napredovanje. Iz izračunov izhaja, da bo število kopij originalne molekule, tudi če je 30 ciklov, več kot 1 milijarda. Tudi če upoštevamo, da se v vsakem ciklu ne podvojijo vsi amplikoni, je skupno število kopij kljub temu precej veliko.

Vsak cikel verižne reakcije s polimerazo (PCR) je sestavljen iz naslednjih korakov:

· Denaturacija – povišanje temperature povzroči, da se dvoverižna molekula DNA odvije in razcepi na dve enoverižni;

· Žarjenje – znižanje temperature omogoča, da se primerji pritrdijo na komplementarne regije molekule DNA;

· Raztezek – encim DNA polimeraza dopolni komplementarno verigo.

Za pomnoževanje izbranega fragmenta uporabimo dva oligonukleotidna primerja (semena), ki obkrožata določeno regijo DNA. Primerno usmerjeno 3 - konča drug proti drugemu in v smeri zaporedja, ki ga je treba ojačati. DNA polimeraza izvaja sintezo (dokončanje) medsebojno komplementarnih verig DNA, začenši s primerji. Med sintezo DNK se primerji fizično vstavijo v verigo na novo sintetiziranih molekul DNK. Vsaka veriga molekule DNA, oblikovana z enim od primerjev, lahko služi kot predloga za sintezo komplementarne verige DNA z uporabo drugega primerja.

1.4 Izvajanje verižne reakcije s polimerazo (PCR)

Verižna reakcija s polimerazo se izvaja v posebnih tankostenskih polipropilenskih epruvetah, ki so po velikosti združljive z uporabljenim termičnim ciklerjem (ojačevalcem) ​​- napravo, ki nadzoruje temperaturne in časovne značilnosti stopenj verižne reakcije s polimerazo (PCR). .

1.5 Princip metode verižne reakcije s polimerazo

Verižna reakcija s polimerazo (PCR) je in vitro metoda pomnoževanja DNK, ki lahko v nekaj urah izolira in pomnoži specifično zaporedje DNK več milijard krat. Možnost pridobitve ogromnega števila izvodov enega strogo določeno območje genoma močno poenostavi preučevanje obstoječega vzorca DNK.

Za izvedbo verižne reakcije s polimerazo morajo biti izpolnjeni številni pogoji:

1.5.1 Prisotnost številnih komponent v reakcijski mešanici

Glavne sestavine reakcijske (PCR) mešanice so: Tris-HCl, KCl, MgCl 2, mešanica nukleotidnih trifosfatov (ATP, GTP, CTP, TTP), primerji (oligonukleotidi), analizirani DNA pripravek, termostabilna DNA polimeraza. Vsaka od komponent reakcijske mešanice je neposredno vključena v verižno reakcijo s polimerazo (PCR), koncentracija reagentov pa neposredno vpliva na potek pomnoževanja.

· Tris-HCl - določa pH reakcijske mešanice, ustvarja pufrsko kapaciteto. Aktivnost DNA polimeraze je odvisna od pH medija, zato vrednost pH neposredno vpliva na potek polimerazne verižne reakcije. Običajno je pH vrednost v območju 8 - 9,5. Visok pH je posledica dejstva, da z naraščanjem temperature pH pufra Tril-HCl pada.

· KCl - koncentracija kalijevega klorida do 50 mm vpliva na potek procesov denaturacije in žarjenja, koncentracija nad 50 mm zavira DNA polimerazo.

· MgCl 2- ker je DNA polimeraza Mg 2+- odvisen encim, potem koncentracija magnezijevih ionov vpliva na aktivnost encima (Mg 2+tvori komplekse z NTP - ti kompleksi so substrat za polimerazo). Visoka koncentracija vodi do povečanja nespecifičnega pomnoževanja, nizka pa do inhibicije reakcije, optimalna (za različne polimeraze) je v območju 0,5 - 5 mM. Poleg tega koncentracija magnezijevih soli vpliva na potek procesov denaturacije in žarjenja - povečanje koncentracije Mg 2+povzroči zvišanje temperature taljenja DNK (tj. temperature, pri kateri se 50 % dvoverižnih verig DNK zlomi v enoverižne verige).

· NTP - nukleotidni trifosfati so neposredni monomeri nukleinskih kislin. Za preprečitev prekinitve verige je priporočljivo enako razmerje vseh štirih nukleotidnih trifosfatov. Nizka koncentracija teh komponent v reakcijski mešanici poveča verjetnost napak pri konstrukciji komplementarne verige DNA.

· Primeri - Najbolj optimalna je uporaba temeljnih premazov z razliko v tališčih največ 2 - 4 o C. Včasih med dolgotrajnim skladiščenjem pri temperaturi 4 o Z ali po velikem številu zamrzovanja - odmrzovanja, primerji tvorijo sekundarne strukture - dimerje, kar zmanjšuje učinkovitost PCR. Odprava tega problema se zmanjša na inkubacijo v vodni kopeli (T=95 o C) 3 minute in nato hitro ohlajanje na 0o Z.

· DNK preparati - količina in kvaliteta DNK preparata (matrice) neposredno vplivata na potek in parametre polimerazne verižne reakcije. Presežek vzorca DNK zavira verižno reakcijo s polimerazo (PCR). nečistoče različne snovi, ki so v pripravku DNA, lahko tudi zmanjšajo učinkovitost verižne reakcije s polimerazo (PCR): natrijev acetat, natrijev klorid, izopropanol, etanol, heparin, fenol, sečnina, hemoglobin itd.

· DNA polimeraza - pri uporabi majhne količine DNA polimeraze opazimo zmanjšanje sinteze končnega produkta neposredno sorazmerno z velikostjo fragmentov. Presežek polimeraze za 2-4 krat vodi do pojava difuznih spektrov in za 4-16-krat nespecifičnih spektrov z nizko molekulsko maso. Razpon uporabljenih koncentracij je 0,5 - 1,5 enote aktivnosti glede na 25 µl mešanice PCR.

Poleg glavnih sestavin mešanice PCR se uporabljajo številne dodatne snovi, ki izboljšujejo kvalitativne in kvantitativne kazalnike PCR: acetamid (5%) - povečanje topnosti glavnih sestavin; betain ( natrijeva sol) - stabilizacija DNA polimeraze, znižanje tališča DNA, izenačenje tališča; goveji albumin (10-100 μg / ml) - stabilizacija DNA polimeraze; dimetil sulfoksid (1-10%) - povečanje topnosti glavnih sestavin; formamid (2-10%) - povečanje specifičnosti žarjenja; glicerol (15-20%) - povečanje toplotne stabilnosti encima, znižanje temperature denaturacije vzorca DNK; amonijev sulfat - znižanje temperature denaturacije in žarjenja.

1.5.2 Cikel in temperatura

Splošni pogled na program verižne reakcije s polimerazo (PCR) je naslednji:

stopnja. Podaljšana primarna denaturacija preparata DNA.1 cikel

stopnja. Hitra denaturacija pripravka DNK. Primerno žarjenje. Raztezek.30 - 45 ciklov.

stopnja. Dolgotrajno raztezanje. Hlajenje reakcijske mešanice 1 cikel.

Vsak element stopnje - denaturacija, žarjenje, raztezek - ima individualne temperaturne in časovne značilnosti. Parametri temperature in časa pretoka vsakega elementa so izbrani empirično, v skladu s kvalitativnimi in kvantitativnimi kazalniki produktov ojačanja.

Denaturacija. Med tem elementom verižne reakcije s polimerazo se dvoverižna molekula DNK razdeli na dve enoverižni. Temperaturni parametri denaturacije so v območju 90 - 95 o C, v primeru vzorca DNK z visoko vsebnostjo gvanina in citozina pa je treba temperaturo povišati na 98 o C. Temperatura denaturacije naj bo zadostna za popolno denaturacijo – cepitev verig DNK in izogibanje "nenadnemu ohlajanju" ali hitremu žarjenju, vendar pa je termostabilna DNK polimeraza pri visokih temperaturah manj stabilna. Tako je izbira optimalnih temperaturnih parametrov denaturacije za razmerje primer/vzorec (priprava DNA) pomemben pogoj za pomnoževanje. Če je temperatura denaturacije v prvem koraku nad 95 o C, je priporočljivo dodati DNA polimerazo v reakcijsko mešanico po primarni denaturaciji. Trajanje tega elementa faze med verižno reakcijo s polimerazo (PCR) bi moralo zadostovati za popolno denaturacijo DNA, vendar hkrati ne bi bistveno vplivalo na aktivnost DNA polimeraze pri dani temperaturi.

Žarjenje. Temperatura žarjenja (T A ) je eden najpomembnejših parametrov verižne reakcije s polimerazo. Temperatura žarjenja za vsak temeljni premaz je izbrana posebej. Odvisno je od dolžine in nukleotidne sestave primerja. Ponavadi je nižja za 2-4 o Iz vrednosti tališča (T m ) temeljni premaz. Če je temperatura žarjenja sistema pod optimalno, se poveča število nespecifičnih pomnoženih fragmentov in, nasprotno, več toplota zmanjša količino pomnoženih izdelkov. V tem primeru se lahko koncentracija specifičnih amplikonov močno zmanjša, vse do inhibicije verižne reakcije polimeraze (PCR). Povečanje časa žarjenja vodi tudi do povečanja števila nespecifičnih amplikonov.

Raztezek. Običajno ima vsaka vrsta termostabilne DNA polimeraze svoj temperaturni optimum aktivnosti. Hitrost sinteze komplementarne verige DNK z encimom je tudi vrednost, specifična za vsako polimerazo (v povprečju je 30–60 nukleotidov na sekundo oz. 1–2 tisoč baz na minuto), zato je čas raztezanja izbran glede na na vrsto DNA polimeraze in dolžino pomnožene regije.

1.5.3 Osnovna načela izbire temeljnih premazov

Pri izdelavi testnega sistema PCR je ena glavnih nalog pravilna izbira primerjev, ki morajo izpolnjevati številne kriterije:

Primerji morajo biti specifični. Posebna pozornost plačati 3 - konci primerjev, saj od njih polimeraza Taq začne dokončati komplementarno verigo DNA. Če je njihova specifičnost nezadostna, je verjetno, da se bodo v epruveti z reakcijsko mešanico pojavili nezaželeni procesi, in sicer sinteza nespecifične DNA (kratki ali dolgi fragmenti). Na elektroforezi je viden v obliki težkih ali svetlih dodatnih trakov. Zaradi tega je težko oceniti rezultate reakcije, saj je specifičen produkt pomnoževanja enostavno zamenjati s sintetizirano tujo DNK. Del primerjev in dNTP se porabi za sintezo nespecifične DNA, kar povzroči znatno izgubo občutljivosti.

Primerji ne smejo tvoriti dimerov in zank, tj. nobena stabilna dvojna pramena ne sme nastati z žarjenjem temeljnih pramenov na samem sebi ali drug na drugem.

1.5.4 Učinek platoja

Treba je opozoriti, da proces kopičenja specifičnih produktov ojačanja eksponentno traja le omejen čas, nato pa njegova učinkovitost kritično pade. To je posledica tako imenovanega "plato" učinka.

izrazni učinek planota uporablja se za opis procesa kopičenja produktov PCR v zadnjih ciklih pomnoževanja.

Odvisno od pogojev in števila ciklov reakcije ojačanja, v času, ko je učinek dosežen planota uporaba substratov (dNTP in primerji), stabilnost reaktantov (dNTP in encim), količina inhibitorjev, vključno s pirofosfati in dupleksi DNA, tekmovanje za reaktante z nespecifičnimi produkti ali primerji-dimeri, koncentracija specifičnega produkta. in nepopolna denaturacija pri visokih koncentracijah produktov pomnoževanja.

Nižja kot je začetna koncentracija tarčne DNK, večje je tveganje za reakcijo plato". Ta točka se lahko pojavi, preden je število specifičnih produktov pomnoževanja zadostno za analizo. Le dobro optimizirani testni sistemi se lahko temu izognejo.

1.5.5 Priprava vzorcev biološkega materiala

Za ekstrakcijo DNK se uporabljajo različne tehnike, odvisno od nalog. Njihovo bistvo je v ekstrakciji (ekstrakciji) DNA iz biološkega proizvoda in odstranitvi ali nevtralizaciji tujih nečistoč, da dobimo pripravek DNA s čistostjo, primerno za PCR.

Metoda pridobivanja pripravka čiste DNK, ki jo je opisal Marmur, velja za standardno in je že postala klasična. Vključuje encimsko proteolizo, ki ji sledi deproteinizacija in ponovno obarjanje DNA z alkoholom. Ta metoda omogoča pridobivanje čistega preparata DNK. Vendar pa je precej naporno in vključuje delo s tako agresivnimi in ostrimi snovmi, kot sta fenol in kloroform.

Ena od trenutno priljubljenih metod je metoda ekstrakcije DNK, ki so jo predlagali Boom et al. Ta metoda temelji na uporabi močnega kaotropnega sredstva, gvanidin tiocianata (GuSCN), za celično lizo in kasnejšo sorpcijo DNA na nosilcu (steklene kroglice, diatomejska zemlja, stekleno mleko itd.). Po izpiranju DNK ostane v vzorcu, adsorbirana na nosilcu, iz katerega jo je mogoče enostavno odstraniti z uporabo elucijskega pufra. Metoda je priročna, tehnološko napredna in primerna za pripravo vzorcev za pomnoževanje. Možne pa so izgube DNK zaradi ireverzibilne sorpcije na nosilcu, pa tudi med številnimi izpiranji. To je še posebej pomembno pri delu z majhnimi količinami DNK v vzorcu. Poleg tega lahko celo sledovi GuSCN zavirajo PCR. Zato je pri uporabi te metode zelo pomembno prava izbira sorbent in skrbno upoštevanje tehnoloških odtenkov.

Druga skupina metod priprave vzorcev temelji na uporabi ionskih izmenjevalcev tipa Chilex, ki za razliko od stekla ne adsorbirajo DNK, temveč nasprotno nečistoče, ki motijo ​​reakcijo. Ta tehnologija praviloma vključuje dve stopnji: vretje vzorca in adsorpcijo nečistoč na ionskem izmenjevalniku. Metoda je izjemno privlačna zaradi svoje preprostosti izvedbe. V večini primerov je primeren za delo s kliničnim materialom. Na žalost včasih obstajajo vzorci z nečistočami, ki jih ni mogoče odstraniti z ionskimi izmenjevalci. Poleg tega nekaterih mikroorganizmov ni mogoče uničiti s preprostim prekuhavanjem. V teh primerih je potrebno uvesti dodatne stopnje obdelave vzorcev.

Zato je treba izbiro metode priprave vzorca obravnavati z razumevanjem namenov predvidenih analiz.

1.5.6 Ojačitev

Za izvedbo reakcije pomnoževanja je potrebno pripraviti reakcijsko zmes in ji dodati analizirani vzorec DNK. V tem primeru je pomembno upoštevati nekatere značilnosti žarjenja temeljnega premaza. Dejstvo je, da so v analiziranem biološkem vzorcu praviloma različne molekule DNA, s katerimi imajo primerji, uporabljeni v reakciji, delno in v nekaterih primerih pomembno homologijo. Poleg tega se lahko primerji med seboj žarijo in tvorijo primerje-dimerje. Oboje vodi do znatne porabe primerjev za sintezo stranskih (nespecifičnih) produktov reakcije in posledično bistveno zmanjša občutljivost sistema. To otežuje ali onemogoča branje rezultatov reakcije med elektroforezo.

1.6 Sestava standardne reakcijske mešanice PCR

x PCR pufer (100 mM raztopina Tris-HCl, pH 9,0, 500 mM raztopina KCl, 25 mM raztopina MgCl2 ) …….2,5 µl

Voda (MilliQ) ………………………………………………………….18,8 µl

Mešanica nukleotidnih trifosfatov (dNTP)

mM raztopina vsakega………………………………………….……….0,5 µl

Primer 1 (10 mM raztopina) ……………………………………….….1 µl

Primer 2 (10 mM raztopina) ……………………………………….….1 µl

DNA polimeraza (5 enot / µl) ……………………………………………0,2 µl

Vzorec DNK (20 ng/µl) …………………………………………..1 µl

1.7 Vrednotenje reakcijskih rezultatov

Da bi pravilno ocenili rezultate PCR, je pomembno razumeti, da ta metoda ni kvantitativna. Teoretično lahko produkte pomnoževanja posameznih tarčnih molekul DNK z elektroforezo zaznamo že po 30-35 ciklih. Vendar se v praksi to izvaja le v primerih, ko reakcija poteka v pogojih, ki so blizu idealnim, kar se v življenju ne srečuje pogosto. Posebno velik vpliv na učinkovitost pomnoževanja ima stopnja čistosti pripravka DNA; prisotnost določenih inhibitorjev v reakcijski mešanici, ki se jih je v nekaterih primerih lahko zelo težko znebiti. Včasih zaradi njihove prisotnosti ni mogoče pomnožiti niti več deset tisoč ciljnih molekul DNK. Tako pogosto ni neposredne povezave med začetno količino ciljne DNA in končno količino produktov pomnoževanja.

2. poglavje: Uporaba verižne reakcije s polimerazo

PCR se uporablja na številnih področjih za analizo in v znanstvenih poskusih.

Kriminalistika

PCR se uporablja za primerjavo tako imenovanih "genetskih prstnih odtisov". Potrebujemo vzorec genetskega materiala s kraja zločina - kri, slina, seme, lasje itd. Primerjajo ga z genetskim materialom osumljenca. Dovolj je zelo majhna količina DNK, teoretično - ena kopija. DNK se razreže na fragmente, nato pa se pomnoži s PCR. Fragmente ločimo z elektroforezo DNA. Nastala slika lokacije trakov DNK se imenuje genetski prstni odtis.

Ugotavljanje očetovstva

Rezultati elektroforeze fragmentov DNA, pomnoženih s PCR. Oče. Otrok. mati. Otrok je podedoval nekatere značilnosti genetskega odtisa obeh staršev, kar je dalo nov, edinstven odtis.

Čeprav so "genetski prstni odtisi" edinstveni, je družinske vezi vseeno mogoče vzpostaviti z izdelavo več takih prstnih odtisov. Enako metodo lahko z majhnimi spremembami uporabimo za ugotavljanje evolucijskih odnosov med organizmi.

Medicinska diagnostika

PCR omogoča bistveno pospešitev in olajšanje diagnosticiranja dednih in virusnih bolezni. Gen, ki nas zanima, se pomnoži s PCR z uporabo ustreznih primerjev in nato sekvencira za določitev mutacij. Virusne okužbe lahko odkrijemo takoj po okužbi, tedne ali mesece preden se pojavijo simptomi bolezni.

Personalizirana medicina

Včasih so zdravila za nekatere bolnike strupena ali alergena. Vzroki za to so deloma v individualnih razlikah v občutljivosti in presnovi zdravil in njihovih derivatov. Te razlike so določene na genetski ravni. Na primer, pri enem bolniku je lahko določen citokrom bolj aktiven, pri drugem pa manj. Da bi ugotovili, kakšen citokrom ima določen bolnik, se pred uporabo zdravila predlaga analiza PCR. Ta analiza se imenuje predhodna genotipizacija.

Kloniranje genov

Kloniranje genov je postopek izolacije genov in kot rezultat manipulacije genskega inženiringa pridobivanje velike količine produkta določenega gena. PCR se uporablja za pomnoževanje gena, ki se nato vstavi v vektor, kos DNK, ki prenaša tuji gen v isti organizem ali drug organizem, ki ga je enostavno gojiti. Kot vektorji se uporabljajo na primer plazmidi ali virusna DNA. Z vstavitvijo genov v tuj organizem se običajno pridobi produkt tega gena – RNK ali najpogosteje protein. Na ta način se pridobi veliko beljakovin v industrijskih količinah za uporabo v kmetijstvo, medicina itd.

Sekvenciranje DNK

Pri metodi sekvenciranja s fluorescentno ali radioaktivno označenimi dideoksinukleotidi je sestavni del PCR, saj se med polimerizacijo v verigo DNA vstavijo fluorescentno ali radioaktivno označeni nukleotidni derivati. To ustavi reakcijo in omogoča določitev položajev specifičnih nukleotidov po ločitvi sintetiziranih verig v gelu.

Mutageneza

Trenutno je PCR postala glavna metoda mutageneze. Uporaba PCR je omogočila poenostavitev in pospešitev postopka mutageneze ter njeno zanesljivost in ponovljivost.

Metoda PCR je omogočila analizo prisotnosti sekvenc humanega papiloma virusa v odsekih biopsij človeških neoplazem materničnega vratu, vdelanih v parafin 40 let pred to študijo. Še več, s pomočjo PCR je bilo mogoče pomnožiti in klonirati fragmente mitohondrijske DNK iz fosilnih ostankov človeških možganov, starih 7 tisoč let!

Na lizatih posameznih človeških semenčic je bila dokazana možnost hkratne analize dveh lokusov, ki se nahajata na različnih nehomolognih kromosomih. Ta pristop ponuja edinstveno priložnost za natančno genetsko analizo in preučevanje kromosomske rekombinacije, polimorfizma DNK itd. Metoda analize posameznih semenčic je takoj najdena praktično uporabo v sodni medicini, saj HLA tipizacija haploidnih celic omogoča ugotavljanje očetovstva ali identifikacijo kriminalca (kompleks HLA je niz genov glavnega histokompatibilnega kompleksa človeka; lokusi kompleksa HLA so najbolj polimorfni od vseh znanih pri višjih vretenčarjih: znotraj vrste, je na vsakem lokusu nenavadno veliko število različnih alelov – alternativnih oblik istega gena).

S pomočjo PCR je mogoče ugotoviti pravilnost integracije tujih genetskih struktur v vnaprej določeno regijo genoma proučevanih celic. Celotna celična DNA je žarjena z dvema oligonukleotidnima začetnima primerjema, od katerih je eden komplementaren mestu gostiteljske DNA blizu insercijske točke, drugi pa zaporedju integriranega fragmenta v antiparalelni verigi DNA. Verižna reakcija s polimerazo pri nespremenjeni strukturi kromosomske DNA na predlaganem mestu vstavitve povzroči nastanek enoverižnih fragmentov DNA nedoločene velikosti, v primeru načrtovane vstavitve pa dvoverižnih fragmentov DNA znanega velikost, določena z razdaljo med mesti žarjenja obeh primerjev. Poleg tega bo stopnja ojačanja analizirane regije genoma v prvem primeru linearno odvisna od števila ciklov, v drugem pa eksponentno. Eksponentno kopičenje pomnoženega fragmenta vnaprej določene velikosti med PCR omogoča vizualno opazovanje po elektroforetski frakcioniranju pripravka DNA in nedvoumen sklep o vstavitvi tujega zaporedja v določeno regijo kromosomske DNA.

Zaključek

Metoda PCR je trenutno najbolj razširjena metoda za diagnosticiranje različnih nalezljivih bolezni. PCR vam omogoča, da ugotovite etiologijo okužbe, tudi če vzorec, odvzet za analizo, vsebuje le nekaj molekul DNA patogena. PCR se pogosto uporablja pri zgodnji diagnostiki okužb s HIV, virusnega hepatitisa itd. Do danes skoraj ni povzročitelja okužbe, ki ga ne bi bilo mogoče odkriti s PCR.

Seznam uporabljene literature

1.Padutov V.E., Baranov O.Yu., Voropaev E.V. Metode molekularno-genetske analize. - Minsk: Unipol, 2007. - 176 str.

2.PCR "v realnem času" / Rebrikov D.V., Samatov G.A., Trofimov D.Yu. in itd.; izd. b. n. D.V. Rebrikov; predgovor L.A. Osterman in akad. RAS in RAAS E.D. Sverdlov; 2. izd., rev. in dodatno - M.: BINOM. Laboratorij znanja, 2009. - 223 str.

.Patrushev L.I. Umetni genetski sistemi. - M.: Nauka, 2005. - V 2 tonah

.B. Glick, J. Pasternak Molekularna biotehnologija. Načela in uporaba 589 strani, 2002

5.Ščelkunov S.N. genski inženiring. - Novosibirsk: Sib. univ. založba, 2004. - 496 str.

Uredil A.A. Vorbjeva "Polimerazna verižna reakcija in njena uporaba v diagnostiki v dermatovenerologiji"; Medicinska tiskovna agencija - 72 strani

http://ru. wikipedia.org

http://učenjak. google.ru

.

.

http://www.med2000.ru/n1/n12. htm

12.http://prizvanie. su/ - zdravniški vestnik

mentorstvo

Potrebujete pomoč pri učenju teme?

Naši strokovnjaki vam bodo svetovali ali nudili storitve mentorstva o temah, ki vas zanimajo.
Oddajte prijavo navedite temo prav zdaj, da izveste o možnosti pridobitve posvetovanja.

Za ustrezno in učinkovito zdravljenještevilne nalezljive bolezni zahtevajo pravočasno odkrivanje natančno diagnozo. Pri reševanju tega problema danes sodelujejo visokotehnološke diagnostične metode, ki temeljijo na metodah molekularne biologije. Verižna reakcija s polimerazo (PCR) se trenutno že pogosto uporablja v praktični medicini kot najbolj zanesljivo laboratorijsko diagnostično orodje.

Kaj pojasnjuje priljubljenost PCR v tem času?

Prvič, ta metoda se uporablja za identifikacijo povzročiteljev različnih nalezljivih bolezni z visoko natančnostjo.

Drugič, spremljanje učinkovitosti zdravljenja.

V različnih priročnikih, prospektih, člankih, pa tudi pojasnilih zdravnikov specialistov se pogosto srečujemo z uporabo nerazumljivih izrazov in besed. Z navadnimi besedami je res težko govoriti o visokotehnoloških izdelkih znanosti.

Kaj je bistvo in mehanizem PCR diagnostike?

Vsak živ organizem ima svoje edinstvene gene. Geni se nahajajo v molekuli DNK, ki je pravzaprav "vizitka" vsakega posameznega organizma. DNK (genetski material) je zelo dolga molekula, ki je sestavljena iz gradnikov, imenovanih nukleotidi. Za vsakega povzročitelja nalezljivih bolezni se nahajajo strogo specifične, to je v določenem zaporedju in kombinaciji. Ko je treba ugotoviti, ali ima oseba določen patogen, se vzame biološki material (kri, urin, slina, bris), ki vsebuje DNK ali fragmente DNK mikroba. Toda količina genetskega materiala patogena je zelo majhna in nemogoče je reči, kateremu mikroorganizmu pripada. Za rešitev te težave služi PCR. Bistvo polimerazne verižne reakcije je v tem, da se vzame majhna količina materiala za raziskavo, ki vsebuje DNK, med postopkom PCR pa se količina genskega materiala, ki pripada določenemu povzročitelju, poveča in ga je tako mogoče identificirati.

PCR diagnostika je genetska študija biomateriala.

Zamisel o metodi PCR pripada ameriškemu znanstveniku K. Mullinsu, ki ga je predlagal leta 1983. Vendar pa je široko klinično uporabo dobil šele sredi 90. let 20. stoletja.

Ukvarjajmo se s terminologijo, kaj je to - DNK itd. Vsaka celica katerega koli živega bitja (žival, rastlina, človek, bakterija, virus) ima kromosome. Kromosomi so skrbniki genetskih informacij, ki vsebujejo celotno zaporedje genov posameznega živega bitja.

Vsak kromosom je sestavljen iz dveh verig DNK, ki sta druga glede na drugo zaviti v vijačnico. DNK je kemično deoksiribonukleinska kislina, ki je sestavljena iz strukturnih komponent – ​​nukleotidov. Poznamo 5 vrst nukleotidov – timin (T), adenozin (A), gvanin (G), citozin (C) in uracil (U). Nukleotidi so razvrščeni drug za drugim v strogem individualnem zaporedju in tvorijo gene. En gen je lahko sestavljen iz 20-200 takih nukleotidov. Na primer, gen, ki kodira proizvodnjo insulina, je dolg 60 baznih parov.

Nukleotidi imajo lastnost komplementarnosti. To pomeni, da je nasproti adenina (A) v eni verigi DNK v drugi verigi vedno timin (T), nasproti gvanina (G) pa citozin (C). Shematično izgleda takole:
G - C
T - A
A - T
Ta lastnost komplementarnosti je ključna za PCR.

Poleg DNK ima RNK enako strukturo – ribonukleinsko kislino, ki se od DNK razlikuje po tem, da namesto timina uporablja uracil. RNA - je hranilec genetske informacije v nekaterih virusih, ki jih imenujemo retrovirusi (na primer HIV).

Molekule DNA in RNA se lahko "množijo" (ta lastnost se uporablja za PCR). To se zgodi na naslednji način: dve verigi DNA ali RNA se odmakneta drug od drugega na straneh, na vsaki niti sedi poseben encim, ki sintetizira novo verigo. Sinteza poteka po principu komplementarnosti, to je, če je nukleotid A v prvotni verigi DNA, potem bo T v novo sintetizirani, če G - potem C itd. Ta posebni "gradbeni" encim potrebuje "seme" - zaporedje 5-15 nukleotidov - za začetek sinteze. To "seme" je definirano za vsak gen (gen za klamidijo, mikoplazme, virusi) eksperimentalno.

Torej je vsak cikel PCR sestavljen iz treh stopenj. V prvi fazi pride do tako imenovanega odvijanja DNK – torej do ločitve dveh med seboj povezanih verig DNK. V drugem je "seme" pritrjeno na del verige DNK. In končno, raztezek teh verig DNK, ki ga proizvaja encim "graditelj". Trenutno vse to težak proces poteka v eni epruveti in je sestavljen iz ponavljajočih se ciklov reprodukcije določene DNK, da se pridobi veliko število kopij, ki jih je nato mogoče zaznati s konvencionalnimi metodami. Se pravi, iz ene verige DNK jih dobimo na stotine ali tisoče.

Faze študije PCR

Zbiranje biološkega materiala za raziskave

Kot vzorec služi različni biološki material: kri in njene sestavine, urin, slina, sluznice, cerebrospinalna tekočina, izcedek. rane površine, vsebina telesnih votlin. Vse biovzorce odvzamemo z instrumenti za enkratno uporabo, zbrani material pa damo v sterilne plastične epruvete ali položimo na gojišča, nato pa jih transportiramo v laboratorij.

Odvzetim vzorcem dodamo potrebne reagente in jih postavimo v programabilni termostat – termocikler (ojačevalnik). V ciklerju se cikel PCR ponovi 30-50-krat, sestavljen je iz treh stopenj (denaturacija, žarjenje in elongacija). Kaj to pomeni? Razmislimo podrobneje.

Faze takojšnje reakcije PCR, kopiranje genetskega materiala

jazStopnja PCR - Priprava genskega materiala za kopiranje.
Pojavi se pri temperaturi 95 ° C, medtem ko so verige DNK odklopljene in "semena" lahko sedijo na njih.

»Semena« industrijsko proizvajajo različna raziskovalna in proizvodna združenja, laboratoriji pa kupujejo že pripravljena. Hkrati pa "seme" za odkrivanje na primer klamidije deluje samo za klamidijo itd. Če torej biomaterial testiramo na prisotnost klamidijske okužbe, potem v reakcijsko mešanico damo "seme" za klamidijo; če testirate biomaterial za virus Epstein-Barr, potem "seme" za virus Epstein-Barr.

IIstopnja - Kombinacija genetskega materiala povzročitelja okužbe in "semena".
Če obstaja DNK virusa ali bakterije, ki jo je treba določiti, se "seme" nahaja na tej DNK. Ta postopek dodajanja primerja je drugi korak PCR. Ta stopnja poteka pri temperaturi 75°C.

IIIfaza - Kopiranje genetskega materiala povzročitelja okužbe.
To je proces dejanskega raztezanja oziroma razmnoževanja genskega materiala, ki se zgodi pri 72°C. Encimski graditelj se približa "semenom" in sintetizira novo verigo DNK. S koncem sinteze nove verige DNK se konča tudi cikel PCR. To pomeni, da se v enem ciklu PCR količina genskega materiala podvoji. Na primer, v začetnem vzorcu je bilo 100 molekul DNK virusa, po prvem ciklu PCR bo v vzorcu že 200 molekul DNK testiranega virusa. En cikel traja 2-3 minute.

Da bi pridobili dovolj genskega materiala za identifikacijo, se običajno izvede 30-50 ciklov PCR, kar traja 2-3 ure.

Faza identifikacije razmnoženega genskega materiala

Sama PCR se tukaj konča in nato pride enako pomembna faza identifikacije. Za identifikacijo se uporablja elektroforeza ali označena "semena". Pri uporabi elektroforeze nastale verige DNK ločimo po velikosti, prisotnost fragmentov DNK različnih dolžin pa kaže na pozitiven rezultat analize (to je prisotnost določenega virusa, bakterije itd.). Pri uporabi označenih "semen" se končnemu produktu reakcije doda kromogen (barvilo), zaradi česar encimsko reakcijo spremlja tvorba barve. Razvoj barve neposredno nakazuje, da je v prvotnem vzorcu prisoten virus ali drug zaznavni povzročitelj.

Danes je z uporabo označenih "semen" in tudi ustrezne programske opreme mogoče takoj "prebrati" rezultate PCR. To je tako imenovani PCR v realnem času.

Zakaj je PCR diagnostika tako dragocena?

Ena od pomembnih prednosti metode PCR je njena visoka občutljivost - od 95 do 100%. Vendar morajo te prednosti temeljiti na nepogrešljivem upoštevanju naslednjih pogojev:

1. pravilno vzorčenje, transport biološkega materiala;
2. razpoložljivost sterilnih instrumentov za enkratno uporabo, posebnih laboratorijev in usposobljenega osebja;
3. strogo upoštevanje metodologije in sterilnosti med analizo

Občutljivost se razlikuje glede na različne odkrite mikrobe. Tako je na primer občutljivost metode PCR za odkrivanje virusa hepatitisa C 97-98%, občutljivost za odkrivanje ureaplazme je 99-100%.

Zmožnosti analize PCR vam omogočajo, da dosežete neprekosljivo analitično specifičnost. To pomeni natančno identifikacijo iskanega mikroorganizma in ne podobnega ali tesno sorodnega.
Diagnostična občutljivost in specifičnosti metode PCR, pogosto prekašajo metode kulture, imenovane "zlati standard" za odkrivanje nalezljivih bolezni. Glede na trajanje rasti kulture (od nekaj dni do nekaj tednov) postane prednost metode PCR očitna.

PCR pri diagnozi okužb
Prednosti metode PCR (občutljivost in specifičnost) določajo širok spekter uporabe v sodobni medicini.
Glavna področja uporabe diagnostike PCR:

1. diagnoza akutnih in kroničnih nalezljivih bolezni različnih lokalizacij
2. spremljanje učinkovitosti terapije
3. pojasnitev vrste patogena

PCR se uporablja v porodništvu, ginekologiji, neonatologiji, pediatriji, urologiji, venerologiji, nefrologiji, kliniki za infekcijske bolezni, oftalmologiji, nevrologiji, ftiziopulmologiji itd.

Uporaba diagnostike PCR se izvaja v povezavi z drugimi raziskovalnimi metodami (ELISA, PIF, RIF itd.). Njihovo kombinacijo in primernost določi lečeči zdravnik.

Povzročitelji okužbe, odkriti s PCR

Virusi:

1. HIV-1 in HIV-2 retrovirusi
2. herpetiformni virusi
3. virus herpes simpleks 1 in 2 vrste

Pred kratkim zanesljiv, zelo občutljiv in hitra metoda diagnosticiranje različnih človeških nalezljivih bolezni. Ta metoda se imenuje "analiza PCR". Kaj je to, kaj je njegovo bistvo, katere mikroorganizme lahko razkrije in kako ga pravilno jemati, bomo povedali v našem članku.

Zgodovina odkritij

Metode PCR se uporabljajo tudi pri diagnosticiranju raka.

Prednosti metode

Diagnostika PCR ima več prednosti:

1. Visoka občutljivost. Tudi ob prisotnosti le nekaj molekul DNK mikroorganizmov PCR analiza ugotovi prisotnost okužbe. Metoda bo pomagala pri kroničnih in latentnih boleznih. Pogosto je v takih primerih mikroorganizem sicer nekulturen.
2. Vsak material je primeren za raziskave, na primer slina, kri, genitalni izločki, lasje, epitelne celice. Najpogostejši je krvni test in urogenitalni bris za PCR.

   

3. Dolgotrajno gojenje pridelkov ni potrebno. Avtomatiziran diagnostični postopek vam omogoča, da dobite rezultate študije po 4-5 urah.
4. Metoda je skoraj 100% zanesljiva. Zabeleženi so bili le posamezni primeri lažno negativnih rezultatov.
5. Možnost identifikacije več vrst patogenov iz enega vzorca materiala. To ne le pospeši postopek diagnosticiranja bolezni, ampak tudi znatno zmanjša materialne stroške. Pogosto zdravnik predpiše celovito analizo PCR. Cena pregleda, ki ga sestavlja določitev šestih patogenov, je približno 1500 rubljev.

Da bi bili rezultati med študijo PCR zanesljivi, je treba analizo opraviti ob upoštevanju priporočil za predhodno pripravo na diagnozo:

1. Pred darovanjem sline se morate vzdržati hrane in jemanja zdravil 4 ure pred odvzemom materiala. Neposredno pred postopkom sperite usta s prekuhano vodo.
2. Zgornja pravila je treba upoštevati tudi pri jemanju vzorca z notranje površine lica. Po izpiranju je priporočljivo izvesti rahlo masažo kože, da poudarite skrivnost žleze.
3. Urin se običajno zbira doma. Če želite to narediti, morate opraviti temeljito stranišče genitalij. Zberite 50-60 ml urina v sterilno plastično posodo. Za zagotovitev čistosti materiala je priporočljivo, da ženske tampon vstavijo v nožnico, moški pa, da kožno gubo potegnejo čim dlje. Materiala ne morete vzeti med menstruacijo.
4. Za darovanje sperme se morate vzdržati spolnih odnosov 3 dni pred zbiranjem materiala. Zdravniki odsvetujejo tudi obisk savne in vroče kopeli, pitje alkohola in začinjene hrane. 3 ure pred analizo se morate vzdržati uriniranja.
5. Za porod, na primer, če se opravi test PCR za klamidijo, se ženskam in moškim priporoča spolni počitek 3 dni. 2 tedna pred analizo ne smete jemati antibakterijskih zdravil. Za en teden morate prenehati uporabljati intimne gele, mazila, vaginalne svečke, izpiranje. 3 ure pred pregledom se morate vzdržati uriniranja. Med menstruacijo se vzorčenje materiala ne izvaja, le 3 dni po prenehanju izločanja krvi lahko vzamete urogenitalni bris.

PCR med nosečnostjo

V obdobju pričakovanja otroka so številne nalezljive bolezni, ki se prenašajo spolno, izjemno nevarne za normalen razvoj plod. SPO lahko povzročijo intrauterini zastoj rasti, spontani splav ali prezgodnji porod, prirojene malformacije otroka. Zato je izjemno pomembno, da se odpravite na zgodnji datumi PCR pregled nosečnosti. Ob registraciji je potrebno opraviti analizo - do 12 tednov.



Material se vzame iz cervikalnega kanala s posebno krtačo. Postopek je neboleč in ne predstavlja nevarnosti za otroka. Običajno se med nosečnostjo opravi analiza za klamidijo z metodo PCR, pa tudi za ureaplazmozo, mikoplazmozo, citomegalovirus, herpes, papiloma virus. Tak kompleks preiskav se imenuje PCR-6.

PCR za diagnozo HIV

Ker je metoda zelo občutljiva na spremembe v telesu in pogoje diagnoze, lahko na rezultat vpliva veliko dejavnikov. Zato analiza PCR za okužbo s HIV ni zanesljiva metoda, njena učinkovitost je 96-98%. V preostalih 2-4% primerov test daje lažno pozitivne rezultate.

Toda v nekaterih situacijah brez PCR diagnostike HIV ni mogoče. Običajno se daje ljudem z lažno negativnim rezultatom ELISA. Takšni kazalniki kažejo, da oseba še ni razvila protiteles proti virusu in jih ni mogoče odkriti brez večkratnega povečanja števila. Prav to je mogoče doseči z izvajanjem krvnega testa z metodo PCR.

Takšna diagnostika je potrebna tudi za otroke prvega leta življenja, rojene od HIV pozitivne matere. Metoda je edina pot zanesljivo ugotavljanje statusa otroka.

PCR za diagnozo hepatitisa

Metoda verižne reakcije s polimerazo omogoča odkrivanje DNK virusa hepatitisa A, B, C že dolgo pred nastankom protiteles proti okužbi ali pojavom simptomov bolezni. Analiza PCR za hepatitis C je še posebej učinkovita, saj je v 85% primerov ta bolezen asimptomatska in brez pravočasnega zdravljenja preide v kronično fazo.



Pravočasno odkrivanje patogena bo pomagalo preprečiti zaplete in dolgotrajno zdravljenje.

Celovit PCR pregled

Celovita analiza PCR: preiskava z metodo polimerne verižne reakcije, ki vključuje določanje več vrst okužb hkrati: mycoplasma genitalium, mycoplasma hominis, gardnerella vaginalis, candida, trichomonas, citomegalovirus, herpes tipa 1 in 2, gonoreja, papiloma virus. Cena takšne diagnostike se giblje od 2000 do 3500 rubljev. odvisno od klinike, uporabljenih materialov in opreme, pa tudi od vrste analize: kvalitativne ali kvantitativne. Kaj je potrebno v vašem primeru - odloči zdravnik. V nekaterih primerih je dovolj samo določiti prisotnost patogena, v drugih, na primer pri okužbi s HIV, ima kvantitativni titer pomembno vlogo. Pri diagnosticiranju vseh zgoraj navedenih patogenov se pregled imenuje "analiza PCR-12".

Dešifriranje rezultatov analize

Dešifriranje analize PCR ni težko. Obstajata samo 2 lestvici indikatorja - " pozitiven rezultat« in »negativen rezultat«. Ko je patogen odkrit, lahko zdravniki z 99-odstotno gotovostjo potrdijo prisotnost bolezni in začnejo zdravljenje bolnika. Pri kvantitativni metodi za določanje okužbe bo v ustreznem stolpcu naveden numerični indikator odkritih bakterij. Samo zdravnik lahko določi stopnjo bolezni in predpiše potrebno zdravljenje.



V nekaterih primerih, na primer pri določanju okužbe s HIV s PCR, z negativnim rezultatom postane potrebno opraviti dodatne preglede za potrditev pridobljenih kazalcev.

Kje vzeti analizo?

Kje opraviti analizo PCR: v javni kliniki ali v zasebnem laboratoriju? Na žalost so v občinskih zdravstvenih ustanovah oprema in metode pogosto zastarele. Zato je bolje dati prednost zasebnim laboratorijem s sodobno opremo in visoko usposobljenim osebjem. Poleg tega boste v zasebni kliniki rezultate dobili veliko hitreje.

V Moskvi številni zasebni laboratoriji ponujajo analizo PCR za različne okužbe. Na primer, v takih klinikah, kot so Vita, Complex Clinic, Happy Family, Uro-Pro, se izvaja analiza PCR. Cena pregleda je od 200 rubljev. za identifikacijo posameznega patogena.

Zaključimo lahko, da je diagnoza nalezljivih bolezni s PCR v večini primerov hiter in zanesljiv način za odkrivanje povzročitelja v telesu v zgodnjih fazah okužbe. Toda v nekaterih primerih je vredno izbrati druge diagnostične metode. Samo specialist lahko ugotovi potrebo po takšni študiji. Dešifriranje analize PCR zahteva tudi profesionalen pristop. Upoštevajte zdravnikova navodila in ne opravljajte testov, ki jih ne potrebujete.