Punkcija regionalnih bezgavk
Kožo nad bezgavkami obdelamo s 96% alkoholom in 3-5% alkoholno raztopino joda. Nato z 1 in 2 prstoma leve roke pritrdite bezgavko. Desna roka vzemite sterilno brizgo z nekaj kapljicami izotonične raztopine natrijevega klorida, ki jo injicirate vzporedno vzdolžna os bezgavka. Igla se potisne v različnih smereh do nasprotne stene kapsule vozla in vsebina brizge se počasi injicira. S prsti leve roke rahlo masiramo bezgavko. S počasnim izvlekom igle se hkrati premakne bat brizge in aspirira vsebino bezgavke. Material nanesemo na predmetno stekelce (z majhno količino materiala dodamo kapljico izotonične raztopine natrijevega klorida), pokrijemo s pokrovnim steklom. Študija nativnega zdravila poteka v temnem vidnem polju s svetlobno-optičnim mikroskopom s temnopoljskim kondenzorjem (objektiv 40, 7x, 10x ali 15x). Blede treponeme najdemo tudi v obarvanih preparatih. Pri barvanju po Romanovsky-Giemsi so bledi treponemi obarvani rožnato, po Fontanu in Morozovu v rjavi (črni), po Burrijevi metodi pa so neobarvane treponeme odkrite na temnem ozadju.Serološka diagnoza
Pomen pri diagnostiki sifilisa, oceni učinkovitosti zdravljenja, vzpostavitvi kriterija ozdravitve, prepoznavanju prikritih, odporne oblike povezan s standardnimi (klasičnimi) in specifičnimi serološkimi reakcijami. Standardni ali klasični serološki testi (SSR) vključujejo:- Wassermanova reakcija (RV),
- sedimentne reakcije Kahna in Sachs-Vitebskega (citoholične),
- reakcija na steklo (ekspresna metoda),
- imobilizacijska reakcija treponeme pallidum (RIBT),
- imunofluorescenčna reakcija (RIF).
Wassermanova reakcija (RV)
- razvil A. Wasserman skupaj z A. Neisserjem in C. Bruckom leta 1906. Wassermanova reakcija temelji na pojavu vezave komplementa (Borde-Gangu reakcija) in omogoča določanje protilipidnih protiteles (reaginov). Po navedbah sodobne ideje, v Wassermanovi reakciji se določijo protitelesa proti lipidom makroorganizma in ne bledi treponemi, reakcija pa razkrije avtoimunski proces, ki ga povzroči denaturacija tkiv makroorganizma s bledimi treponemami s tvorbo lipoproteinskega kompleksa (konjugata), v katerem lipidi (hapteni) so determinanta.Običajno se RV postavi z dvema ali tremi antigeni. Najpogosteje uporabljana sta visoko občutljivi kardiolipinski antigen (ekstrakt govejega srca, obogaten s holesterolom in lecitinom) in treponemski antigen (sonicirana suspenzija anatogeno gojene treponeme pallidum). Ti antigeni skupaj z reagini bolnikovega krvnega seruma tvorijo imunski kompleks, ki je sposoben adsorbirati in vezati komplement. Za vizualno določitev nastalega kompleksa (reagini + antigen + komplement) se kot indikator uporablja hemolitični sistem (mešanica ovčjih eritrocitov s hemolitičnim serumom). Če se v 1. fazi reakcije veže komplement (reagini + antigen + komplement), do hemolize ne pride - eritrociti se izločijo v lahko opazno oborino (PB pozitivni). Če komplement v fazi 1 ni vezan zaradi odsotnosti reaginov v testnem serumu, ga bo uporabil hemolitični sistem in prišlo bo do hemolize (PB negativno). Stopnja resnosti hemolize v nastavitvi RV je ocenjena s plusi: popolna odsotnost hemolize ++++ ali 4+ (RV ostro pozitiven); komaj začeta hemoliza +++ ali 3+ (PB pozitiven); pomembna hemoliza ++ ali 2+ (PB šibko pozitiven); nerazumljiva slika hemolize ± (DV dvomljiv); popolna hemoliza - (Wassermannova reakcija je negativna).
Poleg kvalitativne ocene RV obstaja kvantitativna formulacija z različnimi razredčinami seruma (1:10, 1:20, 1:80, 1:160, 1:320). Titer reaginov je določen z največjo razredčitvijo, ki še vedno daje izrazito pozitiven (4+) rezultat. Kvantitativna formulacija RV je pomembna pri diagnostiki nekaterih kliničnih oblik sifilitične okužbe, pa tudi pri spremljanju učinkovitosti zdravljenja. Trenutno se Wassermanova reakcija uprizarja z dvema antigenoma (kardiolipin in treponemsko sondiran Reiterjev sev). Praviloma postane RV pozitiven v 5-6 tednih po okužbi pri 25-60% bolnikov, v 7-8 tednih - v 75-96%, v 9-19 tednih - v 100%, čeprav v Zadnja leta včasih prej ali slej. Hkrati se titer reaginov postopoma povečuje in doseže največjo vrednost (1: 160-1: 320 in več) v primeru pojava generaliziranih izpuščajev (sekundarni sveži sifilis). Ko je RV pozitiven, se postavi diagnoza primarnega seropozitivnega sifilisa.
S sekundarno svežo in sekundarno ponavljajoči se sifilis, je RV pozitiven pri 100 % bolnikov, vendar je mogoče opaziti negativen rezultat pri imunsko oslabelih in podhranjenih bolnikih. Nato se titer reaginov postopoma zmanjšuje in pri sekundarnem ponavljajočem sifilisu običajno ne presega 1:80-1:120.
S terciarnim sifilisom RV je pozitiven pri 65-70% bolnikov in običajno opazimo nizek titer reaginov (1:20-1:40). S poznimi oblikami sifilisa (sifilis notranji organi, živčni sistem) pozitiven RV opazimo v 50-80% primerov. Titer reagina se giblje od 1:5 do 1:320.
S latentnim sifilisom pozitiven RV opazimo pri 100% bolnikov. Titer reagina je od 1:80 do 1:640, pri poznem latentnem sifilisu pa od 1:10 do 1:20. Hitro zmanjšanje titra reaginov (do popolne negativnosti) med zdravljenjem kaže na učinkovitost zdravljenja.
Slabosti Wassermannove reakcije- pomanjkanje občutljivosti začetni fazi primarni sifilis je negativen). Negativen je tudi pri 1/3 bolnikov, če so bili v preteklosti zdravljeni z antibiotiki, pri bolnikih s terciarnim aktivnim sifilisom s poškodbami kože in sluznic, osteoartikularnega aparata, notranjih organov, centralnega živčnega sistema, s poznim prirojenim sifilisom. .
Pomanjkanje specifičnosti- Wassermanova reakcija je lahko pozitivna pri osebah, ki še niso bile bolne in nimajo sifilisa. Zlasti lažno pozitivne (nespecifične) rezultate RV opazimo pri bolnikih, ki trpijo za sistemskim eritematoznim lupusom, gobavostjo, malarijo, malignimi novotvorbami, poškodbami jeter, obsežnimi miokardnimi infarkti in drugimi boleznimi, včasih pa tudi pri popolnoma zdravih ljudeh.
Zaznana je kratkotrajna lažno pozitivna Wassermanova reakcija pri nekaterih ženskah pred ali po porodu, pri osebah, ki zlorabljajo droge, po anesteziji, uživanju alkohola. Praviloma je lažno pozitiven RV šibko izražen, pogosto z nizkim titrom reaginov (1:5-1:20), pozitiven (3+) ali šibko pozitiven (2+). Pri množičnih seroloških preiskavah je pogostnost lažno pozitivnih rezultatov 0,1-0,15%. Za premagovanje pomanjkanja občutljivosti uporabljajo nastavitev na hladnem (Collardova reakcija) in hkrati nastavijo z drugimi serološkimi reakcijami.
Sedimentne reakcije Kahna in Sachs-Vitebskega
Wassermanova reakcija se uporablja v kombinaciji z dvema sedimentne reakcije (Kahn in Zaks-Vitebsky), med proizvodnjo katerih se pripravijo bolj koncentrirani antigeni. Ekspresna metoda (mikroreakcija na steklu) - se nanaša na lipidne reakcije in temelji na reakciji precipitacije. Namesti se s specifičnim kardiolipinskim antigenom, katerega 1 kapljica se zmeša z 2-3 kapljicami preučevanega krvnega seruma v vdolbinicah posebne steklene plošče.Prednost- hitrost pridobivanja odgovora (v 30-40 minutah). Rezultate ocenimo po količini oborine in velikosti kosmičev. Resnost je opredeljena kot CSR - 4+, 3+, 2+ in negativno. Upoštevati je treba, da so lažno pozitivni rezultati opaženi pogosteje kot pri RV. Praviloma se ekspresna metoda uporablja za množične preglede sifilisa, med pregledi v kliničnih diagnostičnih laboratorijih, somatskih oddelkih in bolnišnicah. Na podlagi rezultatov ekspresne metode je diagnoza sifilisa prepovedana, njegova uporaba pri nosečnicah, darovalcih in tudi za nadzor po zdravljenju je izključena.
Reakcija imobilizacije treponeme pallidum (RIBT)
Reakcija imobilizacije treponeme pallidum (RIBT)- sta leta 1949 predlagala R.W.Nelson in M.Mayer. Je najbolj specifičen diagnostični test za sifilis. Vendar pa zapletenost in visoki stroški nastavitve omejujejo njegovo uporabo. V krvnem serumu bolnikov se določijo video specifična protitelesa (imobilizini), ki vodijo do nepremičnosti bledih treponem v prisotnosti komplementa. Antigen je živa patogena treponema pallidum, izolirana iz kuncev, okuženih s sifilisom. S pomočjo mikroskopa se prešteje število imobiliziranih (imobiliziranih) bledih treponem in ocenijo rezultati RIBT: imobilizacija bledih treponem od 51 do 100% je pozitivna; od 31 do 50% - šibko pozitivno; od 21 do 30% - dvomljivo; od 0 do 20% - negativno.RIBT je pomembno kdaj diferencialna diagnoza za razlikovanje lažno pozitivnih seroloških reakcij od reakcij zaradi sifilisa. Postane pozitiven pozneje kot RV, RIF in zato za diagnostiko različne oblike sifilis se ne uporablja, čeprav je v sekundarnem obdobju sifilisa pozitiven pri 85-100% bolnikov.
V terciarnem obdobju sifilisa s poškodbami notranjih organov, mišično-skeletnega sistema in živčnega sistema je RIBT pozitiven v 98-100% primerov ( RV je pogosto negativen).
Ne smemo pozabiti, da se lahko RIBT izkaže za lažno pozitiven, če so v testnem serumu prisotna treponemocidna zdravila (penicilin, tetraciklin, makroliti itd.), Ki povzročajo nespecifično imobilizacijo bledega treponema. V ta namen se krv za RIBT pregleda ne prej kot 2 tedna po koncu antibiotikov in drugih zdravil.
RIBT je tako kot RIF med zdravljenjem počasi negativen, zato se med zdravljenjem ne uporablja kot kontrola.
Imunofluorescenčna reakcija (RIF)
Imunofluorescenčna reakcija (RIF)- razvil ga je leta 1954 A. Coons in prvič uporabil za diagnosticiranje sifilitične okužbe Deacon, Falcone, Harris leta 1957. RIF temelji na posredni metodi za določanje fluorescentnih protiteles. Antigen za uprizoritev so tkivno patogene blede treponeme, fiksirane na stekelcih, na katere se nanese testni serum. Če so v testnem serumu antitreponemska protitelesa sorodna IgM in IgG, se le-ta močno vežejo na antigen – treponemo, ki jo detektiramo pod fluorescenčnim mikroskopom s protivrstnim (»antihumanim«) fluorescenčnim serumom.Rezultati RIF se upoštevajo z intenzivnostjo sijaja bledega treponema v pripravku (rumeno-zelen sijaj). V odsotnosti antitreponemskih protiteles v serumu bledi treponemi niso odkriti. V prisotnosti protiteles se zazna sijaj blede treponeme, katere stopnja je izražena v plusih: 0 in 1+ - povratni udarec; od 2+ do 4+ - pozitivno.
RIF se nanaša na skupinske treponemske reakcije in se doda v razredčino testnega seruma za 10 in 200-krat (RIF-10 in RIF-200). RIF-10 velja za bolj občutljivega, vendar nespecifični pozitivni rezultati pogosto izpadejo kot pri RIF-200 (ima večjo specifičnost). običajno, RIF postane pozitiven prej kot RW- pozitiven pri primarnem seronegativnem sifilisu pri 80% bolnikov, pri 100% v sekundarnem obdobju sifilisa, vedno pozitiven pri latentnem sifilisu in v 95-100% primerov pri poznih oblikah in prirojenem sifilisu.
RIF specifičnost poveča po predhodni obdelavi testnega seruma s sorbentom-ultrazvočnim treponemskim antigenom, ki veže skupinska protitelesa (RIF - abs).
Indikacije za uprizoritev RIBT in RIF- diagnoza latentnega sifilisa za potrditev specifičnosti kompleksa lipidnih reakcij v primeru sifilične okužbe na podlagi pozitivnega RV. Pozitivni RIBT in RIF sta dokaz latentnega sifilisa. Z lažno pozitivnim RV razne bolezni(sistemski eritematozni lupus, maligne neoplazme itd.) in če so ponovljeni rezultati RIBT in RIF negativni, to kaže na nespecifično naravo RV. Sum na pozne sifilične lezije notranjih organov, mišično-skeletnega sistema, živčnega sistema ob prisotnosti negativnega RV pri bolnikih. Sum na primarni seronegativni sifilis, ko pri bolnikih s ponavljajočimi se študijami izcedka s površine erozije (razjede), s punkcijo iz povečanih regionalnih bezgavk ni odkrita bleda treponema - v tem primeru je nastavljen samo RIF - 10.
Pri pregledu oseb z negativnim RV ki so imeli dolgotrajne spolne in domače stike z bolniki s sifilisom, glede na verjetno možnost, da bi jih v bližnji preteklosti zdravili z antisifilitičnimi zdravili, ki so povzročila RV negativen. Encimski imunski test (ELISA, ELISA - enzymelinked immunosorbent assay) - metodo so razvili E.Engvall et al., S.Avrames (1971). Bistvo je kombinacija sifilitičnega antigena, adsorbiranega na površini trdnofaznega nosilca, s protitelesom proučevanega krvnega seruma in odkrivanje specifičnega kompleksa antigen-protitelo z uporabo encimsko označenega anti-vrstnega imunskega krvnega seruma. To vam omogoča, da vizualno ocenite rezultate ELISA glede na stopnjo spremembe barve substrata pod delovanjem encima, ki je del konjugata. Nezanesljivi rezultati ELISA se lahko pojavijo zaradi nezadostnega redčenja sestavin, kršitve temperaturnih in časovnih režimov, nedoslednosti pH raztopin, kontaminacije laboratorijske steklovine in nepravilne tehnike pranja nosilca.
Reakcija pasivne hemaglutinacije (RPHA)
Predlagano kot diagnostični test za sifilis T. Rathlev (1965.1967), T. Tomizawa (1966). Makromodifikacija reakcije se imenuje TRHA, mikromodifikacija je MHA-TR, avtomatizirana različica je AMNA-TR, reakcija s polisečninskimi makrokapsulami namesto eritrocitov je MSA-TR. Občutljivost in specifičnost RPHA sta podobni RIBT, RIF, vendar je RPHA manj občutljiv pri zgodnjih oblikah sifilisa v primerjavi z RIF-abs in bolj občutljiv pri poznih oblikah, s prirojenim sifilisom. RPGA je predstavljen v kvalitativni in kvantitativni različici.Tehnika odvzema krvi za serološke reakcije
Za raziskave RV, RIF, RIBT se kri vzame iz kubitalne vene na prazen želodec ali ne prej kot 4 ure po obroku s sterilno brizgo ali eno iglo (gravitacija). Na mestu vzorčenja kožo predhodno obdelamo s 70% alkoholom. Brizgo in iglo je treba sprati z izotonično raztopino natrijevega klorida. V čisto, suho in hladno epruveto vlijemo 5-7 ml preizkušane krvi. Na epruveto se prilepi prazen papir s priimkom, začetnicami, številko anamneze ali ambulantnega kartona, datumom odvzema krvi. Po odvzemu krvi se epruveta postavi v hladilnik z temperaturni režim+4°+8°С do naslednjega dne. Naslednji dan se serum odvzame za raziskavo. Če kri ne uporabimo naslednji dan, je treba serum izčrpati iz strdka in shraniti v hladilniku največ 1 teden. Za raziskave na RIBT mora biti epruveta posebej pripravljena in sterilna. V primeru kršitve pravil za odvzem krvi za raziskave lahko neupoštevanje pogojev povzroči izkrivljanje rezultatov.Ni priporočljivo jemati krvi za raziskave po jedi, alkoholu, raznih zdravila, po uvedbi različnih cepiv, med menstrualni ciklus med ženskami.
Za raziskavo na ekspresni metodi je bila kri odvzeta s konice prsta, kot se to naredi pri odvzemu ESR, vendar se kri odvzame za 1 kapilaro več. Ekspresno metodo lahko izvajamo tudi s krvnim serumom, pridobljenim z venepunkcijo. Če je potrebna preiskava krvi v oddaljenih laboratorijih, lahko namesto krvi pošljemo suhi serum (metoda suhih kapljic). Da bi to naredili, se naslednji dan po odvzemu krvi serum loči od strdka in vzame v sterilno brizgo v količini 1 ml. Nato se serum v obliki 2 ločenih krogov vlije na trak debelega pisalnega papirja (voščenega papirja ali celofana) velikosti 6 x 8 cm, na prostem robu napišejo priimek, začetnice preiskovanca in datum odvzema krvi. papir. Serumski papir zaščitimo pred direktno sončno svetlobo in pustimo na sobni temperaturi do naslednjega dne. Serum se posuši v obliki majhnih krogcev bleščečega rumenkastega steklastega filma. Nato se papirnati trakovi s posušenim serumom zvijejo kot farmacevtski prašek in pošljejo v laboratorij, pri čemer je navedena diagnoza in za kakšen namen se proučuje.
Serološka odpornost
Pri delu (2% ali več) bolnikov s sifilisom kljub popolni antisifilični terapiji pride do upočasnitve (odsotnosti) negativnih seroloških reakcij po koncu zdravljenja do 12 mesecev ali več. Obstaja tako imenovana serološka rezistenca, ki je v zadnjih letih postala pogosta. Obstajajo oblike serološke odpornosti:- Prav(absolutno, brezpogojno) - potrebno je dodatno antisifilično zdravljenje v kombinaciji z nespecifično terapijo za povečanje imunskih sil telesa.
- Sorodnik- po popolnem zdravljenju bledi treponemi tvorijo ciste ali L-oblike, ki so v telesu v nizko virulentnem stanju in posledično dodatno zdravljenje ne spremeni indikatorjev seroloških reakcij, zlasti RIF in RIBT.
Psevdo-odpor- po zdravljenju kljub pozitivnim serološkim reakcijam v telesu ni blede treponeme. V telesu ni antigena, vendar se nadaljuje proizvodnja protiteles, ki se določijo pri postavljanju seroloških reakcij.
Serološka odpornost se lahko razvije zaradi:
- neustrezno zdravljenje brez upoštevanja trajanja in stopnje bolezni;
- nezadosten odmerek in zlasti zaradi neupoštevanja telesne teže bolnikov;
- kršitve intervala med uvedbo zdravil;
- ohranitev bledih treponem v telesu kljub polnopravnemu specifično zdravljenje, zaradi njihove odpornosti na penicilin in druga kemoterapevtska zdravila v prisotnosti skritih, encimskih lezij v notranjih organih, živčnem sistemu, bezgavke, ki so nedostopni antibakterijska zdravila(pogosto blede treponeme najdemo v tkivih brazgotine več let po koncu terapije, v bezgavkah je včasih mogoče odkriti blede treponeme 3-5 let po antisifilični terapiji);
- zmanjšanje zaščitnih sil pri različnih boleznih in zastrupitvah (endokrinopatija, alkoholizem, odvisnost od drog itd.);
- splošna izčrpanost (pomanjkanje vitaminov, beljakovin, maščob).
- spremljevalni nespecifične bolezni notranji organi, bolezni srca in ožilja, revmatizem, disfunkcije endokrinega in živčnega sistema, hude kronične dermatoze, maligne neoplazme;
- lezije živčnega sistema (hude poškodbe, pretres možganov, duševne travme);
- nosečnost kronične zastrupitve alkohol, nikotinska zdravila; nalezljive bolezni (malarija, tuberkuloza, virusni hepatitis, dizenterija, tifus, tifus in povratna vročina).
Laboratorijska diagnostika uporablja več testov za sifilis hkrati, da dobi najbolj natančen rezultat. To traja dlje, vendar daje najbolj natančen odgovor.
Najpogosteje je rezultat analize RIF predstavljen v številkah. Dešifriranje ima naslednje oznake:
- ostro pozitiven rezultat označeno s 4 plusi (++++);
- pozitiven rezultat je označen s 3 plusi (+++);
- šibko pozitiven rezultat 2 plusa (++);
- dvomljiv rezultat 1 plus (+);
- negativen rezultat je označen z 1 minus (-).
Rezultat RIF za sifilis je predstavljen tudi v odstotkih, ki je odvisen od kvantitativnega kazalnika povezanih bakterij:
- z negativnim rezultatom imobilizacija do 20%;
- s šibko pozitivnim rezultatom se imobilizacija giblje od 20 do 50%;
- s pozitivnim rezultatom je imobilizacija nad 50%.
Če je rezultat pozitivno odgovor navaja prisotnost bolezni.
Če rezultat šibko pozitivno, to pomeni eno samo količino preostalih protiteles v krvi.
Negativno rezultat kaže na odsotnost blede treponeme, kar pomeni, da je bolnik zdrav.
Izkušeni zdravniki naše klinike bodo hitro in z visoko natančnostjo odčitkov diagnosticirali sifilis. Zato smo socialno usmerjeni v vse segmente prebivalstva stroški analize RIF so poceni. Cena je prikazana v tabeli na naši spletni strani.
Pri serološki diagnostiki sifilisa je zelo pomembno pridobiti zanesljiv in natančen rezultat.
Sprejeti so nekateri ukrepi za izboljšanje kakovosti podatkov:
- Testni serum razredčimo 200-krat (1:200), da preprečimo lažno pozitivne reakcije. Potem pravijo, da je v teku Analiza za sifilis RIF 200.
- V drugi različici, ko je serum razredčen 1: 5, se dodatno uporablja poseben absorbent, ki zbira "odvečna" protitelesa na sebi, tako da ne izkrivljajo rezultatov.
Velikosti treponema igrajo tudi v rokah raziskovalcev. Velika mikrobna telesa spirohet so jasno vidna pod fluorescenčno mikroskopijo. Če so »pritrjeni« na s fosforjem označene beljakovine iz seruma. Uporaba standardiziranega antigena in serumov omogoča čim večjo občutljivost in specifičnost RIF pri diagnozi sifilisa.
Možnosti zasebne analize RIF: absorpcija RIF
Eden od alternativne načine imenovan RIF-Abs. Od običajne tehnike se razlikuje po nizki razredčitvi proučevanega seruma - 1:5 proti 1:200, kot običajno.
Koncentriran vzorec vsebuje veliko aktivnih beljakovinskih molekul.
Da bi se izognili in povečali občutljivost, je serum obdelan s posebnim absorbentom iz drobcev sifilitičnih spirohet. Sorbent nase zbere prekomerno aktivna protitelesa, nato pa vzorec obdelamo z industrijskim, s fosforjem označenim serumom. Zahvaljujoč tej predpripravi so izločene vse nepotrebne molekule, ki bi lahko vplivale na rezultate testa.
Postavili so ga glede na naslednje indikacije:
- Pozitivno glede na klinično počutje in odsotnost tveganja okužbe v zgodovini.
- Pozitiven RV pri bolnikih s kroničnimi boleznimi.
- Negativen RV, ko se pojavijo simptomi, sumljivi na sifilis.
Prvi pozitivni rezultati se pokažejo že 15-16 dni po okužbi. Če pozitivna reakcija postane negativna, to pomeni popolno ozdravitev sifilisa. Verjetnost lažno pozitivnega rezultata je manjša od 0,4%.
Do tega lahko pride pri pregledu bolnikov z rakom, alkoholikov, nosečnic in ljudi z motnjami imunosti.
Določen delež odpade na tehnične napake, saj je izdelava precej zapletena. Obstajajo primeri, ko je treba prirojeno patologijo razlikovati od pridobljene. To lahko storite, če iščete različni tipi protiteles v pacientovi krvi.
Protitelesa proti sifilisu razreda M (IgM) se pojavijo kmalu po okužbi in so veliko hitrejša od IgG. Omogoča vam, da jih prepoznate analiza za absorpcijo RIF sifilisa IgM. Če so rezultati te reakcije pozitivni, potem lahko govorimo o nedavni okužbi. Tako je mogoče ločiti primere ponovne okužbe od ponovitve ali odkriti okužbo otroka po porodu.
Na podlagi rezultatov te metode analize RIF tudi ugotavljajo, da je zdravljenje zgodnjega sifilisa učinkovito.
Če sumite na sifilis, se obrnite na izkušenega venerologa.
Sifilis spremljajo številni simptomi in ima veliko število klinične oblike. Njeno prepoznavanje temelji na celovitem kliničnem in laboratorijskem pregledu bolnika. Splošna analiza kri za sifilis nosi malo informacij, zato se ne uporablja za diagnosticiranje bolezni.
Za analizo lahko vzamete naslednje materiale:
- kri iz prsta in vene;
- liker - cerebrospinalna tekočina;
- snemljiv trdi šankr (razjeda);
- območja regionalnih bezgavk.
Izbira materiala in diagnostične metode je odvisna od stopnje bolezni. O tem, kateri testi so dani za sifilis, bomo govorili v naslednjem razdelku.
Razvrstitev metod za laboratorijsko diagnozo bolezni
V začetni fazi lahko uporabite bakterioskopsko metodo, ki temelji na določitvi patogena - bledo treponemo - pod mikroskopom. V prihodnosti se široko uporabljajo serološki testi, ki temeljijo na določanju mikrobnih antigenov in protiteles, ki jih proizvaja telo v biološkem materialu.
Bakteriološke raziskave se ne izvajajo, saj povzročitelj sifilisa zelo slabo raste na hranilnih medijih v umetnih pogojih.
Vse metode za odkrivanje treponeme, to je vrste testov za sifilis, so razdeljene v dve veliki skupini:
1. Neposredni, ki neposredno zazna sam mikrob:
- mikroskopija temnega polja (odkrivanje treponeme na temnem ozadju);
- RIT-test - okužba kuncev s testnim materialom;
- polimeraza verižna reakcija(PCR), ki zazna dele genetskega materiala mikroorganizma.
2. Posredno (serološko), ki temelji na odkrivanju protiteles proti mikrobu, ki jih proizvaja telo kot odziv na okužbo.
Serološke preiskave delimo v dve skupini
Netreponemalni:
- reakcija vezave komplementa s kardiolipinskim antigenom (RSKk);
- reakcija mikroprecipitacije (RMP);
- hitri test reagina v plazmi (RPR);
- test s toluidin rdečim.
Treponemalni:
- reakcija fiksacije komplementa s treponemskim antigenom (RSKt);
- reakcija imobilizacije treponema (RIT ali RIBT);
- imunofluorescenčna reakcija (RIF);
- reakcija pasivna hemaglutinacija(RPGA);
- encimski imunski test (ELISA);
- imunobloting.
Metode teh analiz so precej kompleksne, zato se bomo osredotočili predvsem na to, kdaj se izvajajo in kako točne informacije dajejo.
Recimo takoj, da je osnova za diagnosticiranje sifilisa serološke metode. Kako se imenuje test za sifilis: v vsakem primeru lahko pregled vključuje različne tehnike. Spodaj jih bomo podrobneje opisali.
Neposredni testi
Njihovo odkrivanje pod mikroskopom prepričljivo dokazuje prisotnost treponeme. Verjetnost sifilisa v tem primeru doseže 97%. Mikrobe pa lahko odkrijemo le pri 8 bolnikih od 10, zato negativen test ne izključuje bolezni.
Diagnoza se izvaja v in obdobjih, ko se pojavi trdi šankr ali kožni izpuščaj. V izločanju teh nalezljivih elementov iščejo patogene.
Učinkovitejši, a tudi dražji in kompleksna analiza– odkrivanje treponem po njihovi predhodni obdelavi s fluorescenčnimi protitelesi. To so snovi, ki se »prilepijo« na mikrobe in tvorijo njihov »sijaj« v polju mikroskopa.
Občutljivost metod se zmanjša z dolgotrajnim trajanjem bolezni, zdravljenjem razjed in izpuščajev z antiseptiki, pa tudi po zdravljenju.
Biološka metoda za diagnosticiranje RIT je zelo specifična, vendar draga, rezultat pa dobimo le s za dolgo časa ko okužena žival razvije bolezen. Trenutno se metoda praktično ne uporablja, čeprav je praktično najbolj natančna od vseh. Odličen krvni test za sifilis za odkrivanje genetskega materiala treponeme - PCR. Njegova edina omejitev so relativno visoki stroški diagnostike.
Serološke metode
Netreponemski testi
RSKk in RMP
Najbolj znan med temi testi je Wassermanova reakcija. To je pot hitra diagnoza(hitra analiza za sifilis), ki temelji na podobni reakciji protiteles iz krvi bolne osebe na same treponeme in na kardiolipin, pridobljen iz govejega srca. Kot posledica te interakcije protiteles in kardiolipina nastanejo kosmiči.
V Rusiji to analizo praktično ni uporabljen. Nadomestila jo je reakcija mikroprecipitacije. Pomanjkljivost metode je nizka specifičnost. Lažno pozitivna analiza kri za sifilis najdemo pri tuberkulozi, krvnih boleznih, sistemskem eritematoznem lupusu, med nosečnostjo, po rojstvu otroka, med menstrualno krvavitvijo in v mnogih drugih primerih. Zato s pozitivnim RW več natančne metode diagnostiko.
Po okužbi postane reakcija pozitivna po dveh mesecih. Pri sekundarnem sifilisu je pozitiven pri skoraj vseh bolnikih.
Reakcija mikroprecipitacije, ki je nadomestila Wassermannovo reakcijo, ima podoben mehanizem. Je poceni, enostaven za izvedbo, hitro ovrednoten, vendar lahko da tudi lažno pozitiven rezultat. Ta dva testa se uporabljata kot presejalna testa.
RMP postane pozitiven en mesec po pojavu trdega šankra. Za njegovo izvedbo se uporablja kri iz prsta.
Ali je test za sifilis lahko napačen? Vsekakor da, še posebej pri uporabi netreponemskih testov.
Vzroki akutnih lažno pozitivnih testov pri uporabi RMP:
- akutne nalezljive bolezni;
- pljučnica;
- miokardni infarkt;
- kap;
- poškodbe in zastrupitve.
Kronični lažno pozitivni rezultati se pogosto pojavijo pri naslednjih boleznih:
- tuberkuloza;
- bruceloza;
- leptospiroza;
- sarkoidoza;
- revmatske bolezni;
- Infekcijska mononukleoza;
- maligni tumorji;
- diabetes;
- ciroza jeter in drugi.
Če so analize sporne, se za razjasnitev diagnoze uporabijo treponemski serološki testi.
RPR in test s toluidinskim rdečim
Hitri plazemski reaginski test (rpr test sifilisa) je druga vrsta reakcije s kardiolipinskim antigenom. Uporablja se v naslednjih primerih:
- pregled prebivalstva;
- sum na sifilis;
- pregled darovalcev.
Omenimo še test s toluidinskim rdečim. Vse te metode se uporabljajo za oceno učinkovitosti zdravljenja. So polkvantitativne, to pomeni, da se zmanjšajo z ozdravitvijo in povečajo s ponovitvijo okužbe.
Negativni rezultati netreponemskih testov najverjetneje kažejo, da subjekt nima sifilisa. Zato se za oceno ozdravitve uporabljajo netreponemski testi. Prvo takšno analizo je treba opraviti 3 mesece po zaključku zdravljenja.
Treponemski testi
Treponemski testi temeljijo na uporabi treponemskih antigenov, kar bistveno poveča njihovo diagnostično vrednost. Uporabljajo se v naslednjih situacijah:
- pozitiven presejalni test (reakcija mikroprecipitacije);
- prepoznavanje lažno pozitivnega presejalnega rezultata;
- sum na sifilis;
- diagnostika latentnih oblik;
- retrospektivna diagnoza, ko je bolnik že imel bolezen.
RIT in RIF
Najbolj kakovostni (visoko občutljivi in zelo specifični) sta RIT in RIF. Slabosti teh metod so kompleksnost, dolgotrajnost, potreba po sodobni opremi in usposobljenem osebju. Pri večini ozdravljenih bolnikov ostanejo treponemski testi več let pozitivni in jih zato ne moremo uporabljati kot merilo ozdravitve.
RIF postane pozitiven dva meseca po okužbi. Če je negativna, je bolnik zdrav, če je pozitivna, je verjetnost bolezni velika.
RIT se še posebej pogosto uporablja pri bolnikih s pozitivnim rakom mehurja za izključitev ali potrditev bolezni. Je zelo občutljiv in vam omogoča, da z veliko natančnostjo ugotovite, ali ima bolnik sifilis ali ne. Vendar analiza postane pozitivna šele tri mesece po okužbi.
Imunobloting
Imunobloting je še bolj občutljiv kot RIF, vendar manj občutljiv kot RPHA. Uporablja se redko, predvsem za diagnozo neonatalnega sifilisa.
Naštete metode niso primerne za presejanje, torej hitro odkrivanje bolezni, ker postanejo pozitivne kasneje kot reakcija mikroprecipitacije.
ELISA in RPGA
Sodobne visoko informativne standardizirane metode za diagnosticiranje sifilisa - ELISA in RPHA. So poceni, hitro nameščeni in testirani v velikih količinah. Ti testi se lahko uporabijo za potrditev diagnoze.
Analiza RPHA postane pozitivna s primarnim seropozitivnim sifilisom, to je s pojavom trdega šankra (en mesec po okužbi). To je še posebej dragoceno pri diagnozi poznih in prirojene oblike bolezni. Vendar je treba RPHA za natančno diagnozo dopolniti z vsaj enim netreponemskim in enim treponemskim testom. Takšen trojni test je najbolj zanesljiva analiza za sifilis. Pomanjkljivost RPGA je ohranitev pozitivna reakcija dolgo časa, kar ne omogoča uporabe testa kot merila za ozdravitev.
Test ELISA za sifilis postane pozitiven že tri tedne po bolezni. Pomanjkljivost ELISA je, da je lahko napačen. Lažno pozitivna reakcija se pojavi, ko sistemske bolezni, presnovne motnje, pa tudi pri otrocih, rojenih bolnim materam.
Napake serološke metode privedlo do razvoja najnaprednejših metod, ki ne dajejo napak, vendar so doslej drage in se redko uporabljajo - plinska kromatografija in masna spektrometrija.
Algoritem za diagnosticiranje sifilitične okužbe v različnih fazah
V primarnem seronegativnem obdobju (do 2 meseca po okužbi) se iskanje treponeme izvaja v temnem polju ali s fluorescentnimi protitelesi.
Pri primarnem seropozitivnem, sekundarnem in latentnem sifilisu uporabljamo RMP in ELISA, kot potrditveni test pa RPHA.
Pri bolnikih z recidivi sekundarnega sifilisa pregledamo elemente izpuščaja, poskušamo iz njih izolirati treponemo za mikroskopski pregled.
V terciarnem obdobju je RMP pri tretjini bolnikov negativen. ELISA in RPHA sta pozitivna, vendar morda ne kažeta na terciarni sifilis, ampak na predhodno bolezen. Šibko pozitivna analiza bolj verjetno kaže na okrevanje kot terciarni sifilis.
Pri postavljanju diagnoze "prirojenega sifilisa" se upoštevajo prisotnost bolezni pri materi, razlika v stopnjah RMP pri materi in otroku, pozitivna ELISA in RPHA pri novorojenčku ter imunobloting.
Nosečnice je treba pregledati za sifilis, zlasti tiste, ki so že imele porod z mrtvim plodom, nosečnostjo, ki se ne razvija, zgodnji splav. Izvajajo RMP, ELISA, RPGA. Preglejte prisotnost bolezni in pred prekinitvijo nosečnosti.
Pravila za pridobitev analize za sifilis
Če želite dobiti napotnico za laboratorij, morate obiskati okrožnega zdravnika. Če želite test opraviti hitreje, lahko to storite v zasebnem laboratoriju brez napotnice (na primer laboratoriji Invitro naredijo analizo na sifilis hitro in anonimno).
Kako se testirati na sifilis? Krv se daje zjutraj, na prazen želodec. Pijete lahko samo čisto vodo.
Priprava: dva dni pred testom je treba iz prehrane izključiti mastno hrano in zlasti alkohol.
Kako poteka analiza? na običajen način iz prsta ali kubitalne vene.
Koliko stane test za sifilis? Rezultat testa je običajno pripravljen naslednji dan. Prepis lahko vzamete pri zdravniku ali v laboratoriju.
Kako veljavna je analiza? Za največ tri mesece.
Analiza cerebrospinalne tekočine
V nekaterih primerih se za diagnosticiranje nevrosifilisa vzame analiza CSF.
Ta pregled je predpisan vsem bolnikom z latentni sifilisče imajo znake patologije živčnega sistema, pa tudi z latentnim in poznim nevrosifilisom.
Poleg tega se analiza izvaja pri vseh bolnikih po okrevanju, pri čemer se ohranijo njihove pozitivne serološke reakcije. V našem članku smo že pisali, da se ta pojav dogaja precej pogosto.
Analizo CSF za sifilis predpisuje in izvaja le zdravnik.
Cerebrospinalno tekočino pridobimo s punkcijo med dvema vretencema ledveno. Zberemo ga po 4 ml v dveh epruvetah. Nato mesto vboda obdelamo z jodom in prekrijemo s sterilnim povojem. Po punkciji mora bolnik vsaj 3-4 ure ležati na trebuhu z dvignjenim nožnim delom postelje, nato se lahko uleže na bok. Počitek v postelji po punkciji se pokaže v dveh dneh.
Cerebrospinalno tekočino iz prve epruvete pregledamo s splošno sprejetimi reakcijami na vsebnost beljakovin, celic in določitvijo znakov meningitisa (vnetja možganskih ovojnic).
Cerebrospinalno tekočino iz druge epruvete pregledamo na vsebnost protiteles proti treponemi z Wassermanovo reakcijo, RMP, RIF in RIBT, o katerih smo razpravljali zgoraj.
Glede na resnost kršitev obstajajo štiri vrste sprememb v cerebrospinalni tekočini. Z njihovo analizo lahko zdravnik sklepa, da gre za različne oblike poškodb živčnega sistema (vaskularni nevrosifilis, sifilični meningitis, meningovaskularni sifilis, dorzalni tabes, pozni mezenhimski nevrosifilis), pa tudi o okrevanju bolnika s pozitivnimi serološkimi testi.
velikost pisave
ODREDBA Ministrstva za zdravje ZSSR z dne 02-09-85 1161 O IZBOLJŠANJU SEROLOŠKE DIAGNOSTIKE SIFILISA (skupaj z NAVODILI ZA ... Ustrezno v 2018
Način nastavitve RIF - ABS
Testiran krvni serum
Kri za pridobivanje krvnega seruma odvzamemo iz kubitalne vene v čisto in suho epruveto v prostornini 5 ml in obdelamo na enak način kot za postavitev Wassermanove reakcije. Krvni serum enkrat inaktiviramo pri temperaturi 56° 30 minut. Ker je RIF-abs nameščen nesterilen, uporaba sterilnih posod in skladnost s pogoji sterilnosti pri shranjevanju krvnih serumov ni potrebna. Pomembno je le za daljše shranjevanje krvnih serumov pred študijo.
Kot antigen se uporablja suspenzija patogenih bledih treponem seva Nichols iz 7 dni starega kunčjega orhitisa. Zdrave kunčje samce z negativnim izvidom po Wassermanu in RIT okužimo intratestikularno in ob pojavu orhitisa odstranimo bledo treponemo iz testisov na enak način kot v primeru pridobivanja antigena za RIT. Nastalo suspenzijo bledih treponem vlijemo iz kosov moda v sterilne epruvete z vatiranimi čepi in pustimo en dan v hladilniku pri 4 °, nato pa jo ločimo od usedline in shranimo pod enakimi pogoji za celotno obdobje. obdobje uporabe.
Pridobivanje in shranjevanje antigena zahteva skladnost s pogoji sterilnosti, tk. z istim antigenom se lahko reakcija uprizori v 2-4 mesecih. Za antigen je treba izbrati suspenzijo, v kateri ni opaziti aglutinacije treponem in jih je dovolj. Antigen je mogoče dobiti v ampulah iz drugih laboratorijev. Pred vsako reakcijo suspenzijo dobro premešamo in pregledamo pod mikroskopom s temnim kondenzatorjem, da določimo njeno gostoto. Za nastavitev RIF-abs je potrebna suspenzija, ki vsebuje 40-60 treponem v temnem vidnem polju, če je prisotna gostejša suspenzija, jo je treba razredčiti.
Kot sorbent za RIF-abs se lahko uporablja ultrazvočni treponemski antigen za RSK, ki ga proizvaja podjetje Kaunas za proizvodnjo bakterijskih pripravkov Ministrstva za zdravje ZSSR. Je suspenzija mešanice gojenih bledih treponem sevov V, VII, VIII, IX in Reiter, uničenih z ultrazvokom. Vsako serijo sorbenta je treba pred uporabo v RIF-abs za diagnostične namene titrirati.
Titracija sorbentov
Sorbenti se titrirajo na krvnih serumih bolnikov s sifilisom, kar daje močno (4+) in šibko (2+) pozitiven rezultat v RIF pri razredčitvi 1: 5, pa tudi na krvnih serumih oseb, ki nimajo sifilisa. okužba, ki daje negativen rezultat RIF-5 in nespecifično pozitivnost (2+ ali več).
Primer določanja titra sorbenta
Celoten sorbent se razredči s fosfatnim pufrom, pH = 7,2, 2, 3, 4-krat ali več. Odvzamejo se 3 krvni serumi bolnikov s sifilisom, od katerih eden daje močno pozitiven (4+) rezultat RIF-5, 2 - šibko pozitiven (2+) in 5 krvnih serumov ljudem brez okužbe s sifilisom, od katerih 3 dajejo nespecifične rezultate in RIF-5 (2+ in več). Vsi krvni serumi se 5-krat razredčijo s sorbentom, razredčenim 2, 3, 4 ali večkrat s fosfatnim pufrom. Nato se v reakciji pregleda krvni serum. Po upoštevanju rezultatov se izbere razredčitev sorbenta, pri kateri sorbirani krvni serumi bolnikov s sifilisom ohranijo stopnjo pozitivnosti, podobno tisti, pridobljeni s krvnimi serumi, razredčenimi s fosfatnim pufrom, in krvni serumi oseb brez sifilitične okužbe ne svetijo. Ta razredčitev sorbenta je njegov titer.
Titer sorbenta je bil v tem primeru razredčitev 1: 3, pri kateri so vsi krvni serumi bolnikov s sifilisom ohranili stopnjo pozitivnosti, pridobljeno v kontroli, in hkrati nespecifično pozitivnost nesifilične krvi. seru zanesljivo odstranili.
Luminescentni serum proti vrsti
Za preučevanje človeških krvnih serumov v RIF-abs je potreben s fluorokromom označen krvni serum živali, imuniziranih s človeškimi serumskimi beljakovinami. Liofiliziran luminiscentni serum raztopimo v sterilnih pogojih v destilirani vodi v volumnu, navedenem na nalepki ampul, vlijemo v sterilno epruveto z gumijastim zamaškom in med uporabo hranimo pri 4°C 1-2 meseca.
Na dan reakcije zahtevano količino tega seruma razredčimo glede na titer z destilirano vodo. Razredčitev delovnega seruma, navedena na etiketi, ni primerna za postavitev reakcije za namen serodiagnostike sifilisa, zato je treba titer vsake serije določiti znova.
Tabela št. 13
Rezultati titracije sorbenta
| Testirani krvni serumi | Rezultati RIF-5 | |||
| Redčenje krvnih serumov 1:5 pufer (K) | Redčenje krvnih serumov 1: 5 sorbent v razredčitvi | |||
| 1: 2 | 1: 3 | 1: 4 | ||
| Krvni serum bolnika s sifilisom | ||||
| N 1 | 4+ | 3+ | 4+ | 4+ |
| N 2 | 2+ | 1+ | 2+ | 2+ |
| N 3 | 2+ | 2+ | 2+ | |
| Nesifilični krvni serum | ||||
| N 1 | 3+ | 1+ | 2+ | |
| N 2 | 2/3+ | 2+ | ||
| N 3 | 2+ | 2+ | ||
| N 4 | 2+ | 2+ | ||
| N 5 | ||||
Titracija protivrstnega luminiscenčnega seruma
Vzamejo 5 krvnih serumov bolnikov s sifilisom in 5 krvnih serumov zdravih ljudi, jih 5-krat razredčijo s sorbentom (ob upoštevanju njegovega titra) in reagirajo z različnimi razredčitvami luminiscenčnega seruma v fazi II proti humanim serumskim globulinom serije, katerih določi se titer. Upoštevati je treba, da je titer luminiscenčnih serumov, ki jih trenutno proizvaja IEM. N. F. Gamalei, niha, ko je RIF-abs nastavljen od 1: 100 do 1: 140. Pri upoštevanju reakcije je treba upoštevati predhodni titer luminiscenčnega seruma, da razredčitev, kadar se uporablja s pozitivnimi krvnimi serumi, dober sijaj treponem je bil pridobljen, in z negativnim sijem antigena ni prejel. Večja razredčitev luminiscenčnega seruma od titra vodi do zmanjšanja občutljivosti reakcije, manjša pa do zmanjšanja specifičnosti. Po določitvi predhodnega titra ga je treba prečistiti več pozitivni in negativni krvni serumi. Za končni titer se lahko šteje tisti, ki je preizkušen na 100 krvnih serumih, od katerih mora biti vsaj 20 od bolnikov s sifilisom.
Da bi preprečili kalitev po redčenju suhega luminescentnega seruma z destilirano vodo, mu je treba dodati mortiolat s hitrostjo 1 volumna njegove raztopine 1: 1000 na 9 volumnov luminiscenčnega seruma. Pri jemanju novih ampul iste serije je treba titer preveriti in razjasniti samo za 10 znanih pozitivnih in negativnih krvnih serumov.
Primer določanja preliminarnega titra luminiscenčnega protivrstnega seruma
Pripravite 60 zdravil, oštevilčite jih od 1 do 60. Vzemite 10 krvnih serumov - 5 od bolnikov s sifilisom, 5 od zdravih ljudi. Vse krvne serume razredčimo 5-krat z razredčenim, vendar titrnim sorbentom.
Na številke 1-10, 11-20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60 se zdravila uporabljajo v prvi fazi reakcije z istimi 10 krvnimi serumi, razredčenimi 5-krat s sorbentom. V II. 41-50 : 140, pri 51-60 - 1 : 150.
Tehnika namestitve RIF-trebušnjakov
Pripravke pripravimo iz antigena na tankih, dobro razmaščenih stekelcih, na hrbtna stran katere kroge s premerom 0,7 cm označimo z rezilom za steklo (10 krogov na 1 predmetnem stekelcu). Znotraj kroga se na steklo nanese antigen-suspenzija bledih treponem. Zaprt konec Pasteurjeve pipete v krožnem gibanju suspenzijo porazdelimo v krog, posušimo na zraku in fiksiramo 10 minut v kemično čistem acetonu. Nato so zdravila oštevilčena. Inaktivirani testni krvni serumi se 5-krat razredčijo s sorbentom, razredčenim v titru s pufrsko raztopino. V stojalo je nameščenih več epruvet, katerih število in število ustreza številu in številu testiranih krvnih serumov. Sorbent, razredčen s titrom, vlijemo v epruvete s pipeto v 0,2 ml, nato dodamo 0,05 ml celotnega krvnega seruma in dobro premešamo. Redčenje krvnega seruma se lahko izvede z aparatom Florinsky. Na antigen nanesemo krvni serum, razredčen s sorbentom, tako da enakomerno pokrije razmaz, preparate damo v vlažno komoro, ki jo zapremo s pokrovom in postavimo v termostat pri 37° za 30 minut (I. reakcijska faza). ). Po prvi fazi preparate previdno speremo v 2 delih fosfatnega pufra, v drugem delu preparate damo za 10 minut, posušimo, nakar jih ponovno postavimo v vlažno komoro, nanesemo luminiscenčni serum, razredčen v titru. in pustimo pri sobni temperaturi 30 minut (reakcije II. faze). Na koncu druge faze preparate speremo s fosfatnim pufrom, kot je opisano zgoraj, posušimo in na površino razmazov po kapljicah nanesemo nesvetleče potopno olje (dimetil ftalat).
Preiskava pripravkov se izvaja v fluorescenčnem mikroskopu z živosrebrno kvarčno žarnico DRSh-250 s potopnim sistemom, okularjem 4X ali 5X, filtri SZS-7 ali 14, FS-1. BS-8 in ZhS-18 ali T-2N. Obračunavanje reakcije se izvede z oceno sijaja blede treponeme. Pri RIF-abs se krvni serumi štejejo za pozitivne, kar daje sijaj na 4+, 3+ in 2+. Briljantno zeleno-rumeni sijaj je ocenjen s 4+, svetel - 3+, šibek sijaj 2+. Krvni serumi se štejejo za negativne, če dajejo sijaj 1+ (treponemi v pripravku so obarvani bolj intenzivno kot ozadje) ali ga ne dajejo.
V vsaki formulaciji RIF-abs je treba uporabiti naslednje kontrole:
Ostra pozitivna kontrola. Krvni serum bolnika s sifilisom, ki daje sijaj 4+, če ga 5-krat razredčimo s pufrom. Pri 5-kratnem razredčenju s sorbentom krvni serum ne sme izgubiti stopnje pozitivnosti za več kot 1+.
Šibka pozitivna kontrola. Celoten ali razredčen krvni serum bolnika s sifilisom, ki daje šibko stopnjo luminiscence antigena 2+, če ga petkrat razredčimo s pufrom. Pri redčenju s sorbentom je treba ohraniti njegovo pozitivnost.
nespecifični nadzor. Nesifilični krvni serum, ki daje, če ga razredčimo s pufrom, fluorescenco najmanj 2+. Pri redčenju s sorbentom je treba njegovo pozitivnost odpraviti.
Kontrole antigena, sorbenta, luminiscenčnega seruma je mogoče nastaviti samo pri uporabi novih serij teh sestavin.
Metoda določanja RIF-abs s kapilarno krvjo
Nastavitev RIF-abs je možna ne le s krvnim serumom, ampak tudi s krvjo, odvzeto iz prsta. Ta modifikacija RIF-abs se lahko uporablja pri pregledu otrok za sifilis, kadar je težko dobiti kri iz vene pri odraslih in pri množičnem pregledu različnih kontingentov za sifilis.
Pri nastavitvi RIF-abs s krvjo uporabimo enake reakcijske sestavine kot pri nastavitvi RIF-abs s krvnim serumom (antigen, sorbent, luminiscentni serum). Titer luminiscenčnega seruma se določi po zgornji shemi, vendar pri nastavitvi reakcije s krvjo. Po punkciji pacientovega prsta odvzamemo kri za preiskavo z mikropipeto do oznake 0,1 ml, na hitro vpihnemo v epruveto z 0,3 ml destilirane vode, temeljito premešamo s pipeto in filtriramo skozi papirnati filter, navlažen z destilirano vodo. . Nastavitev reakcije z razredčeno krvjo je možna tako na dan odvzema kot po 1-2 dneh, pod pogojem, da je shranjena pri 4 °.
Vsem vzorcem krvi, vključenim v nastavitev reakcije, tik pred postavitvijo reakcije dodamo 0,1 ml celotnega sorbenta, premešamo s pipeto in stresanjem ter postavimo v termostat pri 37° za 30 minut. Nato s sorbentom obdelano kri nanesemo na antigenske brise in postavimo v vlažno komoro pri 37° (1. faza reakcije). Po preteku ekspozicije preparate speremo v prvem delu fosfatnega pufra, tako da na stekelcih ni sledi krvi, in jih za 10 minut postavimo v drugi del pufra. Po sušenju brisov se izvede druga faza reakcije. Hkrati se na pripravke nanese luminiscenčni serum proti humanim globulinom, razredčen glede na titer, določen za to modifikacijo RIF. Predmetna stekelca v vlažni komori ponovno postavimo v termostat pri 37°.
Po 30 minutah preparate ponovno speremo v 2 delih fosfatnega pufra 10 minut, posušimo in namestimo za fluorescenčno mikroskopijo. Študija zdravil in beleženje rezultatov reakcije se izvaja na enak način kot pri nastavitvi RIF-abs s krvnim serumom.
Način nastavitve RIF-200
Metoda nastavitve RIF-abs in RIF-200 sta blizu. Pri nastavitvi RIF-200 se obdelava testnih krvnih serumov, priprava antigena, priprava protivrstnega luminiscenčnega seruma in njegova titracija izvajajo na enak način kot pri nastavitvi RIF-abs. Upoštevati je treba le, da se titri luminiscenčnega seruma, ki se trenutno proizvaja v RIF-200, gibljejo od 1:20 do 1:50.
Tehnika nastavitve RIF-200
Testirane krvne serume 200-krat razredčimo s fosfatnim pufrom. Da bi to naredili, so v stojalo postavljene 3 vrstice epruvet, katerih število in oštevilčenje v vsaki vrsti ustreza številu in oštevilčenju testiranih krvnih serumov v delovnem dnevniku. V prvo vrsto vlijemo polne krvne serume, v drugo vrsto vlijemo 0,45 ml pufra v epruvete, v tretjo vrsto pa 0,95 ml pufra. V drugi vrsti pripravimo 10-kratno razredčino krvnih serumov, za katero iz vsake epruvete prve vrste z ločeno 1 ml graduirano pipeto odvzamemo 0,05 ml testiranega krvnega seruma in ga prenesemo v ustrezno epruveto druge vrste. vrsto in zmešate s tamkajšnjim pufrom. Iz vsake epruvete druge vrste z isto pipeto prenesemo 0,05 ml 10-krat razredčenega krvnega seruma v ustrezno epruveto tretje vrste in dobimo 200-kratno razredčino.
Pri pripravi reakcije na pripravke, ki so postavljeni v vlažno komoro, se uporabi 200-krat razredčeni testni krvni serum, tako da se njihova števila, navedena na epruvetah, ujemajo s številkami na stekelcih. Po nanosu na pripravke krvnega seruma se vlažna komora za 30 minut postavi v termostat s temperaturo 37° (I. faza reakcije). Nato preparate 10 minut speremo v 2 delih pufra in posušimo. Nato jih ponovno postavimo v vlažno komoro in na vse skupaj nanesemo luminiscenčni serum, razredčen v titru (II. faza reakcije). Drugo fazo izvajamo 30 minut pri sobni temperaturi, nato pa preparate 10 minut speremo, posušimo in namestimo za fluorescenčno mikroskopijo.
Računovodstvo rezultatov RIF-200 se izvaja na enak način kot RIF-abs.
V primeru, ko klinike zanima titer fluorescentnih protiteles v bolnikovem krvnem serumu, je treba uporabiti RIF-abs in RIF-200 s serijskim redčenjem testiranih krvnih serumov, titer fluorescenčnih protiteles pa je treba šteti za najvišjo razredčino krvni serum, ki še vedno daje pozitiven rezultat reakcije. Običajno je titer označen kot število, ki označuje stopnjo redčenja testiranega krvnega seruma, na primer 5, 10, 20, 40 itd. (RIF-abs) ali 200, 400, 800 itd. (RIF-200).
Pri postavitvi obeh modifikacij reakcije za redčenje testiranih krvnih serumov in za izpiranje preparatov po fazah I in II je treba uporabiti fosfatni pufer naslednje sestave: 1 l destilirane vode, 6,8 g natrijevega klorida, 1,48 g g disubstituiranega natrijevega fosfata, 0,43 g monosubstituiranega kalijevega fosfata (PH = 7,2). Pripravljeno raztopino hranimo pri sobni temperaturi največ en teden.
Zaradi možnosti negativnega rezultata ob prisotnosti fluorescenčnih protiteles krvi in krvnega seruma med zdravljenjem bolnikov s penicilinom ne smemo preiskovati v RIF-abs in RIF-200.
Tehnika nastavitve RIF-c
Zgodnja diagnoza lezij živčnega sistema pri sifilisu je nujno vprašanje v boju proti tej bolezni. Ker je RIF-c občutljivejši od vseh drugih testov, ki se uporabljajo za diagnozo sifilisa s cerebrospinalno tekočino, lahko to modifikacijo RIF priporočamo za diagnostiko sifilitičnih lezij centralnega živčnega sistema pri vseh oblikah sifilisa.
Za določanje stopnje RIF-c se uporablja isti antigen, luminiscentni serum, kot za določanje stopnje RIF-abs in RIF-200 s krvnim serumom. Podobna sta tudi določanje fluorescenčnih protiteles v likvorju in krvnem serumu ter registracija reakcije.
Cerebrospinalna tekočina se v reakcijo vnese neaktivirana in nedotaknjena. Preden začnemo z reakcijo, ga lahko hranimo v zamrzovalnem delu hladilnika v epruvetah pod gumijastimi zamaški do 2 tedna. Odtaljevanje poteka pri sobni temperaturi.
Tehnika nastavitve RIF-c
V fazi I reakcije na antigen nanesemo 0,05 ml nerazredčenega testnega likvorja, pripravke postavimo v vlažno komoro za 30 minut pri sobni temperaturi. Nato jih 10 minut speremo s fosfatnim pufrom, pH = 7,2, posušimo. V fazi II na pripravke nanesemo luminiscenčni serum, razredčen v titru, ki ga titriramo ob postavitvi reakcije s cerebrospinalno tekočino. Preparate hranimo 30 minut pri sobni temperaturi v vlažni komori, operemo, posušimo, namestimo za fluorescentno mikroskopijo.
Viri napak
1. Neupoštevanje pogojev za pripravo, shranjevanje reagentov in nastavitev reakcije.
2. Nizka kakovost luminiscentnega seruma in netočna določitev njegovega titra.
3. Nanos testnega materiala ali luminiscenčnega seruma pri postavljanju reakcije ne na zdravilu, ampak na drugi strani stekelca.
4. Nepravilna nastavitev osvetlitve v fluorescentnem mikroskopu.
5. Slaba kakovost antigena.
