Virusoloģiskie pētījumi ir pētījumi, kas paredzēti vīrusu izolēšanai un to īpašību izpētei, kā arī vīrusu etioloģiskās saiknes noteikšanai ar noteiktām slimībām.

Pētījuma materiāls tiek ņemts atkarībā no dominējošo vīrusu vietas pacienta organismā un to izdalīšanās ceļiem laikā. ārējā vide. Materiālu savāc sterilos traukos, pēc iespējas ātrāk nogādā laboratorijā un uzglabā sasaldētu vai uz ledus līdz pārbaudei. Pirms lietošanas materiāls vīrusa izolācijai tiek apstrādāts (un), lai nomāktu svešu mikrofloru, un tiek apstrādāts, lai noņemtu lielas daļiņas.

Vīrusus izdala, inficējot laboratorijas dzīvniekus, vistu embrijus un audu kultūras ar vīrusu saturošu materiālu. Izolācijas metodes izvēle ir atkarīga no iespējamās slimības izraisītāja. Tādējādi audu kultūras (sk.) izmanto, strādājot ar vīrusiem, kas nav patogēni laboratorijas dzīvniekiem, vai arī, ja tie audu kultūrā tiek atklāti agrāk nekā inficējot dzīvniekus. Vistas embriji tiek inficēti, lai izolētu patogēnus, infekciozo cūciņu (amnija un alantoju dobumos), (dzeltenuma maisiņā), bakas (horioalantoīnajā membrānā).

No laboratorijas dzīvniekiem vīrusu izolēšanai visbiežāk izmanto baltās peles, kam seko truši, žurkas, jūrascūciņas, pērtiķi. Arbovīrusiem visefektīvākā ir vīrusu saturoša materiāla ievadīšana galvā vai pneimotropiem vīrusiem uz gļotādas. elpceļi, baku vīrusiem, - uz skarificētas radzenes.

Vīrusu izolācija ir visefektīvākā slimības akūtā periodā. Būtisks punkts slimības vīrusa rakstura noteikšanai ir rezultāti seroloģiskie pētījumi serumi, kas atkārtoti ņemti no viena un tā paša pacienta slimības sākumā un atveseļošanās periodā. Antivielu noteikšana pret izolētajiem vīrusiem otrajā serumā titrā, kas ir 4 vai vairāk reizes lielāks nekā pirmajā serumā, norāda uz vīrusu etioloģisko saistību ar šo slimību.

Agri un ātra metode Vīrusu antigēnu noteikšana ir fluorescējošu antivielu metode, kuras pamatā ir ar fluorohromu iezīmētu antivielu specifiska fiksācija uz antigēna virsmas. Antigēns ir viegli nosakāms ar fluorescējošu mikroskopiju (sk.), pateicoties uz antigēna adsorbēto antivielu spilgtās fluorescences. Fluorescējošu antivielu metodi izmanto, lai pārbaudītu no pacientiem ņemtās uztriepes, skarto audu histoloģiskās sekcijas un audu kultūras preparātus. Tos izmanto arī elementāru ķermeņu (virionu) noteikšanai (sk.). Citu morfoloģisko metožu vidū tiek izmantotas tās, kas nosaka intracelulāros vīrusu ieslēgumus skarto orgānu un audu sekcijās. Ieslēgumu noteikšana norāda uz infekciju un dažos gadījumos veicina vīrusu slimības diagnozi. Lai noteiktu vīrusu antivielas pacientu asinīs un pētītu antigēna struktūra Tiek izmantoti dažādi vīrusi. Neitralizācijas reakciju izmanto gandrīz visām vīrusu infekcijām. Tas ir balstīts uz imūno antivielu spēju neitralizēt vīrusu infekciozās īpašības, kad maisījumu ievada uzņēmīgu dzīvnieku organismā vai audu kultūrā. Lai noteiktu neitralizācijas indeksu, pastāvīgu seruma devu sajauc ar dažādiem vīrusu atšķaidījumiem un, lai noteiktu antivielu titru - dažādi atšķaidījumi serums ar nemainīgu vīrusu devu. Kontrole ir dzīvnieku (vai audu kultūras) inficēšana ar vīrusu maisījumu ar normālu serumu vai ar sāls šķīdums. Neitralizācijas reakcija tiek veikta ne tikai, lai noteiktu antivielas, bet arī noteiktu vīrusu veidu un veidu.

Komplementa fiksācijas reakcija [piemēram, Bordeta-Džangū reakcija (skatīt)] tiek izmantota, lai noteiktu gan vīrusu antigēnus, gan antivielas. Pirmajā gadījumā reakcija ietver zināma imūnseruma un materiāla, kurā tiek pieņemts antigēnu klātbūtne, mijiedarbību: asins serums, nazofaringeālie uztriepes, inficēta organisma audu ekstrakti. Otrajā gadījumā - zināms antigēns (diagnosticum) un pacienta vai atveseļošanās pacienta serums.

RSK izmanto gripas vīrusu, baku vīrusu, adenovīrusu un arbovīrusu izraisītu slimību diagnosticēšanai.

Kursa darbs

"Klīniskās virusoloģijas metodes"

Ievads

Laboratorijas diagnostika vīrusu infekcijas veic galvenokārt izmantojot elektronu mikroskopiju, jutīgas šūnu kultūras un imunoloģiskās metodes. Parasti diagnozes noteikšanai tiek izvēlēta viena metode atkarībā no vīrusu infekcijas stadijas. Piemēram, visas trīs pieejas var būt noderīgas vējbaku diagnostikā, bet veiksmīga mikroskopijas un šūnu kultūras metožu izmantošana ir atkarīga no spējas savākt apmierinošus paraugus salīdzinoši agrīnā slimības stadijā.

Lielā mērā panākums vīrusu diagnostika ir atkarīgs no saņemto paraugu kvalitātes. Šī iemesla dēļ pašiem laboratorijas darbiniekiem ir jābūt tieši iesaistītiem nepieciešamo paraugu savākšanā. Paraugu raksturojumu, kā arī metodes to nogādāšanai laboratorijā apraksta Lennett, Schmidt, Christ, et al.

Lielāko daļu reaģentu un instrumentu, ko izmanto laboratorijas diagnostikā, var iegādāties dažādos uzņēmumos. Vairumā gadījumu vienu un to pašu reaģentu vienlaikus ražo vairāki uzņēmumi. Šī iemesla dēļ mēs neesam norādījuši atsevišķus uzņēmumus, ja vien reaģentu nepiegādā tikai viens uzņēmums. Visos citos gadījumos jums jāsazinās vispārīgs saraksts tabulā norādītie piegādātāji. 1.

Mūsu mērķis nebija sniegt visaptverošu aprakstu par visām pašlaik pieejamajām cilvēka vīrusu infekciju diagnosticēšanas metodēm. Pirmkārt, mēs raksturojām galvenās metodes. Kā jūs iegūstat pieredzi patstāvīgs darbsšīs pamatmetodes var izmantot sarežģītāku problēmu risināšanai.

1. Elektronu mikroskopija

Vīrusu infekciju elektronmikroskopiskai diagnostikai var izmantot plānas skarto audu daļas. Visbiežāk izmantotais materiāls elektronu mikroskopijai ir izkārnījumi vai šķidrums.

1. tabula. Uzņēmumu saraksts, kas piegādā reaģentus un iekārtas

pūslīši, kas raksturo dažas slimības, piemēram, vējbakas. Analizējot šādu materiālu, vīrusus var noteikt, izmantojot negatīvu krāsojumu, kā rezultātā elektronu blīvs materiāls iezīmē viriona sastāvdaļas. Metode ir efektīva, ja vīrusa koncentrācija testa paraugos, piemēram, izkārnījumos vai vezikulārajā šķidrumā, ir augsta. Gadījumos, kad vīrusa daļiņu saturs paraugos ir zems, vīrusa noteikšanas iespējamību var palielināt, vīrusu koncentrējot ultracentrifugējot vai agregējot ar specifiskām antivielām. Pēdējā metode ir ērta arī vīrusu identificēšanai. Šeit mēs aprakstām elektronu mikroskopiskās diagnostikas metodi rotavīrusa infekcija un imūnelektronu mikroskopijas metode, izmantojot parvovīrusu specifisku antivielu noteikšanas piemēru. Elektronu mikroskopijas metodes sīkāk apraksta Field.

2.1 Tiešā fekāliju elektronmikroskopiskā izmeklēšana

1. Iemērciet Pasteur pipetes galu izkārnījumos un uzvelciet pietiekami daudz materiāla, lai iegūtu 1 cm uztriepi.

2. Atkārtoti suspendējiet fekāliju uztriepi elektronu mikroskopiskā negatīvā kontrasta krāsā, līdz tiek iegūta caurspīdīga suspensija. Negatīvā kontrasta krāsviela ir 2% fosfovolframskābes šķīdums destilētā ūdenī.

3. Lai iegūtu elektronu mikroskopisku paraugu, suspensijas pilienu novieto uz elektronu mikroskopijas režģa, kas pārklāts ar oglekļa formas plēvi. Šīs darbības laikā siets tiek turēts ar tievu pinceti.

4. Zāles atstāj gaisā 30 s.

5. Lieko šķidrumu noņem, pieskaroties stikla malai ar filtrpapīru.

6. Zāles žāvē gaisā.

7. Ja nepieciešams, dzīvotspējīgo vīrusu inaktivē, abas režģa puses apstarojot ar ultravioleto gaismu ar intensitāti 440 000 μW-s/cm2. Šajā gadījumā tiek izmantota īsviļņu ultravioletā lampa ar filtru. Lampai jāatrodas 15 cm attālumā no režģa; Apstarošanas laiks katrai pusei ir 5 minūtes.

8. Rotavīrusa virionus var raksturot caur transmisijas elektronu mikroskopu ar palielinājumu no 30 000 līdz 50 000.

2.2 Imūnelektronu mikroskopija

Tālāk aprakstītā imūnelektronu mikroskopijas metode ir tikai viena no daudzām līdzīgām imunoloģiskajām metodēm. Lai pētītu vīrusam specifiskās antivielas, papildus tiek izmantota metode, kas ietver saistīšanos ar proteīna A mikroskopisko tīklu. Pretvīrusu antivielu darba koncentrāciju nosaka izmēģinājumu un kļūdu diapazonā no 1/10 līdz 1/1000. Mūsu norādītā koncentrācija parasti tiek izmantota ikdienas darbā. Lai iegūtu optimālus rezultātus antivielu mijiedarbībai ar vīrusu, serumu, kas satur parvovīrusu, titrē tādā pašā veidā.

1. 10 µl cilvēka parvovīrusa antiseruma atšķaida 100 reizes ar PBS. Šķīdumu uzkarsē ūdens vannā līdz 56°C.

2. Parastā veidā izkausē 10 ml 2% agarozes PBS un atdzesē līdz 56 °C ūdens vannā.

3. 56 °C temperatūrā sajauc 1 ml atšķaidīta antiseruma ar 1 ml 2% agarozes.

4. Pārnes 200 µl iegūtā maisījuma divās 96 bedrīšu mikrotitrēšanas plāksnes iedobēs.

5. Agarozei ļauj sastingt istabas temperatūrā. Tableti var uzglabāt 4°C vairākas nedēļas, ja tā ir noslēgta ar līmlenti.

6. Pievienojiet 10 µl seruma, kas satur parvovīrusu, iedobē, kurā ir agarozes un antiseruma maisījums.

7. Elektronu mikroskopijas režģis ar iepriekš sagatavotu oglekļa formas pārklājumu tiek novietots mazāk spīdīgajā pusē uz seruma piliena.

8. Tīklu 2 stundas tur 37 °C temperatūrā mitrā kamerā.

9. Izmantojot plānu pinceti, izņemiet sietu un uzklājiet 2% fosfovolframskābes pilienu uz sieta virsmas, kas bija saskarē ar serumu.

10. Pēc 30 s lieko krāsu nomazgā, preparātu nosusina un vīrusu inaktivē.

Agregētās vīrusu daļiņas tiek pārbaudītas caur transmisijas elektronu mikroskopu ar palielinājumu no 30 000 līdz 50 000.

3. Vīrusu antigēnu identificēšana

Audos vai audu šķidrumos atrodamos vīrusus var identificēt pēc vīrusam specifiskiem proteīniem, izmantojot antigēna-antivielu reakciju. Antigēna-antivielu reakcijas produkts tiek testēts pret marķējumu, kas tiek ievadīts vai nu tieši pretvīrusu antivielās, vai antivielās, kas vērstas pret vīrusa specifiskajām antivielām. Antivielas var marķēt ar fluoresceīnu, radioaktīvo jodu vai fermentu, kas šķeļ substrātu, izraisot krāsas maiņu. Turklāt vīrusa identificēšanai tiek izmantota hemaglutinācijas reakcija. Ikdienas praksē aprakstītās metodes galvenokārt tiek izmantotas B hepatīta vīrusa antigēnu noteikšanai asinīs un dažādu vīrusu antigēnu meklēšanai, kas izraisa dažādas elpceļu slimības.

Šobrīd daudzi uzņēmumi ražo eritrocītu, radioaktīvo un fermentatīvo diagnostiku, tai skaitā B hepatīta vīrusa noteikšanai.Mēs neuzskatām par lietderīgu ieskicēt metodes darbam ar šo diagnostiku: pietiek ievērot pievienotos norādījumus. Tālāk mēs pievērsīsimies imunofluorescences metodei respiratorā sincitiālā vīrusa identificēšanai nazofaringijas sekrēcijās.

3.1. Elpošanas sincitiālā vīrusa identificēšana nazofaringijas sekrēcijās ar imunofluorescenci

Nazofaringeālo sekrēciju preparātu iegūšanas metodi apraksta Gārdners un Makkilins. IN laboratorijas apstākļišī darbība tiek veikta divos posmos. Vispirms uz stikla priekšmetstikliņa sagatavo nazofaringijas gļotu uztriepi. Iegūtās uztriepes var uzglabāt fiksētas -20°C temperatūrā vairākus mēnešus. Otrajā posmā tiek iekrāsotas uztriepes, lai noteiktu respiratorā sincitiālā vīrusa antigēnu. Šim nolūkam tiek izmantota netiešās imunofluorescences metode.

3.1.1. Nazofaringeāla sekrēta preparātu sagatavošana

1. Gļotas no speciālām knaiblēm nomazgā ar 1-2 ml PBS un pārnes centrifūgas mēģenē.

2. Centrifugējiet 10 minūtes pie 1500 apgr./min galda centrifūgā.

3. Supernatants tiek notecināts.

4. Šūnu nogulsnes rūpīgi atkārtoti suspendē 2-3 ml PBS, līdz tiek iegūta viendabīga suspensija. Lai to izdarītu, izmantojiet Pasteur pipeti ar platu kaklu.

5. Iegūto suspensiju pārnes mēģenē.

6. Pievienojiet suspensijai vēl 2-4 ml PBS un samaisiet ar pipeti. Tiek noņemti lieli gļotu recekļi.

7. Centrifugējiet 10 minūtes pie 1500 apgr./min galda centrifūgā.

8. Supernatants tiek izmests, nogulsnes atkārtoti suspendētas tādā daudzumā PBS, lai iegūtā suspensija būtu viegli atdalāma no mēģenes sieniņām.

9. Iegūto suspensiju uzklāj uz marķēta stikla priekšmetstikliņa.

10. Glāzi žāvē gaisā.

Nostipriniet acetonā 10 minūtes 4°C temperatūrā.

12. Pēc nostiprināšanas stiklu vēlreiz žāvē gaisā.

13. Iegūtos preparātus nekavējoties iekrāso vai uzglabā -20 °C.

3.1.2. Krāsošanas tehnika

1. Izdrukājiet un atšķaidiet komerciālo RSV antiserumu PBS līdz ieteicamajai darba koncentrācijai.

2. Izmantojot Pasteur pipeti, uzklājiet vienu pilienu antiseruma sagatavotajam preparātam.

3. Zāles ievieto mitrā kamerā.

4. Zāles inkubē 30 minūtes 37 °C temperatūrā.

5. Paraugus rūpīgi mazgā ar PBS, lai īpašā rezervuārā noņemtu liekās antivielas.

6. Paraugus mazgā trīs PBS maiņās, katra 10 minūtes.

7. Nosusiniet paraugus, noņemiet lieko PBS ar filtrpapīru un nosusiniet gaisu.

Pētījumi vīrusu rakstura slimību diagnostikai. Tas nepieciešams, lai identificētu vīrusu, izpētītu tā bioloģiju un spēju ietekmēt dzīvnieku un cilvēku šūnas. Tādējādi kļūst iespējams izprast patoģenēzi vīrusu slimības un, attiecīgi, izvēlēties pareizo ārstēšanas metodi.

Kāda ir diagnoze?

Dzīvās šūnās. Lai to pētītu, ir nepieciešams to kultivēt eksperimentāla organisma līmenī vai šim nolūkam in medicīnas prakse un mikrobioloģijā kopumā tiek veiktas virusoloģiskās izpētes metodes, kurām ir šādas galvenās pieejas:

• taisni;
• netiešs;
• seroloģiskās.

Materiālu var tieši pārbaudīt, lai noteiktu nukleīnskābju, vīrusa antigēna klātbūtni, vai, piemēram, vīrusu var izolēt un identificēt no klīniskā materiāla.

Papildus spējai noteikt slimības etioloģiju, uzraudzība terapeitiskais efekts, vīrusu pētījumu metodēm ir liela nozīme pretepidēmijas pasākumos. Izolācijai izmanto vistu embrijus, laboratorijas dzīvniekus vai šūnu kultūras.

Kā tas tiek pētīts?

Ātrākā ir tiešā metode. Tas ļauj noteikt vīrusu, antigēnu vai NA (nukleīnskābi) pašā klīniskajā materiālā. Tas aizņem no divām stundām līdz dienai.

1. EM - elektronu mikroskopija. Atklāj vīrusu tieši.
2. IEM - imūnelektronu mikroskopija. Izmanto specifiskas antivielas pret vīrusiem.
3. RIF - imunofluorescences reakcija. Izmanto antivielas, kas saistītas ar krāsvielu. Šādas virusoloģiskās izpētes metodes tiek plaši izmantotas, lai ātri atšifrētu ARVI (akūtas elpceļu vīrusu infekcijas) etioloģiju, kad tiek ņemti pirkstu nospiedumu uztriepes no augšējo elpceļu gļotādas.
4. ELISA – ar enzīmu saistīts imūnsorbcijas tests – vīrusu antigēnu noteikšana, līdzīgi kā RIF, bet balstās uz antivielu marķēšanu ar fermentiem.
5. RIA - radioimūntests. Izmanto antivielu radioaktīvo iezīmēšanu, lai nodrošinātu augstu jutību vīrusa antigēna noteikšanā.
6. Molekulārā - NK hibridizācija vai vīrusa genomu izolēšana, izmantojot PCR (polimerāzi ķēdes reakcija).
7. Citoloģiju izmanto reti, taču noteiktām infekcijām šīs virusoloģiskās izpētes metodes ir ļoti efektīvas. Tiek pārbaudīti biopsijas materiāli, autopsijas un uztriepes, kas apstrādātas krāsošanai un analīzei mikroskopā.

Kāda ir pētījuma jēga?

Lai veiksmīgi izolētu vīrusus, klīniskais materiāls tiek ņemts atbilstoši patoģenēzei un pēc iespējas agrāk. Bieži vien šim procesam ir nepieciešami vairāki fragmenti, pirms tiek izmantotas noteiktas virusoloģiskās izpētes metodes.

Mikrobioloģija ir mikroskopisku radījumu izpēte. Un viņas joma nav tikai medicīna. Tā ir fundamentālā zinātne Lauksaimniecība, veterinārmedicīna, kosmosa un tehniskās nozares, ģeoloģija.

Bet, protams, viss tika radīts cilvēkam un viņa attīstībai uz šīs skaistās planētas. Tāpēc ļoti svarīgi ir laikus atklāt briesmas un tās neitralizēt. Vīrusi atšķiras no baktērijām. Tās ir struktūras, kas nonāk organismā un izraisa jaunas paaudzes veidošanos. Tie izskatās kā kristāli un ir vērsti uz to vairošanās procesa kontroli, lai gan paši nebarojas, neaug un neizdala vielmaiņas produktus.

Vīruss var izraisīt nopietna slimība jebkurā dzīvā organismā, kurā tas nonāk. Turklāt tas var attīstīties. Tāpēc ir jāattīsta un jāpilnveido virusoloģiskās izpētes metodes mikrobioloģijā, jo cilvēka civilizācija kopumā var būt apdraudēta.

Materiāli

Lai atklātu un identificētu vīrusus medicīnā, parasti tiek veikti šādi pasākumi:

• nazofaringijas skalošana ( elpceļu infekcijas);
• pietvīkums un izkārnījumi ( enterovīrusu infekcijas);
• skrāpējumi, tulznu saturs (ādas bojājumi, gļotādas, piemēram, herpes, vējbakas);
• pietvīkums (eksantēmiskas infekcijas, piemēram, masalas, masaliņas);
• asinis, cerebrospinālais šķidrums(arbovīrusu infekcijas).

Fāzes

Visi virusoloģiskās izpētes metodes posmi ietver:

• materiālu savākšana;
• atlase, testa sistēmas iegūšana, tās dzīvotspējas noteikšana;
• testa sistēmas infekcija;
• vīrusu indikācija;
• vīrusa veida noteikšana.

Būtībā patogēnie vīrusi atšķiras ar audu klātbūtni un tipa specifiku. Ņemiet, piemēram, poliovīrusu, kas vairojas tikai primātos (to šūnās). Attiecīgi, lai izolētu konkrētu vīrusu, tiek izmantota noteikta audu kultūra. Ja mēs runājam par par nezināmu patogēnu, būtu ieteicams vienlaikus inficēt trīs vai vēlams četras šūnu kultūras.

Tādējādi, iespējams, kāds no viņiem būs jūtīgs. Lai noteiktu vīrusa klātbūtni inficētajās kultūrās, tiek aplūkota specifiskas šūnu deģenerācijas attīstība, intracelulāri ieslēgumi, specifiska antigēna identificēšana, pozitīvas hemaglutinācijas un hemadsorbcijas reakcijas.

Visas virusoloģiskās izpētes metodes (tiešās un netiešās, seroloģiskās) jāizvēlas kā vispiemērotākās konkrētajam iespējamās infekcijas gadījumam.

Netiešās metodes ir balstītas uz vīrusa izolēšanu un identificēšanu. Tie ir darbietilpīgi, laikietilpīgi, bet precīzi.

Serodiagnoze

Šī diagnoze attiecas uz metodi, kuras pamatā ir antigēna-antivielu reakcija. Visbiežāk tiek izmantoti sapāroti asins serumi, kas tiek ņemti ar vairāku nedēļu intervālu. Ja antivielu titrs palielinās 4 reizes vai vairāk, reakcija tiek uzskatīta par pozitīvu. Lai noteiktu vīrusa tipa specifiku, tiek izmantota vīrusa neitralizācijas reakcija. Lai noteiktu grupas specifiku, nepieciešams iegūt komplementa saistīšanas reakciju.

Dažādi enzīmu imūnanalīzes varianti, hemaglutinācijas inhibīcijas reakcijas, pasīvā hemaglutinācija, reversā pasīvā hemaglutinācija, RIF. Arī iekšā gēnu inženierija tika izstrādāta metode monoklonālo antivielu iegūšanai. Monoklonu šauro specifiku var pārvarēt, izmantojot vairākas monoklonālas antivielas pret dažādiem vīrusu determinantiem. Tādējādi tika palielināta antigēna noteikšanas testa specifika un jutība.

Dažas funkcijas

Mūsdienās ir izveidotas daudzas dažādas testu sistēmas, lai imunoloģiski diagnosticētu infekcijas, kas rodas, vīrusam nonākot dzīvā organismā.

Tādējādi virusoloģiskās izpētes metodes ir metodes vīrusu izdalīšanai, to īpašību izpētei un to etioloģiskās saiknes noteikšanai ar noteiktām slimībām.

Virusoloģiskie pētījumi ietver divus galvenos posmus: vīrusu izolēšanu un to identificēšanu. Virusoloģiskās izpētes materiāls var būt asinis, citi bioloģiskie un patoloģiskie šķidrumi, orgānu un audu biopsijas.

Virusoloģiskās asins analīzes bieži tiek veiktas, lai diagnosticētu arbovīrusu infekcijas. Trakumsērgas vīrusus var atrast siekalās, cūciņas, herpes simplex, Nazofaringijas uztriepes izmanto gripas un citu akūtu elpceļu vīrusu infekciju, masalu patogēnu izolēšanai. Adenovīrusi ir atrodami konjunktīvas uztriepēs. No izkārnījumiem tiek izdalīti dažādi entero-, adno-, pso-, nora- un rotavīrusi.

Vīrusu izolēšanai izmanto šūnu kultūras, vistu embrijus un dažreiz laboratorijas dzīvniekus.

Lielākā daļa patogēno vīrusu izceļas ar audu klātbūtni un tipa specifiku, piemēram, poliovīruss vairojas tikai primātu šūnās, tāpēc konkrēta vīrusa izolēšanai izmanto atbilstošu audu kultūru. Lai izolētu nezināmu patogēnu, vēlams vienlaikus inficēt 3-4 šūnu kultūras, pieņemot, ka viena no tām var būt jutīga. Vīrusa klātbūtni inficētajās šūnu kultūrās nosaka specifiskas šūnu deģenerācijas attīstība, t.i. citopatogēna darbība, intracelulāro ieslēgumu noteikšana, kā arī pamatojoties uz specifiska antigēna noteikšanu ar imunofluorescenci, pozitīvas hemadsorbcijas un hemaglutinācijas reakcijas.

Putnu embriji ar to vāji diferencētajiem audiem ir piemēroti daudzu vīrusu kultivēšanai. Lielāko daļu laika tiek izmantoti vistas embriji. Vairojoties embrijos, vīrusi var izraisīt to nāvi (arbovīrusi), izmaiņu parādīšanos horionalantojā membrānā (baku vīrusi) vai embrija ķermenī, lipekļa uzkrāšanos embriju šķidrumos (gripas vīrusi, cūciņas). ) un komplementu saistošo vīrusa antigēnu .

Vīrusu identificēšana tiek veikta, izmantojot imunoloģiskās metodes: hemaglutinācijas inhibīcijas reakciju, komplementa fiksāciju, neitralizāciju, gēla izgulsnēšanos, imunofluorescenci.

Vairāk par tēmu Virusoloģiskā metode:

1. Antropometrisko pamatdatu novērtēšana, izmantojot parametrisko metodi (sigmas metodi)
2. Ārstēšana, izmantojot nosacītās komunikācijas izzušanas metodi un piespiedu apmācības metodi
3. 2. Salīdzinošā juridiskā metode - tiesību zinātnes privātā zinātniskā metode
4. MODERNĀS DIAGNOZES METODES UN ĀRSTNIECĪBAS METODES IZVĒLE DZEMDES MIEMĀ
5. 5.4. Vispārējās izmeklēšanas metodes kā praktiskās darbības metodes jēdziens un struktūra
6. Tēma 8. MIKROBIOLOĢISKĀS METODES MAINĪBAS IZPĒTEI UN MANTOŠANAS INFORMĀCIJAS PĀRRAIDĪŠANAS MEHĀNISMI. ĢENĒTISKĀS METODES PIEMĒROŠANA JAUNU ZĀĻU RADĪŠANAI
7. 15. tēma. MIKROORGANISMU PATOGĒNITĀTE UN VIRULENCITĀTE. VIRULENCES FAKTORI. LABORATORIJAS DZĪVNIEKU INFEKCIJAS METODES. ANTIGĒNI, TO IEGŪŠANAS METODES. ANTIVIELAS. IMUNITĀTES REAKCIJAS UN TO PRAKTISKĀ IZMANTOŠANA. FAGOCITOZE

Virusoloģiskās izpētes metodes

vīrusu bioloģijas izpētes un to identificēšanas metodes. Metodes tiek plaši izmantotas virusoloģijā molekulārā bioloģija, ar kuras palīdzību bija iespējams noteikt vīrusu daļiņu molekulāro struktūru, to iekļūšanas šūnā metodes un vīrusu reprodukcijas pazīmes, vīrusu nukleīnskābju un olbaltumvielu primāro struktūru. Tiek izstrādātas metodes, lai noteiktu vīrusu nukleīnskābju un olbaltumvielu aminoskābju veidojošo elementu secību. Kļūst iespējams nukleīnskābju un to kodēto proteīnu funkcijas saistīt ar nukleotīdu secību un noteikt intracelulāro procesu cēloņus, kam ir svarīga loma vīrusu infekcijas patoģenēzē.

Virusoloģiskās izpētes metodes balstās arī uz imunoloģiskiem procesiem (antigēna mijiedarbība ar antivielām), vīrusa bioloģiskajām īpašībām (hemaglutinācijas, hemolīzes, fermentatīvā aktivitāte), vīrusa mijiedarbības ar saimniekšūnu iezīmes (citopātiskā efekta raksturs, intracelulāru ieslēgumu veidošanās utt.).

Vīrusu infekciju diagnostikā, vīrusu audzēšanā, izolēšanā un identificēšanā, kā arī vakcīnas preparātu ražošanā plaši tiek izmantota audu un šūnu kultūras metode. Tiek izmantotas primārās, sekundārās, stabilās nepārtrauktās un diploīdu šūnu kultūras. Primārās kultūras iegūst, izkliedējot audus ar proteolītiskajiem enzīmiem (tripsīnu, kolagenāzi). Šūnu avots var būt cilvēku un dzīvnieku embriju audi un orgāni (parasti nieres). Šūnu suspensija uzturvielu barotnē tiek ievietota tā sauktajos matračos, pudelēs vai Petri trauciņos, kur pēc pievienošanās trauka virsmai šūnas sāk vairoties. Vīrusu infekcijai parasti izmanto šūnu monoslāni. Barības šķidrumu notecina, vīrusu suspensiju pievieno noteiktos atšķaidījumos un pēc saskares ar šūnām pievieno svaigu barotni, parasti bez seruma.

Lielāko daļu primāro kultūru šūnas var subkultivēt; šādu kultūru sauc par sekundāro kultūru. Ar turpmāku šūnu pāreju veidojas fibroblastiem līdzīgu šūnu populācija, kas spēj ātri vairoties, Lielākā daļa kas saglabā sākotnējo hromosomu komplektu. Tās ir tā sauktās diploīdās šūnas. Sērijveidā kultivējot šūnas, tiek iegūtas stabilas nepārtrauktas šūnu kultūras. Pasāžu laikā parādās ātri dalošas viendabīgas šūnas ar heteroploīdu hromosomu kopu. Stabilas šūnu līnijas var būt viena slāņa vai suspensijas. Viena slāņa kultūras aug nepārtraukta slāņa veidā uz stikla virsmas, bet suspensijas kultūras aug suspensiju veidā dažādos traukos, izmantojot maisīšanas ierīces. Ir vairāk nekā 400 šūnu līnijas, kas iegūtas no 40 dažādi veidi dzīvnieki (tostarp primāti, putni, rāpuļi, abinieki, zivis, kukaiņi) un cilvēki.

Gabaliņus var kultivēt mākslīgā barotnē atsevišķi orgāni un audi (orgānu kultūras). Šāda veida kultūras saglabā audu struktūru, kas ir īpaši svarīgi, lai izolētu un pārvietotu vīrusus, kas nevairojas nediferencētās audu kultūrās (piemēram, koronavīrusi).

Inficētās šūnu kultūrās vīrusus var noteikt pēc šūnu morfoloģijas izmaiņām, citopātijas iedarbības, kas var būt specifiskas, ieslēgumu parādīšanās, nosakot vīrusa antigēnus šūnā un kultūras šķidrumā; vīrusu pēcnācēju bioloģisko īpašību noteikšana kultūras šķidrumā un vīrusu titrēšana audu kultūrā, vistu embrijos vai jutīgos dzīvniekos; identificējot atsevišķas vīrusu nukleīnskābes šūnās ar molekulāro hibridizāciju vai nukleīnskābju akumulāciju ar citoķīmisko metodi, izmantojot fluorescējošu mikroskopiju.

Vīrusu izolēšana ir darbietilpīgs un laikietilpīgs process. To veic, lai noteiktu populācijā cirkulējošā vīrusa veidu vai variantu (piemēram, lai identificētu gripas vīrusa serovariantu, savvaļas vai vakcīnas poliomielīta vīrusa celmu utt.); gadījumos, kad nepieciešams veikt neatliekamus epidemioloģiskos pasākumus; kad parādās jauni vīrusu veidi vai varianti; ja nepieciešams, apstiprina provizorisko diagnozi; lai norādītu uz vīrusiem objektos vidi. Izolējot vīrusus, tiek ņemta vērā to pastāvēšanas iespēja cilvēka organismā, kā arī jauktas infekcijas rašanās, ko izraisa divi vai vairāki vīrusi. Ģenētiski viendabīgu vīrusa populāciju, kas iegūta no viena viriona, sauc par vīrusa klonu, un tā iegūšanas procesu sauc par klonēšanu.

Vīrusu izolēšanai izmanto uzņēmīgo laboratorijas dzīvnieku un vistu embriju inficēšanu, bet visbiežāk izmanto audu kultūru. Vīrusa klātbūtni parasti nosaka specifiska šūnu deģenerācija (citopātiskais efekts), simpplastu un sincitijas veidošanās, intracelulāro ieslēgumu noteikšana, kā arī specifisks antigēns, kas noteikts, izmantojot imunofluorescenci, hemadsorbciju, hemaglutināciju (hemaglutinējošiem vīrusiem) utt. . Šīs pazīmes var atklāt tikai pēc 2-3 vīrusa pārejām.

Lai izolētu vairākus vīrusus, piemēram, gripas vīrusus, tiek izmantoti vistu embriji, bet dažu Koksaki vīrusu un vairāku arbovīrusu izolēšanai tiek izmantotas jaundzimušās peles. Izolētu vīrusu identificēšana tiek veikta, izmantojot seroloģiskās reakcijas un citas metodes.

Strādājot ar vīrusiem, tiek noteikts to titrs. Vīrusu titrēšanu parasti veic audu kultūrā, nosakot vīrusu saturošā šķidruma augstāko atšķaidījumu, pie kura notiek audu deģenerācija, veidojas ieslēgumi un vīrusam specifiski antigēni. Plāksnes metodi var izmantot, lai titrētu vairākus vīrusus. Plāksnes jeb negatīvās vīrusu kolonijas ir vīrusa iznīcināto šūnu perēkļi viena slāņa audu kultūrā zem agara pārklājuma. Koloniju skaitīšana ļauj kvantitatīvi analizēt vīrusu infekciozo aktivitāti, pamatojoties uz to, ka viena infekcioza vīrusa daļiņa veido vienu plāksni. Plāksnes tiek noteiktas, krāsojot kultūru ar intravitālām krāsām, parasti neitrālu sarkanu; plāksnes neabsorbē krāsvielu un tāpēc ir redzamas kā gaiši plankumi uz iekrāsoto dzīvo šūnu fona. Vīrusa titru izsaka kā aplikumu veidojošo vienību skaitu uz 1 ml.

Vīrusu attīrīšanu un koncentrēšanu parasti veic ar diferenciālu ultracentrifugēšanu, kam seko koncentrācijas vai blīvuma gradienta centrifugēšana. Vīrusu attīrīšanai izmanto imunoloģiskās metodes, jonu apmaiņas hromatogrāfiju, imūnsorbentus u.c.

Vīrusu infekciju laboratoriskā diagnostika ietver patogēna vai tā sastāvdaļu noteikšanu klīniskajā materiālā; vīrusa izolēšana no šī materiāla; serodiagnoze. Metodes izvēle laboratorijas diagnostika katrā atsevišķā gadījumā ir atkarīgs no slimības rakstura, slimības perioda un laboratorijas iespējām. Mūsdienu diagnostika vīrusu infekciju pamatā ir ekspresmetodes, kas ļauj saņemt atbildi dažas stundas pēc klīniskā materiāla uzņemšanas agri datumi pēc slimības, Tie ietver elektronu un imūno elektronu mikroskopiju, kā arī imunofluorescenci, molekulārās hibridizācijas metodi, IgM klases antivielu noteikšanu utt.

Negatīvi iekrāsotu vīrusu elektronmikroskopija ļauj diferencēt vīrusus un noteikt to koncentrāciju. Elektronu mikroskopijas izmantošana vīrusu infekciju diagnostikā aprobežojas ar tiem gadījumiem, kad vīrusu daļiņu koncentrācija klīniskajā materiālā ir diezgan augsta (10 5 no 1 ml un augstāk). Metodes trūkums ir nespēja atšķirt vīrusus, kas pieder vienai taksonomiskajai grupai. Šis trūkums tiek novērsts, izmantojot imūno elektronu mikroskopiju. Metodes pamatā ir imūnkompleksu veidošanās, pievienojot vīrusu daļiņām specifisku serumu, vienlaikus koncentrējot vīrusa daļiņas, ļaujot tās identificēt. Šo metodi izmanto arī antivielu noteikšanai. Ekspresdiagnostikas nolūkos tiek veikta audu ekstraktu, fekāliju, šķidruma no vezikulām un nazofarneksa sekrēciju elektronmikroskopiskā izmeklēšana. Elektronu mikroskopija plaši izmanto vīrusa morfoģenēzes pētīšanai, tā iespējas tiek paplašinātas, izmantojot marķētas antivielas.

Molekulārā hibridizācijas metode, kuras pamatā ir vīrusam specifisku nukleīnskābju noteikšana, ļauj noteikt atsevišķas gēnu kopijas, un tai nav līdzvērtīgas jutības. Reakcija balstās uz komplementāru DNS vai RNS virkņu (zondu) hibridizāciju un divpavedienu struktūru veidošanos. Lētākā zonde ir klonēta rekombinantā DNS. Zonde ir marķēta ar radioaktīviem prekursoriem (parasti radioaktīvo fosforu). Kolorimetrisko reakciju izmantošana ir daudzsološa. Ir vairākas molekulārās hibridizācijas iespējas: vietas hibridizācija, blot hibridizācija, sviestmaižu hibridizācija, in situ hibridizācija utt.

IgM klases antivielas parādās agrāk nekā G klases antivielas (3.-5.slimības dienā) un izzūd pēc dažām nedēļām, tāpēc to noteikšana liecina par nesenu infekciju. LgM klases antivielas tiek noteiktas ar imunofluorescenci vai enzīmu imūntestu, izmantojot anti-μ antiserumus (serumus pret lgM smagajām ķēdēm).

Seroloģiskās metodes virusoloģijā balstās uz klasiskām imunoloģiskām reakcijām (skatīt Imunoloģiskās izpētes metodes) : komplementa fiksācijas reakcijas, hemaglutinācijas inhibīcija, bioloģiskā neitralizācija, imūndifūzija, netiešā hemaglutinācija, radiālā hemolīze, imunofluorescence, enzīmu imūntests, radioimūntests. Daudzām reakcijām ir izstrādātas mikrometodes, un to paņēmieni tiek pastāvīgi pilnveidoti. Šīs metodes izmanto vīrusu identificēšanai, izmantojot zināmu serumu komplektu, un serodiagnostikai, lai noteiktu antivielu palielināšanos otrajā serumā, salīdzinot ar pirmo (pirmo serumu ņem pirmajās dienās pēc slimības, otro – pēc 2. 3 nedēļas). Diagnostikas vērtība ir vismaz četrkārtīgs antivielu pieaugums otrajā serumā. Ja IgM klases antivielu noteikšana liecina par nesenu infekciju, tad IgC klases antivielas saglabājas vairākus gadus un dažreiz visu mūžu.

Lai identificētu atsevišķus vīrusu antigēnus un antivielas pret tiem kompleksos maisījumos bez iepriekšējas olbaltumvielu attīrīšanas, tiek izmantota imūnblotēšana. Metode apvieno olbaltumvielu frakcionēšanu, izmantojot poliakrilamīda gēla elektroforēzi, ar sekojošu proteīnu imūnindikāciju, izmantojot enzīmu imūnanalīzes metodi. Olbaltumvielu atdalīšana samazina prasības attiecībā uz antigēna ķīmisko tīrību un ļauj identificēt atsevišķus antigēna-antivielu pārus. Šis uzdevums ir būtisks, piemēram, HIV infekcijas serodiagnozē, kur kļūdaini pozitīvas ar enzīmu saistītās imūnsorbcijas testa reakcijas izraisa antivielu klātbūtne pret šūnu antigēniem, kas rodas vīrusu proteīnu nepietiekamas attīrīšanas rezultātā. Antivielu identificēšana pacienta serumos pret iekšējiem un ārējiem vīrusu antigēniem ļauj noteikt slimības stadiju un, analizējot populācijas, vīrusu proteīnu mainīgumu. HIV infekcijas imūnblotēšana tiek izmantota kā apstiprinošs tests, lai identificētu atsevišķus vīrusu antigēnus un antivielas pret tiem. Analizējot populācijas, šo metodi izmanto, lai noteiktu vīrusu proteīnu mainīgumu. Metodes lielā vērtība ir iespēja analizēt antigēnus, kas sintezēti, izmantojot rekombinantās DNS tehnoloģiju, nosakot to izmērus un antigēnu determinantu klātbūtni.