PCR analīzes (PCR diagnostika) veikšana sākas ar materiāla savākšanu pārbaudei ginekologam, urologam vai dermatovenerologam. Pēc tam iegūto rezultātu kvalitāti un uzticamību nodrošina Euromedprestige medicīnas centra ārstu augstākā kvalifikācija un lielā pieredze, kuri ievēro visus nepieciešamos noteikumus. veicot PCR- analīze: pilnīga sterilitāte, tikai vienreiz lietojamu materiālu izmantošana.

Savākto materiālu no otas ievieto traukā ar sāls šķīdumu. Pēc savākšanas paraugi pēc iespējas ātrāk jānogādā PCR laboratorijā.

PCR analīze laboratorijā tiek veikta trīs posmos:

1. DNS ekstrakcija
2. DNS fragmentu pastiprināšana
3. DNS amplifikācijas produktu noteikšana

DNS ekstrakcija ir PCR diagnostikas sākuma posms, kura būtība ir šāda: ārsts no pacienta paņem materiālu izpētei un pakļauj to īpašai apstrādei. Apstrādes laikā DNS dubultā spirāle tiek sadalīta atsevišķās virknēs. Pacienta materiālam tiek pievienots īpašs šķidrums, kas izšķīdina organiskās vielas, kas traucē reakcijas "tīrību". Tas noņem lipīdus, aminoskābes, peptīdus, ogļhidrātus, olbaltumvielas un polisaharīdus. Tā rezultātā veidojas DNS vai RNS.

PCR metodes princips ir jaunu DNS vai RNS infekciju “konstruēšana”. To nevar izdarīt, nenoņemot šūnu materiālu.

DNS ekstrakcijai pavadītais laiks ir atkarīgs no infekcijas izraisītāja un no PCR pētījumos izmantotā materiāla veida. Piemēram, asiņu sagatavošana nākamajam posmam aizņem 1,5-2 stundas.

0Masīvs ( => Analīzes) Masīvs ( => 2) Masīvs ( =>.html) 2

DNS amplifikācija

Lai veiktu nākamo DNS diagnostikas posmu - DNS pastiprināšanu - ārsti izmanto tā sauktās DNS matricas - infekciju DNS molekulas, uz kurām vēlāk notiks DNS “klonēšana”. Jau minēts, ka pilnīgas infekcijas DNS klātbūtne nav nepieciešama, lai veiktu šo posmu, pietiek ar nelielu DNS molekulas gabalu, kas raksturīgs tikai konkrētajam mikrobam (infekcijai).

DNS amplifikācijas un attiecīgi visa PCR reakcijas principa pamatā ir dabiskais DNS pabeigšanas process visām dzīvajām būtnēm - DNS replikācija, kas tiek veikta, dubultojot vienu DNS ķēdi.

Sākot ar vienu atsevišķu DNS fragmentu, laboratorijas ārsts to kopē un palielina kopiju skaitu ķēdes reakcijas režīmā: pēc pirmā cikla jums jau ir 2 fragmenti, pēc otrā cikla - 4, pēc trešā - 8, pēc ceturtais - 16, tad 32 , 64, 128, 256... Ar katru ciklu eksemplāru skaits dubultojas, un pēc divdesmit cikliem skaitīšana jau kļūst miljonos, bet pēc trīsdesmit - miljardos. Cikls ilgst dažas minūtes un vārās līdz noteiktām temperatūras izmaiņām ļoti mazā ķīmiskajā reaktorā. Šeit, šķīdumā, pietiekamā daudzumā ir visi nepieciešamie sintēzes komponenti, pirmkārt, nukleotīdi A, G, T un C, kā arī tiek veiktas smalkas sagatavošanās ķīmiskās darbības, lai no katra nekavējoties tiktu paņemta precīza kopija. pabeigts DNS segments, tad no šīs kopijas - atkal kopija, tā ir sazarotā ķēdes reakcija.

DNS ķēdei pievienojot primerus – mākslīgi sintezētus DNS “gabalus” (nukleotīdu pārus), kas līdzīgi mikrobu DNS (infekcijām) – veidojas divas īsas spirāles, kas sastāv no divām DNS sekciju virknēm, kas nepieciešamas nākotnes sintēzei. DNS.

Jaunas ķēdes sintēze notiek, pabeidzot katru no diviem DNS pavedieniem. Pastiprināšanas process notiek ar konkrēta reģiona palīdzību - DNS polimerāzi, kas dod nosaukumu laboratorijas metodei. Polimerāze darbojas kā reakcijas katalizators un uzrauga secīgu nukleotīdu bāzu piesaisti augošajai jaunajai DNS virknei.

Tādējādi DNS amplifikācija ir daudzkārtējs DNS kopiju skaita pieaugums, kas ir specifiskas, t.i., raksturīgas tikai noteiktam organismam. Nav nepieciešams pabeigt visu DNS ķēdi, lai redzētu infekcijas izraisītāju. Nepieciešama tikai tā zona, kas ir raksturīga konkrētai baktērijai kā indivīdam.

5360 rubļi. Visaptverošas programmas izmaksas ar gastroenterologu

ATLAIDE 25% PĒC PIEŅEMŠANAS PIE KARDIOLOGA

- 25%primārs
Ārsta vizīte
terapeits nedēļas nogalēs

RUB 5160 nevis 5420 rub. Vīriešu skrīnings attiecībā uz uroloģiskām infekcijām

ALERGOLOĢIJA 5120 RUB nevis 5590 rub.

Visas ļoti atkārtotās pastiprināšanas darbības notiek dažādās temperatūrās. Lai veiktu PCR analīzi, tiek izmantots speciāli programmējams aprīkojums - PCR - termostats vai pastiprinātājs, kas automātiski maina temperatūru. Pastiprināšana tiek veikta saskaņā ar noteiktu programmu, kas atbilst konstatētās infekcijas veidam. Atkarībā no programmas un atklātās infekcijas veida automatizētais PCR process ilgst no 2 līdz 3 stundām.

PCR diagnostikā liela nozīme ir laboratorijas ārsta, kurš veic analīzi, kvalifikācijai, no viņa ir atkarīgi pareizi PCR iekārtas iestatījumi un rezultātu interpretācija. Medicīnas centra Euromedprestige ārstiem ir liela pieredze DNS diagnostikas veikšanā, kas nodrošina pētījuma rezultātu ticamību un garantē pozitīvus panākumus ārstēšanā infekcijas slimības. Lai veiktu pārbaudi, izmantojot PCR metodi, un veikt pilna diagnostika un infekcijas slimību ārstēšana mūsu medicīnas centrs"Euromedprestige".

Pastiprināšanas produktu noteikšanas laikā tiek atdalīts iegūtais amplifikācijas produktu maisījums. Maisījumam tiek pievienoti speciāli šķīdumi, kas dod DNS fragmentiem spēju fluorescēt – atspoguļojas oranžsarkanās gaismas svītrās. Iegūtais spīdums norāda uz vīrusu, mikrobu vai baktēriju DNS klātbūtni materiālā, kas ņemts no pacienta PCR analīzei.

GOU VPO "Krasnojarskas Valsts medicīnas akadēmija"

Nosaukts Jaseņecka federālās veselības un sociālās attīstības aģentūras vārdā »

Medicīnas ģenētikas un klīniskās neirofizioloģijas katedra IPO

METODES PAMATPRINCIPI

POLIMERĀZES ĶĒDES REAKCIJA

Rīku komplekts 3-4 gadu studentiem

vispārējās medicīnas specialitātēs (060101) un

Krasnojarska - 2007

Šneiders, N. A., Butjanovs, R. A. Polimerāzes ķēdes reakcijas metodes pamatprincipi. Metodiskā rokasgrāmata 3-4 kursu studentu ārpusstundu darbam vispārējās medicīnas (060101) un pediatrijas (060103) specialitātēs. – Krasnojarska: Valsts profesionālās augstākās izglītības iestādes izdevniecība KrasSMA, 2007. – 42 lpp.

Metodiskā rokasgrāmata pilnībā atbilst Valsts standarta (2000) prasībām un atspoguļo galvenos aspektus moderna metode diagnostika iedzimtas slimības cilvēks – polimerāzes ķēdes reakcijas metode, izglītojošs materiāls pielāgots izglītības tehnoloģijasņemot vērā apmācības specifiku 3-4 gadu medicīnas un pediatrijas fakultātēs.

Recenzenti: Valsts profesionālās augstākās izglītības iestādes Medicīniskās ģenētikas katedras vadītājs

"Federālās veselības aģentūras Novosibirskas Valsts medicīnas universitāte un sociālā attīstība", medicīnas zinātņu doktors, profesors;

DNS replikācija

Šīs metodes izpētes objekts ir dezoksiribonukleīnskābe (DNS). DNS ir universāls ģenētiskās informācijas nesējs visos uz Zemes esošajos organismos (izņemot RNS saturošos mikroorganismus). DNS ir dubultā virkne, kas savīta spirālē. Katra virkne sastāv no secīgi savienotiem nukleotīdiem. DNS virknēm ir pretēji virzieni: vienas virknes 5" gals atbilst otrās virknes 3" galam. Unikāls īpašums DNS ir tās spēja dubultoties. Šo procesu sauc replikācija. DNS molekulas replikācija notiek starpfāzes sintētiskajā periodā. Katra no divām “mātes” molekulas ķēdēm kalpo kā “meitas” veidne. Pēc replikācijas tikko sintezētā DNS molekula satur vienu “mātes” virkni, bet otrā ir tikko sintezēta “meitas” virkne (daļēji konservatīva metode). Priekš matricas sintēze Lai veidotos jauna DNS molekula, vecā molekula ir jāatvelk un jāizstiepj. Replikācija sākas vairākās DNS molekulas vietās. Tiek saukta DNS molekulas sadaļa no vienas replikācijas sākuma punkta līdz otras replikācijas sākuma punktam replikons.

Ir aktivizēts replikācijas sākums gruntskrāsas(praimeri), kas sastāv no 100-200 nukleotīdu pāriem. DNS helikāzes enzīms atritina un sadala mātes DNS spirāli divās virknēs, uz kurām saskaņā ar komplementaritātes principu, piedaloties DNS polimerāzes enzīmam, tiek saliktas “meitas” DNS virknes. Lai ferments sāktu savu darbu, ir nepieciešams sākuma bloks - neliels sākotnējais divpavedienu fragments. Sākuma bloku veido praimera mijiedarbība ar sākotnējās DNS atbilstošās virknes komplementāro reģionu. Katrā replikonā DNS polimerāze var pārvietoties pa “mātes” virkni tikai vienā virzienā (5`=>3`).

Vadošajā dzīslā, replikonam atritinoties, “meitas” dzīsla pakāpeniski nepārtraukti aug. Atpaliekošajā dzīslā meitas pavediens arī sintezējas virzienā (5`=>3`), bet atsevišķos fragmentos, replikonam atritinot.

Tādējādi “meitas” virkņu komplementāru nukleotīdu pievienošana notiek pretējos virzienos (antiparalēli). Replikācija visos replikonos notiek vienlaicīgi. Dažādos replikonos sintezētos “meitas” pavedienu fragmentus un daļas sašuj vienā virknē enzīma ligāze. Replikāciju raksturo daļēji konservativitāte, pretparalēlisms un pārtraukums. Viss šūnas genoms tiek replicēts vienu reizi laika periodā, kas atbilst vienam mitotiskajam ciklam. Replikācijas procesa rezultātā no vienas DNS molekulas veidojas divas DNS molekulas, kurās viena virkne ir no mātes DNS molekulas, bet otrā, meita, no jauna sintezēta (1. att.).

Rīsi. 1. DNS molekulu replikācijas shēma.

Tādējādi DNS replikācijas cikls ietver trīs galvenie posmi:

1. DNS spirāles attīšana un pavedienu diverģence (denaturācija);

2. gruntējumu piestiprināšana;

3. bērna pavediena ķēdes pabeigšana.

PCR metodes princips

Tā ir DNS replikācija, kas veido PCR pamatu. PCR iepriekšminētie procesi tiek veikti mēģenē cikliskā režīmā. Pāreju no vienas reakcijas stadijas uz otru panāk, mainot inkubācijas maisījuma temperatūru. Kad šķīdumu uzkarsē līdz 93-95°C, notiek DNS denaturācija. Lai pārietu uz nākamo posmu – gruntskrāsu pievienošanu vai “atlaidināšanu”, inkubācijas maisījumu atdzesē līdz 50-65°C. Pēc tam maisījumu uzkarsē līdz 70-72°C - optimālai taq-DNS polimerāzei - šajā posmā notiek jaunas DNS ķēdes uzbūve. Pēc tam cikls atkārtojas vēlreiz. Citiem vārdiem sakot PCR metode ir kopiju skaita daudzkārtēja palielināšana (pastiprināšana) specifiska DNS sadaļa, ko katalizē enzīms DNS polimerāze.

Meitas DNS virkņu augšanai jānotiek vienlaicīgi abās mātes DNS virknēs, tāpēc arī otrās virknes replikācijai ir nepieciešams savs primer. Tādējādi reakcijas maisījumam pievieno divus gruntējumus: vienu “+” ķēdei, otru “-” ķēdei. Piestiprinoties DNS molekulas pretējām virknēm, praimeri aprobežojas ar tās daļu, kas pēc tam tiks dublēta vai pastiprināta daudzas reizes. Šāda fragmenta, ko sauc par amplikonu, garums parasti ir vairāki simti nukleotīdu.

PCR posmi

Katrs pastiprināšanas cikls ietver 3 posmus, kas notiek dažādos temperatūras apstākļos (2. att.).

· 1. posms: DNS denaturācija . Notiek 93-95° 30-40 sekundes.

· 2. posms: grunts atkausēšana . Praimeru pievienošana notiek komplementāri ar attiecīgajām sekvencēm pretējās DNS virknēs pie noteikta reģiona robežām. Katram gruntskrāsu pārim ir sava atlaidināšanas temperatūra, kuras vērtības ir robežās no 50-65°C. Rūdīšanas laiks 20-60 sek.

· 3. posms: DNS ķēžu pabeigšana.DNS ķēžu komplementāra pabeigšana notiek no ķēdes 5" gala līdz 3" galam pretējos virzienos, sākot no praimeru piesaistes vietām. Materiāls jaunu DNS ķēžu sintēzei ir šķīdumam pievienotie dezoksiribonukleozīdu trifosfāti. Sintēzes procesu katalizē ferments taq polimerāze, un tas notiek 70-72°C temperatūrā. Sintēzes laiks ir 20-40 sekundes.

Pirmajā amplifikācijas ciklā izveidotās jaunās DNS ķēdes kalpo kā šabloni otrajam amplifikācijas ciklam, kurā veidojas specifisks DNS amplikona fragments (3. att.). Turpmākajos pastiprināšanas ciklos amplikoni kalpo kā veidne jaunu ķēžu sintēzei.

Tādējādi amplikonu uzkrāšanās šķīdumā notiek pēc formulas 2", kur n ir amplifikācijas ciklu skaits. Tāpēc, pat ja sākotnējā šķīdumā sākotnēji bija tikai viena divpavedienu DNS molekula, tad 30-40 ciklos apm. Šķīdumā uzkrājas 108 amplikonu molekulas, kas ir pietiekams daudzums, lai droši vizuāli noteiktu šo fragmentu ar agarozes gēla elektroforēzi.

Pastiprināšanas process tiek veikts īpašā programmējamā termostatā ( termocikleris), kas saskaņā ar doto programmu automātiski maina temperatūru atbilstoši pastiprināšanas ciklu skaitam.

Lai veiktu pastiprināšanu, ir nepieciešami šādi komponenti:

· DNS matrica(DNS vai tās daļa, kas satur vēlamo specifisko fragmentu);

· Gruntskrāsas(sintētiskie oligonukleotīdi (20-30 nukleotīdu pāri), kas ir komplementāri DNS sekvencēm pie noteiktā fragmenta robežām). Konkrēta fragmenta izvēlei un praimeru izvēlei ir izšķiroša nozīme amplifikācijas specifikā, kas ietekmē analīzes kvalitāti.

· Dezoksinukleotīdu trifosfātu (dNTP) maisījums(četru dNTP maisījums, kas ir materiāls jaunu komplementāru DNS ķēžu sintēzei līdzvērtīgā koncentrācijā 200-500 µM)

· EnzīmsTaq- polimerāze(termostabila DNS polimerāze, kas katalizē praimeru ķēžu pagarināšanos, secīgi pievienojot nukleotīdu bāzes augošajai sintezētās DNS ķēdei, 2-3 mM).

· Buferšķīdums(reakcijas vide, kas satur Mg2+ jonus, kas nepieciešami enzīmu aktivitātes uzturēšanai, pH 6,8-7,8).

Lai identificētu konkrētus RNS vīrusu genoma reģionus, vispirms no RNS veidnes tiek iegūta DNS kopija, izmantojot reversās transkripcijas (RT) reakciju, ko katalizē enzīms revertāze (reversā transkriptāze).

Rīsi. 2. Pastiprināšana (1. cikls).

Rīsi. 3. Pastiprināšana (2. cikls).

Galvenie PCR pielietojumi

· klīniskā medicīna:

o infekciju diagnostika,

o mutāciju identificēšana, ieskaitot iedzimtu slimību diagnostiku,

o genotipēšana, tostarp HLA genotipa noteikšana,

o šūnu tehnoloģijas

· ekoloģija (kā veids, kā uzraudzīt vides objektu un pārtikas produktu stāvokli un kvalitāti)

· transgēno organismu (ĢMO) noteikšana

Personas identifikācija, paternitātes noteikšana, kriminālistika

· vispārējā un specifiskā bioloģija,

Pamatprincipi

diagnostikas laboratoriju organizēšana

Darbs PCR laboratorijā tiek veikts saskaņā ar “Projektēšanas, drošības pasākumu, rūpnieciskās sanitārijas, pretepidēmijas režīma un personīgās higiēnas noteikumiem, strādājot veselības aprūpes sistēmas sanitāro un epidemioloģisko iestāžu laboratorijās (nodaļās, nodaļās).

DNS paraugu piesārņojums

PCR diagnostikas veikšana ir saistīta ar problēmu metodes augstās jutības dēļ - iespēja piesārņojums. Neliela daudzuma pozitīvās DNS iekļūšana reakcijas mēģenē (specifiski DNS amplifikācijas produkti - amplikoni; DNS standarts, ko izmanto kā pozitīvu kontroli; pozitīva DNS no klīniskā parauga) izraisa specifiska DNS fragmenta pastiprināšanos PCR laikā un rezultātā. , līdz viltus pozitīvu rezultātu parādīšanās.

Darba procesā var rasties divu veidu piesārņojums:

1. krusteniskais piesārņojums no parauga uz paraugu (klīnisko paraugu apstrādes laikā vai reakcijas maisījuma šķīdināšanas laikā), izraisot sporādiskus kļūdaini pozitīvus rezultātus;

2. piesārņojums ar pastiprināšanas produktiem(amplikoni), kam augstākā vērtība, jo PCR procesa laikā amplikoni uzkrājas milzīgos daudzumos un ir ideāli produkti reamplifikācijai.

Stikla trauku, automātisko pipešu un laboratorijas iekārtu, laboratorijas stendu virsmas vai pat laboratorijas darbinieku ādas virsmas piesārņojums ar nelielu daudzumu amplikonu izraisa sistemātiskus kļūdaini pozitīvus rezultātus. Piesārņojuma avota noteikšana var būt ļoti sarežģīta un prasa ievērojamus laika un naudas ieguldījumus. Līdz šim gūtā pieredze laboratorijās, kurās diagnostikai izmanto PCR metodi, ļauj formulēt pamatprasības šādu laboratoriju organizēšanai un pašu analīžu veikšanai. Atbilstība šīm prasībām novērš piesārņojuma un viltus pozitīvu rezultātu iespējamību.

PCR analīzes posmi

Tos ģeogrāfiski atdala, ievietojot atsevišķās telpās (4., 5. att.):

· Pirms PCR telpa, kur tiek apstrādāti klīniskie paraugi, tiek izolēta DNS, sagatavots reakcijas maisījums PCR un tiek veikta PCR (ja pastāv apstākļi, arī pēdējos divus posmus ieteicams veikt papildu atsevišķā telpā). Šajās telpās ir aizliegts veikt visa veida citus darbus ar testa aģentiem, kuru PCR diagnostika tiek veikta šajā laboratorijā.

· Pēc PCR telpa, kur tiek veikta pastiprināšanas produktu noteikšana. Šajā telpā var izmantot citas noteikšanas metodes. Ieteicams amplifikācijas produktu noteikšanas telpu novietot pēc iespējas tālāk no telpām pirms PCR.

Darba telpas ir aprīkotas ar ultravioletajām lampām ar maksimālo starojumu 260 nm (DB-60 tips) ar ātrumu 2,5 W uz 1 m3. Lampas ir novietotas tā, lai darba galdu, iekārtu un materiālu virsmas, ar kurām operators saskaras PCR analīzes laikā, tiktu pakļautas tiešai apstarošana. Apstarošana tiek veikta 1 stundas laikā pirms darba uzsākšanas un 1 stundas laikā pēc darba pabeigšanas.

Laboratorijas ārsti strādā speciālā laboratorijas apģērbā, kas tiek mainīts, pārejot no vienas telpas uz otru, un vienreizējās lietošanas cimdos. Apģērbi no dažādām telpām tiek apstrādāti atsevišķi. Dažādi darbinieki strādā dažādos PCR analīzes posmos.

Darbam tiek izmantoti atsevišķi dozatoru komplekti, plastmasas un stikla trauki, laboratorijas aprīkojums, halāti un cimdi, kas paredzēti dažādiem analīzes posmiem un nav pārnēsājami no vienas telpas uz otru. Iekārtas, materiāli un piederumi katrā telpā ir atbilstoši marķēti.

Visi darba posmi tiek veikti, izmantojot tikai vienreizējās lietošanas materiālus: uzgaļus automātiskajām pipetēm, mēģenes, cimdus utt. Pārejot no parauga uz paraugu, noteikti nomainiet uzgaļus. Ir nepieciešams izmantot uzgaļus ar filtru - aerosola barjeru, lai novērstu šķīduma mikropilienu iekļūšanu pipetē. Izlietotās caurules un uzgaļi tiek izmesti īpašos konteineros vai konteineros, kas satur dezinfekcijas šķīdums. Klīniskie paraugi tiek uzglabāti atsevišķi no reaģentiem.

Darba vietas apstrādei un tīrīšanai katra telpa ir aprīkota ar vates-marles tamponiem (salvetēm), pincetēm, dezinfekcijas un inaktivācijas šķīdumiem.

PCR diagnostikas laboratorija izslēdz darbus, kas saistīti ar šajā laboratorijā diagnosticēto patogēnu DNS sekvences vai gēnu fragmentus saturošu rekombinanto plazmīdu ražošanu (klonēšanu) un izolēšanu.

Klīniskā materiāla kolekcija

PCR pētāmais materiāls var būt epitēlija šūnu, asiņu, plazmas, seruma, pleiras un cerebrospinālā šķidruma, urīna, krēpu, gļotu un citu bioloģisko sekrēciju nokasījumi, biopsijas.

Materiāls tiek savākts atbilstoša profila procedūru telpā. Pēc savākšanas paraugi pēc iespējas ātrāk jānogādā PCR diagnostikas laboratorijā.

Paraugi jāņem, izmantojot sterilus, vēlams vienreizlietojamos instrumentus, tikai vienreizējās lietošanas sterilās plastmasas mēģenēs vai stikla mēģenēs, stundu iepriekš apstrādājot ar hroma maisījumu, rūpīgi nomazgājot ar destilētu ūdeni un kalcinējot žāvēšanas skapī 150°C temperatūrā. uz 1 stundu.

Atklāšanas zona (cits stāvs vai cita ēka).

Rīsi. 4. PCR laboratorijas iekārta ar noteikšanu ar elektroforēzi.

Atklāšanas zona (cits stāvs vai cita ēka)

Rīsi. 5. PCR laboratorijas iekārta ar fluorescējošu detektoru (kvantitatīvā analīze).

Rīsi. 6. DNS ekstrakcijas telpa. Parādīta galda kaste ar baktericīdu lampu.

Rīsi. 7. Pastiprināšanas telpa.

Rīsi. 8. Atklāšanas telpa.

Rīsi. 9. Asins paraugi iedzimtu slimību DNS diagnostikai.

Paraugu uzglabāšana un transportēšana

Lai diagnosticētu iedzimtas slimības, asins paraugus ilgstoši uzglabā uz speciālām papīra formām vai epindorfos (plastmasas mēģenēs) sasaldētā stāvoklī (9. att.).

Lai diagnosticētu infekcijas slimības, paraugus glabā istabas temperatūrā ne ilgāk kā 2 stundas. Ja nepieciešama ilgāka uzglabāšana, paraugus var ievietot ledusskapī 2-8°C temperatūrā uz laiku ne ilgāku par dienu. Ilgāka uzglabāšana (līdz 2 nedēļām) ir pieļaujama saldētavā saldētavā mīnus 20°C temperatūrā. Atkārtota paraugu sasaldēšana un atkausēšana nav atļauta.

Ja PCR diagnostikas laboratorija un paraugu ņemšanas procedūru telpa ir ģeogrāfiski nodalītas, tad paraugu transportēšana jāveic termosos vai termiskajos konteineros, ievērojot paraugu uzglabāšanas noteikumus un infekciozo materiālu transportēšanas noteikumus.

DNS ekstrakcija no paraugiem

Plaši ir kļuvusi cietās fāzes sorbcijas metode, kas sastāv no guanidīna šķīdumu saturoša līzes līdzekļa pievienošanas, DNS sorbcijas uz sorbenta, atkārtotas mazgāšanas un DNS rezorbcijas ar buferšķīdumu. Apstrādājot serumu, plazmu vai pilnas asinis, parasti izmanto fenola ekstrakcijas metodi. Metode ietver deproteinizāciju ar fenolu/hloroformu, kam seko DNS (vai RNS) izgulsnēšana ar etanolu vai izopropanolu. Apstrāde tiek veikta Eppendor P mikrocentrifūgas mēģenēs ar tilpumu 1,5 ml. Apstrādes laiks ir 1,5-2 stundas (10. att.).

Rīsi. 10. DNS ekstrakcija.

PCR veikšana

Noteiktu daudzumu parauga no apstrādātā klīniskā parauga pārnes speciālā Eppendorf tipa mikrocentrifūgas mēģenē ar tilpumu 0,2 vai 0,5 ml.Pievieno amplifikācijas maisījumu, kas sastāv no ūdens, PCR buferšķīduma, dNTP šķīduma, praimera šķīduma un šķīduma. tā pati caurule. Taq polimerāze (maisījumam pievieno pēdējo). Parasti reakcijas maisījuma tilpums ir 25 µl. Pēc tam katrā mēģenē pievieno vienu pilienu minerāleļļas, lai novērstu reakcijas maisījuma iztvaikošanu amplifikācijas procesa laikā. lampas tiek pārnestas uz programmējamu termostatu (pastiprinātāju), kur pastiprināšana tiek veikta automātiski saskaņā ar doto programmu (11. att.).

Rīsi. vienpadsmit. Pastiprinātājs" Termocikleris ».

Reakcijas laiks, atkarībā no norādītās programmas, ir 2-3 stundas. Paralēli eksperimentālajiem paraugiem tiek novietoti kontroles paraugi: pozitīvajā kontrolē ir iekļautas visas reakcijas sastāvdaļas, bet klīniskā parauga materiāla vietā tiek pievienots pētāmā gēna kontroles DNS preparāts. Negatīvā kontrole ietver visas reakcijas sastāvdaļas, bet klīniskā materiāla vai DNS preparāta vietā pievieno atbilstošu daudzumu dejonizēta ūdens vai ekstrakta, kas nesatur pārbaudāmo DNS. Negatīvā kontrole ir nepieciešama, lai pārbaudītu, vai reakcijas komponentos nav DNS piesārņojuma dēļ un lai izslēgtu kļūdaini pozitīvus rezultātus.

Rezultātu reģistrācija

Pastiprināto specifisko DNS fragmentu nosaka ar agarozes gēla elektroforēzi etīdija bromīda klātbūtnē. Etīdija bromīds veido stabilu intersticiālu savienojumu ar DNS fragmentiem, kas parādās gaismas joslu veidā, ja gēls tiek apstarots ar UV starojumu ar viļņa garumu 290-330 nm. Atkarībā no PCR rezultātā izveidoto amplikonu lieluma tiek izmantots gēls ar agarozes saturu no 1,5% līdz 2,5%. Lai pagatavotu agarozes gelu, agarozes, buferšķīduma un ūdens maisījumu izkausē mikroviļņu krāsnī vai ūdens vannā un pievieno etīdija bromīda šķīdumu. Maisījumu, kas atdzesēts līdz 50-60°C, lej veidnē 4-6 mm biezā kārtā un, izmantojot speciālas ķemmes, želejā izveido kabatas parauga uzklāšanai. Ķemmes tiek uzstādītas tā, lai starp iedobju dibenu un želejas pamatni paliktu 0,5-1 mm agarozes slānis. Pēc želejas sacietēšanas uz kabatām tiek uzklāts pastiprinātājs 5-15 μl daudzumā. DNS fragmentu garuma marķieru maisījuma elektroforēzi ieteicams veikt paralēli kontroles un eksperimentālajiem paraugiem. Parasti šāds maisījums satur desmit DNS fragmentus, kuru garums ir 100, 200, 300 utt. bāzes pāri.

Šāda testa izmantošana ļauj pārbaudīt amplikonu garumu kontroles un eksperimentālajos paraugos. Gelu ar uzklāto paraugu pārnes elektroforēzes kamerā, kas piepildīta ar buferšķīdumu, kamera tiek pievienota strāvas avotam un tiek veikta pastiprināšanas produktu elektroforētiskā atdalīšana 30-45 minūtes pie elektriskā lauka intensitātes 10-15 V/ cm. Šajā gadījumā reakcijas maisījumā iekļautās krāsvielas priekšpusei jābūt vismaz 3 cm.

Pēc elektroforēzes pabeigšanas želeju pārnes uz stikla transiluminatoru un skatās ultravioletajā gaismā. Dokumentācijai gēls tiek fotografēts uz Micrat 300 filmas vai ierakstīts, izmantojot video sistēmu, kas savienota ar datoru.

Vispirms tiek novērtēti kontroles paraugi. Elektroforēzes joslā, kas atbilst pozitīvajai kontrolei, jābūt oranžai mirdzošai joslai. Tā elektroforētiskajai mobilitātei jāatbilst instrukcijā norādītajam amplikona garumam.

Elektroforētiskajā joslā, kas atbilst negatīvajai kontrolei, šādas joslas nevajadzētu būt. Šādas joslas klātbūtne negatīvajā kontrolē norāda uz piesārņojumu – izmantoto reaģentu piesārņojumu ar testa DNS vai amplikonu. Testa paraugus novērtē pēc joslas klātbūtnes attiecīgajā trasē, kas atrodas vienā līmenī ar joslu pozitīvās kontroles paraugā. Joslas intensitāte atbilst paraugā pārbaudāmā DNS daudzumam, kas ļauj daļēji kvantitatīvi novērtēt PCR. Parasti pozitīvos rezultātus novērtē četru ballu skalā. Ja testa paraugā joslas spīdums ir ļoti vājš, tad šāds paraugs ir jāpārkārto (12. att.).

Rīsi. 12. Agarozes gēla elektroforēze.

PCR pielietojumi priekšpunktu mutāciju un gēnu polimorfismu diagnostika

Viena no vadošajām PCR pielietošanas jomām praktiskajā veselības aprūpē ir punktu mutāciju un gēnu polimorfismu diagnostika. . Ir tiešas un netiešas DNS diagnostikas metodes. Situācijās, kad ir zināms gēns, kura bojājums noved pie iedzimtas slimības attīstības, šo bojājumu var konstatēt ar molekulāri ģenētiskām metodēm. Šādas metodes sauc par tiešajām. Izmantojot tiešās metodes, tiek konstatēti pārkāpumi DNS primārajā nukleotīdu secībā (mutācijas un to veidi). Tiešās metodes raksturo precizitāte, kas sasniedz gandrīz 100%.

Tomēr praksē šīs metodes var izmantot noteiktos apstākļos:

· ar zināmu par iedzimtas slimības attīstību atbildīgā gēna citoģenētisko lokalizāciju;

· slimības gēnam jābūt klonētam un zināmai tā nukleotīdu secībai.

Tiešās DNS diagnostikas mērķis ir identificēt mutantu alēles.

Tādējādi situācijās, kad ir zināms, kāds DNS bojājums noved pie iedzimtas slimības, bojājumu saturošais DNS fragments tiek izmeklēts tieši, t.i., tiek izmantota tiešā DNS diagnostikas metode.

Tomēr līdz šim daudzu slimību gēni nav kartēti, to ekson-intronu organizācija nav zināma, un daudzas iedzimtas slimības ir raksturīga izteikta ģenētiskā neviendabība, kas neļauj pilnībā izmantot tiešās DNS diagnostikas metodes. Tāpēc gadījumos, kad bojājuma lokalizācija nav zināma, tiek izmantota cita pieeja, kas saistīta ar gēnu slimību atbildīgā gēna apkārtnes izpēti, kombinācijā ar ģimenes analīzi, tas ir, netiešām molekulārās ģenētiskās diagnostikas metodēm. tiek izmantotas iedzimtas slimības.

Var izmantot punktu mutāciju un nelielu svītrojumu noteikšanai dažādi veidi tomēr tie visi ir balstīti uz PCR metodes izmantošanu. Šī reakcija ļauj daudzkārt pavairot DNS nukleotīdu secību un pēc tam meklēt mutācijas. Metodes DNS fragmentu, kas satur mutācijas, meklēšanai ir balstītas uz salīdzinošā analīze mutantu un normālu DNS nukleotīdu sekvences.

PCR produktu analīze

tiešās DNS diagnostikas procesā

Ietver pastiprinātā gēna reģiona specifisko iezīmju izpēti. Tādējādi slimībās, ko izraisa trinukleotīdu atkārtojumu paplašināšanās, amplifikācijas produkti atšķiras pēc garuma (atspoguļojot atšķirīgo tripletu skaitu pētītajā gēna reģionā) un līdz ar to arī ar kustības ātrumu gēlā. Pateicoties tam, tiek panākta skaidra normālo un mutantu alēļu elektroforētiskā atdalīšana un precīza patoloģiski iegarena fragmenta noteikšana, t.i., slimības DNS diagnoze (13. att.).

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width="417" height="110 src=">

Rīsi. 14. Dzēšanas diagnostika GAG gēnā DYT 1 pacientiem ar no dopa neatkarīgu distoniju (poliakrilamīda gēla elektroforēze). 2,3,6 joslas – slims; trases 1,4,5 – kontrole. Tievā bultiņa norāda uz parasto alēli, biezā bultiņa norāda uz mutantu īsāku alēli (trīs nukleotīdu dzēšana).

Ja viss pētāmais DNS reģions ir daļa no paplašinātas dzēšanas, tad DNS PCR amplifikācija no šīs izdzēstās alēles netiks veikta, jo trūkst vietu primeru hibridizācijai. Šajā gadījumā homozigota dzēšana tiks diagnosticēta, pamatojoties uz pilnīgu PCR reakcijas produkta neesamību (DNS sintēze nav iespējama no abām gēna kopijām). Ar heterozigotu dzēšanu ir iespējams noteikt PCR produktu, kas sintezēts no normālas (saglabātas) alēles, taču, lai ticami diagnosticētu šādu mutāciju, ir jāizmanto sarežģītākas DNS attēlveidošanas metodes, kas ļauj novērtēt galīgās PCR devu. produkts.

Lai noteiktu punktveida mutācijas (visbiežāk nukleotīdu aizstāšanas) noteiktās vietās, PCR metodi izmanto kombinācijā ar citām molekulārās ģenētiskās analīzes metodēm. Ja iespējamās punktu mutācijas atrašanās vieta un raksturs ir precīzi zināmi, tad restrikcijas endonukleāzes (restrikcijas enzīmi) ir īpaši šūnu fermenti, kas izolēti no dažādiem baktēriju celmiem.

Šie fermenti atpazīst specifiskas nukleotīdu sekvences, kuru garums ir no četriem līdz desmit nukleotīdiem. Pēc tam tiek veikta šo sekvenču restrikcija (lat. (griešana)) kā daļa no divpavedienu DNS molekulas Katrs restrikcijas enzīms atpazīst un fiksētā vietā sagriež stingri noteiktu, specifisku nukleotīdu secību - ierobežošanas vieta (atpazīšanas vieta).

Gadījumos, kad punktveida mutācija maina konkrēta restrikcijas enzīma dabisko atpazīšanas vietu, šis enzīms nespēs šķelt mutantu PCR amplificēto fragmentu. Dažos gadījumos mutācija izraisa jaunas atpazīšanas vietas parādīšanos konkrētam restrikcijas enzīmam, kura parasti nav.

Abās situācijās mutanti un normāli PCR produkti, kas apstrādāti ar izvēlēto restrikcijas enzīmu, veidos dažāda garuma restrikcijas fragmentus, kurus var viegli noteikt ar elektroforēzi (15. att.).

Tādējādi, ja nepieciešams ātri noteikt kādu konkrētu punktu mutāciju, uzdevums tiek samazināts līdz atbilstošā restrikcijas enzīma meklēšanai, kura atpazīšanas vieta ir lokalizēta izjauktās nukleotīdu secības vietā. PCR produktu apstrāde ar šādu restrikcijas enzīmu ļaus viegli atšķirt normālās un mutācijas alēles. Ierobežojumu analīze ievērojami vienkāršo zināmo punktu mutāciju noteikšanu, un tagad to plaši izmanto iedzimtu slimību tiešai DNS diagnostikai.

Pēdējais posms mutāciju molekulārā ģenētiskā analīze ir noteikt pētāmā DNS fragmenta nukleotīdu secību (sekvencēšanu), kas tiek salīdzināta ar normu un tiek formulēta galīgā ģenētiskā diagnoze. Pateicoties molekulārās ģenētikas panākumiem, šobrīd ir izstrādātas DNS diagnostikas metodes vairāk nekā 400 iedzimtām slimībām.

Rīsi. 15. Punktu mutācijas noteikšana, izmantojot restrikcijas analīzi: A – amplificēts gēna reģions, kas satur restrikcijas vietuAGCTrestrikcijas endonukleāzeiAlu es. MutācijaG→ Amaina šo nukleotīdu secību, kā rezultātā rodas restrikcijas enzīmsAluIbloķēts; B – restrikcijas produktu elektroferogramma: 1. celiņš – homozigotiskums normālai alēlei; 2. celiņš – homozigotiskums mutācijai; 3. celiņš – heterozigots stāvoklis (normāla alēle + mutācija).

Iedzimtu slimību diagnostika, balstoties uz mutantu alēļu tiešu izmeklēšanu pacientiem, viņu ģimenes locekļiem vai iespējamiem patoloģisku mutāciju heterozigotiem nesējiem, ir piemērota presimptomātiskai un pirmsdzemdību diagnostikai, ko var piemērot agrīnākajās augļa attīstības stadijās pirms dzemdībām. jebkādu slimību klīnisku vai bioķīmisku simptomu parādīšanās.

Neatkarīgi no mutāciju noteikšanas metodes katras mutācijas precīzas molekulārās īpašības var iegūt tikai ar tiešu sekvencēšanu. Lai automatizētu šo procesu, pēdējos gados plaši tiek izmantotas īpašas ierīces - sekvenceri, kas ļauj būtiski paātrināt DNS informācijas nolasīšanas procesu.

Ceļš uz molekulāro bioloģisko pētījumu plašāku izmantošanu klīniskās diagnostikas laboratorijās tiek pavērts, paātrinot analītisko procesu, veicot visas procedūras vienā kontinuumā, bez paraugu pārvietošanas, radot apstākļus, lai novērstu piesārņojumu paralēli vairāku analītu testēšanai un objektīvi fiksējot rezultāti katrā ciklā.

Galvenās PCR metodes modifikācijas

Izmanto, lai ātri skenētu un meklētu zināmas gēnu mutācijas.

Multiplekss (multi-primer) PCR

Šīs metodes pamatā ir vairāku pētāmā gēna eksonu vienlaicīga pastiprināšana vienā reakcijā. Tas ļauj rentabli ātri pārbaudīt visbiežāk sastopamās mutācijas. Piemēram, lai ātri diagnosticētu deleciju pārnēsāšanu distrofīna gēnā pacientiem ar progresējošu Dišēna/Bekera muskuļu distrofiju, tiek veikta vienlaicīga šī gēna visbiežāk mutēto eksonu kopas amplifikācija. Tā kā šīs slimības tiek mantotas ar X saistītu recesīvu veidā un ir saistītas ar vienīgās X hromosomas bojājumiem zēniem, pagarinātas dzēšanas gadījumā reakcijas produktu elektroforēze atklās viena vai vairāku DNS fragmentu (eksonu) neesamību. ), kas var kalpot kā diagnozes molekulārs apstiprinājums. Turklāt, izvēloties specifiskas gēnu sekcijas PCR amplifikācijai, ir iespējams diezgan precīzi novērtēt dzēšanas kopējo garumu un gēnu pārtraukuma punktus (līdz eksonam).

Vairāku multipleksu reakciju kombinēta izmantošana ļauj diagnosticēt līdz 98% no visām delēcijām, kas rodas pacientiem ar progresējošu Dišēna/Bekera muskuļu distrofiju. Tas veido aptuveni 60% no kopējā zināmo distrofīna gēna mutāciju skaita un norāda uz šīs skrīninga metodes ļoti augsto efektivitāti distrofinopātijas DNS diagnostikai (16. att.).

Rīsi. 16. Dišēna muskuļu distrofijas tiešā DNS diagnostika, izmantojot multiplekso PCR (agarozes gēla elektroforēzi). Katrā no izmeklētajām personām vienlaikus tika pastiprināti četri distrofīna gēna eksoni (eksoni 17, 19, 44 un 45; bultiņas norāda atbilstošos amplifikācijas produktus). 1. josla – kontrole, 2.-5. josla – pacienti ar Dišēna muskuļu distrofiju ar dažādām distrofīna gēna delecijām (2. un 5. josla – 45. eksona dzēšana, 3. celiņš – 44. eksona dzēšana, 4. celiņš – 17. un 19. eksonu dzēšana ).

Alēlēm specifiska amplifikācija

Metodes pamatā ir divu neatkarīgu praimeru pāru izmantošana konkrētam gēna reģionam: viens primers abos pāros ir kopīgs, un otrajam primeram katrā pārī ir atšķirīga struktūra un tas ir komplementārs ar normālu vai mutantu DNS sekvenci. Šādas reakcijas rezultātā šķīdumā var vienlaicīgi sintezēt divu veidu PCR produktus - normālos un mutantos. Turklāt izmantoto primeru dizains ļauj skaidri atšķirt normālus un mutantu amplifikācijas produktus pēc to molekulārā izmēra. Šī metode ir ļoti vizuāla un ļauj pārbaudīt gan homozigotu, gan heterozigotu mutanta alēles pārnēsāšanu.

Metode amplificētas DNS vietējai modifikācijai

Metodes pamatā ir tā sauktā neatbilstības praimera izmantošana PCR (nav pilnībā komplementāra veidnei), kas atšķiras no šablona DNS sekvences par vienu nukleotīdu. Norādītā praimera iekļaušanas mutācijas PCR produktā rezultātā tajā veidojas mākslīgi izveidota restrikcijas vieta vienai no restrikcijas endonukleāzēm, kas ļauj veikt tiešu DNS diagnozi noteiktai zināmai mutācijai, izmantojot restrikcijas analīzi. Šādas mākslīgas restrikcijas vietas izveide ir nepieciešama, ja meklēšana neatklāja zināma un pieejama fermenta esamību, kura “dabisko” restrikcijas vietu ietekmē pētāmās mutācijas parādīšanās DNS molekulā. .

Reversās transkriptāzes PCR metode (RT- PCR)

Šo metodi izmanto gadījumos, kad par pētījuma objektu ērtāk izmantot nevis genoma DNS, bet gan kompaktāku un informācijai bagātāku cDNS, kas iegūta pēc atbilstošas ​​audu paraugu apstrādes, piemēram, biopsijas materiāla vai limfocītu šūnu līnijas. fibroblasti utt. Svarīgs nosacījums šeit ir vēlamā gēna ekspresija (vismaz minimāla) pētāmajos audos.

Pirmajā posmā tiek veikta mRNS reversā transkripcija, un iegūtās cDNS molekulas kalpo par veidni PCR. Pēc tam cDNS kritiskais reģions, kas amplificēts pietiekamā daudzumā, tiek pakļauts sekvencēšanai un citām mutāciju skrīninga metodēm, tiešai elektroforētiskai izpētei (deleciju noteikšana, ievietošana utt.) vai integrācijai ekspresijas sistēmā, lai iegūtu proteīna produktu. un tās tiešā analīze.

Šī metode ir īpaši efektīva, lai noteiktu mutācijas, kas izraisa “saīsināta” proteīna sintēzi (muļķīgas mutācijas, splicing mutācijas, lielas dzēšanas) - tā saukto PTT analīzi (Protein Truncation Test). PTT analīzi parasti izmanto, lai pētītu garus vairāku eksonu gēnus, piemēram, Duchenne/Becker muskuļu distrofiju, ataksiju-telangiektāziju vai 1. tipa neirofibromatozi.

Reāllaika PCR(Reāllaika PCR, angļu)

Katru gadu reāllaika PCR kļūst par arvien populārāku diagnostikas metodi praktiskajā veselības aprūpē. Tās galvenā iezīme ir polimerāzes ķēdes reakcijas produktu uzkrāšanās monitorings un kvantitatīvā analīze un iegūto rezultātu automātiska reģistrēšana un interpretācija. Šai metodei nav nepieciešama elektroforēzes stadija, kas samazina prasības PCR laboratorijai. Pateicoties ražošanas telpas taupīšanai, personāla skaita samazināšanai un pieprasījumam pēc DNS/RNS kvantitatīvas noteikšanas, šī metode pēdējos gados ir veiksmīgi izmantota lielākajos sanitāri epidemioloģiskajos, diagnostikas un pētniecības centros attīstītajās pasaules valstīs, aizstājot PCR tā pašreizējā (“klasiskajā”) formātā.

Reāllaika PCR izmanto fluorescējoši marķētas oligonukleotīdu zondes, lai noteiktu DNS, kad tā tiek pastiprināta. Reāllaika PCR ļauj veikt pilnīgu parauga analīzi 20-60 minūšu laikā un teorētiski spēj noteikt pat vienu DNS vai RNS molekulu paraugā.

Rīsi. 17. Reāllaika PCR.

Reāllaika PCR izmanto TaqMan sistēmu, kas kontrolē PCR kinētiku tieši amplifikācijas laikā, izmantojot rezonanses fluorescences slāpēšanu. Noteikšanai izmanto zondi, kas satur fluoroforu un dzēsēju, kas papildina pastiprinātā fragmenta vidusdaļu. Kad fluorofors un slāpētājs ir saistīti ar oligonukleotīdu zondi, tiek novērota tikai neliela fluorescējoša emisija. Pastiprināšanas procesa laikā Taq polimerāzes 5" eksonukleāzes aktivitātes dēļ fluorescējošais marķējums nonāk šķīdumā, atbrīvojas no tuvuma slāpētājam un ģenerē fluorescējošu signālu, kas reāllaikā palielinās proporcionāli pastiprinātāja uzkrāšanai ( 17. att.).

Galvenās reāllaika PCR priekšrocības salīdzinājumā ar PCR ar gēla elektroforēzi:

· Visa metode notiek vienā mēģenē;

· Metode aizņem 1 stundu;

· pietiek ar 1-2 darba telpām;

· Paralēli kvalitatīvam rezultāta novērtējumam ir iespēja veikt kvantitatīvu novērtējumu (piemēram, izrakstot AIDS vai vīrusu hepatīta pretvīrusu terapiju, jāzina vīrusu slodze, t.i., vīrusa daudzums vienā vienībā, kas nodrošina reālā laika PCR);

· Piesārņojuma risks ir strauji samazināts.

Secinājums

PCR metode ir viena no visizplatītākajām molekulārās bioloģiskās izpētes metodēm. Šī metode klīnicistiem ir jāizmanto saprātīgi, un ārstam, kurš nolemj savā darbā izmantot PCR, ir jābūt noteiktām zināšanām par šīs metodes īpašībām un iespējām. Otrkārt, starp klīnicistu un PCR laboratoriju ir jābūt ciešai atgriezeniskajai saitei, kas nepieciešama, lai analizētu sarežģītus gadījumus un izstrādātu pareizu diagnostikas stratēģiju. Treškārt, PCR analīze nav panaceja diagnostikā (galvenokārt infekcijas slimībām) un neaizstāj esošās pētniecības metodes, bet tikai papildina tās. Un pats galvenais, PCR nevar aizstāt intuīciju un analītisko domāšanu, kādai jābūt ārstam, kurš gaida panākumus.

P . S . Molekulāri bioloģiskie pētījumi - mainīgas diagnostikas un ārstēšanas vadlīnijas. Molekulāri bioloģisko metožu izmantošana ir saistīta ar iespēju radikāli mainīt uzsvaru laboratoriskajā diagnostikā. Var būt runa ne tikai par savlaicīgu informāciju, bet arī par tās iepriekšēju saņemšanu. Ja šobrīd laboratoriskie izmeklējumi vairumā gadījumu tiek veikti jau tad, kad slimība ir attīstījusies un uzsākta ārstēšana, tad paredzams, ka molekulāri bioloģiskā laboratoriskā informācija ļaus noteikt cilvēka tieksmi uz noteikta veida patoloģijām un jutības pakāpi pret noteiktām zālēm. , kas attaisnos prognozējošo, profilaktisko un personalizēto nākotnes medicīnas būtību.

DIAGNOZES UN ĀRSTĒŠANAS ORIENTĀCIJU MAIŅA

IESPĒJAMĀS SLIMĪBAS

Šodien Nākotnē

Diagnoze Ģenētiskā pase

8. Cik darba telpu ir nepieciešams, lai darbinātu PCR laboratoriju ar fluorescējošu detektoru (kvantitatīvā analīze, reāllaika PCR)?

9. Kas ir atklāšana?

10. Kādas ir DNS diagnostikas metodes?

11. Kura enzīma darbība ir PCR pamatā?

12. Kāpēc noteikšanas zona ir jānoņem no citām darba zonām?

13. Kas ir ierobežojuma vietne?

14. Kādas ir atšķirības starp tiešo un netiešo DNS diagnostikas metodēm?

15. Kas ir sekvencēšana?

16. Kas ir multipleksā PCR?

17. Kādi mutāciju veidi tiek noteikti, izmantojot PCR?

18. Kas ir piesārņojums?

19. Kāda ir alēlei specifiskās amplifikācijas metodes būtība?

20. PCR materiāla uzglabāšanas apstākļi?

21. Kādā ierīcē notiek pastiprināšana?

22. Kas ir reversās transkriptāzes PCR (RT-PCR) metode?

23. Kas kalpo par materiālu PCR diagnostikai?

24. Uzskaitiet piesārņojuma veidus?

Pārbaudes pašgatavošanai

1. Endonukleāzes restrikcijas enzīmi:

a) fermenti, kas “salauž” DNS stingri noteiktās vietās;

b) fermenti, kas savieno DNS molekulas pārtraukumus;

c) fermenti, kas nodrošina savienojumus, kas veic DNS labošanu.

2. Gēnu pastiprināšana:

3. Kādu molekulārās ģenētikas metodi izmanto, lai diagnosticētu slimības, ko izraisa zināmas secības mutants gēns?

a) īpaša restrikcijas enzīma izmantošana;

b) tieša noteikšana, izmantojot īpašas molekulārās zondes;

V) ģimenes analīze normālu restrikcijas fragmentu garuma polimorfismu sadalījumi.

4. DNS sekvencēšana:

a) DNS bāzes secības identificēšana;

b) jebkuras DNS sekcijas vairākas atkārtošanās;

c) DNS fragmenta, kas satur pētāmo gēnu, izolēšana.

5. Lai iegūtu DNS paraugus, varat izmantot :

b) horiona bārkstiņas;

c) amnija šķidrums;

d) amnija šķidruma šūnas;

e) ādas, muskuļu, aknu biopsijas paraugi,

e) viss ir pareizi, izņemot punktu “c”,

g) viss ir pareizi, izņemot “d” punktu,

h) viss iepriekš minētais ir patiess.

6. Lai diagnosticētu, kuras mutācijas tiek izmantota PCR metode:

a) genoma;

b) hromosomu;

c) gēns (punkts).

7. Grunts ir:

a) DNS komplementāra sadaļa;

b) sintētiska oligonukleotīda iezīmēta (radioaktīvi vai fluorescējoši) secība, kas komplementāra mutantu vai normālu gēnu;

c) oligonukleotīds, kas darbojas kā "praimeris" un ierosina polinukleotīdu ķēdes sintēzi uz DNS vai RNS matricas.

8. Kas izstrādāja PCR metodes principu?

b) K. Mullis

9. Vai PCR metodi izmanto, lai diagnosticētu trinukleotīdu atkārtojumu paplašināšanos (dinamisks mutācijas veids)?

10. Kādās jomās tiek izmantota PCR?

a) klīniskā medicīna;

b) transgēno organismu (ĢMO) noteikšana

c) personas identifikācija, paternitātes noteikšana, kriminālistika

d) viss iepriekš minētais,

e) neviens no iepriekšminētajiem.

Atbilžu paraugi: 1 – a; 2 – b; 3 – b; 4 – a; 5 – e; 6 – iekšā; 7 – iekšā; 8 – b; 9 – a, 10 – g.

Galvenā

1.Bočkova ģenētika. Maskava. GEOTAR, 2002. gads.

Papildu

1. , Bakharevs un bērnu iedzimtu un iedzimtu slimību ārstēšana. - Maskava, 2004.

2. DNS diagnostika un medicīniskās ģenētiskās konsultācijas. - Maskava, 2004.

3. Ginteru ģenētika. - Maskava, 2003.

4. Gorbunova medicīniskās ģenētikas pamati. – Sanktpēterburga: Intermedica, 1999. gads.

5. Dž. Makgī. Molekulārā klīniskā diagnoze. – Pasaule, 1999. gads.

6. Menšikovs - bioloģiskie pētījumi klīniskajā laboratoriskajā diagnostikā: problēmas iespējas (lekcijas). Klīniskā laboratoriskā diagnostika, Nr.3, 2006.g.

7. Kornienko darbs PCR laboratorijā bioloģiskā materiāla tiešās analīzes laikā. Klīniskā laboratoriskā diagnostika, Nr.10, 2006.g.

8. PCR laboratorijas darba organizācija. Metodiskie norādījumi. MU 1.3.1794-03. Krievijas Federācijas galvenais sanitārais ārsts, 2003.

9. Erlich H. A. PCR tehnoloģija. - Percin-Elmer Cetus, 1993.

10. Heid C. A., Stevens J. Reālā laika kvantitatīvā PCR. Genome Res. – 1996.gada 6.nr.

METODES PAMATPRINCIPI

POLIMERĀZES ĶĒDES REAKCIJA

Metodiskā rokasgrāmata 3-4 kursu studentu ārpusstundu darbam vispārējās medicīnas (060101) un pediatrijas (060103) specialitātēs.

Valsts augstākās profesionālās izglītības iestāde "Federālās veselības un sociālās attīstības aģentūras Krasnojarskas Valsts medicīnas akadēmija"

Krievija, Krasnojarska,

Federālā izglītības aģentūra

Valsts izglītības iestāde

Augstāks profesionālā izglītība

"Karēlijas Valsts pedagoģijas akadēmija"

Kursa darbs par tēmu:

Polimerāzes ķēdes reakcija (PCR) un tās pielietojums

Pabeidza: studente Korjagina Valērija Aleksandrovna

Pārbaudīja: Karpikova Natālija Mihailovna

Petrozavodska 2013

Ievads

1. nodaļa. Literatūras apskats

1.5.4. Plato efekts

1.5.6. Pastiprināšana

Secinājums

Ievads

Pēdējie divdesmit gadi ir bijuši raksturīgi ar plašu molekulāro ģenētisko metožu ieviešanu bioloģijas, medicīnas un lauksaimniecības zinātnēs.

Līdz 1970. gadu sākumam šķita, ka molekulārā bioloģija ir sasniegusi zināmu brieduma pakāpi. Šajā periodā galvenais molekulāro ģenētisko pētījumu objekts bija mikroorganismi. Pāreja uz eikariotiem iepazīstināja pētniekus ar pilnīgi jaunām problēmām, kuras nevarēja atrisināt, izmantojot tajā laikā pastāvošās ģenētiskās analīzes metodes. Izrāviens molekulārās ģenētikas attīstībā kļuva iespējams, pateicoties jauna eksperimentāla instrumenta - restrikcijas endonukleāzes - parādīšanās. Turpmākajos gados strauji pieauga tiešās DNS analīzes metožu skaits, kuru pamatā ir kvalitatīvi atšķirīgas pieejas.

Mūsdienu tehnoloģijas daudzos gadījumos ir ļāvušas sākt pētīt dažādu organismu kodolu un ārpuskodolu genomu smalko strukturālo un funkcionālo organizāciju dziļākā līmenī. Tas bija īpaši svarīgi jaunu diagnostikas un ārstēšanas metožu izstrādē dažādas slimības. Ne mazāk svarīga bija iespēja izmantot molekulārās ģenētikas sasniegumus populācijas bioloģijā un selekcijā, lai identificētu un analizētu populāciju, šķirņu un celmu ģenētisko mainīgumu, identificētu un sertificētu ekonomiski vērtīgus indivīdus, radītu ģenētiski modificētus organismus un risinātu citus jautājumus.

Katrai metodei ir savas priekšrocības un trūkumi. Nav universālas metodes, kas varētu atrisināt visas radušās problēmas. Tāpēc konkrētas metodes izvēle veicamajam pētījumam ir viens no svarīgākajiem jebkura zinātniskā darba posmiem.

1. nodaļa. Literatūras apskats

1.1. Polimerāzes ķēdes reakcijas (PCR) atklāšanas vēsture

1983. gadā K.B. Mullis u.c. publicēja un patentēja polimerāzes ķēdes reakcijas (PCR) metodi, kurai bija lemts būtiski ietekmēt visas nukleīnskābju pētniecības un pielietošanas jomas. Šīs metodes vērtība molekulārā bioloģija un ģenētika izrādījās tik lieliska un acīmredzama, ka pēc septiņiem gadiem autors tika apbalvots Nobela prēmijaķīmijā.

Metodes lietošanas sākumā pēc katra sildīšanas-dzesēšanas cikla reakcijas maisījumam bija jāpievieno DNS polimerāze, jo tā tika inaktivēta augstā temperatūrā, kas nepieciešama DNS spirāles virkņu atdalīšanai. Reakcijas procedūra bija salīdzinoši neefektīva un prasīja daudz laika un fermentu. 1986. gadā tika ievērojami uzlabota polimerāzes ķēdes reakcijas metode. Ir ierosināts izmantot termofīlo baktēriju DNS polimerāzes. Šie fermenti izrādījās termostabīli un spēja izturēt daudzus reakcijas ciklus. To izmantošana ļāva vienkāršot un automatizēt PCR. Viena no pirmajām termostabilajām DNS polimerāzēm tika izolēta no baktērijām Thermus aquaticusun nosaukts Taq- polimerāze.

Iespēja pastiprināt jebkuru DNS segmentu, kura nukleotīdu secība ir zināma, un iegūt to homogēnā formā un preparāta daudzumā pēc PCR pabeigšanas, padara PCR par alternatīvu metodi īsu DNS fragmentu molekulārai klonēšanai. Šajā gadījumā nav nepieciešams izmantot sarežģītas metodiskās metodes, kas tiek izmantotas gēnu inženierija ar parasto klonēšanu. PCR metodes attīstība ir ievērojami paplašinājusi molekulārās ģenētikas un jo īpaši gēnu inženierijas metodiskās iespējas, tiktāl, ka tā ir radikāli mainījusi un nostiprinājusi daudzu tās jomu zinātnisko potenciālu.

1.2 Polimerāzes ķēdes reakcijas (PCR) veidi

· Nested PCR- izmanto, lai samazinātu reakcijas blakusproduktu skaitu. Tiek izmantoti divi primeru pāri un tiek veiktas divas secīgas reakcijas. Otrais primeru pāris pastiprina DNS reģionu pirmās reakcijas produktā.

· Apgrieztā PCR- izmanto, ja ir zināms tikai neliels reģions vēlamajā secībā. Šī metode ir īpaši noderīga, lai noteiktu blakus esošās sekvences pēc DNS ievietošanas genomā. Lai veiktu apgriezto PCR, tiek veikta virkne DNS griezumu, izmantojot restrikcijas enzīmus<#"justify">polimerāzes ķēdes reakcijas grunts

· Grupas specifiskā PCR- PCR radiniekiem<#"center">1.3. Polimerāzes ķēdes reakcija

Astoņdesmito gadu vidū atklātā polimerāzes ķēdes reakcija (PCR) dažu stundu laikā var reizināt oriģinālā parauga kopiju skaitu miljoniem reižu. Katra reakcijas cikla laikā no sākotnējās molekulas veidojas divas kopijas. Katra no sintezētajām DNS kopijām var kalpot par veidni jaunu DNS kopiju sintēzei nākamajā ciklā. Tādējādi atkārtota ciklu atkārtošana palielina kopiju skaitu ģeometriskā progresija. No aprēķiniem izriet, ka pat ar 30 cikliem sākotnējās molekulas kopiju skaits būs vairāk nekā 1 miljards. Pat ja ņemam vērā, ka ne visi amplikoni tiek dublēti katra cikla laikā, kopējais kopiju skaits, neskatoties uz to, ir diezgan liels skaitlis.

Katrs polimerāzes ķēdes reakcijas (PCR) cikls sastāv no šādiem posmiem:

· Denaturācija – temperatūras paaugstināšanās izraisa divpavedienu DNS molekulas atritināšanu un sadalīšanos divās vienpavedienu molekulās;

· Atkvēlināšana – temperatūras pazemināšana ļauj primeriem saistīties ar DNS molekulas komplementāriem reģioniem;

· Pagarinājums – enzīms DNS polimerāze pabeidz komplementāro virkni.

Lai amplificētu atlasīto fragmentu, tiek izmantoti divi oligonukleotīdu praimeri (praimeri), kas atrodas blakus noteiktam DNS reģionam. Orientēts uz gruntskrāsām 3 - beidzas viens pret otru un virzienā uz secību, kas jāpastiprina. DNS polimerāze veic savstarpēji komplementāru DNS ķēžu sintēzi (pabeigšanu), sākot ar praimeriem. DNS sintēzes laikā praimeri tiek fiziski integrēti tikko sintezēto DNS molekulu ķēdē. Katra DNS molekulas virkne, kas izveidota, izmantojot vienu no primeriem, var kalpot par veidni komplementāras DNS virknes sintēzei, izmantojot citu praimeri.

1.4 Polimerāzes ķēdes reakcijas (PCR) veikšana

Polimerāzes ķēdes reakcija tiek veikta īpašās plānsienu polipropilēna caurulēs, kuru izmērs ir saderīgs ar izmantoto termisko cikleru (pastiprinātāju) - ierīci, kas kontrolē polimerāzes ķēdes reakcijas (PCR) posmu temperatūru un laika raksturlielumus.

1.5. Polimerāzes ķēdes reakcijas metodes princips

Polimerāzes ķēdes reakcija (PCR) ir in vitro DNS amplifikācijas metode, ko var izmantot, lai dažu stundu laikā izolētu un pavairotu noteiktu DNS secību miljardiem reižu. Spēja iegūt milzīgu skaitu vienas kopijas stingri noteiktu apgabalu genoms ievērojami vienkāršo esošā DNS parauga izpēti.

Lai veiktu polimerāzes ķēdes reakciju, ir jāievēro vairāki nosacījumi:

1.5.1. Vairāku sastāvdaļu klātbūtne reakcijas maisījumā

Reakcijas (PCR) maisījuma galvenās sastāvdaļas ir: Tris-HCl, KCl, MgCl 2, nukleotīdu trifosfātu (ATP, GTP, CTP, TTP) maisījums, praimeri (oligonukleotīdi), parauga DNS sagatavošana, termostabila DNS polimerāze. Katrs no reakcijas maisījuma komponentiem ir tieši iesaistīts polimerāzes ķēdes reakcijā (PCR), un reaģentu koncentrācija tieši ietekmē amplifikācijas gaitu.

· Tris-HCl - nosaka reakcijas maisījuma pH, veido bufera kapacitāti. DNS polimerāzes aktivitāte ir atkarīga no vides pH, tāpēc pH vērtība tieši ietekmē polimerāzes ķēdes reakcijas gaitu. Parasti pH vērtība ir no 8 līdz 9,5. Augstā pH vērtība tiek ņemta, jo Tril-HCl buferšķīduma pH pazeminās, paaugstinoties temperatūrai.

· KCl - kālija hlorīda koncentrācija līdz 50 mM ietekmē denaturācijas un atkausēšanas procesu gaitu, koncentrācija virs 50 mM inhibē DNS polimerāzi.

· MgCl 2- tā kā DNS polimerāze ir Mg 2+- atkarīgs enzīms, tad magnija jonu koncentrācija ietekmē fermenta aktivitāti (Mg 2+veido kompleksus ar NTP - šie kompleksi ir polimerāzes substrāts). Augsta koncentrācija izraisa nespecifiskas amplifikācijas palielināšanos, un zema koncentrācija izraisa reakcijas kavēšanu; optimālais (dažādām polimerāzēm) ir diapazonā no 0,5 līdz 5 mM. Turklāt magnija sāļu koncentrācija ietekmē denaturācijas un atkausēšanas procesu gaitu - Mg koncentrācijas palielināšanos. 2+izraisa DNS kušanas temperatūras paaugstināšanos (t.i., temperatūru, kurā 50% divpavedienu DNS pavedienu sadalās vienpavedienu).

· NTP - nukleotīdu trifosfāti ir tiešie nukleīnskābju monomēri. Lai novērstu ķēdes pārtraukšanu, ieteicama vienāda visu četru nukleotīdu trifosfātu attiecība. Šo komponentu zemā koncentrācija reakcijas maisījumā palielina kļūdu iespējamību, veidojot komplementāru DNS ķēdi.

· Grunts - visoptimālākais ir izmantot gruntskrāsas ar kušanas temperatūras starpību ne vairāk kā 2–4 o C. Dažkārt ilgstošas ​​uzglabāšanas laikā 4 grādu temperatūrā o C, vai pēc liela skaita sasaldēšanas un atkausēšanas, praimeri veido sekundāras struktūras - dimērus, samazinot PCR efektivitāti. Šīs problēmas novēršana ir saistīta ar inkubāciju ūdens vannā (T = 95 o C) 3 minūtes un pēc tam ātri atdzesē līdz 0o AR.

· DNS preparāti - DNS preparāta (matricas) daudzums un kvalitāte tieši ietekmē polimerāzes ķēdes reakcijas norisi un parametrus. Pārmērīgs DNS parauga daudzums kavē polimerāzes ķēdes reakciju (PCR). Piemaisījumi dažādas vielas DNS preparāta sastāvā esošās vielas var arī samazināt polimerāzes ķēdes reakcijas (PCR) efektivitāti: nātrija acetāts, nātrija hlorīds, izopropanols, etanols, heparīns, fenols, urīnviela, hemoglobīns utt.

· DNS polimerāze - izmantojot nelielu DNS polimerāzes daudzumu, tiek novērota gala produkta sintēzes samazināšanās tieši proporcionāli fragmentu lielumam. Polimerāzes pārpalikums 2-4 reizes izraisa difūzu spektru parādīšanos un 4-16 reizes - mazmolekulāru nespecifisku spektru. Izmantoto koncentrāciju diapazons ir 0,5 - 1,5 aktivitātes vienības uz 25 μl PCR maisījuma.

Papildus PCR maisījuma galvenajām sastāvdaļām tiek izmantotas vairākas papildu vielas, kas uzlabo PCR kvalitatīvos un kvantitatīvos rādītājus: acetamīds (5%) - palielina galveno komponentu šķīdību; betaīns ( nātrija sāls) - DNS polimerāzes stabilizācija, DNS kušanas temperatūras pazemināšana, kušanas temperatūras izlīdzināšana; liellopu albumīns (10-100 μg/ml) - DNS polimerāzes stabilizācija; dimetilsulfoksīds (1-10%) - palielinot galveno sastāvdaļu šķīdību; formamīds (2-10%) - palielinot atkausēšanas specifiku; glicerīns (15-20%) - fermenta termiskās stabilitātes palielināšana, DNS parauga denaturācijas temperatūras pazemināšana; amonija sulfāts - pazemina denaturācijas un atkausēšanas temperatūru.

1.5.2 Cikliskais un temperatūras režīms

Polimerāzes ķēdes reakcijas (PCR) programmas vispārējais izskats ir šāds:

posms. DNS preparāta ilgstoša primārā denaturācija.1.cikls

posms. DNS preparāta ātra denaturācija. Gruntskrāsu atkausēšana. Pagarinājums.30 - 45 cikli.

posms. Ilgs pagarinājums. Reakcijas maisījuma atdzesēšana.1.cikls.

Katram posma elementam - denaturācijai, atkvēlināšanai, pagarināšanai - ir individuālas temperatūras un laika īpašības. Temperatūras un laika parametri katram elementam tiek izvēlēti empīriski, saskaņā ar pastiprināšanas produktu kvalitatīvajiem un kvantitatīvajiem rādītājiem.

Denaturācija. Šī polimerāzes ķēdes reakcijas elementa laikā divpavedienu DNS molekula tiek sadalīta divās vienpavedienu molekulās. Denaturācijas temperatūras parametri ir diapazonā no 90 līdz 95 o C, bet DNS parauga gadījumā ar augstu guanīna un citozīna saturu temperatūra jāpaaugstina līdz 98 o C. Denaturācijas temperatūrai jābūt pietiekamai, lai pilnībā denaturētu DNS virknes un izvairītos no “zibens dzesēšanas” vai ātras atkausēšanas, tomēr termostabila DNS polimerāze ir mazāk stabila augstās temperatūrās. Tādējādi optimālo denaturācijas temperatūras parametru izvēle praimera/parauga (DNS sagatavošana) attiecībai ir svarīgs nosacījums, veicot amplifikāciju. Ja denaturācijas temperatūra pirmajā posmā pārsniedz 95 o C, reakcijas maisījumam ieteicams pievienot DNS polimerāzi pēc sākotnējās denaturācijas. Šī posma elementa ilgumam polimerāzes ķēdes reakcijas (PCR) laikā jābūt pietiekamam, lai pilnībā denaturētu DNS, bet tajā pašā laikā tam nevajadzētu būtiski ietekmēt DNS polimerāzes aktivitāti noteiktā temperatūrā.

Atkausēšana. Atkausēšanas temperatūra (T A ) ir viens no svarīgākajiem polimerāzes ķēdes reakcijas parametriem. Atlaidināšanas temperatūra katram konkrētajam gruntējumam tiek izvēlēta atsevišķi. Tas ir atkarīgs no primera garuma un nukleotīdu sastāva. Parasti tas ir zemāks par 2–4 o No kušanas punkta vērtības (T m ) grunts. Ja sistēmas atkausēšanas temperatūra ir zemāka par optimālo, tad palielinās nespecifisko amplificēto fragmentu skaits un, gluži pretēji, vairāk karstums samazina pastiprināto produktu daudzumu. Šajā gadījumā specifisko amplikonu koncentrācija var strauji samazināties līdz pat polimerāzes ķēdes reakcijas (PCR) inhibīcijai. Palielinot atkausēšanas laiku, palielinās arī nespecifisko amplikonu skaits.

Pagarinājums. Parasti katram termostabilās DNS polimerāzes veidam ir individuāla temperatūras optimālā darbība. Arī komplementārās DNS virknes sintēzes ātrums ar fermentu ir raksturīgs katrai polimerāzei (vidēji tas ir 30 - 60 nukleotīdu sekundē jeb 1 - 2 tūkstoši bāzu minūtē), tāpēc pagarinājuma laiks tiek izvēlēts atkarībā no veida. DNS polimerāzes un amplificētā reģiona garuma.

1.5.3. Primeru atlases pamatprincipi

Veidojot PCR testa sistēmu, viens no galvenajiem uzdevumiem ir pareiza primeru izvēle, kam jāatbilst vairākiem kritērijiem:

Primeriem jābūt specifiskiem. Īpaša uzmanība maksā 3 - praimeru gali, jo tieši no tiem Taq polimerāze sāk pabeigt komplementāro DNS virkni. Ja to specifika ir nepietiekama, tad visticamāk mēģenē ar reakcijas maisījumu notiks nevēlami procesi, proti, nespecifiskas DNS (īso vai garo fragmentu) sintēze. Tas ir redzams elektroforēzē smagu vai vieglu papildu joslu veidā. Tas traucē novērtēt reakcijas rezultātus, jo ir viegli sajaukt konkrētu amplifikācijas produktu ar sintezētu svešu DNS. Daži primeri un dNTP tiek patērēti nespecifiskas DNS sintēzei, kas izraisa ievērojamu jutības zudumu.

Primeriem nevajadzētu veidot dimērus un cilpas, t.i. stabilas dubultšķiedras nedrīkst veidoties gruntskrāsu atkvēlināšanas rezultātā sev vai vienam ar otru.

1.5.4. Plato efekts

Jāņem vērā, ka specifisku pastiprināšanas produktu uzkrāšanās process ģeometriskā progresijā ilgst tikai ierobežotu laiku, un tad tā efektivitāte kritiski pazeminās. Tas ir saistīts ar tā saukto plato efektu.

Termiņa efekts plato izmanto, lai aprakstītu PCR produktu uzkrāšanās procesu pēdējos amplifikācijas ciklos.

Atkarībā no amplifikācijas reakcijas apstākļiem un ciklu skaita efekta sasniegšanas brīdī plato ietekmē substrātu (dNTP un praimeru) izmantošana, reaģentu (dNTP un enzīmu) stabilitāte, inhibitoru, tajā skaitā pirofosfātu un DNS dupleksu daudzums, nespecifisku produktu vai praimeru dimēru konkurence par reaģentiem, konkrēta produkta koncentrācija. un nepilnīga denaturācija pie augstām amplifikācijas produktu koncentrācijām.

Jo zemāka ir mērķa DNS sākotnējā koncentrācija, jo lielāks ir risks, ka reakcija neizdosies. plato." Šis punkts var rasties, pirms ir pietiekami daudz specifisku pastiprināšanas produktu, ko analizēt. No tā var izvairīties tikai labi optimizētas testa sistēmas.

1.5.5. Bioloģiskā parauga sagatavošana

Lai izolētu DNS, atkarībā no veicamajiem uzdevumiem tiek izmantotas dažādas metodes. To būtība ir DNS ekstrakcija (ekstrakcija) no bioloģiskā preparāta un svešu piemaisījumu noņemšana vai neitralizācija, lai iegūtu DNS preparātu ar tīrību, kas ir piemērota PCR.

Marmur aprakstītā tīra DNS preparāta iegūšanas metode tiek uzskatīta par standartu un jau kļuvusi par klasisku. Tas ietver fermentatīvu proteolīzi, kam seko deproteinizācija un DNS atkārtota nogulsnēšana ar spirtu. Šī metode ļauj iegūt tīru DNS preparātu. Tomēr tas ir diezgan darbietilpīgs un ietver darbu ar tādām agresīvām un stipri smaržojošām vielām kā fenols un hloroforms.

Viena no šobrīd populārajām metodēm ir DNS ekstrakcijas metode, ko ierosināja Boom et al. Šīs metodes pamatā ir spēcīga haotropa līdzekļa, guanidīna tiocianāta (GuSCN) izmantošana šūnu līzei un sekojošai DNS sorbcijai uz nesēja (stikla krelles, diatomīta zeme, stikla piens utt.). Pēc mazgāšanas DNS paliek paraugā, sorbēta uz nesēja, no kuras to viegli noņemt, izmantojot eluēšanas buferi. Metode ir ērta, tehnoloģiski progresīva un piemērota parauga sagatavošanai pastiprināšanai. Tomēr DNS zudums ir iespējams neatgriezeniskas sorbcijas dēļ uz nesēja, kā arī daudzu mazgāšanas laikā. Tas ir īpaši svarīgi, strādājot ar nelielu DNS daudzumu paraugā. Turklāt pat neliels GuSCN daudzums var kavēt PCR. Tāpēc, izmantojot šo metodi, tas ir ļoti svarīgi pareizā izvēle sorbents un rūpīga tehnoloģisko nianšu ievērošana.

Vēl viena paraugu sagatavošanas metožu grupa ir balstīta uz Chilex tipa jonu apmaiņu izmantošanu, kas atšķirībā no stikla nesorbē DNS, bet gan piemaisījumus, kas traucē reakciju. Parasti šī tehnoloģija ietver divus posmus: parauga vārīšanu un piemaisījumu sorbciju uz jonu apmaiņas ierīces. Metode ir ārkārtīgi pievilcīga tās izpildes vienkāršības dēļ. Vairumā gadījumu tas ir piemērots darbam ar klīnisko materiālu. Diemžēl dažreiz ir paraugi ar piemaisījumiem, kurus nevar noņemt, izmantojot jonu apmainītājus. Turklāt dažus mikroorganismus nevar iznīcināt ar vienkāršu vārīšanu. Šajos gadījumos ir nepieciešams ieviest papildu paraugu apstrādes posmus.

Tādējādi parauga sagatavošanas metodes izvēle ir jāņem vērā, izprotot paredzētās analīzes mērķus.

1.5.6. Pastiprināšana

Lai veiktu amplifikācijas reakciju, ir nepieciešams sagatavot reakcijas maisījumu un pievienot tam analizēto DNS paraugu. Ir svarīgi ņemt vērā dažas gruntēšanas atkausēšanas iezīmes. Fakts ir tāds, ka analizētajā bioloģiskajā paraugā parasti ir dažādas DNS molekulas, ar kurām reakcijā izmantotajiem primeriem ir daļēja un dažos gadījumos nozīmīga homoloģija. Turklāt grunti var sasaistīt viens ar otru, veidojot grunts dimērus. Abi rada ievērojamu primeru patēriņu blakusproduktu (nespecifisku) reakcijas produktu sintēzei un rezultātā ievērojami samazina sistēmas jutību. Tas apgrūtina vai padara neiespējamu reakcijas rezultātu nolasīšanu elektroforēzes laikā.

1.6. Standarta PCR reakcijas maisījuma sastāvs

x PCR buferšķīdums (100 mM Tris-HCl šķīdums, pH 9,0, 500 mM KCl šķīdums, 25 mM MgCl2 šķīdums ) …….2,5 µl

Ūdens (MilliQ)………………………………………………………….18,8 µl

Nukleotīdu trifosfātu (dNTP) maisījums

mM šķīdums katram…………………………………….……….0,5 µl

Primer 1 (10 mM šķīdums) ………………………………………………………….….1 µl

Primer 2 (10 mM šķīdums) ………………………………………………………….….1 µl

DNS polimerāze (5 vienības/µl) ……………………………………… 0,2 µl

DNS paraugs (20 ng/µl) ……………………………………………..1 µl

1.7. Reakcijas rezultātu novērtējums

Lai pareizi novērtētu PCR rezultātus, ir svarīgi saprast, ka šī metode nav kvantitatīva. Teorētiski atsevišķu mērķa DNS molekulu amplifikācijas produktus var noteikt, izmantojot elektroforēzi pēc 30-35 cikliem. Taču praksē tas tiek darīts tikai gadījumos, kad reakcija notiek ideālam tuvu apstākļos, kas dzīvē nereti notiek. Īpaši liela ietekme uz amplifikācijas efektivitāti ir DNS preparāta tīrības pakāpei, t.i. dažu inhibitoru klātbūtne reakcijas maisījumā, no kuriem dažos gadījumos var būt ārkārtīgi grūti atbrīvoties. Dažreiz to klātbūtnes dēļ nevar pastiprināt pat desmitiem tūkstošu mērķa DNS molekulu. Tādējādi bieži vien nav tiešas attiecības starp sākotnējo mērķa DNS daudzumu un amplifikācijas produktu galīgo daudzumu.

2. nodaļa: Polimerāzes ķēdes reakcijas pielietojumi

PCR izmanto daudzās jomās testēšanai un zinātniskiem eksperimentiem.

Kriminālistika

PCR izmanto, lai salīdzinātu tā sauktos "ģenētiskos pirkstu nospiedumus". Nepieciešams ģenētiskā materiāla paraugs no nozieguma vietas - asinis, siekalas, sperma, mati utt. Tas tiek salīdzināts ar aizdomās turamā ģenētisko materiālu. Pietiek ar ļoti mazu DNS daudzumu, teorētiski ar vienu eksemplāru. DNS sadala fragmentos un pēc tam pastiprina, izmantojot PCR. Fragmenti tiek atdalīti, izmantojot DNS elektroforēzi. Iegūto DNS joslu izvietojuma modeli sauc par ģenētisko pirkstu nospiedumu.

Paternitātes noteikšana

DNS fragmentu elektroforēzes rezultāti, kas pastiprināti ar PCR. Tēvs. Bērns. Māte. Bērns mantoja dažas abu vecāku ģenētiskā nospieduma pazīmes, kā rezultātā radās jauns, unikāls nospiedums.

Lai gan ģenētiskie pirkstu nospiedumi ir unikāli, ģimenes attiecības joprojām var izveidot, noņemot vairākus pirkstu nospiedumus. To pašu metodi var izmantot, nedaudz modificējot, lai noteiktu organismu evolucionāro saistību.

Medicīniskā diagnostika

PCR ļauj ievērojami paātrināt un atvieglot iedzimtu un vīrusu slimību diagnostiku. Interesējošais gēns tiek pastiprināts ar PCR, izmantojot atbilstošus primerus, un pēc tam sekvencē, lai identificētu mutācijas. Vīrusu infekcijas var atklāt tūlīt pēc inficēšanās, nedēļas vai mēnešus pirms simptomu parādīšanās.

Personalizētā medicīna

Dažkārt zāles dažiem pacientiem izrādās toksiskas vai alerģiskas. Daļēji tā iemesls ir individuālās atšķirības zāļu un to atvasinājumu jutībā un metabolismā. Šīs atšķirības tiek noteiktas ģenētiskajā līmenī. Piemēram, vienam pacientam noteikts citohroms var būt aktīvāks, citam – mazāk. Lai noteiktu, kāda veida citohroms ir konkrētajam pacientam, pirms zāļu lietošanas ieteicams veikt PCR analīzi. Šo analīzi sauc par sākotnējo genotipēšanu.

Gēnu klonēšana

Gēnu klonēšana ir process, kurā gēni tiek izolēti un gēnu inženierijas manipulāciju rezultātā tiek iegūts liels daudzums konkrētā gēna produkta. PCR izmanto gēna pastiprināšanai, kas pēc tam tiek ievietots vektorā - DNS gabalā, kas pārnes svešu gēnu tajā pašā vai citā augšanai ērtā organismā. Piemēram, plazmīdas vai vīrusu DNS izmanto kā vektorus. Gēnu ievietošana svešā organismā parasti tiek izmantota, lai ražotu šī gēna produktu - RNS vai, visbiežāk, proteīnu. Tādā veidā daudzas olbaltumvielas tiek iegūtas rūpnieciskos daudzumos izmantošanai lauksaimniecība, zāles utt.

DNS sekvencēšana

Sekvenēšanas metodē, izmantojot dideoksinukleotīdus, kas marķēti ar fluorescējošu marķējumu vai radioaktīvo izotopu, PCR ir neatņemama sastāvdaļa, jo tieši polimerizācijas laikā DNS ķēdē tiek ievietoti nukleotīdu atvasinājumi, kas marķēti ar fluorescējošu vai radioaktīvu marķējumu. Tas aptur reakciju, ļaujot noteikt konkrētu nukleotīdu pozīcijas pēc sintezēto ķēžu atdalīšanas gēlā.

Mutaģenēze

Pašlaik PCR ir kļuvusi par galveno metodi mutaģenēzes veikšanai. PCR izmantošana ir ļāvusi vienkāršot un paātrināt mutaģenēzes procedūru, kā arī padarīt to uzticamāku un reproducējamāku.

PCR metode ļāva analizēt cilvēka papilomas vīrusa sekvenču klātbūtni cilvēka dzemdes kakla audzēju parafīnā iegultās biopsijas sekcijās 40 gadus pirms šī pētījuma. Turklāt, izmantojot PCR, bija iespējams pastiprināt un klonēt mitohondriju DNS fragmentus no 7 tūkstošus gadu vecu cilvēka smadzeņu fosilajām atliekām!

Izmantojot atsevišķu cilvēka spermatozoīdu lizātus, tika pierādīta spēja vienlaikus analizēt divus lokusus, kas atrodas dažādās nehomoloģiskās hromosomās. Šī pieeja sniedz unikālu iespēju smalkai ģenētiskai analīzei un hromosomu rekombinācijas, DNS polimorfisma uc izpētei. Tūlīt tika atrasta metode atsevišķu spermatozoīdu analīzei. praktiska izmantošana tiesu medicīnā, jo haploīdu šūnu HLA tipizēšana ļauj noteikt paternitāti vai identificēt noziedznieku (HLA komplekss ir cilvēka galvenā histokompatibilitātes kompleksa gēnu kopums; HLA kompleksa loki ir polimorfākie no visiem zināmajiem augstākie mugurkaulnieki: sugas ietvaros katrā lokusā ir neparasti liels skaits dažādu alēļu - viena un tā paša gēna alternatīvas formas).

Izmantojot PCR, ir iespējams noteikt pareizu svešu ģenētisko struktūru integrāciju iepriekš noteiktā pētāmo šūnu genoma reģionā. Kopējā šūnu DNS tiek savienota ar diviem oligonukleotīdu praimeriem, no kuriem viens ir komplementārs ar saimnieka DNS daļu, kas atrodas netālu no ievietošanas punkta, un otrs ar integrētā fragmenta secību antiparalēlā DNS virknē. Polimerāzes ķēdes reakcija gadījumā, ja paredzētajā ievietošanas vietā ir nemainīga hromosomu DNS struktūra, veidojas nezināma izmēra vienpavedienu DNS fragmenti, bet plānotas ievietošanas gadījumā - divpavedienu DNS fragmenti. zināms izmērs, ko nosaka attālums starp divu primeru atkausēšanas vietām. Turklāt analizētā genoma reģiona amplifikācijas pakāpe pirmajā gadījumā būs lineāri atkarīga no ciklu skaita, bet otrajā gadījumā tā būs eksponenciāla. Iepriekš noteikta izmēra pastiprināta fragmenta eksponenciāla uzkrāšanās PCR laikā ļauj to vizuāli novērot pēc DNS preparāta elektroforētiskās frakcionēšanas un izdarīt nepārprotamu secinājumu par svešas sekvences ievietošanu noteiktā hromosomu DNS reģionā.

Secinājums

PCR metode šobrīd visplašāk tiek izmantota kā dažādu infekcijas slimību diagnostikas metode. PCR ļauj noteikt infekcijas etioloģiju pat tad, ja analīzei ņemtajā paraugā ir tikai dažas patogēna DNS molekulas. PCR plaši izmanto HIV infekciju, vīrusu hepatīta u.c. agrīnai diagnostikai. Mūsdienās gandrīz nav neviena infekcijas izraisītāja, kuru nevarētu noteikt, izmantojot PCR.

Izmantotās literatūras saraksts

1.Padutovs V.E., Baranovs O.Ju., Voropajevs E.V. Molekulārās ģenētiskās analīzes metodes. - Mn.: Unipol, 2007. - 176 lpp.

2.PCR "reālais laiks" / Rebrikovs D.V., Samatovs G.A., Trofimovs D.Ju. un utt.; rediģēja d.b. n. D.V. Rebrikova; priekšvārds L.A. Ostermans un akadēmiķis RAS un RAAS E.D. Sverdlovs; 2. izdevums, red. un papildu - M.: BINOM. Zināšanu laboratorija, 2009. - 223 lpp.

.Patruševs L.I. Mākslīgās ģenētiskās sistēmas. - M.: Nauka, 2005. - 2 sēj.

.B. Gliks, J. Pasternaks Molekulārā biotehnoloģija. Principi un pielietojumi 589 lpp., 2002.g

5.Ščelkunovs S.N. Gēnu inženierija. - Novosibirska: Sib. Univ. izdevniecība, 2004. - 496 lpp.

Rediģēja A.A. Vorbjeva "Polimerāzes ķēdes reakcija un tās pielietojums diagnostikā dermatoveneroloģijā"; Medicīnas ziņu aģentūra - 72 lappuses

http://ru. wikipedia.org

http://scholar. google.ru

.

.

http://www.med2000.ru/n1/n12. htm

12.http://prizvanie. su/ - medicīnas žurnāls

Apmācība

Nepieciešama palīdzība tēmas izpētē?

Mūsu speciālisti konsultēs vai sniegs apmācību pakalpojumus par jums interesējošām tēmām.
Iesniedziet savu pieteikumu norādot tēmu tieši tagad, lai uzzinātu par iespēju saņemt konsultāciju.

Par adekvātu un efektīva ārstēšana Daudzas infekcijas slimības prasa savlaicīgu atpazīšanu precīza diagnoze. Šīs problēmas risināšanā mūsdienās tiek izmantotas augsto tehnoloģiju diagnostikas metodes, kuru pamatā ir molekulārās bioloģijas metodes. Šobrīd polimerāzes ķēdes reakcija (PCR) jau diezgan plaši tiek izmantota praktiskajā medicīnā kā visuzticamākais laboratorijas diagnostikas instruments.

Kas izskaidro PCR popularitāti šobrīd?

Pirmkārt, šo metodi izmanto, lai ar augstu precizitāti identificētu dažādu infekcijas slimību patogēnus.

Otrkārt, lai uzraudzītu ārstēšanas efektivitāti.

Dažādās rokasgrāmatās, brošūrās, rakstos, kā arī medicīnas speciālistu skaidrojumos nereti sastopamies ar nesaprotamu terminu un vārdu lietojumu. Ir patiešām grūti ikdienas vārdos runāt par zinātnes augsto tehnoloģiju produktiem.

Kāda ir PCR diagnostikas būtība un mehānika?

Katram dzīvam organismam ir savi unikālie gēni. Gēni atrodas DNS molekulā, kas patiesībā ir katra atsevišķa organisma "vizītkarte". DNS (ģenētiskais materiāls) ir ļoti gara molekula, kas sastāv no celtniecības blokiem, ko sauc par nukleotīdiem. Katram infekcijas slimību patogēnam tie atrodas stingri specifiski, tas ir, noteiktā secībā un kombinācijā. Kad nepieciešams saprast, vai cilvēkam ir konkrēts patogēns, tiek ņemts bioloģiskais materiāls (asinis, urīns, siekalas, uztriepes), kas satur mikroba DNS vai DNS fragmentus. Bet patogēna ģenētiskā materiāla daudzums ir ļoti mazs, un nav iespējams pateikt, kuram mikroorganismam tas pieder. Šīs problēmas risināšanai izmanto PCR. Polimerāzes ķēdes reakcijas būtība ir tāda, ka pētniecībai tiek ņemts neliels daudzums DNS saturoša materiāla, un PCR procesa laikā palielinās konkrētam patogēnam piederošā ģenētiskā materiāla daudzums un līdz ar to to var identificēt.

PCR diagnostika – biomateriāla ģenētiskā izpēte.

PCR metodes ideja pieder amerikāņu zinātniekam K. Mullinsam, kuru viņš ierosināja 1983. gadā. Tomēr plašu klīnisko pielietojumu tas saņēma tikai 20. gadsimta 90. gadu vidū.

Sapratīsim terminoloģiju, kas tas ir - DNS utt. Jebkuras dzīvas būtnes (dzīvnieka, augu, cilvēka, baktēriju, vīrusu) katrai šūnai ir hromosomas. Hromosomas ir ģenētiskās informācijas glabātājas, kas satur visu katras konkrētās dzīvās būtnes gēnu secību.

Katra hromosoma sastāv no diviem DNS pavedieniem, kas savīti spirālē viens pret otru. DNS ķīmiski ir dezoksiribonukleīnskābe, kas sastāv no strukturāliem komponentiem – nukleotīdiem. Ir 5 veidu nukleotīdi – timīns (T), adenozīns (A), guanīns (G), citozīns (C) un uracils (U). Nukleotīdi ir sakārtoti viens pēc otra stingrā individuālā secībā, veidojot gēnus. Viens gēns var sastāvēt no 20-200 šādiem nukleotīdiem. Piemēram, gēns, kas kodē insulīna ražošanu, sastāv no 60 nukleotīdu pāriem.

Nukleotīdiem piemīt komplementaritātes īpašība. Tas nozīmē, ka pretējā adenīnam (A) vienā DNS ķēdē obligāti ir timīns (T) citā ķēdē, un pretī guanīnam (G) ir citozīns (C). Shematiski tas izskatās šādi:
G-C
T-A
A-T
Šī komplementaritātes īpašība ir PCR atslēga.

Papildus DNS RNS ir tāda pati struktūra – ribonukleīnskābe, kas atšķiras no DNS ar to, ka timīna vietā izmanto uracilu. RNS ir ģenētiskās informācijas glabātājs dažos vīrusos, ko sauc par retrovīrusiem (piemēram, HIV).

DNS un RNS molekulas var “vairot” (šo īpašību izmanto PCR). Tas notiek šādi: divas DNS vai RNS virknes attālinās viens no otra, un katrā virknē atrodas īpašs enzīms, kas sintezē jaunu ķēdi. Sintēze notiek pēc komplementaritātes principa, tas ir, ja sākotnējā DNS ķēde satur nukleotīdu A, tad tikko sintezētā būs T, ja G, tad C utt. Lai sāktu sintēzi, šim īpašajam enzīmam "celtnieks" ir nepieciešama "sēkla" - 5-15 nukleotīdu secība. Šis “praimeris” ir definēts katram gēnam (hlamīdijas gēnam, mikoplazma, vīrusi) eksperimentāli.

Tātad katrs PCR cikls sastāv no trim posmiem. Pirmajā posmā notiek tā sauktā DNS attīšana - tas ir, divu viena ar otru savienotu DNS virkņu atdalīšana. Otrajā “sēkla” ir pievienota DNS virknes daļai. Un visbeidzot, šo DNS virkņu pagarinājums, ko ražo enzīms “celtnieks”. Šobrīd tas viss grūts process notiek vienā mēģenē un sastāv no atkārtotiem nosakāmas DNS pavairošanas cikliem, lai iegūtu lielu skaitu kopiju, kuras pēc tam var noteikt ar parastajām metodēm. Tas ir, no vienas DNS virknes mēs iegūstam simtiem vai tūkstošus.

PCR izpētes posmi

Bioloģiskā materiāla vākšana pētījumiem

Kā paraugs tiek izmantoti dažādi bioloģiskie materiāli: asinis un to sastāvdaļas, urīns, siekalas, izdalījumi no gļotādas, cerebrospinālais šķidrums, izdalījumi brūču virsmas, ķermeņa dobumu saturs. Visi bioparaugi tiek savākti ar vienreiz lietojamiem instrumentiem, un savākto materiālu ievieto sterilās plastmasas mēģenēs vai novieto uz barotnēm, pēc tam transportējot uz laboratoriju.

Savāktajiem paraugiem pievieno nepieciešamos reaģentus un ievieto programmējamā termostatā - termociklerā (pastiprinātājā). Pastiprinātājā PCR cikls, kas sastāv no trim posmiem (denaturācija, atkausēšana un pagarināšana), tiek atkārtots 30-50 reizes. Ko tas nozīmē? Apskatīsim tuvāk.

Tiešās PCR reakcijas stadijas, ģenētiskā materiāla kopēšana

esPCR posms - ģenētiskā materiāla sagatavošana kopēšanai.
Notiek 95 ° C temperatūrā, kamēr DNS pavedieni tiek atdalīti, un uz tiem var nosēsties “sēklas”.

“Sēklas” rūpnieciski ražo dažādas pētniecības un ražošanas asociācijas, un laboratorijas iepērk jau gatavas. Tajā pašā laikā “primer”, lai identificētu, piemēram, hlamīdijas, darbojas tikai attiecībā uz hlamīdijām utt. Tātad, ja biomateriāls tiek pārbaudīts uz hlamīdiju infekcijas esamību, tad reakcijas maisījumā ievieto hlamīdiju “primer”; ja biomateriāls tiek pārbaudīts uz Epšteina-Barra vīrusu, tad tas ir arī Epšteina-Barra vīrusa “sēkla”.

IIposms – Infekcijas ierosinātāja un “sēklas” ģenētiskā materiāla apvienošana.
Ja ir nosakāma vīrusa vai baktēriju DNS, “praimeris” atrodas uz šīs DNS. Šis “primera” pievienošanas process ir PCR otrais posms. Šis posms notiek 75°C temperatūrā.

IIIposms - infekcijas izraisītāja ģenētiskā materiāla kopēšana.
Tas ir faktiski ģenētiskā materiāla pagarināšanas vai pavairošanas process, kas notiek 72 ° C temperatūrā. Enzīms “celtnieks” tuvojas “sēklām” un sintezē jaunu DNS ķēdi. Līdz ar jaunas DNS ķēdes sintēzes beigām PCR cikls beidzas. Tas ir, vienā PCR ciklā ģenētiskā materiāla daudzums dubultojas. Piemēram, sākotnējā paraugā bija 100 vīrusa DNS molekulas, pēc pirmā PCR cikla paraugā jau būs 200 pārbaudāmā vīrusa DNS molekulas. Viens cikls ilgst 2-3 minūtes.

Lai ģenerētu pietiekamu daudzumu ģenētiskā materiāla identifikācijai, parasti tiek veikti 30-50 PCR cikli, kas aizņem 2-3 stundas.

Pavairotā ģenētiskā materiāla identifikācijas posms

Patiesībā PCR beidzas šeit, un tad nāk ne mazāk nozīmīgais identifikācijas posms. Identifikācijai tiek izmantota elektroforēzes metode vai marķētas "sēklas". Izmantojot elektroforēzi, iegūtās DNS virknes tiek atdalītas pēc izmēra, un dažāda garuma DNS fragmentu klātbūtne norāda uz pozitīvu testa rezultātu (tas ir, konkrēta vīrusa, baktēriju utt.). Izmantojot marķētās “sēklas”, reakcijas galaproduktam tiek pievienots hromogēns (krāsviela), kā rezultātā fermentatīvā reakcija notiek kopā ar krāsas veidošanos. Krāsas attīstība tieši norāda uz vīrusa vai cita nosakāma aģenta klātbūtni sākotnējā paraugā.

Mūsdienās, izmantojot marķētās "sēklas", kā arī atbilstošu programmatūru, ir iespējams nekavējoties "nolasīt" PCR rezultātus. Šī ir tā sauktā reāllaika PCR.

Kāpēc PCR diagnostika ir tik vērtīga?

Viena no būtiskām PCR metodes priekšrocībām ir tās augstā jutība - no 95 līdz 100%. Tomēr šo priekšrocību pamatā ir jābūt stingrai šādu nosacījumu ievērošanai:

1. pareiza bioloģiskā materiāla savākšana un transportēšana;
2. sterilu, vienreiz lietojamu instrumentu, speciālu laboratoriju un apmācīta personāla pieejamība;
3. stingra metodikas ievērošana un sterilitāte analīzes laikā

Dažādu atklāto mikrobu jutība atšķiras. Piemēram, PCR metodes jutīgums C hepatīta vīrusa noteikšanai ir 97-98%, ureaplazmas noteikšanas jutība ir 99-100%.

PCR analīzei raksturīgās iespējas nodrošina nepārspējamu analītisko specifiku. Tas nozīmē precīzi noteikt meklēto mikroorganismu, nevis līdzīgu vai cieši saistītu mikroorganismu.
Diagnostiskā jutība un PCR metodes specifika bieži vien ir pārāka par kultūras metodes specifiku, ko sauc par "zelta standartu" infekcijas slimību noteikšanai. Ņemot vērā kultūras kultivēšanas ilgumu (no vairākām dienām līdz vairākām nedēļām), PCR metodes priekšrocība kļūst acīmredzama.

PCR infekciju diagnostikā
PCR metodes priekšrocības (jutīgums un specifiskums) nosaka plašu pielietojumu klāstu mūsdienu medicīnā.
Galvenās PCR diagnostikas pielietošanas jomas:

1. dažādu lokalizāciju akūtu un hronisku infekcijas slimību diagnostika
2. terapijas efektivitātes uzraudzība
3. patogēna veida noskaidrošana

PCR izmanto dzemdniecībā, ginekoloģijā, neonatoloģijā, pediatrijā, uroloģijā, veneroloģijā, nefroloģijā, infekcijas slimību klīnikā, oftalmoloģijā, neiroloģijā, ftiziopulmonoloģijā u.c.

PCR diagnostikas izmantošana tiek veikta kopā ar citām pētījumu metodēm (ELISA, PIF, RIF utt.). To kombināciju un piemērotību nosaka ārstējošais ārsts.

Infekcijas izraisītāji, kas atklāti ar PCR

Vīrusi:

1. retrovīrusi HIV-1 un HIV-2
2. herpetiformi vīrusi
3. vīruss herpes simplex 1 un 2 veidi

Pēdējā laikā uzticams, ļoti jutīgs un ātra metode dažādu cilvēku infekcijas slimību diagnostika. Šo metodi sauc par "PCR analīzi". Kas tas ir, kāda ir tā būtība, kādus mikroorganismus tas var identificēt un kā to pareizi uzņemt, mēs jums pastāstīsim mūsu rakstā.

Atklājumu vēsture

PCR metodes tiek izmantotas arī vēža diagnostikā.

Metodes priekšrocības

PCR diagnostikai ir vairākas priekšrocības:

1. Augsta jutība. Pat ja ir tikai dažas mikroorganismu DNS molekulas, PCR analīze nosaka infekcijas klātbūtni. Metode palīdzēs ar hroniskām un latentām slimībām. Bieži šādos gadījumos mikroorganisms nav citādi kultivēts.
2. Pētījumiem ir piemērots jebkurš materiāls, piemēram, siekalas, asinis, dzimumorgānu izdalījumi, mati, epitēlija šūnas. Visizplatītākais ir asins un uroģenitālās uztriepes PCR tests.

   

3. Nav nepieciešama ilgstoša kultūraugu audzēšana. Automatizētais diagnostikas process ļauj iegūt pētījumu rezultātus pēc 4-5 stundām.
4. Metode ir gandrīz simtprocentīgi uzticama. Ir reģistrēti tikai atsevišķi kļūdaini negatīvu rezultātu gadījumi.
5. Spēja no viena materiāla parauga identificēt vairākus patogēnu veidus. Tas ne tikai paātrina slimības diagnosticēšanas procesu, bet arī ievērojami samazina materiālās izmaksas. Bieži vien ārsts izraksta kompleksu PCR testu. Izmeklējuma izmaksas, kas sastāv no sešu patogēnu identificēšanas, ir aptuveni 1500 rubļu.

Lai rezultāti būtu ticami, veicot PCR pētījumu, jums jāveic tests, ievērojot ieteikumus iepriekšējai sagatavošanai diagnozei:

1. Pirms siekalu ziedošanas ir jāatturas no ēšanas un medikamentu lietošanas 4 stundas pirms materiāla savākšanas. Tieši pirms procedūras izskalojiet muti ar vārītu ūdeni.
2. Iepriekš minētie noteikumi jāievēro arī, ņemot paraugu no vaiga iekšējās virsmas. Pēc skalošanas ieteicams veikt vieglu ādas masāžu, lai atbrīvotu dziedzera sekrēciju.
3. Urīns parasti tiek savākts mājās. Lai to izdarītu, jums rūpīgi jāiztīra dzimumorgāni. 50-60 ml urīna jāsavāc sterilā plastmasas traukā. Lai nodrošinātu materiāla tīrību, sievietēm ieteicams makstī ievietot tamponu, bet vīriešiem pēc iespējas vairāk atvilkt ādas kroku. Jūs nevarat ziedot materiālus menstruāciju laikā.
4. Lai ziedotu spermu, 3 dienas pirms materiāla savākšanas jāatturas no dzimumakta. Ārsti arī iesaka izvairīties no saunas apmeklēšanas un karstas vannas, alkohola un pikantu ēdienu lietošanas. Jums vajadzētu atturēties no urinēšanas 3 stundas pirms testa.
5. Piemēram, ja tiek veikts PCR tests hlamīdiju noteikšanai, gan sievietēm, gan vīriešiem ieteicams seksuāli atpūsties 3 dienas. 2 nedēļas pirms testa nedrīkst lietot antibakteriālas zāles. Uz nedēļu jums jāpārtrauc intīmo želeju, ziežu, maksts svecīšu un douching lietošana. 3 stundas pirms testa jums vajadzētu atturēties no urinēšanas. Menstruāciju laikā materiāls netiek savākts, tikai 3 dienas pēc asiņošanas pārtraukšanas var ņemt uroģenitālo uztriepi.

PCR grūtniecības laikā

Gaidot bērnu, daudzas seksuāli transmisīvās infekcijas slimības ir ārkārtīgi bīstamas normāla attīstība auglis STS var izraisīt intrauterīnās augšanas aizkavēšanos, spontāno abortu vai priekšlaicīgas dzemdības, kā arī bērna iedzimtus defektus. Tāpēc ir ārkārtīgi svarīgi doties uz agrīnās stadijas grūtniecības pārbaude, izmantojot PCR metodi. Tests jākārto reģistrējoties – līdz 12 nedēļām.



Materiāls tiek savākts no dzemdes kakla kanāla, izmantojot īpašu suku. Procedūra ir nesāpīga un nerada briesmas mazulim. Parasti grūtniecības laikā tiek veikta hlamīdiju analīze, izmantojot PCR metodi, kā arī ureaplazmoze, mikoplazmoze, citomegalovīruss, herpes un papilomas vīruss. Šo izmeklējumu kopumu sauc par PCR-6.

PCR HIV diagnostikai

Sakarā ar to, ka metode ir ļoti jutīga pret izmaiņām organismā un diagnostikas apstākļiem, daudzi faktori var ietekmēt rezultātu. Tāpēc PCR analīze HIV infekcijas noteikšanai nav uzticama metode, tās efektivitāte ir 96-98%. Atlikušajos 2-4% gadījumu tests dod viltus pozitīvus rezultātus.

Bet dažās situācijās jūs nevarat iztikt bez HIV PCR diagnostikas. To parasti veic cilvēkiem ar viltus negatīvu ELISA rezultātu. Šādi rādītāji liecina, ka cilvēkam vēl nav izveidojušās antivielas pret vīrusu un tās nav iespējams noteikt bez vairākkārtēja skaita pieauguma. Tieši to var panākt, veicot asins analīzi ar PCR metodi.

Šāda diagnostika nepieciešama arī bērniem pirmajā dzīves gadā, kas dzimuši no HIV pozitīvas mātes. Metode ir vienīgais ceļš uzticama bērna statusa noteikšana.

PCR hepatīta diagnosticēšanai

Polimerāzes ķēdes reakcijas metode ļauj noteikt A, B, C hepatīta vīrusa DNS ilgi pirms antivielu veidošanās pret infekciju vai slimības simptomu parādīšanās. C hepatīta PCR tests ir īpaši efektīvs, jo 85% gadījumu šī slimība ir asimptomātiska un bez savlaicīgas ārstēšanas kļūst hroniska.



Savlaicīga patogēna atklāšana palīdzēs izvairīties no komplikācijām un ilgstošas ​​ārstēšanas.

Visaptveroša PCR pārbaude

Visaptveroša PCR analīze: pārbaude, izmantojot polimētisko ķēdes reakcijas metodi, kas ietver vairāku veidu infekciju vienlaicīgu noteikšanu: mycoplasma genitalium, mycoplasma hominis, Gardnerella vaginalis, candida, trichomonas, citomegalovīruss, 1. un 2. tipa herpes, gonoreja, papilomas vīruss. Šādas diagnostikas cena svārstās no 2000 līdz 3500 rubļiem. atkarībā no klīnikas, izmantotajiem materiāliem un aprīkojuma, kā arī analīzes veida: kvalitatīvā vai kvantitatīvā. Ārsts izlems, kurš no tiem ir nepieciešams jūsu gadījumā. Dažos gadījumos pietiek ar vienkāršu patogēna klātbūtnes noteikšanu, citos, piemēram, ar HIV infekciju, svarīga loma ir kvantitatīvajam titram. Diagnosticējot visus iepriekš minētos patogēnus, izmeklēšanu sauc par "PCR-12 analīzi".

Analīzes rezultātu atšifrēšana

PCR analīzes atšifrēšana nav grūta. Ir tikai 2 indikatoru skalas - " pozitīvs rezultāts" un "negatīvs rezultāts". Ja tiek atklāts patogēns, ārsti ar 99% pārliecību var apstiprināt slimības klātbūtni un sākt pacienta ārstēšanu. Izmantojot kvantitatīvo infekcijas noteikšanas metodi, attiecīgajā kolonnā tiks norādīts konstatēto baktēriju skaitliskais rādītājs. Tikai ārsts var noteikt slimības pakāpi un noteikt nepieciešamo ārstēšanu.



Atsevišķos gadījumos, piemēram, nosakot HIV infekciju ar PCR metodi, ja rezultāts ir negatīvs, rodas nepieciešamība veikt papildu izmeklējumus, lai apstiprinātu iegūtos rādītājus.

Kur var pārbaudīties?

Kur veikt PCR testu: valsts klīnikā vai privātā laboratorijā? Diemžēl pašvaldību ārstniecības iestādēs iekārtas un metodes bieži vien ir novecojušas. Tāpēc labāk ir dot priekšroku privātām laboratorijām ar modernu aprīkojumu un augsti kvalificētu personālu. Turklāt privātā klīnikā rezultātus iegūsi daudz ātrāk.

Maskavā daudzas privātās laboratorijas piedāvā PCR testus dažādām infekcijām. Piemēram, tādās klīnikās kā “Vita”, “Complex Clinic”, “Happy Family”, “Uro-Pro”, tiek veikta PCR analīze. Pārbaudes cena ir no 200 rubļiem. viena patogēna identificēšanai.

Var secināt, ka infekcijas slimību diagnostika, izmantojot PCR metodi, vairumā gadījumu ir ātrs un uzticams veids, kā atklāt patogēnu organismā agrīnās infekcijas stadijās. Tomēr atsevišķos gadījumos ir vērts izvēlēties citas diagnostikas metodes. Tikai speciālists var noteikt šāda pētījuma nepieciešamību. PCR analīzes atšifrēšanai nepieciešama arī profesionāla pieeja. Ievērojiet ārsta ieteikumus un pats neveiciet nevajadzīgas pārbaudes.