Imūnās reakcijas. Imūnreakciju pielietošana diagnostikā infekcijas slimības.
PLĀNS:
Imūnās reakcijas veidi.
Seroloģisko reakciju veikšanas nosacījumi.
Seruma prasības.
Pozitīvo un negatīvo rezultātu jēdziens.
GALVENAIS SATURS:
Imūnās reakcijas veidi.
Imunoloģiskā reakcija – Tā ir antigēna mijiedarbība ar antivielu, ko nosaka antivielas (paratopa) aktīvo centru specifiskā mijiedarbība ar antigēnu epitopiem.
Vispārējā imunoloģisko reakciju klasifikācija:
seroloģiskās reakcijas - reakcijas starp antigēniem (Ag) un antivielām (Ig)
in vitro ;
šūnu reakcijas ar imūnkompetentu šūnu piedalīšanos;
alerģijas testi - paaugstinātas jutības noteikšana.
Seroloģiskās reakcijas: 1) definīcija, 2) fāzes, 3) mērķi, 4) vispārīgā klasifikācija.
1) Definīcija
Seroloģiskās metodes pētījumi (no latīņu valodas Serum - serums un logos - mācīšana), izmantojot antigēna-antivielu reakciju.
2) Fāzes
2 mijiedarbības fāzes:
es Konkrēts (redzams) – notiek ātri, antivielas apvienojas ar tiem atbilstošajiem antigēniem. Šajā fāzē mijiedarbojas noteicošās antigēnu grupas (AG) un aktīvie antivielu centri (AT).
AG + AT kompleksa veidošanā iesaistītie spēki ir:
kulons;
van der Vāls
Ūdeņraža saites.
Šajā posmā nav redzamu izmaiņu. Elektronu mikroskopija parāda AG+AT kompleksu režģa formā.
II. Nespecifisks – notiek lēni, iegūtais antigēna-antivielu komplekss reaģē ar papildus nespecifisku vides faktoru, kurā notiek reakcija, un tas ir redzams ar aci – līmēšana, šķīšana, nokrišņu pārslas utt. Elektrolīta klātbūtnē lādiņš samazinās , šķīdība samazinās, veidojas redzami konglomerāti , izgulsnējas (aglutināts).
3) Mērķu izvirzīšana :
a) lai identificētu antigēnu (antivielu zināms diagnostiskais serums):
seroloģiskā identifikācija (sugu identifikācija);
serotipēšana (serovāra noteikšana) – celma noteikšana;
patoloģiskajā materiālā (ātrā diagnostika);
tīrajā kultūrā:
b) lai noteiktu antivielas (Ig) (antigēns ir zināms - diagnostisks):
klātbūtne (kvalitatīvas reakcijas);
daudzumi (titra pieaugums - “pāra seruma” metode).
4) Vispārējā klasifikācija seroloģiskās reakcijas :
a) vienkāršs (divkomponentu: Ag+Ig):
RA aglutinācijas reakcijas (ar korpuskulāro antigēnu);
PR izgulsnēšanās reakcijas (ar šķīstošo antigēnu);
b) komplekss (3 komponentu: Ag+Ig+C);
c) izmantojot tagu.
Aglutinācijas un izgulsnēšanās reakciju varianti
Aglutinācijas reakcija :
Aglutinācijas reakcija (RA) - imūnā reakcija antigēnu (eritrocītu, baktēriju) suspensijas mijiedarbība ar antigēniem in sāls šķīdums.
Aglutinācijas laikā AT daļiņas salīp kopā, veidojot flokulentas nogulsnes.
Reakcija pasīvā hemaglutinācija(RPGA) ir aglutinācijas reakcijas veids, kurā tiek izmantota antiviela vai eritrocītu diagnostikas antigēns (eritrocīti, kuru virsmā ir adsorbēts AT vai AG).
Sarkanās asins šūnas šajā reakcijā darbojas kā pasīvie nesēji.
RPGA rezultātu novērtējums tiek veikts šādi:
- plkst pozitīva reakcija pasīvi pielipušie sarkanie asinsķermenīši pārklāj U vai V formas cauruma dibenu vienmērīgā slānī ar šķembām malām (“lietussargs”);
- plkst negatīva reakcija (ja nav aglutinācijas), sarkanās asins šūnas uzkrājas cauruma centrālajā padziļinājumā, veidojot kompaktu “pogu” ar asi izteiktām malām.
Diagnozei izmanto hemaglutinācijas inhibīcijas testu (HIT). vīrusu infekcijas. Dažu vīrusu virsmā ir proteīns, ko sauc par hemaglutinīnu, kas salīmē sarkanās asins šūnas. Specifisku pretvīrusu antivielu pievienošana bloķē vīrusu hemaglutinīnu – hemaglutinācija nenotiek.
Netiešo hemaglutinācijas reakciju (IRHA) vai Kumbsa reakciju izmanto, lai noteiktu nepilnīgas antivielas. Antiglobulīna seruma (AT pret cilvēka Ig) pievienošana uzlabo reakcijas rezultātus. RNGA izmanto, lai noteiktu Rh faktoru.
Lai veiktu aglutinācijas reakciju (RA), ir nepieciešami trīs komponenti:
1) antigēns (aglutinogēns) AG;
2) antivielu(aglutinīns) AT;
3)
elektrolīts
(izotonisks nātrija hlorīda šķīdums).
Ag + AT + elektrolīts = aglutināts
Aglutinācija (no latīņu valodas agglutinatio - līmēšana) - asinsķermenīšu (baktērijas, sarkanās asins šūnas utt.) līmēšana ar antivielām elektrolītu - nātrija hlorīda klātbūtnē.
RA izpaužas kā pārslas vai nogulsnes, kas sastāv no asinsķermenīšiem (piemēram, baktērijām, sarkanajām asins šūnām), kas “salīmētas” ar antivielām.
RA tiek izmantots:
Tiešā mikrobu aglutinācijas reakcija (RA).
Šajā reakcijā antivielas (aglutinīni) tieši aglutinē korpuskulāros antigēnus (aglutinogēnus).
Parasti tos attēlo inaktivētu mikroorganismu suspensija (mikrobu aglutinācijas reakcija).
Lai noteiktu mikroorganismu veidu, izmantojietstandarta diagnostikas aglutinācija serums ( slavenais AT ).
Visizplatītākie ir lamelāri (aptuveni) un paplašināti RA.
Plāksne RA tiek novietota uz stikla. To izmanto kā paātrinātu metodi antivielu noteikšanai vai mikroorganismu identificēšanai.
Sastāvdaļas:
1. standarta diagnostikas aglutinējošie serumi (AT);
2. tīrkultūra, kas tiek pētīta no pacienta;
3. sāls šķīdums.
Pētītajā tīrkultūrā antigēni (AG) ir daļiņu veidā (mikrobu šūnas, eritrocīti un citi korpuskulārie antigēni), kuras salīmē kopā ar antivielām un nogulsnējas.
Piemērs:
Iestudējums indikatīvs aglutinācijas reakcijas (RA ) uz stikla lai identificētu koliformas baktērijas.
Uzklājiet pilienus uz priekšmetstikliņa:
1
dizentērija
;
2
-th piliens: - aglutinējošais serums pret patogēniemvēdertīfs
;
(1-2 diagnostikas serumi)
3
-th piliens: - sāls šķīdums (kontrole).
Katram pilienam pievienojiet pārbaudīto tīro baktēriju kultūru. Samaisiet.
Rezultāts
:
pozitīvs
- aglutināta pārslu klātbūtne,
negatīvs
- aglutināta pārslu trūkums
Secinājums:Pētītās baktērijas ir vēdertīfa izraisītāji (noteikti antigēni).
Lai noteiktu AT pacienta serumā (seroloģiskā diagnoze), standarta mikrobidiagnostika , kas satur suspensijuslavens mikrobi vai to antigēniAG .
ABO asinsgrupu noteikšana (hemaglutinācijas reakcija (HRA)) – aglutinē sarkanās asins šūnas.
Reakcijas sastāvdaļas:
1. AG (sarkanās asins šūnas) pārbauda asinis
2. AT (eritrotesti - zolikloni)
Zoliklonu komplekts:
Coliclone anti-A reaģents (rozā)
Coliclone anti-B reaģents (zils)
Reaģents Tsoliklon anti-AV (bezkrāsains)
3. elektrolīts (sāls šķīdums)
Noteikšanas tehnika:
1
.
Vienu pilienu (0,1 ml) anti-A, anti-B un anti-AB zolikona uzklāj uz tabletes iedobēm (kontrolei).
2.
Blakus katram reaģenta pilienam tiek uzklāts neliels (0,05-0,01 ml) pārbaudāmo asiņu piliens.
Pēc tam zoliklona pilienu sajauc ar asins pilienu, izmantojot atsevišķu tīru stikla stienīti.
3.
Aglutinācijas reakcija attīstās pirmajās 3-5 sekundēs, maigi šūpojot plāksni.
Reakcijas rezultātus ņem vērā 2,5 - 3 minūtes pēc pilienu sajaukšanas. No kreisās uz labo akās ir anti-A, anti-B, anti-AB.
Pozitīvs rezultāts ir granulētu nogulumu (aglutināta) parādīšanās.
pozitīvs RA (+)
Negatīvs - nav nogulumu.
negatīvs RA(-)
4.
Rezultātu analīze.
O(es) α β – nav aglutinācijas
A(II) β – aglutinācija ar anti-A
B(III) α – aglutinācija ar anti-B
AB(IV)O – aglutinācija ar anti-A, ar anti-B
Aglutinācijas shematisks attēlojums.
Ag antigēni uz eritrocītiem (nosakāmi) + antivielaAT(zoliklons) diagnostikas serums
Aglutinācijas uzskaite tabletēs
Nokrišņu reakcija:
Izgulsnēšanās reakcija ir imūnreakcija, ko izraisa antigēna mijiedarbība šķīstošā stāvoklī ar antigēnu fizioloģiskā šķīdumā.
Nokrišņu laikā veidojas makromolekulārais imūnkomplekss, kas izpaužas ar caurspīdīga koloidāla šķīduma pāreju necaurspīdīgā suspensijā jeb nogulsnēs.
Abu reaģentu daudzumam jābūt stingri noteiktās proporcijās, jo viena no tiem pārpalikums samazina rezultātu.
Pastāv dažādi veidi nokrišņu reakcijas inscenēšana.
1. Gredzenveida izgulsnēšanas reakciju veic neliela diametra nokrišņu caurulēs. Mēģenē pievieno imūnserumu un rūpīgi slāņo šķīstošo antigēnu. AG un AT sajaucas molekulu termiskās kustības dēļ, un tie mijiedarbojas. Plkst pozitīvs rezultāts abu šķīdumu robežās veidojas necaurspīdīgu nogulšņu gredzens.
2. Ouchterlony dubultās imūndifūzijas reakciju veic agara gēlā, kura iedobēs pēc shēmas pievieno vai nu AG šķīdumu, vai AT šķīdumu. AG un AT izkliedējas gēlā viens pret otru un, ja reakcija ir pozitīva, veido imūnkompleksus, kas redzami kā nokrišņu līnijas.
Nokrišņu reakcija -šī ir veidošanāsun šķīstošā molekulārā antigēna-antivielu kompleksa izgulsnēšanās mākoņa veidā, ko sauc par nogulsnēm. Tas veidojas, sajaucot antigēnus un antivielas līdzvērtīgos daudzumos.
RA sastāvdaļas:
izgulsnošais serums (pazīstams AT-precipitīns);
testa serums (nezināms precipitinogēna antigēns);
fiziskais Risinājums.
Izgulsnēšanas reakciju veic vai nu īpašās šaurās mēģenēs (gredzenveida nokrišņu reakcija), vai Petri trauciņos želejos, barotnēs utt.
Gredzena-nokrišanas reakcija
Reakcijas rezultātu paziņošana un reģistrēšanagredzenu nokrišņipatogēnu noteikšanai Sibīrijas mēris(Ascoli reakcija).
Iestudējums .
1. Izpētāmo materiālu (ādu, vilnu, filcu, sarus, audumu, gaļu, augsni, dzīvnieku izkārnījumus utt.) vāra sāls šķīdumā 5-45 minūtes. lai iegūtu izotonisku ekstraktu (ekstraktu). Filtrēts.
2. Nogulsnējošo pretsibīrijas mēra serumu ielej mēģenē.
3. Uzmanīgi uzklājiet uz tā testa materiālu (ekstraktu).
Grāmatvedība .
Nākamo 10 minūšu laikā. Pozitīvos gadījumos seruma un ekstrakta saskarnē parādās duļķainības gredzens (gredzena nogulsnēšanās). Ascoli reakcija ir ļoti jutīga un specifiska
Ar tās palīdzību ir iespējams ātri identificēt materiālus, kas inficēti ar Sibīrijas mēri.
Nokrišņu reakcija agarā
Rezultātu paziņošana un reģistrēšananokrišņu reakcijas agarālai noteiktu korinebaktēriju (difterijas izraisītāju) toksicitāti
Iestudējums
Novietots uz fosfāta peptona agara Petri trauciņā.
1. Gar krūzes vidu novietojiet sterila filtrpapīra sloksni, kas samitrināta.antitoksisks serums.
2. Pēc žāvēšanas 1 cm attālumā no sloksnes malas tiek iesētas plāksnes ar diametru 10 mmatlasītās kultūras.
Vienā kausā var iesēt no 3 līdz 10 kultūrām, no kurām vienakontrole, ir jāzinatoksisks.
Kultūraugus ievieto termostatā.
Grāmatvedība
Analīze tiek veikta pēc 24-48-72 stundām.
Pozitīvs rezultāts - (kultūratoksisks) - parādās kādā attālumā no papīra sloksnesnogulsnes līnijas, « ūsiņu bultiņas", kas ir skaidri redzami caurlaidīgā gaismā.
Attēlā parādīta nokrišņu reakcija agarā, lai noteiktu difterijas baciļu toksicitāti. Vidējās kultūras neveido "bultu stīgas"; tie nav toksikogēni patogēni.
Difterijas izraisītāja celmi var būt toksigēni (ražo eksotoksīnu) un netoksigēni. Eksotoksīna veidošanās ir atkarīga no tā, vai baktērijās ir profāgs, kas satur toksīna gēnu, kas kodē eksotoksīna veidošanos.
Saslimšanas gadījumā tiek pārbaudīta visu difterijas patogēnu toksicitāte - difterijas eksotoksīna veidošanās, izmantojot nokrišņu reakciju agarā
Sarežģītas seroloģiskas reakcijas ( 3 komponentu: Ag+Ig+C):
Komplementa fiksācijas reakcija (CFR).
Reakcija tiek veikta divos posmos.
Pirmajā posmā AT mijiedarbojas ar antigēnu un komplementu, otrajā posmā tiek pievienots indikators - hemolītiskā sistēma (eritrocītu un antieritrocītu seruma maisījums).
Ja rezultāts ir pozitīvs, pirmajā posmā antivielas veido imūnkompleksu ar antigēniem, kas saista reakcijas maisījuma komplementu.
Šajā gadījumā hemolītiskās sistēmas sarkanās asins šūnas, kas pievienotas otrajā posmā, netiek iznīcinātas.
Pretējā gadījumā nesaistītais komplements izraisa indikatora sarkano asins šūnu līzi.
Lai to veiktu, nepieciešamas piecas sastāvdaļas: AG, AT un komplements (pirmā sistēma), aitas eritrocīti un hemolītiskais serums (otrā sistēma) (1. att.).
Reakcija notiek divās fāzēs (3. att.).
Pirmā fāze - antigēna un antivielu mijiedarbība ar obligātu komplementa līdzdalību.
Otrkārt - reakcijas rezultātu identificēšana, izmantojot indikatoru hemolītisko sistēmu (aitas sarkanās asins šūnas un hemolītisko serumu). Sarkano asins šūnu iznīcināšana ar hemolītisko serumu notiek tikai tad, ja hemolītiskajai sistēmai pievieno komplementu. Ja komplements iepriekš tika adsorbēts uz antigēna-antivielu kompleksa, tad eritrocītu hemolīze nenotiek (att.).
Pieredzes rezultāts
novērtēts (2. att.), atzīmējot hemolīzes esamību vai neesamību visās mēģenēs. Reakcija tiek uzskatīta par pozitīvu, ja hemolīze ir pilnībā aizkavēta, kad šķidrums mēģenē ir bezkrāsains un sarkanās asins šūnas nosēžas apakšā, negatīva - kad sarkanās asins šūnas ir pilnībā lizētas, kad šķidrums ir intensīvi krāsots (“lako” asinis). ).
Hemolīzes aizkavēšanās pakāpi novērtē atkarībā no šķidruma krāsas intensitātes un sarkano asins šūnu nogulumu lieluma apakšā (++++, +++, ++, +).
Rīsi. 4. RSC paziņojums un rezultāts.
Secinājums:Testa serumā tika konstatētas antivielas.
RSK ļauj noteikt antivielas pret jebkuru tā paša vīrusa serotipa celmu.
Diagnostikas vērtībai ir:
četrkārtīgs antivielu titra pieaugums pārī savienotos serumos (gripas epidēmijas laikā);
divkāršs asins seruma pieaugums pacientiem ar raksturīgu klīnisko ainu.
Reakcijas, izmantojot tagu :
Šīs metodes ir ļoti jutīgas. Kā antigēnu vai antivielu etiķetes tiek izmantotas krāsvielas, radioaktīvie izotopi, fermenti utt.
RIF – imunofluorescences reakcija
Imunofluorescences reakcija balstās uz antigēna-antivielu kompleksa gaismas indikāciju
Saistīts imūnsorbcijas tests.
Mūsdienīgs laboratorijas tests, kuras laikā tiek veikta specifisku antivielu vai specifisku slimību antigēnu meklēšana asinīs, lai noteiktu ne tikai etioloģiju, bet arī slimības stadiju.
ELISA rezultātus var sniegt kvalitatīvi un kvantitatīvi.
Pašlaik ELISA tiek izmantota šādās situācijās:
1) meklēt specifiskas antivielas pret jebkuru infekcijas slimību;
2) jebkuru slimību (infekcijas, veneroloģisko) antigēnu meklēšana;
3) pacienta hormonālā stāvokļa izpēte;
4) audzēju marķieru izmeklēšana;
5) izmeklējums uz autoimūno slimību klātbūtni.
Attēlā cietās fāzes ELISA parāda zināmos antigēnus (kreisajā pusē), kas adsorbēti uz plāksnes iedobes, (labajā pusē) uz plāksnes iedobēm zināmie antigēni
ELISA metodes priekšrocības:
1) ELISA metodes augsta specifika un jutīgums (vairāk nekā 90%).
2) Spēja noteikt slimību un izsekot procesa dinamikai, tas ir, salīdzinot antivielu skaitu dažādos laika periodos.
3) ELISA diagnostikas pieejamība jebkurā medicīnas iestādē.
Relatīvais trūkums: imūnās atbildes (antivielu) noteikšana, bet ne paša patogēna noteikšana, kas konjugēts ar marķējuma enzīmu.
ELISA tests (vispārējais mehānisms):
Enzīmu imūntesta pamatā ir antigēna un antivielas imūnreakcija ar imūnkompleksa veidošanos: antigēns-antiviela, kā rezultātā notiek izmaiņas fermentatīvā aktivitāte specifiskas zīmes uz antivielu virsmas.
Reakcijas sastāvdaļas:
1. AG(AT) zināms - planšetdatora iedobē.
2. AT (AG) tiek pētīta.
3. AT ar enzīmu, kas raksturīgs AT(AG)-AG(AT) kompleksam
4. hromogēns substrāts, kas mijiedarbojas ar fermentu
5. apstāšanās risinājums
ELISA galvenie posmi
1. Uz plāksnes iedobju virsmas atrodas konkrēta patogēna attīrīts antigēns. Viņi piebilst bioloģiskais materiāls pacientam notiek specifiska reakcija starp šo antigēnu un vēlamo antivielu (imūnglobulīnu). Veidojas komplekss.
2. Pievieno konjugantu – AT ar fermentu. Konjugants ir raksturīgs pirmā posma AT-AG kompleksam. Enzīms tiek aktivizēts.
3. Pievieno substrātu, un aktīvais enzīms reaģē ar to, mainot šķīduma bezkrāsaino krāsu.
4. Lai apturētu enzīma un substrāta mijiedarbību, tiek pievienots apturēšanas šķīdums.
Grāmatvedība.
Pozitīvs rezultāts ir krāsas maiņa, attēlā dzeltena.
Imūnhromatogrāfiskā analīze
Imunohromatogrāfiskās analīzes metode (ICA, ātrie testi) ir kvalitatīva sākotnējās skrīninga metode, kas ļauj ātri, dažu minūšu laikā veikt analīzi jebkuros apstākļos, t.sk. "lauks".
ICA priekšrocības ietver:
Ātrums un lietošanas ērtums;
Nelieli paraugu apjomi, parauga sagatavošanas trūkums;
Lētība ražotājam un patērētājam;
Iespēja izgatavot testus lielos apjomos;
Vienkārša lasīšana un rezultāta interpretācija;
Augsta jutība un reproducējamība;
Kvantitatīvās noteikšanas iespēja;
Iespēja izmantot portatīvos lasītājus, kas saderīgi ar datoru;
Daudzkārtējas analīzes iespēja.
Sastāvdaļas (uz testa strēmeles):
1. Konjugāts ar koloidālu zelta marķējumu ir specifisks noteiktajam antigēnam.
2. AT testa līnija – specifiska AT-AG kompleksam
3. Kontrollīnijas abs ir raksturīgas konjugātam.
ICA iestatījums:
1. Uzklājiet paraugu norādītajā sloksnes sākuma zonā.
2. Rezultāta iegūšana krāsainu svītru izskata veidā pārbaudes un kontroles līniju vietā.
Grāmatvedība
Pozitīvs – ja testa līnija ir iekrāsota.
Negatīvs - ja testa līnijai nav iekrāsošanās.
Nederīgs – ja kontroles līnija nav notraipīta.
Vispārējs mehānisms IHA:
1. Paraugs tiek ievadīts sākuma laukā (parauga spilventiņš) un ir saistīts ar konjugātu (konkrētu ķermeni ar krāsainu etiķeti), kas atrodas uz konjugāta paliktņa. Rezultātā veidojas krāsains komplekss.
2. Iegūtais krāsainais imūnkomplekss kapilāro spēku iedarbībā pārvietojas pa nitrocelulozes membrānu Un mijiedarbojasar AT testa līniju.Rezultāts ir vienas krāsas rozā-sarkana svītra.
3. AT (konjugāts) nav saistīts ar pārbaudīto josluvirzās tālāk un sasniedz vadības līniju, sazinās ar vadības līnijas AT.Tā rezultātā parādās otra krāsaina svītra.Ja analīze tiek veikta pareizi, kontroles līnijai vienmēr jāparādās neatkarīgi no testa antigēna (antivielas) klātbūtnes bioloģiskā šķidruma paraugā.
2. Seroloģisko reakciju veikšanas nosacījumi.
1. Homologa klātbūtne - viens otram atbilstošs antigēns un antiviela.
2. Tīri, sausi trauki.
3. Noteikta narkotiku attiecība (visbiežāk vienāda).
4. Obligāta elektrolīta (izotoniskā NaCl šķīduma) klātbūtne.
5. pH neitrāls vai tuvu viegli sārmainam.
6. Temperatūra +37°C vai istabas temperatūra (obligāti pozitīva).
7. Tiek veikta antigēna kontrole un seruma (antivielu) kontrole.
3 Seruma prasības
Serumam jābūt pilnīgi caurspīdīgam, bez šūnu piemaisījumiem.
Parasti viņi to saņem 2. slimības nedēļā, kad antivielas jau ir pieejamas.
Asinis tiek ņemtas 3-5 ml tukšā dūšā vai 6 stundas pēc ēšanas.
Lai iegūtu serumu, asinis atstāj uz 1 stundu istabas temperatūrā vai centrifugē. Serums tiek izsūkts ļoti uzmanīgi, lai nesatvertu izveidotos elementus.
Imūnserumus iegūst no cilvēku vai dzīvnieku (parasti trušu un zirgu) asinīm, imunizētas pēc noteiktas shēmas ar atbilstošo antigēnu (vakcīnu). Serumus parasti gatavo ražošanā.
4. Pozitīvo un negatīvo rezultātu jēdziens.
RA.
Ar pozitīvu reakciju pasīvi pielīmētie sarkanie asinsķermenīši pārklāj cauruma dibenu vienmērīgā slānī ar izgrieztām malām (“lietussargs”); ja nav aglutinācijas, sarkanās asins šūnas uzkrājas cauruma centrālajā padziļinājumā, veidojot kompaktu “pogu” ar asi izteiktām malām (skatīt attēlus augstāk).
RP.
Ja rezultāts ir pozitīvs, abu šķīdumu saskarnē veidojas pienains gredzens (skatīt attēlus iepriekš).
ELISA.
Ar pozitīvu reakciju notiek šķīduma krāsas izmaiņas.
RSK.
Aizkavēta hemolīze - reakcija ir pozitīva; ja komplements ir brīvs, tiek novērota hemolīze - reakcija ir negatīva(skatīt attēlus augstāk).
Vasermana reakcijas rezultāti:
a - pilnīga hemolīzes aizkavēšanās (+ + ++);
b - izteikta hemolīzes aizkavēšanās (+ ++);
c - daļēja hemolīzes aizkavēšanās (++);
d - neliela hemolīzes aizkavēšanās (+);
d - pilnīga hemolīze (-).
Reakcija ir pozitīva ar daļēju, izteiktu un pilnīgu hemolīzes aizkavēšanos, ko nosaka cauruļu satura iekrāsošanās pakāpe no gaiši rozā līdz spilgti sarkanai; nehemolizētie eritrocīti pēc tam veido sarkanas nogulsnes.
Mājasdarbs:
1. Izpētiet materiālu
Izdariet 3 piezīmes videoklipā
Nr.29 Aglutinācijas reakcija. Sastāvdaļas, mehānisms, uzstādīšanas metodes. Pieteikums.
Aglutinācijas reakcija- vienkārša reakcija, kurā antivielas saista korpuskulāros antigēnus (baktērijas, eritrocītus vai citas šūnas, nešķīstošas daļiņas ar uz tām adsorbētiem antigēniem, kā arī makromolekulāros agregātus). Tas notiek elektrolītu klātbūtnē, piemēram, pievienojot izotonisku nātrija hlorīda šķīdumu.
Tiek izmantoti dažādi aglutinācijas reakcijas varianti: ekstensīvs, indikatīvs, netiešs uc Aglutinācijas reakcija izpaužas ar pārslu vai nogulumu veidošanos (šūnas “salīmētas” ar antivielām, kurām ir divi vai vairāki antigēnu saistīšanas centri - 13.1. att.). RA tiek izmantots:
1) antivielu noteikšana pacientu asins serumā, piemēram, ar brucelozi (Raita, Hedelsona reakcijas), vēdertīfs un paratīfs (Vidal reakcija) un citas infekcijas slimības;
2) patogēna noteikšana, izolēts no pacienta;
3) asins grupu noteikšana izmantojot monoklonālās antivielas pret eritrocītu alloantigēniem.
Lai noteiktu antivielas pacientam veikt detalizētu aglutinācijas reakciju: Diagnosticum (nogalinātu mikrobu suspensija) pievieno pacienta asins seruma atšķaidījumiem, un pēc vairāku stundu ilgas inkubācijas 37 °C temperatūrā tiek atzīmēts augstākais seruma atšķaidījums (seruma titrs), pie kura notikusi aglutinācija, t.i., radušās nogulsnes. veidojas.
Aglutinācijas raksturs un ātrums ir atkarīgs no antigēna un antivielu veida. Kā piemēru var minēt diagnostisko (O- un H-antigēnu) mijiedarbības īpatnības ar specifiskām antivielām. Aglutinācijas reakcija ar O-diagnosticum (baktērijas, ko iznīcina karstums, saglabājot termostabilo O-antigēnu) notiek smalkgraudainas aglutinācijas veidā. Aglutinācijas reakcija ar H-diagnosticum (baktērijas, ko iznīcina formaldehīds, saglabājot termolabilu flagellar H-antigēnu) ir rupja un norit ātrāk. Ja nepieciešams noteikt no pacienta izolētu patogēnu, ielieciet indikatīva aglutinācijas reakcija, izmantojot diagnostiskās antivielas (aglutinējošo serumu), t.i., tiek veikta patogēna serotipēšana. Indikatīvu reakciju veic uz stikla priekšmetstikliņa. No pacienta izolētu patogēna tīrkultūru pievieno pilienam diagnostiskā aglutinējošā seruma atšķaidījumā 1:10 vai 1:20. Tuvumā tiek novietota kontrole: seruma vietā tiek uzklāts piliens nātrija hlorīda šķīduma. Kad pilē ar serumu un mikrobiem parādās flokulējošas nogulsnes, mēģenēs veic detalizētu aglutinācijas reakciju ar pieaugošiem aglutinējošā seruma atšķaidījumiem, kam pievieno 2-3 pilienus patogēna suspensijas. Aglutināciju ņem vērā, ņemot vērā nogulšņu daudzumu un šķidruma dzidrības pakāpi. Reakciju uzskata par pozitīvu, ja aglutināciju novēro atšķaidījumā, kas ir tuvu diagnostikas seruma titram. Tajā pašā laikā tiek ņemtas vērā kontroles: serumam, kas atšķaidīts ar izotonisku nātrija hlorīda šķīdumu, jābūt caurspīdīgam, mikrobu suspensijai tajā pašā šķīdumā jābūt vienmērīgi duļķainai, bez nogulsnēm.
Dažādas radniecīgas baktērijas var aglutinēt ar vienu un to pašu diagnostisko aglutinācijas serumu, kas
apgrūtina to identificēšanu. Tāpēc viņi izmanto adsorbētus aglutinācijas serumus, no kuriem
krusteniski reaģējošas antivielas, adsorbējot radniecīgās baktērijās. Antivielas tiek saglabātas šādos serumos,
raksturīgs tikai konkrētai baktērijai.
Aglutinācija ir baktēriju salīmēšana specifisku AT mijiedarbības rezultātā ar tām. Lai veiktu RA, ir nepieciešami trīs komponenti: 1) AG (aglutinogēns); 2) AT (aglutinīns); 3) elektrolīta šķīdums (izotoniskais nātrija hlorīda šķīdums). Aglutinācijas reakcijā piedalās tikai korpuskulārie antigēni (baktērijas, sarkanās asins šūnas, ar antigēnu iekrautas lateksa daļiņas).
Aglutinācijas reakcija uz stikla. Uz beztauku priekšmetstikliņa ar pipeti uzklāj diagnostiskā seruma pilienu (seruma atšķaidījums 1:10 – 1:20). Izmantojot bakterioloģisko cilpu, no slīpā agara virsmas ņem pētāmā mikroorganisma tīrkultūru, pārnes uz seruma pilienu un sajauc. Reakcijas rezultāts tiek ņemts vērā ar neapbruņotu aci pēc 3-5 minūtēm. Ja reakcija ir pozitīva, seruma pilē tiek novērotas pārslas (lielas vai mazas), kas skaidri redzamas uz tumša fona, kad priekšmetstikliņu sakrata. Negatīvās reakcijas gadījumā šķidrums paliek vienmērīgi duļķains.
Aglutinācijas reakcija mēģenēs. Mēģenīšu rindai pievieno 1 ml fizioloģiskā šķīduma. Pirmajai mēģenei pievieno vienādu daudzumu pārbaudāmā asins seruma. Tiek sagatavoti sērijveida divkārši seruma atšķaidījumi (seruma titrēšana), pēc tam katrā mēģenē pievieno 2 pilienus inaktivētu baktēriju suspensijas (diagnosticum). Caurules ievieto termostatā 37 °C uz 2 stundām. Reakcija norisinās, veidojot mazas, ar neapbruņotu aci neredzamas pārsliņas, tāpēc rezultāti tiek fiksēti ar nelielu palielinājumu īpašā ierīcē – aglutinoskopā. Aglutinācijas intensitāte tiek ņemta vērā pēc “četri plus” sistēmas: pilnīga aglutinācija - 4+, daļēja aglutinācija - 3+ vai 2+, apšaubāms rezultāts - +. Pēdējais atšķaidījums, kurā tiek novērota aglutinācija 2+, tiek ņemts par antivielu titru testa serumā.
Tiek veikta aglutinācijas reakcija mēģenēs (plaša aglutinācijas reakcija), lai noteiktu antivielu titru pret vēdertīfa un paratīfa (Vidal reakcija), brucelozes (Raita reakcija) un tīfa (Veigla reakcija) izraisītājiem.
Aglutinācija (no latīņu valodas agglutinatio — līmēšana) ir antigēnu saturošu korpuskulāro daļiņu (veselu šūnu, lateksa daļiņu u.c.) salīmēšana (savienošana) ar specifisku antivielu molekulām elektrolītu klātbūtnē, kas beidzas ar pārslu vai nogulumu veidošanos. (aglutināts), kas redzams ar neapbruņotu aci. Sedimentu raksturs ir atkarīgs no antigēna rakstura: kažokādas baktērijas rada rupjus flokulentus nogulsnes, ar kauliņiem un nekapsulāras baktērijas rada smalkgraudainus nogulumus, bet kapsulārās baktērijas rada stīgas nogulsnes. Izšķir tiešo aglutināciju, kurā baktēriju vai jebkuras citas šūnas, piemēram, eritrocītu, pašu antigēni tieši piedalās mijiedarbībā ar specifiskām antivielām; un netiešās jeb pasīvās, kurās baktēriju šūnas vai eritrocīti, vai lateksa daļiņas ir ne pašu, bet svešu antigēnu (vai antivielu) nesēji, kas uz tiem ir sorbēti, lai identificētu tām specifiskās antivielas (vai antigēnus). Aglutinācijas reakcija galvenokārt ietver antivielas, kas pieder IgG un IgM klasēm. Tas notiek divās fāzēs: pirmkārt, notiek specifiska mijiedarbība starp antivielu aktīvo centru un antigēna noteicēju; šis posms var notikt, ja nav elektrolītu, un to nepavada redzamas izmaiņas reaģējošā sistēmā. Otrajam posmam - aglutināta veidošanai - nepieciešama elektrolītu klātbūtne, kas samazina elektriskais lādiņš antigēnu + antivielu kompleksus un paātrina to līmēšanas procesu. Šī fāze beidzas ar aglutināta veidošanos.
Aglutinācijas reakcijas veic vai nu uz stikla vai gludām kartona plāksnēm, vai sterilās aglutinācijas mēģenēs. Aglutinācijas reakcijas (tiešās un pasīvās) uz stikla parasti izmanto kā paātrināta metode specifisku antivielu noteikšana pacienta serumā (piemēram, ar brucelozi) vai patogēna seroloģiskai identificēšanai. Pēdējā gadījumā parasti izmanto labi attīrītus (adsorbētus) diagnostikas serumus, kas satur tikai monoreceptoru antivielas vai to komplektu pret dažādiem antigēniem. Stikla aglutinācijas reakcijas neapšaubāmā priekšrocība ir tās īstenošanas vienkāršība un fakts, ka tas aizņem vairākas minūtes vai pat sekundes, jo abas sastāvdaļas tiek izmantotas koncentrētā veidā. Tomēr tai ir tikai kvalitatīva vērtība, un tā ir mazāk jutīga nekā mēģene. Plašāka aglutinācijas reakcija mēģenēs dod precīzākus rezultātus, jo ļauj noteikt kvantitatīvo antivielu saturu serumā (noteikt tā titru) un nepieciešamības gadījumā reģistrēt antivielu titra pieauguma faktu, kam ir diagnostiska vērtība. . Lai izveidotu reakciju, aglutinācijas mēģenēm noteiktā veidā pievieno atšķaidītu 0,85% šķīdumu. NaCl šķīdums serums un vienāds tilpums (parasti 0,5 ml) standarta diagnostikas (vai testa kultūras) suspensijas, kas satur 1 miljardu baktēriju 1 ml. Aglutinācijas reakcijas rezultātus reģistrē vispirms pēc 2 stundu ilgas stobriņu inkubācijas 37 °C temperatūrā un visbeidzot pēc 20–24 stundām saskaņā ar diviem kritērijiem: nogulšņu klātbūtni un lielumu un supernatanta šķidruma caurspīdīguma pakāpi. Vērtēšana tiek veikta pēc četru krustu sistēmas. Reakciju obligāti papildina seruma un antigēna kontrole. Gadījumos, kad patogēna seroloģiskai identificēšanai tiek veikta detalizēta aglutinācijas reakcija mēģenē, tai ir diagnostiskā vērtība, ja reakcija novērtēta kā pozitīva, ja diagnostiskais serums ir atšķaidīts vismaz līdz pusei no tā titra.
Jāņem vērā, ka, sajaucot homologu antigēnu un antivielu šķīdumus, ne vienmēr tiek novērotas redzamas aglutinācijas reakcijas izpausmes. Nogulsnes veidojas tikai pie noteiktām optimālām abu reakcijas komponentu attiecībām. Ārpus šīm robežām, ja ir ievērojams antigēna vai antivielu pārpalikums, reakcija netiek novērota. Šo parādību sauc par "prozona fenomenu". To novēro gan aglutinācijas reakcijā, gan nokrišņu reakcijā. Prozona parādīšanās imūnreakcijās ir izskaidrojama ar to, ka tajās iesaistītie antigēni, kā likums, ir polideterminanti, un molekulas IgG antivielas ir divi aktīvi centri. Ar antivielu pārpalikumu katras antigēna daļiņas virsma tiek pārklāta ar antivielu molekulām, lai nepaliktu brīvas determinantu grupas, līdz ar to otrs, nesaistītais antivielu aktīvais centrs nevar mijiedarboties ar citu antigēna daļiņu un saistīt tās viena ar otru. Redzama aglutināta vai nogulšņu veidošanās tiek nomākta arī tad, ja ir antigēna pārpalikums, kad nepaliek neviena brīva aktīvā antivielu centra, un līdz ar to antigēna + antivielas + antigēna kompleksi vairs nevar palielināties.
Iespējas paātrinātām aglutinācijas reakcijām. Pasīvā hemaglutinācijas reakcija un tās varianti
Klasiskā aglutinācijas reakcija ietver korpuskulāro antigēnu izmantošanu. Tomēr var būt iesaistīti arī šķīstošie antigēni. Lai tas būtu iespējams, šādi antigēni tiek adsorbēti uz imunoloģiski inertām daļiņām. Par nesēju var izmantot lateksa vai bentonīta daļiņas, bet šobrīd visbiežāk tiek izmantoti dzīvnieku vai cilvēka eritrocīti, uzlabojot to adsorbcijas īpašības, apstrādājot tos ar tanīna, formalīna vai benzidīna šķīdumiem. Sarkanās asins šūnas, kas uz sevi ir adsorbējušas antigēnu, tiek sauktas par sensibilizētām ar šo antigēnu, un imūnreakciju, kurā tās piedalās, sauc par netiešo vai pasīvo hemaglutinācijas reakciju (IRHA jeb RPHA), jo sarkanās asins šūnas tajā piedalās pasīvi.
RPGA tiek ievietota īpašās polistirola plāksnēs ar caurumiem ar puslodes formu. Lietojot to seroloģiskajai diagnostikai, šajās iedobēs fizioloģiskā šķīdumā sagatavo divkāršus testa seruma atšķaidījumus un pēc tam kā diagnostikas līdzekli pievieno sensibilizēto eritrocītu suspensiju. Rezultātus reģistrē pēc 2 stundu inkubācijas 37 °C temperatūrā, izmantojot četru krustu sistēmu. Ar pozitīvu reakciju aglutinētie sarkanie asinsķermenīši nosēžas cauruma apakšā un vienmērīgi pārklāj to apgriezta lietussarga veidā. Ja reakcija ir negatīva, sarkanās asins šūnas arī nosēžas, šķidrums kļūst dzidrs, un nogulsnes izskatās kā mazs “disks” akas centrā. Seruma titrs RPHA tiek uzskatīts par tā pēdējo atšķaidījumu, kas joprojām rada izteiktu hemaglutināciju bez nozīmīgas pazīmes"diska" klātbūtne.
RPGA var izmantot arī kā paātrinātu bakterioloģiskās diagnostikas metodi, lai tieši testa materiālā atklātu nezināmas baktērijas, vīrusus, toksīnus, piemēram, mēra patogēnus, stafilokoku enterotoksīnus utt. Izmantojot šo RPGA versiju, eritrocīti, kas ir adsorbēti, ir pazīstami ar savu specifiskumu izmanto kā zināmu reakcijas komponentu antivielas - antivielu eritrocītu diagnosticum. Ja testa materiāls satur pietiekamu daudzumu zināma antigēna, RPGA būs pozitīva.
RPHA izmantošanas iespējas ir: antigēna neitralizācijas reakcija (RNAg), antivielu neitralizācijas reakcija (RNAb), pasīvā hemaglutinācijas inhibīcijas reakcija (PHA). Šīm reakcijām tiek izmantota antigēnu un antivielu eritrocītu diagnostika. Vienlaikus var izmantot divas savstarpēji kontrolējošas vienvirziena reakcijas, piemēram, RPHA ar antigēna diagnostiku un RNSg ar antivielu eritrocītu diagnostiku.
Antivielu neitralizācijas reakcija (RNSb) sastāv no suspensijas, kas satur vēlamo antigēnu, sajaukšanas ar specifisku imūnserumu, kas atbilstos tilpumos satur zināmas antivielas, un divas stundas inkubējot 37 °C temperatūrā. Pēc tam pievieno antigēnu eritrocītu diagnostikas līdzekli. Maisījumu sakrata un atstāj istabas temperatūrā. Rezultāti tiek ņemti vērā pēc 3-4 stundām un visbeidzot pēc 18-24 stundām.Ja testa materiāls satur antigēnu, tas saistīs antivielas (neitralizēs tās), un tāpēc hemaglutinācija nenotiks.
Antigēna neitralizācijas reakcija (RNSg) tiek veikta, izmantojot to pašu principu. Tikai šajā gadījumā testa materiālā tiek noteiktas antivielas. Šādam testa materiālam pievienots specifisks antigēns saistīsies ar tajā esošajām antivielām, t.i., notiks antigēna neitralizācija ar antivielām, un līdz ar to, pievienojot eritrocītu diagnostisko antivielu, nenotiks hemaglutinācija.
Koaglutinācijas reakcija. Tā ir viena no iespējām pasīvai, t.i., paātrinātai aglutinācijas reakcijai uz stikla, ko mediē antivielas nesošās šūnas. Šīs reakcijas pamatā ir unikāls īpašums Staphylococcus aureus, kura šūnu sieniņā satur proteīnu A, saistās ar IgG un IgM Fc fragmentiem. Šajā gadījumā antivielu aktīvie centri paliek brīvi un var mijiedarboties ar specifiskiem antigēnu determinantiem. Uz stikla priekšmetstikliņa uzklāj pilienu 2% stafilokoku suspensijas, kas sensibilizēta ar atbilstošām antivielām, un pievieno pilienu pētāmo baktēriju suspensijas. Ja antigēns sakrīt ar antivielām, 30-60 s laikā notiek skaidra ar antivielām piesātināto stafilokoku aglutinācija.
Lateksa aglutinācijas reakcija (LAR). Antivielu nesējs šajā diagnostikas sistēmā ir mazas standarta lateksa daļiņas. Reakciju veic, izmantojot mikrometodi stikla iedobēs. Galvenais nosacījums veiksmīgai PAH inscenēšanai ir stingra sistēmas komponentu kvantitatīvo attiecību ievērošana: 50 μl testa materiāla pievieno 10 μl lateksa preparāta, kas sensibilizēts ar antivielām. PAO specifiku kontrolē, izmantojot trīs kontroles testus, kas ietverti komerciālās testēšanas sistēmās: zināms pozitīva reakcija, acīmredzot negatīva reakcija un lateksa suspensijas kvalitātes kontrole, izmantojot ar PAH nesensibilizētus (nesatur antivielas) lateksus ar testa materiālu. Mūsu valstī kā specifisku antivielu nesēji tiek izmantoti polistirola monodispersie lateksi ar dažādu daļiņu diametru (0,3; 0,66; 0,75; 0,8 μm). VVG izmanto ātrai mikroorganismu vai to antigēnu noteikšanai testa materiālā.
Antigēnu imūnmagnētiskā noteikšana. Viena no paātrinātas aglutinācijas reakcijas iespējām uz stikla ir saistīta ar supermagnētisku polimēru daļiņu izmantošanu, kas pārklātas ar specifiskām antivielām. Viena no šādām daļiņām saista līdz 107-108 mikroorganismu šūnām, kuru dēļ jutīgums šī metode sasniedz 5 KVV/ml. Mikroorganismu imūnmagnētisko noteikšanu var izmantot kombinācijā ar CPR.
Kopējā hemaglutinācijas reakcija (AHA). Ļauj ātri noteikt pacientu asinīs gan brīvi cirkulējošos antigēnus (antigēnēmiju), gan ar antivielām saistītos antigēnus – cirkulējošos imūnkompleksus (CIC). RAHA gadījumā izmanto sarkanās asins šūnas, kas sensibilizētas ar atbilstošām antivielām. Pacienta asins seruma, kas satur antigēnus, pievienošana sensibilizētiem eritrocītiem, uz kuriem ir fiksētas antivielas, noved pie eritrocītu un imūnkompleksu līmēšanas (aglutinācijas).
Antiglobulīna Kumbsa tests (R. Kumbsa reakcija). Pilnas (divalentās) antivielas tiek noteiktas, izmantojot tiešas un pasīvas aglutinācijas reakcijas. Nepilnīgas (monovalentas, bloķējošas) antivielas ar šīm metodēm netiek atklātas, jo, apvienojoties ar antigēnu, tās to bloķē, bet nevar izraisīt antigēna agregāciju lielos konglomerātos. Nepilnīgas (bloķējošas) antivielas ir tās, kurās darbojas tikai viens aktīvais centrs; otrais aktīvais centrs nezināma iemesla dēļ nedarbojas. Lai noteiktu nepilnīgas antivielas, tiek izmantota īpaša Kumbsa reakcija (72. att.). Reakcijā ietilpst: pacienta serums, kurā nepilnīgas antivielas, corpuscular antigen-diagnosticum, antiglobulīna serums, kas satur antivielas pret cilvēka globulīnu. Reakcija notiek divos posmos:
Antigēna mijiedarbība ar nepilnīgām antivielām. Nav redzamu izpausmju. Pirmais posms tiek pabeigts, mazgājot antigēnu no pacienta atlikušā seruma.
Antiglobulīna seruma mijiedarbība, kas iegūta dzīvnieka imunizācijas rezultātā ar cilvēka globulīnu ar nepilnīgām antivielām, kas adsorbētas uz antigēna. Sakarā ar to, ka antiglobulīna antivielas ir divvērtīgas, tās saista divas monovalentas antivielas no atsevišķiem antigēna + nepilnīgas antivielas kompleksiem, kas noved pie to līmēšanas un redzamu nogulšņu parādīšanās.
13.1. Antigēna-antivielu reakcijas un to pielietojums
Kad tiek ievadīts antigēns, organismā veidojas antivielas. Antivielas papildina antigēnu, kas izraisīja to sintēzi, un spēj ar to saistīties. Antigēnu saistīšanās ar antivielām sastāv no divām fāzēm. Pirmā fāze ir specifiska, kurā notiek ātra antigēna determinanta saistīšanās ar antivielu Fab fragmenta aktīvo centru. Jāatzīmē, ka saistīšanās notiek van der Vāla spēku, ūdeņraža un hidrofobās mijiedarbības dēļ. Saites stiprumu nosaka telpiskās atbilstības pakāpe starp antivielas aktīvo vietu un antigēna epitopu. Pēc konkrētās fāzes sākas lēnāka fāze - nespecifiska, kas izpaužas ar redzamu fizikālu parādību (piemēram, pārslu veidošanās aglutinācijas laikā u.c.).
Imūnās reakcijas ir mijiedarbība starp antivielām un antigēniem, un šīs reakcijas ir specifiskas un ļoti jutīgas. Tie tiek plaši izmantoti medicīnas prakse. Ar imūnreakciju palīdzību var atrisināt šādas problēmas:
Nezināmu antivielu noteikšana ar zināmiem antigēniem (antigenic diagnosticum). Šis uzdevums rodas, ja pacienta asins serumā nepieciešams noteikt antivielas pret patogēnu (serodiagnostika). Antivielu atrašana ļauj apstiprināt diagnozi;
Nezināmu antigēnu noteikšana, izmantojot zināmas antivielas (diagnostikas serumu). Šis pētījums tiek veikts, identificējot no pacienta materiāla izolētu patogēnu kultūru (serotipēšana), kā arī atklājot
mikrobu antigēni un to toksīni asinīs un citos bioloģiskajos šķidrumos. Ir daudz veidu imūnreakciju, kas atšķiras pēc inscenēšanas tehnikas un reģistrētā efekta. Tās ir aglutinācijas reakcijas (RA), izgulsnēšanās reakcijas (RP), reakcijas ar komplementu (RSC), reakcijas, kurās tiek izmantoti marķēti komponenti (RIF, ELISA, RIA).
13.2. Aglutinācijas reakcija
Aglutinācijas reakcija (RA) ir imūnreakcija no antigēna mijiedarbības ar antivielām elektrolītu klātbūtnē, un antigēns atrodas korpuskulārā stāvoklī (eritrocīti, baktērijas, lateksa daļiņas ar adsorbētiem antigēniem). Aglutinācijas laikā korpuskulārie antigēni tiek salīmēti kopā ar antivielām, kas izpaužas, veidojoties flokulentām nogulsnēm. Pārslu veidošanās notiek tāpēc, ka antivielām ir divi aktīvi centri, un antigēni ir polivalenti, t.i. ir vairāki antigēnu determinanti. RA izmanto, lai identificētu no pacienta materiāla izolētu patogēnu, kā arī noteiktu antivielas pret patogēnu pacienta asins serumā (piemēram, Raita un Hedlsona reakcijas brucelozei, Vidala reakcija pret vēdertīfu un paratīfu).
Vienkāršākais veids, kā diagnosticēt RA, ir reakcija uz stikla; tas ir aptuvens RA, ko izmanto, lai noteiktu no pacienta izolētu patogēnu. Kad reakcija ir konstatēta, uz stikla priekšmetstikliņa tiek uzklāts diagnostiskais aglutinējošais serums (atšķaidījumā 1:10 vai 1:20), pēc tam pievieno pacienta kultūru. Reakcija ir pozitīva, ja pilē parādās flokulējošas nogulsnes. Tuvumā tiek novietota kontrole: seruma vietā tiek uzklāts piliens nātrija hlorīda šķīduma. Ja diagnostiskais aglutinējošais serums nav adsorbēts 1, tad tas tiek atšķaidīts (līdz titram - atšķaidījumam, līdz kuram jānotiek aglutinācijai), t.i. ielieciet paplašināto RA mēģenēs, palielinoties
1 Neadsorbēts aglutinējošais serums var aglutinēt radniecīgas baktērijas, kurām ir kopīgi (savstarpēji reaģējoši) antigēni. Tāpēc viņi izmantoadsorbēti aglutinējošie serumi, no kuriem, adsorbējot radniecīgās baktērijās, ir izņemtas krusteniski reaģējošas antivielas. Šādi serumi saglabā antivielas, kas ir specifiskas tikai konkrētai baktērijai.
aglutinējošā seruma atšķaidījumi, kam pievieno 2-3 pilienus no pacienta izolētas patogēna suspensijas. Aglutināciju ņem vērā, ņemot vērā nogulšņu daudzumu un šķidruma attīrīšanas pakāpi mēģenēs. Reakciju uzskata par pozitīvu, ja aglutināciju novēro atšķaidījumā, kas ir tuvu diagnostikas seruma titram. Reakciju pavada kontroles: serumam, kas atšķaidīts ar izotonisko nātrija hlorīda šķīdumu, jābūt caurspīdīgam, mikrobu suspensijai tajā pašā šķīdumā jābūt vienmērīgi duļķainai, bez nogulsnēm.
Lai noteiktu antivielas pret patogēnu pacienta asins serumā, tiek izmantota pilna mēroga RA. Uzstādot to, pacienta asins serums tiek atšķaidīts mēģenēs un mēģenēs tiek pievienots vienāds daudzums diagnostiskās suspensijas (nogalināto mikrobu suspensijas). Pēc inkubācijas nosaka augstāko seruma atšķaidījumu, pie kura notikusi aglutinācija, t.i. ir izveidojušās nogulsnes (seruma titrs). Šajā gadījumā aglutinācijas reakcija ar O-diagnosticum (baktērijas iznīcina karstums, saglabājot termostabilo O-antigēnu) notiek smalkgraudainas aglutinācijas veidā. Aglutinācijas reakcija ar H-diagnosticum (baktērijas, ko iznīcina formaldehīds, saglabājot termolabilu flagellar H-antigēnu) ir rupja un norit ātrāk.
Netiešā (pasīvā) hemaglutinācijas reakcija(RNGA vai RPGA) ir RA veids. Šī metode ir ļoti jutīga. Ar RNGA palīdzību var atrisināt divas problēmas: noteikt antivielas pacienta asins serumā, kam pievienota antigēna eritrocītu diagnostika, kas ir eritrocīti, uz kuriem adsorbējas zināmie antigēni; nosaka antigēnu klātbūtni testa materiālā. Šajā gadījumā reakciju dažreiz sauc par reverso netiešo hemaglutinācijas reakciju (RONHA). Procedūras laikā pētāmajam materiālam pievieno antivielu eritrocītu diagnostiku (eritrocītus, kuru virsmā ir adsorbētas antivielas). Šajā reakcijā sarkanās asins šūnas darbojas kā nesēji un ir pasīvi iesaistītas imūnagregātu veidošanā. Ar pozitīvu reakciju pasīvi pielīmētie sarkanie asinsķermenīši pārklāj cauruma dibenu vienmērīgā slānī ar izgrieztām malām (“lietussargs”); ja nav aglutinācijas, sarkanās asins šūnas uzkrājas cauruma centrālajā padziļinājumā, veidojot kompaktu “pogu” ar asi izteiktām malām.
Koaglutinācijas reakcija izmanto patogēnu šūnu (antigēnu) noteikšanai, izmantojot adsorbētas antivielas Staphylococcus aureus, kas satur proteīnu A. Proteīnam A ir afinitāte pret imūnglobulīnu Fc fragmentu. Pateicoties tam, antivielas saistās ar stafilokoku netieši caur Fc fragmentu, un Fab fragmenti ir vērsti uz āru un spēj mijiedarboties ar attiecīgajiem mikrobiem, kas izolēti no pacientiem. Šajā gadījumā veidojas pārslas.
Hemaglutinācijas inhibīcijas reakcija (HAI) izmanto vīrusu infekciju diagnostikā un tikai hemaglutinējošu vīrusu izraisītas infekcijas. Šo vīrusu virsmā ir proteīns – hemaglutinīns, kas ir atbildīgs par hemaglutinācijas reakciju (HRA), kad vīrusiem pievieno sarkanās asins šūnas. RTGA ietver vīrusu antigēnu bloķēšanu ar antivielām, kā rezultātā vīrusi zaudē spēju aglutinēt sarkanās asins šūnas.
Kumbsa reakcija - RA nepilnīgu antivielu noteikšanai. Dažās infekcijas slimībās, piemēram, brucelozes gadījumā, pacienta asins serumā cirkulē nepilnīgas antivielas pret patogēnu. Nepilnīgas antivielas sauc par bloķējošām antivielām, jo tām ir viena antigēna saistīšanās vieta, nevis divas, piemēram, pilnīgas antivielas. Tāpēc, pievienojot antigēnu diagnostiku, nepilnīgas antivielas saistās ar antigēniem, bet nesalīmē tās kopā. Reakcijas izpausmei tiek pievienots antiglobulīna serums (antivielas pret cilvēka imūnglobulīniem), kas novedīs pie imūnkompleksu (antigēna diagnostika + nepilnīgas antivielas), kas veidojas reakcijas pirmajā posmā, aglutinācijas.
Netiešo Kumbsa reakciju lieto pacientiem ar intravaskulāra hemolīze. Dažiem no šiem pacientiem tiek konstatētas nepilnīgas monovalentas anti-rēzus antivielas. Tie īpaši mijiedarbojas ar Rh pozitīviem eritrocītiem, bet neizraisa to aglutināciju. Tāpēc anti-Rh antivielu + Rh-pozitīvo eritrocītu sistēmai tiek pievienots antiglobulīna serums, kas izraisa eritrocītu aglutināciju. Kumbsa testu izmanto, lai diagnosticētu patoloģiski apstākļi, kas saistīta ar imūnās izcelsmes eritrocītu intravaskulāru lizu, piemēram, jaundzimušo hemolītisko slimību, ko izraisa Rh konflikts.
RA asins grupu noteikšanai pamatā ir eritrocītu aglutinācija ar imūnseruma antivielām pret asins grupas antigēniem A(II), B(III). Kontrole ir serums, kas nesatur antivielas, t.i. seruma AB(IV) asinsgrupa un A(P) un B(III) grupas eritrocītu antigēni. 0(I) grupas sarkanās asins šūnas tiek izmantotas kā negatīva kontrole, jo tām nav antigēnu.
Lai noteiktu Rh faktoru, tiek izmantoti anti-Rh serumi (vismaz divas dažādas sērijas). Ja uz pētāmo eritrocītu membrānas ir Rh antigēns, notiek šo šūnu aglutinācija.
13.3. Nokrišņu reakcija
RP ir imūnreakcija antivielu mijiedarbībai ar antigēniem elektrolītu klātbūtnē, un antigēns ir šķīstošā stāvoklī. Nokrišņu laikā šķīstošie antigēni tiek izgulsnēti ar antivielām, kas izpaužas kā duļķainība nokrišņu joslu veidā. Redzamu nogulšņu veidošanos novēro, ja abus reaģentus sajauc līdzvērtīgās attiecībās. Viena no tām pārpalikums samazina izgulsnēto imūnkompleksu skaitu. Ir dažādi veidi, kā veikt nokrišņu reakciju.
Gredzena nokrišņu reakcija ievieto neliela diametra nokrišņu caurulēs. Mēģenē pievieno imūnserumu un rūpīgi slāņo šķīstošo antigēnu. Ja rezultāts ir pozitīvs, abu risinājumu saskarnē veidojas pienains gredzens. Gredzenveida izgulsnēšanās reakciju, ko izmanto, lai noteiktu antigēnu klātbūtni orgānos un audos, kuru ekstraktus vāra un filtrē, sauc par termoprecipitācijas reakciju (Ascoli reakcija termostabila Sibīrijas mēra antigēna noteikšanai).
Ouchterlony dubultā imūndifūzijas reakcija.Šo reakciju veic agara gēlā. Vienāda biezuma gēla slānī noteiktā attālumā viena no otras tiek izgrieztas iedobes un attiecīgi piepildītas ar antigēnu un imūnserumu. Pēc tam antigēni un antivielas izkliedējas gēlā, satiekas viens ar otru un veido imūnkompleksus, kas nogulsnējas gēlā un kļūst redzami kā precīzas līnijas.
uzturs. Šo reakciju var izmantot, lai identificētu nezināmus antigēnus vai antivielas, kā arī pārbaudītu dažādu antigēnu līdzību: ja antigēni ir identiski, nokrišņu līnijas saplūst, ja antigēni nav identiski, nokrišņu līnijas krustojas, ja antigēni ir daļēji. identisks, veidojas spurs.
Radiāla imūndifūzijas reakcija. Izkausētajā agara želeja Pievieno antivielas un gēlu vienmērīgā kārtā uzklāj uz stikla. Želejā izgriež iedobes un tām pievieno standarta tilpumu dažādu koncentrāciju antigēnu šķīdumu. Inkubācijas laikā antigēni izkliedējas radiāli no akas un, satiekoties ar antivielām, veido nokrišņu gredzenu. Kamēr akā paliek antigēna pārpalikums, pakāpeniski palielinās nokrišņu gredzena diametrs. Šo metodi izmanto, lai noteiktu antigēnus vai antivielas testa šķīdumā (piemēram, lai noteiktu dažādu klašu imūnglobulīnu koncentrāciju asins serumā).
Imūnelektroforēze. Antigēnu maisījumu vispirms elektroforētiski atdala, pēc tam rievai, kas iet pa proteīna kustības virzienu, pievieno nogulsnējošu antiserumu. Antigēni un antivielas izkliedējas želejā viens pret otru; mijiedarbojoties, tie veido lokveida nokrišņu līnijas.
Flokulācijas reakcija(pēc Ramona) - nokrišņu reakcijas veids, ko izmanto, lai noteiktu antitoksiskā seruma vai toksoīda aktivitāti. Reakciju veic mēģenēs. Mēģenē, kurā toksoīds un antitoksīns ir līdzvērtīgā attiecībā, tiek novērota duļķainība.
13.4. Komplementa fiksācijas reakcija
Antivielas, mijiedarbojoties ar atbilstošo antigēnu, saista pievienoto komplementu (1. sistēma). Komplementa fiksācijas indikators ir eritrocīti, kas sensibilizēti ar hemolītisko serumu, t.i. antivielas pret sarkanajām asins šūnām (2. sistēma). Ja komplements nav fiksēts 1. sistēmā, t.i. Ja antigēna-antivielu reakcija nenotiek, sensibilizētās sarkanās asins šūnas tiek pilnībā lizētas (negatīva reakcija). Kad komplementu fiksē 1. sistēmas imūnkomplekss pēc sensibilizētu eritrocītu pievienošanas, hemolīze no plkst.
nav (pozitīva reakcija). Komplementa saistīšanās reakciju izmanto, lai diagnosticētu infekcijas slimības (gonoreju, sifilisu, gripu utt.).
13.5. Neitralizācijas reakcija
Mikrobiem un to toksīniem ir kaitīga ietekme uz cilvēka ķermeņa orgāniem un audiem. Antivielas spēj saistīties ar šiem kaitīgajiem aģentiem un tos bloķēt, t.i. neitralizēt. Pamatojoties uz šo antivielu pazīmi diagnostikas reakcija neitralizācija. To veic, ievadot antigēnu-antivielu maisījumu dzīvniekiem vai jutīgos testa objektos (šūnu kultūrā, embrijos). Piemēram, lai noteiktu toksīnus pacienta materiālā, 1. grupas dzīvniekiem injicē materiālu no pacienta. 2. grupas dzīvnieki tiek injicēti ar līdzīgu materiālu, iepriekš apstrādāti ar atbilstošu antiserumu. 1. grupas dzīvnieki mirst, ja materiālā ir toksīns. Otrā dzīvnieku grupa izdzīvo, toksīna kaitīgā iedarbība neizpaužas, jo tiek neitralizēta.
13.6. Reakcijas, izmantojot marķētas antivielas vai antigēnus
13.6.1. Imunofluorescences reakcija (RIF, Kūnsa metode)
Šo metodi izmanto ekspresdiagnostikai. To var izmantot, lai noteiktu gan mikrobu antigēnus, gan antivielas.
Tiešā RIF metode- imūnreakcija no antivielu mijiedarbības ar antigēniem, un antivielas tiek marķētas ar fluorohromu - vielu, kas spēj izstarot noteikta viļņa garuma gaismas kvantus, pakļaujoties noteikta viļņa garuma gaismai. Šīs metodes īpatnība ir nepieciešamība noņemt nereaģējušos komponentus, lai izslēgtu nespecifiskas luminiscences noteikšanu. Lai to izdarītu, nomazgājiet nereaģējušās antivielas. Rezultātus novērtē, izmantojot fluorescences mikroskopu. Ar šādu luminiscējošu serumu apstrādātā uztriepē baktērijas mirdz uz tumša fona gar šūnas perifēriju.
Netiešā RIF metode tiek izmantots biežāk nekā iepriekšējais. Šī reakcija tiek veikta divos posmos. Pirmajā posmā antigēni savstarpēji
mijiedarbojas ar attiecīgajām antivielām, veidojot imūnkompleksus. Visas sastāvdaļas, kas nav reaģējušas (t.i., neietilpst imūnkompleksos), ir jānoņem, mazgājot. Otrajā posmā iegūtais antigēna-antivielu komplekss tiek noteikts, izmantojot fluorohromētu antiglobulīna serumu. Rezultātā veidojas mikrobu + pretmikrobu trušu antivielu + antivielu pret trušu imūnglobulīniem komplekss, kas marķēts ar fluorohromu. Rezultātus novērtē, izmantojot fluorescences mikroskopu.
13.6.2. Enzīmu imūnsorbcijas metode vai tests
ELISA - visizplatītākā moderna metode, ko izmanto vīrusu, baktēriju, vienšūņu infekciju diagnosticēšanai, jo īpaši HIV infekcijas diagnosticēšanai, vīrusu hepatīts un utt.
Ir daudz ELISA modifikāciju. Plaši tiek izmantots cietās fāzes nekonkurējošs ELISA tests. To veic 96 bedrīšu polistirola plāksnēs (cietā fāze). Veicot reakciju, katrā posmā ir jānomazgā nereaģējušas sastāvdaļas. Nosakot antivielas, iedobēm, uz kurām tiek sorbēti antigēni, pievieno testa asins serumu, pēc tam antiglobulīna serumu marķē ar fermentu. Reakciju veic, pievienojot substrātu fermentam. Fermenta klātbūtnē substrāts mainās, un enzīma-substrāta komplekss tiek izvēlēts tā, lai reakcijā izveidotais produkts būtu krāsots. Tādējādi ar pozitīvu reakciju tiek novērota šķīduma krāsas maiņa. Lai noteiktu antigēnus, cietās fāzes nesēju sensibilizē ar antivielām, pēc tam secīgi pievieno testējamo materiālu (antigēnus) un enzīmu iezīmēto serumu antigēniem. Lai reakcija notiktu, tiek pievienots enzīma substrāts. Ar pozitīvu reakciju notiek šķīduma krāsas izmaiņas.
13.6.3. Imunoblotēšana
Šīs metodes pamatā ir elektroforēzes un ELISA kombinācija. Veicot imūnblotēšanu (blotēšana no angļu valodas. traips- plankums) komplekss antigēnu maisījums vispirms tiek pakļauts elektroforēzei poliakrilamīda gēlā. Iegūtais frakcionētais anti-
gēnu peptīdi tiek pārnesti uz nitrocelulozes membrānu. Pēc tam blotus apstrādā ar enzīmu iezīmētām antivielām pret konkrētu antigēnu, t.i. veikt ELISA blotēšanu. Imunoblotēšanu izmanto tādu infekciju kā HIV diagnostikā.
13.6.4. Imūnā elektronu mikroskopija
Metode ietver vīrusu (retāk citu mikrobu) mikroskopēšanu elektronu mikroskopā, kas iepriekš apstrādāts ar atbilstošu imūnserumu, kas marķēts ar elektronu optiski blīviem preparātiem, piemēram, feritīnu, dzelzi saturošu proteīnu.
13.7. Plūsmas citometrija
Asins šūnas tiek diferencētas, pamatojoties uz lāzera citofluorometriju. Lai to izdarītu, vajadzīgās šūnas tiek iekrāsotas ar fluorescējošām monoklonālām antivielām pret CD antigēniem. Asins paraugs pēc apstrādes ar iezīmētām antivielām tiek izvadīts caur plānu cauruli un caur to tiek izvadīts lāzera stars, kas ierosina fluorohromu mirdzēt. Fluorescences intensitāte korelē ar antigēnu blīvumu uz šūnas virsmas, un to var kvantitatīvi izmērīt, izmantojot fotopavairotāja cauruli. Iegūtie rezultāti tiek pārvērsti histogrammā.
Lai noteiktu, tiek izmantota plūsmas citometrija imūnsistēmas stāvoklis(limfocītu galveno populāciju saturs, intracelulāro un ārpusšūnu citokīnu saturs, NK šūnu funkcionālā aktivitāte, fagocitozes aktivitāte utt.).
Detalizēta aglutinācijas reakcija (RA). Lai noteiktu AT pacienta asins serumā, a plaša aglutinācijas reakcija (RA). Lai to izdarītu, asins seruma atšķaidījumu sērijai pievieno diagnostiku - nogalinātu mikroorganismu vai daļiņu suspensiju ar sorbētu Ag. Maksimālais atšķaidījums aglutinācija Ag sauc par seruma titru.
Aglutinācijas reakciju veidi (RA) lai noteiktu AT - asins pilienu testu tularēmijai (ar diagnostiku, kas uzklāta uz asins piliena un redzamu bālganu aglutinātu parādīšanos) un Hadlsona testu brucelozei (ar genciānas vijolītes krāsotu diagnostiku, kas uzklāta asins pilienam serums).
Aptuvenā aglutinācijas reakcija (RA)
Lai identificētu izolētos mikroorganismus, uz stikla priekšmetstikliņiem uzliek aptuvenu RA. Lai to izdarītu, standarta diagnostikas antiseruma (atšķaidīts 1:10, 1:20) pilienam pievieno patogēna kultūru. Ja rezultāts ir pozitīvs, tiek veikta detalizēta reakcija, palielinot antiseruma atšķaidījumus.
Reakcija uzskata par pozitīvu, ja aglutināciju novēro atšķaidījumos, kas ir tuvu diagnostiskā seruma titram.
OAS. Somatiskie O-Ags ir karstumizturīgi un var izturēt vārīšanu 2 stundas.Mijiedarbojoties ar AT, tie veido smalkgraudainus agregātus.
N-Ag. N-Ag (zibens) ir termolabīli un ātri sadalās 100 °C, kā arī etanola ietekmē. Reakcijās ar H-antiserumu pēc 2 stundu inkubācijas veidojas irdenas lielas pārslas (veidojas baktērijām, kas salīp kopā ar flagellas).
Vi-Ar vēdertīfa baktērijas ir relatīvi karstumizturīgas (iztur 60-62 °C temperatūru 2 stundas); Inkubējot ar Vi antiserumu, veidojas smalkgraudains aglutināts.
Tiešas hemaglutinācijas reakcijas
Vienkāršākais no tiem reakcijas - aglutinācija sarkanās asins šūnas jeb hemaglutinācija, ko izmanto asins grupu noteikšanai ABO sistēmā. Lai noteiktu aglutinācija(vai tā trūkums) izmantojiet standarta antiserumus ar anti-A un anti-B aglutinīniem. Reakciju sauc par tiešu, jo pētāmās Ags ir sarkano asins šūnu dabiskas sastāvdaļas.
Kopīgs ar tieša hemaglutinācija vīrusu hemaglutinācijai ir mehānismi. Daudzi vīrusi spēj spontāni aglutinēt putnu un zīdītāju eritrocītus; to pievienošana eritrocītu suspensijai izraisa no tiem agregātu veidošanos.
