Mērķis: Apgūt aglutinācijas reakciju un nokrišņu reakciju veikšanas tehniku infekcijas slimību diagnosticēšanai.
1. modulis. Mikroorganismu morfoloģija un fizioloģija. Infekcija. Imunitāte.
16. tēma: Aglutinācijas reakcija. Nokrišņu reakcija.
Tēmas atbilstība. Zem imunitāte nozīmē ķermeņa imunitāti pret infekcijas un neinfekcijas izraisītājiem ( patogēni mikroorganismi, svešas olbaltumvielas un citas vielas). Šos līdzekļus sauc par antigēniem. Imunitāte var būt iedzimta vai iegūta. Iedzimta– veidojoties audu un humora aizsargierīcēm, izraisot imunitāti pret mantojuma ceļā pārnēsātām infekcijas slimībām.
Iegādāts– ko veic organisma imūnsistēma antivielu ražošanas vai sensibilizētu limfocītu uzkrāšanās veidā. Tas ir sadalīts dabīgs un mākslīgs. Saskaņā ar darbības mehānismu tas ir sadalīts aktīvs un pasīvs. Visās imunoloģiskās reakcijās galvenā sastāvdaļa ir antigēns.
Galvenā funkcija imūnsistēma, kas sastāv no limfoīdiem audiem, ir atpazīt svešķermeņus (antigēnus) un neitralizēt tos.
Antigēni var iekļūt organismā caur Elpceļi, gremošanas trakts, caur ādu un gļotādām. Katrs antigēns stimulē īpašu proteīna vielu – antivielu veidošanos.
Antigēni tiek iedalīti pilnīgajos un zemākajos (haptēnos). Pilnīgi antigēni izraisīt pilnīgu imūnreakciju. Bojāti antigēni Tie paši par sevi neizraisa imūnreakciju, bet dažreiz iegūst šo spēju, konjugējot ar augstas molekulmasas proteīnu nesējiem. Turklāt ir antigēni: hemihaptēni, proantigēni, heteroantigēni un izoantigēni.
Antivielas ir imūnglobulīni no cilvēka vai dzīvnieka asins seruma. Antivielas veidojas pēc infekcijas un imunizācijas rezultātā ar novājinātām vai nogalinātām baktērijām, riketsiju, vīrusiem, toksīniem un citiem līdzekļiem. Antivielas- imūnglobulīna proteīni ķīmiskais sastāvs pieder pie glikoproteīniem. Pamatojoties uz to struktūru un imūnbioloģiskajām īpašībām, imūnglobulīnus iedala 5 klases: IgM, IgG, IgA, IgE, IgD.
Normālas antivielas sastopams cilvēkiem un dzīvniekiem, kuri nav imunizēti. Specifiskas antivielas veidojas infekcijas vai imunizācijas rezultātā.
Reakciju starp antivielu un antigēnu sauc seroloģiskās. Seroloģiskie testi ir ļoti specifiski un tiek izmantoti daudzu infekcijas slimību diagnostikā. Izšķir aglutinācijas un nokrišņu reakcijas.
1. Aglutinācijas reakcija (RA) balstās uz antigēna (aglutinogēna) un antivielas (aglutinīna) mijiedarbību, kurā mikrobu ķermeņi salīp kopā un izgulsnējas elektrolīta klātbūtnē. Ir dažādas aglutinācijas reakcijas modifikācijas.
Augstākā vērtība ir:
- Makroskopiskā (paplašinātā) aglutinācija mēģenēs. Pacienta serumam pievieno mikrobu suspensiju (diagnosticum) un pēc 1 stundas termostatā 37 grādu temperatūrā tiek atzīmēts seruma atšķaidījums (titrs), kurā notika reakcija. Aglutinācijas reakcija tiek uzskatīta par pozitīvu, ja mēģenes apakšā veidojas nogulsnes ar izteiktu supernatanta šķidruma notīrīšanu. Šīs nogulsnes sauc par aglutinātu.
Pamatojoties uz aglutināta raksturu, izšķir smalkgraudainu (O) un rupji graudainu (H) aglutināciju. Aglutinoskopu izmanto, lai identificētu smalkgraudainu aglutinātu. Rezultātu reģistrēšana sākas ar kontroles mēģenēm. Pēdējais seruma atšķaidījums, kurā tiek novērota aglutinācija, tiek uzskatīts par tā titru.
Reakcijas mērķis: antivielu noteikšana pacienta serumā.
- Mikroskopisks (paātrināts ) aptuvenā aglutinācija uz stikla. Diagnostiskā imūnseruma pilienam pievieno baktēriju kultūras pilienu un vienmērīgi samaisa. Reakcija notiek istabas temperatūrā 5-10 minūšu laikā. Pēc tam tiek veikta grāmatvedība. Ja reakcija ir pozitīva, seruma pilē tiek konstatēta baktēriju uzkrāšanās graudu vai pārslu veidā. Reakcijas mērķis: patogēna veida noteikšana, izmantojot zināmu diagnostikas serumu.
- Netiešā (pasīvā) hemaglutinācijas reakcija (IRHA).Šīs reakcijas būtība ir tāda, ka aitas sarkanās asins šūnas spēj adsorbēt antigēnus uz to virsmas. Specifisku antivielu ietekmē sarkanās asins šūnas salīp kopā un izgulsnējas, apakšā veidojot hemaglutinātu. Reakcija ir ļoti jutīga un specifiska. RNGA ļauj noteikt minimālu daudzumu antivielu un bojātu polisaharīdu antigēnu. Šo reakciju izmanto daudzu infekcijas slimību diagnostikā (tīfs un vēdertīfs, paratīfs, tuberkuloze utt.).
2. Nokrišņu reakcija (RP ) – antigēna-antivielu kompleksa izgulsnēšanās. Galvenā atšķirība starp RP un RA ir tāda, ka RA gadījumā tiek izmantots korpuskulārais antigēns, savukārt RP antigēns ir proteīna vai polisaharīda rakstura koloidāla viela. Šajā reakcijā antigēnu sauc par precipitinogēnu, un antivielas sauc par precipitīniem. Reakciju veic mēģenēs, uzklājot antigēna šķīdumu uz imūnseruma. Ar optimālu antigēna un antivielu attiecību pie robežas
Šie šķīdumi veido nogulšņu gredzenu. Ja kā antigēnu izmanto vārītus un filtrētus orgānu un audu ekstraktus, reakciju sauc par termoprecipitācijas reakciju (Ascoli reakcija, ko izmanto diagnostikā Sibīrijas mēris, mēris, tularēmija utt.).
Nokrišņu reakcijas agarā ir kļuvušas plaši izplatītas: vienkārša difūzijas metode, dubultdifūzijas metode.
Nokrišņu veids ir flokulācijas reakcija– toksoīda vai antitoksiskā seruma aktivitātes noteikšanai. Turklāt šo reakciju var izmantot, lai noteiktu Corynebacterium diphtheriae celmu toksicitāti.
Konkrēti mērķi:
· Izskaidrot antigēnu kā imūnās atbildes inducētāju lomu;
· Aprakstīt antigēnu, tajā skaitā mikroorganismu antigēnu, struktūru;
· Aprakstiet aglutinācijas reakcijas mehānismu;
· Aprakstiet nokrišņu reakcijas mehānismu.
Būt spējīgam:
· Izskaidrot antigēnu kā imūnās atbildes inducētāju lomu;
· Aprakstīt antivielu struktūru (dažādas imūnglobulīnu klases);
· Analizēt antivielu mijiedarbības mehānismu ar antigēniem;
· Interpretēt aglutinācijas reakcijas rezultātus;
· Interpretēt nokrišņu reakcijas rezultātus;
· Analizēt iegūtos rezultātus.
1. Jēdzienu “antigēni”, “antivielas” definīcija.
2. Antigēnu kā imūnās atbildes inducētāju loma.
3. Antivielu struktūra (dažādas imūnglobulīnu klases).
4. Antivielu mijiedarbības mehānisms ar antigēniem.
5. Imūnās reakcijas, to nozīme imūnreakcijā un infekcijas slimību diagnostikā.
6. Aglutinācijas reakcijas mehānisms.
7. Nokrišņu reakcijas mehānisms.
Praktiskie uzdevumi nodarbībās:
1. Aglutinācijas reakcijas veikšana, lai noteiktu antivielas pacienta serumā.
2. Mikroaglutinācijas reakcijas iestatīšana uz stikla ar diagnostikas serumiem, lai identificētu baktēriju tīrkultūru.
3. Aglutinācijas reakcijas rezultātu novērtējums.
4. Izgulsnēšanās reakcijas iestatīšana baktēriju antigēna noteikšanai.
5. Nokrišņu reakcijas rezultātu novērtējums.
6. Netiešās hemaglutinācijas reakcijas rezultātu novērtējums.
7. Protokola sastādīšana.
Literatūra:
1. Pjatkins K.D., Krivošeins Ju.S. Mikrobioloģija ar virusoloģiju un imunoloģiju – Kijeva: Augstskola, 1992.- 431 lpp.
2. Vorobjovs A.V., Bikovs A.S., Paškovs E.P., Ribakova A.M. Mikrobioloģija.- M.: Medicīna, 1998.- 336 lpp.
3. Medicīniskā mikrobioloģija /Rediģēja V.P. Pokrovskis – M.: GEOTAR-MED, 2001. – 768 lpp.
4. Korotjajevs A.I., Babičevs S.A. Medicīniskā mikrobioloģija, imunoloģija un virusoloģija / Mācību grāmata medicīnas universitātes, Sanktpēterburga: “Īpašā literatūra”, 1998.- 592 lpp.
5. Timakovs V.D., Ļevaševs V.S., Borisovs L.B. Mikrobioloģija / Mācību grāmata - 2. izdevums, pārstrādāts. un papildus – M.: Medicīna, 1983.- 512 lpp.
6. Lekciju konspekti.
1. Titovs M.V. Infekcijas slimības.- K., 1995.– 321 lpp.
2. Šuvalova E.P. Infekcijas slimības.– M.: Medicīna, 1990.- 559 lpp.
Aglutinācijas reakcijas pamatā ir specifiska antivielu (aglutinīnu) mijiedarbība ar veselām mikrobu vai citām šūnām. Šīs mijiedarbības rezultātā veidojas aglomerāta daļiņas, kas izgulsnējas (aglutina). Aglutinācijas reakcijā var piedalīties baktērijas, vienšūņi, sēnītes, raugs, riketsija, eritrocīti un citas šūnas, gan dzīvas, gan nogalinātas. Reakcija notiek divās fāzēs: pirmā ir specifiska antigēna un antivielu kombinācija, otrā ir nespecifiska, t.i., veidojas redzams aglutināts. Aglutināta nogulsnēšanās notiek elektrolītu, piemēram, nātrija hlorīda, klātbūtnē. Aglutinātā esošie mikroorganismi paliek dzīvi, bet zaudē savu mobilitāti.
Aglutinācijas reakciju plaši izmanto infekcijas slimību seroloģiskai diagnostikai un izolētu mikrobu antigēnās struktūras noteikšanai. No pacienta vai nesēja ķermeņa izolēta patogēna antigēnās struktūras noteikšanai tiek izmantots specifisks imūnserums, kas iegūts, imunizējot dzīvniekus (trušus, ēzeļus, aitas) ar noteiktiem mikroorganismiem. Mikroba identifikāciju veic aglutinācijas reakcijā uz stikla ar adsorbētiem vai monoreceptoru serumiem vai mēģenēs ar specifiskiem aglutinējošiem serumiem. Adsorbētie serumi satur antivielas tikai pret konkrētam mikrobam raksturīgiem antigēniem, bet monoreceptoru serumi satur antivielas tikai pret vienu specifisku patogēna antigēnu.
Sugas serumi satur antivielas pret visiem konkrēta mikroba antigēniem.
Vai izolētā mikroorganismu kultūra pieder šī suga nosaka, aglutinējot ar zināmu serumu līdz antivielu titram, kas norādīts uz seruma ampulas etiķetes. Seruma antivielu titrs tiek uzskatīts par tā pēdējo atšķaidījumu, kurā joprojām tiek novērota dzīvnieka imunizācijai izmantoto mikrobu kultūras aglutinācija. Adsorbētie un monoreceptoru serumi parasti tiek izmantoti neatšķaidītā veidā stikla aglutinācijas reakcijā.
Nosakot antivielu klātbūtni pacienta asins serumā, to atšķaida ar izotonisku nātrija hlorīda šķīdumu, sākot ar atšķaidījumu no 1:50 līdz 1:800 vai vairāk. Katram atšķaidījumam pievieno dzīvu vai nogalinātu mikrobu suspensiju. Preparātus, kas satur mikrobus, kurus iznīcina karstums vai formaldehīds, sauc par diagnostikas līdzekļiem. Diagnostikas, kas iegūtas, sildot mikroorganismu kultūras, satur tikai somatiskos antigēnus. Lietojot tikai formaldehīdu, mikrobi saglabā savus flagellas antigēnus.
Ja pacienta asinīs ir antivielas, reakcijā ņemtā diagnostikas viela salīp kopā un uz divām mēģenēm veidojas nogulsnes (aglutināts). Šajā gadījumā aglutinācijas reakcijas rezultāti tiek uzskatīti par pozitīviem. Kontroles mēģenē, kurā pievienots izotoniskais nātrija hlorīda šķīdums un diagnostikas līdzeklis, mikrobu suspensijai jābūt viendabīgai ( negatīva reakcija aglutinācija).
Aglutinācijas reakcijas rezultāti dažu slimību, piemēram, leptospirozes, gadījumā tiek ņemti vērā tikai mikroskopiski tumšā mikroskopa redzes laukā (mikroaglutinācija). Lai noteiktu slimības seroloģisko diagnozi, tiek ņemta vērā diagnostiskā slimība. Parasti tas atbilst seruma atšķaidījumam 1:100 vai 1:200.
Antivielas pacienta asins serumā var noteikt, izmantojot aglutinācijas reakciju vēdertīfa un paratīfa (Vidal reakcija), brucelozes (Raita reakcija), tularēmijas u.c. gadījumos.
Kastelāni reakcija. Dažiem infekcijas slimības vai imunizācija ar mikroorganismiem, kas satur grupas antigēni, asins serumā papildus šim tipam specifiskajām antivielām parādās arī grupu antivielas. Šajā gadījumā radniecīgās baktēriju sugas tiks aglutinētas ar iegūtajiem serumiem.
Castellani ierosināja metodi grupu antivielu adsorbcijai no imūnserumiem, pamatojoties uz to izņemšanu ar radniecīgu sugu mikroorganismu palīdzību, kuriem ir grupas antigēni, bet trūkst specifisku. Šādu mikroorganismu kultūra, kas pievienota serumam, adsorbē nespecifiskās grupas antivielas, un pēc antigēna-antivielu kompleksa noņemšanas ar centrifugēšanu serumā paliek tikai specifiski imūnglobulīni. Serumus, kas apstrādāti pēc Castellani metodes, var izmantot aglutinācijas reakcijā kā ļoti specifiskus.
Imūndiagnostikas reakcijas. Antigēnu-antivielu reakcijas un reakcijas ar marķētiem komponentiem. Izmanto mikroorganismu identificēšanai un infekcijas slimību diagnostikai.
Imūnās reakcijas izmanto diagnostikas un imunoloģiskos pētījumos pacientiem un veseliem cilvēkiem. Šim nolūkam viņi izmanto seroloģiskās metodes (no lat. serums - sūkalas un logotipi - mācīšana), t.i., metodes antivielu un antigēnu pētīšanai, izmantojot asins serumā un citos šķidrumos, kā arī ķermeņa audos noteiktas antigēnu-antivielu reakcijas.
Antivielu noteikšana pret patogēnu antigēniem pacienta asins serumā ļauj noteikt slimības diagnozi. Seroloģiskie pētījumi tiek izmantoti arī mikrobu antigēnu, dažādu bioloģiski aktīvo vielu, asins grupu, audu un audzēju antigēnu, imūnkompleksu, šūnu receptoru u.c.
Izolējot mikrobu no pacienta, patogēns tiek identificēts, to pētot antigēnas īpašības izmantojot imūndiagnostikas serumus, t.i., hiperimunizētu dzīvnieku asins serumus, kas satur specifiskas antivielas. Šis ir tā sauktais seroloģiskā identifikācija mikroorganismiem.
Mikrobioloģijā un imunoloģijā plaši tiek izmantotas aglutinācijas, izgulsnēšanas, neitralizācijas reakcijas, reakcijas ar komplementu, izmantojot marķētas antivielas un antigēnus (radioimunoloģiskās, enzīmu imūnanalīzes, imunofluorescējošās metodes). Norādītās reakcijas atšķiras reģistrētā efekta un ražošanas tehnikas ziņā, tomēr tās visas ir pamata. ir balstīti uz antigēna un antivielu mijiedarbības reakciju un tiek izmantoti gan antivielu, gan antigēnu noteikšanai. Imūnās reakcijas raksturo augsta jutība un specifiskums.
Tālāk ir sniegti galveno imūndiagnostisko reakciju principi un diagrammas. Detalizēta reakcijas iestatīšanas tehnika ir sniegta. praktiskie norādījumi imūndiagnostikai.
Aglutinācijas reakcija - RA(no lat. agluti- natio- adhēzija) ir vienkārša reakcija, kurā antivielas saistās ar korpuskulārajiem antigēniem (baktērijas, eritrocītus vai citas šūnas, nešķīstošās daļiņas ar uz tām adsorbētiem antigēniem, kā arī makromolekulāros agregātus). Tas notiek elektrolītu klātbūtnē, piemēram, pievienojot izotonisku nātrija hlorīda šķīdumu.
Aglutinācijas reakcijai tiek izmantotas dažādas iespējas: ekstensīva, indikatīva, netieša utt. Aglutinācijas reakcija izpaužas kā pārslu vai nogulumu veidošanās.
RA tiek izmantots:
antivielu noteikšana asins serumā pacientiem, piemēram, ar brucelozi (Raita, Hedelsona reakcija), vēdertīfu un paratīfu (Vidal reakcija) un citām infekcijas slimībām;
no pacienta izolēta patogēna noteikšana;
asins grupu noteikšana, izmantojot monoklonālās antivielas pret eritrocītu alloantigēniem.
Lai noteiktu antivielas pacientam ieliecietdetalizēta aglutinācijas reakcija: pievienot pacienta asins seruma atšķaidījumiem diagnostika(nogalinātu mikrobu suspensija) un pēc vairāku stundu inkubācijas 37 °C temperatūrā tiek atzīmēts augstākais seruma atšķaidījums (seruma titrs), pie kura notika aglutinācija, t.i., veidojās nogulsnes.
Aglutinācijas raksturs un ātrums ir atkarīgs no antigēna un antivielu veida. Kā piemēru var minēt diagnostikas līdzekļu (O- un R-antigēnu) mijiedarbības īpatnības ar specifiskām antivielām. Aglutinācijas reakcija ar O-diagnostika(baktērijas iznīcina karstums, saglabājot siltuma stabilitāti O-antigēns) notiek smalkgraudainas aglutinācijas veidā. Aglutinācijas reakcija ar H-diagnosticum (baktērijas, ko iznīcina formaldehīds, saglabājot termolabilu flagellar H-antigēnu) ir rupja un norit ātrāk.
Ja nepieciešams noteikt no pacienta izolētu patogēnu, ielieciet indikatīva aglutinācijas reakcija, izmantojot diagnostiskās antivielas (aglutinējošo serumu), t.i., tiek veikta patogēna serotipēšana. Indikatīvu reakciju veic uz stikla priekšmetstikliņa. No pacienta izolētu patogēna tīrkultūru pievieno pilienam diagnostiskā aglutinējošā seruma atšķaidījumā 1:10 vai 1:20. Tuvumā tiek novietota kontrole: seruma vietā tiek uzklāts piliens nātrija hlorīda šķīduma. Kad pilē, kas satur serumu un mikrobus, parādās flokulējošas nogulsnes, a plaša aglutinācijas reakcija mēģenēs ar pieaugošiem aglutinējošā seruma atšķaidījumiem, kam pievieno 2-3 pilienus patogēna suspensijas. Aglutināciju ņem vērā, ņemot vērā nogulšņu daudzumu un šķidruma dzidrības pakāpi. Reakciju uzskata par pozitīvu, ja aglutināciju novēro atšķaidījumā, kas ir tuvu diagnostikas seruma titram. Tajā pašā laikā tiek ņemtas vērā kontroles: serumam, kas atšķaidīts ar izotonisku nātrija hlorīda šķīdumu, jābūt caurspīdīgam, mikrobu suspensijai tajā pašā šķīdumā jābūt vienmērīgi duļķainai, bez nogulsnēm.
Ar vienu un to pašu diagnostisko aglutinācijas serumu var aglutinēt dažādas radniecīgas baktērijas, kas apgrūtina to identificēšanu. Tāpēc viņi izmanto adsorbēti aglutinējošie serumi, no kuriem, adsorbējot radniecīgās baktērijās, ir izņemtas krusteniski reaģējošas antivielas. Šādi serumi saglabā antivielas, kas ir specifiskas tikai konkrētai baktērijai. Īpašu monoreceptoru diagnostikas aglutinējošu serumu ražošanu ierosināja A. Castellani (1902).
Netiešā (pasīvā) hemaglutinācijas reakcija (RNGA, RPGA) pamatā ir sarkano asins šūnu izmantošana ar uz to virsmas adsorbētiem antigēniem vai antivielām, kuru mijiedarbība ar attiecīgajām antivielām vai asins seruma antigēniem izraisa sarkano asins šūnu pielipšanu un nogulsnēšanos uz to virsmas. mēģene vai šūna Vķemmētu nogulumu veidā (13.2. att.). Negatīvās reakcijas gadījumā sarkanās asins šūnas nosēžas ■ “pogas” veidā. Parasti antivielas tiek noteiktas RNGA, izmantojot antigēnu eritrocītu diagnostikas līdzekli, kas ir eritrocīti ar adsorbētu. ieslēgts tos ar antigēniem. Dažreiz tiek izmantota antivielu eritrocītu diagnostika, uz kuras tiek adsorbētas antivielas. Piemēram, botulīna toksīnu var noteikt, pievienojot tam eritrocītu antivielu botulīna toksīnu (šo reakciju sauc apgrieztā netiešā hemaglutinācijas reakcija- RONG). RNGA izmanto, lai diagnosticētu infekcijas slimības, noteiktu gonadotropīna hormons V urīns, nosakot grūtniecību, lai noteiktu paaugstināta jutība Uz zāles, hormoni un dažos citos gadījumos.
Koaglutinācijas reakcija . Patogēnu šūnas tiek noteiktas, izmantojot stafilokokus, kas iepriekš apstrādāti ar imūndiagnostikas serumu. Stafilokoki, kas satur proteīnu A, kam ir afinitāte pret Fc - imūnglobulīnu fragments, nespecifiski adsorbē pretmikrobu antivielas, kas pēc tam mijiedarbojas ar aktīvajiem centriem ar atbilstošajiem mikrobiem, kas izolēti no pacientiem. Koaglutinācijas rezultātā veidojas pārslas, kas sastāv no stafilokokiem, diagnostiskajām seruma antivielām un konstatētā mikroba.
Hemaglutinācijas inhibīcijas reakcija (RTGA) pamatā ir bloķēšana, vīrusu antigēnu nomākšana ar imūnseruma antivielām, kā rezultātā vīrusi zaudē spēju aglutinēt sarkanās asins šūnas (13.3. att.). RTGA izmanto daudzu vīrusu slimību diagnosticēšanai, kuru izraisītāji (gripas vīrusi, masalas, masaliņas, ērču encefalīts u.c.) var aglutinēt dažādu dzīvnieku sarkanās asins šūnas.
Aglutinācijas reakcija asins grupu noteikšanai izmanto, lai izveidotu ABO sistēmu (skatīt 10.1.4.1. sadaļu), izmantojot sarkano asins šūnu aglutināciju ar imūnseruma antivielām pret asins grupas antigēniem A (II), B (III). Kontrole ir: serums, kas nesatur antivielas, t.i., serums AB (GU) asins veidi; antigēni, ko satur A (II), B (III) grupas sarkanās asins šūnas. Negatīvā kontrole nesatur antigēnus, t.i., tiek izmantoti 0 (I) grupas eritrocīti.
IN aglutinācijas reakcijas, lai noteiktu Rh faktoru(skatīt 10.1.4.1. sadaļu) izmantojiet anti-Rēzus serumus (vismaz divas dažādas sērijas). Ja uz pētāmo eritrocītu membrānas ir Rh antigēns, notiek šo šūnu aglutinācija. Visu asins grupu standarta Rh pozitīvie un Rh negatīvie eritrocīti kalpo kā kontrole.
Aglutinācijas reakcija, lai noteiktu anti-rēzus antivielas ( netieša reakcija Kumbsa)lieto pacientiem ar intravaskulāra hemolīze. Dažiem no šiem pacientiem tiek konstatētas anti-Rēzus antivielas, kas ir nepilnīgas un monovalentas. Tie īpaši mijiedarbojas ar Rh pozitīviem eritrocītiem, bet neizraisa to aglutināciju. Šādu nepilnīgu antivielu klātbūtni nosaka ar netiešo Kumbsa testu. Lai to izdarītu, anti-Rh antivielu + Rh-pozitīvo eritrocītu sistēmai tiek pievienots antiglobulīna serums (antivielas pret cilvēka imūnglobulīniem), kas izraisa eritrocītu aglutināciju (13.4. att.). Izmantojot Kumbsa reakciju, tiek diagnosticēti patoloģiski stāvokļi, kas saistīti ar imūnās izcelsmes eritrocītu intravaskulāru līzi, piemēram, jaundzimušā hemolītiskā slimība: Rh pozitīva augļa eritrocīti apvienojas ar asinīs cirkulējošām nepilnīgām antivielām pret Rh faktoru, kas ir caur placentu no Rh-negatīvas mātes.
Nokrišņu reakcijas
Nokrišņu reakcija - RP (nolatu. praecipito- nogulsnes) - tā ir šķīstoša molekulārā antigēna kompleksa veidošanās un nogulsnēšanās ar antivielām duļķainības veidā, ko sauc par nogulsnes. Tas veidojas, sajaucot antigēnus un antivielas līdzvērtīgos daudzumos; viena no tām pārpalikums samazina imūnkompleksu veidošanās līmeni.
Izgulsnēšanās reakcijas tiek veiktas mēģenēs (gredzenveida izgulsnēšanās reakcija),želejos, barotnēs utt. Plaši izplatītas ir kļuvušas dažādas nokrišņu reakcijas agara vai agarozes pusšķidros želejos: dubultā imūndifūzija saskaņā ar Ouchterlony. radiālā imūndifūzija, imūnelektroforēze un utt.
Gredzena nokrišņu reakcija . Reakciju veic šaurās izgulsnēšanas mēģenēs ar imūnserumu, uz kuras tiek uzklāts šķīstošs antigēns. Ar optimālu antigēna un antivielu attiecību uz šo divu šķīdumu robežas veidojas necaurspīdīgs nogulšņu gredzens (13.5. att.). Antigēna pārpalikums neietekmē gredzena izgulsnēšanās reakcijas rezultātu, jo reaģenti pakāpeniski izkliedējas līdz šķidruma robežai. Ja gredzena izgulsnēšanas reakcijā kā antigēnus izmanto vārītus un filtrētus orgānu vai audu ūdens ekstraktus, tad šo reakciju sauc. termoprecipitācijas reakcija (Ascoli reakcija, ar Sibīrijas mēri/
Dubultā imūndifūzijas reakcija saskaņā ar Ouchteruny . Lai iestatītu reakciju, izkusis agara želeja uz stikla plāksnes uzlej plānu kārtu un pēc sacietēšanas tajā izgriež 2-3 mm lielus caurumus. Šajās iedobēs atsevišķi ievieto antigēnus un imūnserumus, kas izkliedējas viens pret otru. Tikšanās vietā līdzvērtīgās proporcijās tie veido nogulsnes baltas svītras formā. Daudzkomponentu sistēmās starp iedobēm ar dažādiem antigēniem un seruma antivielām parādās vairākas nogulšņu līnijas; identiskiem antigēniem nogulšņu līnijas saplūst; neidentiskiem tie krustojas (13.6. att.).
Radiāla imūndifūzijas reakcija . Uz stikla vienmērīgi lej imūnserumu ar izkausētu agara želeju. Pēc sacietēšanas želejā izveido iedobes, kurās ievieto antigēnu dažādi atšķaidījumi. Antigēns, difundējot gēlā, ap iedobēm ar antivielām veido gredzenveida nokrišņu zonas (13.7. att.). Nokrišņu gredzena diametrs ir proporcionāls antigēna koncentrācijai. Reakciju izmanto, lai noteiktu dažādu klašu imūnglobulīnu saturu, komplementa sistēmas komponentus utt.
Imūnelektroforēze- elektroforēzes un imunoprecipitācijas kombinācija: gēla iedobēs ievada antigēnu maisījumu un atdala gēlā, izmantojot elektroforēzi. Pēc tam rievā paralēli elektroforēzes zonām ievada imūnserumu, kura antivielas, izkliedējoties gēlā, veido nokrišņu līnijas tikšanās vietā ar antigēnu.
Flokulācijas reakcija(pēc Ramona vārdiem) (no lat. floccus - vilnas pārslas) - opalescences vai flokulējošas masas parādīšanās (imunoprecipitācija) mēģenē toksīna-antitoksīna vai toksoīda-antitoksīna reakcijas laikā. To lieto, lai noteiktu antitoksiskā seruma vai toksoīda aktivitāti.
Imūns elektronu mikroskopija - mikrobu, bieži vien vīrusu, elektronu mikroskopija, kas apstrādāta ar atbilstošām antivielām. Vīrusi, kas apstrādāti ar imūnserumu, veido imūnagregātus (mikroprecipitātus). Ap virioniem veidojas antivielu “korola”, kas kontrastē ar fosfotungstīnskābi vai citiem elektronoptiski blīviem preparātiem.
Reakcijas, kas ietver komplementu
Reakcijas, kas ietver komplementubalstās uz komplementa aktivāciju ar antigēna-antivielu kompleksu (komplementa fiksācijas reakcija, radiālā hemolīze utt.).
Komplementa fiksācijas reakcija (RSK) ir tas, ka tad, kad antigēni un antivielas atbilst viens otram, tie veido imūnkompleksu, kuram caur Fc -antivielas fragments ir pievienots komplementam (C), t.i., komplementu saista antigēna-antivielu komplekss. Ja antigēna-antivielu komplekss neveidojas, tad komplements paliek brīvs (13.8. att.). RSK tiek veikts divās fāzēs: 1. fāze - maisījuma, kas satur trīs komponentus antigēns + antiviela + komplements, inkubācija; 2. fāze (indikators) - brīvā komplementa noteikšana maisījumā, pievienojot tam hemolītisko sistēmu, kas sastāv no aitu eritrocītiem un hemolītiskā seruma, kas satur antivielas pret tiem. Reakcijas 1.fāzē, veidojoties antigēna-antivielu kompleksam, saistās komplements, un tad 2.fāzē nenotiks ar antivielām sensibilizēto eritrocītu hemolīze; reakcija ir pozitīva. Ja antigēns un antiviela nesakrīt (pārbaudāmajā paraugā nav antigēna vai antivielas), komplements paliek brīvs un 2.fāzē pievienosies eritrocītu - antieritrocītu antivielu kompleksam, izraisot hemolīzi; reakcija ir negatīva.
RSC izmanto, lai diagnosticētu daudzas infekcijas slimības, jo īpaši sifilisu (Wassermann reakcija).
Radiālās hemolīzes reakcija (RRH) ) ievieto agara gela iedobēs, kas satur aitas sarkanās asins šūnas un komplementu. Pēc hemolītiskā seruma (antivielas pret aitu sarkanajām asins šūnām) ievadīšanas gēla iedobēs ap tām veidojas hemolīzes zona (antivielu radiālās difūzijas rezultātā). Tādā veidā ir iespējams noteikt komplementa un hemolītiskā seruma aktivitāti, kā arī antivielas asins serumā pacientiem ar gripu, masaliņām, ērču encefalīts. Lai to izdarītu, attiecīgie vīrusa antigēni tiek adsorbēti uz eritrocītiem, un pacienta asins serums tiek pievienots gēla iedobēm, kas satur šos eritrocītus. Pretvīrusu antivielas mijiedarbojas ar vīrusu antigēniem, kas adsorbēti uz eritrocītiem, pēc tam
Tad šim kompleksam pievienojas komplementa sastāvdaļas, izraisot hemolīzi.
Imūnās adhēzijas reakcija (IAR) ) pamatā ir komplementa sistēmas aktivizēšana ar korpuskulāriem antigēniem (baktērijām, vīrusiem), kas apstrādāti ar imūnserumu. Rezultātā veidojas aktivēta trešā komplementa sastāvdaļa (C3b), kas kā daļa no imūnkompleksa pievienojas korpuskulārajam antigēnam. Eritrocītos, trombocītos un makrofāgos ir C3b receptori, kuru dēļ šīs šūnas tiek sajauktas ar imūnkompleksiem, kas satur C3b, notiek to kombinācija un aglutinācija.
Neitralizācijas reakcija
Imūnseruma antivielas spēj neitralizēt mikrobu vai to toksīnu kaitīgo iedarbību uz jutīgām šūnām un audiem, kas ir saistīta ar mikrobu antigēnu bloķēšanu ar antivielu palīdzību, t.i. neitralizācija. Neitralizācijas reakcija(RN) tiek veikta, ievadot antigēnu-antivielu maisījumu dzīvniekiem vai jutīgos testa objektos (šūnu kultūrā, embrijos). Ja nav mikroorganismu vai to antigēnu vai toksīnu kaitīgās iedarbības uz dzīvniekiem un testa objektiem, tie runā par imūnseruma neitralizējošu iedarbību un līdz ar to arī par antigēna-antivielu kompleksa mijiedarbības specifiku (13.9. att.).
Imunofluorescences reakcija — RIF (Kona metode)
Ir trīs galvenie metodes veidi: tiešā, netiešā (13.10. att.), ar komplementu. Kūnsa reakcija ir ātra diagnostikas metode mikrobu antigēnu identificēšanai vai antivielu noteikšanai.
Tiešā RIF metode ir balstīts uz faktu, ka audu antigēni vai mikrobi, kas apstrādāti ar imūnserumu ar antivielām, kas iezīmētas ar fluorohromiem, spēj mirdzēt fluorescējošā mikroskopa UV staros.
Baktērijas uztriepē, kas apstrādātas ar šādu luminiscējošu serumu, mirdz gar šūnas perifēriju zaļas apmales veidā.
Netiešā RIF metode sastāv no antigēna-antivielu kompleksa identificēšanas, izmantojot antiglobulīna (anti-antivielu) serumu, kas marķēts ar fluorohromu. Lai to izdarītu, uztriepes no mikrobu suspensijas apstrādā ar antivielām no pretmikrobu trušu diagnostikas seruma. Pēc tam tiek mazgātas antivielas, kuras nesaista mikrobu antigēni, un, apstrādājot uztriepi ar antiglobulīna (anti-truša) serumu, kas marķēts ar fluorohromiem, nosaka uz mikrobiem palikušās antivielas. Rezultātā veidojas mikrobu + pretmikrobu trušu antivielu + prettrušu antivielu komplekss, kas marķēts ar fluorohromu. Šis komplekss tiek novērots fluorescējošā mikroskopā, tāpat kā tiešajā metodē.
Enzīmu imūnsorbcijas metode jeb analīze (ELISA)
ELISA —antigēnu noteikšana, izmantojot to atbilstošās antivielas, kas konjugētas ar marķējuma enzīmu (mārrutku peroksidāzi, beta-galaktozidāzi vai sārmaino fosfatāzi). Pēc antigēna apvienošanas ar enzīmu iezīmētu imūnserumu maisījumam pievieno substrātu/hromogēnu. Substrātu šķeļ ferments, un mainās reakcijas produkta krāsa - krāsas intensitāte ir tieši proporcionāla piesaistīto antigēnu un antivielu molekulu skaitam.
Cietās fāzes ELISA - visizplatītākais imunoloģiskā testa variants, kad viens no imūnreakcijas komponentiem (antigēns vai antivielas) tiek sorbēts uz cieta nesēja, piemēram, polistirola plākšņu iedobēs.
Nosakot antivielas, plākšņu iedobēm ar sorbētu antigēnu secīgi pievieno pacienta asins serumu, antiglobulīna serumu, kas marķēts ar fermentu, un enzīma substrātu (hromogēnu).
Katru reizi pēc cita komponenta pievienošanas nesaistītie reaģenti tiek noņemti no iedobēm, rūpīgi mazgājot. Plkst pozitīvs rezultāts Hromogēna šķīduma krāsa mainās. Cietās fāzes nesēju var sensibilizēt ne tikai ar antigēnu, bet arī ar antivielām. Pēc tam iedobēm ar sorbētajām antivielām pievieno vajadzīgo antigēnu, pievieno imūnserumu pret antigēnu, kas iezīmēts ar fermentu, un pēc tam pievieno fermenta substrātu.
Konkurētspējīga ELISA iespēja . mērķa antigēns un ar enzīmu iezīmētais antigēns konkurē viens ar otru, lai saistītu ierobežotu imūnseruma antivielu daudzumu. Vēl viens tests – meklētās antivielas
un iezīmētās antivielas konkurē savā starpā par antigēniem.
Radioimunoloģiskā metode jeb analīze (RIA)
Ļoti jutīga metode, kuras pamatā ir antigēna-antivielu reakcija, izmantojot antigēnus vai antivielas, kas marķētas ar radionuklīdu (125 J, 14 C, 3 H, 51 Cr utt.). Pēc to mijiedarbības iegūtais radioaktīvais imūnkomplekss tiek atdalīts un tā radioaktivitāte tiek noteikta atbilstošā skaitītājā (beta vai gamma starojums):
starojuma intensitāte ir tieši proporcionāla saistīto antigēnu un antivielu molekulu skaitam.
Plkst cietfāzes RIA versija viena no reakcijas sastāvdaļām (antigēns vai antivielas) tiek sorbēta uz cieta nesēja, piemēram, polistirola mikropaneļu iedobēs. Vēl viena metodes iespēja ir konkurētspējīgu RIA. vēlamais antigēns un radionuklīdu iezīmētais antigēns konkurē viens ar otru, lai saistītu ierobežotu imūnseruma antivielu daudzumu. Šo iespēju izmanto, lai noteiktu antigēna daudzumu testa materiālā.
RIA izmanto, lai identificētu mikrobu antigēnus, noteiktu hormonus, fermentus, ārstnieciskas vielas un imūnglobulīni, kā arī citas vielas, ko satur testējamais materiāls nelielā koncentrācijā - 10~ |0 -I0~ 12 g/l. Metode rada zināmu vides apdraudējumu.
Imunoblotēšana
Imūnblotēšana (IB)- ļoti jutīga metode, kuras pamatā ir elektroforēzes un ELISA vai RIA kombinācija.
Antigēnu izolē, izmantojot elektroforēzi poliakrilamīda gēlā, pēc tam pārnes (blotēšana - no angļu valodas. traips, traipu) no želejas uz aktivēta papīra vai nitrocelulozes membrānas un izstrādāts, izmantojot ELISA. Uzņēmumi ražo šādas sloksnes ar “blotiem”
antigēni. Uz šīm sloksnēm tiek uzklāts pacienta serums. Pēc tam, pēc inkubācijas, pacients tiek nomazgāts no nesaistītajām antivielām un tiek uzklāts serums pret cilvēka imūnglobulīniem, kas marķēti ar fermentu. Uz sloksnes izveidojušos komplekso antigēnu + pacienta antivielu + antivielu pret cilvēka Ig nosaka, pievienojot substrātu/hromogēnu, kas fermenta ietekmē maina krāsu (13.12. att.).
IB izmanto kā HIV infekcijas diagnostikas metodi u.c.
Aglutinācija ir baktēriju salīmēšana specifisku AT mijiedarbības rezultātā ar tām. Lai veiktu RA, ir nepieciešami trīs komponenti: 1) AG (aglutinogēns); 2) AT (aglutinīns); 3) elektrolīta šķīdums (izotoniskais nātrija hlorīda šķīdums). Aglutinācijas reakcijā piedalās tikai korpuskulārie antigēni (baktērijas, sarkanās asins šūnas, ar antigēnu iekrautas lateksa daļiņas).
Aglutinācijas reakcija uz stikla. Uz beztauku priekšmetstikliņa ar pipeti uzklāj diagnostiskā seruma pilienu (seruma atšķaidījums 1:10 – 1:20). Izmantojot bakterioloģisko cilpu, no slīpā agara virsmas ņem pētāmā mikroorganisma tīrkultūru, pārnes uz seruma pilienu un sajauc. Reakcijas rezultāts tiek ņemts vērā ar neapbruņotu aci pēc 3-5 minūtēm. Ja reakcija ir pozitīva, seruma pilē tiek novērotas pārslas (lielas vai mazas), kas skaidri redzamas uz tumša fona, kad priekšmetstikliņu sakrata. Negatīvās reakcijas gadījumā šķidrums paliek vienmērīgi duļķains.
Aglutinācijas reakcija mēģenēs. Mēģenīšu rindai pievieno 1 ml fizioloģiskā šķīduma. Pirmajai mēģenei pievieno vienādu daudzumu pārbaudāmā asins seruma. Tiek sagatavoti sērijveida divkārši seruma atšķaidījumi (seruma titrēšana), pēc tam katrā mēģenē pievieno 2 pilienus inaktivētu baktēriju suspensijas (diagnosticum). Caurules ievieto termostatā 37 °C uz 2 stundām. Reakcija norisinās, veidojot mazas, ar neapbruņotu aci neredzamas pārsliņas, tāpēc rezultāti tiek fiksēti ar nelielu palielinājumu īpašā ierīcē – aglutinoskopā. Aglutinācijas intensitāte tiek ņemta vērā pēc “četri plus” sistēmas: pilnīga aglutinācija - 4+, daļēja aglutinācija - 3+ vai 2+, apšaubāms rezultāts - +. Pēdējais atšķaidījums, kurā tiek novērota aglutinācija 2+, tiek ņemts par antivielu titru testa serumā.
Lai noteiktu patogēnu antivielu titru, tiek veikta aglutinācijas reakcija mēģenēs (plaša aglutinācijas reakcija). vēdertīfs un paratīfs (Vidal reakcija), bruceloze (Raita reakcija), tīfs (Veigla reakcija).
Aglutinācija (no latīņu valodas agglutinatio — līmēšana) ir antigēnu saturošu korpuskulāro daļiņu (veselu šūnu, lateksa daļiņu u.c.) salīmēšana (savienošana) ar specifisku antivielu molekulām elektrolītu klātbūtnē, kas beidzas ar pārslu vai nogulumu veidošanos. (aglutināts), kas redzams ar neapbruņotu aci. Sedimentu raksturs ir atkarīgs no antigēna rakstura: kažokādas baktērijas rada rupjus flokulentus nogulsnes, ar kauliņiem un nekapsulāras baktērijas rada smalkgraudainus nogulumus, bet kapsulārās baktērijas rada stīgas nogulsnes. Izšķir tiešo aglutināciju, kurā baktēriju vai jebkuras citas šūnas, piemēram, eritrocītu, pašu antigēni tieši piedalās mijiedarbībā ar specifiskām antivielām; un netiešās jeb pasīvās, kurās baktēriju šūnas vai eritrocīti, vai lateksa daļiņas ir ne pašu, bet svešu antigēnu (vai antivielu) nesēji, kas uz tiem ir sorbēti, lai identificētu tām specifiskās antivielas (vai antigēnus). Aglutinācijas reakcija galvenokārt ietver antivielas, kas pieder IgG un IgM klasēm. Tas notiek divās fāzēs: pirmkārt, notiek specifiska mijiedarbība starp antivielu aktīvo centru un antigēna noteicēju; šis posms var notikt, ja nav elektrolītu, un to nepavada redzamas izmaiņas reaģējošā sistēmā. Otrajam posmam - aglutināta veidošanai - nepieciešama elektrolītu klātbūtne, kas samazina elektriskais lādiņš antigēnu + antivielu kompleksus un paātrina to līmēšanas procesu. Šī fāze beidzas ar aglutināta veidošanos.
Aglutinācijas reakcijas veic vai nu uz stikla vai gludām kartona plāksnēm, vai sterilās aglutinācijas mēģenēs. Aglutinācijas reakcijas (tiešās un pasīvās) uz stikla parasti izmanto kā paātrināta metode specifisku antivielu noteikšana pacienta serumā (piemēram, ar brucelozi) vai patogēna seroloģiskai identificēšanai. Pēdējā gadījumā parasti izmanto labi attīrītus (adsorbētus) diagnostikas serumus, kas satur tikai monoreceptoru antivielas vai to komplektu pret dažādiem antigēniem. Stikla aglutinācijas reakcijas neapšaubāmā priekšrocība ir tās īstenošanas vienkāršība un fakts, ka tas aizņem vairākas minūtes vai pat sekundes, jo abas sastāvdaļas tiek izmantotas koncentrētā veidā. Tomēr tai ir tikai kvalitatīva vērtība, un tā ir mazāk jutīga nekā mēģene. Plašāka aglutinācijas reakcija mēģenēs dod precīzākus rezultātus, jo ļauj noteikt kvantitatīvo antivielu saturu serumā (noteikt tā titru) un nepieciešamības gadījumā reģistrēt antivielu titra pieauguma faktu, kam ir diagnostiska vērtība. . Lai izveidotu reakciju, aglutinācijas mēģenēm noteiktā veidā pievieno atšķaidītu 0,85% šķīdumu. NaCl šķīdums serums un vienāds tilpums (parasti 0,5 ml) standarta diagnostikas (vai testa kultūras) suspensijas, kas satur 1 miljardu baktēriju 1 ml. Aglutinācijas reakcijas rezultātus reģistrē vispirms pēc 2 stundu ilgas stobriņu inkubācijas 37 °C temperatūrā un visbeidzot pēc 20–24 stundām saskaņā ar diviem kritērijiem: nogulšņu klātbūtni un lielumu un supernatanta šķidruma caurspīdīguma pakāpi. Vērtēšana tiek veikta pēc četru krustu sistēmas. Reakciju obligāti papildina seruma un antigēna kontrole. Gadījumos, kad patogēna seroloģiskai identificēšanai tiek veikta detalizēta aglutinācijas reakcija mēģenē, tai ir diagnostiskā vērtība, ja reakcija novērtēta kā pozitīva, ja diagnostiskais serums ir atšķaidīts vismaz līdz pusei no tā titra.
Jāņem vērā, ka, sajaucot homologu antigēnu un antivielu šķīdumus, ne vienmēr tiek novērotas redzamas aglutinācijas reakcijas izpausmes. Nogulsnes veidojas tikai pie noteiktām optimālām abu reakcijas komponentu attiecībām. Ārpus šīm robežām, ja ir ievērojams antigēna vai antivielu pārpalikums, reakcija netiek novērota. Šo parādību sauc par "prozona fenomenu". To novēro gan aglutinācijas reakcijā, gan nokrišņu reakcijā. Prozona parādīšanās imūnreakcijās ir izskaidrojama ar to, ka tajās iesaistītie antigēni, kā likums, ir polideterminanti, un molekulas IgG antivielas ir divi aktīvi centri. Ar antivielu pārpalikumu katras antigēna daļiņas virsma tiek pārklāta ar antivielu molekulām, lai nepaliktu brīvas determinantu grupas, līdz ar to otrs, nesaistītais antivielu aktīvais centrs nevar mijiedarboties ar citu antigēna daļiņu un saistīt tās viena ar otru. Redzama aglutināta vai nogulšņu veidošanās tiek nomākta arī tad, ja ir antigēna pārpalikums, kad nepaliek neviena brīva aktīvā antivielu centra, un līdz ar to antigēna + antivielas + antigēna kompleksi vairs nevar palielināties.
Iespējas paātrinātām aglutinācijas reakcijām. Reakcija pasīvā hemaglutinācija un tā varianti
Klasiskā aglutinācijas reakcija ietver korpuskulāro antigēnu izmantošanu. Tomēr var būt iesaistīti arī šķīstošie antigēni. Lai tas būtu iespējams, šādi antigēni tiek adsorbēti uz imunoloģiski inertām daļiņām. Par nesēju var izmantot lateksa vai bentonīta daļiņas, bet šobrīd visbiežāk tiek izmantoti dzīvnieku vai cilvēka eritrocīti, uzlabojot to adsorbcijas īpašības, apstrādājot tos ar tanīna, formalīna vai benzidīna šķīdumiem. Sarkanās asins šūnas, kas ir adsorbējušas antigēnu uz sevi, sauc par sensibilizētām ar šo antigēnu, un imūnā reakcija kurā tie piedalās, ir netieša vai pasīva hemaglutinācijas reakcija (IRHA jeb RPHA), jo sarkanās asins šūnas tajā piedalās pasīvi.
RPGA tiek ievietota īpašās polistirola plāksnēs ar caurumiem ar puslodes formu. Lietojot to seroloģiskajai diagnostikai, šajās iedobēs sagatavo divkāršus atšķaidījumus sāls šķīdums testa serumu, un pēc tam tam kā diagnostikas līdzekli pievieno sensibilizētu eritrocītu suspensiju. Rezultātus reģistrē pēc 2 stundu inkubācijas 37 °C temperatūrā, izmantojot četru krustu sistēmu. Ar pozitīvu reakciju aglutinētie sarkanie asinsķermenīši nosēžas cauruma apakšā un vienmērīgi pārklāj to apgriezta lietussarga veidā. Ja reakcija ir negatīva, sarkanās asins šūnas arī nosēžas, šķidrums kļūst dzidrs, un nogulsnes izskatās kā mazs “disks” akas centrā. Seruma titrs RPHA tiek uzskatīts par tā pēdējo atšķaidījumu, kas joprojām rada izteiktu hemaglutināciju bez nozīmīgas pazīmes"diska" klātbūtne.
RPGA var izmantot arī kā paātrinātu bakterioloģiskās diagnostikas metodi, lai tieši testa materiālā atklātu nezināmas baktērijas, vīrusus, toksīnus, piemēram, mēra patogēnus, stafilokoku enterotoksīnus utt. Izmantojot šo RPGA versiju, eritrocīti, kas ir adsorbēti, ir pazīstami ar savu specifiskumu izmanto kā zināmu reakcijas komponentu antivielas - antivielu eritrocītu diagnosticum. Ja testa materiāls satur pietiekamu daudzumu zināma antigēna, RPGA būs pozitīva.
RPHA izmantošanas iespējas ir: antigēna neitralizācijas reakcija (RNAg), antivielu neitralizācijas reakcija (RNAb), pasīvā hemaglutinācijas inhibīcijas reakcija (PHA). Šīm reakcijām tiek izmantota antigēnu un antivielu eritrocītu diagnostika. Vienlaikus var izmantot divas savstarpēji kontrolējošas vienvirziena reakcijas, piemēram, RPHA ar antigēna diagnostiku un RNSg ar antivielu eritrocītu diagnostiku.
Antivielu neitralizācijas reakcija (RNSb) sastāv no suspensijas, kas satur vēlamo antigēnu, sajaukšanas ar specifisku imūnserumu, kas atbilstos tilpumos satur zināmas antivielas, un divas stundas inkubējot 37 °C temperatūrā. Pēc tam pievieno antigēnu eritrocītu diagnostikas līdzekli. Maisījumu sakrata un atstāj istabas temperatūrā. Rezultāti tiek ņemti vērā pēc 3-4 stundām un visbeidzot pēc 18-24 stundām.Ja testa materiāls satur antigēnu, tas saistīs antivielas (neitralizēs tās), un tāpēc hemaglutinācija nenotiks.
Antigēna neitralizācijas reakcija (RNSg) tiek veikta, izmantojot to pašu principu. Tikai šajā gadījumā testa materiālā tiek noteiktas antivielas. Šādam testa materiālam pievienots specifisks antigēns saistīsies ar tajā esošajām antivielām, t.i., notiks antigēna neitralizācija ar antivielām, un līdz ar to, pievienojot eritrocītu diagnostisko antivielu, nenotiks hemaglutinācija.
Koaglutinācijas reakcija. Tā ir viena no iespējām pasīvai, t.i., paātrinātai aglutinācijas reakcijai uz stikla, ko mediē antivielas nesošās šūnas. Šīs reakcijas pamatā ir unikāls īpašums Staphylococcus aureus, kura šūnu sieniņā satur proteīnu A, saistās ar IgG un IgM Fc fragmentiem. Šajā gadījumā antivielu aktīvie centri paliek brīvi un var mijiedarboties ar specifiskiem antigēnu determinantiem. Uz stikla priekšmetstikliņa uzklāj pilienu 2% stafilokoku suspensijas, kas sensibilizēta ar atbilstošām antivielām, un pievieno pilienu pētāmo baktēriju suspensijas. Ja antigēns sakrīt ar antivielām, 30-60 s laikā notiek skaidra ar antivielām piesātināto stafilokoku aglutinācija.
Lateksa aglutinācijas reakcija (LAR). Antivielu nesējs šajā diagnostikas sistēmā ir mazas standarta lateksa daļiņas. Reakciju veic, izmantojot mikrometodi stikla iedobēs. Galvenais nosacījums veiksmīgai PAH inscenēšanai ir stingra sistēmas komponentu kvantitatīvo attiecību ievērošana: 50 μl testa materiāla pievieno 10 μl lateksa preparāta, kas sensibilizēts ar antivielām. PAH specifiku kontrolē, izmantojot trīs kontroles testus, kas ietverti komerciālās testēšanas sistēmās: zināma pozitīva reakcija, zināma negatīva reakcija un lateksa suspensiju kvalitātes kontrole, izmantojot ar PAH nesensibilizētus (nesatur antivielas) lateksus ar testa materiālu. Mūsu valstī kā specifisku antivielu nesēji tiek izmantoti polistirola monodispersie lateksi ar dažādu daļiņu diametru (0,3; 0,66; 0,75; 0,8 μm). VVG izmanto mikroorganismu vai to antigēnu ātrai noteikšanai testa materiālā.
Antigēnu imūnmagnētiskā noteikšana. Viena no paātrinātas aglutinācijas reakcijas iespējām uz stikla ir saistīta ar supermagnētisku polimēru daļiņu izmantošanu, kas pārklātas ar specifiskām antivielām. Viena no šādām daļiņām saista līdz 107-108 mikroorganismu šūnām, kuru dēļ jutīgums šī metode sasniedz 5 KVV/ml. Mikroorganismu imūnmagnētisko noteikšanu var izmantot kombinācijā ar CPR.
Kopējā hemaglutinācijas reakcija (AHA). Ļauj ātri noteikt pacientu asinīs gan brīvi cirkulējošos antigēnus (antigēnēmiju), gan ar antivielām saistītos antigēnus – cirkulējošos imūnkompleksus (CIC). RAHA gadījumā izmanto sarkanās asins šūnas, kas sensibilizētas ar atbilstošām antivielām. Pacienta asins seruma, kas satur antigēnus, pievienošana sensibilizētiem eritrocītiem, uz kuriem ir fiksētas antivielas, noved pie eritrocītu un imūnkompleksu līmēšanas (aglutinācijas).
Antiglobulīna Kumbsa tests (R. Kumbsa reakcija). Pilnas (divalentās) antivielas tiek noteiktas, izmantojot tiešas un pasīvas aglutinācijas reakcijas. Nepilnīgas (monovalentas, bloķējošas) antivielas ar šīm metodēm netiek atklātas, jo, apvienojoties ar antigēnu, tās to bloķē, bet nevar izraisīt antigēna agregāciju lielos konglomerātos. Nepilnīgas (bloķējošas) antivielas ir tās, kurās darbojas tikai viens aktīvais centrs; otrais aktīvais centrs nezināma iemesla dēļ nedarbojas. Lai noteiktu nepilnīgas antivielas, tiek izmantota īpaša Kumbsa reakcija (72. att.). Reakcijā ietilpst: pacienta serums, kurā tiek noteiktas nepilnīgas antivielas, korpuskulārā antigēna diagnostika, antiglobulīna serums, kas satur antivielas pret cilvēka globulīnu. Reakcija notiek divos posmos:
Antigēna mijiedarbība ar nepilnīgām antivielām. Nav redzamu izpausmju. Pirmais posms tiek pabeigts, mazgājot antigēnu no pacienta atlikušā seruma.
Antiglobulīna seruma mijiedarbība, kas iegūta dzīvnieka imunizācijas rezultātā ar cilvēka globulīnu ar nepilnīgām antivielām, kas adsorbētas uz antigēna. Sakarā ar to, ka antiglobulīna antivielas ir divvērtīgas, tās saista divas monovalentas antivielas no atsevišķiem AG+ kompleksiem nepilnīga antiviela, kas noved pie to salīmēšanas un redzamu nogulumu parādīšanās.
Tēmas "Imūnmodulatori. Infekcijas slimību imūndiagnoze" satura rādītājs:Detalizēta aglutinācijas reakcija (RA). Lai noteiktu AT pacienta asins serumā, a plaša aglutinācijas reakcija (RA). Lai to izdarītu, asins seruma atšķaidījumu sērijai pievieno diagnostiku - nogalinātu mikroorganismu vai daļiņu suspensiju ar sorbētu Ag. Maksimālais atšķaidījums aglutinācija Ag sauc par seruma titru.
Aglutinācijas reakciju veidi (RA) lai noteiktu AT - asins pilienu testu tularēmijai (ar diagnostiku, kas uzklāta uz asins piliena un redzamu bālganu aglutinātu parādīšanos) un Hadlsona testu brucelozei (ar genciānas vijolītes krāsotu diagnostiku, kas uzklāta asins pilienam serums).
Aptuvenā aglutinācijas reakcija (RA)
Lai identificētu izolētos mikroorganismus, uz stikla priekšmetstikliņiem uzliek aptuvenu RA. Lai to izdarītu, standarta diagnostikas antiseruma (atšķaidīts 1:10, 1:20) pilienam pievieno patogēna kultūru. Ja rezultāts ir pozitīvs, tiek veikta detalizēta reakcija, palielinot antiseruma atšķaidījumus.
Reakcija uzskata par pozitīvu, ja aglutināciju novēro atšķaidījumos, kas ir tuvu diagnostiskā seruma titram.
OAS. Somatiskie O-Ags ir karstumizturīgi un var izturēt vārīšanu 2 stundas.Mijiedarbojoties ar AT, tie veido smalkgraudainus agregātus.
N-Ag. N-Ag (zibens) ir termolabīli un ātri sadalās 100 °C, kā arī etanola ietekmē. Reakcijās ar H-antiserumu pēc 2 stundu inkubācijas veidojas irdenas lielas pārslas (veidojas baktērijām, kas salīp kopā ar flagellas).
Vi-Ar vēdertīfa baktērijas ir relatīvi karstumizturīgas (iztur 60-62 °C temperatūru 2 stundas); Inkubējot ar Vi antiserumu, veidojas smalkgraudains aglutināts.
Tiešas hemaglutinācijas reakcijas
Vienkāršākais no tiem reakcijas - aglutinācija sarkanās asins šūnas jeb hemaglutinācija, ko izmanto asins grupu noteikšanai ABO sistēmā. Lai noteiktu aglutinācija(vai tā trūkums) izmantojiet standarta antiserumus ar anti-A un anti-B aglutinīniem. Reakciju sauc par tiešu, jo pētāmās Ags ir sarkano asins šūnu dabiskas sastāvdaļas.
Kopīgs ar tieša hemaglutinācija vīrusu hemaglutinācijai ir mehānismi. Daudzi vīrusi spēj spontāni aglutinēt putnu un zīdītāju eritrocītus; to pievienošana eritrocītu suspensijai izraisa no tiem agregātu veidošanos.
