Úvod → Analýzy → Imunologická metóda → Hemaglutinačné reakcie (imunologická metóda)

Aglutinačné reakcie založené na interakcii činidla (protilátok) s antigénmi umiestnenými na povrchu buniek alebo cudzích častíc. V dôsledku toho vznikajú agregáty veľkých rozmerov, ktoré sa vyzrážajú a sú viditeľné aj voľným okom. Krvná skupina sa teda určuje podľa systému ABO, prítomnosti Rh faktora v ňom atď. Ide o citlivejšiu diagnostickú metódu v porovnaní so zrážacími reakciami, keďže objem sedimentu (aglutinátu) prevyšuje objem zrazeniny.

Priama hemaglutinácia

Priamy hemaglutinačný test (RPHA) sa používa na detekciu povrchových antigénov mikroorganizmov a erytrocytov, ako aj protilátok proti nim.
TO štandardné séra obsahujúce protilátky, pridajte testovaný materiál (krv). Rýchlosť priamej aglutinačnej reakcie súvisí s množstvom testovaného materiálu, množstvom a koncentráciou séra a teplotou okolia.

Nepriama hemaglutinácia

reakciu nepriama hemaglutinácia vykonávané na detekciu protilátok v krvi pacienta pomocou erytrocytárneho diagnostica. Činidlom sú erytrocyty, na povrchu ktorých sa nachádza antigén (proteíny mikroorganizmov, toxíny, alergény atď.).
Krvné sérum pacienta sa zriedi 0,9% roztokom chloridu sodného, ​​potom sa pridá erytrocytárne diagnosticum a sleduje sa výsledok. Táto vysoko citlivá diagnostická metóda deteguje antigény už pri nízkych koncentráciách.

Hemaglutinačná reakcia (RGA).

V laboratóriu sa používajú dve rôzne hemaglutinačné reakcie.

Prvý RGA sa týka sérologického. Pri tejto reakcii dochádza k aglutinácii erytrocytov pri interakcii so zodpovedajúcimi protilátkami (hemaglutiníny). Reakcia sa široko používa na stanovenie krvných skupín.

Druhá RHA nie je sérologická. V ňom je spôsobená aglutinácia erytrocytov nie

protilátky, ale špeciálne látky tvorené vírusmi. Napríklad vírus chrípky aglutinuje kuracie erytrocyty a morčatá, vírus poliomyelitídy – ovčie erytrocyty. Táto reakcia umožňuje posúdiť prítomnosť konkrétneho vírusu v testovanom materiáli.

Reakcia sa uskutočňuje v skúmavkách alebo na špeciálnych platniach s jamkami. Materiál, ktorý sa má testovať na prítomnosť vírusu, sa zriedi izotonickým roztokom od 1:10 do 1:1280; 0,5 ml každého riedenia sa zmieša s rovnakým objemom 1-2% suspenzie erytrocytov. Pri kontrole sa zmieša 0,5 ml erytrocytov s 0,5 ml izotonického roztoku. Skúmavky sa umiestnia do termostatu na 30 minút a doštičky sa nechajú pri teplote miestnosti 45 minút.

Účtovanie výsledkov. O pozitívny výsledok reakciou na dne skúmavky alebo jamky padá zrazenina erytrocytov s vrúbkovanými okrajmi („dáždnik“), ktorá pokrýva celé dno jamky. Ak je výsledok negatívny, erytrocyty tvoria hustú zrazeninu s hladkými okrajmi („tlačidlo“). Rovnaká zrazenina by mala byť pod kontrolou. Intenzita reakcie je vyjadrená znamienkami „+“.

Hemaglutinačná reakcia

Titer vírusu je maximálne zriedenie materiálu, v ktorom dochádza k aglutinácii.

Reakcia inhibície hemaglutinácie

Ide o sérologickú reakciu, pri ktorej je špecifická antivírusové protilátky, ktoré interagujú s vírusom (antigénom), neutralizujú ho a zbavujú schopnosti aglutinovať erytrocyty, t.j. inhibovať hemaglutinačnú reakciu. Táto reakcia vám umožňuje určiť typ a typ vírusov.

Nastavenie reakcie. 0,25 ml antivírusového séra sa zmieša s rovnakým objemom materiálu obsahujúceho vírus. Zmes sa pretrepe a umiestni sa do termostatu na 30 minút, potom sa pridá 0,5 ml 1-2% suspenzie erytrocytov.

Účtovanie výsledkov. Pri správnom nastavení experimentu pri kontrole séra a erytrocytov by malo vzniknúť „gombík“ – neexistuje faktor aglutinujúci erytrocyty; v antigénovej kontrole vzniká „dáždnik“ – vírus spôsobil aglutináciu erytrocytov. Ak je sérum homológne so skúmaným vírusom, vytvorí sa "tlačidlo" - sérum neutralizovalo vírus.

Nepriama hemaglutinačná reakcia

Reakcia nepriamej (pasívnej) hemaglutinácie (RIHA) je založená na skutočnosti, že erytrocyty, ak je na ich povrchu adsorbovaný rozpustný antigén, získavajú schopnosť aglutinácie pri interakcii s protilátkami proti adsorbovanému antigénu.

Nastavenie reakcie. Sérum sa zahrieva 30 minút na 56 °C, zriedi sa postupne v pomere 1:10 - 1:1280 a naleje sa do skúmaviek alebo jamiek po 0,25 ml, kde sa potom pridajú 2 kvapky erytrocytov s adsorbovanými antigénmi.

Ovládanie: suspenzia erytrocytov s na nich adsorbovanými antigénmi s evidentne imúnnym sérom, suspenzia erytrocytov s na nich adsorbovanými antigénmi s normálnym sérom; suspenzia normálnych erytrocytov s testovaným sérom. Pri prvej kontrole by malo dôjsť k aglutinácii, pri druhej a tretej nie.

Kontrolné otázky.

1. Čo naznačuje pozitívny výsledok RGA medzi erytrocytmi a materiálom testovaným na prítomnosť vírusu?

2. Vznikne aglutinačná reakcia erytrocytov, ak sa k nim pridá vírus a jemu zodpovedajúce sérum? Ako sa volá reakcia, ktorá odhaľuje tento jav?

PRAKTICKÁ PRÁCA №12.

Reakcia väzby komplementu.

Reakcia väzby komplementu (RCT) je založená na skutočnosti, že špecifický komplex antigén-protilátka vždy adsorbuje (viaže) komplement na seba.

Táto reakcia je široko používaná pri identifikácii antigénov a sérodiagnostike infekcií, najmä chorôb spôsobených spirochétami (Wassermannova reakcia), rickettsiami a vírusmi.

PCS je komplexná sérologická reakcia. Zahŕňa komplement a dva systémy antigén-protilátka. V podstate ide o dve sérologické reakcie.

Pravo-základný systém pozostáva z antigénu a protilátky (jedna je známa, druhá nie). Pridáva sa k nemu určité množstvo komplementu. Ak sa antigén a protilátka tohto systému zhodujú, spoja sa a spoja kompliment. Výsledný komplex je jemne rozptýlený a nie je viditeľný.

Tvorba tohto komplexu je známa pomocou druhého hemolytického alebo indikátorového systému. Zahŕňa ovčie erytrocyty (antigén) a im zodpovedajúce hemolytické sérum (protilátka), t.j. hotový imunitný komplex. V tomto systéme môže k lýze erytrocytov dôjsť len v prítomnosti komplementu. Ak je komplement viazaný prvým systémom, potom nedôjde k hemolýze v druhom systéme; žiadny voľný doplnok. Ako pozitívny výsledok RSK sa zaznamenáva absencia hemolýzy (obsah skúmavky je zakalený alebo je na dne skúmavky sediment erytrocytov).

Ak v prvom systéme antigén nezodpovedá protilátke, potom sa imunitný komplex nevytvorí a kompliment zostane voľný. Zostávajúci voľný kompliment sa podieľa na druhom systéme, čo spôsobuje hemolýzu, výsledok RSK je negatívny (obsah skúmaviek je priehľadný - "laková krv").

Komponenty, reakcie fixácie komplementu:

1. Antigén - zvyčajne lyzát, extrakt, haptén,

menej často suspenzia mikroorganizmov.

2. Protilátka – sérum pacienta.

3. Doplnok - morčacie sérum.

4. Antigén – ovčie erytrocyty.

5. Protilátka - hemolyzín na ovčie erytrocyty.

6. Izotonický roztok.

Vzhľadom na to, že sa RSC zúčastňuje veľké množstvo zložité komponenty,

musia byť vopred titrované a vložené do reakcie v presných množstvách a v rovnakých objemoch: 0,5 alebo 0,25 ml, menej často 0,2, 1,25 alebo 1,0 ml (väčšie objemy poskytujú presnejší výsledok). Titrácia reakčných zložiek sa uskutočňuje v rovnakom objeme ako experiment, pričom chýbajúce zložky sa nahradia izotonickým roztokom.

Súvisiace informácie:

Vyhľadávanie na stránke:

Reakcia nepriamej alebo pasívnej hemaglutinácie (RNHA alebo RPHA) je citlivejšia a špecifickejšia ako aglutinačná reakcia. Táto reakcia sa tiež používa dvoma spôsobmi.

1) Na detekciu protilátok v krvnom sére pacienta sa používajú erytrocytárne diagnostika, pri ktorých sa antigén adsorbuje na povrchu erytrocytov ošetrených tanínom. V súvislosti s touto reakciou sa častejšie používa termín RPHA.

Testované sérum sa zriedi v jamkách plastových platničiek a pridá sa erytrocytárne diagnosticum. Pri pozitívnej reakcii sa pozdĺž stien otvoru objaví tenký film vo forme "čipkového dáždnika" s spätnú reakciu- hustý sediment erytrocytov vo forme "gombíka".

2) Na detekciu toxínov a bakteriálnych antigénov v študovanom materiáli sa používajú protilátkové erytrocytové diagnosticum získané adsorpciou protilátok na erytrocytoch. V súvislosti s touto reakciou sa častejšie používa termín RNGA. Napríklad pomocou protilátkových diagnostik sa zisťuje morový bacilový antigén, difterický exotoxín, botulínový exotoxín.

Čo je diagnostika erytrocytov? Čo je to protilátková diagnostika erytrocytov?

Erytrocytové diagnosticum sú erytrocyty (ošetrené tanínom alebo formalínom) s antigénmi extrahovanými z baktérií, ktoré sú na nich adsorbované a používajú sa pri RPHA (pasívna hemaglutinačná reakcia). V prípade, že sa RPGA používa na detekciu antigénu v sekrétoch pacientov, v tkanivách atď., používajú sa "protilátkové diagnostická", t.j. erytrocyty senzibilizované protilátkami.

Pri RNHA sa protilátky v krvnom sére zisťujú pomocou antigénneho erytrocytárneho diagnostica, ktorým sú erytrocyty s adsorbovanými antigénmi.

Technika nastavovania reakcií. Koaglutinačná reakcia.

- fixácia erytrocytov formaldehydom alebo glutarovými alebo akrylovými aldehydmi. Takto spracované erytrocyty sú dlhodobo skladované. Častejšie sa na tento účel používajú erytrocyty oviec, ľudí, kurčiat atď.;
— ošetrenie fixovaných erytrocytov roztokom tanínu. Výsledkom je, že erytrocyty nadobúdajú vlastnosť ireverzibilne adsorbovať proteíny (vírusy a protilátky) na svojom povrchu;
- senzibilizácia tanizovaných erytrocytov vírusmi alebo protilátkami.

Koaglutinačná reakcia (RCA)

Koaglutinačná reakcia sa používa na stanovenie antigénov pomocou protilátok adsorbovaných na proteín A buniek stafylokoka (antibody diagnosticum).
Proteín A má afinitu k Fc fragmentu imunoglobulínov, preto takéto baktérie ošetrené imunodiagnostickým sérom nešpecificky adsorbujú sérové ​​protilátky, ktoré potom interagujú s aktívnymi centrami so zodpovedajúcimi mikróbmi izolovanými od pacientov. V dôsledku koagulácie sa vytvárajú vločky pozostávajúce zo stafylokokov, diagnostických sérových protilátok a mikróbu, ktorý sa určuje.

Aglutinačné séra: čo obsahujú; ako sa získavajú, na čo sa používajú; aký je titer aglutinačného séra?

Aglutinačné sérum sa získava imunizáciou králikov (intravenózne, subkutánne alebo intraperitoneálne) suspenziou usmrtených baktérií, počínajúc dávkou 200 miliónov, potom 500 miliónov, 1 miliardy, 2 miliárd mikrobiálnych teliesok v 1 ml, v intervaloch 5 dní. 7-8 dní po poslednej imunizácii sa odoberie krv a stanoví sa titer protilátok.

Titer aglutinačného séra je maximálne zriedenie séra, pri ktorom dochádza k aglutinácii s príslušným mikroorganizmom.

Aglutinačné séra sa používajú na identifikáciu mikróbov v rozšírenej aglutinačnej reakcii.

Hemaglutinačná reakcia (RHA)

Ak je skúmaný mikroorganizmus aglutinovaný sérom na titer alebo na polovičnú hodnotu titra, možno ho považovať za patriaci k druhu, ktorého názov je uvedený na štítku ampulky.

Aké sú rozdiely medzi polyvalentnými a monovalentnými (monoreceptorovými) aglutinačnými sérami; Prečo imunizácia králika mikróbmi jedného druhu produkuje sérum obsahujúce protilátky proti niekoľkým antigénom?

Monoreceptorové séra - séra obsahujúce protilátky len proti jednému antigénu a polyvalentné séra, ktoré spôsobujú aglutinačné reakcie s dvomi alebo tromi príbuznými baktériami, ktoré majú spoločný antigén. Aglutinačné séra sa používajú na identifikáciu mikroorganizmov v aglutinačnej reakcii. Nevýhodou takýchto sér je, že sú schopné poskytnúť skupinové aglutinačné reakcie, tk. obsahujú protilátky proti baktériám, ktoré majú spoločné antigény.

Hemaglutinačná reakcia. Popis a aplikácia

Vychádza zo skutočnosti, že erytrocyty, na ktorých sú vopred adsorbované antigény, získavajú schopnosť aglutinácie v prítomnosti homológnych sér (protilátok).

V tomto prípade erytrocyty zohrávajú úlohu nosičov so špecifickými determinantami, ktorých aglutinácia nastáva v dôsledku reakcie antigén + protilátka.

Erytrocyty, na ktorých povrchu sú pevne naviazané antigény, sa nazývajú erytrocytárne antigénne diagnosticum alebo erytrocyty senzibilizované antigénom.

Iný typ RNHA - protilátky sú adsorbované na povrchu erytrocytov a v prítomnosti homológneho antigénu dochádza k ich následnej aglutinácii. V tomto prípade sa takéto erytrocyty nazývajú erytrocyty protilátka diagnosticum alebo erytrocyty senzibilizované protilátkami.

Na základe týchto dvoch základných metodologických prístupov bolo vyvinutých a využívaných mnoho modifikácií RNGA. Ako nosiče sa teda používajú malé štandardné častice latexu. V tomto prípade sa reakcia nazýva latexová aglutinačná reakcia (RLA) alebo sa používa Staphylococcus aureus- koagulačná reakcia atď. Zvyčajne sa erytrocytové diagnostiky pripravujú v podnikoch biologického priemyslu a hlavné skúsenosti RNGA sú už inštalované v diagnostických laboratóriách.

Príprava diagnostiky erytrocytov zahŕňa nasledujúce kroky:

• fixácia erytrocytov formaldehydom alebo glutarovými alebo akrylovými aldehydmi. Takto spracované erytrocyty sú dlhodobo skladované. Častejšie sa na tento účel používajú erytrocyty oviec, ľudí, kurčiat atď.;
• ošetrenie fixovaných erytrocytov roztokom tanínu. Výsledkom je, že erytrocyty nadobúdajú vlastnosť ireverzibilne adsorbovať proteíny (vírusy a protilátky) na svojom povrchu;
• senzibilizácia tanizovaných erytrocytov vírusmi alebo protilátkami.

Je potrebné poznamenať, že metódy prípravy erytrocytov diagnosticum pre vírusové infekcie rôzne.

Technika nastavenia RNHA na detekciu a stanovenie titra protilátok je nasledovná:

• k následným 2-násobným riedeniam séra pridajte rovnaké dávky erytrocytov senzibilizovaných antigénom;
• zmes sa nechá 2-3 hodiny pri teplote miestnosti alebo 16-18 hodín pri 4 °C;
• brať do úvahy výsledky. Ak sérum obsahuje protilátky proti vírusu, ktorým boli erytrocyty senzibilizované, pozoruje sa hemaglutinácia, ktorá sa hodnotí krížením.

Titer sérových protilátok sa považuje za najvyššie riedenie séra, ktoré ešte poskytuje hemaglutináciu aspoň dvoma kríženiami.

RNGA sprevádzajú všetky príslušné kontroly. Zvyčajne dávajú reakciu mikrometódou.

RNHA umožňuje riešiť nasledujúce diagnostické úlohy:

• detekovať protilátky a určiť ich titer v krvnom sére pomocou známeho erytrocytárneho antigénneho diagnostika;
• detekovať a identifikovať neznámy vírus pomocou známeho erytrocytárneho diagnostika protilátok.

Výhody RNGA: vysoká citlivosť, jednoduchá technika nastavenia a rýchla odozva. Je však dôležité poznamenať, že pri príprave stabilných erytrocytových diagnostik sú veľké ťažkosti (veľká závislosť od čistoty použitých komponentov, nutnosť výberu spôsobu fixácie, tanizácie a senzibilizácie erytrocytov pre každý typ vírusu) .

Ak nájdete chybu, vyberte časť textu a stlačte Ctrl+Enter.

V kontakte s

REAKCIA NA PRIAMY HEMAGLUTINATION, RNGA
(Nepriamy hemaglutinačný test)

Spôsob detekcie antigénov a protilátok založený na schopnosti erytrocytov, na povrchu ktorých sú antigény alebo protilátky vopred adsorbované, aglutinovať v prítomnosti homológnych sér alebo zodpovedajúcich antigénov.

Pri detekcii antigénov je reakcia indikovaná reverznou pasívnou hemaglutináciou - ROPHA (reverzný pasívny hemaglutinačný test), a pri detekcii protilátok - pasívnou hemaglutináciou - RPHA (pasívny hemaglutinačný test). RNHA našla široké uplatnenie pri detekcii sérologických markerov infekcie vírusom hepatitídy B, najmä HBsAg a protilátok proti nemu.

V súčasnosti vyvinutý rôzne metódy výroba erytrocytových diagnostik, líšiacich sa metódami senzibilizácie erytrocytov (pomocou tanínu, glutaraldehydu, chloridu chrómu, rivanolu a pod.), ich druhmi (človek, baran, kura, morka a pod.), možnosťami nastavenia reakcie ( v mikrotitračných platniach, skúmavkách, kapilárach atď.) a zaznamenávanie výsledkov (vizuálne a inštrumentálne). Erytrocytárne diagnostika na detekciu HBsAg a anti-HBs vyrábajú mnohé podniky a firmy u nás aj v zahraničí.

Častejšie sa RNHA uskutočňuje na mikrotitračných platniach, v ktorých sa predbežne pripravujú riedenia testovacieho séra a kontrolných vzoriek. Po zavedení diagnostiky erytrocytov a inkubácii sa zaznamenajú výsledky reakcie. Vzorky, v ktorých dochádza k aglutinácii erytrocytov vo forme obráteného „dáždnika“, sa považujú za pozitívne. Pri negatívnej reakcii sa erytrocyty usadia na dne jamky vo forme krúžku alebo disku.

Na potvrdenie špecifickosti získaných výsledkov sa reakcia vykonáva s „experimentálnym“ erytrocytovým diagnostikom (t.j. erytrocyty senzibilizované antigénom alebo protilátkami), ako aj s „kontrolným“ diagnostikom (t.j. erytrocyty nie sú senzibilizované antigénom alebo protilátkami). . Prítomnosť pozitívnej reakcie s „kontrolným“ diagnostickým produktom naznačuje falošne pozitívnu reakciu. Na odstránenie nešpecifických reakcií sa testované sérum ošetrí nesenzibilizovanými erytrocytmi. Predpokladom na uskutočnenie RNGA je neutralizačná reakcia, t.j. potvrdzovací test.

V porovnaní s metódami ako RPG, VIEF a RSK má reakcia nepriamej hemaglutinácie vyššiu citlivosť (200-400-krát). HBsAg v TPHA je teda možné detegovať v koncentráciách 6-10 ng/ml. Jednoduchosť reakcie a rýchlosť (20 - 30 minút) určili široké uplatnenie túto metódu v transfúznej službe na zistenie HBsAg.

Okrem diagnostiky erytrocytov boli vyvinuté diagnostické prípravky na detekciu HBsAg a anti-HBs a pre prejavov anti-HBs, anti-HBs triedy IgM (variant na tuhej fáze), HBeAg, antigén vírusu hepatitídy A a protilátky proti nemu, všetky však nenašli uplatnenie v praktickom zdravotníctve.

Reakcia nepriamej hemaglutinácie (RIGA).

RIGA sa používa v dvoch verziách: so známymi antigénmi na detekciu protilátok so známymi protilátkami na detekciu hypertenzie. Táto reakcia je špecifická a používa sa na diagnostiku chorôb spôsobených baktériami a rickettsiae. Na vykonanie RIGA sa používajú erytrocytové diagnostické roztoky pripravené adsorpciou AG alebo AT na erytrocytoch v závislosti od účelu štúdie (obr. 10.3). V pozitívnych prípadoch je stupeň aglutinácie erytrocytov označený plusmi. Štyri plusy hodnotia reakciu, ktorá má formu tenkého filmu lepiacich červených krviniek (dáždnik), ktorý pokrýva dno skúmavky; prítomnosť filmu s vrúbkovanými krajkami je označená dvoma plusmi. Titer sa berie ako limitné riedenie testovaného materiálu, ktoré spôsobilo aglutináciu erytrocytov dvoma plusmi.

Ryža. 10.3.

1 - erytrocyty, 2 - erytrocyt AG, 3 - konjugovaný AG, 4-AT

RGA a hemaglutinačná inhibičná reakcia (RTGA).

Ako už bolo uvedené, RGA je založená na schopnosti erytrocytov držať sa spolu, keď sú na ne adsorbované určité antigény. Ako testovací materiál na hemaglutináciu sa používa alantoický, plodová voda, suspenzia chorion-alantoidných membrán kuracích embryí, suspenzie a extrakty z kultúr alebo orgánov zvierat infikovaných vírusmi, natívny infekčný materiál. RGA nie je sérologická reakcia, pretože sa vyskytuje bez účasti imunitného séra a používa sa na výber pracovného riedenia AG na nastavenie RTGA alebo prítomnosti AG (vírusu) v testovanom materiáli (napríklad pri chrípke). Reakcia využíva erytrocyty zvierat, vtákov, ľudí s krvnou skupinou I (0). Na nastavenie približného RGA sa na podložné sklíčko nanesie kvapka 5 % suspenzie erytrocytov a kvapka testovaného materiálu, pričom sa dôkladne premieša. S pozitívnym výsledkom po 1-2 minútach makroskopicky pozorujte výskyt flokulentnej aglutinácie erytrocytov. Na nastavenie RHA v predĺženom rade v jamkách polystyrénových platní sa pripravia dvojnásobne sa zvyšujúce riedenia testovaného materiálu na fyziologický roztok v objeme 0,5 ml. Do všetkých skúmaviek sa pridá 0,5 ml 0,25-1% suspenzie erytrocytov. Výsledky sa berú do úvahy po úplnej sedimentácii erytrocytov v kontrole (erytrocyty + fyziologický roztok). Reakcia sa berie do úvahy podľa charakteru sedimentu erytrocytov. V pozitívnych prípadoch je stupeň aglutinácie označený plusmi. Štyri plusy hodnotia reakciu, ktorá má formu tenkého filmu zlepených erytrocytov pokrývajúcich dno skúmavky (dáždnik), reakcia s medzerami vo filme je označená tromi plusmi, prítomnosť filmu s vrúbkovanými krajkovými okrajmi zlepených erytrocytov je označený dvoma plusmi, vločkovitý sediment erytrocytov obklopený zónou hrudiek aglutinovaných erytrocytov zodpovedá jednému plusu. Ostro ohraničený sediment erytrocytov, nerozoznateľný od kontroly, naznačuje neprítomnosť aglutinácie. Titer sa berie ako limitné riedenie testovaného materiálu, ktoré spôsobilo aglutináciu erytrocytov dvoma plusmi. Ak je výsledok RHA pozitívny, štúdia pokračuje stanovením typu izolovaného vírusu pomocou HA RT s typovo špecifickými sérami. RTGA je založená na schopnosti antiséra potlačiť hemaglutináciu vírusu, keďže vírus neutralizovaný špecifickými protilátkami stráca schopnosť aglutinovať červené krvinky. Na približnú typizáciu vírusov sa používa metóda kvapky na sklo. Na konečné určenie typovej príslušnosti izolovaného vírusu a titráciu protilátok v sére sa expandovaný RTHA umiestni do skúmaviek alebo do jamiek. Na tento účel sa pripravia dvojnásobné riedenia séra vo fyziologickom roztoku a nalejú sa do 0,25 ml. K riedeniu séra sa pridá jedna kvapka materiálu obsahujúceho vírus a jedna kvapka 1 % suspenzie erytrocytov. Pri použití RTGA na určenie typu vírusu sa používajú typovo špecifické séra, ktoré sa pridávajú do rovnakého objemu pracovného riedenia AG. Typová príslušnosť izolovaného vírusu je stanovená špecifickým imunitným sérom, ktoré vykazovalo najvyšší titer protilátok proti tomuto vírusu. RGA a RTGA sa široko používajú na diagnostiku vírusových infekcií ( kliešťová encefalitída, chrípka a pod.) s cieľom zistiť špecifické protilátky a identifikovať mnohé vírusy podľa ich antigénov.

Reakcia nepriamej hemaglutinácie (RIHA)

Použitie adsorbovaných diagnostických prípravkov je založené na princípe imunologického rozpoznávania povrchových štruktúr, ktorý je neustále implementovaný v prírode. Z tohto pohľadu nie sú zásadné rozdiely medzi použitím napríklad mikrobiálnej bunky alebo umelého nosiča nabitého antigénom (protilátkami). Ako základ sorbovaných prípravkov sa používajú rôzne nosiče - mikrobiálne bunky, erytrocyty, latex, bentonín, cholesterol, Sephadex, dermatol, Aktívne uhlie, spóry húb atď.

Po práci A. T. Kravčenka (1945) sa erytrocyty zbavené životaschopnosti a fixované rôznymi chemickými činidlami stali najrozšírenejšími ako nosič antigénu alebo protilátok. Na princípe použitia erytrocytov (natívnych aj fixných) ako nosiča antigénu sa rozšírila reakcia nepriamej (pasívnej) hemaglutinácie.

Návrh na využitie nepriamej hemaglutinačnej reakcie (IHA) na diagnostické účely vznikol na základe už skôr vyvinutých poznatkov o vysokej sorpčnej aktivite erytrocytov. V porovnaní s mnohými inými nosičmi antigénov a protilátok majú erytrocyty určité výhody v reakcii nepriamej hemaglutinácie. Po prvé, izotonicky soľné roztoky vytvárajú pomerne stabilnú priľnavosť a neuspokojujú sa krátky čas. Po druhé, červené krvinky rovnakého živočíšneho druhu majú rovnakú veľkosť. A nakoniec, erytrocyty pomerne ľahko priamo alebo v dôsledku špeciálneho spracovania pripájajú rôzne sérologicky aktívne zložky.

Vytvorenie erytrocytových diagnostik zo stabilizovaných erytrocytov umožňuje prekonať ťažkosti, ktoré vznikajú pri použití natívnych erytrocytov.

Pri štúdiu erytrocytov ošetrených rôznymi fixačnými prostriedkami sa zistili niektoré z ich spoločných vlastností:

V morfológii sa prakticky nelíšia od čerstvých;

Nehemolyzovaný v hypotonických roztokoch, vo vode a po zmrazení-rozmrazení;

Môže sa sušiť mrazom;

Ich povrchové štruktúry si zachovávajú schopnosť chemickej modifikácie (napr. tanín, diazozlúčeniny) a reakcie s antigénmi a protilátkami.

Hlavným kritériom kvality fixovaných erytrocytov je možnosť ich použitia na získanie senzibilizovaných preparátov pri absencii nešpecifickej aglutinácie v stabilizačných kvapalinách.

Pri návrhu diagnostických prípravkov je dôležitá príprava povrchu erytrocytov za účelom zvýšenia sorpčnej kapacity pre antigény. Obzvlášť rozšírené je ošetrenie erytrocytov tanínom.

Pod jeho vplyvom zmena antigénne vlastnosti erytrocyty (permeabilita, rýchlosť sedimentácie), ich odolnosť voči hemolytickým účinkom určitých mastné kyseliny. To hlavné je však dosiahnuté – tanizované erytrocyty majú oveľa vyššiu sorpčnú schopnosť proteínov, čo sa v súčasnosti hojne využíva pri výrobe kvalitných antigénnych a protilátkových diagnostik.

Spolu s tanizáciou erytrocytov, na výrobu erytrocytových diagnostik a prípravu nosiča antigénu sa používajú chemické činidlá ako bromelaín, triopsín a jodistan draselný, ktoré modifikujú aj membrány erytrocytov.

Po príprave povrchu erytrocytov naj dôležitý proces- proces hemosenzibilizácie - záverečná fáza produkcia diagnostických erytrocytov.

Na posilnenie spojenia medzi nosičom a antigénom sa používajú rôzne konjugačné látky - bisdiazobenzidín, difluórdinitrobenzín, kyanidchlorid, chlorid kademnatý a kyselina octová, chlorid brómu, formaldehyd, glutaraldehyd, brómkyán, rivanol, amidol atď.

Použitie konjugačných látok pomáha eliminovať nedostatky, ktoré majú tanizované erytrocyty používané na senzibilizáciu bez konjugačných látok.

Najpoužívanejšími konjugačnými látkami sú chlorid chrómový, glutaraldehyd, diazolová čerň C a amidol. Proces senzibilizácie chloridom chrómovým sa vyskytuje veľmi rýchlo - od 4 do 10 minút, čo priťahuje pozornosť výskumníkov. V tomto prípade sa používajú koncentrácie chloridu chrómového od 0,05 do 2 %, pH nie je nižšie ako 5,0 pri teplote reakčnej zmesi 20-250 C. V procese senzibilizácie chloridom chrómovým sa karboxylové skupiny membránových proteínov erytrocytov sú aktivované. V dôsledku toho sa medzi membránou erytrocytov a senzitínom vytvorí kovalentná väzba.

Reakcia nepriamej hemaglutinácie má vysokú špecifickosť, pretože k aglutinácii erytrocytov dochádza v dôsledku interakcie antigénu s protilátkami adsorbovanými na erytrocytoch. Jeho charakteristickým znakom je vysoká citlivosť: deteguje sa v ňom 0,02-0,05 μg protilátkového proteínu. Z hľadiska citlivosti výrazne prevyšuje reakcie imunodifúzie, imunofluorescencie, radiálnej imunodifúzie, fixácie komplementu a neutralizácie. RNGA je menej citlivý ako metódy rádioimunoelektroforézy, stanovenie množstva proteínu rádioaktívnych protilátok v imunosorbente, enzýmová imunoanalýza.

Medzi výhody RNGA patrí dostatočne vysoká reprodukovateľnosť, jednoduchosť implementácie a potreba minimálnych množstiev prísad, najmä pri použití mikrometódy.

RNGA v posledné roky našiel široké uplatnenie v diagnostike infekčnej rinotracheitídy, hnačky, adenovírusová infekcia, rota- a koronavírusová infekcia, parainfluenza - 3 a respiračná syncyciálna infekcia.

Uvádzame príklad výroby a použitia erytrocytového diagnostika na detekciu protilátok proti rota- a koronavírusovým infekciám.

Spôsob prípravy protilátkových diagnostik na detekciu rota- a koronavírusových antigénov v RNGA je nasledovný: získanie suspenzie erytrocytov; fixácia ich akroleínov; tanizácia, ktorá umožňuje získať stabilnú sorpciu požadovaného proteínu na erytrocytoch; senzibilizácia tanizovaných erytrocytov imunoglobulínmi; stanovenie špecificity pripraveného diagnostika. Príprava suspenzie erytrocytov sa uskutočňuje odberom krvi klinicky zdravého barana do banky so sklenenými guľôčkami. Po defibrinácii krvi by sa erytrocyty mali premyť 3-5 krát izotonickým (0,9 %) roztokom chloridu sodného centrifugáciou počas 15-20 minút pri 400 g.

Aby sa červené krvinky stabilizovali, liečia sa akroleínom. Ako viete, jeho pôsobenie je o niečo miernejšie ako formaldehyd a poskytuje stabilitu a ďalšie vysoká aktivita erytrocyty. Na tento účel sa zmiešajú rovnaké objemy 10 % suspenzie erytrocytov s 0,2 % roztokom akroleínu pripraveného vo fosfátovom tlmivom roztoku (PBS) s pH 7,2. Výsledná suspenzia sa udržiava 30 minút pri 37 °C, dôkladne sa premieša, potom sa uvoľní akroleín opakovaným odstreďovaním počas 5 minút pri 600 až 800 g, kým špecifický zápach úplne nezmizne. Výhodou takto pripravených erytrocytov je, že sa zbierajú pre budúcnosť, kan dlho pretrvávajú bez hemolýzy.

Následne sa stabilizované erytrocyty v 10 % koncentrácii udržiavajú pri 2-4 °C v PBS s pH 7,2 počas dvoch mesiacov.

Na zvýšenie sorpčnej kapacity a sedimentácie erytrocytov je potrebné ich tanizovať zmiešaním rovnakých dielov 10% suspenzie premytých erytrocytov a roztoku tanínu v PBS a pH 7,2 v riedení 1:30 000. Zmes sa dôkladne premieša a udržiava sa pri teplote 370 °C počas 15 minút, potom sa erytrocyty dôkladne premyjú od tanínu dvakrát v PBS s pH 7,2 a trikrát izotonickým roztokom chloridu sodného s pH 7,2-7,4.

Optimálny čas na zaručenie príjmu kvalitných erytrocytových diagnostik je ich senzibilizácia do 24-48 hodín po ich ošetrení tanínom.

V procese výroby diagnostických prípravkov sa ako rozpúšťadlo a konzervačná látka používa 0,3% fenolizovaný izotonický roztok chloridu sodného s 0,1% normálnym králičím alebo konským sérom, predtým inaktivovaný pri 56°C počas 30 minút a adsorbovaný normálnymi ovčími erytrocytmi. 37°C na 30 min.

Senzibilizácia tanizovaných erytrocytov by sa mala uskutočniť hyperimúnnym sérom proti rotavírusom a koronavírusom vo veľkom meradle. dobytka(vyrobené v Celoruskom výskumnom ústave experimentálnej veterinárnej medicíny pomenovanom po Ya.R. Kovalenko). Zároveň je senzibilizačná dávka (koncentrácia proteínu) antirotavírusového imunitného séra 280 μg/ml a imunitného séra na koronavírus 260 μg/ml.

Senzibilizácia sa uskutočňuje zmiešaním rovnakých objemov tanizovaných erytrocytov a imunitného séra predhriateho počas 30 minút na 56 °C v optimálnej koncentrácii. Okrem toho sa pridajú 3 diely izotonického roztoku chloridu sodného s pH 7,2 a 5 dielov 0,1 % roztoku chloridu chrómového. Zmes sa za občasného miešania nechá 5 minút pri teplote miestnosti. Po stanovenom čase sa zmes dôkladne premyje PBS s pH 7,2 a potom sa pripravené diagnostické vzorky erytrocytov resuspendujú v konzervačnom prostriedku na koncentráciu 1 %. Pripravené diagnostické činidlo si pri skladovaní pri teplote 4°C zachováva základné vlastnosti 8 mesiacov.

Vo všetkých štádiách výroby diagnostika sa monitoruje autoaglutinácia. Špecifickosť pripravených diagnostík sa zisťuje stagingom RNGA, kde boli ako antigény použité štandardné diagnostická vírusy RTI, PG-3, adenovírusy, vírusové hnačky, ako aj rota- a koronavírusové antigény.

Pri príprave RNHA sa pripravia sériové dvojité riedenia študovaného materiálu obsahujúceho vírus (20-50 % suspenzia vzoriek stolice) a potom sa do každej jamky pridá rovnaký objem erytrocytárneho diagnostica. Platne by sa mali niekoľkokrát dôkladne pretrepať, ponechať pri izbovej teplote, kým sa erytrocyty úplne neusadia v kontrole. Index pozitívna reakcia- aglutinácia erytrocytárneho diagnosticum s intenzitou aglutinácie 2+ v titri 1:4 a viac.

pasívna hemaglutinačná reakcia)

spôsob detekcie a identifikácie antigénov alebo protilátok založený na fenoméne aglutinácie erytrocytov, ku ktorému dochádza v ich prítomnosti, na povrchu ktorých boli predtým adsorbované zodpovedajúce špecifické alebo antigény.

1. Malá lekárska encyklopédia. - M.: Lekárska encyklopédia. 1991-96 2. Najprv zdravotná starostlivosť. - M.: Veľká ruská encyklopédia. 1994 3. Encyklopedický slovník lekárske termíny. - M.: Sovietska encyklopédia. - 1982-1984.

Pozrite sa, čo je „Reakcia nepriamej hemaglutinácie“ v iných slovníkoch:

nepriama hemaglutinačná reakcia- RNGA Laboratórny test s použitím erytrocytových diagnostik. [Anglicko-ruský slovník základných pojmov z vakcinológie a imunizácie. Svetová zdravotnícka organizácia, 2009] Témy vakcinológia, imunizácia Synonymá RNGA EN ... ... Technická príručka prekladateľa

- (RNGA; synonymum pasívnej hemaglutinačnej reakcie) metóda detekcie a identifikácie antigénov alebo protilátok, založená na fenoméne aglutinácie erytrocytov, ku ktorému dochádza v ich prítomnosti, na povrchu ktorých boli predtým adsorbované ... ... Veľký lekársky slovník

- (RPHA) pozri Reakcia nepriamej hemaglutinácie ... Veľký lekársky slovník

Táto stránka je glosár. # A ... Wikipedia

Hlavné skratky akceptované vo veterinárnom encyklopedickom slovníku- a., aa, artena, arteriae aa ana (rovnako) Akadémia lekárskych vied ZSSR lekárske vedy Akadémia vied ZSSR Akadémia vied ZSSR Bac. baktérie bacil. Baktéria BSSR Bieloruská SSR in., vv. storočie, storočie v., vv. vena, venae VASKHNIL Celoúniový rád Lenina a ... ...

Tento výraz má iné významy, pozri Mor. Psia psinka (Kareova choroba), akútna alebo subakútna nákazlivá vírusové ochorenie, prejavuje sa horúčkou, katarom slizníc, kožnými léziami, centrálnym ... ... Wikipedia

- (renes) párový vylučovací a endokrinný orgán, ktorý prostredníctvom funkcie močenia reguluje chemickú homeostázu organizmu. ANATOMOFYZIOLOGICKÝ PREHĽAD Obličky sú umiestnené v retroperitoneálnom priestore (Retroperitoneálny priestor) na ... ... Lekárska encyklopédia

I (trichinelóza; synonymum: trichinelóza, "opuch") helmintiáza zo skupiny nematodóz, charakterizovaná horúčkou, myalgiou, opuchom tváre, kožné vyrážky, krvná eozinofília a pri ťažkej vnútorné orgány a centrálny...... Lekárska encyklopédia

- (nematodózy) helmintiázy spôsobené nematódami triedy Nematoda. Medzi inými helmintiázami majú N. najvyššia hodnota v ľudskej patológii ide väčšinou o geohelmintiázy (pozri Helmintiázy); vývoj ich vajíčok alebo lariev ... ... Lekárska encyklopédia

infekčná epididymitída- Ryža. 1. Zvýšenie ľavého semenníka u barana s infekčnou epididymitídou. Ryža. 1. Zvýšenie ľavého semenníka u barana s infekčnou epididymitídou. epididymitída infekčná ovčia (Epididymitis infectiosa arietum), chronická infekčná ... ... Veterinárny encyklopedický slovník

Pozri Nepriama hemaglutinačná reakcia... Veľký lekársky slovník