Vychádza z toho, že červené krvinky, na ktorých sú predtým adsorbované antigény, získavajú schopnosť aglutinácie v prítomnosti homológnych sér (protilátok).
Červené krvinky v tomto prípade pôsobia ako nosiče so špecifickými determinantami, ktorých aglutinácia nastáva v dôsledku reakcie antigén + protilátka.
Červené krvinky, na ktorých povrchu sú pevne naviazané antigény, sa nazývajú erytrocytárne antigén diagnosticum alebo erytrocyty senzibilizované antigénom.
Ďalší typ RNGA - protilátok sa adsorbuje na povrchu erytrocytov a v prítomnosti homológneho antigénu dochádza k ich následnej aglutinácii. V tomto prípade sa takéto erytrocyty nazývajú erytrocyty protilátka diagnosticum alebo erytrocyty senzibilizované protilátkami.
Na základe týchto dvoch základných metodologických prístupov boli vyvinuté a používané mnohé modifikácie RNGA. Ako nosiče sa teda používajú malé štandardné latexové častice. V tomto prípade sa reakcia nazýva latexová aglutinačná reakcia (RLA) alebo sa používa Staphylococcus aureus- koagulačná reakcia atď. Zvyčajne sa erytrocytové diagnostiky pripravujú v biologických priemyselných podnikoch a hlavné skúsenosti RNGA sa vykonávajú v diagnostických laboratóriách.
Príprava diagnostiky erytrocytov zahŕňa nasledujúce kroky:
- fixácia červených krviniek formaldehydom alebo glutarovými alebo akrylovými aldehydmi. Takto ošetrené červené krvinky sa dlhodobo skladujú. Častejšie sa na tento účel používajú erytrocyty oviec, ľudí, kurčiat atď.;
- ošetrenie fixovaných erytrocytov roztokom tanínu. Výsledkom je, že červené krvinky získavajú schopnosť nevratne adsorbovať proteíny (vírusy a protilátky) na svojom povrchu;
- senzibilizácia tanizovaných erytrocytov vírusmi alebo protilátkami.
Treba poznamenať, že metódy na prípravu diagnostiky erytrocytov pre vírusové infekcie rôzne.
Postup vykonania RNGA na detekciu a stanovenie titra protilátok je nasledujúci:
- rovnaké dávky erytrocytov senzibilizovaných antigénom sa pridajú k postupným 2-násobným riedeniam séra;
- zmes sa nechá 2-3 hodiny pri teplote miestnosti alebo 16-18 hodín pri 4 °C;
- brať do úvahy výsledky. Ak sérum obsahuje protilátky proti vírusu, ktorým boli červené krvinky senzibilizované, pozoruje sa hemaglutinácia, ktorá sa hodnotí krížením.
Titer protilátky v sére sa považuje za najvyššie riedenie séra, ktoré ešte poskytuje hemaglutináciu aspoň dvoma kríženiami.
RNGA sprevádzajú všetky príslušné kontroly. Zvyčajne sa reakcia uskutočňuje pomocou mikrometódy.
RNGA vám umožňuje vyriešiť nasledujúce diagnostické problémy:
- detekovať protilátky a určiť ich titer v krvnom sére pomocou známeho diagnostika antigénu erytrocytov;
- detekovať a identifikovať neznámy vírus pomocou známej diagnostiky protilátok proti erytrocytom.
Výhody RNGA: vysoká citlivosť, jednoduchosť techniky umiestnenia a rýchlosť odozvy. Je však dôležité poznamenať, že veľké ťažkosti vznikajú pri príprave stabilnej diagnostiky erytrocytov (veľká závislosť od čistoty použitých komponentov, nutnosť výberu spôsobu fixácie, tanizácie a senzibilizácie erytrocytov pre každý typ vírusu).
Princíp RTGA spočíva v zmiešaní rovnakých objemov krvného séra a vírusovej suspenzie v skúmavke a po expozícii sa pridaním suspenzie červených krviniek určí, či vírus zostáva v zmesi. Aglutinácia erytrocytov indikuje prítomnosť a neprítomnosť hemaglutinácie indikuje neprítomnosť vírusu v zmesi. Vymiznutie vírusu zo zmesi vírus + sérum sa považuje za znak interakcie medzi sérovými protilátkami a vírusom.
Ale protilátky interagujú s antigénmi v presne definovaných kvantitatívnych pomeroch. Preto, aby bolo určité množstvo vírusu zbavené svojej hemaglutinačnej schopnosti, je potrebné určité minimum protilátok, a keďže jedna zo zložiek RTHA je vždy neznáma, reakcia musí byť zaradená do série skúmavky s rôznymi dávkami protilátok a rovnakými dávkami vírusu, alebo naopak. To sa dosiahne tak, že sa odoberú buď rôzne riedenia séra a rovnaké riedenie vírusu, alebo rôzne riedenia vírusu a rovnaké riedenie séra.
RTGA vám umožňuje vyriešiť nasledujúce problémy: určiť titer protilátok proti hemaglutinačnému vírusu v sére; identifikovať neznámy hemaglutinačný vírus zo známych sér; stanoviť stupeň antigénnej príbuznosti týchto dvoch vírusov.
Výhody RTGA: jednoduchosť techniky, rýchlosť, nie je potrebná sterilná práca, špecifickosť, nízka cena. Nevýhoda: RTGA je možná len s hemaglutinačnými vírusmi.
Princíp titrácie protilátok v RTGA je nasledujúca:
– pripravte sériu postupných (zvyčajne 2-násobných) riedení testovacieho séra v rovnakých objemoch (zvyčajne 0,25 alebo 0,2 ml);
– ku každému riedeniu pridajte rovnaké objemy homológneho vírusu v titri 4 HAE;
– zmesi sa uchovávajú určitý čas pri určitej teplote (pre vírus pseudomoru hydiny 40–60 minút pri izbovej teplote);
– do všetkých zmesí sa pridajú rovnaké objemy 1 % suspenzie premytých erytrocytov;
– po expozícii sa hemaglutinácia v každej zmesi hodnotí krížovo.
Reakcia zahŕňa kontrolu séra, vírusu a červených krviniek.
Najvyššie riedenie séra, ktoré ešte úplne inhibuje hemaglutináciu, sa považuje za indikátor titra protilátok v tomto sére.
Využitie hemadsorpčnej reakcie vo virológii.
RGAd. Hemadsorpciu - spojenie erytrocytov s povrchom buniek postihnutých vírusom - prvýkrát objavili Vogel a Shchelokov (1957) na tkanivovej kultúre infikovanej vírusom chrípky. Tento jav je založený na afinite vírusových receptorov umiestnených na povrchu postihnutej bunky k erytrocytovým receptorom, čo vedie k ich vzájomnej adhézii podobnej hemaglutinačnej reakcii. Výhodou tejto reakcie je, že sa stáva pozitívnou ešte pred objavením sa zreteľných cytopatických zmien v infikovaných bunkách.
Technika RGAd je nasledujúca. Na 3-4 deň po infekcii buniek sa odoberú dve skúmavky s rovnakou bunkovou kultúrou, z ktorých jedna je infikovaná materiálom obsahujúcim vírus a druhá je kontrolná. Kultivačná kvapalina sa vypustí z oboch skúmaviek a do oboch sa pridajú 2–3 kvapky 0,5 % suspenzie premytých erytrocytov. Obe skúmavky sa nechajú 5 až 10 minút, aby boli červené krvinky na povrchu buniek (umiestnené vodorovne na stole), a potom sa zľahka opláchnu fyziologickým roztokom a skúmajú sa pod mikroskopom (malé zväčšenie). V kontrolnej skúmavke sa červené krvinky úplne odstránia soľným roztokom a niektoré zostávajúce plávajú spolu s kvapalinou. Ak červené krvinky v infikovanej skúmavke neboli odstránené fyziologickým roztokom a neplávajú, ale sú pripojené k povrchu buniek, RGAd by sa mal považovať za pozitívny.
V závislosti od vírusu a typu bunky môže byť usporiadanie červených krviniek trojité:
– červené krvinky sa adsorbujú iba pozdĺž okraja bunkovej vrstvy vo forme „náhrdelníka“ (vírus afrického moru ošípaných);
– červené krvinky sa nachádzajú na bunkovej vrstve v ložiskách alebo zhlukoch (vírus chrípky);
– červené krvinky sú umiestnené difúzne na bunkovej vrstve (vírus parainfluenzy).
Každý vírus je schopný adsorbovať červené krvinky určitých druhov zvierat.
Sérologická diagnostika vírusových ochorení zvýšením titra protilátok v párových krvných sérach.
Hemaglutinačná reakcia (HRA) a hemaglutinačná inhibičná reakcia (HIR), mechanizmus, zložky a aplikácia reakcií.
Hemaglutinačná reakcia je založená na fenoméne zlepovania červených krviniek, ku ktorému dochádza pod vplyvom rôzne faktory. Existuje priama a nepriama hemaglutinácia.
Najprv sa červené krvinky premyjú izotonickým roztokom chloridu sodného, potom sa v prípade potreby (pri použití proteínových antigénov) ošetria roztokom tanínu 1:20 000 a senzibilizujú sa rozpustnými antigénmi. Po premytí pufrovaným izotonickým roztokom chloridu sodného je erytrocytový antigén pripravený na použitie.
Testovacie séra sa zriedia izotonickým roztokom chloridu sodného v skúmavkách alebo špeciálnych plastových platniach s jamkami, potom sa do každého riedenia séra pridá erytrocytové diagnosticum. Výsledky reakcie nepriama hemaglutinácia zohľadnené povahou sedimentu červených krviniek vytvoreného na dne skúmavky. Výsledok reakcie, pri ktorom červené krvinky rovnomerne pokrývajú celé dno skúmavky, sa považuje za pozitívny. V prípade negatívnej reakcie sú červené krvinky vo forme malého disku alebo „tlačidla“ umiestnené v strede dna skúmavky
Hlavné zložky RP:
A) rozpustný antigén,
B) Špecifické protilátky (sérum)
(RTGA) je metóda identifikácie vírusu alebo detekcie antivírusových protilátok v krvnom sére pacienta, založená na fenoméne absencie aglutinácie červených krviniek liekom obsahujúcim vírus v prítomnosti krvného séra, ktoré je voči nemu imúnne.
je založená na blokáde, supresii vírusových antigénov imunitnými sérovými protilátkami, v dôsledku čoho vírusy strácajú schopnosť aglutinovať červené krvinky.
RTGA sa používa na diagnostiku mnohých vírusových ochorení, ktorých pôvodcovia (vírusy chrípky, osýpky, rubeola, kliešťová encefalitída atď.) môžu aglutinovať erytrocyty rôznych zvierat.
Mechanizmus. Typizácia vírusu sa uskutočňuje pomocou hemaglutinačnej inhibičnej reakcie (HAI) so sadou typovo špecifických sér. Výsledky reakcie sa berú do úvahy absenciou hemaglutinácie. Podtypy vírusu A s antigénmi H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 atď.
môžu byť diferencované v RTGA so sadou homologických typovo špecifických sér.
V jadre hemaglutinačné reakcie spočíva fenomén adhézie červených krviniek, ku ktorému dochádza pod vplyvom rôznych faktorov.
Existuje priama a nepriama hemaglutinácia.
Pri priamej hemaglutinačnej reakcii sa červené krvinky zlepia, keď sa na ne adsorbujú určité antigény, ako sú vírusy.
V sérologických štúdiách sa používa priama hemaglutinačná inhibičná reakcia, keď sa vírus izolovaný od pacienta neutralizuje špecifickým imunitným sérom a potom sa kombinuje s červenými krvinkami.
Neprítomnosť hemaglutinácie naznačuje konzistenciu vírusu a použitého imunitného séra.
Nepriama hemaglutinačná reakcia (pasívna hemaglutinácia) sa pozoruje v prípadoch, keď sa imunitné sérum alebo sérum pacienta obsahujúce vhodné protilátky pridá k červeným krvinkám, ktoré boli predtým ošetrené (senzibilizované) rôznymi antigénmi.
Dochádza k špecifickému zlepovaniu červených krviniek, ich pasívnej hemaglutinácii.
Nepriama alebo pasívna hemaglutinačná reakcia je lepšia v senzitivite a špecifickosti ako iné sérologické metódy a používa sa pri diagnostike infekcií spôsobených baktériami, rickettsiou a prvokmi.
Spôsob uskutočňovania nepriamej hemaglutinačnej reakcie pozostáva z niekoľkých stupňov.
Najprv sa červené krvinky premyjú izotonickým roztokom chloridu sodného, potom sa v prípade potreby (pri použití proteínových antigénov) ošetria roztokom tanínu 1:20 000 a senzibilizujú sa rozpustnými antigénmi.
Po premytí pufrovaným izotonickým roztokom chloridu sodného je erytrocytový antigén pripravený na použitie. Testovacie séra sa zriedia izotonickým roztokom chloridu sodného v skúmavkách alebo špeciálnych plastových platniach s jamkami, potom sa do každého riedenia séra pridá erytrocytové diagnosticum.
Výsledky nepriamej hemaglutinačnej reakcie sú zohľadnené povahou sedimentu červených krviniek vytvoreného na dne skúmavky. Výsledok reakcie, pri ktorom červené krvinky rovnomerne pokrývajú celé dno skúmavky, sa považuje za pozitívny. Pri negatívnej reakcii sú červené krvinky vo forme malého disku alebo „tlačidla“ umiestnené v strede dna skúmavky.
Reakcia inhibície hemaglutinácie- sérologická reakcia založená na schopnosti protilátok zabrániť aglutinácii erytrocytov hemaglutinačnými typmi vírusov (adenovírusy, arbovírusy, niektoré enterovírusy, vírusy chrípky a parainfluenzy, osýpky, reovírusy).
Špecifické antivírusové protilátky interagujú s povrchovými molekulami hemaglutinínu viriónov týchto vírusov a blokujú ich väzbu na komplementárne molekuly membrány erytrocytov.
IN V poslednej dobe reakcia je široko používaná v laboratóriách klinickej virológie na stanovenie titrov špecifických protilátok proti určitým vírusom, ako aj na sérologickú identifikáciu a typizáciu vírusových izolátov z klinického materiálu od pacientov.
Ich použitie je trochu obmedzené kvôli prítomnosti nešpecifických vírusových inhibítorov v ľudskom krvnom sére, ako aj prirodzených protilátok - aglutinínov.
Neutralizačná reakcia je hemaglutinačná inhibičná reakcia (HAI).
RTGA sa používa:
-na sérotypizáciu vírusov;
- na sérodiagnostiku infekcií.
Existujú dva spôsoby nastavenia:
- metóda kvapkania na sklo ( indikatívna reakcia), ktorý sa používa na sérokopírovanie vírusov;
- expandovaný v skúmavkách.
Mechanizmus.
Niektoré vírusy (napríklad chrípka) majú hemaglutinín, ktorý spôsobuje aglutináciu červených krviniek rôznych zvierat v závislosti od typu vírusu.
V prítomnosti protilátok - antihemaglutinínov - v sére sa pozoruje inhibícia vírusovej aktivity.
RTGA.
Cieľ: sérotypizácia vírusu chrípky A
Komponenty:
1. Skúmaný materiál je alantoická tekutina kuracieho embrya,
2. Diagnostické séra špecifické pre typ chrípky,
3. 5 % suspenzia kuracích erytrocytov.
4.
Fyziologický roztok.
Reakcia sa uskutočňuje na skle kvapkovou metódou. Naneste 1 kvapku diagnostického séra a testovacieho materiálu na sklo, premiešajte a potom pridajte 1 kvapku suspenzie červených krviniek. Pri pozitívnej reakcii sa pozoruje homogénne začervenanie a pri negatívnej reakcii vypadávajú červené vločky (hemaglutinácia).
Predchádzajúci31323334353637383940414243444546Ďalší
Charakteristika vírusov chrípky. Epidemiológia a diagnostika chrípky. Použitie RTGA na sérotypizáciu vírusov chrípky. Prípravky na špecifickú prevenciu a liečbu.
Chrípka alebo chrípka - akút infekcia, charakterizované poškodením slizníc horných dýchacieho traktu, horúčka, všeobecná intoxikácia, narušenie kardiovaskulárneho a nervového systému.
Chrípka je náchylná na šírenie epidémie a pandémie kvôli vysokej nákazlivosti a variabilite patogénu.
Charakteristika patogénov. Patogény - vírusy chrípky patria do čeľade. Orthomyxoviridae, rody Influenzavirus A, B a Influenzavirus C. Vírusy chrípky sú RNA vírusy. Vírus chrípky typu A izolovali v roku 1933 W. Smith, K. Andrews a P. Laidlaw. V roku 1940 T.
Aplikácia metódy hemaglutinácie vo virológii.
Francis a R. Magill izolovali vírusy chrípky typu B, v roku 1949 R. Taylor - typ C. V Rusku boli prvé vírusy chrípky izolované v roku 1936 A. A. Smorodintsevom a klasifikované ako typ A. Morfológia. Vírusy chrípky majú guľovitý tvar (tvar gule) - 80 - 120 nm, menej často majú vláknitý tvar. Pozostáva z: 1) jadro - nukleokapsida helikálneho typu symetrie (jednovláknové lineárne „-“ vlákno RNA + proteínová kapsida); 2) bazálnej membrány- vonkajšia lipoproteínová membrána - superkapsida.
Na povrchu škrupiny sú glykoproteíny (vo forme hrotov a klkov) 2 typov: 1) hemaglutinín - podporuje pripojenie k bunkovým receptorom; 2) neuraminidáza – podporuje uvoľňovanie vírusu z bunky. Kultivácia. Na kultiváciu sa používajú kuracie embryá, primárne trypsinizované bunkové kultúry a niekedy laboratórne zvieratá.
Najvhodnejším modelom sú kuracie embryá 10-12 - dni veku. Umožňuje vám získať veľké množstvo vírusu, ktorý je potrebný pri výrobe vakcín a antibakteriálnych liekov.
Infekcia sa prenáša do alontoickej dutiny, do chorion-allontoickej membrány, do amniovej dutiny, do amniónu. Prítomnosť vírusu v kuracom embryu sa zisťuje pomocou hemaglutinačnej reakcie. Antigénna štruktúra. Vírusy majú vnútorný antigén - S a povrchové antigény: HA-hemaglutinín a NA-neuraminidázu. S-antigén je skupinovo špecifický, spoločný pre celý typ, podľa tohto antigénu sa chrípkové vírusy delia na typy A, B a C. Ide o komplement fixujúci, stabilný (nemenný) antigén.
HA a NA antigény sú špecifické antigény. Antigén HA spôsobuje tvorbu protilátok neutralizujúcich vírus a adhéziu červených krviniek.
Antigén NA spôsobuje tvorbu protilátok, ktoré čiastočne neutralizujú vírusy.
Vírus typu B je menej variabilný, zatiaľ čo typ C je vysoko stabilný.
Toxické vlastnosti. Toxický účinok vírusu na organizmus ( bolesť hlavy, bolesť svalov, horúčka, katarálne príznaky) je spôsobená vírusovými proteínmi (samotná vírusová častica). Tento účinok je prísne špecifický a je neutralizovaný iba imunitným sérom vhodného typu alebo podtypu alebo sérom tých, ktorí sa z choroby zotavili. Odpor. Vírusy chrípky sú citlivé na UV žiarenie, dezinfekčné prostriedky (formalín, alkohol, fenol, chloramín) a rozpúšťadlá tukov.
V kvapalnom prostredí hynú pri teplote 50 - 60°C niekoľko minút. Pri izbovej teplote na vzduchu si vírusy zachovávajú infekčné vlastnosti niekoľko hodín. Sušené dlho vydržia a zmrazené (-70°C) nielen dlho vydržia, ale nestrácajú ani virulenciu.
Vnímavosť zvierat. V prirodzených podmienkach vírusy typu A infikujú ľudí a zvieratá (postihnuté sú kone a ošípané), zatiaľ čo vírusy typu B a C infikujú iba ľudí. Z laboratórnych zvierat sú na vírusy citlivé biele myši, africké fretky, sýrske škrečky a opice.
Ochorenie zvierat je charakterizované poškodením pľúc, horúčkovitým stavom a môže mať za následok smrť zvierat. Epidemiológia choroby. Zdrojom infekcie je chorý človek s klinicky výraznou alebo asymptomatickou formou. Chorý človek uvoľní vírus do životné prostredie pri kašli, rozprávaní, kýchaní kvapkami slín, hlienu, hlienu už v inkubačnej dobe.
Pacient sa stáva infekčným 24 hodín pred nástupom hlavných príznakov a predstavuje epidemické nebezpečenstvo do 48 hodín po ich vymiznutí.
Prenosový mechanizmus je aerogénny. Cesta prenosu je vzduchom. Náchylnosť ľudí na chrípku je veľmi vysoká. Každý ochorie vekových skupín, hlavne v zimný čas. Najnáchylnejšie sú deti a starší ľudia. Názov choroby odráža zvláštnosti epidemiológie: chrípka z francúzštiny. chápadlo - chvat, chrípka - z taliančiny. Influenza di freddo - vplyv prechladnutia.
Zo všetkých pikantných ochorenia dýchacích ciest chrípka je najrozšírenejšia a závažné ochorenie. Pandémie a epidémie chrípky pokrývajú až 30 – 50 % alebo viac populácie zemegule, čo spôsobuje obrovské škody na zdraví a ekonomike krajín. Prvé popisy epidémií chrípky pochádzajú z 12.-14. storočia. Výskyt pandémií a veľkých epidémií je spôsobený vírusom chrípky typu A, ktorý je spôsobený vysokou variabilitou vírusu a je spojený so vznikom nového podtypu v dôsledku posunu antigénu.
Medzi pandémiami sa každé 1,5-2 roky vyskytujú epidémie, čo je spojené s antigénnym driftom vírusov. V roku 1918 pandémiu španielskej chrípky (ochorelo 1,5 miliardy ľudí, zomrelo 20 miliónov ľudí) spôsobil vírus chrípky A1. Táto pandémia bola pôvodne zaregistrovaná v Španielsku a zasiahla takmer celú populáciu Zeme; ochorenie bolo charakterizované rozvojom extrémne ťažkej hemoragickej pneumónie s rekordnou úmrtnosťou (až 1 % všetkých prípadov).
V roku 1957 bola „ázijská“ pandémia (2 miliardy ľudí ochoreli) spôsobená novým podtypom - podtypom A2. V roku 1968 bola pandémia „Hong Kong“ (ochorela 1 miliarda ľudí) spôsobená novo vznikajúcim podtypom – podtypom A3. zvyčajne nová možnosť vírus vytesňuje predtým cirkulujúci variant z ľudskej populácie.
Ale v roku 1977, po 20-ročnej prestávke, sa typ A1 nečakane „vrátil“, čo viedlo k veľkej epidémii. V dôsledku toho vytlačené varianty vírusu chrípky pretrvávajú a v určitých intervaloch môžu opäť spôsobiť epidémiu. Vírus typu B spôsobuje lokálne epidémie, ale typ C nespôsobuje epidémie. Patogenéza a klinický obraz choroby. Vstupnou bránou sú horné dýchacie cesty. Vírus napáda epiteliálne bunky sliznice a množí sa v nich.
Vplyv vírusu na epitelové bunky spôsobuje ich nekrózu a deskvamáciu (odvrhnutie) epitelu, v dôsledku čoho sa sliznica stáva priepustnou pre vírusy a baktérie. Prenikajú do krvi a šíria sa po tele.“ Virémia je sprevádzaná mnohopočetnými léziami endotelu kapilár so zvýšením ich permeability.
IN ťažké prípady V pľúcach, myokarde a parenchýmových orgánoch sa pozorujú rozsiahle krvácania. Produkty rozpadu poškodených buniek a vírusové proteíny majú toxický účinok na rôznych orgánoch a orgánových systémoch. Toxíny vírusu silne tlmia centrálny nervový systém, a hoci proces netrvá dlho (3 - 5 dní), chorý človek zostáva dlhodobo oslabený a k oslabenému organizmu sa pripojí sekundárna infekcia a vznikajú komplikácie: chrípkový zápal pľúc , akútny pľúcny edém, poškodenie obličiek, srdca, priedušiek.
Častou komplikáciou chrípky je bakteriálny zápal pľúc(streptokoky skupiny B). Počas pandémie španielskej chrípky ľudia zomierali najmä na sekundárny bakteriálny zápal pľúc.
V patogenéze chrípky je dôležitá nielen intoxikácia, ale aj alergizácia, ako aj porušenie funkčných vlastností imunokompetentných buniek s rozvojom imunodeficiencie. Inkubačná doba- niekoľko hodín - 1-3 dni. Charakterizovaný akútnym nástupom, zvýšením teploty na 37,5 - 38 ° C, všeobecná intoxikácia, vyjadrené v malátnosti, bolesti hlavy, bolesti v očné buľvy, zápalové procesy dýchacieho traktu rôznej závažnosti (rinitída, laryngitída, tracheitída, faryngitída).
Febrilný stav chrípky bez komplikácií trvá 5-6 dní. Imunita. Po ochorení sa vytvára typovo a kmeňovo špecifická imunita, ktorú zabezpečujú špecifické a nešpecifické bunkové a humorálne faktory. Veľký význam majú protilátky Ig A. Krížová imunita sa nevyvíja, po prekonaní chrípky typu A1 môžete dostať chrípku typu A2 atď. Po víruse typu B trvá imunita 1-2 roky, po víruse typu B - 3-5 rokov.
Pasívna prirodzená imunita - u detí do 8 - 11 mesiacov. Vzhľadom na vysokú antigénnu variabilitu vírusu zotavenie nevedie k vytvoreniu stabilnej imunity voči opakovaným infekciám.
Laboratórna diagnostika. Sledovaný materiál: šmuhy-odtlačky zo sliznice nosovej dutiny, výtok z nosohltanu, kúsky pľúc, mozog v prípade smrti.
Diagnostické metódy: 1) metóda cytorinoskopie - detekcia intracelulárnych inklúzií špecifických pre vírus - pri farbení pyoktanínom pod mikroskopom sú v bunkách ciliárneho epitelu viditeľné jasne červené inklúzie vírusu chrípky; 2) virologická metóda— izolácia vírusu chrípky z ľudského tela infikovaním kuracích embryí výtermi z nosohltanu pacienta; indikácia (prítomnosť) vírusu sa vykonáva pomocou RGA (vírusy chrípky aglutinujú erytrocyty ľudí a rôznych zvierat), identifikácia vírusu sa uskutočňuje v etapách: typ sa určuje v RSC, subtyp hemaglutinínu sa určuje v RGA a podtyp neuraminidázy sa určuje v reakcii inhibície aktivity enzýmu; 3) sérologická metóda - detekcia zvýšenia titra (4-krát) špecifických protilátok v krvnom sére pacienta pomocou RSK, RTGA, RN v bunkovej kultúre, precipitačná reakcia v géli, ELISA; 4) biologická metóda— intranazálna infekcia myší — injekcia materiálu do pľúc pod éterová anestézia; myši uhynú po 2 - 3 dňoch v dôsledku zápalu pľúc; 5) rýchla diagnostika - detekcia vírusového antigénu pomocou RIF.
Liečba a prevencia.
Na prevenciu a liečbu v prvých dňoch ochorenia sa používa ľudský leukocytový interferón (intranazálne). IN liečebné účely použitie antivírusové lieky- remantadín (chrípka typu A), adapromín, virazol a imunomodulačné lieky - dibazol, prodigiosan, levamizol.
Pri ťažkej chrípke, najmä u detí, sa používa darcovský protichrípkový imunoglobulín a tiež lieky - inhibítory bunkových proteáz (Gordox, Contrical, kyselina aminokaprónová).
Špeciálna prevencia. Používajú sa nasledujúce antivírusové lieky a imunomodulátory, ako aj vakcíny - živé a inaktivované: 1) živé monovakcíny na perorálne použitie - oslabené kmene vírusov, ktoré v súčasnosti cirkulujú (A1, A3 a B); vykazujú najväčšiu imunogenicitu; 2) celoviriónové vakcíny z virulentných kmeňov inaktivovaných formaldehydom alebo UV lúčmi; 3) podjednotkové chrípkové vakcíny len z povrchových antigénov - HA a NA antigénov (majú minimálnu reaktogenitu).
Na získanie vakcín sa vírusy kultivujú v kuracích embryách a v bunkových kultúrach kuracích embryí.
Pri podávaní vakcín sa vytvára lokálna a humorálna imunita. Očkovanie sa vykonáva v obdobiach najväčšieho rizika epidémií. Väčšinou je indikovaný mladším a starším ľuďom. Použitie usmrtených vakcín vyžaduje každoročné preočkovanie; ich účinnosť nepresahuje 60 - 70%.
Pretože Antigénne variácie patogénu sa často pozorujú, potom sa súbor antigénov zodpovedajúceho vírusu na imunizáciu môže určiť až po začiatku prepuknutia choroby.
Vstupenka 15.
Hemaglutinačná reakcia (HRA).
V laboratóriu sa využívajú dve hemaglutinačné reakcie s rôznym mechanizmom účinku.
Prvá RGA je sérologická. Pri tejto reakcii dochádza k aglutinácii červených krviniek pri interakcii s vhodnými protilátkami (hemaglutiníny).
Reakcia sa široko používa na stanovenie krvných skupín.
Druhá RGA nie je sérologická. V ňom adhézia červených krviniek nie je spôsobená o
protilátky, ale špeciálne látky tvorené vírusmi. Napríklad vírus chrípky aglutinuje kuracie červené krvinky a morčatá, vírus detskej obrny – ovčie červené krvinky. Táto reakcia umožňuje posúdiť prítomnosť konkrétneho vírusu v skúmanom materiáli.
Reakcia sa uskutočňuje v skúmavkách alebo na špeciálnych platniach s jamkami.
Materiál testovaný na prítomnosť vírusu sa zriedi izotonickým roztokom od 1:10 do 1:1280; 0,5 ml každého riedenia sa zmieša s rovnakým objemom 1-2% suspenzie červených krviniek. Pri kontrole sa zmieša 0,5 ml erytrocytov s 0,5 ml izotonického roztoku. Skúmavky sa umiestnia do termostatu na 30 minút a doštičky sa nechajú pri teplote miestnosti 45 minút.
Účtovanie výsledkov. Ak je reakcia pozitívna, na dne skúmavky alebo jamky sa objaví sediment červených krviniek s vrúbkovanými okrajmi („dáždnik“), ktorý pokrýva celé dno jamky.
Reakcia inhibície hemaglutinácie
Ak je výsledok negatívny, červené krvinky vytvoria hustý sediment s hladkými okrajmi („tlačidlo“). Rovnaký sediment by mal byť v kontrole.
Intenzita reakcie je vyjadrená znamienkami „+“. Vírusový titer je maximálne zriedenie materiálu, v ktorom dochádza k aglutinácii.
Reakcia inhibície hemaglutinácie
Ide o sérologickú reakciu, pri ktorej špecifické antivírusové protilátky v interakcii s vírusom (antigénom) ho neutralizujú a zbavujú ho schopnosti aglutinovať červené krvinky, t.j.
inhibovať hemaglutinačnú reakciu. Táto reakcia vám umožňuje určiť typ a typ vírusov.
Nastavenie reakcie. 0,25 ml antivírusové sérum zmiešané s rovnakým objemom materiálu obsahujúceho vírus. Zmes sa pretrepe a umiestni sa do termostatu na 30 minút, potom sa pridá 0,5 ml 1-2% suspenzie červených krviniek.
Účtovanie výsledkov. Ak je experiment vykonaný správne, v kontrole séra a erytrocytov by sa malo vytvoriť „tlačidlo“ - neexistuje žiadny faktor aglutinujúci erytrocyty; pri kontrole antigénu sa vytvorí „dáždnik“ - vírus spôsobil aglutináciu červených krviniek.
Ak je sérum homológne so skúmaným vírusom, vytvorí sa „tlačidlo“ - sérum neutralizuje vírus.
Nepriama hemaglutinačná reakcia
Nepriama (pasívna) hemaglutinačná reakcia (RIHA) je založená na skutočnosti, že červené krvinky, ak je na ich povrchu adsorbovaný rozpustný antigén, získavajú schopnosť aglutinácie pri interakcii s protilátkami proti adsorbovanému antigénu.
Nastavenie reakcie.
Sérum sa zahrieva 30 minút na 56 °C, zriedi sa postupne v pomere 1:10 - 1:1280 a naleje sa do 0,25 ml do skúmaviek alebo jamiek, kde sa potom nakvapkajú 2 kvapky červených krviniek s adsorbovanými antigénmi. pridané.
Ovládanie: suspenzia erytrocytov s na nich adsorbovanými antigénmi s evidentne imúnnym sérom, suspenzia erytrocytov s na nich adsorbovanými antigénmi s normálnym sérom; suspenzia normálnych červených krviniek s testovacím sérom.
Pri prvej kontrole by malo dôjsť k aglutinácii, pri druhej a tretej by k nej nemalo dôjsť.
1. Čo naznačuje pozitívny výsledok röntgenovej analýzy medzi červenými krvinkami a materiálom, ktorý sa testuje na prítomnosť vírusu?
2. Vyskytne sa aglutinačná reakcia červených krviniek, ak sa k nim pridá vírus a jemu zodpovedajúce sérum?
Ako sa volá reakcia, ktorá odhaľuje tento jav?
PRAKTICKÁ PRÁCA č.12.
Reakcia fixácie komplementu.
Reakcia fixácie komplementu (FFR) je založená na skutočnosti, že špecifický komplex antigén-protilátka vždy adsorbuje (viaže) komplement na seba.
Táto reakcia je široko používaná pri identifikácii antigénov a sérodiagnostike infekcií, najmä chorôb spôsobených spirochétami (Wassermannova reakcia), rickettsiou a vírusmi.
RKS je komplexná sérologická reakcia.
Zahŕňa komplement a dva systémy antigén-protilátka. V podstate ide o dve sérologické reakcie.
Pravý hlavný systém pozostáva z antigénu a protilátky (jeden je známy, druhý nie). Pridáva sa k nemu určité množstvo komplementu. Ak sa antigén a protilátka tohto systému zhodujú, spoja sa a spoja kompliment. Výsledný komplex je jemne rozptýlený a nie je viditeľný.
Tvorba tohto komplexu sa zisťuje pomocou druhého hemolytického alebo indikátorového systému.
Zahŕňa ovčie červené krvinky (antigén) a príslušné hemolytické sérum (protilátka), t.j. hotový imunitný komplex. V tomto systéme môže k lýze červených krviniek dôjsť len v prítomnosti komplementu. Ak je komplement viazaný prvým systémom, tak v druhom systéme nedôjde k hemolýze, pretože
žiadny voľný doplnok. Neprítomnosť hemolýzy (obsah skúmavky je zakalený alebo je na dne sediment erytrocytov) sa zaznamená ako pozitívny výsledok RSC.
Ak v prvom systéme antigén nezodpovedá protilátke, potom sa imunitný komplex nevytvorí a komplement zostane voľný. Kompliment, ktorý zostáva voľný, sa podieľa na druhom systéme, čo spôsobuje hemolýzu, výsledok RSC je negatívny (obsah skúmaviek je priehľadný - „lakovaná krv“).
Komponenty, reakcie fixácie komplementu:
Antigén - zvyčajne lyzát, extrakt, haptén,
menej často suspenzia mikroorganizmov.
2. Protilátka – sérum pacienta.
3. Doplnok - morčacie sérum.
Antigén - ovčie červené krvinky.
5. Protilátka - hemolyzín na ovčie erytrocyty.
6. Izotonický roztok.
Vzhľadom na to, že sa RSK zúčastňuje veľké množstvo zložité komponenty,
musia sa najprv titrovať a vniesť do reakcie v presných množstvách a v rovnakých objemoch: 0,5 alebo 0,25, menej často 0,2, 1,25 alebo 1,0 ml (väčšie objemy poskytujú presnejší výsledok). Titrácia reakčných zložiek sa uskutočňuje v rovnakom objeme ako experiment, pričom chýbajúce zložky sa nahradia izotonickým roztokom.
Súvisiace informácie:
Hľadať na stránke:
Vychádza z toho, že červené krvinky, na ktorých sú predtým adsorbované antigény, získavajú schopnosť aglutinácie v prítomnosti homológnych sér (protilátok).
Červené krvinky v tomto prípade pôsobia ako nosiče so špecifickými determinantami, ktorých aglutinácia nastáva v dôsledku reakcie antigén + protilátka.
Červené krvinky, na ktorých povrchu sú pevne naviazané antigény, sa nazývajú erytrocytárne antigén diagnosticum alebo erytrocyty senzibilizované antigénom.
Ďalší typ RNGA - protilátok sa adsorbuje na povrchu erytrocytov a v prítomnosti homológneho antigénu dochádza k ich následnej aglutinácii.
V tomto prípade sa takéto erytrocyty nazývajú erytrocyty protilátka diagnosticum alebo erytrocyty senzibilizované protilátkami.
Na základe týchto dvoch základných metodologických prístupov boli vyvinuté a používané mnohé modifikácie RNGA. Ako nosiče sa teda používajú malé štandardné latexové častice.
Hemaglutinačná inhibičná reakcia (HAI)
V tomto prípade sa reakcia nazýva latexová aglutinačná reakcia (RLA) alebo sa používa Staphylococcus aureus - koagulačná reakcia atď. Diagnostika erytrocytov sa zvyčajne pripravuje v biologických priemyselných podnikoch a hlavné skúsenosti RNGA sa vykonávajú v diagnostických laboratóriách.
Príprava diagnostiky erytrocytov zahŕňa nasledujúce kroky:
- fixácia červených krviniek formaldehydom alebo glutarovými alebo akrylovými aldehydmi.
Takto ošetrené červené krvinky sa dlhodobo skladujú. Častejšie sa na tento účel používajú erytrocyty oviec, ľudí, kurčiat atď.;
- ošetrenie fixovaných erytrocytov roztokom tanínu. Výsledkom je, že červené krvinky získavajú schopnosť nevratne adsorbovať proteíny (vírusy a protilátky) na svojom povrchu;
- senzibilizácia tanizovaných erytrocytov vírusmi alebo protilátkami.
Treba poznamenať, že metódy prípravy diagnostiky erytrocytov na vírusové infekcie sú odlišné.
Postup vykonania RNGA na detekciu a stanovenie titra protilátok je nasledujúci:
- rovnaké dávky erytrocytov senzibilizovaných antigénom sa pridajú k postupným 2-násobným riedeniam séra;
- zmes sa nechá 2-3 hodiny pri teplote miestnosti alebo 16-18 hodín pri 4 °C;
- brať do úvahy výsledky.
Ak sérum obsahuje protilátky proti vírusu, ktorým boli červené krvinky senzibilizované, pozoruje sa hemaglutinácia, ktorá sa hodnotí krížením.
Titer protilátky v sére sa považuje za najvyššie riedenie séra, ktoré ešte poskytuje hemaglutináciu aspoň dvoma kríženiami.
RNGA sprevádzajú všetky príslušné kontroly. Zvyčajne sa reakcia uskutočňuje pomocou mikrometódy.
RNGA vám umožňuje vyriešiť nasledujúce diagnostické problémy:
- detekovať protilátky a určiť ich titer v krvnom sére pomocou známeho diagnostika antigénu erytrocytov;
- detekovať a identifikovať neznámy vírus pomocou známej diagnostiky protilátok proti erytrocytom.
Výhody RNGA: vysoká citlivosť, jednoduchosť techniky umiestnenia a rýchlosť odozvy.
Je však dôležité poznamenať, že veľké ťažkosti vznikajú pri príprave stabilnej diagnostiky erytrocytov (veľká závislosť od čistoty použitých komponentov, nutnosť výberu spôsobu fixácie, tanizácie a senzibilizácie erytrocytov pre každý typ vírusu).
Ak nájdete chybu, vyberte časť textu a stlačte Ctrl+Enter.
V kontakte s
Spolužiaci
Využíva červené krvinky alebo neutrálne syntetické materiály (napríklad latexové častice), na ktorých povrchu sa sorbujú antigény (bakteriálne, vírusové, tkanivové) alebo protilátky.
K ich aglutinácii dochádza po pridaní vhodných sér alebo antigénov. Červené krvinky senzibilizované antigénmi sa nazývajú antigénne erytrocytové diagnosticum a používajú sa na detekciu a titráciu protilátok. Erytrocyty senzibilizované protilátkami. sa nazývajú imunoglobulínové erytrocytové diagnosticum a používajú sa na detekciu antigénov.
Pasívna hemaglutinačná reakcia sa používa na diagnostiku chorôb spôsobených baktériami (týfus a paratýfus, úplavica, brucelóza, mor, cholera atď.), prvokmi (malária) a vírusmi (chrípka, adenovírusové infekcie, vírusová hepatitída B, osýpky, kliešťová encefalitída, Krymská hemoragická horúčka atď.), ako aj na stanovenie niektorých hormónov, identifikáciu precitlivenosť trpezlivý lieky a hormóny ako penicilín a inzulín.
Pasívna hemaglutinačná reakcia (RPHA).
Pasívny hemaglutinačný test je citlivá metóda sérologickej diagnostiky a používa sa na včasnú aj retrospektívnu diagnostiku, ako aj na zistenie imunopogického stavu očkovaných jedincov. U pacientov s tularémiou sa protilátky zvyčajne detegujú na konci 1. alebo 2. týždňa ochorenia, po 1-1,5 mesiaci dosahujú titre RPHA maximálne hladiny (1: 100 000-1: 20 000, menej často vyššie), potom pokles na úroveň 1:100-1:200 sú uložené na dlhú dobu.
U očkovaných ľudí sa protilátky tiež neustále zisťujú, avšak v nižších titroch nepresahujúcich 1:2000-1:5000 1-1,5 mesiaca po očkovaní a zostávajú niekoľko rokov na nízkej úrovni 1:20-1:80.
Antigén na stanovenie štádia RPHA je tularemia erythrocyte diagnosticum (antigénny).
Liečivo je formalinizované ovčie červené krvinky, senzibilizované antigénom tularémie, dostupné v tekutej a suchej forme. Kvapalný prípravok - 10% suspenzia červených krviniek v roztoku formaldehydu s koncentráciou 10%. Suchý lyofilizovaný prípravok je vákuovo sušená 10% suspenzia červených krviniek bez konzervačnej látky. Pred použitím sa zriedi podľa pokynov na etikete. Na uskutočnenie reakcie v polystyrénových platniach sa obidve liečivá používajú v koncentrácii 2,5% a pri uskutočňovaní reakcie v mikroobjemoch - pri koncentrácii 0,5%.
Technika nastavenia RPGA.
Testovacie séra sa zriedia soľný roztok 1:5 (1:10) a zahrievaná na 56 stupňov C počas 30 minút.
Hemaglutinačná reakcia (HRA) a
Potom, aby sa odstránili heterogénne protilátky proti ovčím erytrocytom, sa séra ošetria 50 % suspenziou formalinizovaných ovčích erytrocytov. Za týmto účelom pridajte červené krvinky rýchlosťou 2 kvapky (0,05 ml) na 1 ml séra a dôkladne premiešajte pretrepávaním.
Sérum sa nechá, kým sa erytrocyty úplne neusadia, alebo sa po jednej hodine pri izbovej teplote odstredí, potom je pripravené na vyšetrenie.
Riediaca kvapalina sa naleje v objeme 0,5 ml do radu jamiek na polystyrénovej platni.
Počas predbežnej štúdie sér sa odporúča otestovať ich umiestnením reakcie v krátkom rade platne (6 jamiek). Ak sa protilátky detegujú v krátkej sérii, séra sa znovu testujú v dlhej sérii riedení (12 jamiek).
Po rozliatí riediacej kvapaliny pridajte 0,5 ml testovacích sér v riedení 1:5 do prvej jamky každého radu (krátke alebo dlhé). Potom sa rovnaké objemy séra titrujú dvojnásobným riedením. Takto sa získajú riedenia séra v krátkych sériách od 1:10 do 1:320 a v dlhých sériách od 1:10 do 1:20480. Po titrácii séra sa do každej jamky pridá jedna kvapka (0,05 ml) pracovnej 2,5 % suspenzie senzibilizovaných erytrocytov.
Obsah platní sa dôkladne pretrepe, kým sa nezíska homogénna suspenzia. Doštičky sa nechajú pri izbovej teplote na stacionárnom povrchu stola. Predbežný záznam reakcie sa uskutoční po 2 až 3 hodinách, konečné stanovenie titra sa uskutoční po úplnej sedimentácii červených krviniek v jamkách. Pre reakciu sú poskytnuté nasledujúce kontroly: 1) testovacie sérum zriedené 1:10 v objeme 0,5 ml + 1 kvapka 2,5 % suspenzie nesenzibilizovaných erytrocytov; 2) riediaca kvapalina v objeme 0,5 ml + 1 kvapka 2,5 % suspenzie nesenzibilizovaných erytrocytov; 3) riediaca kvapalina v objeme 0,5 ml + 1 kvapka 2,5 % suspenzie senzibilizovaných erytrocytov.
Všetky kontroly by mali mať jasne negatívnu reakciu.
Účtovanie a posudzovanie RPGA. Reakcia sa hodnotí podľa nasledujúcej schémy:
1) ostro pozitívna reakcia (++++) - červené krvinky padajú na dno otvoru v rovnomernej vrstve vo forme „dáždnika“, ktorý má často vrúbkované roztavenie okrajov;
2) pozitívna reakcia (+++) - červené krvinky pokrývajú aspoň 2/3 dna jamky;
3) slabo pozitívna reakcia (++) - aglutinát je malý a nachádza sa v samom strede jamky;
4) pochybná reakcia (+) - okolo sedimentu erytrocytov v samom strede jamky sú jednotlivé zrnká aglutinátu;
5) negatívny (-) - na dne otvoru sa červené krvinky usadzujú vo forme „tlačidla“ alebo malého krúžku s hladkými, ostro ohraničenými okrajmi.
Sérový titer sa berie do úvahy na základe posledného riedenia séra, ktoré poskytlo veľmi jasnú reakciu (najmenej tri plusy).
Za diagnostický titer sa považuje riedenie 1:100 alebo vyššie, avšak rovnako ako v prípade RA je potrebné sledovať jeho zvýšenie.
RPHA pre tularémiu je dosť špecifický a deteguje niektoré skrížené reakcie len so sérami na brucelózu. Odlišná diagnóza možno výškou titrov v RPGA, ktoré sú výrazne vyššie s homológnym antigénom.
Technika nastavenia RPHA v mikroobjemoch.
RPGA je možné vykonávať v mikroobjemoch pomocou mikrotitrátora typu Takachi (alebo mikroplatničiek s okrúhlym dnom s mikropipetami), ktorý umožňuje titráciu materiálu v objemoch 25 μl a 50 μl. Reakčná technika a postupnosť všetkých operácií sú rovnaké ako pri štúdiu v polystyrénových platniach. Treba však mať na pamäti, že citlivosť mikrometódy je zvyčajne jedno riedenie (t.j.
2 krát) nižšia ako makrometóda.
Na nastavenie reakcie v mikrotitrátore sa do každej jamky pridá riediaca kvapalina v objeme 50 μl pomocou kvapkadla pipety. Potom sa pomocou titrátorov s 50 μl hlavicou odoberie testovacie sérum ponorením hlavice do nej.
Uistite sa, že kvapalina naplnila hlavu titrátora. Titrátor so sérom sa prenesie do prvej jamky a niekoľko, pričom sa drží vo vertikálnej polohe rotačné pohyby spiatočná cesta. Potom sa titrátor prenesie do ďalšej jamky a manipulácia sa zopakuje. Titrácia sa môže uskutočniť súčasne v niekoľkých radoch. Po titrácii celej série sa titrátor rotačnými pohybmi premyje destilovanou vodou (výmena 2 dávok), voda sa z hlavy odstráni pomocou tampónu a spáli sa na plameni horáka.
Po titrácii pridajte do jamiek 25 μl diagnostickej tekutiny pre erytrocyty.
Koncentrácia diagnostica pre RPHA v mikroobjemoch by mala byť 0,5 % (t.j. 2,5 % suspenzia červených krviniek sa dodatočne zriedi 5-krát). Po pridaní červených krviniek je potrebné doštičky mierne pretrepať, kým sa nezíska homogénna suspenzia. Výsledky je možné zaznamenať v priebehu 1-1,5 hodiny, čo je významná výhoda RPGA v mikrotitraci.
Okrem toho táto technika vyžaduje malé množstvá všetkých reakčných zložiek a testovacích sér.
Reakcia sa berie do úvahy podľa nasledujúcej schémy:
1) „+“ – úplná hemaglutinácia, pri ktorej červené krvinky padajú na dno jamky v rovnomernej vrstve vo forme „dáždnika“, ktorý zaberá najmenej 2/3 dna;
2) „+-“ - čiastočná hemaglutinácia, pri ktorej červené krvinky padajú na dno vo forme voľného prstenca malej veľkosti;
3) „-“ – absencia hemaglutinácie, keď červené krvinky padajú na dno vo forme malého gombíka alebo krúžku s hladkým okrajom.
Špecifickosť pozitívny výsledok, získané v RPHA, je možné testovať pomocou trojzložkovej reakcie – reakcie inhibície pasívnej hemaglutinácie (RPHA).
Technika nastavenia RTPGA.
Táto reakcia sa používa na potvrdenie špecifickosti pozitívneho výsledku RPGA v prípade pochybností alebo mimoriadneho epidemiologického záujmu. Mechanizmus reakcie je špecifická inhibícia hemaglutinácie, keď sa do testovacieho séra pridá suspenzia usmrtených baktérií tularémie. V reakcii interagujú tri zložky: testované sérum, špecifický antigén tularémie a antigénne erytrocytárne diagnosticum RTPHA sa zvyčajne umiestni do radu 7-8 jamiek.
Odporúča sa nainštalovať opakované RPGA paralelne s RTPGA. Do dvoch radov jamiek sa naleje 0,25 ml riediacej kvapaliny, potom sa do prvých jamiek oboch radov pridá testovacie sérum v objeme 0,25 ml a vykoná sa titrácia. Získajú sa dva rovnaké rady riedení séra. Do všetkých jamiek druhého radu pridajte 0,25 ml riediacej kvapaliny a do jamiek prvého radu 0,25 ml suspenzie baktérií tularémie.
Používa sa Tularemia diagnosticum (obsahuje 25 miliárd baktérií tularémie v 1 ml), predtým zriedená 50-krát.
Táto suspenzia obsahuje 500 miliónov baktérií v 1 ml alebo 125 miliónov v objeme 0,25 ml. Po pridaní antigénu sa doštička nechá 1 hodinu pri teplote miestnosti, potom sa do všetkých jamiek oboch radov pridá jedna kvapka (0,05 ml) erytrocytárneho diagnosticum, doštička sa pretrepe a nechá sa na rovnom povrchu stola.
Účtovanie sa vykonáva po 2-3 hodinách.
Účtovanie a posudzovanie RTPGA. Ak testovacie sérum obsahuje špecifické protilátky proti tularémii, sú neutralizované pridaným antigénom a v prvom rade jamiek nedôjde k hemaglutinácii, alebo pri vysokom titri séra bude hemaglutinácia pozorovaná v menšom (2-4) počte jamky ako v rade s RPHA. V tomto prípade sa potvrdila špecifickosť výsledkov.
Ak je hemaglutinácia zaznamenaná v oboch radoch, t.j. Ak sa výsledky RTPGA a RPGA zhodujú, znamená to neprítomnosť protilátok proti tularémii v testovacom sére. V tomto prípade sa primárny výsledok RPGA považuje za nešpecifický.
Technika inscenovania RTHG v mikroobjemoch. RTPGA, podobne ako RPGA, sa môže uskutočňovať v mikroobjemoch pomocou mikrotitra typu Takachi.
Za týmto účelom pridajte 0,25 μl riediacej kvapaliny do jamiek mikrodoštičiek v dvoch radoch po 7 – 8 jamiek. Potom sa pomocou titrátora pridá 0,25 μl testovacieho séra a titruje sa v oboch radoch. Potom sa do každej jamky v prvom rade pridá 25 μl antigénu tularémie (ktorého koncentrácia je 500 miliónov baktérií tularémie v 1 ml) a do druhého radu sa pridá 25 μl riediacej kvapaliny.
Doštičky sa nechajú 1 hodinu pri teplote miestnosti, potom sa do všetkých jamiek oboch radov pridá 25 μl antigénneho zritrocytárneho diagnostica (0,5 % koncentrácia).
Účtovanie a vyhodnotenie výsledkov prebieha podobne ako reakcie v makroobjemoch.
Dátum zverejnenia: 03.02.2015; Prečítané: 3176 | Porušenie autorských práv stránky
studopedia.org - Studopedia.Org - 2014-2018 (0,003 s)…
Vidalova reakcia. Od druhého týždňa ochorenia sa v krvi pacientov hromadia protilátky proti infekčnému agens. Na ich identifikáciu sa pacientovo krvné sérum vyšetrí v aglutinačnej reakcii. Ako antigény sa používajú usmrtené kultúry Salmonella - diagnosticums.
Na vykonanie Widalovej reakcie sa používa sérum pacienta, sada diagnostických súprav a izotonický roztok chloridu sodného.
Krv (2-3 ml) z pulpy prsta alebo z loketnej žily sa odoberie do sterilnej skúmavky a dodá sa do laboratória. V laboratóriu sa skúmavka umiestni na 20-30 minút do termostatu, aby sa vytvorila zrazenina, potom sa použije Pasteurova pipeta na krúženie zrazeniny, aby sa oddelila od steny skúmavky, a umiestni sa do chladu. na 30-40 minút. Oddelené sérum sa odsaje a použije na aglutináciu s diagnostikou Salmonella tyfus a paratýfus. Krv sa môže centrifugovať, aby sa získalo sérum.
Kedykoľvek infekčný proces- brušný týfus alebo paratýfus - telo produkuje O- a H-protilátky proti rovnakým antigénom patogénu.
O-protilátky sa objavia ako prvé a celkom rýchlo miznú. H-protilátky trvajú dlho. To isté sa deje aj pri očkovaní, preto pozitívna Widalova reakcia s O- a H-antigénmi indikuje prítomnosť ochorenia a reakcia len s H-antigénmi môže nastať tak u tých, ktorí sa z ochorenia vyliečili (anamnestická reakcia), ako aj očkovaní (reakcia na vakcínu). Na základe toho sa Widalova reakcia vykonáva oddelene s O- a H-antigénmi (diagnostika).
Keďže týfus a paratýfus A a B sú klinicky podobné, na identifikáciu povahy ochorenia sa pacientovo sérum testuje súčasne s diagnostikou zo Salmonella tyfus a paratýfus A a B.
Widalova reakcia je široko používaná, pretože je jednoduchá a nevyžaduje špeciálne podmienky.
Reakcia sa môže uskutočniť dvoma spôsobmi: po kvapkách a volumetricky (pozri kapitolu 12). V praxi sa častejšie používa volumetrická metóda. Pri vykonávaní lineárnej aglutinačnej reakcie musí počet riadkov zodpovedať počtu antigénov (diagnostik). Za pôvodcu ochorenia sa považuje mikroorganizmus, z ktorého bolo diagnostikum aglutinované sérom pacienta. Niekedy je zaznamenaná skupinová aglutinácia, pretože pôvodcovia týfusu a paratýfusu majú spoločné skupinové antigény. V tomto prípade sa výsledok reakcie v sérii, v ktorej je zaznamenaná aglutinácia pri väčšom zriedení séra, považuje za pozitívny (tabuľka 36).
Tabuľka 36. Možný výsledok aglutinačnej reakcie
Poznámka. V praxi sa Widalova reakcia vykonáva so štyrmi diagnostikami: brušný týfus „O“ a „H“ a paratýfus A a B s diagnostikou „ON“.
Ak dôjde k aglutinácii len v malých riedeniach séra - 1:100, 1:200, tak na odlíšenie reakcie počas ochorenia od očkovania alebo anamnestické reakcie sa uchyľujú k opakovaniu aglutinačnej reakcie po 5-7 dňoch. U pacienta sa titer protilátok zvyšuje, ale u očkovaného alebo uzdraveného človeka sa nemení. Zvýšenie titra protilátok v krvnom sére teda slúži ako indikátor ochorenia.
V reakcii na zavedenie týfusových patogénov s Vi antigénom do tela sa v krvi pacienta objavia Vi aglutiníny. Zisťujú sa od 2. týždňa choroby, ale ich titer zvyčajne nepresahuje 1:10. Detekcia Vi-protilátok je spojená s prítomnosťou patogénov týfusu v organizme, preto má stanovenie týchto protilátok veľký epidemiologický význam, pretože umožňuje identifikáciu nosičov baktérií.
Vi-hemaglutinačná reakcia. Toto je najcitlivejšia reakcia na detekciu protilátok.
Princíp reakcie spočíva v tom, že ľudské (I. skupina) alebo ovčie erytrocyty môžu po špeciálnej úprave adsorbovať Vi-antigén na svojom povrchu a tým získať schopnosť aglutinácie s príslušnými Vi-protilátkami.
Červené krvinky s antigénmi adsorbovanými na povrchu sa nazývajú erytrocytové diagnosticum.
Na vykonanie Vi-hemaglutinačnej reakcie vezmite:
1) krvné sérum pacienta (1-2 ml); 2) erytrocyt Salmonella Vi-diagnosticum; H) Vi-sérum; 4) O-sérum; 5) izotonický roztok chloridu sodného.
Reakcia sa uskutočňuje v aglutinačných skúmavkách alebo v plastových platniach s jamkami.
Krv sa pacientovi odoberá rovnakým spôsobom ako pri Vidalovej reakcii. Získa sa sérum. Zo séra sa pripravia dvojnásobné sériové riedenia, počínajúc od 1:10 do 1:160.
Do jamky sa pridá 0,5 ml každého riedenia a pridá sa 0,25 ml erytrocytárneho diagnosticum. Reakcia sa uskutočňuje v objeme 0,75 ml.
Kontroly sú: 1) štandardné aglutinačné monoreceptorové sérum + diagnosticum - reakcia musí byť pozitívna do sérového titra; 2) diagnosticum v izotonickom roztoku chloridu sodného (kontrola) - reakcia by mala byť negatívna.
Obsah jamiek sa dôkladne premieša, umiestni sa na 2 hodiny do termostatu a nechá sa pri izbovej teplote do nasledujúceho dňa (18-24 hodín).
Účtovníctvo začína kontrolou. Reakcia sa hodnotí v závislosti od stupňa aglutinácie diagnostika.
Výsledky sa berú do úvahy podľa štvorkrížového systému:
Červené krvinky sú úplne aglutinované - sedimentujú na dne jamky vo forme „dáždnika“;
+++ „dáždnik“ je menší, nie všetky červené krvinky sú aglutinované;
++ „dáždnik“ je malý, na dne otvoru je sediment neaglutinovaných erytrocytov;
Reakcia je negatívna; červené krvinky sa neaglutinovali a usadili sa na dne jamky vo forme gombíka.
Kontrolné otázky
1. V akom období ochorenia sa vykonáva Vidalova reakcia?
2. Aké zložky sú potrebné na uskutočnenie Widalovej reakcie?
3. Aká diagnostika sa používa na uskutočnenie Vidalovej reakcie?
4. Ktorá sérologická reakcia je najcitlivejšia pri diagnostike týfusových paratýfusových infekcií?
5. Aké diagnostické činidlo sa používa pri vykonávaní Vi-hemaglutinačnej reakcie?
6. Aké sérum sa používa na stanovenie prítomnosti Vi-antigénu v skúmanej kultúre?
7. Aký význam má určenie Vi-fagotypu?
Od učiteľa odoberte O- a H-diagnostiku zo Salmonella tyfus, paratýfus A a paratýfus B a sérum pacienta. Dajte Vidalovu reakciu.
Kultúrne médiá
Medicínsky priemysel vyrába agarové médiá EMS, Ploskireva a bizmutovo-sulfitové vo forme suchého prášku. Pripravujú sa podľa návodu na etikete: odvážte určité množstvo prášku, zalejte primeraným množstvom vody, povarte a nasypte do sterilných Petriho misiek.
Russell Streda. Pridajte 40 g suchého živného média do 950 ml destilovanej vody a pridajte 5 g živného agaru. Zahrievajte do varu a prášky sa nerozpustia. 1 g x sa rozpustí v 50 ml destilovanej vody. hodiny glukózy a pridajte do pripravenej zmesi. Médium sa naleje do sterilných skúmaviek s objemom 5-7 ml, sterilizuje sa prúdiacou parou (2 dni po 2 minúty) a skosí sa tak, aby zostal stĺpec. Rovnakým spôsobom sa pripraví Russellovo médium s manitolom a sacharózou.
Olkenitského médium zo suchého agaru. 2,5 g suchého živného agaru sa rozpustí v 100 ml destilovanej vody. Do agaru ochladeného na 50 °C sa pridajú všetky ingrediencie uvedené v recepte (na etikete). Médium naliate do skúmaviek sa sterilizuje prúdiacou parou (3 dni, 20 minút každý) a potom sa pokosí. Pripravené médium by malo mať svetloružovú farbu.
Reakcia inhibície hemaglutinácie
Hemaglutinačná reakcia
Aglutinačná reakcia
Aglutinačná reakcia (RA) je zlepenie a precipitácia mikróbov alebo iných buniek pod vplyvom protilátok v prítomnosti elektrolytu (izotonický roztok chloridu sodného). Vzniknutá zrazenina sa nazýva aglutinovať.
Pre reakciu potrebujete:
1. Protilátky (aglutiníny) – nachádzajú sa v sére pacienta alebo v imunitnom sére.
2. Antigén – suspenzia živých alebo usmrtených mikroorganizmov, červených krviniek alebo iných buniek.
3. Izotonický roztok.
Aglutinačný test na sérodiagnostiku je široko používaný v brušný týfus, paratýfus (Vidalova reakcia), brucelóza (Wrightova reakcia) atď. Protilátka je v tomto prípade sérum pacienta a antigén je známy mikrób.
Pri identifikácii mikróbov alebo iných buniek sa ich suspenzia používa ako antigén a ako protilátka sa používa známe imunitné sérum. Táto reakcia je široko používaná v diagnostike črevné infekcie, čierny kašeľ a pod.
V laboratórnej praxi sa využívajú dve hemaglutinačné reakcie (HRA), ktoré sa líšia mechanizmom účinku.
Prvé RGA sa týka sérologického. Pri tejto reakcii dochádza k aglutinácii červených krviniek pri interakcii s vhodnými protilátkami (hemaglutiníny). Reakcia sa široko používa na stanovenie krvných skupín.
Druhé RGA nie je sérologický. V ňom je lepenie červených krviniek spôsobené nie protilátkami, ale špeciálnymi látkami tvorenými vírusmi. Napríklad vírus chrípky aglutinuje červené krvinky kurčiat a morčiat a vírus detskej obrny aglutinuje červené krvinky oviec. Táto reakcia umožňuje posúdiť prítomnosť konkrétneho vírusu v skúmanom materiáli.
Ide o sérologickú reakciu, pri ktorej špecifické antivírusové protilátky interagujúce s vírusom (antigénom) ho neutralizujú a zbavujú ho schopnosti aglutinovať červené krvinky, t.j. inhibovať hemaglutinačnú reakciu. Vysoká špecifickosť reakcie inhibície hemaglutinácie (HAI) umožňuje jej použitie na určenie typu a dokonca aj typu vírusov zistených počas testu HRA.
Nepriama (pasívna) hemaglutinačná reakcia (IRHA) je založená na skutočnosti, že červené krvinky, ak je na ich povrchu adsorbovaný rozpustný antigén, získavajú schopnosť aglutinácie pri interakcii s protilátkami proti adsorbovanému antigénu. Schéma RNGA je znázornená na obr. RNGA sa široko používa pri diagnostike mnohých infekcií.
Ryža. Schéma pasívnej hemaglutinačnej reakcie (RPHA). A - získanie diagnostiky erytrocytov; B - RNGA: 1-erytrocyt: 2 - skúmaný antigén; 3 - diagnostika erytrocytov; 4 - protilátka proti študovanému antigénu: 5 - aglutinát.
Pomocou RNGA môžete určiť neznámy antigén, ak sú známe protilátky adsorbované na erytrocytoch.
Hemaglutinačná reakcia (HRA)
RGA je založená na skutočnosti, že niektoré druhy baktérií a vírusov majú schopnosť adsorbovať sa na povrchu červených krviniek odlišné typy zvierat (a vtákov), čo spôsobuje ich zlepenie a vytvorenie aglutinátu (priame RGA).
Adsorpcia antigénu (baktérie, vírusy) na povrchu erytrocytov sa nie vždy prejaví tvorbou viditeľnej zrazeniny; Okrem toho je RHA nešpecifická, pretože červené krvinky rovnakého živočíšneho druhu môžu adsorbovať rôzne antigény.
Špecifická je pasívna (nepriama) hemaglutinačná reakcia (RPHA). Na vykonanie tohto postupu sa najskôr pripraví erytrocytové diagnosticum (erytrocyty, na ktorých je adsorbovaný antigén). Na tento účel sa sterilne získa ovčia (alebo kohútia) krv, defibrinuje sa a niekoľkokrát sa premyje vo fosfátom pufrovanom roztoku (pH 7,2) s použitím 3- až 5-násobnej centrifugácie. Supernatant sa odstráni, koncentrácia erytrocytov sa upraví na 2,5 % (1:40). K 2,5 % suspenzii erytrocytov pridajte rovnaký objem (1 ml alebo 0,5 ml) suspenzie baktérií študovaných druhov mikróbov v koncentrácii 5 až 10 miliárd buniek na 1 ml. Červené krvinky ľahko adsorbujú polysacharidové antigény. Na adsorpciu proteínového antigénu sa erytrocyty vopred ošetria tanínom v riedení 1:20 000. Erytrocyty v kombinácii s pridaným antigénom sa nechajú na senzibilizáciu (adsorpciu) 2 hodiny v termostate (37 °C), potom sa odstredia opäť pri 3-4 tisíc otáčkach za minútu počas 5 minút s fosfátovým tlmivým roztokom (obr. 9.13).
Výsledné erytrocytárne diagnosticum sa vloží do skúmaviek (alebo jamiek v plexisklovej doske) a pridá sa k nemu štandardné imunitné sérum.
V pozitívnych prípadoch dôjde k RHA – úbytku červených krviniek vo forme charakteristického vločkovitého alebo zrnitého sedimentu rozmiestneného po celom povrchu dna skúmavky (hemaglutinát). To znamená, že typ študovaného mikróbu (antigén) je špecifický pre protilátky imunitného séra. V negatívnych prípadoch sa nezlepené červené krvinky usadia na dne vo forme malého rovnomerného kruhu.
Pre väčšiu spoľahlivosť výsledkov sa používa RPGA oneskorenie reakcie(brzdenie) fenomén hemaglutinácie(RZGA) alebo jeho modifikácia - protilátková neutralizačná reakcia(RIA).
Ryža. 9.13. Pasívna hemaglutinačná reakcia (schéma): Er - červené krvinky: AG - antigén: AT - protilátka
Podstata RZGA spočíva v tom, že sa uskutoční aglutinačná reakcia so špecifickým diagnostickým sérom a testovacím antigénom (ako antigén sa používa typ skúmaného mikróbu). Táto zmes sa udržiava 1-2 hodiny pri 37 °C, potom sa pridajú červené krvinky. Ak je testovací antigén homológny s protilátkami diagnostického séra, dochádza k ich vzájomnej interakcii a pridané červené krvinky neaglutinujú – výsledok reakcie je pozitívny. Ak testovaný antigén nie je homológny so sérovými protilátkami alebo nie je obsiahnutý v materiáli, potom pridané erytrocyty adsorbujú antigén a vzniká RGA - výsledok RGA je negatívny, typ testovaného mikróbu (antigénu) nie je stanovený.
Metodika nastavenia PH A spočíva v odbere rovnakých objemov a zmiešaní diagnostického imunitného séra s rôzne riedenia skúmaný materiál (požadovaný antigén), ponechaný v kontakte 1-2 hodiny, potom sa pridajú červené krvinky senzibilizované určitým (známym) antigénom špecifickým pre sérové protilátky (erytrocyty diagnosticum). Pri reakcii požadovaného antigénu so sérovými protilátkami dochádza k ich neutralizácii a pridané červené krvinky neaglutinujú, RHA nevzniká – výsledok RHA je pozitívny. Ak testovaný materiál neobsahuje antigén špecifický pre protilátky použitého séra, k neutralizácii protilátok nedôjde. Pri pridaní erytrocytárneho diagnostika sa preto objavuje aglutinácia erytrocytov (hemaglutinácia) a výsledok RNA je negatívny. Protilátková neutralizačná reakcia je vysoko citlivá metóda na detekciu antigénu nielen v suspenzii živých (alebo usmrtených) baktérií, ale aj v suspenzii mletého tkaniva rôznych orgánov, natívnych a zahrievaných sekrétov a exkrementov chorého organizmu.
