Cieľ: Ovládať techniku stagingu aglutinačnej reakcie a precipitačnej reakcie pre diagnostiku infekčných ochorení.
Modul 1 Morfológia a fyziológia mikroorganizmov. Infekcia. Imunita.
Téma 16: Aglutinačná reakcia. zrážacia reakcia.
Relevantnosť témy. Pod imunita znamená imunitu tela voči infekčným a neinfekčným agensom ( patogénne mikroorganizmy cudzorodé bielkoviny atď. látky). Tieto činidlá sa nazývajú antigény. Imunita je buď vrodená alebo získaná. Vrodené- keď sa vytvárajú tkanivové a humorálne ochranné prostriedky, ktoré spôsobujú imunitu voči infekčným chorobám, ktoré sú dedičné.
Získané- sa uskutočňuje imunitným systémom tela vo forme tvorby protilátok alebo akumulácie senzibilizovaných lymfocytov. Je rozdelená na prírodné a umelé. Podľa mechanizmu účinku sa delí na aktívny a pasívny. Pri všetkých imunologických reakciách je hlavnou zložkou antigén.
hlavná funkcia imunitný systém, ktorý pozostáva z lymfoidného tkaniva, je rozpoznanie cudzích agens (antigénov) a ich neutralizácia.
Antigény môžu vstúpiť do tela cez Dýchacie cesty, tráviaci trakt cez kožu a sliznice. Každý antigén stimuluje tvorbu špecifických proteínových látok – protilátok.
Antigény rozdelené na úplné a podradné (haptény). Kompletné antigény vyvolať úplnú imunitnú odpoveď. Defektné antigény nespôsobujú nezávisle imunitnú odpoveď, ale niekedy získajú túto schopnosť, keď sú konjugované s proteínovými nosičmi s vysokou molekulovou hmotnosťou. Okrem toho existujú antigény: semihaptény, proantigény, heteroantigény a izoantigény.
Protilátky sú ľudské alebo zvieracie sérové imunoglobulíny. Protilátky sa tvoria po infekcii a v dôsledku imunizácie oslabenými alebo usmrtenými baktériami, rickettsiami, vírusmi, toxínmi a inými pôvodcami. Protilátky- imunoglobulínové proteíny chemické zloženie patria medzi glykoproteíny. Podľa štruktúry a imunobiologických vlastností sa imunoglobulíny delia na 5 tried: IgM, IgG, IgA, IgE, IgD.
Normálne protilátky vyskytujúce sa u neimunizovaných ľudí a zvierat. Špecifické protilátky sa tvoria v dôsledku infekcie alebo imunizácie.
Reakcia medzi protilátkou a antigénom sa nazýva sérologické. Sérologické reakcie sú vysoko špecifické a využívajú sa pri diagnostike mnohých infekčných ochorení. Vyskytujú sa reakcie aglutinácie a zrážania.
1. Aglutinačná reakcia (RA) je založená na interakcii antigénu (aglutinogénu) a protilátky (aglutinínu), pri ktorej dochádza k aglutinácii a precipitácii mikrobiálnych teliesok v prítomnosti elektrolytu. Existujú rôzne modifikácie formulácie aglutinačnej reakcie.
Najvyššia hodnota mať:
- Makroskopická (nasadená) aglutinácia v skúmavkách. Do séra pacienta sa pridá suspenzia mikróbov (diagnosticum) a po 1 hodine v termostate pri teplote 37 stupňov sa zaznamená zriedenie (titer) séra, pri ktorom došlo k reakcii. Aglutinačná reakcia sa považuje za pozitívnu, keď sa na dne skúmavky vytvorí zrazenina s výrazným vyčírením supernatantu. Táto zrazenina sa nazýva aglutinát.
Podľa charakteru aglutinátu sa rozlišuje jemnozrnná (O) a hrubozrnná (H) aglutinácia. Na detekciu jemnozrnného aglutinátu sa používa aglutinoskop. Účtovanie výsledkov začína pri kontrolných skúmavkách. Posledné riedenie séra, v ktorom sa pozoruje aglutinácia, sa považuje za jeho titer.
Účel reakcie: detekcia protilátok v sére pacienta.
- mikroskopický (zrýchlený) ) približná aglutinácia na skle. Kvapka bakteriálnej kultúry sa pridá do kvapky diagnostického imunitného séra a rovnomerne sa premieša. Reakcia prebieha pri teplote miestnosti po 5 až 10 minútach. Potom sa vytvorí účet. Pri pozitívnej reakcii v kvapke séra je zaznamenaná akumulácia baktérií vo forme zŕn alebo vločiek. Účel reakcie: určiť typ patogénu podľa známeho diagnostického séra.
- Reakcia nepriamej (pasívnej) hemaglutinácie (RNGA). Podstata tejto reakcie spočíva v tom, že erytrocyty barana sú schopné adsorbovať antigény na svojom povrchu. Pod vplyvom špecifických protilátok sa erytrocyty zlepia a vyzrážajú, pričom na dne tvoria hemaglutinát. Reakcia je vysoko citlivá a špecifická. RNGA umožňuje detekovať minimálne množstvo protilátok a defektných antigénov polysacharidovej povahy. Táto reakcia sa využíva pri diagnostike mnohých infekčných ochorení (týfus a týfus, paratýfus, tuberkulóza atď.).
2. Zrážacia reakcia (RP ) – precipitácia komplexu antigén-protilátka. Hlavný rozdiel medzi RP a RA je v tom, že pri RA sa používa korpuskulárny antigén, zatiaľ čo pri RP je antigénom koloidná látka proteínovej alebo polysacharidovej povahy. Pri tejto reakcii sa antigén nazýva precipitinogén a protilátky sa nazývajú precipitíny. Reakcia sa vloží do skúmaviek navrstvením roztoku antigénu na imunitné sérum. S optimálnym pomerom antigénu a protilátok na hranici
tieto roztoky tvoria kruh zrazeniny. Ak sa ako antigén použijú uvarené a prefiltrované extrakty orgánov a tkanív, reakcia sa nazýva termoprecipitačná reakcia (Ascoliho reakcia, ktorá je zaradená do diagnózy antrax mor, tularémia atď.).
Zrážacie reakcie v agare sú široko používané: jednoduchá difúzna metóda, dvojitá difúzna metóda.
Typ zrážok je flokulačná reakcia- na stanovenie aktivity toxoidu alebo antitoxického séra. Okrem toho sa táto reakcia môže použiť na stanovenie toxigenity kmeňov Corynebacterium diphtheriae.
Konkrétne ciele:
· Vysvetliť úlohu antigénov ako induktorov imunitnej odpovede;
· Popíšte štruktúru antigénov vrátane antigénov mikroorganizmov;
· Popíšte mechanizmus aglutinačnej reakcie;
· Popíšte mechanizmus precipitačnej reakcie.
Byť schopný:
· Vysvetliť úlohu antigénov ako induktorov imunitnej odpovede;
Popíšte štruktúru protilátok (rôzne triedy imunoglobulínov);
· Analyzovať mechanizmus interakcie protilátok s antigénmi;
· interpretovať výsledky aglutinačnej reakcie;
· interpretovať výsledky zrážacej reakcie;
· Analyzujte výsledky.
1. Definícia pojmu "antigény", "protilátky".
2. Úloha antigénov ako induktorov imunitnej odpovede.
3. Štruktúra protilátok (rôzne triedy imunoglobulínov).
4. Mechanizmus interakcie protilátok s antigénmi.
5. Reakcie imunitného systému, ich úloha v imunitnej odpovedi a diagnostike infekčných ochorení.
6. Mechanizmus aglutinačnej reakcie.
7. Mechanizmus precipitačnej reakcie.
Praktické úlohy, ktoré sa vykonávajú v triede:
1. Nastavenie aglutinačnej reakcie na detekciu protilátok v sére pacienta.
2. Nastavenie mikroaglutinačnej reakcie na skle s diagnostickými sérami na identifikáciu čistej bakteriálnej kultúry.
3. Vyhodnotenie výsledkov aglutinačnej reakcie.
4. Nastavenie precipitačnej reakcie na detekciu bakteriálneho antigénu.
5. Vyhodnotenie výsledkov zrážacej reakcie.
6. Vyhodnotenie výsledkov reakcie nepriamej hemaglutinácie.
7. Registrácia protokolu.
Literatúra:
1. Pyatkin K.D., Krivoshein Yu.S. Mikrobiológia s virológiou a imunológiou - Kyjev: Vyššia škola, 1992.- 431s.
2. Vorobyov A.V., Bykov A.S., Pashkov E.P., Rybakova A.M. Mikrobiológia.- M.: Medicína, 1998.- 336s.
3. Lekárska mikrobiológia /Editoval V.P. Pokrovsky.-M .: GEOTAR-MED, 2001. - 768s.
4. Korotyaev A.I., Babichev S.A. Lekárska mikrobiológia, imunológia a virológia / Učebnica pre lekárske univerzity, Petrohrad: "Špeciálna literatúra", 1998.- 592s.
5. Timakov V.D., Levašev V.S., Borisov L.B. Mikrobiológia / Učebnica - 2. vydanie, prepracované. a príd.- M .: Medicína, 1983.- 512s.
6. Poznámky k prednáške.
1. Titov M.V. infekčné choroby.- K., 1995.- 321s.
2. Šuvalová E.P. Infekčné choroby - M .: Medicína, 1990. - 559. roky.
Aglutinačná reakcia je založená na špecifickej interakcii protilátok (aglutinínov) s celými mikrobiálnymi alebo inými bunkami. V dôsledku tejto interakcie sa vytvárajú častice-aglomeráty, ktoré sa zrážajú (aglutinujú). Baktérie, prvoky, huby, kvasinky, rickettsia, erytrocyty a iné bunky, živé aj usmrtené, sa môžu zúčastniť aglutinačnej reakcie. Reakcia prebieha v dvoch fázach: prvá je špecifická kombinácia antigénu a protilátky, druhá je nešpecifická, t.j. tvorba viditeľného aglutinátu. Precipitácia aglutinátu nastáva v prítomnosti elektrolytov, ako je chlorid sodný. Mikroorganizmy v aglutináte zostávajú nažive, ale strácajú svoju pohyblivosť.
Aglutinačná reakcia je široko používaná na sérologickú diagnostiku infekčných ochorení a stanovenie antigénnej štruktúry izolovaných mikróbov. Na stanovenie antigénnej štruktúry patogénu izolovaného z tela pacienta alebo nosiča sa používa špecifické imunitné sérum získané imunizáciou zvierat (králik, somár, baran) určitými mikroorganizmami. Identifikácia mikróba sa uskutočňuje aglutinačnou reakciou na skle s adsorbovanými alebo monoreceptorovými sérami alebo v skúmavkách so špecifickými aglutinačnými sérami. Adsorbované séra obsahujú protilátky len proti antigénom špecifickým pre daný mikrób a monoreceptorové séra obsahujú protilátky len proti jednému špecifickému antigénu patogénu.
Druhové séra obsahujú protilátky proti všetkým antigénom konkrétneho mikróbu.
Príslušnosť izolovanej kultúry mikroorganizmu k tento druh sa stanoví aglutináciou s jeho známym sérom na titer protilátky uvedený na štítku sérovej ampulky. Titer sérových protilátok sa považuje za jeho posledné riedenie, pri ktorom sa ešte pozoruje aglutinácia kultúry mikróbov použitých na imunizáciu zvieraťa. Adsorbované a monoreceptorové séra sa zvyčajne používajú neriedené pri aglutinačnej reakcii na skle.
Pri určovaní prítomnosti protilátok v krvnom sére pacienta sa riedi izotonickým roztokom chloridu sodného, pričom sa začína riedením 1: 50 až 1: 800 alebo viac. Ku každému riedeniu sa pridá suspenzia živých alebo usmrtených mikróbov. Prípravky obsahujúce mikróby zabité teplom alebo formalínom sa nazývajú diagnosticum. Diagnostika získané zahrievaním kultúr mikroorganizmov obsahujú iba somatické antigény. Keď sa používa iba formalín, bičíkové antigény sú tiež zachované v mikróboch.
V prítomnosti protilátok v krvi pacienta sa pri reakcii prijaté diagnostické činidlo zlepí a zrazenina (aglutinát) sa vytvorí do dvoch skúmaviek. V tomto prípade sa výsledky aglutinačnej reakcie považujú za pozitívne. V kontrolnej skúmavke, kde sa pridáva izotonický roztok chloridu sodného a diagnostika, by mala byť suspenzia mikróbov homogénna ( spätnú reakciu aglutinácia).
Zúčtovanie výsledkov aglutinačnej reakcie pri niektorých ochoreniach, ako je leptospiróza, sa vykonáva iba mikroskopicky v tmavom zornom poli mikroskopu (mikroaglutinácia). Na stanovenie sérologickej diagnózy ochorenia sa berie do úvahy diagnostické ochorenie. Zvyčajne zodpovedá riedeniu séra 1:100 alebo 1:200.
Protilátky v krvnom sére pacienta pomocou aglutinačnej reakcie možno zistiť v prípadoch brušného týfusu a paratýfusu (Vidalova reakcia), brucelózy (Wrightova reakcia), tularémie atď.
Castellaniho reakcia. Pre niektoré infekčné choroby alebo imunizácia mikroorganizmami obsahujúcimi skupinové antigény, v krvnom sére sa okrem protilátok špecifických pre tento typ objavujú aj skupinové. V tomto prípade budú príbuzné bakteriálne druhy aglutinované výsledným sérom.
Castellani navrhol metódu adsorpcie skupinových protilátok z imunitných sér, založenú na ich odstránení pomocou mikroorganizmov príbuzných druhov, ktoré majú skupinové antigény, ale chýbajú im špecifické. Kultúra takýchto mikroorganizmov pridaná do séra adsorbuje nešpecifické skupinové protilátky a po odstránení komplexu antigén-protilátka centrifugáciou ostanú v sére len špecifické imunoglobulíny. Séra ošetrené podľa Castellaniho metódy môžu byť použité v aglutinačnej reakcii ako vysoko špecifické.
imunodiagnostické reakcie. Reakcie antigén-protilátka a reakcie s označenými zložkami. Použitie na identifikáciu mikroorganizmov a diagnostiku infekčných chorôb.
Imunitné reakcie sa využívajú v diagnostických a imunologických štúdiách u pacientov a zdravých ľudí. Na tento účel použite sérologické metódy (z lat. sérum - sérum a logá - doktrína), t. j. metódy na štúdium protilátok a antigénov pomocou reakcií antigén-protilátka stanovených v krvnom sére a iných tekutinách, ako aj v telesných tkanivách.
Detekcia protilátok proti antigénom patogénu v krvnom sére pacienta umožňuje diagnostikovať ochorenie. Sérologické štúdie sa používajú aj na identifikáciu mikrobiálnych antigénov, rôznych biologicky aktívnych látok, krvných skupín, tkanivových a nádorových antigénov, imunitných komplexov, bunkových receptorov atď.
Keď je mikrób izolovaný od pacienta, patogén sa identifikuje jeho štúdiom. antigénne vlastnosti použitím imunodiagnostických sér, t.j. krvných sér hyperimunizovaných zvierat obsahujúcich špecifické protilátky. Tento tzv sérologická identifikácia mikroorganizmov.
V mikrobiológii a imunológii sa široko používa aglutinácia, precipitácia, neutralizačné reakcie, reakcie zahŕňajúce komplement, s použitím značených protilátok a antigénov (rádioimunologické, enzýmové imunostanovenie, imunofluorescenčné metódy). Uvedené reakcie sa líšia zaznamenaným efektom a technikou nastavenia, všetky sú však základné. van na reakciu interakcie antigénu s protilátkou a používajú sa na detekciu protilátok aj antigénov. Imunitné reakcie sa vyznačujú vysokou citlivosťou a špecifickosťou.
Princípy a schémy hlavných imunodiagnostických reakcií sú uvedené nižšie. Podrobná technika nastavenia reakcií je uvedená v. praktické pokyny pre imunodiagnostiku.
Aglutinačná reakcia - RA(z lat. agluti- národa- väzba) - jednoduchá reakcia, pri ktorej protilátky viažu korpuskulárne antigény (baktérie, erytrocyty alebo iné bunky, nerozpustné častice s na nich adsorbovanými antigénmi, ako aj makromolekulové agregáty). Vyskytuje sa v prítomnosti elektrolytov, napríklad keď sa pridá izotonický roztok chloridu sodného.
Používajú sa rôzne varianty aglutinačnej reakcie: expandovaná, približná, nepriama atď. Aglutinačná reakcia sa prejavuje tvorbou vločiek alebo sedimentu
RA sa používa na:
stanovenie protilátok v krvnom sére pacientov, napríklad s brucelózou (Wrightova, Heddelsonova reakcia), týfusom a paratýfusom (Vidalova reakcia) a inými infekčnými chorobami;
stanovenie patogénu izolovaného od pacienta;
stanovenie krvných skupín pomocou monoklonálnych protilátok proti alogénom erytrocytov.
Na stanovenie protilátok pacienta daťrozšírená aglutinačná reakcia: pridať do riedenia pacientovho krvného séra diagnosticum(suspenzia usmrtených mikróbov) a po niekoľkých hodinách inkubácie pri 37 °C je zaznamenané najvyššie zriedenie séra (sérový titer), pri ktorom došlo k aglutinácii, t.j. vytvoreniu zrazeniny.
Povaha a rýchlosť aglutinácie závisia od typu antigénu a protilátok. Príkladom sú znaky interakcie diagnostika (O- a R-antigénov) so špecifickými protilátkami. Aglutinačná reakcia s O-diagnostika(baktérie zabité teplom, ktoré si zachovávajú termostabilitu O antigén) vyskytuje sa vo forme jemnozrnnej aglutinácie. Aglutinačná reakcia s H-diagnosticum (baktérie usmrtené formalínom, zadržiavajúce tepelne labilný bičíkový H-antigén) je hrubozrnná a prebieha rýchlejšie.
Ak je potrebné určiť patogén izolovaný od pacienta, dajte orientačná aglutinačná reakcia, pomocou diagnostických protilátok (aglutinačné sérum), t.j. vykonáva sa sérotypizácia patogénu. Približná reakcia sa uskutoční na podložnom sklíčku. Ku kvapke diagnostického aglutinačného séra v riedení 1:10 alebo 1:20 pridajte čistú kultúru patogénu izolovaného od pacienta. V blízkosti je umiestnená kontrola: namiesto séra sa aplikuje kvapka roztoku chloridu sodného. Keď sa vločkovitý sediment objaví v kvapke so sérom a mikróbmi, dajú rozsiahla aglutinačná reakcia v skúmavkách so zvyšujúcim sa riedením aglutinačného séra, do ktorého sa pridajú 2-3 kvapky suspenzie patogénu. Aglutinácia sa zohľadňuje množstvom sedimentu a stupňom vyčírenia kvapaliny. Reakcia sa považuje za pozitívnu, ak je zaznamenaná aglutinácia v riedení blízkom titru diagnostického séra. Súčasne sa berú do úvahy kontroly: sérum zriedené izotonickým roztokom chloridu sodného by malo byť priehľadné, suspenzia mikróbov v tom istom roztoku by mala byť rovnomerne zakalená, bez sedimentu.
Rôzne príbuzné baktérie môžu byť aglutinované rovnakým diagnostickým aglutinačným sérom, čo sťažuje ich identifikáciu. Preto si užívajte adsorbované aglutinačné séra, z ktorých boli skrížene reagujúce protilátky odstránené adsorpciou ich príbuznými baktériami. V takýchto sérach zostávajú protilátky špecifické len pre túto baktériu. Prípravu monoreceptorových diagnostických aglutinačných sér týmto spôsobom navrhol A. Castellani (1902).
Reakcia nepriamej (pasívnej) hemaglutinácie (RNGA, RPHA) je založená na použití erytrocytov s antigénmi alebo protilátkami adsorbovanými na povrchu, ktorých interakcia s príslušnými protilátkami alebo antigénmi krvného séra guľôčky spôsobí, že sa erytrocyty zlepia a padnú na dno guľôčky. skúmavku alebo bunku V forma vrúbkovaného sedimentu (obr. 13.2). S negatívnou reakciou sa erytrocyty usadia vo forme "gombíka". Zvyčajne sa protilátky v RNHA detegujú pomocou antigénneho diagnostického erytrocytu, ktorým sú erytrocyty s adsorbovanými na sú to antigény. Niekedy využívame protilátkovú diagnostiku erytrocytov, na ktorých sa protilátky adsorbujú. Napríklad botulotoxín sa dá zistiť tak, že sa k nemu pridá protilátka erytrocytov botulinum diagnosticum (táto reakcia je tzv. reverzná nepriama hemaglutinačná reakcia- RONGA). RNHA sa používa na diagnostiku infekčných chorôb, určenie gonadotropný hormón V moču, keď sa zistí tehotenstvo precitlivenosť Komu lieky, hormóny av niektorých ďalších prípadoch.
Koaglutinačná reakcia . Bunky patogénu sa určujú pomocou stafylokokov, vopred ošetrených imunitným diagnostickým sérom. Proteín obsahujúci stafylokoky A, majúci afinitu k Fc -fragment imunoglobulínov, nešpecificky adsorbujú antimikrobiálne protilátky, ktoré následne interagujú s aktívnymi centrami so zodpovedajúcimi mikróbmi izolovanými od pacientov. V dôsledku koagulácie sa vytvárajú vločky pozostávajúce zo stafylokokov, diagnostických sérových protilátok a mikróbu, ktorý sa určuje.
Reakcia inhibície hemaglutinácie (RTGA) je založená na blokáde, supresii antigénov vírusov protilátkami imunitného séra, v dôsledku čoho vírusy strácajú schopnosť aglutinovať červené krvinky (obr. 13.3). RTHA sa používa na diagnostiku mnohých vírusových ochorení, ktorých pôvodcovia (chrípka, osýpky, rubeola, kliešťová encefalitída atď.) môžu aglutinovať erytrocyty rôznych zvierat.
Aglutinačná reakcia na stanovenie krvných skupín používa sa na vytvorenie systému ABO (pozri časť 10.1.4.1) pomocou aglutinácie erytrocytov s protilátkami imunitného séra proti antigénom krvných skupín A (II), B (III). Kontroly sú: sérum bez protilátok, teda sérum AB (GU) krvné skupiny; antigény obsiahnuté v erytrocytoch skupín A (II), B (III). Negatívna kontrola neobsahuje žiadne antigény, t.j. používajú sa erytrocyty skupiny 0 (I).
IN aglutinačné reakcie na stanovenie Rh faktora(pozri časť 10.1.4.1) použite anti-Rh séra (najmenej dve rôzne série). V prítomnosti Rh antigénu na membráne študovaných erytrocytov dochádza k aglutinácii týchto buniek. Ako kontroly slúžia štandardné Rh-pozitívne a Rh-negatívne erytrocyty všetkých krvných skupín.
Aglutinačná reakcia na stanovenie protilátok proti Rhesus ( nepriama reakcia Coombs)používané u pacientov s intravaskulárna hemolýza. U niektorých z týchto pacientov sa nachádzajú protilátky proti Rhesus, ktoré sú neúplné, monovalentné. Špecificky interagujú s Rh-pozitívnymi erytrocytmi, ale nespôsobujú ich aglutináciu. Prítomnosť takýchto neúplných protilátok sa stanovuje v nepriamej Coombsovej reakcii. K tomu sa do systému anti-Rh protilátok + Rh-pozitívnych erytrocytov pridáva antiglobulínové sérum (protilátky proti ľudským imunoglobulínom), ktoré spôsobuje aglutináciu erytrocytov (obr. 13.4). Pomocou Coombsovej reakcie sa diagnostikujú patologické stavy spojené s intravaskulárnou lýzou erytrocytov imunitného pôvodu, napríklad hemolytická choroba novorodenca: erytrocyty Rh-pozitívneho plodu sa spájajú s neúplnými protilátkami proti Rh faktoru cirkulujúcimi v krvi, ktoré prechádzajú placenta od Rh-negatívnej matky.
Zrážacie reakcie
zrážacia reakcia - RP (odlat. praeci-pito- precipitát,) je tvorba a precipitácia komplexu rozpustného molekulového antigénu s protilátkami vo forme zákalu, tzv. zrazenina. Vzniká zmiešaním antigénov a protilátok v ekvivalentných množstvách; nadbytok jedného z nich znižuje úroveň tvorby imunitného komplexu.
Zrážacie reakcie vložené do skúmaviek (reakcia zrážania prstenca), v géloch, živných médiách atď. Odrody precipitačnej reakcie v polotekutom géli agaru alebo agarózy sú široko používané: dvojitá imunodifúzia podľa Ouchterlonyho. radiálna imunodifúzia, imunoelektroforéza atď.
Reakcia zrážania kruhu . Reakcia prebieha v úzkych precipitačných skúmavkách s imunitným sérom, na ktorom je navrstvený rozpustný antigén. Pri optimálnom pomere antigénu a protilátok sa na hranici týchto dvoch roztokov vytvorí nepriehľadný prstenec precipitátu (obr. 13.5). Nadbytok antigénu neovplyvňuje výsledok reakcie zrážania kruhu v dôsledku postupnej difúzie činidiel na hranicu kvapaliny. Ak sa ako antigény v kruhovej precipitačnej reakcii použijú prevarené a prefiltrované vodné extrakty orgánov alebo tkanív, potom sa takáto reakcia nazýva tzv. termoprecipitačná reakcia-iii (Ascoliho reakcia, s antraxom /
Oukhteruniho dvojitá imunodifúzna reakcia . Na nastavenie reakcie sa roztopí agarový gél tenká vrstva sa naleje na sklenenú dosku a po jej vytvrdnutí sa do nej vyrežú otvory o veľkosti 2-3 mm. Antigény a imunitné séra sú umiestnené oddelene v týchto jamkách, ktoré difundujú smerom k sebe. V mieste stretnutia v ekvivalentných pomeroch tvoria zrazeninu vo forme bieleho pásu. Vo viaczložkových systémoch sa medzi jamkami s rôznymi antigénmi a sérovými protilátkami objaví niekoľko línií precipitátu; pre identické antigény sa línie precipitátu spájajú; pri neidentických sa prelínajú (obr. 13.6).
Radiálna imunodifúzna reakcia . Imunitné sérum s roztaveným agarovým gélom sa rovnomerne naleje na pohár. Po stuhnutí v géli sa vytvoria jamky, do ktorých sa vloží antigén rôzne riedenia. Antigén difundujúci do gélu vytvára kruhové precipitačné zóny okolo jamiek s protilátkami (obr. 13.7). Priemer precipitačného prstenca je úmerný koncentrácii antigénu. Reakcia sa používa na stanovenie krvných hladín imunoglobulínov rôznych tried, zložiek komplementového systému atď.
Imunoelektroforéza- kombinácia metódy elektroforézy a imunoprecipitácie: zmes antigénov sa zavedie do jamiek gélu a separuje sa v géli pomocou elektroforézy. Potom sa paralelne so zónami elektroforézy zavedie do drážky imúnne sérum, ktorého protilátky sa difundujú do gélu a tvoria sa v mieste stretnutia s antigénom precipitačnej línie.
flokulačná reakcia(podľa Ramona) (z lat. vločka- vlnené vločky) - objavenie sa opalescencie alebo flokulentnej hmoty (imunoprecipitácia) v skúmavke počas reakcie toxín-antitoxín alebo anatoxín-antitoxín. Používa sa na stanovenie aktivity antitoxického séra alebo toxoidu.
imúnna elektrónová mikroskopia - elektrónová mikroskopia mikróbov, častejšie vírusov, ošetrených vhodnými protilátkami. Vírusy ošetrené imunitným sérom tvoria imunitné agregáty (mikroprecipitáty). Okolo viriónov sa vytvára "korolla" protilátok, na rozdiel od kyseliny fosfowolfrámovej alebo iných elektrónovo-opticky hustých prípravkov.
Reakcie zahŕňajúce komplement
Reakcie zahŕňajúce komplementna základe aktivácie komplementu komplexom antigén-protilátka (reakcia fixácie komplementu, radiálna hemolýza a pod.).
Reakcia fixácie komplementu (RSK) spočíva v tom, že pri vzájomnej korešpondencii tvoria antigény a protilátky imunitný komplex, na ktorý sa cez Fc -fragment protilátok spája komplement (C), t.j. väzba komplementu nastáva s komplexom antigén-protilátka. Ak sa nevytvorí komplex antigén-protilátka, komplement zostáva voľný (obr. 13.8). RSK sa uskutočňuje v dvoch fázach: 1. fáza - inkubácia zmesi obsahujúcej tri zložky antigén + protilátka + komplement; 2. fáza (indikátor) - detekcia voľného komplementu v zmesi pridaním hemolytického systému pozostávajúceho z ovčích erytrocytov a hemolytického séra obsahujúceho protilátky proti nim. V 1. fáze reakcie pri tvorbe komplexu antigén-protilátka dochádza k väzbe komplementu a následne v 2. fáze nedôjde k hemolýze erytrocytov senzibilizovaných protilátkami; reakcia je pozitívna. Ak si antigén a protilátka navzájom nezodpovedajú (v testovanej vzorke nie je antigén alebo protilátka), komplement zostáva voľný a v 2. fáze sa spojí s komplexom erytrocyt-antierytrocytová protilátka, čo spôsobí hemolýzu; reakcia je negatívna.
RSK sa používa na diagnostiku mnohých infekčných chorôb, najmä syfilisu (Wassermanova reakcia).
Reakcia radiálnej hemolýzy (RRH ) umiestnené do jamiek agarového gélu obsahujúceho baranie erytrocyty a komplement. Po pridaní hemolytického séra (protilátky proti baraním erytrocytom) do jamiek gélu sa okolo nich vytvorí hemolytická zóna (ako výsledok radiálnej difúzie protilátok). Tak je možné stanoviť aktivitu komplementu a hemolytického séra, ako aj protilátok v krvnom sére pacientov s chrípkou, rubeolou, kliešťová encefalitída. Na tento účel sa na erytrocyty adsorbujú zodpovedajúce antigény vírusu a do jamiek gélu obsahujúceho tieto erytrocyty sa pridá krvné sérum pacienta. Antivírusové protilátky interagujú s vírusovými antigénmi adsorbovanými na erytrocytoch po
Komponenty komplementu sa pripájajú k tomuto komplexu a spôsobujú hemolýzu.
Imunitná adhézna reakcia (RIP ) je založená na aktivácii komplementového systému korpuskulárnymi antigénmi (baktériami, vírusmi) ošetrenými imunitným sérom. Výsledkom je vytvorenie aktivovanej tretej zložky komplementu (C3b), ktorá sa naviaže na korpuskulárny antigén ako súčasť imunitného komplexu. Na erytrocytoch, krvných doštičkách, makrofágoch sú receptory pre C3b, vďaka čomu pri zmiešaní týchto buniek s imunitnými komplexmi nesúcimi C3b dochádza k ich kombinácii a aglutinácii.
Neutralizačná reakcia
Protilátky imunitného séra sú schopné neutralizovať škodlivý účinok mikróbov alebo ich toxínov na citlivé bunky a tkanivá, ktorý je spojený s blokádou mikrobiálnych antigénov protilátkami, t.j. neutralizácia. Neutralizačná reakcia(RN) sa vykonáva zavedením zmesi antigén-protilátka do zvierat alebo do citlivých testovacích objektov (bunková kultúra, embryá). Pri absencii škodlivého účinku mikroorganizmov alebo ich antigénov, toxínov u zvierat a testovaných predmetov hovoria o neutralizačnom účinku imunitného séra a teda o špecifickosti interakcie komplexu antigén-protilátka (obr. 13.9).
Imunofluorescenčná reakcia - RIF (Koonsova metóda)
Existujú tri hlavné varianty metódy: priama, nepriama (obr. 13.10), s doplnkom. Koonsova reakcia je rýchla diagnostická metóda na detekciu mikrobiálnych antigénov alebo detekciu protilátok.
Priama metóda RIF je založená na skutočnosti, že tkanivové antigény alebo mikróby ošetrené imunitným sérom s protilátkami značenými fluorochrómmi sú schopné žiariť v UV lúčoch fluorescenčného mikroskopu.
Baktérie v nátere ošetrené takýmto luminiscenčným sérom žiaria pozdĺž okraja bunky vo forme zeleného okraja.
Nepriama metóda RIF je identifikovať komplex antigén-protilátka pomocou antiglobulínového (protilátkového) séra označeného fluorochrómom. Na tento účel sa nátery zo suspenzie mikróbov ošetria protilátkami antimikrobiálneho králičieho diagnostického séra. Potom sa protilátky, ktoré nie sú naviazané na mikrobiálne antigény, vymyjú a protilátky zostávajúce na mikróboch sa detegujú ošetrením náteru antiglobulínovým (antikráličím) sérom značeným fluorochrómmi. V dôsledku toho sa vytvorí komplexný mikrób + antimikrobiálne králičie protilátky + anti-králičie protilátky značené fluorochrómom. Tento komplex sa pozoruje vo fluorescenčnom mikroskope, ako pri priamej metóde.
ELISA metóda alebo analýza (ELISA)
ELISA -detekcia antigénov pomocou ich zodpovedajúcich protilátok konjugovaných so značkovacím enzýmom (chrenová peroxidáza, beta-galaktozidáza alebo alkalická fosfatáza). Po spojení antigénu s enzýmom značeným imunitným sérom sa do zmesi pridá substrát/chromogén. Substrát sa štiepi enzýmom a mení sa farba reakčného produktu - intenzita farby je priamo úmerná počtu naviazaných molekúl antigénu a protilátky.
ELISA na pevnej fáze - najbežnejší variant imunologického testu, kedy je jedna zo zložiek imunitnej odpovede (antigén alebo protilátky) adsorbovaná na pevnom nosiči, napríklad v jamkách polystyrénových platní
Pri stanovení protilátok sa krvné sérum pacienta, antiglobulínové sérum značené enzýmom a substrát (chromogén) pre enzým postupne pridávajú do jamiek doštičiek s adsorbovaným antigénom.
Vždy po pridaní ďalšej zložky sa nenaviazané činidlá odstránia z jamiek dôkladným premytím. O pozitívny výsledok farba roztoku chromogénu sa mení. Nosič v tuhej fáze môže byť senzibilizovaný nielen antigénom, ale aj protilátkami. Potom sa požadovaný antigén zavedie do jamiek s adsorbovanými protilátkami, pridá sa imunitné sérum proti antigénu označenému enzýmom a potom sa pridá substrát pre enzým.
Konkurenčná ELISA . cieľový antigén a enzýmom značený antigén navzájom súťažia o väzbu obmedzeného množstva protilátok imunitného séra. Ďalším testom sú protilátky, ktoré hľadáte
a značené protilátky medzi sebou súťažia o antigény.
Rádioimunologická metóda alebo analýza (RIA)
Vysoko citlivá metóda založená na reakcii antigén-protilátka s použitím antigénov alebo protilátok značených rádionuklidom (125 J, 14 C, 3 H, 51 Cr atď.). Po ich interakcii sa výsledný rádioaktívny imunitný komplex oddelí a jeho rádioaktivita sa stanoví v príslušnom počítadle (beta alebo gama žiarenie):
intenzita žiarenia je priamo úmerná počtu naviazaných molekúl antigénu a protilátky.
O verzia RIA na pevnej fáze jedna z reakčných zložiek (antigén alebo protilátky) je adsorbovaná na pevnom nosiči, napríklad v jamkách polystyrénových mikročipov. Ďalšou verziou metódy je konkurenčné RIA. cieľový antigén a rádionuklidom značený antigén si navzájom konkurujú o naviazanie obmedzeného množstva protilátok imunitného séra. Táto možnosť sa používa na určenie množstva antigénu v testovanom materiáli.
RIA sa používa na detekciu mikrobiálnych antigénov, stanovenie hormónov, enzýmov, liečivých látok a imunoglobulíny, ako aj iné látky obsiahnuté v testovanom materiáli v malých koncentráciách - 10 ~ | 0 -I0 ~ 12 g / l. Metóda predstavuje určité nebezpečenstvo pre životné prostredie.
Imunoblotting
Imunoblotting (IB)- vysoko citlivá metóda založená na kombinácii elektroforézy a ELISA alebo RIA.
Antigén sa izoluje pomocou elektroforézy na polyakrylamidovom géli, potom sa prenesie (blotovanie - z angl. škvrna, spot) z gélu na aktivovaný papier alebo nitrocelulózovú membránu a vyvolaný testom ELISA. Firmy vyrábajú takéto pásy s „blotami“
antigény. Na tieto prúžky sa aplikuje pacientovo sérum. Potom sa po inkubácii pacient umyje od nenaviazaných protilátok pacienta a aplikuje sa sérum proti ľudským imunoglobulínom značené enzýmom. Komplex antigén + protilátka pacienta + protilátka proti ľudskému Ig vytvorený na prúžku sa deteguje pridaním substrátu / chromogénu, ktorý pôsobením enzýmu mení farbu (obr. 13.12).
IB sa používa ako diagnostická metóda pri infekcii HIV atď.
Aglutinácia sa nazýva aglutinácia baktérií ako výsledok interakcie špecifických AT s nimi. RA vyžaduje tri zložky: 1) AG (aglutinogén); 2) AT (aglutinín); 3) roztok elektrolytu (izotonický roztok chloridu sodného). Na aglutinačnej reakcii sa zúčastňujú iba korpuskulárne antigény (baktérie, erytrocyty, latexové častice naplnené antigénom).
Aglutinačná reakcia na skle. Na podložné sklíčko bez tuku sa pipetou nanesie kvapka diagnostického séra (riedenie séra 1:10 - 1:20). Čistá kultúra skúmaného mikroorganizmu sa odoberie z povrchu šikmého agaru bakteriologickou slučkou, prenesie sa do kvapky séra a premieša sa. Výsledok reakcie sa berie do úvahy voľným okom po 3-5 minútach. Pri pozitívnej reakcii v kvapke séra sa zaznamená vzhľad vločiek (veľkých alebo malých), ktoré sú jasne viditeľné na tmavom pozadí pri pretrepaní podložného skla. V prípade negatívnej reakcie zostáva kvapalina rovnomerne zakalená.
Aglutinačná reakcia v skúmavkách. Pridajte 1 ml fyziologického roztoku do niekoľkých skúmaviek. Pridajte rovnaký objem testovaného krvného séra do prvej skúmavky. Pripravia sa postupné dvojnásobné riedenia séra (titrácia séra), po ktorých sa do každej skúmavky pridajú 2 kvapky suspenzie inaktivovaných baktérií (diagnosticum). Skúmavky sa umiestnia na 2 hodiny do termostatu pri 37 °C. Reakcia prebieha s tvorbou malých vločiek, neviditeľných voľným okom, preto sa výsledky zaznamenávajú pri miernom zvýšení v špeciálnom zariadení - aglutinoskope. Intenzita aglutinácie sa berie do úvahy podľa systému „štyri plusy“: úplná aglutinácia - 4+, čiastočná aglutinácia - 3+ alebo 2+, pochybný výsledok - +. Posledné riedenie, pri ktorom sa pozoruje aglutinácia pri 2+, sa považuje za titer protilátky v testovacom sére.
Aglutinačná reakcia v skúmavkách (rozšírená aglutinačná reakcia) sa vykonáva na stanovenie titra protilátok proti patogénom brušný týfus a paratýfus (Vidalova reakcia), brucelóza (Wrightova reakcia), týfus (Weiglova reakcia).
Aglutinácia (z lat. aglutinatio - väzba) - spájanie (spájanie) korpuskulárnych častíc nesúcich antigén (celé bunky, latexové častice a pod.) so špecifickými protilátkovými molekulami za prítomnosti elektrolytov, ktoré končí tvorbou vločiek alebo sedimentu (aglutinátu). ) viditeľné voľným okom. Povaha sedimentu závisí od povahy antigénu: bičíkové baktérie dávajú sediment veľkých vločiek, bičíkové a bezkapsulové - jemnozrnné, kapsulárne - vláknité. Rozlišujte priamu aglutináciu, pri ktorej interakcia so špecifickými protilátkami priamo zahŕňa vlastné antigény bakteriálnej alebo akejkoľvek inej bunky, ako sú erytrocyty; a nepriame alebo pasívne, v ktorých sú bakteriálne bunky alebo erytrocyty alebo latexové častice nosičmi nie svojimi, ale cudzími antigénmi (alebo protilátkami), ktoré sú na nich adsorbované, na detekciu protilátok (alebo antigénov), ktoré sú pre ne špecifické. Aglutinačná reakcia zahŕňa najmä protilátky patriace do tried IgG a IgM. Prebieha v dvoch fázach: po prvé, dochádza k špecifickej interakcii aktívneho centra protilátok s determinantom antigénu, toto štádium môže nastať v neprítomnosti elektrolytov a nie je sprevádzané viditeľnými zmenami v reagujúcom systéme. Pre druhý stupeň – tvorbu aglutinátu – je potrebná prítomnosť elektrolytov, ktoré redukujú nabíjačka komplexy antigén + protilátka a urýchľujú proces ich väzby. Táto fáza končí tvorbou aglutinátu.
Aglutinačné reakcie sú umiestnené buď na skle alebo na hladkých kartónových platniach, alebo v sterilných aglutinačných skúmavkách. Aglutinačné reakcie (priame a pasívne) na skle sa bežne používajú ako zrýchlená metóda detekcia špecifických protilátok v sére pacienta (napríklad s brucelózou) alebo na sérologickú identifikáciu patogénu. V druhom prípade sa zvyčajne používajú dobre purifikované (adsorbované) diagnostické séra obsahujúce iba monoreceptorové protilátky alebo ich sadu na rôzne antigény. Nepochybnou výhodou aglutinačnej reakcie na skle je jednoduchosť jej formulácie a skutočnosť, že trvá niekoľko minút alebo dokonca sekúnd, keďže obe zložky sú v nej použité v koncentrovanej forme. Má však len kvalitatívnu hodnotu a je menej citlivý ako skúmavka. Rozšírený aglutinačný test v skúmavkách poskytuje presnejšie výsledky, pretože umožňuje určiť kvantitatívny obsah protilátok v sére (nastaviť jeho titer) a v prípade potreby zaregistrovať skutočnosť zvýšenia titra protilátok, čo je diagnostické hodnotu. Na nastavenie reakcie v aglutinačných skúmavkách pridajte určitým spôsobom zriedený 0,85 % roztok NaCl sérum a rovnaký objem (zvyčajne 0,5 ml) suspenzie štandardného diagnostika (alebo testovacej kultúry) obsahujúcej 1 miliardu baktérií v 1 ml. Započítanie výsledkov aglutinačnej reakcie sa vykonáva predbežne po 2 hodinách inkubácie skúmaviek pri 37 ° C a nakoniec po 20 až 24 hodinách podľa dvoch kritérií: prítomnosť a veľkosť precipitátu a stupeň priehľadnosti skúmavky. supernatant. Hodnotenie sa vykonáva podľa štvorkrížového systému. Reakcia je nevyhnutne sprevádzaná kontrolou séra a antigénu. V tých prípadoch, keď sa na sérologickú identifikáciu patogénu používa podrobný aglutinačný test v skúmavke, má diagnostickú hodnotu, ak je reakcia vyhodnotená ako pozitívna pri zriedení diagnostického séra aspoň na polovicu jeho titra.
Je potrebné vziať do úvahy, že pri miešaní roztokov homológnych antigénov a protilátok nie sú vždy pozorované viditeľné prejavy aglutinačnej reakcie. Precipitát vzniká len pri určitých optimálnych pomeroch oboch reakčných zložiek. Mimo týchto limitov sa pri výraznom prebytku antigénu alebo protilátok nepozoruje žiadna reakcia. Tento jav sa nazýva „fenomén prozóny“. Pozoruje sa tak pri aglutinačnej reakcii, ako aj pri precipitačnej reakcii. Výskyt prozónu v imunitných reakciách sa vysvetľuje skutočnosťou, že antigény, ktoré sa na nich podieľajú, sú spravidla polydeterminanty a molekuly IgG protilátky majú dve aktívne centrá. Pri nadbytku protilátok je povrch každej častice antigénu pokrytý molekulami protilátky, takže nezostávajú žiadne voľné determinantné skupiny, takže druhé, neviazané aktívne centrum protilátok nemôže interagovať s inou antigénnou časticou a viazať ich na seba. Tvorbu viditeľného aglutinátu alebo precipitátu potláča aj nadbytok antigénu, kedy nie je jediné voľné aktívne miesto protilátok, a preto sa už nedajú zväčšiť komplexy antigén + protilátka + antigén.
Možnosti zrýchlených aglutinačných reakcií. Reakcia pasívna hemaglutinácia a jeho varianty
Klasická aglutinačná reakcia zahŕňa použitie korpuskulárnych antigénov. Avšak môžu byť zahrnuté aj rozpustné antigény. Aby to bolo možné, takéto antigény sa adsorbujú na imunologicky inertné častice. Ako nosič možno použiť častice latexu alebo bentonitu, v súčasnosti sa však najčastejšie používajú erytrocyty zvierat alebo ľudí, ktoré zlepšujú svoje adsorpčné vlastnosti úpravou roztokmi tanínu, formalínu alebo benzidínu. Erytrocyty adsorbujúce antigén na seba sa nazývajú senzibilizované týmto antigénom a imunitná odpoveď, na ktorej sa zúčastňujú, - reakcia nepriamej alebo pasívnej hemaglutinácie (RNHA, alebo RPHA), pretože erytrocyty sa na nej pasívne podieľajú.
RPGA je umiestnený v špeciálnych polystyrénových platniach s otvormi s polguľovým dnom. Pri jeho použití na sérologickú diagnostiku sa v týchto jamkách pripravujú dvojnásobné riedenia fyziologický roztokštudovaného séra a následne sa k nemu pridá suspenzia senzibilizovaných erytrocytov ako diagnostická súprava. Výsledky sa zaznamenávajú po 2 hodinách inkubácie pri 37 °C podľa štvorkrížového systému. Pri pozitívnej reakcii sa aglutinované erytrocyty usadzujú na dne jamky a rovnomerne ju pokrývajú vo forme obráteného dáždnika. Pri negatívnej reakcii sa erytrocyty tiež usadia, kvapalina sa stáva priehľadnou, zrazenina vyzerá ako malý „disk“ v strede otvoru. Sérový titer v RPHA sa považuje za jeho posledné riedenie, ktoré stále poskytuje výraznú hemaglutináciu bez významné znaky mať disk.
RPHA je možné použiť aj ako zrýchlenú metódu bakteriologickej diagnostiky na detekciu neznámych baktérií, vírusov, toxínov, ako sú morové patogény, stafylokokové enterotoxíny a pod., priamo v testovanom materiáli protilátky - protilátka erytrocytum diagnosticum. Ak testovaný materiál obsahuje dostatočné množstvo známeho antigénu, TPHA bude pozitívny.
Možnosti použitia RPGA sú: reakcia neutralizácie antigénu (RNAg), reakcia neutralizácie protilátky (RNAt), reakcia pasívnej inhibície hemaglutinácie (RPHA). Na tieto reakcie sa používajú antigénne a protilátkové erytrocytové diagnostiky. Súbežne možno použiť dve vzájomne sa kontrolujúce jednosmerné reakcie, napríklad RPHA s antigénnym diagnostikom a RNAg s protilátkovým erytrocytovým diagnostikom.
Protilátková neutralizačná reakcia (RNAt) spočíva v tom, že suspenzia obsahujúca požadovaný antigén sa zmieša so špecifickým imunitným sérom obsahujúcim známe protilátky vo vhodných objemoch a inkubuje sa pri teplote 37 °C počas dvoch hodín. Potom sa pridá antigénne erytrocytové diagnosticum. Zmes sa pretrepe a nechá sa pri teplote miestnosti. Výsledky sa berú do úvahy po 3-4 hodinách a nakoniec - po 18-24 hodinách.Ak je v testovanom materiáli antigén, naviaže protilátky (neutralizuje ich), a preto nedôjde k hemaglutinácii.
Podľa rovnakého princípu sa uskutočňuje reakcia neutralizácie antigénu (RNAg). Iba v tomto prípade sa v testovanom materiáli zistia protilátky. Špecifický antigén pridaný k takému testovanému materiálu sa naviaže na protilátky v ňom obsiahnuté, t.j. antigén bude neutralizovaný protilátkami, a preto po pridaní protilátky erytrocytárne diagnosticum nenastane hemaglutinácia.
Koaglutinačná reakcia. Je to jedna z možností pasívnej, t.j. bunkami sprostredkovanej protilátkovo-nosičom zrýchlenej aglutinačnej reakcie na skle. Táto reakcia je založená na jedinečná nehnuteľnosť Staphylococcus aureus, ktorý má vo svojej bunkovej stene proteín A, sa viažu na Fc fragmenty IgG a IgM. Súčasne aktívne centrá protilátok zostávajú voľné a môžu interagovať so špecifickými determinantami antigénov. Na podložné sklíčko sa nanesie kvapka 2% suspenzie stafylokokov senzibilizovaných zodpovedajúcimi protilátkami a pridá sa kvapka suspenzie študovaných baktérií. Keď antigén zodpovedá protilátkam, po 30-60 sekundách dôjde k jasnej aglutinácii stafylokokov naložených protilátkami.
Latexová aglutinačná reakcia (LAH). Nosičom protilátok v tomto diagnostickom systéme sú malé štandardné častice latexu. Reakcia sa uskutočňuje mikrometódou v jamkách na skle. Hlavnou podmienkou úspešného nastavenia PAH je prísne dodržiavanie kvantitatívnych pomerov zložiek systému: 10 µl latexového prípravku senzibilizovaného protilátkami sa pridá k 50 µl testovaného materiálu. Špecifickosť PAH sa kontroluje pomocou troch kontrolných testov obsiahnutých v komerčných testovacích systémoch: známa pozitívna reakcia, známa negatívna reakcia a kontrola kvality latexovej suspenzie pre latexy nesenzibilizované PAH (neobsahujúce protilátky) testom materiál. U nás sa ako nosiče špecifických protilátok používajú monodisperzné polystyrénové latexy s rôznymi priemermi častíc (0,3; 0,66; 0,75; 0,8 μm). PAH sa používa na rýchlu detekciu mikroorganizmov alebo ich antigénov v testovanom materiáli.
Imunomagnetická detekcia antigénov. Jedna z možností zrýchlenej aglutinačnej reakcie na skle je spojená s použitím supermagnetických polymérnych častíc potiahnutých špecifickými protilátkami. Jedna takáto častica viaže až 107-108 buniek mikroorganizmov, vďaka čomu je citlivosť túto metódu dosahuje 5 CFU / ml. Imunomagnetickú detekciu mikroorganizmov možno použiť v kombinácii s KPR.
Agregátno-hemaglutinačná reakcia (RAGA). Umožňuje rýchlo odhaliť v krvi pacientov ako voľne cirkulujúce antigény (antigenémia), tak aj antigény spojené s protilátkami – cirkulujúce imunitné komplexy (CIC). Pre RAGA sa používajú erytrocyty senzibilizované vhodnými protilátkami. Pridanie krvného séra pacienta, ktoré obsahuje antigény, k senzibilizovaným erytrocytom, na ktoré sú fixované protilátky, vedie k zlepeniu (aglutinácii) erytrocytov a imunitných komplexov.
Antiglobulínový Coombsov test (R. Coombsova reakcia). Pomocou priamych a pasívnych aglutinačných reakcií sa stanovujú kompletné (bivalentné) protilátky. Nekompletné (monovalentné, blokujúce) protilátky sa týmito metódami nedetekujú, pretože v kombinácii s antigénom ho blokujú, ale nemôžu spôsobiť agregáciu antigénu do veľkých konglomerátov. Neúplné (blokujúce) protilátky sú tie, v ktorých funguje iba jedno aktívne centrum; druhé aktívne centrum z neznámeho dôvodu nefunguje. Na identifikáciu neúplných protilátok sa používa špeciálna Coombsova reakcia (obr. 72). Na reakcii sa podieľa: sérum pacienta, v ktorom sa stanovujú neúplné protilátky, korpuskulárny antigén-diagnostika, antiglobulínové sérum s obsahom protilátok proti ľudskému globulínu. Reakcia prebieha v dvoch fázach:
Interakcia antigénu s nekompletnými protilátkami. Neexistujú žiadne viditeľné prejavy. Prvý stupeň je ukončený premytím antigénu zo zvyškov pacientovho séra.
Interakcia antiglobulínového séra získaného ako výsledok imunizácie zvieraťa ľudským globulínom s neúplnými protilátkami adsorbovanými na antigén. Vzhľadom na to, že antiglobulínové protilátky sú bivalentné, viažu dve monovalentné protilátky samostatných komplexov antigén +. neúplná protilátka, čo vedie k ich zlepeniu a vzniku viditeľnej zrazeniny.
Obsah predmetu "Imunomodulátory. Imunodiagnostika infekčných chorôb.":Predĺžená aglutinačná reakcia (RA). Na stanovenie AT v krvnom sére pacienta vložte rozšírená aglutinačná reakcia (RA). Na tento účel sa do série riedení krvného séra pridáva diagnostikum - suspenzia usmrtených mikroorganizmov alebo častíc s adsorbovaným Ag. Maximálne riedenie aglutinácia Ag, nazývaný titer krvného séra.
Odrody aglutinačnej reakcie (RA) na zistenie AT - kvapkový test na tularémiu (s aplikáciou diagnostika na kvapku krvi a objavením sa viditeľných belavých aglutinátov) a Huddlesonovej reakcie na brucelózu (s diagnostikom zafarbeným genciánovou violeťou aplikovanou na kvapku krvného séra).
Približná aglutinačná reakcia (RA)
Na identifikáciu izolovaných mikroorganizmov sa na podložné sklíčka umiestni približná RA. Za týmto účelom sa kultúra patogénu pridá do kvapky štandardného diagnostického antiséra (v riedení 1:10, 1:20). Ak je výsledok pozitívny, dajú podrobnú reakciu so zvyšujúcim sa riedením antiséra.
reakciu za pozitívne, ak sa aglutinácia pozoruje v riedeniach blízkych titru diagnostického séra.
OAS. Somatické O-Ag sú tepelne stabilné a odolávajú varu 2 h.. Pri interakcii s AT tvoria jemnozrnné agregáty.
N-Ag. H-Ag (bičíkatý) termolabilné a rýchlo zničené pri 100 °C, ako aj pôsobením etanolu. Pri reakciách s H-antisérom sa po 2 hodinách inkubácie vytvoria voľné veľké vločky (vytvorené baktériami, ktoré sa zlepia s bičíkmi).
Vi Ar baktérie týfusu sú relatívne termostabilné (odoláva teplote 60-62 ° C počas 2 hodín); pri inkubácii s Vi-antisérom vzniká jemnozrnný aglutinát.
Priame hemaglutinačné reakcie
Najjednoduchšie z nich reakcie - aglutinácia erytrocyty, alebo hemaglutinácia, používané na stanovenie krvných skupín v systéme AB0. Na určenie aglutinácia(alebo jeho absencia) sa používajú štandardné antiséra s anti-A a anti-B aglutinínmi. Reakcia sa nazýva priama, pretože študované antigény sú prirodzenými zložkami erytrocytov.
Zdieľané s priama hemaglutinácia mechanizmov má vírusovú hemaglutináciu. Mnohé vírusy sú schopné spontánne aglutinovať vtáčie a cicavčie erytrocyty a ich pridanie do suspenzie erytrocytov spôsobuje tvorbu agregátov z nich.
