VŠEOBECNÉ FARMAKOPICKÉ POVOLENIE

Zavedené namiesto metódy uvedenej vo FS 42-3874-99

Táto monografia všeobecného liekopisu je určená na štúdium antigénneho zloženia biologické materiály, ako aj na stanovenie čistoty, kvalitatívneho a kvantitatívneho zloženia imunobiologických lieky(ILP) metódou imunoelektroforézy (IEF) v agarovom géli, kombinujúcou metódy zonálnej elektroforézy a imunodifúzie.

V procese imunoelektroforézy v géloch alebo na filmoch acetátu celulózy pomocou jednoduchých alebo dvojitých imunodifúznych metód dochádza k reakcii medzi rozpustnými proteínmi a precipitačnými protilátkami pre ne špecifickými. Kvantitatívne stanovenie proteínov sa môže uskutočniť pomocou elektroforézy v médiu obsahujúcom protilátky (elektroimunoanalýza, elektroimunodifúzia, raketová imunoelektroforéza). Antigénna povaha proteínových zložiek môže byť skúmaná ich porovnaním so známymi markermi.

Účinnosť imunochemických testov závisí od špecifickosti použitých antisér, ako aj od ich titra a afinity k antigénom.

Typicky je imunoelektroforéza kombináciou agarovej (alebo agarózovej) gélovej elektroforézy, po ktorej nasleduje dvojitá imunodifúzia v rovnakom médiu. Pri dvojrozmernej dvojitej imunodifúzii antigén a protilátky umiestnené v okrúhlych alebo pravouhlých priehlbinách gélu migrujú k sebe, v dôsledku čoho sa pri stretnutí vytvárajú precipitačné línie (oblúky). Poloha precipitačných pásov závisí od difúzneho koeficientu antigénu, jeho koncentrácie vo vzťahu k protilátkam (rýchlosť difúzie protilátky možno považovať za konštantnú). Určitý pomer koncentrácií antigénu a protilátky, ktorý je optimálny pre tvorbu zrazeniny, sa nazýva zóna ekvivalencie. Výsledkom sú jasné čiary zrážok.

Koncentrácia (titer) protilátok v imunitnom sére sa tiež môže výrazne líšiť. Je možné, že zóny ekvivalencie pre rôzne zložky zmesi sa nebudú prekrývať. Na výber ekvivalentného pomeru antigén-protilátka sa odporúča vykonať imunoelektroforézu viaczložkových zmesí pri niekoľkých relatívnych koncentráciách antigén-protilátka, pretože pri použití len jednej takejto koncentrácie nemusí byť jedna alebo druhá zložka detekovaná.

Metóda imunoelektroforézy na agarovom géli

Sklenená doska s rozmermi 90 x 120 mm ošetrená alkoholom je na pódiu umiestnená striktne horizontálne. Ochladený na teplotu (45±5) 0 C sa na sklenenú platňu nanesie agarový gél v množstve 18,0-20,0 ml. Po stuhnutí pri teplote miestnosti sa po 20-30 minútach na platni vytvorí agarová vrstva s hrúbkou 2,0-2,5 mm.

Po vytvrdnutí gélu sa v ňom pomocou špeciálnej šablóny vyreže 6-7 otvorov s priemerom 1-2 mm. Jamky sa naplnia testovanou vzorkou v objeme nepresahujúcom objem jamky (2 jamky pre každú testovanú vzorku). Súčasne sa do hornej a dolnej jamky sklenenej platne zavedie kontrolná vzorka s gélom - normálne ľudské krvné sérum („Štandardná vzorka testovacieho systému na stanovenie frakčného (antigénneho) zloženia prípravkov z ľudského krvného séra imunoelektroforézou“ alebo iná kontrolná vzorka v súlade s pokynmi v monografii alebo normatívnej dokumentácii), zafarbená pyronínom B (alebo iným farbivom špecifikovaným v monografii alebo normatívnej dokumentácii).

Do odmerného valca s objemom 1000 ml pridajte 500 ml veronal-medinal alebo borátového tlmivého roztoku, objem roztoku doplňte po značku čistenou vodou a premiešajte. Výsledný roztok (alebo iný tlmivý roztok špecifikovaný v monografii alebo regulačnej dokumentácii) sa naleje do elektródových sekcií komory elektroforézneho zariadenia.

Platňa s pripraveným gélom sa umiestni do zariadenia na elektroforézu a pomocou niekoľkých vrstiev filtračného papiera sa spojí s tlmivým roztokom v elektródových komorách zariadenia. V prípade konštrukcie zariadenia na elektroforézu, ktorá zabezpečuje spojenie agaru na platni s elektródovým tlmivým roztokom pomocou agarových stĺpcov, sa platňa vloží do vyváženého zariadenia a zaleje sa roztaveným agarom, kým sa nespojí s agarovými stĺpcami. a vytvorí sa gélová vrstva hrubá 1–2 mm.

Zariadenie na elektroforézu je zakryté vekom a zapnutý zdroj energie (napätie 70-200 V, prúd 10-40 mA). Elektroforéza sa uskutočňuje 1,5 až 3 hodiny, kým škvrna pyronínu B, zodpovedajúca migrácii albumínu, nebude vo vzdialenosti 20 až 25 mm od jamky.

Po elektroforéze pomocou špeciálnej šablóny sa medzi jamkami v agarovom géli vyrežú pozdĺžne „ryhy“ (paralelné so smerom migrácie). Do „drážok“ sa pridá 0,25 ml zrážacieho antiséra: proti ľudským sérovým proteínom (pri testovaní frakčného zloženia) alebo polyvalentné sérum proti ľudským sérovým proteínom, veľké dobytka, kone a ošípané (na potvrdenie pravosti).

Platňa s agarovým gélom sa umiestni do vlhkej komory a udržiava sa pri teplote (5 ± 3) 0 C počas 24-48 hodín.

Na premytie proteínov, ktoré nevstúpili do precipitačnej reakcie, sa agarová platňa vloží do kyviet, naleje sa do 0,9 % roztoku chloridu sodného a inkubuje sa 16 až 18 hodín, pričom sa roztok 3 až 4-krát vymení. Potom sa platňa vyberie z 0,9 % roztoku chloridu sodného, ​​prikryje sa filtračným papierom namočeným v 0,9 % roztoku chloridu sodného a suší sa na vzduchu, kým sa agarový gél nezmení na tenký film. Potom sa platňa s vysušeným gélom prekryje filtračným papierom namočeným v 0,9% roztoku chloridu sodného, ​​pričom nezanecháva vzduchové bubliny, a suší sa pri izbovej teplote alebo v sušiarni pri teplote neprevyšujúcej 40°C. Po vysušení platní sa filtračný papier navlhčí vodou a opatrne sa odstráni.

Na farbenie proteínov sa používa farbivo amido black 10B alebo iné vhodné farbivo (v súlade s pokynmi v monografii alebo regulačnej dokumentácii), pričom sa platňa umiestni do kyvety s roztokom farbiva na 30-40 minút. Potom sa platňa premyje v agarovom premývacom roztoku (2% roztok kyseliny octovej alebo iný roztok, v súlade s pokynmi v regulačnej dokumentácii) počas 15-40 minút, kým úplne nezmizne farebné pozadie, a znova sa vysuší pri izbovej teplote alebo v rúre pri teplote neprevyšujúcej 40 °C.

Lipoproteíny sa farbia sudánskou čiernou B. Na farbenie sa úplne vysušené platne umiestnia na 3 hodiny do roztoku farbiva, potom sa odfarbia 50 % etanolom, kým nie je pozadie úplne čisté. Lipoproteíny sa farbia na tmavomodro. Malo by sa vykonať farbenie úplne vysušeného prípravku, pretože sudánska čerň B je nerozpustná vo vode a farbí mokrý gél.

Započítanie výsledkov pri štúdiu frakčného zloženia ľudských imunoglobulínových prípravkov sa vykonáva vizuálne porovnaním elektroforegramu testovanej vzorky s elektroforegramom kontrolnej vzorky – normálneho ľudského krvného séra („Štandardná vzorka testovacieho systému na stanovenie frakčné (antigénne) zloženie prípravkov z ľudského krvného séra imunoelektroforézou“ alebo inej kontrolnej vzorky v súlade s pokynmi v regulačnej dokumentácii), ktorá by mala vykazovať regulovaný počet precipitačných línií so sérom proti ľudským sérovým proteínom (najmenej 15 precipitačných línií). pri použití " štandardná vzorka testovacie systémy na stanovenie frakčného (antigénneho) zloženia prípravkov z ľudského krvného séra imunoelektroforézou). Hlavná zložka prípravku ľudského imunoglobulínu by mala zodpovedať imunoglobulínu G (Ig G) normálneho ľudského krvného séra.

Zohľadňovanie výsledkov pri vykonávaní štúdií na potvrdenie pravosti produktov ľudskej krvi sa vykonáva vizuálne identifikáciou línií precipitácie so sérom proti sérovým proteínom ľudskej, hovädzej, konskej a prasacej krvi. Precipitačné línie by sa mali detegovať iba so sérom proti ľudským sérovým proteínom.

Poznámky

1. Príprava 0,05 M veronal-medinal tlmivého roztoku(pH 8,6 ± 0,1). Do odmernej banky s objemom 1000 ml pridajte 1,38 g veronalu, 8,76 g medinalu, pridajte čistenú vodu po značku a miešajte, kým sa úplne nerozpustí.

1. Príprava 0,05 M roztoku borátového pufra(pH 8,6 ± 0,1). Do odmernej banky s objemom 1000 ml pridajte 6,7 g kyselina boritá 13,4 g 10-vodného tetraboritanu sodného, ​​pridajte vodu vyčistenú po značku a premiešajte.
2. Príprava 1,25% agarového gélu. Príprava agarového gélu sa vykonáva jedným z nasledujúcich spôsobov:
3. Na prípravu 1,25 % agarového gélu sa použije 0,05 M veronal-medinal pufor (pH 8,6 ± 0,1) s dvojnásobnou koncentráciou soli (v tomto poradí 2,76 g veronalu a 17,52 g medinalu na 1000 ml čistenej vody).
4. Na prípravu 1,25 % agarového gélu sa použije borátový tlmivý roztok (pH 8,6 ± 0,1) s koncentráciou dvojitej soli (v tomto poradí: 13,4 g kyseliny boritej a 26,8 g 10-vodného tetraboritanu sodného na 1000 ml čistenej vody).

Do chemickej kadičky s objemom 1000 ml sa pridá 12,5 g agaru, pridá sa 500 ml čistenej vody a gél sa nechá hodinu napučať pri teplote (20 ± 1) 0 C. obsah sa umiestni do vriaceho vodného kúpeľa a inkubuje sa, kým sa agar úplne neroztopí. Objem gélového roztoku sa upraví vodou na 500 ml, potom sa pridá rovnaký objem veronal-medinal alebo borátový tlmivý roztok (alebo iný tlmivý roztok špecifikovaný v monografii alebo v normatívnej dokumentácii). Agarový roztok sa prefiltruje cez 2-3 vrstvy gázy, pridá sa tiomersal do koncentrácie 100 μg / ml a naleje sa do 40-50 ml fľaštičiek (množstvo potrebné pre dve platne). Roztopený agar by mal byť číry.

1. Príprava farbiaceho roztoku amidovej černe 10B. Príprava roztoku farbiva sa uskutočňuje jedným z nasledujúcich spôsobov:
2. Do odmernej banky s objemom 1000 ml pridajte 1,0 g amidovej černe 10B, 450 ml 0,1 M roztoku kyseliny octovej, 550 ml 0,1 M roztoku octanu sodného a premiešajte.
3. Do odmernej banky s objemom 1000 ml pridajte 1,0 g aminočerne 10B, 100 ml ľadovej kyseliny octovej, doplňte objem po značku čistenou vodou a premiešajte. Po 12 hodinách prefiltrujte cez papierový filter.
4. Príprava farbiaceho roztoku Sudánska čerň B. Do odmernej banky s objemom 1000 ml pridajte 1,2 g čierneho Sudánu B, 20 ml 1M roztoku hydroxidu sodného, ​​380 ml čistenej vody a objem roztoku doplňte po značku absolútnym etanolom a premiešajte. Zmes sa krátko povarí, ochladí na izbovú teplotu a po vychladnutí sa farbivo preleje do tmavej fľaše so zabrúsenou zátkou. Činidlo sa uchováva pri izbovej teplote 3 mesiace.
5. Príprava 2% roztoku kyseliny octovej na premývanie agaru. Do odmernej banky s objemom 1000 ml pridajte 20,0 ml ľadovej kyseliny octovej, doplňte objem roztoku čistenou vodou po značku a premiešajte. Činidlo sa uchováva pri izbovej teplote 3 mesiace.

Vynález sa týka laboratórneho zariadenia. Účelom vynálezu je skrátiť čas výskumu a znížiť spotrebu gélu. Zariadenie obsahuje kyvetu 1, prepážku 2, tlmivý roztok 3, držiak 4 gélu s viečkom 11 a elektródy 12. V držiaku 4 na jeho pracovnej ploche sú horizontálne drážky spojené kanálmi s dutinami na protiľahlých stranách oddielu. Kryt 11 má rady otvorov 7 a 8 usporiadaných v pároch nad každou drážkou. Držiak a kryt sú vyrobené z priehľadného materiálu. Séra sa umiestnia do otvorov 7 a 8 a zapne sa napájanie. V dôsledku reakcie vzniká zrazenina, podľa ktorej sa posudzuje prítomnosť alebo neprítomnosť antigénu. Reakcia prebieha v uzavretom bloku, gél nevypĺňa celý držiak, ale len drážky, čo umožňuje znížiť jeho spotrebu. 1 z.p. f-ly, 3 chor.

SOVIETSKÁ ÚNIA

SOCIALISTA

REPUBLIKA

OPIS VYNÁLEZU

K CERTIFIKÁTU BTOPCKOMY

ŠTÁTNY VÝBOR

ZA VYNÁLEZY A OBJAVY

V SCST ZSSR

1 2) 11 4) 6111(1>(-1-1 (221 1(1.(n>.X7)

I 4t> I; 3 (I. I (j.> Ü. I ">. i X 4 (1 (711 Veeeon) zn>> n (napr. (b (ni a lbor>triple technpki (721 V.) !. (:obole(3, . 3. V. bap (tano> 3, V.. 1. Výhra, iüåv a 3. V. (; g3 IIHh (> v

N()6)7471), kl. A 6! V 5i ():), 1 (177.

1541 Y(. E C3(r1(:Th() L, 15(!! P()BE:., ((.1!1! SI)

1! Y:) (Y ((OE.1 () .. (; TR (.) FOR! .3> "3 V (l, 1 (. (571 And) (obreT (ni (od nouite> 1 až 1 "l) ()()j) ()),"(onwin) I I(.lb tt 3(>()e l (. niya okrap (epis of time veilingll. i ne.> elova1eni)<.>„„SU„„15179 8 A 1 (5() 4 A b (V 5/04, C (01 3 33) 48

2 eo i (1,11 hv>ttl g „(, ozvučnica -”, b 1), (, terzh "te.> 4 gel e viečko 11 II s. (ektrols 12. V držiaku 4 na sv.

Raen> a ll VYSOKÁ UDALOSŤ EXP.> N kibl G) RIZONT; 1.> ьHl, i (113> bi, spojené (kanály s poloetmi pozdĺž E); t 1 p (> kap., ((sused a kryt sú vyrobené h;>ts rial. Sy(>s>rotki ps>m"n11>n>t v geretii 7 a 8 a incln)11)n>t bloku vírenia. In re T 3T (. reakcia ((ii obrdz3e1 u; i.t (> h, a kT () I) "%ted e) lyat o n,), (a" Hll lt, lit o ": an". l (ll "n a ll. k (). 1it 13 3 1 kE>tT(>M (<.1>h(, Г(. l b 3 ,!v

tl >t(ll a.(b1, a T(>new>;o 1,1() 3 b1eHbllll(Tb (th P;t 1 3 a

Nárokovať

[0001] Vynález sa týka lekárskeho zariadenia a môže byť použitý v krvnej službe, na infekčných oddeleniach

6 nemocníc, v klinických diagnostických laboratóriách zdravotníckych zariadení.

Účelom vynálezu je skrátiť čas vykonávania výskumu a znížiť spotrebu gélu.

Na obr. 1 znázorňuje zariadenie pre

II!)()k3Deniss Red)I(HI(; kid Obr. 2 držiak, rez, Obr. 3 rovnaký, pohľad zhora.

Zariadenie na imunoelektroforézu pozostáva z vetu 1, rozdeleného po celej dĺžke prepážkou 2 na dve časti, tvoriace priestory medzi tlmivými elektródami naplnené tlmivým roztokom 3.

111k prepážka 2, je osadený držiak 4 gs I) I, ktorý je priehľadný a

6 1()k, ktorý obsahuje sériu slotov 5, cat()!)bl(. imageK)T autonómne kanály spájajúce vyrovnávaciu pamäť 3 na oboch stranách partície 2. Každý kanál má dva ()Tk3cpcTkIkI b na ich vytvorenie syn () tkanivo 7 a sérum 8. Kanály sú od seba oddelené tenkou stenou 9.

Na elektroforézu v prístroji sa z barbitu pripraví veronal-medinal tlmivý roztok l I sodík (medinal 17,5 g a barG> a I I.ld Be!) he 1) l) 2,7 g B 1000 ml dis1 a, s , l )11)()k)k)IIII()II Zv.

Gól r () govyaz z 1) gara fi pmi>

k.("I1kckIT1), 1 g agaru na 100 ml tlmivého roztoku.

11re.l nicha) om drážky pre elektroforézu 5 zai (.) nyak) 1 nosič 0 (agarový gél), 3dT (I v dslak géle) t vybrania, v jednom

I I 3), r)) 6. 1 n a i V i os Ya t sy V o r k x 7, V I I 1) buffer 3, držiak podpery B.II)k)dk()T cez prepážku 2. Cuvée Tv

3dk!)I l«d l() l kryt 11 s elektródami 2.

Zariadenie funguje nasledovne.

Komora je napájaná konštantným napätím. Pri prechode jednosmerného prúdu cez elektródový tlmivý obvod - nosič - tlmivý roztok - elektróda sa antigény a protilátky pohybujú k sebe a pri interakcii vytvárajú voľným okom viditeľnú zrazeninu. Sediment umožňuje posúdiť prítomnosť alebo neprítomnosť

1O antigén v študovaných sérach. Takto je možné identifikovať pacientov s kliešťovou k3blM encefalitídou, meningitídou, sérovou hepatitídou a inými imunologickými ochoreniami.

V navrhovanom zariadení na vedenie -! 5 elektroforéza, technológia výroby je výrazne zjednodušená, držiak je eliminovaný komplexný dizajn, ale vzhľadom na to, že reakcia prebieha v uzavretej jednotke, a vyparovanie a iné vonkajšie faktory nemôže ovplyvniť sérum a nosič umiestnený v drážkach 5, viečko môže byť ploché. Tým sa zlepšujú ukazovatele kvality.

1. Zariadenie na uskutočňovanie imunoelektroforézy v géli, obsahujúce kyvetu, elektródy, priehradku rozdeľujúcu komorovú kyvetu na dve dutiny a držiak gélu namontovaný na priehradke, vyznačujúci sa tým, že na skrátenie doby študujte a znižujte spotrebu gélu, držiak je vyrobený s horizontálnymi drážkami na pracovnej ploche, spojenými kanálmi s rôznymi podlahami (kyvetami) a vybavený doskou Ç5 v kontakte s jej pracovným povrchom a s radmi otvorov umiestnenými v pároch nad každou drážkou .

Imunoelektroforéza- jedna zo široko používaných metód kvalitatívnej analýzy antigénov. S vhodným precipitačným AS sa môže použiť na skúmanie akejkoľvek antigénnej zmesi. Úspešne sa analyzujú najmä bielkoviny krvného séra, cerebrospinálneho moku, moču, mlieka, extrakty z orgánov, ako aj bielkoviny rastlinného a bakteriálneho pôvodu. V ambulancii sa táto metóda najčastejšie využíva pri diagnostike paraproteinémie a stavy imunodeficiencie. IN forenzná medicína používa sa na analýzu systémov haptoglobínu a skupinovo špecifickej zložky Gc.

Vo výskumnej práci je imunoelektroforéza hlavnou metódou identifikácie proteínov obsiahnutých v komplexných zmesiach. Je nevyhnutný ako metóda na dôsledné sledovanie procesu čistenia proteínových prípravkov. Často sa používa aj na kontrolu pravosti a čistoty týchto prípravkov. Prirodzene, metódu, ktorá má také široké uplatnenie, bolo potrebné v rôznych smeroch upravovať a zdokonaľovať. Boli navrhnuté nové nosiče: agarózový gél, PAAG, filmy z acetátu celulózy.

Zároveň sa IEF začal kombinovať s rôzne metódyšpecifické farbenie a fluorochromizácia na detekciu enzýmov, sacharidov, lipoproteínov, nukleoproteínov. V dôsledku kombinácie s inými metódami analýzy vznikla disková imunoelektroforéza, imunoelektrofokusácia, rádioimunoelektroforéza atď.. Pre kvantitatívne stanovenie pomocou polyšpecifickej AS bola nedávno navrhnutá dvojrozmerná IEF. Špeciálna modifikácia dvojrozmerného IEF môže zvýšiť jeho citlivosť na úroveň RIA. To sa dosiahne elektroforetickou elúciou antigénu z malých sklenených nádobiek s objemom 0,1-10 ml. Pre IEF s chladením Wimet navrhol zariadenie, ktoré automaticky udržiava konštantnú teplotu a prúd počas separačného procesu.

Toto zariadenie je veľmi vhodné na stanovenie elektroforetickej mobility rôznych látok. Použitie termoelektrického chladenia (Peltierova batéria) v tomto zariadení by sa malo odporúčať najmä pri práci s enzýmami a inými termolabilnými látkami. Nedávno bola navrhnutá jednoduchá metóda na separáciu proteínov v dvojrozmernej elektroforéze. Známa je citlivá metóda stanovenia neprecipitačných systémov antigén-protilátka na základe použitia MAb, tzv. kaskáda IEF, vrátane fixácie AG po elektroforéze, naviazania protilátok na antigény, odstránenia naviazaných protilátok a ich kvantifikácie.

V prípade imunofixačnej elektroforézy sa separujú protilátky, nie antigén. Je to rýchla a ekonomická metóda a je vhodná najmä na hromadný skríning na detekciu paraproteinémie a na získanie proteínových prípravkov. Pri IEF sa často pozorujú poruchy normálneho priebehu procesu a nie je vždy možné okamžite zistiť ich príčinu. Ak sa napríklad použije nedostatočne vyčistený agar, najčastejšie to vedie k trom porušeniam: slabá tvorba gélu, silná elektrosmóza, zlé zafarbenie prípravkov. Nedostatočne čistý agar by sa mal vždy čistiť. Ak chcete začať s novou časťou agaru, musíte najskôr otestovať jej vhodnosť. Často sa zistí, že rovnaké antigény majú rôznu elektroforetickú pohyblivosť a odlišne sa farbia pri použití rôznych šarží agaru. Poruchy IEF môžu byť spôsobené hydrolýzou agaru v dôsledku opakovaného alebo príliš dlhého zahrievania.

Hydrolýza sa prejavuje oslabením gélotvorných vlastností a objavením sa nepravidelností na povrchu gélu. Elektroforetická separácia môže byť narušená, ak sa použije nesprávny tlmivý roztok. Väčšina pufrov slúži ako dobrá živná pôda pre baktérie a plesne. Preto by sa tlmivý roztok mal skladovať v chladničke alebo do neho pridať konzervačný prostriedok. Tlmivý roztok plniaci elektroforetickú komoru by sa mal meniť aspoň raz týždenne. Pri viacnásobnom použití elektródového pufra je potrebné po každom oddelení meniť póly elektród. Veľkosť napätia na svorkách kamery zvyčajne neumožňuje posúdiť fyzická sila prúd prechádzajúci gélom, preto musí byť v obvode sériovo zapojený miliampérmeter. Počas odlúčenia sa prúd takmer vždy zvyšuje. Tento jav je spôsobený zahrievaním gélu, ktoré sa zvyšuje s trvaním elektroforézy.

Po počiatočnom vzostupe však môže prúd v obvode klesnúť. Často je to spôsobené vysušením prúžkov filtračného papiera spájajúceho gél s pufrom alebo dokonca sušením samotného gélu. V tomto prípade znížte iónovú silu pufra alebo napätie na svorkách komory. Okrem toho sa dá vysychaniu zabrániť obalením gélovej platne a papierových prúžkov polymérnym filmom pred elektroforézou. Najpohodlnejšie je pracovať so zdrojom, ktorý poskytuje trvalá sila prúd (stabilizácia prúdu). Je samozrejmé, že výsledky IEF závisia od kvality antigénov a antisér.

Ryža. 8. Princíp imunoelektroforézy.

Stupeň 1: elektroforéza antigénu na agarovom géli. Antigén migruje na určitú hypotetickú vzdialenosť.

2. fáza: prúd je vypnutý. V agare sa vyreže drážka a naplní sa protilátkami. Vytvára sa zrážací oblúk. Teoreticky antigén difunduje radiálne z bodového zdroja a protilátky difundujú z drážky v rovnomernej prednej časti. Precipitáty vytvorené v bodoch optimálneho pomeru antigénu a protilátok tvoria oblúk. Oblúk sa nachádza najbližšie k drážke, kde je najvyššia koncentrácia antigénu.

Imunoelektroforéza pomáha identifikovať antigény elektroforetickou pohyblivosťou, najmä ak sú vo vzorke prítomné iné antigény.

Pomocou tejto metódy v klinickej imunológii sa semikvantitatívne stanoví koncentrácia imunoglobulínov a identifikujú sa myelómové proteíny (obr. 9).

Ryža. 9. Hlavné triedy ľudských imunoglobulínov v krvnom sére, detegované imunoelektroforézou. Do drážky bolo pridané králičie antisérum. Je znázornené umiestnenie hlavných globulínových frakcií. Boli identifikované tri z piatich hlavných tried ľudských imunoglobulínov: IgG, IgA a IgM. Oblúk zrážania IgG sa rozprestiera od oblasti y do oblasti ά2-globulínu, čo odráža extrémnu heterogenitu populácie protilátok v zložení aminokyselín aj v celkovom náboji.

Na základe kombinácie elektroforézy s imunoprecipitáciou bolo vyvinutých niekoľko úspešných metód, z ktorých každá vedie pohybom antigénu v elektrickom poli k jeho kontaktu s protilátkami. Protiimunoelektroforéza sa môže použiť na detekciu antigénov migrujúcich v agare na kladne nabitú elektródu.

Obr.10. Protiimunoelektroforéza. V dôsledku endosmózy sa protilátky pohybujú v géli "späť"; antigén, ktorý je pri danom pH negatívne nabitý, sa presunie na pozitívnu elektródu a po kontakte s protilátkami vytvorí zrazeninu.

Táto metóda trvá menej času a je citlivejšia ako Uchterlonyho dvojitá difúzia. Používa sa na identifikáciu antigénov vírusu hepatitídy B a zodpovedajúcich protilátok, protilátok proti DNA pri systémovom lupus erythematosus, autoprotilátok proti rozpustným jadrovým antigénom pri kolagenóze a protilátok (precipitínov) proti Asperqillus pri alergickej bronchopulmonálnej aspergilóze.

Raketová elektroforéza je kvantitatívna metóda, ktorá zahŕňa zavedenie antigénu do gélu obsahujúceho protilátky. Precipitačná čiara má tvar rakety, ktorej dĺžka je určená koncentráciou antigénu.

Obr.11. raketová elektroforéza. Antigén, v tomto prípade ľudský sérový albumín, sa podrobí elektroforéze v géli obsahujúcom protilátky. Vzdialenosť medzi štartovacím otvorom a prednou hranou oblúka v tvare rakety závisí od koncentrácie antigénu. V tomto prípade sú relatívne koncentrácie ľudského sérového albumínu (zľava doprava) 3, 2 a 1.

Je to ako protielektroforéza rýchla metóda, ale aj tu sa musí antigén presunúť na kladne nabitú elektródu. Raketová elektroforéza je teda vhodná pre proteíny ako albumín, transferín a ceruloplazmín, pričom koncentrácia imunoglobulínov sa zvyčajne určuje jednoduchou radiálnou imunodifúziou.

Jedným z najúspešnejších variantov raketovej elektroforézy je Laurellova dvojrozmerná alebo skrížená imunoelektroforéza. Súčasne sa v prvom stupni elektroforeticky separuje zmes antigénov v agarózovom géli. Oddelené proteíny sú potom opäť nútené difundovať cez gél pod vplyvom elektrického poľa v inom smere, kolmom na prvý. Je teda možné kvantifikovať každý z antigénov zmesi. Najpôsobivejším príkladom je hodnotenie stupňa premeny C3 na inaktivovanú formu C3c, ku ktorej často dochádza pri exacerbácii v sére pacientov so systémovým lupus erythematosus alebo v synoviálnej tekutine postihnutých kĺbov v akútnej fáze. reumatoidná artritída, ako aj v iných prípadoch.

Obr.12. Krížová imunoelektroforéza.

A. Antigény sú separované elektroforetickou pohyblivosťou v agarovom géli. Z gélu sa vyreže úzky pozdĺžny prúžok (obmedzený prerušovanou čiarou) obsahujúci oddelené antigény a aplikuje sa na iný gél obsahujúci antisérum. Potom sa uskutoční elektroforéza v smere kolmom na prvý; pričom antigény reagujú s antisérom obsiahnutým v géli, pričom vznikajú precipitačné píky. Plocha pod vrcholom závisí od koncentrácie daného antigénu.

b. Elektroferogram ukazujúci konverziu komplementovej zložky C3 (C3 → C3c) v sére. Gél je dodatočne zafarbený. V tomto prípade sa oblúky navzájom spájajú, pretože antigény majú spoločné determinanty.

V. "Mountain Fantasy" - tento elektroforegram demonštruje úžasné možnosti zosieťovanej imunoelektroforézy na oddelenie komplexnej zmesi antigénov.

Imunofluorescencia zahŕňa pripojenie fluorescenčného farbiva, ako je izotiokyanát sodný, na molekulu protilátky. Antigénny materiál (baktérie, bunky alebo ich zložky), na ktoré sú pripojené označené protilátky, sa stáva viditeľným v ultrafialovom svetle. Metóda nie je kvantitatívna, ale veľmi dôležitá v imunomorfológii na určenie lokalizácie antigénne štruktúry alebo protilátky.

Konkurencia s rádioaktívnym antigénom(rádioimunologická metóda) – jedna z naj moderné metódy. Zohľadnenie reakcie antigén-protilátka sa môže uskutočniť pomocou rádioizotopové metódy v prípade použitia „značených“ protilátok alebo antigénov. Meranie rádioaktivity precipitátu umožňuje odhadnúť množstvo protilátok alebo antigénu v testovaných vzorkách. To zvyšuje objektivitu hodnotenia, zrýchľuje účtovanie a zvyšuje citlivosť reakcie. Najcitlivejšie (stanovenie 1 - 10 ng látky) metódy konkurencie protilátok neznačeného antigénu so značeným. Princíp metódy je nasledujúci. Používa sa štandardné množstvo antiséra proti skúmanému antigénu a štandardné množstvo tohto antigénu označeného rádioaktívnym125I,131I,2H alebo iným izotopom. Ich pomer je taký, že 70 – 80 % značeného antigénu je viazaných protilátkami, pričom vzniká rádioaktívna zrazenina s hodnotou rádioaktivity N. Ak sa do reakčného systému zavedie substrát testovaný na prítomnosť tohto antigénu, potom v prítomnosti antigénu súťaží so značeným antigénom a rádioaktivita zrazeniny klesá. Čím viac antigénu v testovanej vzorke, tým menšia rádioaktivita zrazeniny. Touto metódou sa zisťuje koncentrácia v krvi, moči a iných látkach takých látok, ktoré sa pre zanedbateľné koncentrácie biochemickými metódami nezistia (hormóny: inzulín, rastový hormón, ACTH, gonadotropín, digoxín, somatotropín atď.). .).

Ryža. 13. Spôsob izolácie membránového imunoglobulínu (IgM - 8S) z povrchu B-lymfocytov.

1. Značenie povrchových proteínov lymfocytov 125 I v prítomnosti laktoperoxidázy (LP).

2. Lýza buniek a uvoľnenie povrchových proteínov do roztoku.

3. Precipitácia značených imunoglobulínov špecifickým anti-Ig sérom.

4. Pranie a vyzrážanie zrazeniny.

5. Deštrukcia precipitátu a elektroforetická analýza ľahkých a ťažkých reťazcov v polyakrylamidovom géli

Metóda ELISA predstavuje rozvoj naj v posledných rokoch. Pokiaľ ide o citlivosť, nie je nižšia ako predchádzajúca, ale je jednoduchšia v prítomnosti komerčných činidiel. Na stenách polystyrénových skúmaviek sú adsorbované protilátky proti určitému antigénu. Do tejto skúmavky sa pridá testovací substrát. V prítomnosti tohto antigénu sa spája s protilátkami. Substrát sa vypustí a do skúmavky sa zavedú protilátky proti rovnakému antigénu. Tieto protilátky sú značené enzýmom, najčastejšie chrómperoxidázou. Označené protilátky sa naviažu na predchádzajúci komplex a tiež ostanú na stenách skúmavky. Obsah skúmavky sa nahradí zmesou chromogénu (ortofenyléndiamínu) so substrátom pre tento enzým - H 2 0 2 . Ak bol v testovacej kvapaline požadovaný antigén, enzým je fixovaný na stenách skúmavky, rozkladá H 2 0 2: uvoľnený kyslík zafarbí chromogén do žlta.

Väčší spôsob zahŕňa použitie fotoelektrického nefelometra na započítanie precipitácie, ktorým sa zaznamenáva zmena optickej hustoty séra po pridaní antigénu. Keď sa sérum zriedi destilovanou vodou, optická hustota sa zníži. Ak sú v sére protilátky a ako riedidlo, vodný roztok antigén, potom bude krivka zmien optickej hustoty iná. Najprv dochádza k poklesu optickej hustoty, pri nahromadení dostatočného množstva antigénu sa pokles zastaví, potom sa pozoruje nárast optickej hustoty zmesi antigén-protilátka.

Fenomén lýzy- schopnosť niektorých protilátok rozpúšťať bunky, proti ktorým vznikli. Tieto protilátky vo vzťahu k baktériám sa nazývajú bakteriolyzíny, k erytrocytom - erytrolyzíny alebo hemolyzíny. Reakcie imunitnej lýzy sú charakteristické tým, že sa nevyskytujú len v prítomnosti dvoch zložiek – antigénu a protilátky. Musí byť prítomná tretia zložka, nazývaná doplnok. V rôznych množstvách je komplement obsiahnutý v krvnom sére mnohých zvierat; najmä veľa v krvnom sére morčatá. Reakcia spočiatku prebieha podľa typu aglutinácie, potom sa ku komplexu antigén-protilátka pripojí komplement a dochádza k lokálnemu rozpusteniu membrány baktérií, erytrocytov alebo iných buniek.

Fenomén cytotoxicity určené protilátkami nazývanými cytotoxíny. Ich pôsobenie spočíva v tom, že vykazujú toxický účinok, ktorý zbavuje bunky životaschopnosti. Reakcia na detekciu cytotoxínov vložená do suspenzie buniek v izotonickom tlmivom roztoku chloridu sodného. Pridáva sa do nich farbivo, napríklad eozín alebo trypánová modrá. Živé bunky nie sú zafarbené, mŕtve bunky rýchlo vnímajú farbivo (do 30 s). Ak sa do bunkovej suspenzie pridá imunitné sérum obsahujúce cytotoxíny a komplement, bunky pri testovaní farbivami odumrú a zafarbia sa. Percento mŕtvych buniek udáva množstvo cytotoxínov v krvnom sére. Reakcia vyžaduje povinnú prítomnosť komplementu.

Reakcia fixácie komplementu (CFR) je založená na vlastnosti komplementu opísanej vyššie spájať sa s komplexom antigén-protilátka. Presnejšie, komplement je fixovaný na špeciálnej časti ťažkého reťazca molekuly protilátky. Toto miesto sa však stane prístupným až po pripojení protilátky k antigénu. Po spojení s jedným komplexom antigén-protilátka nemôže komplement prejsť do iného komplexu zavedeného do reakčného systému po interakcii prvého komplexu a komplementu pridaného v známom množstve. Ako druhý komplex sa zvyčajne používa takzvaný hemolytický systém – zmes baraních erytrocytov s protilátkami proti nim. Ak je prvým komplexom komplex antigén-protilátka, potom v reakčnej zmesi nebude žiadny voľný komplement; hemolýza erytrocytov nenastane. Naopak, ak v testovanom materiáli (napríklad v krvnom sére) nie sú protilátky proti antigénom použitým, potom komplement zostane voľný a zabezpečí hemolýzu erytrocytov. RSK sa používa pri diagnostike syfilisu (Wassermanova reakcia), štúdiách protilátok proti tkanivám a autoprotilátok; je široko používaný pri diagnostike množstva vírusových infekcií.

Fenomén špecifického oneskoreniačasto používaný na porovnanie dvoch skúmaných antigénov. Napríklad sa pripravujú imunitné séra proti myším erytrocytom. Aby sa určilo, či obsahuje protilátky proti erytrocytom príbuzného živočíšneho druhu (potkan), sérum sa ošetrí potkaními erytrocytmi. Ak sa hladina protilátok v sére zníži, potom existujú príbuzné antigény, ak klesne úplne, potom sú antigény identické. Pomocou tejto reakcie boli mnohé príbuzné antigény a haptény analyzované na identitu alebo neidentitu.

Reakcia neutralizácie toxínov. Antitoxíny sa nazývajú protilátky proti bakteriálnym a niektorým iným (napríklad hadiemu jedu) toxínom antigénnej povahy. Antitoxíny v kombinácii so zodpovedajúcimi toxickými látkami ich neutralizujú. Stupeň neutralizácie sa môže vziať do úvahy podaním zmesi toxínu a antitoxínu vnímavému zvieraťu. Množstvo antitoxínu v imunitnom sére je charakterizované počtom minimálnych smrteľných dávok toxínu, ktoré môžu byť neutralizované určitým množstvom séra. Neutralizačná reakcia sa používa na stanovenie koncentrácie toxínov patogénov záškrtu, tetanu atď. Na tento účel sa používajú štandardizované antitoxické séra.

Fenomén opsonizácie spočíva v tom, že protilátky zvyšujú fagocytárnu aktivitu neutrofilov a makrofágov vo vzťahu k tým antigénnym látkam alebo mikroorganizmom, proti ktorým sú získané. Napríklad aktivita fagocytov proti stafylokokom sa výrazne zvýši, ak sa leukocyty alebo darca leukocytov liečia antistafylokokovým sérom. Tento účinok bol spojený s prítomnosťou špecifických opsonínových protilátok. Treba však mať na pamäti, že neexistujú žiadne špeciálne protilátky opsonínov, hemolyzínov, bakteriolyzínov alebo precipitínov. Toto sú len prejavy hlavnej funkcie molekúl imunoglobulínu, ktorým je poskytnúť špecifický komplex antigén-protilátka.

D. Gray vedie dobrý príklad jednota a rôznorodosť tejto funkcie. Protilátky pripravené proti pneumokokovým polysacharidom typu I môžu:

1) spôsobiť aglutináciu pneumokokov typu I a opuch ich puzdra;

2) spôsobiť precipitáciu rozpustného extraktu z pneumokokov typu I;

3) pripojiť doplnok, t.j. poskytnúť RSK;

4) mať opsonizačný účinok na leukocyty proti pneumokokom typu I;

5) vykonávať špecifickú ochranu zvierat pred pneumokokovou infekciou.

Napriek tomu sa v rôznych špecifických experimentálnych alebo klinických situáciách uprednostňujú špecifické reakcie antigén-protilátka. Pri diagnostike brušný týfus použiť Vidalovu reakciu - aglutináciu baktérií, na analýzu antigénnych zložiek komplexných biologických tekutín alebo tkanivových extraktov - precipitačné reakcie na agare vo forme imunodifúzie alebo imunoelektroforézy. Pri práci s toxínmi a mnohými rozpustnými antigénmi sa používajú metódy pasívna hemaglutinácia. Na stanovenie hladiny hormónov v krvi je najvhodnejšia rádioimunologická metóda atď. Rôzne triedy imunoglobulínov vykazujú funkciu kombinovania s antigénom rôznymi spôsobmi.

Princíp protiimunoelektroforéza(VIEF) spočíva v súčasnom pohybe antigénov a protilátok voči sebe v géli pod vplyvom elektrického prúdu.

V dôsledku ich špecifickej interakcie sa vytvorí zrazenina. Metóda kombinuje jednoduchosť gélovej difúznej precipitačnej reakcie s vysokým rozlíšením elektroforézy. Aj keď je táto metóda v citlivosti nižšia ako metóda fluorescenčných protilátok a reakcie nepriama hemaglutinácia nevyžaduje však luminiscenčné protilátky, luminiscenčný mikroskop a diagnostiku erytrocytov.

WIEF je kvalitatívna metóda. Je vysoko špecifický a ľahko implementovateľný. Môže sa použiť na detekciu bakteriálnych alebo vírusových antigénov v patologickom materiáli, orgánoch laboratórnych (biotest) zvierat alebo environmentálnych objektoch.

Materiály a vybavenie. 1. Agaróza A a B. 2. 0,05 M medinal-HCl pufor (pH 8,6). 3. Chlorid sodný. 4. Disubstituovaný fosforečnan sodný. 5. Monosubstituovaný fosforečnan draselný. 6. Chlorid draselný. 7. Šťavelan amónny. 8. Špecifický bakteriálny alebo vírusový antigén. 9. Kamera na elektroforézu. 10. Jednosmerný usmerňovač 50 mA. 11. Elektrický termostat suchého vzduchu. 12. Stolná laboratórna odstredivka.

Technika nastavenia. Na sklenenú platňu umiestnenú vodorovne nalejte 30 ml roztavenej 1% agarózy pripravenej v pufri Medinal - HCl (pH 8,6). Po vytvrdnutí gélu sa raznicou vyrežú dva dvojrady otvorov s priemerom 5 mm (8 otvorov v každom rade); vzdialenosť medzi dvojité riadky je 30 mm. Gél sa vyberie z jamiek, zozbiera sa do skúmavky, roztopí sa nad plameňom horáka a pomocou Pasteurovej pipety sa privedie na dno jamiek.

Zo strany katódy je umiestnený testovací materiál a zo strany anódy - monošpecifické sérum, ale lepšie monoklonálne protilátky (MAB) v objeme 0,035 ml. Napríklad na detekciu pneumokoka - antapneumokokové sérum, na detekciu antigénu vírusu chrípky - proti chrípke atď.

Doštička sa umiestni do elektroforetickej komory tak, aby sa pena použitá ako spojovací mostík medzi tlmivým systémom a nosným gélom dotýkala nosného gélu. Elektroforéza sa uskutočňuje pri izbovej teplote pri napätí 140...150 V a prúde 35 mA počas 18...35 minút.

Kontrola. Štúdium materiálu vo VIEF na prítomnosť špecifického antigénu by malo byť sprevádzané kontrolou so známym pozitívnym materiálom.

Detekcia patogénu v kombinácii VIEF s chovom. Na siatie kontaminovaného materiálu by sa mali použiť selektívne médiá.

Po 36-hodinovej inkubácii pri 37 °C sa pridá 0,3 ml 0,85 % roztok NaCl so 4% formalínom sa urobí výplach, ktorý sa odsaje do skúmavky a po expozícii 1 hodinu sa vyšetrí na VIEF.

Účtovanie výsledkov. O pozitívny výsledok medzi jamkou s testovaným materiálom a jamkou so špecifickým sérom sa objaví preschitata čiara. Línia precipitátu, v závislosti od množstva antigénu v testovanom materiáli, môže byť umiestnená buď v strede vzdialenosti medzi jamkami, alebo bližšie k sérovému rezervoáru.

Typicky sa zrazeniny tvoria 18 až 35 minút po začiatku elektroforézy.

Ak nájdete chybu, zvýraznite časť textu a kliknite Ctrl+Enter.