imunitné reakcie. Aplikácia imunitných odpovedí v diagnostike infekčné choroby.
PLÁN:
Typy imunitných reakcií.
Podmienky na vykonávanie sérologických reakcií.
Požiadavky na sérum.
Koncept pozitívnych a negatívnych výsledkov.
HLAVNÝ OBSAH:
Typy imunitných reakcií.
Imunologická reakcia – ide o interakciu antigénu s protilátkou, ktorá je určená špecifickou interakciou aktívnych centier protilátky (paratopu) s epitopmi antigénu.
Všeobecná klasifikácia imunologických reakcií:
sérologické reakcie - reakcie medzi antigénmi (Ag) a protilátkami (Ig)
in vitro ;
bunkové reakcie za účasti imunokompetentných buniek;
alergické testy - detekcia precitlivenosti.
Sérologické reakcie: 1) definícia, 2) fázy, 3) stanovenie cieľa, 4) všeobecná klasifikácia.
1) Definícia
Sérologické metódy výskum (z lat. Sérum - sérum a logos - výučba) pomocou reakcie antigén-protilátka.
2) Fázy
2 fázy interakcie:
ja konkrétne (viditeľné) - prichádza rýchlo, protilátky sa spájajú s ich zodpovedajúcimi antigénmi. V tejto fáze interagujú determinantné skupiny antigénov (AG) a aktívne centrá protilátok (AT).
Sily podieľajúce sa na tvorbe komplexu AG + AT sú:
Coulomb;
Van der Waals
Vodíkové väzby.
V tejto fáze nie sú žiadne viditeľné zmeny. Pod elektrónovou mikroskopiou komplex AG + AT vo forme mriežky.
II. Nešpecifické - prichádza pomaly, vytvorený komplex antigén-protilátka reaguje s dodatočným nešpecifickým faktorom prostredia, v ktorom reakcia prebieha, a ten je viditeľný okom - lepenie, rozpúšťanie, precipitácia vločiek a pod. elektrolytu klesá náboj, klesá rozpustnosť, vytvárajú sa viditeľné konglomeráty vyzrážané (aglutinát).
3) Stanovenie cieľov :
a) na identifikáciu antigénu (sérum so známou protilátkou):
sérologická identifikácia (identifikácia druhu);
sérotypizácia (stanovenie sérovaru) - určenie kmeňa;
v patologickom materiáli (expresná diagnostika);
v čistej kultúre:
b) na detekciu protilátok (Ig) (známy antigén – diagnostika):
prítomnosť (kvalitatívne reakcie);
množstvo (zvýšenie titra – metóda „párových sér“).
4) Všeobecná klasifikácia sérologické reakcie :
a) jednoduché (2-zložkové: Ag + Ig):
RA aglutinačné reakcie (s korpuskulárnym antigénom);
RP precipitačné reakcie (s rozpustným antigénom);
b) komplex (3-zložkový: Ag + Ig + C);
c) pomocou štítku.
Varianty reakcie aglutinácie a precipitácie
Aglutinačná reakcia :
Aglutinačná reakcia (RA) - imunitná odpoveď interakcia suspenzie AG (erytrocytov, baktérií) s AT v fyziologický roztok.
Počas aglutinácie sa častice AT zlepia a vytvorí sa flokulentná zrazenina.
Reakcia pasívna hemaglutinácia(RPHA) je typ aglutinačnej reakcie, pri ktorej sa používa protilátkové alebo antigénne erytrocytové diagnostikum (erytrocyty s AT alebo AG adsorbované na ich povrchu).
Erytrocyty v tejto reakcii pôsobia ako pasívne nosiče.
Vyhodnotenie výsledkov RPGA sa vykonáva takto:
- pri pozitívna reakcia pasívne prilepené erytrocyty pokrývajú dno otvoru v tvare U alebo V rovnomernou vrstvou s vrúbkovanými okrajmi („dáždnik“);
- pri spätnú reakciu (nedostatok aglutinácie), erytrocyty sa hromadia v centrálnom vybraní jamky a vytvárajú kompaktný "gombík" s ostro ohraničenými okrajmi.
V diagnostike sa používa hemaglutinačný inhibičný test (RTGA). vírusové infekcie. Niektoré vírusy obsahujú na svojom povrchu proteín hemaglutinín, ktorý spája červené krvinky. Pridanie špecifických antivírusových protilátok blokuje vírusový hemaglutinín – nedochádza k hemaglutinácii.
Na stanovenie neúplných protilátok sa používa reakcia nepriamej hemaglutinácie (RIHA), alebo Coombsova reakcia. Pridanie antiglobulínového séra (AT proti ľudskému Ig) zlepšuje výsledky reakcie. RNGA sa používa na stanovenie Rh faktora.
Na nastavenie aglutinačnej reakcie (RA) sú potrebné tri zložky:
1) antigén (aglutinogén) AG;
2) protilátka(aglutinín) AT;
3)
elektrolyt
(izotonický roztok chloridu sodného).
Ag + AT + elektrolyt = aglutinát
Aglutinácia (z lat. aglutinatio – lepenie) – zlepovanie teliesok (baktérie, erytrocyty a pod.) protilátkami za prítomnosti elektrolytov – chloridu sodného.
RA sa prejavuje vo forme vločiek alebo sedimentu, pozostávajúcich z teliesok (napríklad baktérií, erytrocytov), "zlepených" protilátkami.
RA sa používa na:
Reakcia priamej aglutinácie mikróbov (RA).
Pri tejto reakcii protilátky (aglutiníny) priamo aglutinujú korpuskulárne antigény (aglutinogény).
Zvyčajne sú reprezentované suspenziou inaktivovaných mikroorganizmov (mikrobiálna aglutinačná reakcia).
používa sa na určenie typu mikroorganizmuštandardná diagnostická aglutinácia sérum ( známe AT ).
Najčastejšie sú lamelárne (indikatívne) a dislokované RA.
Lamelový RA je umiestnený na skle. Používa sa ako zrýchlená metóda na detekciu protilátok alebo identifikáciu mikroorganizmov.
Komponenty:
1. štandardné diagnostické aglutinačné séra (AT);
2. otestovať čistú kultúru od pacienta;
3. soľný roztok.
V skúmanej čistej kultúre sú antigény (AG) vo forme častíc (mikrobiálne bunky, erytrocyty a iné korpuskulárne antigény), ktoré sú zlepené protilátkami a precipitujú.
Príklad:
inscenovanie orientačné aglutinačné reakcie (RA ) na skle na identifikáciu baktérií črevnej skupiny.
Kvapky sa aplikujú na sklíčko:
1
úplavica
;
2
- kvapka: - aglutinačné sérum na patogénybrušný týfus
;
(1-2 diagnostické séra)
3
-tá kvapka: - fyziologický roztok (kontrola).
Do každej kvapky sa pridá testovaná čistá kultúra baktérií. Miešajte.
Výsledok
:
pozitívne
- prítomnosť aglutinačných vločiek,
negatívne
- bez aglutinačných vločiek
Záver:Študované baktérie sú pôvodcami brušného týfusu (boli stanovené antigény).
Na stanovenie protilátok v sére pacienta (sérologická diagnóza), štandardná mikrobiálnadiagnosticum obsahujúci suspenziuslávny mikróby alebo ich antigényAG .
Stanovenie krvných skupín systému ABO (hemaglutinačná reakcia (RHA)) - aglutinujú erytrocyty.
Zložky reakcie:
1. AG (červené krvinky) testuje krv
2. AT (erytrotesty – tsoliklony)
Zoliclone sada:
Činidlo Tsoliklon anti-A (ružové)
Činidlo Tsoliklon anti-B (modré)
Zoliklonové anti-AB činidlo (bezfarebné)
3. elektrolyt (fyziologický roztok)
Technika definície:
1
.
Jedna kvapka (0,1 ml) anti-A, anti-B a anti-AB tsoliklonu (na kontrolu) sa aplikuje do jamiek tablety.
2.
Malá (0,05-0,01 ml) kvapka testovanej krvi sa aplikuje vedľa každej kvapky činidla.
Potom sa kvapka tsoliklonu zmieša s kvapkou krvi pomocou individuálnej čistej sklenenej tyčinky.
3.
Aglutinačná reakcia sa rozvinie počas prvých 3-5 sekúnd, keď sa platnička jemne kýva.
Výsledky reakcie sa berú do úvahy 2,5 - 3 minúty po zmiešaní kvapiek. Zľava doprava v jamkách anti-A, anti-B, anti-AB.
Pozitívnym výsledkom je výskyt granulovanej zrazeniny (aglutinátu).
pozitívna RA (+)
Negatívne - bez sedimentu.
negatívna RA(-)
4.
Analýza výsledkov.
O(ja) α β – žiadna aglutinácia
A(II) β – aglutinácia s anti-A
B(III) α – aglutinácia s anti-B
AB(IV)O - aglutinácia s anti-A, s anti-B
Schematické znázornenie aglutinácie.
AH antigény na erytrocytoch (detegované) + protilátkaAT(tsoliclone) diagnostické sérum
Účtovanie aglutinácie v tanieroch
Zrážková reakcia:
Precipitačná reakcia je imunitná reakcia interakcie AG v rozpustnom stave s AT vo fyziologickom roztoku.
Pri precipitácii dochádza k tvorbe makromolekulárneho imunitného komplexu, čo sa prejavuje prechodom priehľadného koloidného roztoku na nepriehľadnú suspenziu, prípadne zrazeninu.
Množstvo oboch činidiel musí byť v presne definovaných pomeroch, pretože prebytok jedného z nich znižuje výsledok.
Existovať rôznymi spôsobmi nastavenie precipitačnej reakcie.
1. Reakcia precipitácie kruhu sa vloží do precipitačných skúmaviek s malým priemerom. Do skúmavky sa pridá imunitné sérum a opatrne sa navrství rozpustný antigén. AG a AT sú zmiešané v dôsledku tepelného pohybu molekúl a vzájomne sa ovplyvňujú. o pozitívny výsledok na hranici dvoch roztokov sa vytvorí prstenec nepriehľadnej zrazeniny.
2. Ouchterlonyho dvojitá imunodifúzna reakcia sa uskutočňuje na agarovom géli, do ktorého jamiek sa podľa schémy pridá buď AG roztok alebo AT roztok. AG a AT difundujú do gélu smerom k sebe a ak je reakcia pozitívna, vytvárajú imunitné komplexy, viditeľné ako precipitačné čiary.
Zrážková reakcia -túto formáciua precipitácia komplexu rozpustného molekulárneho antigénu s protilátkami vo forme zákalu, nazývaného precipitát. Vzniká zmiešaním antigénov a protilátok v ekvivalentných množstvách.
RA komponenty:
precipitujúce sérum (známe ako AT-precipitín);
testovacie sérum (neznámy AG-precipitinogén);
fyzické Riešenie.
Precipitačná reakcia sa umiestni do špeciálnych úzkych skúmaviek alebo do špeciálnych úzkych skúmaviek (krúžková precipitačná reakcia), prípadne do Petriho misiek v géloch, živných médiách atď.
Reakcia zrážania kruhu
Vyhlásenie a účtovanie výsledkov reakcieprstencové zrážaniena detekciu patogénu antrax(Ascoliho reakcia).
inscenovanie .
1. Testovaný materiál (koža, vlna, plsť, štetiny, látka, mäso, zemina, zvieracie výkaly atď.) sa varí vo fyziologickom roztoku počas 5-45 minút. získať izotonický extrakt (extrakt). Filter.
2. Nalejte vyzrážané anti-antraxové sérum do skúmavky.
3. Opatrne naň navrstvíme testovací materiál (extrakt).
účtovníctvo .
Počas nasledujúcich 10 min. na hranici medzi sérom a extraktom sa v pozitívnych prípadoch objavuje zákalový krúžok (prstencová precipitácia). Ascoliho reakcia je veľmi citlivá a špecifická
S jeho pomocou je možné rýchlo identifikovať materiály infikované antraxom.
Precipitačná reakcia v agare
Výkaz a účtovanie výsledkovagarové zrážacie reakciena stanovenie toxigenity korynebaktérií (pôvodcov záškrtu)
inscenovanie
Nanesené na fosfát-peptónový agar v Petriho miske.
1. Prúžok sterilného filtračného papiera navlhčenýantitoxické sérum.
2. Po zaschnutí sa vo vzdialenosti 1 cm od okraja pásu vysejú plaky s priemerom 10 mm.izolované plodiny.
V jednom pohári môžete zasiať 3 až 10 plodín, z ktorých jednaovládanie, musí byť známytoxigénne.
Plodiny sú umiestnené v termostate.
účtovníctvo
Analýza sa uskutoční po 24-48-72 hodinách.
Pozitívny výsledok - (kultúratoxigénne) - v určitej vzdialenosti od pásu papiera vznikajúprecipitačné čiary, « úponkové šípy“, ktoré sú jasne viditeľné v prechádzajúcom svetle.
Obrázok ukazuje reakciu zrážania v agare na stanovenie toxigenity bacilov záškrtu. Stredné kultúry nevytvorili „šípové antény“, nejde o toxikogénne patogény.
Kmene pôvodcu záškrtu môžu byť toxigénne (produkujúce exotoxín) a netoxické. Tvorba exotoxínu závisí od prítomnosti profága nesúceho tox gén kódujúci tvorbu exotoxínu v baktériách.
V prípade ochorenia sa všetky patogény záškrtu testujú na toxigenitu - produkcia difterického exotoxínu pomocou zrážacej reakcie v agare
Komplexné sérologické reakcie ( 3-zložkové: Ag + Ig + C):
Reakcia fixácie komplementu (RSC).
Reakcia sa uskutočňuje v dvoch stupňoch.
V prvom štádiu protilátky interagujú s AG a komplementom, v druhom štádiu sa pridáva indikátor - hemolytický systém (zmes erytrocytov a antierytrocytového séra).
S pozitívnym výsledkom v prvej fáze AT tvorí imunitný komplex s AG, ktorý viaže komplement reakčnej zmesi.
V tomto prípade nie sú erytrocyty hemolytického systému pridané v druhom štádiu zničené.
V opačnom prípade neviazaný komplement spôsobí lýzu indikátorových červených krviniek.
Vyžaduje päť zložiek: AG, AT a komplement (prvý systém), baranie erytrocyty a hemolytické sérum (druhý systém) (obr. 1).
Reakcia prebieha v dvoch fázach (obr. 3).
Prvá fáza - interakcia antigénu a protilátok s povinnou účasťou komplementu.
Po druhé - identifikácia výsledkov reakcie pomocou indikátorového hemolytického systému (ovčie erytrocyty a hemolytické sérum). K deštrukcii erytrocytov hemolytickým sérom dochádza iba v prípade pripojenia komplementu k hemolytickému systému. Ak bol komplement adsorbovaný skôr na komplex antigén-protilátka, potom nedochádza k hemolýze erytrocytov (obr.).
Výsledok skúsenosti
vyhodnotiť (obr. 2), pričom sa zaznamená prítomnosť alebo neprítomnosť hemolýzy vo všetkých skúmavkách. Reakcia sa považuje za pozitívnu s úplným oneskorením hemolýzy, keď je kvapalina v skúmavke bezfarebná a erytrocyty sa usadia na dne, negatívna - s úplnou lýzou erytrocytov, keď je kvapalina intenzívne sfarbená ("lak" krv) .
Stupeň oneskorenia hemolýzy sa odhaduje v závislosti od intenzity farby kvapaliny a množstva sedimentu erytrocytov na dne (++++, +++, ++, +).
Ryža. 4. Vyhlásenie a výsledok RSC.
Záver:V študovanom sére boli detegované protilátky.
RSK vám umožňuje detegovať protilátky proti akémukoľvek kmeňu rovnakého sérotypu vírusu.
Diagnostická hodnota je:
štvornásobné zvýšenie titra protilátok v párových sérach (počas epidémie chrípky);
dvojnásobné zvýšenie krvného séra pacientov s charakteristickým klinickým obrazom.
Label Reactions :
Tieto metódy sú veľmi citlivé. Ako značky pre antigény alebo protilátky sa používajú farbivá, rádioaktívne izotopy, enzýmy atď.
RIF - imunofluorescenčná reakcia
Imunofluorescenčná reakcia je založená na svetelnej indikácii komplexu antigén-protilátka
Prepojený imunosorbentový test.
Súčasné laboratórny výskum, počas ktorej sa hľadajú špecifické protilátky v krvi alebo antigény na konkrétne ochorenia s cieľom identifikovať nielen etiológiu, ale aj štádium ochorenia.
Výsledky ELISA je možné získať kvalitatívne a kvantitatívne.
V súčasnosti sa ELISA používa v nasledujúcich situáciách:
1) hľadanie špecifických protilátok proti akejkoľvek infekčnej chorobe;
2) hľadanie antigénov akýchkoľvek chorôb (infekčné, pohlavné choroby);
3) štúdium hormonálneho stavu pacienta;
4) vyšetrenie nádorových markerov;
5) vyšetrenie na prítomnosť autoimunitných ochorení.
Na obrázku je ELISA na pevnej fáze - známe antigény (vľavo) sú adsorbované na jamke platne, (vpravo) v jamkách platne sú známe protilátky
Výhody metódy ELISA:
1) Vysoká špecificita a senzitivita metódy ELISA (viac ako 90 %).
2) Schopnosť určiť ochorenie a sledovať dynamiku procesu, to znamená porovnávať množstvo protilátok v rôznych časových intervaloch.
3) Dostupnosť diagnostiky ELISA v akomkoľvek zdravotníckom zariadení.
Relatívny nedostatok: Detekcia imunitnej odpovede (protilátok), ale nie samotného patogénu, konjugovaného s enzýmovou značkou.
Nastavenie ELISA (všeobecný mechanizmus):
Základom enzymatickej imunoanalýzy je imunitná reakcia antigénu a protilátky s tvorbou imunitného komplexu: antigén-protilátka, v dôsledku čoho dochádza k zmene enzymatickú aktivitušpecifické značky na povrchu protilátok.
Zložky reakcie:
1. AG(AT) známy - na jamke tablety.
2. AT (AG) vyšetrované.
3. AT s enzýmom špecifickým pre komplex AT(AG)-AG(AT).
4.chromogénny substrát interagujúci s enzýmom
5. zastavenie roztoku
Hlavné fázy testu ELISA
1. Na povrchu jamiek tablety je purifikovaný antigén špecifického patogénu. Sú pridané biologický materiál pacienta, dôjde k špecifickej reakcii medzi týmto antigénom a požadovanou protilátkou (imunoglobulínom). Vytvára sa komplex.
2. Pridá sa konjugát - AT s enzýmom. Konjugant je špecifický pre komplex AT-AG prvého stupňa. Enzým sa aktivuje.
3. Pridá sa substrát a aktívny enzým s ním interaguje, čím sa zmení bezfarebná farba roztoku.
4. Na zastavenie interakcie enzým-substrát sa pridá stop roztok.
účtovníctvo.
Pozitívnym výsledkom je zmena farby na obrázku - žltá.
Imunochromatografická analýza
Metóda imunochromatografickej analýzy (ICA, rýchle testy) je kvalitatívna skríningová predbežná metóda, ktorá umožňuje rýchlo, v priebehu niekoľkých minút, analyzovať za akýchkoľvek podmienok, vrátane. "lúka".
Medzi výhody ICA patria:
Rýchlosť a jednoduchosť použitia;
Malé objemy vzoriek, žiadna príprava vzorky;
Lacnosť pre výrobcu a spotrebiteľa;
Schopnosť produkovať testy vo veľkých objemoch;
Jednoduché čítanie a interpretácia výsledku;
Vysoká citlivosť a reprodukovateľnosť;
Možnosť kvantitatívneho stanovenia;
Schopnosť používať prenosné čítačky kompatibilné s počítačom;
Možnosť multianalýzy.
Komponenty (aplikované na testovací prúžok):
1. Konjugát označený koloidným zlatom - špecifický pre stanovený AG.
2. AT testovacej línie - špecifický pre komplex AT-AG
3. Abs kontrolnej línie sú špecifické pre konjugát.
Nastavenie IHA:
1. Aplikácia vzorky na určenú počiatočnú oblasť prúžku.
2. Získanie výsledku vo forme objavenia sa farebných pásov na mieste testovacích a kontrolných čiar.
účtovníctvo
Pozitívne - pri farbení testovacej čiary.
Negatívne - pri absencii zafarbenia testovacej čiary.
Neplatné - pri absencii zafarbenia kontrolnej čiary.
1. Vzorka sa umiestni na štartovacie pole (vzorková podložka) a priviaže sa ku konjugátu (špecifické teliesko s farebnou značkou) umiestnenému na podložke konjugátu. V dôsledku toho sa vytvorí farebný komplex.
2. Výsledný farebný imunitný komplex sa pôsobením kapilárnych síl pohybuje pozdĺž nitrocelulózovej membrány A interagujes testovacou linkou AT.Výsledkom je jednofarebný ružovo-červený prúžok.
3. Abs nie je viazaný na testovací prúžok (konjugát)sa pohybuje ďalej a dosiahne kontrolnú čiaru, naviaže sa na AT kontrolnej čiary.V dôsledku toho sa objaví druhý farebný pás.Ak je analýza vykonaná správne, kontrolná čiara by sa mala objaviť vždy, bez ohľadu na prítomnosť vyšetrovaného antigénu (protilátky) vo vzorke biologickej tekutiny.
2. Podmienky na vykonávanie sérologických reakcií.
1. Prítomnosť homológneho - navzájom zodpovedajúceho antigénu a protilátky.
2. Čistý a suchý riad.
3. Určitý pomer liekov (najčastejšie rovnaký).
4. Povinná prítomnosť elektrolytu (izotonický roztok NaCl).
5. pH neutrálne alebo takmer mierne zásadité.
6. Teplota + 37 ° С alebo izbová teplota (nevyhnutne kladná).
7. Uskutoční sa kontrola antigénu a kontrola séra (protilátky).
3 Požiadavky na sérum
Sérum musí byť úplne číre bez prímesí buniek.
Zvyčajne sa získava v 2. týždni choroby, keď sú už prítomné protilátky.
Krv sa odoberá v množstve 3-5 ml nalačno alebo 6 hodín po jedle.
Na získanie séra sa krv nechá 1 hodinu pri izbovej teplote alebo sa odstredí. Sérum sa odsaje veľmi opatrne, aby nezachytilo vzniknuté prvky.
Imunitné séra sa získavajú z krvi ľudí alebo zvierat (zvyčajne králikov a koní) imunizovaných podľa určitej schémy zodpovedajúcim antigénom (vakcínou). Srvátka sa zvyčajne pripravuje vo výrobe.
4. Koncept pozitívnych a negatívnych výsledkov.
RA.
Pri pozitívnej reakcii pasívne prilepené erytrocyty pokrývajú dno jamky rovnomernou vrstvou s vrúbkovanými okrajmi („dáždnik“); v neprítomnosti aglutinácie sa erytrocyty hromadia v centrálnom vybraní jamky a vytvárajú kompaktný „gombík“ s ostro ohraničenými okrajmi (pozri obrázky vyššie).
RP.
Pri pozitívnom výsledku sa na hranici dvoch riešení vytvorí mliečny krúžok (pozri obrázky vyššie).
ELISA.
Pri pozitívnej reakcii nastáva zmena farby roztoku.
RSK.
Oneskorenie hemolýzy - reakcia je pozitívna; ak je komplement voľný, pozoruje sa hemolýza - reakcia je negatívna(pozri obrázky vyššie).
Výsledky Wassermanovej reakcie:
a - úplné oneskorenie hemolýzy (++ ++);
b - výrazné oneskorenie hemolýzy (+ ++);
c - čiastočné oneskorenie hemolýzy (++);
d - slabé oneskorenie hemolýzy (+);
e - úplná hemolýza (-).
Reakcia je pozitívna s čiastočným, výrazným a úplným oneskorením hemolýzy, determinovaným stupňom zafarbenia obsahu skúmaviek od svetloružovej po jasnočervenú, nehemolyzované erytrocyty následne tvoria červenú zrazeninu.
Domáca úloha:
1. Preštudujte si látku
Urobte si 3 poznámky k videu
Č. 29 Aglutinačná reakcia. Komponenty, mechanizmus, spôsoby nastavenia. Aplikácia.
Aglutinačná reakcia- jednoduchá reakcia, pri ktorej protilátky viažu korpuskulárne antigény (baktérie, erytrocyty alebo iné bunky, nerozpustné častice s adsorbovanými antigénmi, ako aj makromolekulové agregáty). Vyskytuje sa v prítomnosti elektrolytov, napríklad keď sa pridá izotonický roztok chloridu sodného.
Používajú sa rôzne varianty aglutinačnej reakcie: expandovaná, približná, nepriama a pod.. Aglutinačná reakcia sa prejavuje tvorbou vločiek alebo sedimentu (bunky „zlepené“ protilátkami, ktoré majú dve alebo viac centier viažucich antigén – obr. 13.1) . RA sa používa na:
1) detekcia protilátok v krvnom sére pacientov, napríklad s brucelózou (Wrightova, Heddelsonova reakcia), brušný týfus a paratýfus (Vidalova reakcia) a iné infekčné choroby;
2) definície patogénov izolované od pacienta;
3) stanovenie krvných skupín pomocou monoklonálnych protilátok proti aloantigénom erytrocytov.
Na stanovenie protilátok pacienta uveďte podrobnú aglutinačnú reakciu: k riedeniam pacientovho krvného séra sa pridá diagnosticum (suspenzia usmrtených mikróbov) a po niekoľkých hodinách inkubácie pri 37 °C sa zaznamená najvyššie riedenie séra (sérový titer), pri ktorom došlo k aglutinácii, t.j. vytvorená zrazenina.
Povaha a rýchlosť aglutinácie závisia od typu antigénu a protilátok. Príkladom sú znaky interakcie diagnostika (O- a H-antigénov) so špecifickými protilátkami. Aglutinačná reakcia s O-diagnosticum (baktérie usmrtené zahrievaním, zachovávajúce si termostabilný O-antigén) prebieha vo forme jemnozrnnej aglutinácie. Aglutinačná reakcia s H-diagnosticum (baktérie usmrtené formalínom, zadržiavajúce tepelne labilný bičíkový H-antigén) je hrubozrnná a prebieha rýchlejšie. Ak je potrebné určiť patogén izolovaný od pacienta, dajte orientačná aglutinačná reakcia, pomocou diagnostických protilátok (aglutinačné sérum), t.j. vykonáva sa sérotypizácia patogénu. Približná reakcia sa uskutoční na podložnom sklíčku. Ku kvapke diagnostického aglutinačného séra v riedení 1:10 alebo 1:20 pridajte čistú kultúru patogénu izolovaného od pacienta. V blízkosti je umiestnená kontrola: namiesto séra sa aplikuje kvapka roztoku chloridu sodného. Keď sa v kvapke so sérom a mikróbmi objaví vločkovitý sediment, vykoná sa podrobná aglutinačná reakcia v skúmavkách so zvyšujúcimi sa riedeniami aglutinačného séra, do ktorej sa pridajú 2-3 kvapky suspenzie patogénu. Aglutinácia sa zohľadňuje množstvom sedimentu a stupňom vyčírenia kvapaliny. Reakcia sa považuje za pozitívnu, ak je zaznamenaná aglutinácia v riedení blízkom titru diagnostického séra. Súčasne sa berú do úvahy kontroly: sérum zriedené izotonickým roztokom chloridu sodného by malo byť priehľadné, suspenzia mikróbov v tom istom roztoku by mala byť rovnomerne zakalená, bez sedimentu.
Rôzne príbuzné baktérie môžu byť aglutinované rovnakým diagnostickým aglutinačným sérom, ktoré
sťažuje ich identifikáciu. Preto sa používajú adsorbované aglutinačné séra, z ktorých
krížovo reagujúce protilátky adsorpciou na im príbuzné baktérie. Tieto séra obsahujú protilátky
špecifické pre túto baktériu.
Aglutinácia sa nazýva aglutinácia baktérií ako výsledok interakcie špecifických AT s nimi. RA vyžaduje tri zložky: 1) AG (aglutinogén); 2) AT (aglutinín); 3) roztok elektrolytu (izotonický roztok chloridu sodného). Na aglutinačnej reakcii sa zúčastňujú iba korpuskulárne antigény (baktérie, erytrocyty, latexové častice naplnené antigénom).
Aglutinačná reakcia na skle. Na podložné sklíčko bez tuku sa pipetou nanesie kvapka diagnostického séra (riedenie séra 1:10 - 1:20). Čistá kultúra skúmaného mikroorganizmu sa odoberie z povrchu šikmého agaru bakteriologickou slučkou, prenesie sa do kvapky séra a premieša sa. Výsledok reakcie sa berie do úvahy voľným okom po 3-5 minútach. Pri pozitívnej reakcii v kvapke séra sa zaznamená vzhľad vločiek (veľkých alebo malých), ktoré sú jasne viditeľné na tmavom pozadí pri pretrepaní podložného skla. V prípade negatívnej reakcie zostáva kvapalina rovnomerne zakalená.
Aglutinačná reakcia v skúmavkách. Pridajte 1 ml fyziologického roztoku do niekoľkých skúmaviek. Pridajte rovnaký objem testovaného krvného séra do prvej skúmavky. Pripravia sa postupné dvojnásobné riedenia séra (titrácia séra), po ktorých sa do každej skúmavky pridajú 2 kvapky suspenzie inaktivovaných baktérií (diagnosticum). Skúmavky sa umiestnia na 2 hodiny do termostatu pri 37 °C. Reakcia prebieha s tvorbou malých vločiek, neviditeľných voľným okom, preto sa výsledky zaznamenávajú pri miernom zvýšení v špeciálnom zariadení - aglutinoskope. Intenzita aglutinácie sa berie do úvahy podľa systému „štyri plusy“: úplná aglutinácia - 4+, čiastočná aglutinácia - 3+ alebo 2+, pochybný výsledok - +. Posledné riedenie, pri ktorom sa pozoruje aglutinácia pri 2+, sa považuje za titer protilátky v testovacom sére.
Aglutinačná reakcia v skúmavkách (rozšírená aglutinačná reakcia) sa vykonáva na stanovenie titra protilátok proti patogénom brušného týfusu a paratýfusu (Vidalova reakcia), brucelózy (Wrightova reakcia), týfusu (Weiglova reakcia).
Aglutinácia (z lat. aglutinatio - väzba) - spájanie (spájanie) korpuskulárnych častíc nesúcich antigén (celé bunky, latexové častice a pod.) so špecifickými protilátkovými molekulami za prítomnosti elektrolytov, ktoré končí tvorbou vločiek alebo sedimentu (aglutinátu). ) viditeľné voľným okom. Povaha sedimentu závisí od povahy antigénu: bičíkové baktérie dávajú sediment veľkých vločiek, bičíkové a bezkapsulové - jemnozrnné, kapsulárne - vláknité. Rozlišujte priamu aglutináciu, pri ktorej interakcia so špecifickými protilátkami priamo zahŕňa vlastné antigény bakteriálnej alebo akejkoľvek inej bunky, ako sú erytrocyty; a nepriame alebo pasívne, v ktorých sú bakteriálne bunky alebo erytrocyty alebo latexové častice nosičmi nie svojimi, ale cudzími antigénmi (alebo protilátkami), ktoré sú na nich adsorbované, na detekciu protilátok (alebo antigénov), ktoré sú pre ne špecifické. Aglutinačná reakcia zahŕňa najmä protilátky patriace do tried IgG a IgM. Prebieha v dvoch fázach: po prvé, dochádza k špecifickej interakcii aktívneho centra protilátok s determinantom antigénu, toto štádium môže nastať v neprítomnosti elektrolytov a nie je sprevádzané viditeľnými zmenami v reagujúcom systéme. Pre druhý stupeň – tvorbu aglutinátu – je potrebná prítomnosť elektrolytov, ktoré redukujú nabíjačka komplexy antigén + protilátka a urýchľujú proces ich väzby. Táto fáza končí tvorbou aglutinátu.
Aglutinačné reakcie sú umiestnené buď na skle alebo na hladkých kartónových platniach, alebo v sterilných aglutinačných skúmavkách. Aglutinačné reakcie (priame a pasívne) na skle sa zvyčajne používajú ako zrýchlená metóda detekcia špecifických protilátok v sére pacienta (napríklad s brucelózou) alebo na sérologickú identifikáciu patogénu. V druhom prípade sa zvyčajne používajú dobre purifikované (adsorbované) diagnostické séra obsahujúce iba monoreceptorové protilátky alebo ich sadu na rôzne antigény. Nepochybnou výhodou aglutinačnej reakcie na skle je jednoduchosť jej formulácie a skutočnosť, že trvá niekoľko minút alebo dokonca sekúnd, keďže obe zložky sú v nej použité v koncentrovanej forme. Má však len kvalitatívnu hodnotu a je menej citlivý ako skúmavka. Rozšírený aglutinačný test v skúmavkách poskytuje presnejšie výsledky, pretože umožňuje určiť kvantitatívny obsah protilátok v sére (nastaviť jeho titer) a v prípade potreby zaregistrovať skutočnosť zvýšenia titra protilátok, čo je diagnostické hodnotu. Na nastavenie reakcie v aglutinačných skúmavkách pridajte určitým spôsobom zriedený 0,85 % roztok NaCl sérum a rovnaký objem (zvyčajne 0,5 ml) suspenzie štandardného diagnostika (alebo testovacej kultúry) obsahujúcej 1 miliardu baktérií v 1 ml. Započítanie výsledkov aglutinačnej reakcie sa vykonáva predbežne po 2 hodinách inkubácie skúmaviek pri 37 ° C a nakoniec po 20 až 24 hodinách podľa dvoch kritérií: prítomnosť a veľkosť precipitátu a stupeň priehľadnosti skúmavky. supernatant. Hodnotenie sa vykonáva podľa štvorkrížového systému. Reakcia je nevyhnutne sprevádzaná kontrolou séra a antigénu. V tých prípadoch, keď sa na sérologickú identifikáciu patogénu použije podrobný aglutinačný test v skúmavke, má diagnostickú hodnotu, ak je reakcia vyhodnotená ako pozitívna pri zriedení diagnostického séra aspoň na polovicu jeho titra.
Je potrebné vziať do úvahy, že pri miešaní roztokov homológnych antigénov a protilátok nie sú vždy pozorované viditeľné prejavy aglutinačnej reakcie. Precipitát vzniká len pri určitých optimálnych pomeroch oboch reakčných zložiek. Mimo týchto limitov sa pri výraznom prebytku antigénu alebo protilátok nepozoruje žiadna reakcia. Tento jav sa nazýva „fenomén prozóny“. Pozoruje sa tak pri aglutinačnej reakcii, ako aj pri precipitačnej reakcii. Výskyt prozónu v imunitných reakciách sa vysvetľuje skutočnosťou, že antigény, ktoré sa na nich podieľajú, sú spravidla polydeterminanty a molekuly IgG protilátky majú dve aktívne centrá. Pri nadbytku protilátok je povrch každej častice antigénu pokrytý molekulami protilátky, takže nezostávajú žiadne voľné determinantné skupiny, takže druhé, neviazané aktívne centrum protilátok nemôže interagovať s inou antigénnou časticou a viazať ich na seba. Tvorbu viditeľného aglutinátu alebo precipitátu potláča aj nadbytok antigénu, kedy nie je jediné voľné aktívne miesto protilátok, a preto sa už nedajú zväčšiť komplexy antigén + protilátka + antigén.
Možnosti zrýchlených aglutinačných reakcií. Pasívna hemaglutinačná reakcia a jej varianty
Klasická aglutinačná reakcia zahŕňa použitie korpuskulárnych antigénov. Avšak môžu byť zahrnuté aj rozpustné antigény. Aby to bolo možné, takéto antigény sa adsorbujú na imunologicky inertné častice. Ako nosič možno použiť častice latexu alebo bentonitu, v súčasnosti sa však najčastejšie používajú erytrocyty zvierat alebo ľudí, ktoré zlepšujú svoje adsorpčné vlastnosti úpravou roztokmi tanínu, formalínu alebo benzidínu. Erytrocyty, ktoré na seba adsorbujú antigén, sa nazývajú senzibilizované týmto antigénom a imunitná reakcia, na ktorej sa zúčastňujú, je nepriama alebo pasívna hemaglutinačná reakcia (RNHA alebo RPHA), pretože erytrocyty sa na nej zúčastňujú pasívne.
RPGA je umiestnený v špeciálnych polystyrénových platniach s otvormi s polguľovým dnom. Pri jeho použití na sérologickú diagnostiku sa v týchto jamkách pripravia dvojnásobné riedenia testovacieho séra vo fyziologickom roztoku a následne sa doň pridá suspenzia senzibilizovaných erytrocytov ako diagnostický prostriedok. Výsledky sa zaznamenávajú po 2 hodinách inkubácie pri 37 °C podľa štvorkrížového systému. Pri pozitívnej reakcii sa aglutinované erytrocyty usadzujú na dne jamky a rovnomerne ju pokrývajú vo forme obráteného dáždnika. Pri negatívnej reakcii sa erytrocyty tiež usadia, kvapalina sa stáva priehľadnou, zrazenina vyzerá ako malý „disk“ v strede otvoru. Sérový titer v RPHA sa považuje za jeho posledné riedenie, ktoré stále poskytuje výraznú hemaglutináciu bez významné znaky mať disk.
RPHA je možné použiť aj ako zrýchlenú metódu bakteriologickej diagnostiky na detekciu neznámych baktérií, vírusov, toxínov, ako sú morové patogény, stafylokokové enterotoxíny a pod., priamo v testovanom materiáli protilátky - protilátka erytrocytum diagnosticum. Ak testovaný materiál obsahuje dostatočné množstvo známeho antigénu, TPHA bude pozitívny.
Možnosti použitia RPGA sú: reakcia neutralizácie antigénu (RNAg), reakcia neutralizácie protilátky (RNAt), reakcia pasívnej inhibície hemaglutinácie (RPHA). Na tieto reakcie sa používajú antigénne a protilátkové erytrocytové diagnostiky. Súbežne možno použiť dve vzájomne sa kontrolujúce jednosmerné reakcie, napríklad RPHA s antigénnym diagnostikom a RNAg s protilátkovým erytrocytovým diagnostikom.
Protilátková neutralizačná reakcia (RNAt) spočíva v tom, že suspenzia obsahujúca požadovaný antigén sa zmieša so špecifickým imunitným sérom obsahujúcim známe protilátky vo vhodných objemoch a inkubuje sa pri teplote 37 °C počas dvoch hodín. Potom sa pridá antigénne erytrocytové diagnosticum. Zmes sa pretrepe a nechá sa pri teplote miestnosti. Výsledky sa berú do úvahy po 3-4 hodinách a nakoniec - po 18-24 hodinách.Ak je v testovanom materiáli antigén, naviaže protilátky (neutralizuje ich), a preto nedôjde k hemaglutinácii.
Podľa rovnakého princípu sa uskutočňuje reakcia neutralizácie antigénu (RNAg). Iba v tomto prípade sa v testovanom materiáli zistia protilátky. Špecifický antigén pridaný k takému testovanému materiálu sa naviaže na protilátky v ňom obsiahnuté, t.j. antigén bude neutralizovaný protilátkami, a preto po pridaní protilátky erytrocytárne diagnosticum nenastane hemaglutinácia.
Koaglutinačná reakcia. Je to jedna z možností pasívnej, t.j. bunkami sprostredkovanej protilátkovo-nosičom zrýchlenej aglutinačnej reakcie na skle. Táto reakcia je založená na jedinečná nehnuteľnosť Staphylococcus aureus, ktorý má vo svojej bunkovej stene proteín A, sa viažu na Fc fragmenty IgG a IgM. Súčasne aktívne centrá protilátok zostávajú voľné a môžu interagovať so špecifickými determinantami antigénov. Na podložné sklíčko sa nanesie kvapka 2% suspenzie stafylokokov senzibilizovaných zodpovedajúcimi protilátkami a pridá sa kvapka suspenzie študovaných baktérií. Keď antigén zodpovedá protilátkam, po 30-60 sekundách dôjde k jasnej aglutinácii stafylokokov naložených protilátkami.
Latexová aglutinačná reakcia (LAH). Nosičom protilátok v tomto diagnostickom systéme sú malé štandardné častice latexu. Reakcia sa uskutočňuje mikrometódou v jamkách na skle. Hlavnou podmienkou úspešného nastavenia PAH je prísne dodržiavanie kvantitatívnych pomerov zložiek systému: 10 µl latexového prípravku senzibilizovaného protilátkami sa pridá k 50 µl testovaného materiálu. Špecifickosť PAH sa kontroluje pomocou troch kontrolných testov obsiahnutých v komerčných testovacích systémoch: známe pozitívna reakcia, samozrejme spätnú reakciu a kontrola kvality latexovej suspenzie pre latexy nesenzibilizované PAH (neobsahujúce protilátky) s testovaným materiálom. U nás sa ako nosiče špecifických protilátok používajú monodisperzné polystyrénové latexy s rôznymi priemermi častíc (0,3; 0,66; 0,75; 0,8 μm). LAH sa používa na rýchlu detekciu mikroorganizmov alebo ich antigénov v testovanom materiáli.
Imunomagnetická detekcia antigénov. Jedna z možností zrýchlenej aglutinačnej reakcie na skle je spojená s použitím supermagnetických polymérnych častíc potiahnutých špecifickými protilátkami. Jedna takáto častica viaže až 107-108 buniek mikroorganizmov, vďaka čomu je citlivosť túto metódu dosahuje 5 CFU / ml. Imunomagnetickú detekciu mikroorganizmov možno použiť v kombinácii s KPR.
Agregátno-hemaglutinačná reakcia (RAGA). Umožňuje rýchlo odhaliť v krvi pacientov ako voľne cirkulujúce antigény (antigenémia), tak aj antigény spojené s protilátkami – cirkulujúce imunitné komplexy (CIC). Pre RAGA sa používajú erytrocyty senzibilizované vhodnými protilátkami. Pridanie krvného séra pacienta, ktoré obsahuje antigény, k senzibilizovaným erytrocytom, na ktoré sú fixované protilátky, vedie k zlepeniu (aglutinácii) erytrocytov a imunitných komplexov.
Antiglobulínový Coombsov test (R. Coombsova reakcia). Pomocou priamych a pasívnych aglutinačných reakcií sa stanovujú kompletné (bivalentné) protilátky. Nekompletné (monovalentné, blokujúce) protilátky sa týmito metódami nedetekujú, pretože v kombinácii s antigénom ho blokujú, ale nemôžu spôsobiť agregáciu antigénu do veľkých konglomerátov. Neúplné (blokujúce) protilátky sú tie, v ktorých funguje iba jedno aktívne centrum; druhé aktívne centrum z neznámeho dôvodu nefunguje. Na identifikáciu neúplných protilátok sa používa špeciálna Coombsova reakcia (obr. 72). Reakcia zahŕňa: sérum pacienta, v ktorom určujú neúplné protilátky, korpuskulárne antigénne diagnosticum, antiglobulínové sérum obsahujúce protilátky proti ľudskému globulínu. Reakcia prebieha v dvoch fázach:
Interakcia antigénu s nekompletnými protilátkami. Neexistujú žiadne viditeľné prejavy. Prvý stupeň je ukončený premytím antigénu zo zvyškov pacientovho séra.
Interakcia antiglobulínového séra získaného ako výsledok imunizácie zvieraťa ľudským globulínom s neúplnými protilátkami adsorbovanými na antigén. Vzhľadom na to, že antiglobulínové protilátky sú divalentné, viažu dve monovalentné protilátky samostatných komplexov antigénov + neúplnú protilátku, čo vedie k ich zlepeniu a vzniku viditeľnej zrazeniny.
13.1. Reakcie antigén-protilátka a ich použitie
Pri injekcii antigénu sa v tele tvoria protilátky. Protilátky sú komplementárne k antigénu, ktorý spôsobil ich syntézu, a sú schopné sa naň viazať. Väzba antigénov na protilátky pozostáva z dvoch fáz. Prvá fáza je špecifická, v ktorej dochádza k rýchlej väzbe antigénneho determinantu na aktívne centrum Fab fragmentu protilátok. Je potrebné poznamenať, že väzba je spôsobená van der Waalsovými silami, vodíkom a hydrofóbnymi interakciami. Sila väzby je určená stupňom priestorovej zhody medzi aktívnym miestom protilátky a epitopom antigénu. Po špecifickej fáze nastupuje pomalšia - nešpecifická, ktorá sa prejavuje viditeľným fyzikálnym javom (napríklad tvorbou vločiek pri aglutinácii a pod.).
Imunitné reakcie sú interakcie medzi protilátkami a antigénmi a tieto reakcie sú špecifické a vysoko citlivé. Sú široko používané v lekárska prax. Pomocou imunitných reakcií je možné vyriešiť tieto úlohy:
Stanovenie neznámych protilátok známymi antigénmi (antigenic diagnosticum). Takouto úlohou je, keď je potrebné stanoviť protilátky proti patogénu v krvnom sére pacienta (sérodiagnostika). Nájdenie protilátok vám umožňuje potvrdiť diagnózu;
Stanovenie neznámych antigénov známymi protilátkami (diagnostické sérum). Táto štúdia sa vykonáva pri identifikácii kultúry patogénu izolovaného z materiálu pacienta (sérotypizácia), ako aj pri detekcii
antigény mikróbov a ich toxínov v krvi a iných biologických tekutinách. Existuje mnoho typov imunitných reakcií, ktoré sa líšia technikou nastavenia a zaznamenaným efektom. Sú to aglutinačné reakcie (RA), precipitácia (RP), reakcie zahŕňajúce komplement (RCC), reakcie s použitím značených komponentov (RIF, ELISA, RIA).
13.2. Aglutinačná reakcia
Aglutinačná reakcia (RA) je imunitná reakcia interakcie antigénu s protilátkami za prítomnosti elektrolytov a antigén je v korpuskulárnom stave (erytrocyty, baktérie, latexové častice s adsorbovanými antigénmi). Pri aglutinácii dochádza k zlepovaniu korpuskulárnych antigénov protilátkami, čo sa prejavuje tvorbou flokulentnej zrazeniny. K tvorbe vločiek dochádza vďaka tomu, že protilátky majú dve aktívne centrá, pričom antigény sú polyvalentné, t.j. majú viacero antigénnych determinantov. RA sa používa na identifikáciu patogénu izolovaného z materiálu pacienta, ako aj na detekciu protilátok proti patogénu v krvnom sére pacienta (napríklad Wrightova a Huddlesonova reakcia pri brucelóze, Vidalova reakcia pri brušnom týfuse a paratýfusu ).
Najjednoduchší spôsob nastavenia RA je reakcia na skle, ide o približnú RA, ktorá sa používa na určenie patogénu izolovaného od pacienta. Pri nastavení reakcie na podložné sklíčko sa aplikuje diagnostické aglutinačné sérum (v riedení 1:10 alebo 1:20), následne sa zavedie kultúra od pacienta. Reakcia je pozitívna, ak sa v kvapke objaví vločkovitá zrazenina. V blízkosti je umiestnená kontrola: namiesto séra sa aplikuje kvapka roztoku chloridu sodného. Ak je diagnostické aglutinačné sérum neadsorbované 1, tak sa riedi (na titer - riedenie, na ktoré má dôjsť k aglutinácii), t.j. vložte expandovanú RA do skúmaviek so zvyšujúcou sa hodnotou
1 Neadsorbované aglutinačné sérum môže aglutinovať príbuzné baktérie, ktoré majú bežné (skrížene reagujúce) antigény. Preto si užívajteadsorbované aglutinačné séra, z ktorých boli skrížene reagujúce protilátky odstránené adsorpciou ich príbuznými baktériami. V takýchto sérach zostávajú protilátky špecifické len pre túto baktériu.
riedenia aglutinačného séra, do ktorého sa pridajú 2-3 kvapky suspenzie patogénu izolovaného od pacienta. Aglutinácia sa zohľadňuje podľa množstva sedimentu a stupňa vyčírenia kvapaliny v skúmavkách. Reakcia sa považuje za pozitívnu, ak je zaznamenaná aglutinácia v riedení blízkom titru diagnostického séra. Reakcia je sprevádzaná kontrolami: sérum zriedené izotonickým roztokom chloridu sodného by malo byť priehľadné, suspenzia mikróbov v tom istom roztoku by mala byť rovnomerne zakalená, bez sedimentu.
Na stanovenie protilátok proti patogénu v krvnom sére pacienta sa používa rozšírená RA. Keď sa vloží do skúmaviek, krvné sérum pacienta sa zriedi a do skúmaviek sa pridá rovnaké množstvo suspenzie diagnosticum (suspenzia usmrtených mikróbov). Po inkubácii sa určí najvyššie riedenie séra, pri ktorom došlo k aglutinácii, t.j. vytvorila sa zrazenina (sérový titer). V tomto prípade dochádza k aglutinačnej reakcii s O-diagnosticum (baktérie usmrtené zahrievaním, zachovávajúce si termostabilný O-antigén) vo forme jemnozrnnej aglutinácie. Aglutinačná reakcia s H-diagnosticum (baktérie usmrtené formalínom, zadržiavajúce tepelne labilný bičíkový H-antigén) je hrubozrnná a prebieha rýchlejšie.
Reakcia nepriamej (pasívnej) hemaglutinácie(RNGA alebo RPGA) je typ RA. Táto metóda je vysoko citlivá. Pomocou RNGA možno vyriešiť dve úlohy: stanoviť protilátky v krvnom sére pacienta, ku ktorému sa pridáva antigénne erytrocytové diagnosticum, čo sú erytrocyty, na ktorých sú adsorbované známe antigény; určiť prítomnosť antigénov v testovanom materiáli. V tomto prípade sa reakcia niekedy nazýva reverzná nepriama hemaglutinačná reakcia (RONGA). Pri stagingu sa do testovaného materiálu pridáva protilátkové erytrocytové diagnosticum (erytrocyty s protilátkami adsorbovanými na ich povrchu). Erytrocyty v tejto reakcii pôsobia ako nosiče a pasívne sa podieľajú na tvorbe imunitných agregátov. Pri pozitívnej reakcii pasívne prilepené erytrocyty pokrývajú dno jamky rovnomernou vrstvou s vrúbkovanými okrajmi („dáždnik“); v neprítomnosti aglutinácie sa erytrocyty hromadia v centrálnom vybraní jamky a vytvárajú kompaktný "gombík" s ostro ohraničenými okrajmi.
Koaglutinačná reakcia používa sa na detekciu patogénnych buniek (antigénov) pomocou protilátok adsorbovaných na Staphylococcus aureus, obsahujúci proteín A. Proteín A má afinitu k Fc fragmentu imunoglobulínov. Vďaka tomu sa protilátky viažu na stafylokoka nepriamo cez Fc fragment a Fab fragmenty sú orientované smerom von a sú schopné interagovať so zodpovedajúcimi mikróbmi izolovanými od pacientov. V tomto prípade sa tvoria vločky.
Hemaglutinačná inhibičná reakcia (HITA) používané pri diagnostike vírusových infekcií a iba infekcií spôsobených hemaglutinačnými vírusmi. Tieto vírusy obsahujú na svojom povrchu proteín - hemaglutinín, ktorý je zodpovedný za hemaglutinačnú reakciu (RHA) po pridaní k vírusom erytrocytov. RTGA spočíva v blokovaní vírusových antigénov protilátkami, v dôsledku čoho vírusy strácajú schopnosť aglutinovať červené krvinky.
Coombsova reakcia - RA na detekciu neúplných protilátok. Pri niektorých infekčných ochoreniach, ako je brucelóza, cirkulujú v krvnom sére pacienta neúplné protilátky proti patogénu. Neúplné protilátky sa nazývajú blokujúce, pretože majú jedno väzbové miesto pre antigén a nie dve, ako sú plné protilátky. Preto, keď sa pridá antigénne diagnostické činidlo, neúplné protilátky sa viažu na antigény, ale nezlepujú ich. Na prejavenie reakcie sa pridáva antiglobulínové sérum (protilátky proti ľudským imunoglobulínom), čo povedie k aglutinácii imunitných komplexov (antigénne diagnosticum + neúplné protilátky) vytvorených v prvom štádiu reakcie.
Nepriama Coombsova reakcia sa používa u pacientov s intravaskulárna hemolýza. U niektorých z týchto pacientov sa našli neúplné monovalentné protilátky proti Rhesus. Špecificky interagujú s Rh-pozitívnymi erytrocytmi, ale nespôsobujú ich aglutináciu. Preto sa do systému anti-Rh protilátok + Rh-pozitívne erytrocyty pridáva antiglobulínové sérum, ktoré spôsobuje aglutináciu erytrocytov. Na diagnostiku sa používa Coombsova reakcia patologických stavov spojené s intravaskulárnou lýzou erytrocytov imunitného pôvodu, napríklad hemolytická choroba novorodenca v dôsledku konfliktu Rhesus.
RA na stanovenie krvných skupín je založená na aglutinácii erytrocytov protilátkami imunitného séra na antigény krvných skupín A (II), B (III). Kontrolou je sérum, ktoré neobsahuje protilátky, t.j. krvné skupiny AB (IV) v sére a antigény erytrocytov skupín A (P) a B (III). Erytrocyty skupiny 0(I) sa používajú ako negatívna kontrola, pretože nemajú antigény.
Na stanovenie Rh faktora sa používajú anti-Rh séra (najmenej dve rôzne série). V prítomnosti Rh antigénu na membráne študovaných erytrocytov dochádza k aglutinácii týchto buniek.
13.3. zrážacia reakcia
RP je imunitná reakcia interakcie protilátok s antigénmi v prítomnosti elektrolytov a antigén je v rozpustnom stave. Pri precipitácii dochádza k vyzrážaniu rozpustných antigénov protilátkami, čo sa prejavuje zákalom vo forme precipitačných pásov. Tvorba viditeľnej zrazeniny sa pozoruje, keď sa obe činidlá zmiešajú v ekvivalentných pomeroch. Nadbytok jedného z nich znižuje množstvo vyzrážaných imunitných komplexov. Existujú rôzne spôsoby, ako nastaviť zrážaciu reakciu.
Reakcia zrážania kruhu umiestnené v zrážacích skúmavkách s malým priemerom. Imunitné sérum sa pridá do skúmavky a opatrne sa navrství rozpustný antigén. S pozitívnym výsledkom sa na hranici dvoch roztokov vytvorí mliečny krúžok. Kruhová precipitačná reakcia, ktorá určuje prítomnosť antigénov v orgánoch a tkanivách, ktorých extrakty sa varia a filtrujú, sa nazýva termoprecipitačná reakcia (Ascoliho reakcia na stanovenie termostabilného antraxového antigénu).
Ouchterlonyho dvojitá imunodifúzna reakcia. Táto reakcia sa uskutočňuje na agarovom géli. Jamky sa vyrežú v gélovej vrstve rovnomernej hrúbky v určitej vzdialenosti od seba a naplnia sa antigénom a imunitným sérom. Potom antigény a protilátky difundujú do gélu, stretávajú sa a vytvárajú imunitné komplexy, ktoré sa vyzrážajú v géli a stávajú sa viditeľnými ako línie precipitácie.
výživa. Táto reakcia sa môže použiť na detekciu neznámych antigénov alebo protilátok, ako aj na kontrolu podobnosti medzi rôznymi antigénmi: ak sú antigény identické, precipitačné línie sa spoja; ak antigény nie sú identické, precipitačné línie sa pretínajú; ak sú antigény čiastočne identické, vzniká ostroha.
Radiálna imunodifúzna reakcia. Do roztaveného agarový gél pridajte protilátky a naneste gél v rovnomernej vrstve na sklo. V géli sa vyrežú jamky a zavedie sa do nich štandardný objem roztokov antigénu rôznych koncentrácií. Počas inkubácie antigény radiálne difundujú z jamky a pri stretnutí s protilátkami vytvoria precipitačný kruh. Pokiaľ je v jamke nadbytok antigénu, dochádza k postupnému zväčšovaniu priemeru precipitačného prstenca. Táto metóda sa používa na stanovenie antigénov alebo protilátok v testovacom roztoku (napríklad na stanovenie koncentrácie imunoglobulínov rôznych tried v krvnom sére).
Imunoelektroforéza. Zmes antigénov sa predbežne oddelí elektroforézou, potom sa do drážky v smere pohybu proteínu zavedie zrážacie antisérum. Antigény a protilátky difundujú do gélu smerom k sebe; pri interakcii tvoria oblúkovité línie zrážok.
flokulačná reakcia(podľa Ramona) - druh precipitačnej reakcie, ktorá sa používa na stanovenie aktivity antitoxického séra alebo toxoidu. Reakcia sa uskutočňuje v skúmavkách. V skúmavke, kde sú toxoid a antitoxín v ekvivalentnom pomere, sa pozoruje zákal.
13.4. Reakcia fixácie komplementu
Protilátky, ktoré interagujú so zodpovedajúcim antigénom, viažu pridaný komplement (1. systém). Indikátorom fixácie komplementu sú erytrocyty senzibilizované hemolytickým sérom, t.j. protilátky proti erytrocytom (2. systém). Ak doplnok nie je v 1. systéme fixovaný, t.j. nedochádza k reakcii antigén-protilátka, potom sú senzibilizované červené krvinky úplne lyzované (negatívna reakcia). Keď je komplement viazaný imunitnými komplexmi 1. systému, po pridaní senzibilizovaných erytrocytov hemolýza
chýba (pozitívna reakcia). Reakcia fixácie komplementu sa používa na diagnostiku infekčných ochorení (kvapavka, syfilis, chrípka atď.).
13.5. Neutralizačná reakcia
Mikróby a ich toxíny majú škodlivý účinok na orgány a tkanivá ľudského tela. Protilátky sú schopné naviazať sa na tieto škodlivé látky a blokovať ich, t.j. neutralizovať. Táto vlastnosť protilátok je založená diagnostická reakcia neutralizácia. Vykonáva sa zavedením zmesi antigén-protilátka do zvierat alebo do citlivých testovacích objektov (bunková kultúra, embryá). Napríklad na detekciu toxínov v materiáli pacienta sa zvieratám 1. skupiny vstrekne materiál pacienta. Zvieratám z 2. skupiny sa injekčne podá podobný materiál vopred ošetrený vhodným antisérom. Zvieratá 1. skupiny uhynú v prítomnosti toxínu v materiáli. Druhá skupina zvierat prežije, škodlivý účinok toxínu sa neprejaví, pretože je neutralizovaný.
13.6. Reakcie využívajúce značené protilátky alebo antigény
13.6.1. Imunofluorescenčná reakcia (RIF, Koonsova metóda)
Táto metóda sa používa na expresnú diagnostiku. Dokáže detekovať mikrobiálne antigény aj protilátky.
Priama metóda RIF- imunitná reakcia interakcie protilátok s antigénmi a protilátky sú značené fluorochrómom - látkou schopnou vyžarovať svetelné kvantá určitej vlnovej dĺžky pri dopade svetla určitej vlnovej dĺžky. Zvláštnosťou nastavenia tejto metódy je potreba odstrániť nezreagované zložky, aby sa vylúčila detekcia nešpecifickej luminiscencie. Na tento účel vykonajte pranie nezreagovaných protilátok. Výsledky sa vyhodnocujú pomocou fluorescenčného mikroskopu. Baktérie v nátere ošetrenom takýmto luminiscenčným sérom žiaria na tmavom pozadí pozdĺž obvodu bunky.
Nepriama metóda RIF používaná viac ako predchádzajúca. Táto reakcia sa uskutočňuje v dvoch krokoch. V prvej fáze sa antigény navzájom
interagujú so zodpovedajúcimi protilátkami a vytvárajú imunitné komplexy. Všetky zložky, ktoré nezreagovali (t.j. nie sú súčasťou imunitných komplexov), sa musia odstrániť umytím. V druhom štádiu sa vytvorený komplex antigén-protilátka deteguje pomocou fluorochrómového antiglobulínového séra. V dôsledku toho vzniká komplexný mikrób + antimikrobiálne králičie protilátky + protilátky proti králičím imunoglobulínom značené fluorochrómom. Výsledky sa vyhodnocujú pomocou fluorescenčného mikroskopu.
13.6.2. Imunotest alebo test
ELISA je najbežnejšia moderná metóda používané na diagnostiku vírusových, bakteriálnych, protozoálnych infekcií, najmä na diagnostiku infekcie HIV, vírusová hepatitída atď.
Existuje veľa modifikácií ELISA. Široko sa používa nekompetitívna ELISA na pevnej fáze. Uskutočňuje sa v 96-jamkových polystyrénových platniach (tuhá fáza). Počas reakcie je potrebné v každom stupni zmyť nezreagované zložky. Pri určovaní protilátok sa jamky, na ktorých sa adsorbujú antigény, naplnia skúmaným krvným sérom a potom antiglobulínovým sérom označeným enzýmom. Ukážte reakciu pridaním substrátu pre enzým. V prítomnosti enzýmu sa substrát mení a komplex enzým-substrát sa volí tak, aby sa produkt vzniknutý pri reakcii zafarbil. Pri pozitívnej reakcii sa teda pozoruje zmena farby roztoku. Na stanovenie antigénov sa nosič v tuhej fáze senzibilizuje protilátkami, potom sa postupne zavedie testovaný materiál (antigény) a enzýmovo značené antigénne sérum. Na prejavenie reakcie sa zavedie substrát pre enzým. Pri pozitívnej reakcii nastáva zmena farby roztoku.
13.6.3. Imunoblotting
Táto metóda je založená na kombinácii elektroforézy a ELISA. Pri vykonávaní imunoblottingu (blotting z angl. škvrna- spot) komplexná zmes antigénov sa najskôr podrobí elektroforéze v polyakrylamidovom géli. Výsledná frakcionovaná anti-
génové peptidy sa prenesú na nitrocelulózovú membránu. Bloty sa potom ošetria enzýmom značenými protilátkami proti špecifickému antigénu, t.j. vykonajte ELISA blot. Imunoblotting sa používa pri diagnostike infekcií, ako je HIV.
13.6.4. Imunitná elektrónová mikroskopia
Metóda spočíva v mikroskopovaní vírusov (zriedkavo iných mikróbov) v elektrónovom mikroskope, ktoré boli predtým ošetrené vhodným imunitným sérom značeným elektrónovo-opticky hustými prípravkami, napríklad feritínom, proteínom obsahujúcim železo.
13.7. prietoková cytometria
Krvné bunky sa diferencujú na základe laserovej cytofluorometrie. Na tento účel sa požadované bunky zafarbia fluorescenčnými monoklonálnymi protilátkami proti CD antigénom. Vzorka krvi po ošetrení značenými protilátkami prechádza cez tenkú skúmavku a cez ňu prechádza laserový lúč, ktorý vybudí luminiscenciu fluorochrómu. Intenzita fluorescencie koreluje s hustotou antigénov na bunkovom povrchu a možno ju kvantifikovať pomocou fotonásobiča. Získané výsledky sa prevedú do histogramu.
Na stanovenie sa používa prietoková cytometria imunitný stav(obsah hlavných populácií lymfocytov, obsah intracelulárnych a extracelulárnych cytokínov, funkčná aktivita NK buniek, aktivita fagocytózy atď.).
Predĺžená aglutinačná reakcia (RA). Na stanovenie AT v krvnom sére pacienta vložte rozšírená aglutinačná reakcia (RA). Na tento účel sa do série riedení krvného séra pridáva diagnostikum - suspenzia usmrtených mikroorganizmov alebo častíc s adsorbovaným Ag. Maximálne riedenie aglutinácia Ag, nazývaný titer krvného séra.
Odrody aglutinačnej reakcie (RA) na zistenie AT - kvapkový test na tularémiu (s aplikáciou diagnostika na kvapku krvi a objavením sa viditeľných belavých aglutinátov) a Huddlesonovej reakcie na brucelózu (s diagnostikom zafarbeným genciánovou violeťou aplikovanou na kvapku krvného séra).
Približná aglutinačná reakcia (RA)
Na identifikáciu izolovaných mikroorganizmov sa na podložné sklíčka umiestni približná RA. Za týmto účelom sa kultúra patogénu pridá do kvapky štandardného diagnostického antiséra (v riedení 1:10, 1:20). Ak je výsledok pozitívny, dajú podrobnú reakciu so zvyšujúcim sa riedením antiséra.
reakciu za pozitívne, ak sa aglutinácia pozoruje v riedeniach blízkych titru diagnostického séra.
OAS. Somatické O-Ag sú tepelne stabilné a odolávajú varu 2 h.. Pri interakcii s AT tvoria jemnozrnné agregáty.
N-Ag. H-Ag (bičíkatý) termolabilné a rýchlo zničené pri 100 °C, ako aj pôsobením etanolu. Pri reakciách s H-antisérom sa po 2 hodinách inkubácie vytvoria voľné veľké vločky (vytvorené baktériami, ktoré sa zlepia s bičíkmi).
Vi Ar baktérie týfusu sú relatívne termostabilné (odoláva teplote 60-62 ° C počas 2 hodín); pri inkubácii s Vi-antisérom vzniká jemnozrnný aglutinát.
Priame hemaglutinačné reakcie
Najjednoduchšie z nich reakcie - aglutinácia erytrocyty, alebo hemaglutinácia, používané na stanovenie krvných skupín v systéme AB0. Na určenie aglutinácia(alebo jeho absencia) sa používajú štandardné antiséra s anti-A a anti-B aglutinínmi. Reakcia sa nazýva priama, pretože študované antigény sú prirodzenými zložkami erytrocytov.
Zdieľané s priama hemaglutinácia mechanizmov má vírusovú hemaglutináciu. Mnohé vírusy sú schopné spontánne aglutinovať vtáčie a cicavčie erytrocyty a ich pridanie do suspenzie erytrocytov spôsobuje tvorbu agregátov z nich.
