Virologické štúdie sú štúdie určené na izoláciu vírusov a štúdium ich vlastností, ako aj na stanovenie etiologického vzťahu vírusov s určitými chorobami.

Materiál na štúdiu sa odoberá v závislosti od umiestnenia prevládajúcich vírusov v tele pacienta a od spôsobov ich izolácie počas vonkajšie prostredie. Materiál sa odoberie do sterilnej misky, čo najrýchlejšie sa dodá do laboratória a uskladní sa, kým sa štúdia nezmrazí alebo na ľade. Pred použitím je materiál na izoláciu vírusu spracovaný (a) na potlačenie cudzej mikroflóry a podrobený odstráneniu veľkých častíc.

Izolácia vírusov sa vykonáva infikovaním laboratórnych zvierat, kuracích embryí, tkanivovej kultúry materiálom obsahujúcim vírus. Výber spôsobu izolácie závisí od údajného pôvodcu ochorenia. Tkanivové kultúry (pozri) sa teda používajú pri práci s vírusmi, ktoré nie sú patogénne pre laboratórne zvieratá, alebo keď sú detegované v tkanivovej kultúre skôr, ako keď sú zvieratá infikované. Kuracie embryá sa infikujú, aby sa izolovali patogény, infekčná parotitída (do amniotickej a alantoidnej dutiny), (do žĺtkového vaku), kiahne (na choriolantoickej membráne).

Z laboratórnych zvierat sa na izoláciu vírusov najčastejšie používajú biele myši, nasledujú králiky, potkany, morčatá, opice. V prípade arbovírusov je najúčinnejšie zavedenie materiálu obsahujúceho vírus do hlavy alebo v prípade pneumotropných vírusov - na sliznicu dýchacieho traktu, na vírusy kiahní, na skarifikovanú rohovku.

Izolácia vírusov je najúčinnejšia v akútnom období ochorenia. Podstatným bodom pri stanovení vírusovej povahy ochorenia sú výsledky sérologické štúdie séra odobraté opakovane od toho istého pacienta na začiatku ochorenia a počas rekonvalescencie. Detekcia protilátok proti izolovaným vírusom v druhom sére v titri 4 a viackrát vyššom ako v prvom sére naznačuje etiologickú súvislosť vírusov s týmto ochorením.

Skoré a rýchla metóda detekcia vírusových antigénov je metóda fluorescenčných protilátok založená na špecifickej fixácii protilátok značených fluorochrómom na povrchu antigénu. Antigén sa dá ľahko odhaliť luminiscenčnou mikroskopiou (pozri) vďaka jasnej fluorescencii protilátok adsorbovaných na antigéne. Metódou fluorescenčných protilátok sa vyšetrujú stery odobraté pacientom, histologické rezy postihnutých tkanív, preparáty z tkanivovej kultúry. Platí aj pre detekciu elementárnych telies (viriónov) (pozri). Z ďalších morfologických metód sa používajú tie, ktoré detegujú intracelulárne vírusové inklúzie v rezoch postihnutých orgánov a tkanív. Detekcia inklúzií naznačuje infekciu a v niektorých prípadoch prispieva k diagnostike vírusového ochorenia. Zisťovať vírusové protilátky v krvi pacientov a študovať antigénna štruktúra používajú sa rôzne vírusy. Neutralizačná reakcia sa používa takmer pri všetkých vírusových infekciách. Je založená na schopnosti imunitných protilátok neutralizovať infekčné vlastnosti vírusov, keď sa zmes zavádza do tela vnímavých zvierat alebo do tkanivovej kultúry. Na stanovenie neutralizačného indexu sa konštantná dávka séra zmieša s rôznymi riedeniami vírusov a na stanovenie titra protilátok - rôzne riedenia sérum s konštantnou dávkou vírusov. Kontrolou je infekcia zvierat (alebo tkanivových kultúr) zmesou vírusov s normálnym sérom alebo s fyziologický roztok. Neutralizačná reakcia je nastavená nielen na detekciu protilátok, ale aj na určenie typu a typu vírusov.

Reakcia fixácie komplementu [napríklad Borde - Zhanguova reakcia (pozri)] sa používa na detekciu vírusových antigénov aj protilátok. V prvom prípade dochádza k interakcii známeho imunitného séra s materiálom, v ktorom sa predpokladá prítomnosť antigénov: krvné sérum, výtery z nosohltanu, tkanivové extrakty infikovaného organizmu. V druhom prípade známy antigén (diagnosticum) a sérum pacienta alebo rekonvalescenta.

RSK sa používa na diagnostiku ochorení spôsobených chrípkou, kiahňami, adenovírusmi a arbovírusmi.

Práca na kurze

"Metódy klinickej virológie"

Úvod

Laboratórna diagnostika vírusové infekcie realizované najmä pomocou elektrónovej mikroskopie, citlivých bunkových kultúr a imunologických metód. Na diagnostiku sa spravidla vyberá ľubovoľná metóda v závislosti od štádia vírusovej infekcie. Napríklad všetky tri prístupy môžu byť užitočné pri diagnostike ovčích kiahní, ale úspešné použitie mikroskopie a bunkovej kultúry závisí od schopnosti odobrať uspokojivé vzorky v relatívne skorom štádiu ochorenia.

Do veľkej miery úspech vírusová diagnostika závisí od kvality získaných vzoriek. Z tohto dôvodu by sa do odberu potrebných vzoriek mali priamo zapojiť aj samotní pracovníci laboratória. Charakteristiky vzoriek, ako aj spôsoby ich dodania do laboratória sú opísané Lennettom, Schmidtom, Kristom a kol.

Väčšina činidiel a nástrojov používaných v laboratórnej diagnostike je dostupná od rôznych spoločností. Vo väčšine prípadov rovnaké činidlo vyrába súčasne niekoľko spoločností. Z tohto dôvodu sme neuviedli jednotlivé firmy, pokiaľ činidlo nedodáva iba jedna firma. Vo všetkých ostatných prípadoch kontaktujte všeobecný zoznam dodávateľov uvedených v tabuľke. 1.

Nezamerali sme sa na komplexný popis všetkých v súčasnosti dostupných metód diagnostiky vírusových infekcií u ľudí. Najprv sme opísali hlavné metódy. Ako získavate skúsenosti samostatná práca tieto základné metódy možno použiť na riešenie zložitejších problémov.

1. Elektrónová mikroskopia

Na diagnostiku vírusových infekcií pomocou elektrónového mikroskopu sa môžu použiť tenké rezy postihnutého tkaniva. Najbežnejším materiálom pre elektrónovú mikroskopiu sú výkaly alebo kvapalina.

Tabuľka 1. Zoznam spoločností dodávajúcich činidlá a vybavenie

vezikuly, ktoré charakterizujú určité choroby, ako napríklad ovčie kiahne. Pri analýze takéhoto materiálu možno vírusy detegovať pomocou negatívneho farbenia, čo vedie k ohraničeniu zložiek viriónu materiálom s hustotou elektrónov. Metóda je účinná pri vysokých koncentráciách vírusu v testovacích vzorkách, ako napríklad vo výkaloch alebo vezikulárnej tekutine. V prípadoch, keď je obsah vírusových častíc vo vzorkách nízky, je možné zvýšiť pravdepodobnosť detekcie vírusu zahustením vírusu ultracentrifugáciou alebo jeho agregáciou so špecifickými protilátkami. Posledná uvedená metóda je vhodná aj na identifikáciu vírusov. Tu popisujeme elektrónovú mikroskopickú metódu diagnostiky rotavírusová infekcia a metóda imunoelektrónovej mikroskopie na príklade detekcie špecifických protilátok proti parvovírusom. Metódy elektrónovej mikroskopie podrobnejšie popisuje Field.

2.1 Priama elektrónová mikroskopia fekálií

1. Koniec Pasteurovej pipety sa ponorí do výkalov a odoberie sa dostatok materiálu, aby sa získal 1 cm náter.

2. Resuspendujte fekálny náter vo farbe negatívneho elektrónového mikroskopu, kým nezískate priesvitnú suspenziu. Negatívnym kontrastným farbivom je 2% roztok kyseliny fosfowolfrámovej v destilovanej vode.

3. Na získanie preparátu elektrónového mikroskopu sa kvapôčka suspenzie umiestni na mriežku elektrónovej mikroskopie potiahnutú uhlíkovo-formvarovým filmom. Počas tejto operácie sa sieťka drží pomocou jemnej pinzety.

4. Liečivo sa nechá na vzduchu 30 sekúnd.

5. Prebytočná kvapalina sa odstráni dotykom okraja pohára s filtračným papierom.

6. Droga sa suší na vzduchu.

7. V prípade potreby sa životaschopný vírus inaktivuje ožiarením oboch strán mriežky ultrafialovým svetlom s intenzitou 440 000 μW-s/cm 2 . V tomto prípade sa používa krátkovlnná ultrafialová lampa s filtrom. Lampa by mala byť vo vzdialenosti 15 cm od mriežky; doba ožarovania každej strany - 5 min.

8. Rotavírusové virióny možno charakterizovať pod transmisným elektrónovým mikroskopom so zväčšením 30 000 až 50 000.

2.2 Imunoelektrónová mikroskopia

Nižšie opísaná metóda imunoelektrónovej mikroskopie je len jednou z mnohých takýchto imunologických metód. Na štúdium vírusovo špecifických protilátok sa okrem toho používa metóda, ktorá zahŕňa väzbu na mikroskopickú sieť proteínu A. Pracovná koncentrácia antivírusových protilátok sa určuje pokusom a omylom v rozsahu od 1/10 do 1/1000. Nami uvedená koncentrácia sa spravidla používa pri bežnej práci. Na získanie optimálnych výsledkov interakcie protilátok s vírusom sa sérum obsahujúce parvovírus titruje rovnakým spôsobom.

1. 10 ul antiséra ľudského parvovírusu zriedeného 100-krát PBS. Roztok sa zahrieva vo vodnom kúpeli na 56 °C.

2. Roztopte 10 ml 2% agarózy v PBS obvyklým spôsobom a ochlaďte na 56 °C vo vodnom kúpeli.

3. Pri 56°C zmiešajte 1 ml zriedeného antiséra s 1 ml 2% agarózy.

4. Preneste 200 µl výslednej zmesi do dvoch jamiek 96-jamkovej mikrotitračnej doštičky.

5. Nechajte agarózu stuhnúť pri izbovej teplote. Doštičku možno skladovať pri teplote 4 °C niekoľko týždňov, ak je utesnená lepiacou páskou.

6. Pridajte 10 µl séra obsahujúceho parvovírus do jamky obsahujúcej zmes agarózy a antiséra.

7. Mriežka elektrónovej mikroskopie s vopred pripraveným uhlíkovo-formvarovým povlakom sa umiestni menej lesklou stranou na kvapku séra.

8. Mriežka sa udržiava 2 hodiny pri teplote 37 °C vo vlhkej komore.

9. Tenkou pinzetou sa sieťka vyberie a na povrch sieťky, ktorá bola v kontakte so sérom, sa nanesie kvapka 2% kyseliny fosfowolfrámovej.

10. Po 30 s sa prebytočná farba zmyje, prípravok sa vysuší a vírus sa inaktivuje.

Agregované vírusové častice sa skúmajú pod transmisným elektrónovým mikroskopom pri zväčšení 30 000 až 50 000.

3. Identifikácia vírusových antigénov

Vírusy v tkanivách alebo tkanivových tekutinách môžu byť identifikované vírusovo špecifickými proteínmi pomocou reakcie antigén-protilátka. Produkt reakcie antigén-protilátka sa testuje na značku, ktorá sa zavedie buď priamo do antivírusových protilátok, alebo do protilátok namierených proti vírusovo špecifickým protilátkam. Protilátky môžu byť označené fluoresceínom, rádioaktívnym jódom alebo enzýmom, ktorý štiepi substrát so zmenou farby. Okrem toho sa na identifikáciu vírusu používa hemaglutinačná reakcia. V každodennej praxi sa opísané metódy využívajú najmä na detekciu antigénov vírusu hepatitídy B v krvi a na vyhľadávanie antigénov rôznych vírusov, ktoré spôsobujú rôzne respiračné ochorenia.

V súčasnosti mnohé firmy vyrábajú erytrocytové, rádioaktívne a enzymatické diagnostika, vrátane tých na detekciu vírusu hepatitídy B. Nepovažujeme za vhodné popisovať spôsoby práce s týmito diagnostikami: úplne stačí postupovať podľa priloženého návodu. Nižšie sa zameriame na imunofluorescenčnú metódu na identifikáciu respiračného syncyciálneho vírusu v nazofaryngeálnych sekrétoch.

3.1 Identifikácia respiračného syncyciálneho vírusu v nazofaryngeálnych sekrétoch imunofluorescenciou

Spôsob získania preparátov nazofaryngeálnych sekrétov opísali Gardner a McQuilin. IN laboratórne podmienky táto operácia sa vykonáva v dvoch fázach. Najprv sa pripraví náter z nosohltanového hlienu na podložnom skle. Získané tampóny sa môžu skladovať v zafixovanom stave pri -20 °C po mnoho mesiacov. V druhom štádiu sa nátery zafarbia na detekciu antigénu respiračného syncyciálneho vírusu. Na tento účel sa používa metóda nepriamej imunofluorescencie.

3.1.1 Príprava nazofaryngeálnych sekrétov

1. Hlien zo špeciálnych klieští sa zmyje 1-2 ml PBS a prenesie sa do centrifugačnej skúmavky.

2. Centrifugujte 10 minút pri 1500 ot./min. v stolovej centrifúge.

3. Supernatant sa zlikviduje.

4. Bunková peleta sa jemne resuspenduje v 2-3 ml PBS, kým sa nezíska homogénna suspenzia. Na tento účel použite Pasteurovu pipetu so širokým hrdlom.

5. Výsledná suspenzia sa prenesie do skúmavky.

6. K suspenzii pridajte ďalšie 2-4 ml PBS a premiešajte pipetovaním. Veľké zrazeniny hlienu sú odstránené.

7. Centrifugujte 10 minút pri 1500 ot./min. v stolovej centrifúge.

8. Supernatant sa vypustí, zrazenina sa resuspenduje v takom objeme PBS, aby sa výsledná suspenzia ľahko oddelila od stien skúmavky.

9. Výsledná suspenzia sa nanesie na označené sklíčko.

10. Sklo sa suší na vzduchu.

Fixovať v acetóne 10 minút pri 4 °C.

12. Po upevnení sa sklo opäť vysuší na vzduchu.

13. Výsledné prípravky sa ihneď farbia alebo skladujú pri -20 °C.

3.1.2. Technika farbenia

1. Vytlačte a zrieďte komerčné antisérum proti RSV v PBS na odporúčanú pracovnú koncentráciu.

2. Pasteurovou pipetou naneste jednu kvapku antiséra na pripravený prípravok.

3. Liečivo sa umiestni do vlhkej komory.

4. Prípravok sa inkubuje 30 minút pri 37 °C.

5. Vzorky sa opatrne premyjú PBS, aby sa odstránili nadbytočné protilátky v špeciálnej nádrži.

6. Vzorky sa premyjú v troch zmenách PBS počas 10 minút.

7. Vysušte vzorky, odstráňte nadbytočný PBS filtračným papierom a vysušte na vzduchu.

Výskum na diagnostiku chorôb vírusovej povahy. Je to potrebné na identifikáciu vírusu, štúdium jeho biológie a schopnosti ovplyvňovať zvieracie a ľudské bunky. Takto je možné pochopiť patogenézu vírusové ochorenia a podľa toho zvoliť správny spôsob liečby.

Aká je diagnóza?

v živých bunkách. Na jej vyšetrenie je potrebné kultivovať na úrovni experimentálneho organizmu alebo K tomu je potrebné v lekárska prax a mikrobiológie vo všeobecnosti sa vykonávajú virologické výskumné metódy, ktoré majú tieto hlavné prístupy:

• rovný;
• nepriame;
• sérologické.

Materiál môže byť vyšetrený priamo na prítomnosť nukleových kyselín, vírusového antigénu, alebo napríklad na izoláciu a identifikáciu vírusu z klinického materiálu.

Okrem schopnosti stanoviť etiológiu ochorenia, sledovanie terapeutický účinok, v protiepidemických opatreniach zohrávajú významnú úlohu virologické výskumné metódy. Na izoláciu a použitie kuracích embryí, laboratórnych zvierat alebo bunkových kultúr.

Ako sa skúmajú?

Najrýchlejšia je priama metóda. Umožňuje detekovať vírus, antigén alebo NA (nukleovú kyselinu) v samotnom klinickom materiáli. Trvá to od dvoch hodín do jedného dňa.

1. EM - elektrónová mikroskopia. Detekuje vírus priamo.
2. IEM - imunitná elektrónová mikroskopia. Používa špecifické protilátky proti vírusom.
3. RIF - imunofluorescenčná reakcia. Používa protilátky naviazané na farbivo. Takéto virologické výskumné metódy sa široko používajú ako rýchle dekódovanie etiológie SARS (akútnych respiračných vírusových infekcií), keď sa odoberajú tampóny zo sliznice horných dýchacích ciest.
4. ELISA - enzýmová imunoanalýza - stanovenie vírusových antigénov, podobne ako RIF, ale založené na enzýmovom značení protilátok.
5. RIA - rádioimunoanalýza. Používa rádioizotopové značenie protilátok na zabezpečenie vysokej citlivosti pri detekcii vírusového antigénu.
6. Molekulárna - NK hybridizácia alebo izolácia vírusových genómov pomocou PCR (polymeráza reťazová reakcia).
7. Cytológia - používa sa zriedka, ale pri určitých infekciách sú tieto virologické metódy výskumu veľmi účinné. Skúmajú sa bioptické materiály, pitvy a nátery spracované na farbenie a analýzu pod mikroskopom.

Aký je zmysel výskumu?

Na úspešnú izoláciu vírusov sa klinický materiál odoberá v súlade s patogenézou a čo najskôr. Tento proces často vyžaduje niekoľko pasáží, kým sa použijú určité virologické testy.

Mikrobiológia je náuka o mikroskopických bytostiach. A jej odborom nie je len medicína. Je to základná veda pre poľnohospodárstvo, veterinárna medicína, kozmický a technický priemysel, geológia.

Ale samozrejme, všetko je stvorené pre človeka a jeho rozvoj na tejto krásnej planéte. Preto je veľmi dôležité včas odhaliť nebezpečenstvo a neutralizovať ho. Vírusy sa líšia od baktérií. Sú to štruktúry, ktoré vstupujú do tela a spôsobujú vznik novej generácie. Vyzerajú ako kryštály a sú zamerané na kontrolu procesu ich reprodukcie, hoci samy nekŕmia, nerastú a nevylučujú metabolické produkty.

Vírus môže spôsobiť závažné ochorenie v akomkoľvek živom organizme, do ktorého vstúpil. Navyše sa môže vyvíjať. Preto je potrebné vyvinúť a zdokonaliť virologické výskumné metódy v mikrobiológii, keďže ľudská civilizácia ako celok môže byť ohrozená.

materiálov

Na detekciu a identifikáciu vírusov v medicíne spravidla berú:

• návaly nosohltanu ( respiračné infekcie);
• splachovanie a výkaly ( enterovírusové infekcie);
• škrabance, obsah vezikúl (lézie kože, slizníc, ako herpes, kiahne);
• návaly horúčavy (exantemické infekcie ako osýpky, ružienka);
• krv, cerebrospinálnej tekutiny(arbovírusové infekcie).

Fázy

Všetky štádiá metódy virologického výskumu zahŕňajú:

• zber materiálu;
• výber, získanie testovacieho systému, určenie jeho životaschopnosti;
• infekcia testovacieho systému;
• indikácia vírusu;
• určenie typu vírusu.

Patogénne vírusy sa v podstate líšia v prítomnosti tkanivovej a typovej špecifickosti. Vezmime si napríklad poliovírus, ktorý sa rozmnožuje iba v primátoch (v ich bunkách). V súlade s tým sa na izoláciu konkrétneho vírusu používa špecifická tkanivová kultúra. Ak rozprávame sa o neznámom patogéne by bolo vhodné súčasne infikovať tri, výhodne štyri bunkové kultúry.

Možno teda jeden z nich bude citlivý. Na určenie prítomnosti vírusu v infikovaných kultúrach sa pozrite na vývoj špecifickej degenerácie buniek, intracelulárne inklúzie, detekciu špecifického antigénu, pozitívne hemaglutinačné a hemadsorpčné testy.

Všetky virologické vyšetrovacie metódy (priame a nepriame, sérologické) by sa mali zvoliť ako najvhodnejšie pre konkrétny prípad podozrenia na infekciu.

Nepriame metódy sú založené na izolácii a identifikácii vírusu. Sú pracné, zdĺhavé, ale presné.

Serodiagnostika

Táto diagnóza sa týka metódy založenej na reakcii antigén-protilátka. Najčastejšie sa používajú párové krvné séra, ktoré sa odoberajú v niekoľkotýždňových intervaloch. Ak je zvýšenie titra protilátok 4 alebo viackrát, reakcia sa považuje za pozitívnu. Na určenie typovej špecifickosti vírusu sa používa vírus neutralizačný test. Na určenie skupinovej špecifickosti musíte získať reakciu fixácie komplementu.

Rôzne varianty enzýmového imunotestu, hemaglutinačné inhibičné reakcie, pasívna hemaglutinácia, reverzná pasívna hemaglutinácia, RIF. Tiež v genetické inžinierstvo vyvinuli metódu na získanie monoklonálnych protilátok. Úzka špecificita monoklonov môže byť prekonaná použitím niekoľkých monoklonálnych protilátok proti rôznym vírusovým determinantom. Zvýšila sa tak špecificita a citlivosť testu so stanovením antigénov.

Niektoré funkcie

Dnes bolo vytvorených mnoho rôznych testovacích systémov na imunologickú diagnostiku infekcií vyplývajúcich zo vstupu vírusu do živého organizmu.

Virologické výskumné metódy sú teda metódami na izoláciu vírusov, štúdium ich vlastností a stanovenie ich etiologického vzťahu s určitými chorobami.

Virologický výskum zahŕňa dve hlavné etapy: izoláciu vírusov a ich identifikáciu. Materiálom na virologický výskum môže byť krv, iné biologické a patologické tekutiny, biopsie orgánov a tkanív.

Na diagnostiku arbovírusových infekcií sa často vykonáva virologické vyšetrenie krvi. Vírusy besnoty možno nájsť v slinách, mumps, herpes simplex, Výtery z nosohltanu sa používajú na izoláciu patogénov chrípky a iných akútnych respiračných vírusových infekcií, osýpok. Vo výplachoch zo spojovky sa nachádzajú adenovírusy. Z výkalov sa izolujú rôzne entero-, adsno-, pso-, nora- a rotavírusy.

Na izoláciu vírusov sa používajú bunkové kultúry, kuracie embryá a niekedy laboratórne zvieratá.

Väčšina patogénnych vírusov je tkanivovo a typovo špecifická, napríklad poliovírus sa rozmnožuje iba v bunkách primátov, takže na izoláciu špecifického vírusu sa používa vhodná tkanivová kultúra. Na izoláciu neznámeho patogénu sa odporúča súčasne infikovať 3-4 bunkové kultúry za predpokladu, že jedna z nich môže byť citlivá. Prítomnosť vírusu v infikovaných bunkových kultúrach je daná vývojom špecifickej degenerácie buniek, t.j. cytopatogénny efekt, detekcia intracelulárnych inklúzií, ako aj na základe dôkazu špecifického antigénu imunofluorescenciou, pozitívne hemadsorpčné a hemaglutinačné reakcie.

Vtáčie embryá so svojimi slabo diferencovanými tkanivami sú vhodné na kultiváciu mnohých vírusov. Chat stačí použiť kuracie embryá. Pri množení v embryách môžu vírusy spôsobiť ich smrť (arbovírusy), objavenie sa zmien na chorion-alantoidnej membráne (vírusy kiahní) alebo v tele embrya, hromadenie mag glutinínu v embryonálnych tekutinách v embryonálnych tekutinách (vírusy chrípky mumps) a komplement väzbového vírusového antigénu .

Identifikácia vírusov sa uskutočňuje pomocou imunologických metód: hemaglutinačná inhibičná reakcia, fixácia komplementu, neutralizácia, gélová precipitácia, imunofluorescencia.

Viac k téme Virologická metóda:

1. Vyhodnotenie hlavných antropometrických údajov parametrickou metódou (metóda sigma)
2. Liečba podmieneného zániku a metóda núteného tréningu
3. 2. Porovnávacia právna metóda - súkromná vedecká metóda právnej vedy
4. MODERNÉ METÓDY DIAGNOSTIKY A VOĽBA METÓDY LIEČBY SUBMUKÓZNEHO UTERNICKÉHO MYÓMU
5. 5.4. Pojem a štruktúra všeobecnej metódy vyšetrovania ako metódy praktickej činnosti
6. Téma 8. MIKROBIOLOGICKÉ METÓDY ŠTÚDIA VARIABILITY A MECHANIZMOV PRENOSU DEDIČNÝCH INFORMÁCIÍ. APLIKÁCIA GENETICKÝCH METÓD NA TVORBU NOVÝCH LIEKOV
7. Téma 15. PATOGENICITA A VIRULENCIA MIKROORGANIZMOV. FAKTORY VIRULENCIE. METÓDY INFEKCIE LABORATÓRNYCH ZVIERAT. ANTIGÉNY, METÓDY ICH ZÍSKÁVANIA. PROTILÁTKY. IMUNITNÉ REAKCIE A ICH PRAKTICKÉ VYUŽITIE. FAGOCYTÓZA

Metódy virologického výskumu

metódy štúdia biológie vírusov a ich identifikácie. Metódy sú široko používané vo virológii molekulárna biológia, pomocou ktorého bolo možné stanoviť molekulárnu štruktúru vírusových častíc, spôsoby ich prenikania do bunky a vlastnosti reprodukcie vírusov, primárnu štruktúru vírusových nukleových kyselín a proteínov. Vyvíjajú sa metódy na určenie sekvencie základných prvkov vírusových nukleových kyselín a proteínových aminokyselín. Je možné spojiť funkcie nukleových kyselín a nimi kódovaných proteínov s nukleotidovou sekvenciou a zistiť príčiny intracelulárnych procesov, ktoré hrajú dôležitú úlohu v patogenéze vírusovej infekcie.

Virologické metódy výskumu sú tiež založené na imunologických procesoch (interakcia antigénu s protilátkami), biologických vlastnostiach vírusu (schopnosť hemaglutinácie, hemolýza, enzymatickú aktivitu), znaky interakcie vírusu s hostiteľskou bunkou (povaha cytopatického účinku, tvorba intracelulárnych inklúzií atď.).

Pri diagnostike vírusových infekcií, pri kultivácii, izolácii a identifikácii vírusov, ako aj pri príprave vakcínových prípravkov sa široko používa metóda tkanivových a bunkových kultúr. Používajú sa primárne, sekundárne, stabilné kontinuálne a diploidné bunkové kultúry. Primárne kultúry sa získavajú dispergovaním tkaniva proteolytickými enzýmami (trypsín, kolagenáza). Zdrojom buniek môžu byť tkanivá a orgány (častejšie obličky) ľudských a zvieracích embryí. Suspenzia buniek v živnom médiu sa umiestni do takzvaných matracov, fliaš alebo Petriho misiek, kde sa bunky po prichytení na povrch nádoby začnú množiť. Pri vírusovej infekcii sa zvyčajne používa bunková monovrstva. Živná kvapalina sa vypustí, vírusová suspenzia sa zavedie v určitých riedeniach a po kontakte s bunkami sa pridá čerstvé živné médium, zvyčajne bez séra.

Bunky z väčšiny primárnych kultúr možno subkultivovať a označujú sa ako sekundárne kultúry. Pri ďalšom prechode buniek sa vytvorí populácia buniek podobných fibroblastom, schopná rýchlej reprodukcie, väčšina z nich ktorá zachováva pôvodnú sadu chromozómov. Ide o takzvané diploidné bunky. Pri sériovej kultivácii buniek sa získajú stabilné kontinuálne bunkové kultúry. Počas pasáží sa objavujú rýchlo sa deliace homogénne bunky s heteroploidnou sadou chromozómov. Stabilné bunkové línie môžu byť jednovrstvové a suspenzie. Jednovrstvové kultúry rastú vo forme súvislej vrstvy na povrchu skla, suspenzné kultúry rastú vo forme suspenzií v rôznych nádobách pomocou miešadiel. Existuje viac ako 400 bunkových línií odvodených zo 40 rôzne druhy zvierat (vrátane primátov, vtákov, plazov, obojživelníkov, rýb, hmyzu) a ľudí.

Kusy môžu byť pestované v umelých živných médiách jednotlivé orgány a tkanivách (orgánové kultúry). Tieto typy kultúr zachovávajú tkanivovú štruktúru, čo je obzvlášť dôležité pre izoláciu a pasáž vírusov, ktoré sa nereprodukujú v nediferencovaných tkanivových kultúrach (napríklad koronavírusy).

V infikovaných bunkových kultúrach možno vírusy detegovať zmenou morfológie buniek, cytopatickým účinkom, ktorý môže byť špecifický, výskytom inklúzií, stanovením vírusových antigénov v bunke a v kultivačnej tekutine; stanovenie biologických vlastností vírusového potomstva v kultivačnej tekutine a titrácia vírusov v tkanivovej kultúre, kuracích embryách alebo citlivých zvieratách; detekciou jednotlivých vírusových nukleových kyselín v bunkách molekulárnou hybridizáciou alebo zhlukov nukleových kyselín cytochemickou metódou pomocou fluorescenčnej mikroskopie.

Izolácia vírusov je namáhavý a zdĺhavý proces. Uskutočňuje sa s cieľom určiť typ alebo variant vírusu cirkulujúceho medzi populáciou (napríklad identifikovať sérovariant vírusu chrípky, divokého alebo vakcinačného kmeňa vírusu detskej obrny atď.); v prípadoch, keď je potrebné vykonať naliehavé epidemiologické opatrenia; keď sa objavia nové typy alebo varianty vírusov; v prípade potreby potvrďte predbežnú diagnózu; na označenie vírusov v objektoch životné prostredie. Pri izolácii vírusov sa berie do úvahy možnosť ich pretrvávania v ľudskom organizme, ako aj výskyt zmiešanej infekcie spôsobenej dvoma alebo viacerými vírusmi. Geneticky homogénna populácia vírusu získaná z jedného viriónu sa nazýva vírusový klon a proces jeho získania sa nazýva klonovanie.

Na izoláciu vírusov sa používa infekcia vnímavých laboratórnych zvierat, kuracie embryá, ale najčastejšie sa používa tkanivová kultúra. Prítomnosť vírusu je zvyčajne určená špecifickou degeneráciou buniek (cytopatický účinok), tvorbou sympplastov a syncýcií, detekciou intracelulárnych inklúzií, ako aj špecifickým antigénom detekovaným pomocou imunofluorescencie, hemadsorpcie, hemaglutinácie (u hemaglutinujúcich vírusov) atď. . Tieto príznaky možno zistiť až po 2-3 prechodoch vírusom.

Na izoláciu množstva vírusov, ako sú vírusy chrípky, sa používajú kuracie embryá, na izoláciu niektorých vírusov Coxsackie a množstva arbovírusov sa používajú novonarodené myši. Identifikácia izolovaných vírusov sa vykonáva pomocou sérologických testov a iných metód.

Pri práci s vírusmi sa určuje ich titer. Titrácia vírusov sa zvyčajne uskutočňuje v tkanivovej kultúre, pričom sa určuje najvyššie riedenie tekutiny obsahujúcej vírus, pri ktorom dochádza k degenerácii tkaniva, tvoria sa inklúzie a vírusovo špecifické antigény. Plakovú metódu možno použiť na titráciu množstva vírusov. Plaky alebo negatívne kolónie vírusov sú ložiská vírusom zničených buniek jednovrstvovej tkanivovej kultúry pod agarovým povlakom. Počítanie kolónií umožňuje kvantitatívnu analýzu infekčnej aktivity vírusov na základe toho, že jedna infekčná vírusová častica tvorí jeden plak. Plaky sa identifikujú zafarbením kultúry životne dôležitými farbivami, zvyčajne neutrálnou červenou; plaky neadsorbujú farbivo, a preto sú viditeľné ako svetlé škvrny na pozadí zafarbených živých buniek. Titer vírusu je vyjadrený ako počet jednotiek tvoriacich plak v 1 ml.

Purifikácia a koncentrácia vírusov sa zvyčajne uskutočňuje diferenciálnou ultracentrifugáciou, po ktorej nasleduje centrifugácia v koncentračných alebo hustotných gradientoch. Na čistenie vírusov sa používajú imunologické metódy, iónovo-výmenná chromatografia, imunosorbenty atď.

Laboratórna diagnostika vírusových infekcií zahŕňa detekciu patogénu alebo jeho zložiek v klinickom materiáli; izolácia vírusu z tohto materiálu; sérodiagnostika. Výber metódy laboratórna diagnostika v každom jednotlivom prípade závisí od povahy ochorenia, obdobia ochorenia a schopností laboratória. Moderná diagnostika vírusových infekcií je založený na expresných metódach, ktoré umožňujú získať odpoveď niekoľko hodín po prijatí klinického materiálu skoré dátumy po ochorení, Patrí sem elektrónová a imunitná elektrónová mikroskopia, ako aj imunofluorescencia, metóda molekulárnej hybridizácie, detekcia protilátok triedy lgM atď.

Elektrónová mikroskopia negatívne zafarbených vírusov umožňuje diferenciáciu vírusov a stanovenie ich koncentrácie. Použitie elektrónovej mikroskopie pri diagnostike vírusových infekcií je obmedzené na prípady, keď je koncentrácia vírusových častíc v klinickom materiáli dostatočne vysoká (10 5 v 1 ml a vyššie). Nevýhodou metódy je neschopnosť rozlíšiť vírusy patriace do rovnakej taxonomickej skupiny. Táto nevýhoda je eliminovaná použitím imunitnej elektrónovej mikroskopie. Metóda je založená na tvorbe imunitných komplexov, keď sa k vírusovým časticiam pridáva špecifické sérum, pričom dochádza k súčasnej koncentrácii vírusových častíc, čo umožňuje ich identifikáciu. Metóda sa používa aj na detekciu protilátok. Na účely expresnej diagnostiky sa vykonáva elektrónové mikroskopické vyšetrenie tkanivových extraktov, výkalov, tekutiny z vezikúl a sekrétov z nosohltanu. elektrónová mikroskopiaširoko používaný na štúdium morfogenézy vírusu, jeho schopnosti sa rozširujú s použitím značených protilátok.

Metóda molekulárnej hybridizácie, založená na detekcii vírusovo špecifických nukleových kyselín, umožňuje detegovať jednotlivé kópie génov a nemá z hľadiska citlivosti obdobu. Reakcia je založená na hybridizácii komplementárnych reťazcov DNA alebo RNA (sond) a tvorbe dvojvláknových štruktúr. Najlacnejšou sondou je klonovaná rekombinantná DNA. Sonda je označená rádioaktívnymi prekurzormi (zvyčajne rádioaktívnym fosforom). Sľubné je použitie kolorimetrických reakcií. Existuje niekoľko variantov molekulárnej hybridizácie: bodová hybridizácia, blotová hybridizácia, sendvičová hybridizácia, in situ hybridizácia atď.

Protilátky triedy lgM sa objavujú skôr ako protilátky triedy G (na 3. – 5. deň choroby) a po niekoľkých týždňoch miznú, takže ich detekcia naznačuje nedávnu infekciu. Protilátky triedy IgM sa detegujú imunofluorescenciou alebo enzýmovým imunotestom s použitím anti-μ antisér (séra anti-IgM ťažkého reťazca).

Sérologické metódy vo virológii sú založené na klasických imunologických reakciách (pozri Imunologické metódy výskumu) : reakcie fixácie komplementu, inhibícia hemaglutinácie, biologická neutralizácia, imunodifúzia, nepriama hemaglutinácia, radiálna hemolýza, imunofluorescencia, enzýmová imunoanalýza, rádioimunoanalýza. Boli vyvinuté mikrometódy pre mnohé reakcie a ich techniky sa neustále zdokonaľujú. Tieto metódy sa používajú na identifikáciu vírusov pomocou súboru známych sér a na sérodiagnostiku s cieľom určiť nárast protilátok v druhom sére v porovnaní s prvým (prvé sérum sa odoberá v prvých dňoch po ochorení, druhé - po 2-3 týždne). Diagnostická hodnota má najmenej štvornásobné zvýšenie protilátok v druhom sére. Ak detekcia protilátok triedy lgM naznačuje nedávnu infekciu, potom protilátky triedy lgC pretrvávajú niekoľko rokov a niekedy aj celý život.

Na identifikáciu jednotlivých antigénov vírusov a protilátok proti nim v komplexných zmesiach bez predchádzajúcej purifikácie proteínov sa používa imunoblotting. Metóda kombinuje proteínovú frakcionáciu pomocou elektroforézy na polyakrylamidovom géli s následným imunotestom proteínov pomocou enzýmového imunotestu. Separácia proteínov znižuje požiadavky na chemickú čistotu antigénu a umožňuje identifikovať jednotlivé páry antigén-protilátka. Táto úloha je relevantná napríklad pri sérodiagnostike infekcie HIV, kde sú falošne pozitívne reakcie enzýmovej imunoanalýzy spôsobené prítomnosťou protilátok proti bunkovým antigénom, ktoré sú prítomné v dôsledku nedostatočnej purifikácie vírusových proteínov. Identifikácia protilátok v sére pacientov na vnútorné a vonkajšie vírusové antigény umožňuje určiť štádium ochorenia a pri analýze populácií - variabilitu vírusových proteínov. Imunoblotting pri infekcii HIV sa používa ako potvrdzujúci test na detekciu jednotlivých vírusových antigénov a protilátok proti nim. Pri analýze populácií sa metóda používa na stanovenie variability vírusových proteínov. Veľká hodnota metódy spočíva v možnosti analyzovať antigény syntetizované pomocou technológie rekombinantnej DNA, stanoviť ich veľkosť a prítomnosť antigénnych determinantov.