Realizácia PCR analýzy (PCR diagnostika) začína odberom materiálu na vyšetrenie gynekológom, urológom alebo dermatovenerológom. Kvalita, spoľahlivosť následne získaných výsledkov je zabezpečená najvyššou kvalifikáciou a bohatými skúsenosťami lekárov Euromedprestige Medical Center, ktorí spĺňajú všetky potrebné pravidlá. PCR-analýza: úplná sterilita, používanie výhradne jednorazových materiálov.

Zozbieraný materiál z kefy sa umiestni do nádoby s fyziologickým roztokom. Po odbere vzoriek by sa vzorky mali čo najskôr doručiť do laboratória PCR.

PCR analýza v laboratóriu prebieha v troch fázach:

1. izolácia DNA
2. Amplifikácia fragmentov DNA
3. Detekcia produktov amplifikácie DNA

Extrakcia DNA je počiatočným štádiom diagnostiky PCR, ktorej podstata je nasledovná: lekár odoberie materiál na výskum od pacienta a podrobí ho špeciálnemu spracovaniu. Počas spracovania sa dvojitá špirála DNA rozdelí na samostatné vlákna. Do materiálu pacienta sa pridáva špeciálna kvapalina, ktorá rozpúšťa organické látky, ktoré narúšajú "čistotu" reakcie. Tým sa odstránia lipidy, aminokyseliny, peptidy, sacharidy, proteíny a polysacharidy. Výsledkom je DNA alebo RNA.

Princípom metódy PCR je „vybudovanie“ nových infekcií DNA alebo RNA. To sa nedá urobiť bez odstránenia bunkového materiálu.

Množstvo času stráveného extrakciou DNA závisí od pôvodcu infekcie a od typu materiálu použitého na testovanie PCR. Napríklad príprava krvi na ďalší krok trvá 1,5-2 hodiny.

0Pole ( => Analýzy) Pole ( => 2) Pole ( =>.html) 2

amplifikácia DNA

Na realizáciu ďalšej etapy DNA diagnostiky – amplifikácie DNA – používajú lekári takzvané DNA matrice – molekuly DNA infekcií, na ktorých následne dôjde k „klonovaniu“ DNA. Už bolo spomenuté, že nie je potrebná prítomnosť kompletnej DNA infekcie, pre toto štádium stačí malý kúsok molekuly DNA, ktorá je pre tento mikrób jedinečná (infekcia).

V srdci amplifikácie DNA, a teda aj v srdci celého princípu reakcie PCR, je prirodzený proces kompletizácie DNA pre všetky živé veci - replikácia DNA, ktorá sa uskutočňuje zdvojením jedného reťazca DNA.

Počnúc jedným fragmentom DNA, laboratórny lekár ho skopíruje a zvyšuje počet kópií v reťazovej reakcii: po prvom cykle máte už 2 fragmenty, po druhom cykle - 4, po treťom - 8, po štvrtom - 16, potom 32, 64, 128, 256... S každým cyklom sa počet kópií zdvojnásobuje a po dvadsiatich cykloch ide počet na milióny a po tridsiatich na miliardy. Cyklus trvá niekoľko minút a redukuje sa na určitú zmenu teplotného režimu vo veľmi malom chemickom reaktore. Tu sú v roztoku v dostatočnom množstve všetky potrebné zložky syntézy, predovšetkým nukleotidy A, G, T a C, a tiež sa vykonali jemné prípravné chemické operácie, takže z každej hotovej DNA sa okamžite vytvorila presná kópia. segment, potom z tejto kópie - opäť kópia, toto je rozvetvená reťazová reakcia.

Naviazaním primerov na reťazec DNA - umelo syntetizované "kúsky" DNA (nukleotidové páry) podobné DNA mikróbov (infekcia) - dva krátke, pozostávajúce z dvoch reťazcov úsekov DNA, vznikajú helixy, ktoré sú nevyhnutné pre syntézu budúcej DNA.

Syntéza nového reťazca nastáva dokončením každého z dvoch reťazcov DNA. K procesu amplifikácie dochádza pomocou špecifického miesta - DNA polymerázy, ktorá dala názov laboratórnej metóde. Polymeráza pôsobí ako katalyzátor reakcie a monitoruje sekvenčné pripojenie nukleotidových báz k rastúcemu novému vláknu DNA.

Amplifikácia DNA je teda viacnásobné zvýšenie počtu kópií DNA, ktoré sú špecifické, t. j. vlastné len určitému organizmu. Nie je potrebné dokončiť celý reťazec DNA, aby ste videli pôvodcu infekcie. Potrebná je len oblasť, ktorá je charakteristická pre túto baktériu ako jednotlivca.

5360 rubľov. Náklady na komplexný program s gastroenterológom

25% ZĽAVA NA PRÍJME KU KARDIOLOGOVI

- 25%primárny
Návšteva lekára
víkendový terapeut

5 160 rubľov. namiesto 5 420 rubľov. Vyšetrenie mužov na urologické infekcie

ALERGOLÓGIA 5 120 rubľov. namiesto 5 590 rubľov.

Všetky početne sa opakujúce kroky amplifikácie prebiehajú pri rôznych teplotách. Na PCR analýzu sa používa špeciálne programovateľné zariadenie - PCR - termostat alebo zosilňovač, ktorý automaticky mení teploty. Amplifikácia sa uskutočňuje podľa vopred určeného programu zodpovedajúceho typu detekovanej infekcie. V závislosti od programu a typu detekovanej infekcie trvá proces automatizovanej PCR 2 až 3 hodiny.

Dôležitú úlohu v diagnostike PCR zohráva kvalifikácia laboratórneho asistenta vykonávajúceho analýzu, od toho závisí správne nastavenie PCR zariadenia a interpretácia výsledkov. Lekári Euromedprestige Medical Center majú bohaté skúsenosti s vykonávaním DNA diagnostiky, čo zaisťuje spoľahlivosť výsledkov štúdie a zaručuje pozitívny úspech v liečbe. infekčné choroby. Vykonať testy a vykonať testy PCR kompletná diagnostika a liečbe infekčných chorôb u nás zdravotné stredisko Euromedprestige.

Počas detekcie produktov amplifikácie sa výsledná zmes produktov amplifikácie oddelí. Do zmesi sa pridávajú špeciálne roztoky, ktoré dodávajú fragmentom DNA schopnosť fluorescencie - odrážať oranžovo-červené svietiace pásiky. Výsledná žiara indikuje prítomnosť DNA vírusov, mikróbov alebo baktérií v materiáli odobratom pacientovi na analýzu PCR.

SEI HPE "Krasnojarská štátna lekárska akadémia

pomenovaný po Yasenetsky federálnej agentúre pre zdravie a sociálny rozvoj »

Ústav lekárskej genetiky a klinickej neurofyziológie, ÚPV

HLAVNÉ PRINCÍPY METÓDY

POLYMERÁZOVÁ REŤAZOVÁ REAKCIA

Toolkit pre študentov 3-4 kurzov

v odboroch všeobecné lekárstvo (060101) a

Krasnojarsk - 2007

Shnaider, N. A., Butyanov, R. A. Základné princípy metódy polymerázovej reťazovej reakcie. Metodická príručka pre mimoškolskú prácu študentov 3-4 odborov v odboroch všeobecné lekárstvo (060101) a pediatria (060103). - Krasnojarsk: Vydavateľstvo GOU VPO KrasGMA, 2007. - 42s.

Metodická príručka plne zodpovedá požiadavkám Štátnej normy (2000) a odráža hlavné aspekty moderná metóda diagnostika dedičné chorobyčlovek - metóda polymerázovej reťazovej reakcie, edukačný materiál je prispôsobený vzdelávacie technológie s prihliadnutím na špecifiká školenia v 3-4 kurzoch lekárskych a detských fakúlt.

Recenzenti: Vedúci Katedry lekárskej genetiky Štátneho vzdelávacieho ústavu vyššieho odborného vzdelávania

"Štátna lekárska univerzita v Novosibirsku Federálnej agentúry pre zdravie a sociálny vývoj“, doktor lekárskych vied, profesor;

replikácia DNA

Predmetom štúdia tejto metódy je deoxyribonukleová kyselina (DNA). DNA je univerzálnym nosičom genetickej informácie vo všetkých organizmoch existujúcich na Zemi (s výnimkou mikroorganizmov obsahujúcich RNA). DNA je dvojvlákno skrútené do špirály. Každé vlákno pozostáva z nukleotidov spojených do série. Reťazce DNA majú opačný smer: 5'-koniec jedného vlákna zodpovedá 3'-koncu druhého vlákna. Jedinečná nehnuteľnosť DNA je jej schopnosť duplikovať sa. Tento proces sa nazýva replikácie. K replikácii molekuly DNA dochádza počas syntetického obdobia interfázy. Každý z dvoch reťazcov „rodičovskej“ molekuly slúži ako šablóna pre „dcéru“. Po replikácii novo syntetizovaná molekula DNA obsahuje jeden "materský" reťazec a druhý - "dcéru", novo syntetizovaný (semikonzervatívna metóda). Pre syntéza matrice pre novú molekulu DNA treba starú molekulu despiralizovať a natiahnuť. Replikácia začína na niekoľkých miestach v molekule DNA. Úsek molekuly DNA od začiatku jednej replikácie po začiatok druhej sa nazýva replikón.

Aktivuje sa začiatok replikácie primery(semená), pozostávajúce zo 100-200 párov báz. Enzým DNA helikáza rozvinie a rozdelí materskú špirálu DNA na dve vlákna, na ktorých sa podľa princípu komplementarity za účasti enzýmu DNA polymerázy zostavia „dcérske“ vlákna DNA. Na to, aby enzým začal svoju prácu, je potrebná prítomnosť štartovacieho bloku – malého počiatočného dvojvláknového fragmentu. Štartovací blok sa vytvorí, keď primér interaguje s komplementárnou oblasťou zodpovedajúceho vlákna rodičovskej DNA. V každom replikóne sa DNA polymeráza môže pohybovať pozdĺž "materského" vlákna iba jedným smerom (5`=>3`).

Na vedúcom vlákne, ako sa replikón odvíja, postupne neustále rastie „dcérsky“ reťazec. Na zaostávajúcom vlákne sa dcérske vlákno tiež syntetizuje v smere (5`=>3`), ale v samostatných fragmentoch, keď sa replikón odvíja.

Pripojenie komplementárnych nukleotidov „dcérskych“ reťazcov teda ide v opačných smeroch (antiparalelné). Replikácia vo všetkých replikónoch prebieha súčasne. Fragmenty a časti "dcérskych" vlákien syntetizovaných v rôznych replikónoch sú ligované do jedného vlákna pomocou enzýmovej ligázy. Replikáciu charakterizuje polokonzervácia, antiparalelnosť a diskontinuita. Celý genóm bunky sa replikuje raz za časové obdobie zodpovedajúce jednému mitotickému cyklu. V dôsledku procesu replikácie sa z jednej molekuly DNA vytvoria dve molekuly DNA, z ktorých jeden reťazec je z materskej molekuly DNA a druhý, dcérska, sa novo syntetizuje (obr. 1).

Ryža. 1. Schéma replikácie molekuly DNA.

Replikačný cyklus DNA teda zahŕňa tri hlavné etapy:

1. odvíjanie špirály DNA a divergencia vlákien (denaturácia);

2. pripojenie primérov;

3. dokončenie reťaze detského vlákna.

Princíp metódy PCR

Práve replikácia DNA tvorila základ PCR. V PCR sa vyššie uvedené procesy vykonávajú v skúmavke v cyklickom režime. Prechod z jedného štádia reakcie do druhého sa dosiahne zmenou teploty inkubačnej zmesi. Keď sa roztok zahreje na 93-95 °C, dôjde k denaturácii DNA. Aby sa pristúpilo k ďalšiemu kroku - pridanie alebo "žíhanie" primerov - inkubačná zmes sa ochladí na 50-65 °C. Potom sa zmes zahreje na 70-72 °C - optimálna operácia taq-DNA polymerázy - v tomto štádiu je dokončený nový reťazec DNA. Potom sa cyklus znova opakuje. Inými slovami Metóda PCR je niekoľkonásobné zvýšenie počtu kópií (zosilnenie) špecifický úsek DNA katalyzovaný enzýmom DNA polymerázou.

Predĺženie reťazcov dcérskej DNA musí prebiehať súčasne na oboch reťazcoch materskej DNA, takže replikácia druhého reťazca tiež vyžaduje vlastný primér. Do reakčnej zmesi sa teda zavedú dva priméry: jeden pre "+"-reťazec, druhý pre "-"-reťazec. Po spojení opačných reťazcov molekuly DNA sa priméry obmedzia na tú jej časť, ktorá bude následne opakovane zdvojená alebo amplifikovaná. Dĺžka takéhoto fragmentu, ktorý sa nazýva amplikón, je zvyčajne niekoľko stoviek nukleotidov.

Kroky PCR

Každý amplifikačný cyklus zahŕňa 3 stupne prebiehajúce pri rôznych teplotných podmienkach (obr. 2).

· 1. fáza: denaturácia DNA . Tečie pri 93-95° po dobu 30-40 sekúnd.

· 2. fáza:žíhanie primérov . Pripojenie priméru prebieha komplementárne k zodpovedajúcim sekvenciám na opačných reťazcoch DNA na hraniciach špecifického miesta. Každý pár primerov má svoju vlastnú teplotu žíhania, ktorej hodnoty sú v rozmedzí 50-65°C. Doba žíhania 20-60 sekúnd.

· 3. fáza: Komplementárne predlžovanie reťazcov DNA nastáva od 5" konca po 3" koniec reťazca v opačných smeroch, počínajúc od miest pripojenia priméru. Materiálom na syntézu nových reťazcov DNA sú deoxyribonukleozidtrifosfáty pridané do roztoku. Proces syntézy je katalyzovaný enzýmom taq-polymeráza a prebieha pri teplote 70-72°C. Čas syntézy - 20-40 sekúnd.

Nové reťazce DNA vytvorené v prvom amplifikačnom cykle slúžia ako templáty pre druhý amplifikačný cyklus, v ktorom vzniká špecifický fragment amplikónovej DNA (obr. 3). V nasledujúcich amplifikačných cykloch slúžia amplikóny ako templát pre syntézu nových reťazcov.

V roztoku sa teda akumulujú amplikóny podľa vzorca 2", kde n je počet amplifikačných cyklov. Preto aj keď bola na začiatku v počiatočnom roztoku iba jedna molekula dvojvláknovej DNA, v roztoku sa nahromadí asi 108 molekúl amplikónu. 30-40 cyklov Toto množstvo je dostatočné na spoľahlivú vizuálnu detekciu tohto fragmentu elektroforézou na agarózovom géli.

Proces zosilnenia prebieha v špeciálnom programovateľnom termostate ( cyklovač), ktorý podľa daného programu automaticky mení teploty podľa počtu cyklov zosilnenia.

Na zosilnenie sú potrebné nasledujúce komponenty:

· DNA templát(DNA alebo jej časť obsahujúca požadovaný špecifický fragment);

· Priméry(syntetické oligonukleotidy (20-30 nukleotidových párov) komplementárne so sekvenciami DNA na hraniciach špecifického fragmentu, ktorý sa určuje). Výber špecifického fragmentu a výber primérov hrajú hlavnú úlohu v špecifickosti amplifikácie, ktorá ovplyvňuje kvalitu analýzy.

· Zmes deoxynukleotidových trifosfátov (dNTP)(zmes štyroch dNTP, ktoré sú materiálom na syntézu nových komplementárnych reťazcov DNA v ekvivalentných koncentráciách 200-500 mikrónov)

· EnzýmTaq-polymeráza(termostabilná DNA polymeráza, katalyzujúca predlžovanie reťazcov primérov postupným pridávaním nukleotidových báz k rastúcemu reťazcu syntetizovanej DNA, 2-3 mm).

· Tlmivého roztoku(reakčné médium obsahujúce ióny Mg2+ potrebné na udržanie aktivity enzýmu, PH 6,8-7,8).

Na určenie špecifických oblastí genómu RNA vírusov sa najprv získa kópia DNA z templátu RNA pomocou reakcie reverznej transkripcie (RT) katalyzovanej enzýmom reverzná transkriptáza (reverzná transkriptáza).

Ryža. 2. Amplifikácia (1. cyklus).

Ryža. 3. Amplifikácia (2. cyklus).

Hlavné aplikácie PCR

klinická medicína:

o diagnostiku infekcií,

o detekciu mutácií vrátane diagnostiky dedičných chorôb,

o genotypizácia vrátane genotypizácie HLA,

o bunkové technológie

ekológia (ako spôsob sledovania stavu a kvality objektov životného prostredia a potravín)

definícia transgénnych organizmov (GMO)

Identifikácia, otcovstvo, forenzná

všeobecná a osobitná biológia,

Základné princípy

organizácia diagnostických laboratórií

Práca v laboratóriu PCR sa vykonáva v súlade s „Pravidlami pre projektovanie, bezpečnosť, priemyselnú sanitáciu, protiepidemický režim a osobnú hygienu pri práci v laboratóriách (oddelenia, oddelenia) hygienicko-epidemiologických ústavov zdravotníctva.

Kontaminácia vzoriek DNA

Vykonávanie diagnostiky PCR je spojené s problémom spôsobeným vysokou citlivosťou metódy - možnosťou kontaminácia. Ak sa do reakčnej skúmavky dostanú stopové množstvá pozitívnej DNA (špecifické produkty amplifikácie DNA - amplikóny; štandard DNA použitý ako pozitívna kontrola; pozitívna DNA klinickej vzorky), vedie to počas PCR k amplifikácii špecifického fragmentu DNA a v dôsledku toho k objavenie sa falošne pozitívnych výsledkov.

V priebehu práce sa môžete stretnúť dva druhy znečistenia:

1. krížová kontaminácia od vzorky k vzorke (počas spracovania klinických vzoriek alebo pri vykopávaní reakčnej zmesi), čo vedie k objaveniu sa sporadických falošne pozitívnych výsledkov;

2. kontaminácia amplifikačným produktom(amplikony) majúci najvyššia hodnota, pretože počas procesu PCR sa amplikóny hromadia v obrovských množstvách a sú ideálnymi produktmi na reamplifikáciu.

Kontaminácia misiek, automatických pipiet a laboratórnych zariadení stopovými amplikónmi, povrchu laboratórnych stolov, či dokonca povrchu kože laboratórnych pracovníkov vedie k objaveniu sa systematických falošne pozitívnych výsledkov. Určenie zdroja kontaminácie môže byť veľmi ťažké a vyžaduje značné investície času a peňazí. Doterajšie skúsenosti z práce laboratórií s použitím metódy PCR na diagnostiku nám umožňujú formulovať základné požiadavky na organizáciu takýchto laboratórií a vykonávanie samotných analýz. Dodržiavanie týchto požiadaviek eliminuje možnosť kontaminácie a získania falošne pozitívnych výsledkov.

Etapy PCR analýzy

Geograficky oddelené, ich umiestnenie do samostatných miestností (obr. 4.5):

· Pred-PCR miestnosť, kde sa vykonáva spracovanie klinických vzoriek, extrakcia DNA, príprava reakčnej zmesi na PCR a PCR (ak sú k dispozícii podmienky, posledné dva kroky sa tiež odporúča vykonať v ďalšej samostatnej miestnosti). V týchto miestnostiach je zakázané vykonávať všetky ostatné druhy práce so študovanými látkami, ktorých PCR diagnostika sa vykonáva v tomto laboratóriu.

· Post-PCR miestnosť, kde sa vykonáva detekcia amplifikačných produktov. V tejto miestnosti je možné použiť iné metódy detekcie. Je žiaduce umiestniť miestnosť na detekciu amplifikačných produktov čo najďalej od miestností pred PCR.

Pracovné miestnosti sú vybavené ultrafialovými lampami s maximálnym vyžarovaním v oblasti 260 nm (typ DB-60) s výkonom 2,5 W na 1 m3. Lampy sú umiestnené tak, aby povrchy pracovných stolov, zariadení a materiálov, s ktorými operátor prichádza do kontaktu počas PCR analýzy, boli vystavené priamemu žiareniu. Ožarovanie sa vykonáva do 1 hodiny pred začiatkom práce a do 1 hodiny po ukončení práce.

Laboratórni lekári pracujú v špeciálnom laboratórnom oblečení, ktoré sa mení pri prechode z jednej miestnosti do druhej, a v jednorazových rukaviciach. Spracovanie odevov z rôznych miestností sa vykonáva oddelene. Rôzni zamestnanci pracujú v rôznych fázach analýzy PCR.

Na prácu sa používajú samostatné súpravy dávkovačov, plastového a skleneného riadu, laboratórneho vybavenia, plášťov a rukavíc, ktoré sú určené na rôzne stupne analýzy a nie sú prenosné z jednej miestnosti do druhej. Vybavenie, materiály a inventár v každej miestnosti sú zodpovedajúcim spôsobom označené.

Všetky fázy práce sa vykonávajú iba s použitím jednorazového spotrebného materiálu: špičky pre automatické pipety, skúmavky, rukavice atď. Pri prechode zo vzorky na vzorku nezabudnite vymeniť špičky. Je potrebné použiť špičky s aerosólovým bariérovým filtrom, aby sa zabránilo vniknutiu mikrokvapiek roztoku do pipety. Použité skúmavky a hroty sa vyhodia do špeciálnych nádob alebo nádob obsahujúcich dezinfekčný roztok. Klinické vzorky sa uchovávajú oddelene od činidiel.

Na spracovanie a čistenie pracoviska má každá miestnosť vatové tampóny (obrúsky), pinzetu, dezinfekčné a inaktivačné roztoky.

V PCR diagnostickom laboratóriu sú vylúčené práce súvisiace s produkciou (klonovaním) a izoláciou rekombinantných plazmidov obsahujúcich sekvencie DNA alebo génové fragmenty patogénov, ktoré sú diagnostikované v tomto laboratóriu.

Zber klinického materiálu

Študovaným materiálom pre PCR môžu byť zoškraby epitelových buniek, krv, plazma, sérum, pleurálna a cerebrospinálna tekutina, moč, spútum, hlien a iné biologické sekréty, bioptické vzorky.

Odber vzoriek materiálu sa vykonáva v podmienkach upravovacej miestnosti zodpovedajúceho profilu. Po odbere vzoriek by sa vzorky mali čo najskôr odniesť do diagnostického laboratória PCR.

Odber vzoriek sa musí vykonávať pomocou sterilných, pokiaľ možno jednorazových, nástrojov iba v jednorazových sterilných plastových skúmavkách alebo sklenených skúmavkách, vopred ošetrených zmesou chrómu, dôkladne umytých destilovanou vodou a kalcinovaných v peci pri teplote 150 °C na 1 hodinu.

Detekčná zóna (iné poschodie alebo iná budova).

Ryža. 4. Laboratórny prístroj PCR s detekciou elektroforézou.

Detekčná zóna (iné poschodie alebo budova)

Ryža. 5. Laboratórny prístroj PCR s fluorescenčnou detekciou (kvantitatívna analýza).

Ryža. 6. Miestnosť na extrakciu DNA. Zobrazený je stolový box s baktericídnou lampou.

Ryža. 7. zosilňovacia miestnosť.

Ryža. 8. Detekčná miestnosť.

Ryža. 9. Vzorky krvi na DNA diagnostiku dedičných chorôb.

Skladovanie a preprava vzoriek

Pre diagnostiku dedičných chorôb sa vzorky krvi dlhodobo uchovávajú na špeciálnych papierových formách alebo v epindorfoch (plastových skúmavkách) v zmrazenom stave (obr. 9).

Na diagnostiku infekčných chorôb sa vzorky uchovávajú pri izbovej teplote nie dlhšie ako 2 hodiny. V prípade potreby dlhšieho skladovania je možné vzorky umiestniť do chladničky pri teplote 2-8°C na dobu nepresahujúcu 24 hodín. Dlhšie skladovanie (do 2 týždňov) je prijateľné pri zmrazení v mrazničke pri teplote mínus 20°C. Opakované zmrazovanie a rozmrazovanie vzoriek nie je povolené.

Ak sú diagnostické laboratórium PCR a miestnosť na odber vzoriek územne oddelené, potom by sa vzorky mali prepravovať v termoskách alebo termonádobách v súlade s pravidlami skladovania vzoriek a pravidlami pre prepravu infekčných materiálov.

Extrakcia DNA zo vzoriek

Rozmohla sa metóda sorpcie na pevnej fáze, ktorá spočíva v pridaní lyzačného činidla s obsahom roztoku guanidínu, sorpcii DNA na sorbent, opakovanom premývaní a resorpcii DNA tlmivým roztokom. V prípade spracovania séra, plazmy alebo plnej krvi sa zvyčajne používa metóda fenolovej extrakcie. Spôsob zahŕňa deproteinizáciu fenolom/chloroformom, po ktorej nasleduje precipitácia DNA (alebo RNA) etanolom alebo izopropanolom. Spracovanie prebieha v mikrocentrifugačných skúmavkách typu Eppendor P s objemom 1,5 ml. Doba spracovania je 1,5-2 hodiny (obr. 10).

Ryža. 10. Izolácia DNA.

Vedenie PCR

Určité množstvo vzorky zo spracovanej klinickej vzorky sa prenesie do špeciálnej mikrocentrifugačnej skúmavky typu Eppendorf s objemom 0,2 alebo 0,5 ml. Taq-polymeráza (pridaná ako posledná do zmesi) Typicky je objem reakčnej zmesi 25 µl Potom sa do každej skúmavky pridá jedna kvapka minerálneho oleja, aby sa zabránilo vyparovaniu reakčnej zmesi počas amplifikácie. Skúmavky sa prenesú do programovateľný termostat (zosilňovač), kde zosilnenie prebieha v automatickom režime podľa daného programu (obr. 11).

Ryža. jedenásť. Zosilňovač" Termocykler ».

Reakčná doba v závislosti od daného programu je 2-3 hodiny. Paralelne s experimentálnymi vzorkami sa umiestnia kontrolné vzorky: pozitívna kontrola zahŕňa všetky zložky reakcie, ale namiesto materiálu klinickej vzorky sa zavedie kontrolný preparát DNA skúmaného génu. Negatívna kontrola zahŕňa všetky zložky reakcie, ale namiesto klinického materiálu alebo preparátu DNA sa pridáva primerané množstvo deionizovanej vody alebo extraktu, ktorý neobsahuje študovanú DNA. Negatívna kontrola je potrebná na kontrolu zložiek reakcie na neprítomnosť DNA v dôsledku kontaminácie a na vylúčenie falošne pozitívnych výsledkov.

Registrácia výsledkov

Amplifikovaný špecifický fragment DNA sa deteguje elektroforézou na agarózovom géli v prítomnosti etídiumbromidu. Etídiumbromid tvorí stabilnú intersticiálnu zlúčeninu s fragmentmi DNA, ktorá sa po ožiarení gélu UV žiarením s vlnovou dĺžkou 290-330 nm javí ako svietiace pásy. V závislosti od veľkosti výsledných PCR amplikónov sa použije gél obsahujúci 1,5 % až 2,5 % agarózy. Na prípravu agarózového gélu sa zmes agarózy, pufra a vody roztopí v mikrovlnnej rúre alebo vo vodnom kúpeli a pridá sa roztok etídiumbromidu. Ochladená na 50-60°C sa zmes naleje do formy s hrúbkou 4-6 mm a pomocou špeciálnych hrebeňov sa do gélu vyrobia vrecká na nanášanie vzorky. Hrebene sú nastavené tak, aby medzi dnom jamiek a základňou gélu zostala vrstva agarózy 0,5-1 mm. Po stuhnutí gélu sa do vreciek aplikuje amplifikát v množstve 5-15 ul. Odporúča sa vykonať elektroforézu zmesi markerov dĺžky fragmentov DNA paralelne s kontrolnými a experimentálnymi vzorkami. Typicky takáto zmes obsahuje desať fragmentov DNA s dĺžkou 100, 200, 300 atď.

Nastavenie takejto vzorky umožňuje overiť dĺžku amplikónov v kontrolných a experimentálnych vzorkách. Gél s nanesenou vzorkou sa prenesie do elektroforetickej komory naplnenej tlmivým roztokom, komora sa pripojí k zdroju energie a elektroforetická separácia produktov amplifikácie sa vykonáva 30-45 minút pri sile elektrického poľa 10-15 V/cm. V tomto prípade musí predná strana farbiva, ktorá je súčasťou reakčnej zmesi, prejsť aspoň 3 cm.

Po skončení elektroforézy sa gél prenesie na sklo transiluminátora a pozoruje sa v ultrafialovom svetle. Pre dokumentáciu je gél odfotografovaný na film Mikrat 300 alebo zaznamenaný pomocou videosystému pripojeného k počítaču.

Najskôr sa vyhodnotia kontrolné vzorky. V elektroforetickej dráhe zodpovedajúcej pozitívnej kontrole by mal byť prítomný oranžový svetelný pás. Jeho elektroforetická pohyblivosť by mala zodpovedať dĺžke amplikónu uvedenej v návode.

V elektroforetickej stope zodpovedajúcej negatívnej kontrole by takýto pás nemal chýbať. Prítomnosť takéhoto pásu v negatívnej kontrole indikuje kontamináciu – kontamináciu použitých činidiel študovanou DNA alebo amplikónom. Testované vzorky sa hodnotia podľa prítomnosti pruhu v príslušnom pruhu, ktorý je umiestnený na rovnakej úrovni ako pruh v pozitívnej kontrolnej vzorke. Intenzita žiary pásu zodpovedá množstvu skúmanej DNA vo vzorke, čo umožňuje semikvantitatívne hodnotenie PCR. Pozitívne výsledky sa zvyčajne hodnotia na štvorbodovej stupnici. Ak je žiara pásu v experimentálnej vzorke veľmi slabá, potom by sa takáto vzorka mala preusporiadať (obr. 12).

Ryža. 12. Elektroforéza v agarózovom géli.

PCR aplikácie prediagnostika bodových mutácií a génových polymorfizmov

Jednou z popredných oblastí aplikácie PCR v praktickom zdravotníctve je diagnostika bodových mutácií a génových polymorfizmov. . Existujú priame a nepriame metódy diagnostiky DNA. V tých situáciách, keď je známy gén, ktorého poškodenie vedie k rozvoju dedičného ochorenia, možno toto poškodenie zistiť molekulárno-genetickými metódami. Takéto metódy sa nazývajú priame. Pomocou priamych metód sa zisťujú poruchy v primárnej nukleotidovej sekvencii DNA (mutácie a ich typy). Priame metódy sa vyznačujú presnosťou dosahujúcou takmer 100 %.

V praxi je však možné tieto metódy za určitých podmienok aplikovať.:

so známou cytogenetickou lokalizáciou génu zodpovedného za vývoj dedičného ochorenia;

Gén choroby musí byť klonovaný a musí byť známa jeho nukleotidová sekvencia.

Cieľom priamej DNA diagnostiky je identifikovať mutantné alely.

V situáciách, keď je známe, aký druh poškodenia DNA vedie k dedičnému ochoreniu, sa fragment DNA obsahujúci poškodenie skúma priamo, t. j. použije sa priama metóda diagnostiky DNA.

Doteraz však neboli zmapované gény mnohých chorôb, ich organizácia exón-intrón je neznáma a mnohé dedičné choroby charakterizovaná výraznou genetickou heterogenitou, ktorá neumožňuje plné využitie priamych metód diagnostiky DNA. Preto v prípadoch, keď nie je známa lokalizácia poškodenia, sa používa iný prístup spojený so štúdiom blízkosti génu zodpovedného za génové ochorenie v kombinácii s rodinnou analýzou, teda nepriamymi metódami molekulárno-genetickej diagnostiky. sa používajú dedičné choroby.

Môže sa použiť na detekciu bodových mutácií a malých delécií rôznymi spôsobmi všetky sú však založené na použití metódy PCR. Táto reakcia vám umožňuje opakovane množiť nukleotidovú sekvenciu DNA a potom hľadať mutácie. Metódy hľadania fragmentov DNA nesúcich mutácie sú založené na komparatívna analýza mutantné a normálne nukleotidové sekvencie DNA.

Analýza produktov PCR

v procese priamej DNA diagnostiky

Zahŕňa štúdium špecifických znakov amplifikovanej oblasti génu. Pri ochoreniach spôsobených expanziou trinukleotidových repetícií sa teda produkty amplifikácie líšia svojou dĺžkou (odrážajú rôzny počet tripletov v oblasti študovaného génu) a v dôsledku toho aj rýchlosťou pohybu v géli. Vďaka tomu sa dosiahne jasná elektroforetická separácia normálnych a mutantných alel a presné určenie patologicky predĺženého fragmentu, teda DNA diagnostika ochorenia (obr. 13).

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width="417" height="110 src=">

Ryža. 14. Diagnóza vymazania GAG v géne DYT 1 u pacientov s dystóniou nezávislou od dopa (polyakrylamidová gélová elektroforéza). Skladby 2,3,6 - choré; pruhy 1,4,5 - kontrola. Tenká šípka označuje normálnu alelu, hrubá šípka označuje mutantnú kratšiu alelu (delécia troch nukleotidov).

Ak je študovaná oblasť DNA úplne zahrnutá do rozšírenej delécie, potom sa PCR amplifikácia DNA z tejto deletovanej alely neuskutoční kvôli nedostatku miest na hybridizáciu primérov. V tomto prípade bude homozygotná delécia diagnostikovaná na základe úplnej absencie PCR produktu reakcie (syntéza DNA nie je možná z oboch kópií génu). Pri heterozygotnej delécii je možné detekovať PCR produkt syntetizovaný z normálnej (bezpečnej) alely, avšak pre spoľahlivú diagnostiku takejto mutácie je potrebné použiť sofistikovanejšie metódy vizualizácie DNA, ktoré umožňujú odhadnúť dávku výslednej PCR produkt.

Na detekciu bodových mutácií (najčastejšie nukleotidových substitúcií) na určitých miestach sa používa metóda PCR v kombinácii s inými metódami molekulárnej genetickej analýzy. Ak je miesto a povaha navrhovanej bodovej mutácie presne známe, potom pre účelné zistenie takejto mutácie reštrikčné endonukleázy (obmedzenia) sú špeciálne bunkové enzýmy izolované z rôznych kmeňov baktérií.

Tieto enzýmy rozpoznávajú špecifické nukleotidové sekvencie s dĺžkou od štyroch do desiatich nukleotidov. Potom uskutočnia reštrikciu (lat. (strihanie) týchto sekvencií ako súčasť dvojvláknovej molekuly DNA. Každý reštrikčný enzým rozpoznáva a štiepi na pevnom mieste presne definovanú, špecifickú nukleotidovú sekvenciu - reštrikčné miesto (miesto rozpoznania).

V prípadoch, keď bodová mutácia zmení prirodzené miesto rozpoznávania pre konkrétny reštrikčný enzým, tento enzým nebude schopný štiepiť mutantný fragment amplifikovaný PCR. V niektorých prípadoch vedie mutácia k objaveniu sa nového rozpoznávacieho miesta pre konkrétny reštrikčný enzým, ktorý v norme chýba.

V oboch situáciách mutantný a normálny PCR produkt ošetrený vybraným reštrikčným enzýmom poskytne reštrikčné fragmenty rôznych dĺžok, ktoré možno ľahko detegovať elektroforézou (obr. 15).

Ak je teda potrebné rýchlo detegovať akúkoľvek konkrétnu bodovú mutáciu, úloha sa zredukuje na hľadanie zodpovedajúceho reštrikčného enzýmu, ktorého rozpoznávacie miesto je lokalizované v mieste narušenej nukleotidovej sekvencie. Ošetrenie produktov PCR týmto reštrikčným enzýmom umožní ľahkú diferenciáciu normálnych a mutantných alel. Reštrikčná analýza výrazne zjednodušuje detekciu známych bodových mutácií a v súčasnosti je široko používaná na priamu DNA diagnostiku dedičných chorôb.

záverečná fáza molekulárno-genetická analýza mutácií je stanovenie nukleotidovej sekvencie študovaného fragmentu DNA (sekvenovanie), ktorá sa porovná s normou a sformuluje sa konečná genetická diagnóza. Vďaka pokroku v molekulárnej genetike boli v súčasnosti vyvinuté metódy diagnostiky DNA pre viac ako 400 dedičných chorôb.

Ryža. 15. Detekcia bodovej mutácie pomocou reštrikčnej analýzy: A - amplifikovateľná oblasť génu obsahujúca reštrikčné miestoAGCTpre reštrikčnú endonukleázuAlu ja. MutáciaG→ Amení túto nukleotidovú sekvenciu, čo vedie k vzniku reštrikčného enzýmuAluizablokované; B - elektroferogram reštrikčných produktov: dráha 1 - homozygotnosť pre normálnu alelu; dráha 2, homozygotnosť pre mutáciu; dráha 3 - heterozygotný stav (normálna alela + mutácia).

Diagnostika dedičných ochorení založená na priamom vyšetrení mutantných alel u pacientov, ich rodinných príslušníkov alebo predpokladaných heterozygotných nosičov patologických mutácií je vhodná na presymptomatickú a prenatálnu diagnostiku, ktorú možno aplikovať už v najskorších štádiách vývoja plodu, ešte pred objavením sa akékoľvek klinické alebo biochemické symptómy.choroba.

Bez ohľadu na metódu detekcie mutácií je možné presnú molekulárnu charakterizáciu každej mutácie získať iba priamym sekvenovaním. Na automatizáciu tohto procesu sa v posledných rokoch vo veľkej miere využívajú špeciálne zariadenia – sekvenátory, ktoré umožňujú výrazne urýchliť proces čítania informácií o DNA.

Cesta k širšej aplikácii molekulárno-biologického výskumu v klinicko-diagnostických laboratóriách sa otvára zrýchlením analytického procesu vykonávaním všetkých postupov v jednom kontinuu, bez prenosu vzorky, vytvorením podmienok pre zamedzenie kontaminácie pri paralelnom testovaní množstva analytov a s objektívnou registráciou. výsledkov v každom cykle.

Hlavné modifikácie metódy PCR

Používa sa na rýchle skenovanie a vyhľadávanie známych génových mutácií.

Multiplexná (multiprimérová) PCR

Táto metóda je založená na súčasnej amplifikácii niekoľkých exónov študovaného génu v jednej reakcii. To umožňuje ekonomický rýchly skríning najčastejších mutácií. Napríklad na rýchlu diagnostiku prenosu delécií v géne pre dystrofín u pacientov s progresívnou svalovou dystrofiou Duchenne/Becker sa vykonáva súčasná amplifikácia súboru najčastejšie mutujúcich exónov tohto génu. Keďže tieto choroby sa dedia v X-viazanom recesívnom type a sú spojené s poškodením jediného chromozómu X u chlapcov, v prípade rozšírenej delécie elektroforéza reakčných produktov odhalí neprítomnosť jedného alebo viacerých fragmentov DNA (exónov ), čo môže slúžiť ako molekulárne potvrdenie diagnózy. Okrem toho výberom špecifických génových oblastí pre PCR amplifikáciu je možné pomerne presné posúdenie celkovej dĺžky delécie a bodov zlomu génu (až po exón).

Kombinované použitie niekoľkých multiplexných reakcií umožňuje diagnostikovať až 98 % všetkých delécií, ktoré sa vyskytujú u pacientov s progresívnou Duchennovou/Beckerovou svalovou dystrofiou. Je to približne 60 % z celkového počtu známych mutácií v géne pre dystrofín a svedčí to o veľmi vysokej účinnosti tejto skríningovej metódy na DNA diagnostiku dystrofinopatie (obr. 16).

Ryža. 16. Priama DNA diagnostika Duchennovej svalovej dystrofie pomocou multiplexnej PCR (elektroforéza na agarózovom géli). U každého zo skúmaných jedincov boli súčasne amplifikované štyri exóny dystrofínového génu (exóny 17, 19, 44 a 45; šípky označujú zodpovedajúce amplifikačné produkty). Dráha 1 - kontrola, dráhy 2-5 - pacienti s Duchennovou svalovou dystrofiou s rôznymi deléciami génu pre dystrofín (dráhy 2 a 5 - delécia exónu 45, dráha 3 - delécia exónu 44, dráha 4 - delécia exónu 17 a 19 ).

Alelovo špecifická amplifikácia

Metóda je založená na použití dvoch nezávislých párov primérov pre špecifickú oblasť génu: jeden primér v oboch pároch je spoločný a druhý primér v každom páre má odlišnú štruktúru a je komplementárny k normálnej alebo mutantnej DNA. sekvencie. V dôsledku takejto reakcie v roztoku môžu byť súčasne syntetizované dva typy produktov PCR - normálne a mutantné. Okrem toho dizajn použitých primérov umožňuje jasne odlíšiť normálne a mutantné amplifikačné produkty podľa ich molekulovej veľkosti. Táto metóda je veľmi jasná a umožňuje overiť homo- aj heterozygotné prenášanie mutantnej alely.

Spôsob miestne cielenej modifikácie amplifikovanej DNA

Metóda je založená na použití v PCR takzvaného mismatch primeru (nie plne komplementárneho s templátom), ktorý sa líši od templátovej DNA sekvencie o jeden nukleotid. V dôsledku zahrnutia špecifikovaného priméru do zloženia mutantného produktu PCR sa v ňom vytvorí umelo vytvorené reštrikčné miesto pre jednu z restrikčných endonukleáz, čo umožňuje priamu DNA diagnostiku určitej známej mutácie pomocou reštrikčnej analýzy. Vytvorenie takéhoto umelého reštrikčného miesta môže byť nevyhnutné, ak vyhľadávanie neodhalilo existenciu známeho a dostupného enzýmu, ktorého „prirodzené“ reštrikčné miesto je ovplyvnené v dôsledku objavenia sa študovanej mutácie v molekule DNA. .

Metóda PCR s reverznou transkriptázou (RT- PCR)

Táto metóda sa používa v prípadoch, keď je vhodnejšie použiť ako predmet štúdia nie genómovú DNA, ale kompaktnejšiu a informačne bohatšiu cDNA získanú po vhodnom spracovaní vzoriek tkaniva, ako je bioptický materiál alebo bunkové línie lymfocytov, fibroblastov atď. Dôležitou podmienkou je tu expresia (aspoň minimálna) požadovaného génu v skúmanom tkanive.

V prvom štádiu sa uskutoční reverzná transkripcia mRNA a výsledné molekuly cDNA slúžia ako templát pre PCR. Následne je kritická cDNA oblasť amplifikovaná v dostatočnom množstve podrobená sekvenovaniu a iným metódam skríningu mutácií, priamej elektroforetickej štúdii (detekcia delécií, inzercií atď.) alebo integrácii do expresného systému za účelom získania proteínového produktu a jeho priamej analýzy. .

Táto metóda je obzvlášť účinná pri detekcii mutácií vedúcich k syntéze „skráteného“ proteínu (nezmyselné mutácie, zostrihové mutácie, veľké delécie) – tzv. PTT analýza (Protein Truncation Test). Analýza PTT sa bežne používa pri skúmaní rozšírených multiexónových génov, ako je gén pre Duchenne/Beckerovu svalovú dystrofiu, ataxiu-telangiektáziu alebo neurofibromatózu typu 1.

PCR v reálnom čase(PCR v reálnom čase)

Každoročne sa v praktickom zdravotníctve stáva real-time PCR čoraz populárnejšou diagnostickou metódou. Jeho základnou črtou je sledovanie a kvantitatívna analýza akumulácie produktov polymerázovej reťazovej reakcie a automatická registrácia a interpretácia výsledkov. Táto metóda nevyžaduje krok elektroforézy, čo znižuje požiadavky na laboratórium PCR. Vďaka úspore výrobných priestorov, zníženiu počtu personálu a náročnosti na kvantifikáciu DNA/RNA sa táto metóda v posledných rokoch úspešne využíva v najväčších sanitárnych epidemických, diagnostických a výskumných centrách vo vyspelých krajinách sveta, nahradenie PCR v jej súčasnom („klasickom“) formáte.

PCR v reálnom čase využíva fluorescenčne značené oligonukleotidové sondy na detekciu DNA počas amplifikácie. Real-time PCR umožňuje kompletnú analýzu vzorky v priebehu 20-60 minút a je teoreticky schopná detegovať aj jednu molekulu DNA alebo RNA vo vzorke.

Ryža. 17. PCR v reálnom čase.

PCR v reálnom čase využíva systém TaqMan na riadenie kinetiky PCR priamo počas amplifikácie pomocou rezonančného zhášania fluorescencie. Na detekciu sa používa sonda nesúca fluorofór a zhášač komplementárny k strednej časti amplifikovaného fragmentu. Keď sa fluorofór a zhášač naviažu na oligonukleotidovú sondu, pozoruje sa len malé množstvo fluorescenčnej emisie. Počas amplifikačného procesu v dôsledku 5'-exonukleázovej aktivity Taq polymerázy prechádza fluorescenčná značka do roztoku, pričom sa uvoľňuje z blízkosti zhášača a vytvára fluorescenčný signál, ktorý sa zvyšuje v reálnom čase úmerne k akumulácii amplifikovať (obr. 17).

Hlavné výhody PCR-Real-Time oproti PCR s gélovou elektroforézou:

Celá metóda prebieha v jednej skúmavke;

· Metóda trvá 1 hodinu;

Dostatok 1-2 pracovných miestností;

Spolu s kvalitatívnym hodnotením výsledku je možné ho kvantifikovať (napríklad pri predpisovaní antivírusovej liečby AIDS alebo vírusovej hepatitídy je potrebné poznať vírusovú záťaž, t.j. množstvo vírusu na 1 jednotku, čo poskytuje skutočnú -časová PCR);

· Dramaticky znižuje riziko kontaminácie.

Záver

Metóda PCR je jednou z najbežnejších metód molekulárno-biologického výskumu. Túto metódu by mali lekári využívať zmysluplne a lekár, ktorý sa rozhodne pri svojej práci použiť PCR, musí mať určité znalosti o vlastnostiach a možnostiach tejto metódy. Po druhé, medzi klinickým lekárom a laboratóriom PCR musí existovať úzka spätná väzba, ktorá je potrebná na analýzu zložitých prípadov a vývoj správnej diagnostickej stratégie. Po tretie, analýza PCR nie je všeliekom v diagnostike (predovšetkým infekčných chorôb) a nenahrádza existujúce metódy výskumu, ale iba ich dopĺňa. A čo je najdôležitejšie, PCR nemôže nahradiť intuíciu a analytické myslenie, ktoré by mal mať lekár, ktorý očakáva úspech.

P . S . Molekulárno-biologické výskumy - zmena referenčných bodov diagnostiky a liečby. Využitie molekulárno-biologických metód je spojené s perspektívou radikálnej zmeny dôrazu v laboratórnej diagnostike. Môžeme hovoriť nielen o včasných informáciách, ale aj o ich predstihu. Ak sa teraz laboratórne štúdie vo väčšine prípadov vykonávajú už pri pokročilom ochorení a nasadení liečby, potom sa očakáva, že molekulárne biologické laboratórne informácie umožnia identifikovať inklináciu človeka k určitým typom patológie a stupeň citlivosti na určité lieky, ktoré umožní podložiť prediktívny, preventívny a personalizovaný charakter medicíny budúcnosti.

ZMENA DIAGNOSTIKY A ZAMERANIA LIEČBY

DEDIČNÉ CHOROBY

Dnes V budúcnosti

Diagnóza Genetický pas

8. Koľko pracovných miestností je potrebných pre laboratórium PCR s fluorescenčnou detekciou (kvantitatívna analýza, Real-Time PCR)?

9. Čo je detekcia?

10. Aké metódy diagnostiky DNA rozlišujeme?

11. Ktorý enzým funguje na báze PCR?

12. Prečo musí byť detekčná zóna oddelená od ostatných pracovných zón?

13. Čo je to obmedzujúce miesto?

14. Aký je rozdiel medzi priamou metódou diagnostiky DNA a nepriamou?

15. Čo je sekvenovanie?

16. Čo je to multiplexná PCR?

17. Aké typy mutácií sa určujú pomocou PCR?

18. Čo je kontaminácia?

19. Čo je podstatou alelovo špecifickej amplifikačnej metódy?

20. Podmienky skladovania materiálu PCR?

21. Aké zariadenie sa používa na zosilnenie?

22. Aká je metóda PCR s reverznou transkriptázou (RT-PCR)?

23. Aký je materiál na diagnostiku PCR?

24. Uveďte typy kontaminácie?

Testy na samoštúdium

1. Reštrikčné endonukleázy:

a) enzýmy, ktoré „rozbíjajú“ DNA na presne špecifických miestach;

b) enzýmy, ktoré vytvárajú zlomy v molekule DNA;

c) enzýmy, ktoré poskytujú zlúčeniny, ktoré vykonávajú opravu DNA.

2. Génová amplifikácia:

3. Ktorá z metód molekulárnej genetiky sa používa na diagnostiku chorôb spôsobených mutantným génom známej sekvencie?

a) použitie špecifickej restriktázy;

b) priama detekcia pomocou špecifických molekulárnych sond;

V) rodinná analýza distribúcia normálneho polymorfizmu dĺžky restrikčných fragmentov.

4. Sekvenovanie DNA:

a) identifikácia sekvencie báz DNA;

b) opakované opakovanie akéhokoľvek segmentu DNA;

c) izolácia fragmentu DNA obsahujúceho študovaný gén.

5. Vzorky DNA možno získať pomocou :

b) choriové klky;

c) plodová voda;

d) bunky plodovej vody;

e) biopsie kože, svalov, pečene,

e) všetko je správne, okrem bodu „c“,

g) všetko je správne, okrem bodu "d",

h) Všetky vyššie uvedené sú správne.

6. Ktoré mutácie sú diagnostikované pomocou PCR?

a) genomický;

b) chromozomálne;

c) gén (bod).

7. Primer je:

a) komplementárna časť DNA;

b) syntetická oligonukleotidom značená (rádioaktívne alebo fluorescenčne) sekvencia komplementárna k mutantnému alebo normálnemu génu;

c) oligonukleotid pôsobiaci ako "zárodok" a iniciujúci syntézu polynukleotidového reťazca na templáte DNA alebo RNA.

8. Kto vyvinul princíp metódy PCR?

b) K. Mullis

9. Používa sa metóda PCR na diagnostiku expanzie trinukleotidových opakovaní (dynamický typ mutácií)?

10. V akých oblastiach sa používa PCR?

a) klinická medicína;

b) definícia transgénnych organizmov (GMO)

c) identifikácia osoby, určenie otcovstva, kriminalistika

d) všetky vyššie uvedené

d) nič z vyššie uvedeného.

Vzorové odpovede: 1 - a; 2 - b; 3 - b; 4 - a; 5 - e; 6 - palcov; 7 - palcov; 8 - b; 9 – a, 10 – d.

Hlavná

1. Bochkovská genetika. Moskva. GEOTAR, 2002.

Dodatočné

1., Bakharev a liečba vrodených a dedičných chorôb u detí. - Moskva, 2004.

2. DNA diagnostika a lekárske genetické poradenstvo. - Moskva, 2004.

3. Ginter genetika. - Moskva, 2003.

4. Gorbunovove základy lekárskej genetiky. - Petrohrad: Intermedica, 1999.

5. J. McGee. Molekulárna klinická diagnostika. – Svet, 1999.

6. Menshikov - biologický výskum v klinickej laboratórnej diagnostike: možnosti problému (prednášky). Klinická laboratórna diagnostika, č.3,2006.

7. Kornienka o práci PCR laboratória pri in-line analýze biologického materiálu. Klinická laboratórna diagnostika, č.10,2006.

8. Organizácia práce laboratória PCR. Metodické pokyny. MU 1.3.1794-03. Hlavný sanitárny lekár Ruskej federácie, 2003.

9. Erlich H. A. PCR technológia. – Percin-Elmer Cetus, 1993.

10. Heid C. A., Stevens J. Kvantitatívna PCR v reálnom čase. Genome Res. - č. 6, 1996.

HLAVNÉ PRINCÍPY METÓDY

POLYMERÁZOVÁ REŤAZOVÁ REAKCIA

Metodická príručka pre mimoškolskú prácu študentov 3-4 odborov v odboroch všeobecné lekárstvo (060101) a pediatria (060103).

SEI HPE "Krasnojarská štátna lekárska akadémia Federálnej agentúry pre zdravie a sociálny rozvoj"

Rusko, Krasnojarsk,

Federálna agentúra pre vzdelávanie

Štát vzdelávacia inštitúcia

Najvyšší odborné vzdelanie

"Kareliánska štátna pedagogická akadémia"

Cvičenie na tému:

Polymerázová reťazová reakcia (PCR) a jej aplikácia

Vyplnila: študentka Koryagina Valeria Alexandrovna

Kontrolovala: Karpikova Natalya Mikhailovna

Petrozavodsk 2013

Úvod

Kapitola 1 Prehľad literatúry

1.5.4 Plató efekt

1.5.6 Zosilnenie

Záver

Úvod

Posledných dvadsať rokov sa nieslo v znamení rozsiahleho zavádzania molekulárno-genetických metód do biologických, lekárskych a poľnohospodárskych vied.

Začiatkom 70. rokov sa zdalo, že molekulárna biológia dosiahla určitý stupeň dokonalosti. V tomto období boli mikroorganizmy hlavným objektom molekulárneho genetického výskumu. Prechod na eukaryoty postavil výskumníkov pred úplne nové problémy, ktoré nebolo možné vyriešiť pomocou metód genetickej analýzy, ktoré v tom čase existovali. Prelom vo vývoji molekulárnej genetiky bol možný vďaka objaveniu sa nového experimentálneho nástroja - reštrikčných endonukleáz. V nasledujúcich rokoch sa počet metód priamej analýzy DNA založených na kvalitatívne odlišných prístupoch začal rýchlo zvyšovať.

V mnohých prípadoch moderné technológie umožnili začať hlbšie študovať jemnú štrukturálnu a funkčnú organizáciu jadrových a mimojadrových genómov rôznych organizmov. To malo osobitný význam pre vývoj nových metód diagnostiky a liečby. rôzne choroby. Nemenej dôležitá bola možnosť využitia výdobytkov molekulárnej genetiky v populačnej biológii a šľachtení na identifikáciu a analýzu genetickej variability populácií, odrôd a kmeňov, identifikáciu a certifikáciu ekonomicky hodnotných jedincov, vytváranie geneticky modifikovaných organizmov a riešenie ďalších problémov.

Každá metóda má svoje výhody a nevýhody. Neexistuje univerzálna metóda, ktorá by dokázala vyriešiť všetky vzniknuté problémy. Preto je výber konkrétnej metódy pre prebiehajúci výskum jednou z najdôležitejších etáp každej vedeckej práce.

Kapitola 1 Prehľad literatúry

1.1 História objavu polymerázovej reťazovej reakcie (PCR)

V roku 1983 K.B. Mullis a spol., publikovali a patentovali metódu polymerázovej reťazovej reakcie (PCR), ktorá bola predurčená na to, aby mala hlboký vplyv na všetky oblasti výskumu a aplikácie nukleových kyselín. Hodnota tejto metódy pre molekulárna biológia a genetika sa ukázala byť taká skvelá a samozrejmá, že po siedmich rokoch bol autor ocenený nobelová cena v chémii.

Na začiatku použitia metódy, po každom cykle zahrievania a chladenia, sa do reakčnej zmesi musela pridať DNA polymeráza, pretože bola inaktivovaná pri vysokej teplote potrebnej na oddelenie reťazcov špirály DNA. Reakčný postup bol relatívne neefektívny, vyžadoval veľa času a enzýmov. V roku 1986 sa výrazne zlepšila metóda polymerázovej reťazovej reakcie. Bolo navrhnuté použiť DNA polymerázy z termofilných baktérií. Tieto enzýmy sa ukázali ako termostabilné a boli schopné odolať mnohým reakčným cyklom. Ich použitie umožnilo zjednodušiť a zautomatizovať PCR. Jedna z prvých termostabilných DNA polymeráz bola izolovaná z baktérií Thermus aquaticusa pomenované Taq-polymeráza.

Možnosť amplifikácie akéhokoľvek segmentu DNA, ktorého nukleotidová sekvencia je známa, a jeho získania po PCR v homogénnej forme a preparatívnom množstve, robí z PCR alternatívnu metódu molekulárneho klonovania krátkych fragmentov DNA. Nie je potrebné aplikovať zložité metodické techniky, ktoré sa používajú v genetické inžinierstvo s konvenčným klonovaním. Rozvoj metódy PCR výrazne rozšíril metodologické možnosti molekulárnej genetiky a najmä genetického inžinierstva natoľko, že radikálne zmenil a posilnil vedecký potenciál mnohých jej oblastí.

1.2 Odrody polymerázovej reťazovej reakcie (PCR)

· Nested PCR- používa sa na zníženie počtu vedľajších produktov reakcie. Použite dva páry primérov a vykonajte dve po sebe idúce reakcie. Druhý pár primérov amplifikuje oblasť DNA v produkte prvej reakcie.

· Invertovaná PCR- používa sa, keď je známa len malá oblasť v rámci požadovanej sekvencie. Táto metóda je užitočná najmä vtedy, keď je potrebné určiť susedné sekvencie po vložení DNA do genómu. Na implementáciu invertovanej PCR sa uskutoční séria rezov DNA reštrikčnými enzýmami<#"justify">primer polymerázovej reťazovej reakcie

· Skupinovo špecifická PCR- PCR pre príbuzných<#"center">1.3 Polymerázová reťazová reakcia

Polymerázová reťazová reakcia (PCR), objavená v polovici 80. rokov 20. storočia, môže v priebehu niekoľkých hodín miliónkrát zvýšiť počet kópií pôvodnej vzorky. Počas každého cyklu reakcie sa z pôvodnej molekuly vytvoria dve kópie. Každá zo syntetizovaných kópií DNA môže slúžiť ako templát pre syntézu nových kópií DNA v ďalšom cykle. Opakované opakovanie cyklov teda vedie k zvýšeniu počtu kópií v geometrická progresia. Z výpočtov vyplýva, že aj keď ide o 30 cyklov, počet kópií pôvodnej molekuly bude viac ako 1 miliarda. Aj keď vezmeme do úvahy, že nie všetky amplikóny sa počas každého cyklu duplikujú, celkový počet kópií je napriek tomu dosť veľký údaj.

Každý cyklus polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) pozostáva z nasledujúcich krokov:

· Denaturácia – Zvýšenie teploty spôsobí, že sa dvojvláknová molekula DNA rozvinie a rozdelí na dve jednovláknové;

· Žíhanie - Zníženie teploty umožňuje primérom pripojiť sa ku komplementárnym oblastiam molekuly DNA;

· Predlžovanie – enzým DNA polymeráza dopĺňa komplementárne vlákno.

Na amplifikáciu vybraného fragmentu sa použijú dva oligonukleotidové priméry (semená) lemujúce určitú oblasť DNA. Priméry orientované 3 - končia smerom k sebe a v smere sekvencie, ktorú je potrebné zosilniť. DNA polymeráza uskutočňuje syntézu (kompletizáciu) vzájomne komplementárnych reťazcov DNA, počnúc primérmi. Počas syntézy DNA sa priméry fyzicky vkladajú do reťazca novosyntetizovaných molekúl DNA. Každý reťazec molekuly DNA vytvorený pomocou jedného z primérov môže slúžiť ako templát na syntézu komplementárneho reťazca DNA pomocou druhého priméru.

1.4 Vedenie polymerázovej reťazovej reakcie (PCR)

Polymerázová reťazová reakcia sa uskutočňuje v špeciálnych tenkostenných polypropylénových skúmavkách, ktoré sú svojou veľkosťou kompatibilné s použitým tepelným cyklovačom (zosilňovačom) - zariadením, ktoré riadi teplotné a časové charakteristiky fáz polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) .

1.5 Princíp metódy polymerázovej reťazovej reakcie

Polymerázová reťazová reakcia (PCR) je in vitro metóda amplifikácie DNA, ktorá dokáže izolovať a znásobiť špecifickú sekvenciu DNA miliardkrát v priebehu niekoľkých hodín. Možnosť získať obrovské množstvo kópií jedného prísne určitú oblasť genóm výrazne zjednodušuje štúdium existujúcej vzorky DNA.

Na uskutočnenie polymerázovej reťazovej reakcie je potrebné splniť niekoľko podmienok:

1.5.1 Prítomnosť viacerých zložiek v reakčnej zmesi

Hlavné zložky reakčnej (PCR) zmesi sú: Tris-HCl, KCl, MgCl 2, zmes nukleotidových trifosfátov (ATP, GTP, CTP, TTP), primery (oligonukleotidy), analyzovaný preparát DNA, termostabilná DNA polymeráza. Každá zo zložiek reakčnej zmesi sa priamo zúčastňuje polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) a koncentrácia činidiel priamo ovplyvňuje priebeh amplifikácie.

· Tris-HCl - určuje pH reakčnej zmesi, vytvára pufrovaciu kapacitu. Aktivita DNA polymerázy závisí od pH média, takže hodnota pH priamo ovplyvňuje priebeh polymerázovej reťazovej reakcie. Zvyčajne je hodnota pH v rozmedzí 8 - 9,5. Vysoké pH je spôsobené tým, že ako teplota stúpa, pH Tril-HCl pufra klesá.

· KCl - koncentrácia chloridu draselného do 50 mm ovplyvňuje priebeh procesov denaturácie a žíhania, koncentrácia nad 50 mm inhibuje DNA polymerázu.

· MgCl 2- pretože DNA polymeráza je Mg 2+- závislý enzým, potom koncentrácia horčíkových iónov ovplyvňuje aktivitu enzýmu (Mg 2+tvorí komplexy s NTP – práve tieto komplexy sú substrátom pre polymerázu). Vysoká koncentrácia vedie k zvýšeniu nešpecifickej amplifikácie a nízka vedie k inhibícii reakcie, optimum (pre rôzne polymerázy) je v oblasti 0,5 - 5 mM. Okrem toho koncentrácia horečnatých solí ovplyvňuje priebeh procesov denaturácie a žíhania - zvýšenie koncentrácie Mg 2+spôsobuje zvýšenie teploty topenia DNA (t.j. teploty, pri ktorej sa 50 % dvojvláknových reťazcov DNA rozbije na jednovláknové reťazce).

· NTP - nukleotid trifosfáty sú priame monoméry nukleových kyselín. Aby sa zabránilo ukončeniu reťazca, odporúča sa rovnaký pomer všetkých štyroch nukleotidových trifosfátov. Nízka koncentrácia týchto zložiek v reakčnej zmesi zvyšuje pravdepodobnosť chýb pri konštrukcii komplementárneho reťazca DNA.

· Priméry - Najoptimálnejšie je použitie primérov s rozdielom teploty topenia nie väčším ako 2 - 4 o C. Niekedy pri dlhodobom skladovaní pri teplote 4 o Pri alebo po veľkom počte zmrazení - rozmrazení tvoria priméry sekundárne štruktúry - diméry, čím sa znižuje účinnosť PCR. Odstránenie tohto problému sa redukuje na inkubáciu vo vodnom kúpeli (T=95 o C) po dobu 3 minút a následné rýchle ochladenie na 0 °C S.

· DNA preparáty - množstvo a kvalita preparátu DNA (matrice) priamo ovplyvňuje priebeh a parametre polymerázovej reťazovej reakcie. Nadbytok vzorky DNA inhibuje polymerázovú reťazovú reakciu (PCR). nečistoty rôzne látky, ktoré sú v prípravku DNA, môžu tiež znížiť účinnosť polymerázovej reťazovej reakcie (PCR): octan sodný, chlorid sodný, izopropanol, etanol, heparín, fenol, močovina, hemoglobín atď.

· DNA polymeráza - pri použití malého množstva DNA polymerázy sa pozoruje pokles syntézy konečného produktu priamo úmerný veľkosti fragmentov. 2- až 4-násobný nadbytok polymerázy vedie k vzniku difúznych spektier a 4 až 16-násobný nešpecifický spektier s nízkou molekulovou hmotnosťou. Rozsah použitých koncentrácií je 0,5 - 1,5 jednotiek aktivity v zmysle 25 ul zmesi PCR.

Okrem hlavných zložiek zmesi PCR sa používa množstvo ďalších látok, ktoré zlepšujú kvalitatívne a kvantitatívne ukazovatele PCR: acetamid (5%) - zvýšenie rozpustnosti hlavných zložiek; betaín ( sodná soľ) - stabilizácia DNA polymerázy, zníženie teploty topenia DNA, vyrovnanie teploty topenia; hovädzí albumín (10-100 μg / ml) - stabilizácia DNA polymerázy; dimetylsulfoxid (1-10%) - zvýšenie rozpustnosti hlavných zložiek; formamid (2-10%) - zvýšenie špecifickosti žíhania; glycerol (15-20%) - zvýšenie tepelnej stability enzýmu, zníženie teploty denaturácie vzorky DNA; síran amónny - zníženie teploty denaturácie a žíhania.

1.5.2 Cyklus a teplota

Všeobecný pohľad na program polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) je nasledujúci:

etapa. Predĺžená primárna denaturácia preparátu DNA.1 cyklus

etapa. Rýchla denaturácia preparátu DNA. Žíhanie základného náteru. Predĺženie.30 - 45 cyklov.

etapa. Predĺžené predĺženie. Ochladenie reakčnej zmesi 1 cyklus.

Každý prvok fázy - denaturácia, žíhanie, predĺženie - má individuálne teplotné a časové charakteristiky. Parametre teploty a doby prietoku každého prvku sa vyberajú empiricky v súlade s kvalitatívnymi a kvantitatívnymi ukazovateľmi produktov amplifikácie.

Denaturácia. Počas tohto prvku polymerázovej reťazovej reakcie sa molekula dvojvláknovej DNA rozdelí na dve jednovláknové. Teplotné parametre denaturácie sú v rozmedzí 90 - 95 o C, ale v prípade vzorky DNA s vysokým obsahom guanínu a cytozínu treba teplotu zvýšiť na 98 o C. Teplota denaturácie by mala byť dostatočná na úplnú denaturáciu – rozštiepenie reťazcov DNA a vyhnúť sa „náhlemu ochladeniu“ alebo rýchlemu žíhaniu, avšak termostabilná DNA polymeráza je pri vysokých teplotách menej stabilná. Výber optimálnych parametrov denaturačnej teploty pre pomer primér/vzorka (príprava DNA) je teda dôležitou podmienkou amplifikácie. Ak je teplota denaturácie v prvom kroku vyššia ako 95 o C sa odporúča po primárnej denaturácii pridať do reakčnej zmesi DNA polymerázu. Trvanie tohto prvku štádia počas polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) by malo postačovať na úplnú denaturáciu DNA, ale zároveň by nemalo výrazne ovplyvniť aktivitu DNA polymerázy pri danej teplote.

Žíhanie. Teplota žíhania (T A ) je jedným z najdôležitejších parametrov polymerázovej reťazovej reakcie. Teplota žíhania pre každý špecifický primer sa volí individuálne. Závisí to od dĺžky a nukleotidového zloženia priméru. Zvyčajne je nižšia o 2 - 4 o Z hodnoty bodu topenia (T m ) základný náter. Ak je teplota žíhania systému pod optimálnou, potom sa počet nešpecifických amplifikovaných fragmentov zvyšuje a naopak. teplo znižuje množstvo zosilnených produktov. V tomto prípade môže koncentrácia špecifických amplikónov prudko klesnúť až do inhibície polymerázovej reťazovej reakcie (PCR). Predĺženie doby žíhania tiež vedie k zvýšeniu počtu nešpecifických amplikónov.

Predĺženie. Typicky má každý typ termostabilnej DNA polymerázy individuálne teplotné optimum aktivity. Rýchlosť syntézy komplementárneho reťazca DNA enzýmom je tiež hodnota špecifická pre každú polymerázu (v priemere je to 30–60 nukleotidov za sekundu alebo 1–2 000 báz za minútu), takže čas predĺženia sa volí v závislosti na type DNA polymerázy a dĺžke amplifikovanej oblasti.

1.5.3 Základné princípy výberu primérov

Pri vytváraní testovacieho systému PCR je jednou z hlavných úloh správny výber primerov, ktoré musia spĺňať niekoľko kritérií:

Priméry musia byť špecifické. Osobitná pozornosť zaplatiť 3 - konce primérov, pretože práve z nich Taq polymeráza začína dopĺňať reťazec komplementárnej DNA. Ak je ich špecificita nedostatočná, potom je pravdepodobné, že v skúmavke s reakčnou zmesou dôjde k nežiaducim procesom, konkrétne k syntéze nešpecifickej DNA (krátke alebo dlhé fragmenty). Pri elektroforéze je viditeľný vo forme ťažkých alebo ľahkých prídavných pásov. To sťažuje vyhodnotenie výsledkov reakcie, pretože je ľahké zameniť špecifický produkt amplifikácie so syntetizovanou cudzou DNA. Časť primerov a dNTP sa spotrebuje na syntézu nešpecifickej DNA, čo vedie k významnej strate citlivosti.

Priméry by nemali vytvárať diméry a slučky, t.j. žíhaním primérov k sebe alebo k sebe navzájom by sa nemali vytvárať stabilné dvojreťazce.

1.5.4 Plató efekt

Treba poznamenať, že proces akumulácie špecifických amplifikačných produktov trvá exponenciálne len obmedzený čas a potom jeho účinnosť kriticky klesá. Je to spôsobené takzvaným „plató“ efektom.

termínovaný efekt plošina používa sa na opis procesu akumulácie produktov PCR v posledných cykloch amplifikácie.

V závislosti od podmienok a počtu cyklov amplifikačnej reakcie v čase dosiahnutia účinku plošina využitie substrátov (dNTP a primery), stabilita reaktantov (dNTP a enzým), množstvo inhibítorov vrátane pyrofosfátov a DNA duplexov, súťaž o reaktanty s nešpecifickými produktmi alebo primer-diméry, koncentrácia špecifického produktu a neúplná denaturácia pri vysokých koncentráciách amplifikačných produktov.

Čím nižšia je počiatočná koncentrácia cieľovej DNA, tým vyššie je riziko reakcie plateau". Tento bod môže nastať skôr, než bude dostatočný počet špecifických amplifikačných produktov na analýzu. Len dobre optimalizované testovacie systémy sa tomu môžu vyhnúť.

1.5.5 Príprava vzorky biologického materiálu

Na extrakciu DNA sa používajú rôzne techniky v závislosti od úloh. Ich podstata spočíva v extrakcii (extrakcii) DNA z biologického produktu a odstránení alebo neutralizácii cudzích nečistôt na získanie preparátu DNA s čistotou vhodnou pre PCR.

Spôsob získania čistého preparátu DNA, ktorý opísal Marmur, sa považuje za štandardný a už sa stal klasickým. Zahŕňa enzymatickú proteolýzu, po ktorej nasleduje deproteinizácia a reprecipitácia DNA alkoholom. Táto metóda umožňuje získať čistý preparát DNA. Je to však dosť namáhavé a zahŕňa prácu s takými agresívnymi a štipľavými látkami, ako je fenol a chloroform.

Jednou zo súčasných populárnych metód je metóda extrakcie DNA navrhnutá Boomom a kol. Táto metóda je založená na použití silného chaotropného činidla, guanidíntiokyanátu (GuSCN), na lýzu buniek a následnú sorpciu DNA na nosič (sklenené guľôčky, kremelina, sklenené mlieko a pod.). Po premytí zostáva DNA vo vzorke adsorbovaná na nosiči, z ktorého sa dá ľahko odstrániť pomocou elučného pufra. Metóda je pohodlná, technologicky vyspelá a vhodná na prípravu vzoriek na amplifikáciu. Straty DNA sú však možné v dôsledku ireverzibilnej sorpcie na nosiči, ako aj počas početných premývaní. Toto je obzvlášť dôležité pri práci s malým množstvom DNA vo vzorke. Navyše aj stopové množstvá GuSCN môžu inhibovať PCR. Preto je pri použití tejto metódy veľmi dôležitá správna voľba sorbent a starostlivé dodržiavanie technologických nuancií.

Ďalšia skupina metód prípravy vzoriek je založená na použití iónomeničov typu Chilex, ktoré na rozdiel od skla neadsorbujú DNA, ale naopak nečistoty interferujúce s reakciou. Táto technológia spravidla zahŕňa dva stupne: var vzorky a adsorpciu nečistôt na iónomeniči. Metóda je mimoriadne atraktívna vďaka svojej jednoduchosti prevedenia. Vo väčšine prípadov je vhodný na prácu s klinickým materiálom. Bohužiaľ, niekedy existujú vzorky s nečistotami, ktoré nie je možné odstrániť pomocou iónomeničov. Navyše niektoré mikroorganizmy nemožno zničiť jednoduchým varom. V týchto prípadoch je potrebné zaviesť ďalšie stupne spracovania vzoriek.

Preto by sa výber metódy prípravy vzorky mal posudzovať s pochopením cieľov zamýšľaných analýz.

1.5.6 Zosilnenie

Na uskutočnenie amplifikačnej reakcie je potrebné pripraviť reakčnú zmes a pridať do nej analyzovanú vzorku DNA. V tomto prípade je dôležité vziať do úvahy niektoré vlastnosti žíhania primérov. Faktom je, že v analyzovanej biologickej vzorke sú spravidla rôzne molekuly DNA, s ktorými majú priméry použité v reakcii čiastočnú a v niektorých prípadoch významnú homológiu. Okrem toho môžu priméry na seba napojiť za vzniku primér-dimérov. Oboje vedie k značnej spotrebe primerov na syntézu vedľajších (nešpecifických) reakčných produktov a v dôsledku toho výrazne znižuje citlivosť systému. To sťažuje alebo znemožňuje odčítanie výsledkov reakcie počas elektroforézy.

1.6 Zloženie štandardnej reakčnej zmesi PCR

x PCR pufor (100 mM roztok Tris-HCl, pH 9,0, 500 mM roztok KCl, 25 mM roztok MgCl2 ) …….2,5 µl

Voda (MilliQ) ………………………………………………………. 18,8 µl

Zmes nukleotidových trifosfátov (dNTP)

mM roztok z každého……………………………………………….. 0,5 µl

Primer 1 (10 mM roztok) ………………………………………….….1 µl

Primer 2 (10 mM roztok) ………………………………………….….1 µl

DNA polymeráza (5 jednotiek / µl) …………………………………………………0,2 µl

Vzorka DNA (20 ng/µl) …………………………………………..1 µl

1.7 Vyhodnotenie výsledkov reakcií

Aby bolo možné správne posúdiť výsledky PCR, je dôležité pochopiť, že táto metóda nie je kvantitatívna. Teoreticky môžu byť produkty amplifikácie jednotlivých cieľových molekúl DNA detegované elektroforézou už po 30-35 cykloch. V praxi sa to však robí len v prípadoch, keď reakcia prebieha za podmienok blízkych ideálnym, s čím sa v živote často nestretávame. Stupeň čistoty preparátu DNA má obzvlášť veľký vplyv na účinnosť amplifikácie; prítomnosť určitých inhibítorov v reakčnej zmesi, ktorých sa v niektorých prípadoch môže mimoriadne ťažko zbaviť. Niekedy kvôli ich prítomnosti nie je možné amplifikovať ani desaťtisíce cieľových molekúl DNA. Preto často neexistuje priamy vzťah medzi počiatočným množstvom cieľovej DNA a konečným množstvom amplifikačných produktov.

Kapitola 2: Aplikácie polymerázovej reťazovej reakcie

PCR sa používa v mnohých oblastiach na analýzu a vo vedeckých experimentoch.

Kriminalistika

PCR sa používa na porovnanie takzvaných „genetických odtlačkov prstov“. Potrebujeme vzorku genetického materiálu z miesta činu – krv, sliny, semeno, vlasy atď. Porovnáva sa s genetickým materiálom podozrivého. Teoreticky stačí veľmi malé množstvo DNA - jedna kópia. DNA sa rozreže na fragmenty a potom sa amplifikuje pomocou PCR. Fragmenty sa oddelia elektroforézou DNA. Výsledný obraz umiestnenia pásov DNA sa nazýva genetický odtlačok prsta.

Stanovenie otcovstva

Výsledky elektroforézy DNA fragmentov amplifikovaných pomocou PCR. otec. Dieťa. matka. Dieťa zdedilo niektoré znaky genetického odtlačku oboch rodičov, čo dalo nový, jedinečný odtlačok.

Aj keď sú „genetické odtlačky prstov“ jedinečné, rodinné väzby sa stále dajú vytvoriť vytvorením niekoľkých takýchto odtlačkov prstov. Rovnakú metódu možno použiť s malými úpravami na stanovenie evolučných vzťahov medzi organizmami.

Lekárska diagnostika

PCR umožňuje výrazne urýchliť a uľahčiť diagnostiku dedičných a vírusových ochorení. Požadovaný gén sa amplifikuje pomocou PCR s použitím vhodných primerov a potom sa sekvenuje, aby sa určili mutácie. Vírusové infekcie môžu byť zistené bezprostredne po infekcii, týždne alebo mesiace predtým, ako sa objavia príznaky ochorenia.

Personalizovaná medicína

Niekedy sú lieky pre niektorých pacientov toxické alebo alergénne. Príčiny sú čiastočne v individuálnych rozdieloch v citlivosti a metabolizme liečiv a ich derivátov. Tieto rozdiely sú určené na genetickej úrovni. Napríklad u jedného pacienta môže byť určitý cytochróm aktívnejší, u iného - menej. Aby sa určilo, aký druh cytochrómu má daný pacient, navrhuje sa pred použitím lieku vykonať analýzu PCR. Táto analýza sa nazýva predbežná genotypizácia.

Klonovanie génov

Génové klonovanie je proces izolácie génov a ako výsledok manipulácií genetického inžinierstva získanie veľkého množstva produktu daného génu. PCR sa používa na amplifikáciu génu, ktorý sa potom vloží do vektora, časti DNA, ktorá prenáša cudzí gén do toho istého organizmu alebo iného organizmu, ktorý sa ľahko pestuje. Ako vektory sa používajú napríklad plazmidy alebo vírusová DNA. Vloženie génov do cudzieho organizmu sa zvyčajne využíva na získanie produktu tohto génu – RNA alebo najčastejšie proteínu. Týmto spôsobom sa mnohé proteíny získavajú v priemyselných množstvách na použitie v poľnohospodárstvo, lieky a pod.

Sekvenovanie DNA

V metóde sekvenovania s použitím fluorescenčne alebo rádioaktívne značených dideoxynukleotidov je PCR integrálnou súčasťou, pretože práve počas polymerizácie sú nukleotidové deriváty značené fluorescenčnou alebo rádioaktívnou značkou vložené do reťazca DNA. To zastaví reakciu, čo umožňuje určiť polohy špecifických nukleotidov po separácii syntetizovaných vlákien v géli.

Mutagenéza

V súčasnosti sa PCR stala hlavnou metódou mutagenézy. Použitie PCR umožnilo zjednodušiť a urýchliť postup mutagenézy, ako aj zvýšiť jeho spoľahlivosť a reprodukovateľnosť.

Metóda PCR umožnila analyzovať prítomnosť sekvencií ľudského papilomavírusu v rezoch biopsií ľudských cervikálnych novotvarov uložených v parafíne 40 rokov pred touto štúdiou. Navyše, pomocou PCR bolo možné amplifikovať a klonovať fragmenty mitochondriálnej DNA z fosílnych pozostatkov ľudského mozgu vo veku 7 tisíc rokov!

Na lyzátoch jednotlivých ľudských spermií bola preukázaná možnosť simultánnej analýzy dvoch lokusov umiestnených na rôznych nehomologických chromozómoch. Tento prístup poskytuje jedinečnú príležitosť pre jemnú genetickú analýzu a štúdium chromozomálnej rekombinácie, polymorfizmu DNA atď. Metóda analýzy jednotlivých spermií okamžite nájdená praktické využitie v súdnom lekárstve, keďže HLA typizácia haploidných buniek umožňuje určiť otcovstvo alebo identifikovať zločinca (HLA komplex je súbor génov ľudského hlavného histokompatibilného komplexu; lokusy HLA komplexu sú najpolymorfnejšie zo všetkých známych u vyšších stavovcov: v rámci druhu, na každom lokuse je nezvyčajne veľké množstvo rôznych alel - alternatívne formy toho istého génu).

Pomocou PCR je možné odhaliť správnosť integrácie cudzích genetických štruktúr vo vopred určenej oblasti genómu študovaných buniek. Celková bunková DNA sa aneluje s dvoma oligonukleotidovými primérmi, z ktorých jeden je komplementárny k oblasti hostiteľskej DNA blízko miesta inzercie a druhý k sekvencii integrovaného fragmentu v antiparalelnom reťazci DNA. Polymerázová reťazová reakcia v prípade nezmenenej štruktúry chromozomálnej DNA na navrhovanom mieste inzercie vedie k vytvoreniu jednovláknových fragmentov DNA neurčitej veľkosti a v prípade plánovanej inzercie dvojvláknových fragmentov DNA známej veľkosť, určená vzdialenosťou medzi miestami nasadenia dvoch primérov. Okrem toho bude stupeň amplifikácie analyzovanej oblasti genómu v prvom prípade lineárne závislý od počtu cyklov av druhom - exponenciálne. Exponenciálna akumulácia počas PCR amplifikovaného fragmentu vopred stanovenej veľkosti umožňuje jeho vizuálne pozorovanie po elektroforetickej frakcionácii preparátu DNA a jednoznačný záver o inzercii cudzej sekvencie do danej oblasti chromozomálnej DNA.

Záver

Metóda PCR je v súčasnosti najpoužívanejšia ako metóda na diagnostiku rôznych infekčných ochorení. PCR umožňuje identifikovať etiológiu infekcie, aj keď vzorka odobratá na analýzu obsahuje len niekoľko molekúl DNA patogénu. PCR sa široko používa pri včasnej diagnostike infekcií HIV, vírusovej hepatitídy atď. K dnešnému dňu neexistuje takmer žiadne infekčné činidlo, ktoré by nebolo možné zistiť pomocou PCR.

Zoznam použitej literatúry

1.Padutov V.E., Baranov O.Yu., Voropaev E.V. Metódy molekulárno - genetickej analýzy. - Minsk: Unipol, 2007. - 176 s.

2.PCR "v reálnom čase" / Rebrikov D.V., Samatov G.A., Trofimov D.Yu. atď.; vyd. b. n. D.V. Rebrikov; predslov L.A. Osterman a akad. RAS a RAAS E.D. Sverdlov; 2. vydanie, rev. a dodatočné - M.: BINOM. Vedomostné laboratórium, 2009. - 223 s.

.Patrushev L.I. Umelé genetické systémy. - M.: Nauka, 2005. - V 2 tonách

.B. Glick, J. Pasternak Molekulárna biotechnológia. Princípy a aplikácia 589 strán, 2002

5.Shchelkunov S.N. genetické inžinierstvo. - Novosibirsk: Sib. univ. vydavateľstvo, 2004. - 496 s.

Upravil A.A. Vorbyeva "Polymerázová reťazová reakcia a jej využitie v diagnostike v dermatovenerológii"; Lekárska tlačová agentúra - 72 strán

Http://ru. wikipedia.org

http://scholar. google.ru

.

.

http://www.med2000.ru/n1/n12. htm

12.http://prizvanie. nie/ - lekársky časopis

Doučovanie

Potrebujete pomôcť s učením témy?

Naši odborníci vám poradia alebo poskytnú doučovacie služby na témy, ktoré vás zaujímajú.
Odoslať žiadosť s uvedením témy práve teraz, aby ste sa dozvedeli o možnosti konzultácie.

Za primerané a účinnú liečbu mnohé infekčné choroby vyžadujú včasnú detekciu presná diagnóza. Pri riešení tohto problému sa dnes využívajú high-tech diagnostické metódy založené na metódach molekulárnej biológie. V súčasnosti je polymerázová reťazová reakcia (PCR) už široko používaná v praktickej medicíne ako najspoľahlivejší laboratórny diagnostický nástroj.

Čo vysvetľuje popularitu PCR v súčasnosti?

Po prvé, táto metóda sa používa na identifikáciu patogénov rôznych infekčných chorôb s vysokou presnosťou.

Po druhé, sledovať účinnosť liečby.

V rôznych príručkách, prospektoch, článkoch, ale aj vysvetlivkách medicínskych špecialistov sa často stretávame s používaním nezrozumiteľných výrazov a slov. Je naozaj ťažké hovoriť o high-tech produktoch vedy obyčajnými slovami.

Aká je podstata a mechanika PCR diagnostiky?

Každý živý organizmus má svoje vlastné jedinečné gény. Gény sa nachádzajú v molekule DNA, ktorá je v skutočnosti „vizitkou“ každého konkrétneho organizmu. DNA (genetický materiál) je veľmi dlhá molekula, ktorá sa skladá zo stavebných blokov nazývaných nukleotidy. Pre každý patogén infekčných chorôb sú umiestnené prísne špecifické, to znamená v určitom poradí a kombinácii. Keď je potrebné pochopiť, či má osoba konkrétny patogén, odoberie sa biologický materiál (krv, moč, sliny, náter), ktorý obsahuje DNA alebo fragmenty DNA mikróbov. Množstvo genetického materiálu patogénu je však veľmi malé a nie je možné povedať, ku ktorému mikroorganizmu patrí. Na vyriešenie tohto problému slúži PCR. Podstatou polymerázovej reťazovej reakcie je, že sa odoberie malé množstvo materiálu na výskum, ktorý obsahuje DNA, a počas procesu PCR sa množstvo genetického materiálu, ktorý patrí konkrétnemu patogénu, zvyšuje, a tak ho možno identifikovať.

PCR diagnostika je genetická štúdia biomateriálu.

Myšlienka metódy PCR patrí americkému vedcovi K. Mullinsovi, ktorý navrhol v roku 1983. Široké klinické využitie však získal až v polovici 90-tych rokov XX storočia.

Poďme sa zaoberať terminológiou, čo to je - DNA atď. Každá bunka akejkoľvek živej bytosti (zviera, rastlina, človek, baktérie, vírus) má chromozómy. Chromozómy sú správcami genetickej informácie, ktorá obsahuje celú sekvenciu génov každej konkrétnej živej bytosti.

Každý chromozóm sa skladá z dvoch reťazcov DNA, ktoré sú navzájom stočené do špirály. DNA je chemicky deoxyribonukleová kyselina, ktorá pozostáva zo štruktúrnych zložiek – nukleotidov. Existuje 5 typov nukleotidov – tymín (T), adenozín (A), guanín (G), cytozín (C) a uracil (U). Nukleotidy sú usporiadané jeden po druhom v prísnej individuálnej sekvencii a tvoria gény. Jeden gén môže pozostávať z 20-200 takýchto nukleotidov. Napríklad gén kódujúci produkciu inzulínu má dĺžku 60 párov báz.

Nukleotidy majú vlastnosť komplementarity. To znamená, že opačný adenín (A) v jednom reťazci DNA je vždy tymín (T) v druhom reťazci a opačný guanín (G) - cytozín (C). Schematicky to vyzerá takto:
G – C
T - A
A - T
Táto vlastnosť komplementarity je kľúčová pre PCR.

Okrem DNA má rovnakú štruktúru aj RNA – kyselina ribonukleová, ktorá sa od DNA líši tým, že namiesto tymínu používa uracil. RNA - je nositeľkou genetickej informácie v niektorých vírusoch, ktoré sa nazývajú retrovírusy (napríklad HIV).

Molekuly DNA a RNA sa môžu „rozmnožovať“ (táto vlastnosť sa využíva pri PCR). Deje sa to nasledovne: dve vlákna DNA alebo RNA sa od seba vzdialia do strán, na každé vlákno sedí špeciálny enzým, ktorý syntetizuje nový reťazec. Syntéza prebieha podľa princípu komplementarity, to znamená, že ak je nukleotid A v pôvodnom reťazci DNA, potom T bude v novosyntetizovanom reťazci, ak G - potom C atď. Tento špeciálny „stavebný“ enzým potrebuje „semienko“ – sekvenciu 5-15 nukleotidov – na spustenie syntézy. Toto „semeno“ je definované pre každý gén (gén chlamýdií, mykoplazma, vírusy) experimentálne.

Takže každý cyklus PCR pozostáva z troch etáp. V prvej fáze nastáva takzvané odvíjanie DNA – teda oddelenie dvoch reťazcov DNA spojených navzájom. V druhom je „semeno“ pripojené k časti vlákna DNA. A nakoniec, predlžovanie týchto reťazcov DNA, ktoré je produkované enzýmom "staviteľ". V súčasnosti toto všetko náročný proces prebieha v jednej skúmavke a pozostáva z opakovaných cyklov rozmnožovania stanovenej DNA s cieľom získať veľké množstvo kópií, ktoré je možné následne detegovať bežnými metódami. To znamená, že z jedného vlákna DNA získame stovky alebo tisíce.

Etapy štúdie PCR

Zber biologického materiálu na výskum

Ako vzorka slúži rôzny biologický materiál: krv a jej zložky, moč, sliny, sliznice, cerebrospinálny mok, výtok povrchy rany, obsah telesných dutín. Všetky biologické vzorky sa odoberajú pomocou jednorazových nástrojov a odobratý materiál sa umiestni do sterilných plastových skúmaviek alebo sa umiestni na kultivačné médium, po čom nasleduje preprava do laboratória.

K odobratým vzorkám sa pridajú potrebné reagencie a umiestnia sa do programovateľného termostatu – termocykléra (zosilňovača). V cykléri sa cyklus PCR opakuje 30-50 krát, pozostáva z troch fáz (denaturácia, žíhanie a predlžovanie). Čo to znamená? Uvažujme podrobnejšie.

Etapy okamžitej PCR reakcie, kopírovanie genetického materiálu

jaFáza PCR - Príprava genetického materiálu na kopírovanie.
Vyskytuje sa pri teplote 95 ° C, zatiaľ čo vlákna DNA sú odpojené a môžu na nich sedieť „semená“.

„Semená“ priemyselne vyrábajú rôzne výskumné a výrobné združenia, laboratóriá kupujú hotové. Zároveň „semeno“ na detekciu napríklad chlamýdií funguje iba na chlamýdie atď. Ak sa teda biomateriál testuje na prítomnosť chlamýdiovej infekcie, potom sa do reakčnej zmesi vloží „semeno“ na chlamýdie; ak testujeme biomateriál na vírus Epstein-Barrovej, potom „semeno“ na vírus Epstein-Barrovej.

IIštádium – Spojenie genetického materiálu pôvodcu infekcie a „semena“.
Ak existuje DNA vírusu alebo baktérie, ktorá sa má určiť, "semeno" sedí na tejto DNA. Tento proces pridávania primérov je druhým krokom PCR. Táto fáza prebieha pri teplote 75°C.

IIIštádium - Kopírovanie genetického materiálu pôvodcu infekcie.
Ide o proces skutočného predlžovania alebo rozmnožovania genetického materiálu, ku ktorému dochádza pri 72°C. K "semenám" sa priblíži tvorca enzýmov a syntetizuje nové vlákno DNA. S ukončením syntézy nového reťazca DNA končí aj cyklus PCR. To znamená, že v jednom cykle PCR sa množstvo genetického materiálu zdvojnásobí. Napríklad v počiatočnej vzorke bolo 100 molekúl DNA vírusu, po prvom cykle PCR už bude vo vzorke 200 molekúl DNA testovaného vírusu. Jeden cyklus trvá 2-3 minúty.

Aby sa vytvoril dostatok genetického materiálu na identifikáciu, zvyčajne sa vykoná 30-50 cyklov PCR, čo trvá 2-3 hodiny.

Štádium identifikácie rozmnožovaného genetického materiálu

Tu sa samotná PCR končí a potom prichádza rovnako významná fáza identifikácie. Na identifikáciu sa používa elektroforéza alebo označené "semená". Pri použití elektroforézy sa výsledné vlákna DNA oddelia podľa veľkosti a prítomnosť fragmentov DNA rôznych dĺžok indikuje pozitívny výsledok analýzy (to znamená prítomnosť konkrétneho vírusu, baktérie atď.). Pri použití označených „semien“ sa do konečného produktu reakcie pridáva chromogén (farbivo), v dôsledku čoho je enzymatická reakcia sprevádzaná tvorbou farby. Vývoj farby priamo naznačuje, že v pôvodnej vzorke je prítomný vírus alebo iné detekovateľné činidlo.

Dnes je možné pomocou označených „semien“, ako aj vhodného softvéru okamžite „čítať“ výsledky PCR. Ide o takzvanú real-time PCR.

Prečo je diagnostika PCR taká cenná?

Jednou z významných výhod metódy PCR je jej vysoká citlivosť – od 95 do 100 %. Tieto výhody však musia byť založené na nevyhnutnom dodržaní nasledujúcich podmienok:

1. správny odber vzoriek, preprava biologického materiálu;
2. dostupnosť sterilných nástrojov na jedno použitie, špeciálnych laboratórií a vyškoleného personálu;
3. prísne dodržiavanie metodiky a sterility počas analýzy

Citlivosť sa líši pre rôzne zistené mikróby. Takže napríklad citlivosť metódy PCR na detekciu vírusu hepatitídy C je 97-98%, citlivosť na detekciu ureaplazmy je 99-100%.

Schopnosti, ktoré sú súčasťou analýzy PCR, vám umožňujú dosiahnuť neprekonateľnú analytickú špecifickosť. To znamená presne identifikovať mikroorganizmus, ktorý sa hľadal, a nie podobný alebo blízko príbuzný.
Diagnostická citlivosť a špecifickosť metódy PCR, často prevyšuje špecifickosť metódy kultivácie, nazývanej "zlatý štandard" na detekciu infekčných chorôb. Vzhľadom na trvanie kultivačného rastu (od niekoľkých dní do niekoľkých týždňov) je výhoda metódy PCR zrejmá.

PCR v diagnostike infekcií
Výhody metódy PCR (senzitivita a špecifickosť) predurčujú široké možnosti využitia v modernej medicíne.
Hlavné oblasti použitia diagnostiky PCR:

1. diagnostika akútnych a chronických infekčných ochorení rôznej lokalizácie
2. sledovanie účinnosti terapie
3. objasnenie typu patogénu

PCR sa používa v pôrodníctve, gynekológii, neonatológii, pediatrii, urológii, venerológii, nefrológii, klinike infekčných chorôb, oftalmológii, neurológii, ftizeiopulmonológii atď.

Použitie diagnostiky PCR sa uskutočňuje v spojení s inými výskumnými metódami (ELISA, PIF, RIF atď.). Ich kombináciu a účelnosť určuje ošetrujúci lekár.

Infekčné agens detekované pomocou PCR

Vírusy:

1. Retrovírusy HIV-1 a HIV-2
2. herpetiformné vírusy
3. vírus herpes simplex 1 a 2 typy

V poslednej dobe je spoľahlivý, vysoko citlivý a rýchla metóda diagnostika rôznych ľudských infekčných chorôb. Táto metóda sa nazýva "PCR analýza". Čo to je, aká je jeho podstata, aké mikroorganizmy dokáže odhaliť a ako ho správne užívať, povieme v našom článku.

História objavov

Pri diagnostike rakoviny sa používajú aj metódy PCR.

Výhody metódy

PCR diagnostika má niekoľko výhod:

1. Vysoká citlivosť. Aj v prítomnosti iba niekoľkých molekúl DNA mikroorganizmov analýza PCR určuje prítomnosť infekcie. Metóda pomôže pri chronických a latentne sa vyskytujúcich ochoreniach. Často v takýchto prípadoch je mikroorganizmus inak nekultivovaný.
2. Na výskum je vhodný akýkoľvek materiál, napríklad sliny, krv, pohlavné sekréty, vlasy, epitelové bunky. Najčastejšie ide o krvný test a urogenitálny náter na PCR.

   

3. Dlhodobé pestovanie plodín sa nevyžaduje. Automatizovaný diagnostický proces vám umožňuje získať výsledky štúdie po 4-5 hodinách.
4. Metóda je takmer 100% spoľahlivá. Boli zaznamenané len ojedinelé prípady falošne negatívnych výsledkov.
5. Možnosť identifikovať viacero druhov patogénov z jednej vzorky materiálu. To nielen urýchľuje proces diagnostiky ochorenia, ale tiež výrazne znižuje náklady na materiál. Lekár často predpisuje komplexnú analýzu PCR. Cena vyšetrenia, pozostávajúceho z určenia šiestich patogénov, je asi 1500 rubľov.

Aby boli výsledky počas štúdie PCR spoľahlivé, je potrebné vykonať analýzu podľa odporúčaní na predbežnú prípravu na diagnostiku:

1. Pred darovaním slín by ste sa mali zdržať jedenia a užívania liekov 4 hodiny pred užitím materiálu. Bezprostredne pred procedúrou si vypláchnite ústa prevarenou vodou.
2. Vyššie uvedené pravidlá treba dodržiavať aj pri odbere vzorky z vnútornej plochy líc. Po opláchnutí sa odporúča vykonať ľahkú masáž pokožky, aby sa zvýraznilo tajomstvo žľazy.
3. Moč sa zvyčajne zbiera doma. Aby ste to dosiahli, musíte vykonať dôkladnú toaletu pohlavných orgánov. Odoberte 50-60 ml moču do sterilnej plastovej nádoby. Pre zabezpečenie čistoty materiálu sa ženám odporúča zaviesť si tampón do pošvy a mužom stiahnuť kožnú riasu čo najďalej. Počas menštruačného toku nemôžete vziať materiál.
4. Ak chcete darovať spermie, musíte sa zdržať pohlavného styku 3 dni pred odberom materiálu. Lekári tiež neodporúčajú navštevovať saunu a horúci kúpeľ, piť alkohol a korenené jedlá. 3 hodiny pred analýzou sa musíte zdržať močenia.
5. Napríklad pri pôrode, ak sa vykoná test PCR na chlamýdie, ženám aj mužom sa odporúča sexuálny odpočinok po dobu 3 dní. Antibakteriálne lieky by sa nemali užívať 2 týždne pred analýzou. Na týždeň musíte prestať používať intímne gély, masti, vaginálne čapíky, sprchy. 3 hodiny pred vyšetrením sa musíte zdržať močenia. Počas menštruácie sa odber vzoriek materiálu nevykonáva, iba 3 dni po zastavení výtoku krvi môžete odobrať urogenitálny náter.

PCR počas tehotenstva

Počas obdobia očakávania dieťaťa sú mnohé infekčné choroby prenášané pohlavným stykom mimoriadne nebezpečné normálny vývoj plod. STD môžu vyvolať intrauterinnú rastovú retardáciu, potrat alebo predčasný pôrod, vrodené malformácie dieťaťa. Preto je mimoriadne dôležité ísť do skoré dátumy tehotenské vyšetrenie pomocou PCR. Pri registrácii je potrebné absolvovať analýzu - do 12 týždňov.



Materiál sa odoberá z cervikálneho kanála pomocou špeciálnej kefy. Postup je bezbolestný a nepredstavuje nebezpečenstvo pre dieťa. Zvyčajne sa počas tehotenstva vykonáva analýza na chlamýdie metódou PCR, ako aj na ureaplazmózu, mykoplazmózu, cytomegalovírus, herpes, papilomavírus. Takýto komplex vyšetrení sa nazýva PCR-6.

PCR na diagnostiku HIV

Vzhľadom na to, že metóda je veľmi citlivá na zmeny v organizme a podmienky diagnózy, môže výsledok ovplyvniť veľa faktorov. Preto analýza PCR na infekciu HIV nie je spoľahlivou metódou, jej účinnosť je 96-98%. Vo zvyšných 2-4% prípadov test dáva falošne pozitívne výsledky.

Ale v niektorých situáciách sa človek nezaobíde bez PCR diagnostiky HIV. Zvyčajne sa podáva ľuďom s falošne negatívnym výsledkom ELISA. Takéto indikátory naznačujú, že osoba ešte nevytvorila protilátky proti vírusu a nemožno ich zistiť bez viacnásobného zvýšenia počtu. To je presne to, čo možno dosiahnuť vykonaním krvného testu pomocou metódy PCR.

Takáto diagnostika je potrebná aj u detí prvého roku života narodených od HIV pozitívnej matky. Metóda je jediná cesta spoľahlivé určenie stavu dieťaťa.

PCR na diagnostiku hepatitídy

Metóda polymerázovej reťazovej reakcie umožňuje odhaliť DNA vírusu hepatitídy A, B, C dlho pred tvorbou protilátok proti infekcii alebo nástupom príznakov ochorenia. Analýza PCR na hepatitídu C je obzvlášť účinná, pretože v 85% prípadov je toto ochorenie asymptomatické a bez včasnej liečby prechádza do chronického štádia.



Včasná detekcia patogénu pomôže vyhnúť sa komplikáciám a dlhodobej liečbe.

Komplexné vyšetrenie PCR

Komplexná PCR analýza: vyšetrenie metódou polymérnej reťazovej reakcie, ktorá zahŕňa stanovenie viacerých typov infekcií súčasne: mycoplasma genitalium, mycoplasma hominis, gardnerella vaginalis, candida, Trichomonas, cytomegalovírus, herpes typu 1 a 2, kvapavka, papilomavírus. Cena takejto diagnostiky sa pohybuje od 2000 do 3500 rubľov. v závislosti od kliniky, použitých materiálov a zariadení, ako aj od typu analýzy: kvalitatívna alebo kvantitatívna. Čo je potrebné vo vašom prípade - lekár rozhodne. V niektorých prípadoch stačí len určiť prítomnosť patogénu, v iných, napríklad pri infekcii HIV, hrá dôležitú úlohu kvantitatívny titer. Pri diagnostikovaní všetkých vyššie uvedených patogénov sa vyšetrenie nazýva „analýza PCR-12“.

Dešifrovanie výsledkov analýzy

Dešifrovanie analýzy PCR nie je ťažké. Existujú iba 2 stupnice indikátora - " pozitívny výsledok“ a „negatívny výsledok“. Pri zistení patogénu môžu lekári s 99% istotou potvrdiť prítomnosť ochorenia a začať s liečbou pacienta. Pri kvantitatívnej metóde stanovenia infekcie bude príslušný stĺpec indikovať číselný ukazovateľ zistených baktérií. Len lekár môže určiť stupeň ochorenia a predpísať potrebnú liečbu.



V niektorých prípadoch, napríklad pri určovaní infekcie HIV pomocou PCR, s negatívnym výsledkom, je potrebné vykonať ďalšie vyšetrenia na potvrdenie získaných ukazovateľov.

Kde vziať analýzu?

Kde urobiť analýzu PCR: na verejnej klinike alebo v súkromnom laboratóriu? Bohužiaľ, v mestských zdravotníckych zariadeniach sú zariadenia a metódy často zastarané. Preto je lepšie dať prednosť súkromným laboratóriám s moderným vybavením a vysoko kvalifikovaným personálom. Navyše v súkromnej klinike získate výsledky oveľa rýchlejšie.

V Moskve mnoho súkromných laboratórií ponúka analýzu PCR na rôzne infekcie. Napríklad na klinikách ako Vita, Komplexná klinika, Šťastná rodina, Uro-Pro sa vykonáva analýza PCR. Cena vyšetrenia je od 200 rubľov. na identifikáciu jedného patogénu.

Možno konštatovať, že diagnostika infekčných ochorení pomocou PCR je vo väčšine prípadov rýchlym a spoľahlivým spôsobom detekcie patogénu v tele v počiatočných štádiách infekcie. V určitých prípadoch však stojí za to zvoliť iné diagnostické metódy. Len odborník môže určiť potrebu takejto štúdie. Dešifrovanie PCR analýzy si tiež vyžaduje profesionálny prístup. Postupujte podľa pokynov lekára a nerobte testy, ktoré nepotrebujete.