Punkcia regionálnych lymfatických uzlín
Koža nad lymfatickými uzlinami je ošetrená 96% alkoholom a 3-5% alkoholovým roztokom jódu. Potom 1 a 2 prsty ľavej ruky fixujú lymfatickú uzlinu. Pravá ruka vezmite sterilnú injekčnú striekačku s niekoľkými kvapkami izotonického roztoku chloridu sodného, ktorý sa vstrekuje paralelne pozdĺžna os lymfatická uzlina. Ihla sa zatlačí rôznymi smermi na opačnú stenu kapsuly uzla a obsah striekačky sa pomaly vstrekuje. Prstami ľavej ruky sa zľahka masíruje lymfatická uzlina. Pri pomalom vytiahnutí ihly sa piest injekčnej striekačky súčasne vysunie a nasaje obsah lymfatickej uzliny. Materiál sa nanesie na podložné sklíčko (s malým množstvom hmoty sa pridá kvapka izotonického roztoku chloridu sodného), prikryté krycím sklom. Štúdium natívneho liečiva sa uskutočňuje v tmavom zornom poli pomocou svetelno-optického mikroskopu s kondenzorom v tmavom poli (objektív 40, 7x, 10x alebo 15x). Bledé treponémy možno nájsť aj vo farbených prípravkoch. Pri farbení podľa Romanovského-Giemsa sa bledé treponémy farbia na ružovo, podľa Fontana a Morozova na hnedo (čierno), podľa Burriho metódy sa na tmavom pozadí zisťujú nefarbené treponémy.Sérologická diagnostika
Význam pri diagnostike syfilisu, hodnotení účinnosti liečby, stanovení kritéria na vyliečenie, identifikácii skrytých, odolné formy pripojený k štandardným (klasickým) a špecifickým sérologickým reakciám. Štandardné alebo klasické sérologické testy (SSR) zahŕňajú:- Wassermanova reakcia (RV),
- sedimentárne reakcie Kahna a Sachs-Vitebského (cytocholické),
- reakcia na skle (expresná metóda),
- imobilizačná reakcia treponema pallidum (RIBT),
- imunofluorescenčná reakcia (RIF).
Wassermanova reakcia (RV)
- vyvinul A. Wasserman spolu s A. Neisserom a C. Bruckom v roku 1906. Wassermanova reakcia je založená na fenoméne fixácie komplementu (Borde-Ganguova reakcia) a umožňuje stanovenie antilipidových protilátok (reaginov). Podľa moderné nápady, pri Wassermanovej reakcii sa stanovujú protilátky proti lipidom makroorganizmov a nie bledý treponém a reakcia odhaľuje autoimunitný proces, ktorý je spôsobený denaturáciou tkanív makroorganizmov svetlými treponémami s tvorbou lipoproteínového komplexu (konjugátu), pri ktorom lipidy (haptény) sú determinantom.Zvyčajne sa RV umiestňuje s dvoma alebo tromi antigénmi. Najčastejšie sa používa vysoko citlivý kardiolipínový antigén (extrakt z hovädzieho srdca obohatený o cholesterol a lecitín) a treponémový antigén (sonifikovaná suspenzia anatogénneho kultivovaného treponema pallidum). Spolu s reaginami z krvného séra pacienta tvoria tieto antigény imunitný komplex schopný adsorbovať a viazať komplement. Na vizuálne stanovenie vytvoreného komplexu (reagins + antigén + komplement) sa ako indikátor používa hemolytický systém (zmes baraních erytrocytov s hemolytickým sérom). Ak je komplement naviazaný v 1. fáze reakcie (reaginuje + antigén + komplement), nedochádza k hemolýze - erytrocyty sa vyzrážajú na ľahko znateľný precipitát (PB pozitívny). Ak komplement nie je naviazaný vo fáze 1 kvôli absencii reaginov v testovacom sére, bude použitý hemolytickým systémom a dôjde k hemolýze (PB negatívna). Stupeň závažnosti hemolýzy v prostredí RV sa odhaduje pomocou plusov: úplná absencia hemolýzy ++++ alebo 4+ (RV výrazne pozitívna); sotva začatá hemolýza +++ alebo 3+ (PB pozitívna); významná hemolýza ++ alebo 2+ (PB slabo pozitívny); nezrozumiteľný obraz hemolýzy ± (RV pochybná); úplná hemolýza - (Wassermannova reakcia je negatívna).
Okrem kvalitatívneho hodnotenia RV existuje kvantitatívna formulácia s rôznymi riedeniami séra (1:10, 1:20, 1:80, 1:160, 1:320). Titer reaginov je určený maximálnym zriedením, ktoré stále dáva výrazne pozitívny (4+) výsledok. Kvantitatívna formulácia RV je dôležitá pri diagnostike niektorých klinických foriem syfilitickej infekcie, ako aj pri monitorovaní účinnosti liečby. V súčasnosti sa Wassermanova reakcia uskutočňuje pomocou dvoch antigénov (kardiolipín a treponémový kmeň Reiter). Spravidla sa RV stáva pozitívnou 5-6 týždňov po infekcii u 25-60% pacientov, po 7-8 týždňoch - u 75-96%, po 9-19 týždňoch - u 100%, hoci v r. posledné roky niekedy skôr či neskôr. Súčasne sa titer reaginov postupne zvyšuje a dosahuje maximálnu hodnotu (1:160-1:320 a viac) v prípade výskytu generalizovaných vyrážok (sekundárny čerstvý syfilis). Keď je RV pozitívna, stanoví sa diagnóza primárneho séropozitívneho syfilisu.
So sekundárnym čerstvým a sekundárny recidivujúci syfilis, RV je pozitívna u 100 % pacientov, ale negatívny výsledok môže byť pozorovaný u imunokompromitovaných pacientov s podvýživou. Následne titer reaginov postupne klesá a pri sekundárnom recidivujúcom syfilise zvyčajne nepresahuje 1:80-1:120.
S terciárnym syfilisom RV je pozitívna u 65-70% pacientov a zvyčajne sa pozoruje nízky titer reaginov (1:20-1:40). S neskorými formami syfilisu (syfilis vnútorné orgány, nervový systém) pozitívna RV sa pozoruje v 50 – 80 % prípadov. Reaginový titer sa pohybuje od 1:5 do 1:320.
S latentným syfilisom pozitívna RV sa pozoruje u 100 % pacientov. Reaginový titer je od 1:80 do 1:640 a pri neskorom latentnom syfilise od 1:10 do 1:20. Rýchly pokles titra reaginov (až do úplnej negativity) počas liečby naznačuje účinnosť liečby.
Nevýhody Wassermannovej reakcie- nedostatok citlivosti počiatočná fáza primárny syfilis je negatívny). Negatívny je aj u 1/3 pacientov, ak boli v minulosti liečení antibiotikami, u pacientov s terciárne aktívnym syfilisom s léziami kože a slizníc, osteoartikulárneho aparátu, vnútorných orgánov, centrálneho nervového systému, s neskorým vrodeným syfilisom .
Nedostatok špecifickosti- Wassermanova reakcia môže byť pozitívna u osôb, ktoré predtým neboli choré a netrpia syfilisom. Falošne pozitívne (nešpecifické) výsledky RV sa pozorujú najmä u pacientov, ktorí trpia systémovým lupus erythematosus, leprou, maláriou, malígnymi novotvarmi, poškodením pečene, rozsiahlymi infarktmi myokardu a inými ochoreniami a niekedy aj u úplne zdravých ľudí.
Zisťuje sa krátkodobá falošne pozitívna Wassermanova reakcia u niektorých žien pred alebo po pôrode, u ľudí, ktorí zneužívajú drogy, po anestézii, požití alkoholu. Falošne pozitívna RV je spravidla slabo vyjadrená, často s nízkym titrom reaginov (1:5-1:20), pozitívna (3+) alebo slabo pozitívna (2+). Pri hromadných sérologických vyšetreniach je frekvencia falošne pozitívnych výsledkov 0,1-0,15%. Na prekonanie nedostatočnej citlivosti používajú nastavenie v chlade (Collardova reakcia) a zároveň sa nastavuje s inými sérologickými reakciami.
Sedimentárne reakcie Kahna a Sachsa-Vitebského
Wassermanova reakcia sa používa v kombinácii s dvoma sedimentárne reakcie (Kahn a Zaks-Vitebsky), pri výrobe ktorých sa pripravujú koncentrovanejšie antigény. Expresná metóda (mikroreakcia na skle) – týka sa lipidových reakcií a je založená na precipitačnej reakcii. Umiestňuje sa so špecifickým kardiolipínovým antigénom, ktorého 1 kvapka sa zmieša s 2-3 kvapkami študovaného krvného séra v jamkách špeciálnej sklenenej platne.Výhoda- rýchlosť získania odpovede (za 30-40 minút). Výsledky sa vyhodnocujú podľa množstva zrazeniny a veľkosti vločiek. Závažnosť je definovaná ako CSR – 4+, 3+, 2+ a negatívna. Treba poznamenať, že falošne pozitívne výsledky sa pozorujú častejšie ako pri RV. Expresná metóda sa spravidla používa pri hromadných vyšetreniach na syfilis, pri vyšetreniach v klinických diagnostických laboratóriách, somatických oddeleniach a nemocniciach. Na základe výsledkov expresnej metódy je diagnostika syfilisu zakázaná, jeho použitie u tehotných žien, darcov a tiež na kontrolu po liečbe je vylúčené.
Treponema pallidum imobilizačná reakcia (RIBT)
Treponema pallidum imobilizačná reakcia (RIBT)- navrhli v roku 1949 R.W.Nelson a M.Mayer. Je to najšpecifickejší diagnostický test na syfilis. Zložitosť a vysoké náklady na nastavenie však obmedzujú jeho aplikáciu. V krvnom sére pacientov sa stanovujú videošpecifické protilátky (imobilizíny), ktoré vedú k nehybnosti bledých treponémov v prítomnosti komplementu. Antigén je živý patogénny treponema pallidum izolovaný z králikov infikovaných syfilisom. Pomocou mikroskopu sa spočíta počet imobilizovaných (imobilizovaných) bledých treponémov a vyhodnotia sa výsledky RIBT: imobilizácia bledých treponém od 51 do 100 % je pozitívna; od 31 do 50% - slabo pozitívne; od 21 do 30% - pochybné; od 0 do 20 % - záporné.RIBT záleží kedy odlišná diagnóza na rozlíšenie falošne pozitívnych sérologických reakcií od reakcií spôsobených syfilisom. Stane sa pozitívnym neskôr ako RV, RIF a preto pre diagnostiku rôzne formy syfilis sa nepoužíva, aj keď v sekundárnom období syfilisu je pozitívny u 85-100% pacientov.
V terciárnom období syfilisu s poškodením vnútorných orgánov, pohybového aparátu a nervového systému je RIBT pozitívny v 98-100% prípadov ( RV je často negatívny).
Je potrebné mať na pamäti, že RIBT sa môže ukázať ako falošne pozitívny, ak sú v testovanom sére prítomné treponemocídne lieky (penicilín, tetracyklín, makrolity atď.), ktoré spôsobujú nešpecifickú imobilizáciu bledého treponému. Na tento účel sa krv na RIBT vyšetrí najskôr 2 týždne po ukončení antibiotík a iných liekov.
RIBT, podobne ako RIF, je počas liečby pomaly negatívny, preto sa počas liečby nepoužíva ako kontrola.
Imunofluorescenčná reakcia (RIF)
Imunofluorescenčná reakcia (RIF)- vyvinutý v roku 1954 A. Coonsom a prvýkrát použitý na diagnostiku syfilitickej infekcie Deaconom, Falcone, Harrisom v roku 1957. RIF je založený na nepriamej metóde stanovenia fluorescenčných protilátok. Antigénom pre staging sú tkanivovo patogénne svetlé treponémy fixované na podložných sklíčkach, na ktoré je nanesené testovacie sérum. Ak testovacie sérum obsahuje antitreponémové protilátky súvisiace s IgM a IgG, silne sa viažu na antigén – treponém, ktorý sa deteguje vo fluorescenčnom mikroskope pomocou protidruhového („anti-ľudského“) fluorescenčného séra.Výsledky RIF sa zohľadňujú intenzitou žiary bledého treponému v prípravku (žltozelená žiara). Pri absencii anti-treponemálnych protilátok v sére sa bledé treponémy nezistia. V prítomnosti protilátok sa zistí žiara bledého treponému, ktorej stupeň je vyjadrený v plusoch: 0 a 1+ - spätnú reakciu; od 2+ do 4+ - pozitívne.
RIF označuje skupinové treponémové reakcie a je umiestnený v riedení testovacieho séra 10-krát a 200-krát (RIF-10 a RIF-200). RIF-10 sa považuje za citlivejší, ale nešpecifické pozitívne výsledky často vypadávajú ako pri RIF-200 (má vyššiu špecificitu). zvyčajne RIF sa stáva pozitívnym skôr ako RW- pozitívny pri primárnom séronegatívnom syfilise u 80% pacientov, u 100% v sekundárnom období syfilisu, vždy pozitívny pri latentnom syfilise a v 95-100% prípadov pri neskorých formách a vrodenom syfilise.
RIF špecifickosť zvyšuje po predbežnej úprave testovaného séra sorbent-ultrazvukovým treponémovým antigénom, ktorý viaže skupinové protilátky (RIF - abs).
Indikácie pre staging RIBT a RIF- diagnostika latentného syfilisu na potvrdenie špecifickosti komplexu lipidových reakcií pri syfilitickej infekcii na základe pozitívnej RV. Pozitívne RIBT a RIF sú dôkazom latentného syfilisu. S falošne pozitívnym RV rôzne choroby(systémový lupus erythematosus, zhubné novotvary atď.) a ak sú opakované výsledky RIBT a RIF negatívne, naznačuje to nešpecifickú povahu RV. Podozrenie na neskoré syfilitické lézie vnútorných orgánov, muskuloskeletálneho systému, nervového systému v prítomnosti negatívnej RV u pacientov. Podozrenie na primárny séronegatívny syfilis, keď u pacientov s opakovanými štúdiami výtoku z povrchu erózie (vred), s punkciou zo zväčšených regionálnych lymfatických uzlín, sa nezistí bledý treponém - v tomto prípade je nastavený iba RIF - 10.
Pri vyšetrovaní jedincov s negatívnou RV ktorí mali dlhodobé sexuálne a domáce kontakty s pacientmi so syfilisom, vzhľadom na pravdepodobnú možnosť ich liečby v nedávnej minulosti antisyfilitickými liekmi, ktoré spôsobovali RV negatív. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA, ELISA - enzymelinked immunosorbent assay) - metódu vyvinul E.Engvall a kol., S.Avrames (1971). Podstata spočíva v kombinácii syfilitického antigénu adsorbovaného na povrchu pevného nosiča s protilátkou študovaného krvného séra a detekcii špecifického komplexu antigén-protilátka pomocou enzýmovo značeného protidruhového imunitného krvného séra. To vám umožňuje vizuálne vyhodnotiť výsledky ELISA podľa stupňa zmeny farby substrátu pôsobením enzýmu, ktorý je súčasťou konjugátu. Nespoľahlivé výsledky ELISA sa môžu vyskytnúť v dôsledku nedostatočného riedenia zložiek, porušenia teplotných a časových režimov, nejednotnosti pH roztokov, kontaminácie laboratórneho skla a nesprávnej techniky umývania nosiča.
Pasívna hemaglutinačná reakcia (RPHA)
Navrhnutý ako diagnostický test na syfilis T. Rathlev (1965.1967), T. Tomizawa (1966). Makromodifikácia reakcie sa nazýva TRHA, mikromodifikácia je MHA-TR, automatizovaná verzia je AMNA-TR, reakcia s polymočovinovými makrokapsulami namiesto erytrocytov je MSA-TR. Citlivosť a špecifickosť RPHA sú podobné ako RIBT, RIF, ale RPHA je menej citlivá v skorých formách syfilisu v porovnaní s RIF-abs a citlivejšia v neskorých formách s vrodeným syfilisom. RPGA sa dodáva v kvalitatívnych a kvantitatívnych verziách.Technika odberu krvi pre sérologické reakcie
Na výskum RV, RIF, RIBT sa krv z loketnej žily odoberá nalačno alebo najskôr 4 hodiny po jedle sterilnou injekčnou striekačkou alebo jednou ihlou (spádom). V mieste odberu sa pokožka vopred ošetrí 70% alkoholom. Striekačka a ihla sa majú prepláchnuť izotonickým roztokom chloridu sodného. 5-7 ml testovanej krvi sa naleje do čistej, suchej a studenej skúmavky. Na skúmavku sa nalepí čistý papierik s priezviskom pacienta, iniciálami, číslom anamnézy alebo ambulantnej karty, dátumom odberu krvi. Po odbere krvi sa skúmavka vloží do chladničky s teplotný režim+4°+8°С do nasledujúceho dňa. Nasledujúci deň sa sérum vypustí na výskum. Ak sa krv nepoužije nasledujúci deň, sérum sa musí zo zrazeniny vypustiť a uchovávať v chladničke maximálne 1 týždeň. Na výskum RIBT musí byť skúmavka špeciálne pripravená a sterilná. V prípade porušenia pravidiel odberu krvi na výskum môže mať nedodržanie podmienok za následok skreslenie výsledkov.Neodporúča sa odoberať krv na výskum po jedle, alkohole, rôzne lieky, po zavedení rôznych vakcín, počas menštruačný cyklus medzi ženami.
Na výskum expresnej metódy bola odobratá krv z končeka prsta, ako sa to robí pri odbere na ESR, ale krv sa odoberá o 1 kapiláru viac. Expresnú metódu možno uskutočniť aj s krvným sérom získaným venepunkciou. Ak sú potrebné krvné testy vo vzdialených laboratóriách, namiesto krvi sa môže poslať suché sérum (metóda suchých kvapiek). Za týmto účelom sa nasledujúci deň po odbere krvi oddelí sérum od zrazeniny a natiahne sa do sterilnej injekčnej striekačky v množstve 1 ml. Potom sa sérum naleje vo forme 2 samostatných kruhov na prúžok hrubého písacieho papiera (voskový papier alebo celofán) o veľkosti 6x8 cm.Na voľný okraj sa napíše priezvisko, iniciály subjektu a dátum odberu krvi. papier. Sérový papier je chránený pred priamym slnečným žiarením a ponechaný pri izbovej teplote do nasledujúceho dňa. Sérum zasychá vo forme malých kruhov lesklého žltkastého sklovitého filmu. Potom sa papierové prúžky so sušeným sérom zrolujú ako farmaceutický prášok a odošlú sa do laboratória s uvedením diagnózy a za akým účelom sa skúma.
Sérologická rezistencia
U časti (2 % a viac) pacientov so syfilisom aj napriek plnohodnotnej antisyfilitickej terapii dochádza po ukončení liečby k spomaleniu (absencii) negatívnych sérologických reakcií až na 12 a viac mesiacov. Existuje takzvaná sérologická rezistencia, ktorá sa v posledných rokoch často pozoruje. Existujú formy sérologickej rezistencie:- Pravda(absolútna, bezpodmienečná) - je potrebné vykonať dodatočnú antisyfilitickú liečbu kombinovanú s nešpecifickou terapiou na zvýšenie imunitných síl tela.
- Relatívna- po úplnej liečbe sa z bledých treponémov tvoria cysty alebo L-formy, ktoré sú v tele v nízkovirulentnom stave a v dôsledku toho dodatočná liečba nemení ukazovatele sérologických reakcií, najmä RIF a RIBT.
Pseudoodolnosť- po liečbe sa napriek pozitívnym sérologickým reakciám v tele nevyskytuje bledý treponém. V tele nie je žiadny antigén, ale pokračuje tvorba protilátok, ktoré sa fixujú pri nastavení sérologických reakcií.
Sérologická rezistencia sa môže vyvinúť v dôsledku:
- nedostatočná liečba bez zohľadnenia trvania a štádia ochorenia;
- nedostatočná dávka a najmä v dôsledku nezohľadnenia telesnej hmotnosti pacientov;
- porušenie intervalu medzi zavedením liekov;
- zachovanie bledých treponémov v tele napriek plnohodnotnému špecifická liečba, kvôli ich rezistencii na penicilín a iné chemoterapeutické lieky v prítomnosti skrytých, encystovaných lézií vo vnútorných orgánoch, nervovom systéme, lymfatické uzliny, ktoré sú neprístupné antibakteriálne lieky(často sa bledé treponémy nachádzajú v tkanivách jazvy mnoho rokov po ukončení terapie, v lymfatických uzlinách je niekedy možné zistiť bledé treponémy 3-5 rokov po antisyfilitickej liečbe);
- zníženie ochranných síl pri rôznych chorobách a intoxikáciách (endokrinopatia, alkoholizmus, drogová závislosť atď.);
- celková vyčerpanosť (stravovanie chudobné na vitamíny, bielkoviny, tuky).
- sprevádzajúci nešpecifické ochorenia vnútorné orgány, poruchy kardiovaskulárneho systému, reumatizmus, dysfunkcie endokrinného a nervového systému, ťažké chronické dermatózy, zhubné novotvary;
- lézie nervového systému (ťažké zranenia, otras mozgu, duševná trauma);
- tehotenstva chronické intoxikácie alkohol, nikotínové drogy; infekčné choroby (malária, tuberkulóza, vírusová hepatitída, úplavica, týfus, týfus a recidivujúca horúčka).
Laboratórna diagnostika používa niekoľko testov na syfilis naraz na získanie čo najpresnejšieho výsledku. Trvá to dlhšie, ale dáva najpresnejšiu odpoveď.
Najčastejšie je výsledok analýzy RIF prezentovaný v číslach. Dešifrovanie má nasledujúce označenia:
- ostrý pozitívny výsledok označené 4 plusmi (++++);
- pozitívny výsledok je označený 3 plusmi (+++);
- slabo pozitívny výsledok 2 plusy (++);
- pochybný výsledok 1 plus (+);
- negatívny výsledok je označený 1 mínus (-).
Výsledok RIF pre syfilis je tiež prezentovaný ako percento, ktoré závisí od kvantitatívneho ukazovateľa pridružených baktérií:
- s negatívnym výsledkom imobilizácia do 20%;
- so slabo pozitívnym výsledkom sa imobilizácia pohybuje od 20 do 50%;
- pri pozitívnom výsledku je imobilizácia nad 50 %.
Ak je výsledok pozitívne odpoveď, uvádza prítomnosť choroby.
Ak výsledok slabo pozitívne znamená to jedno množstvo zvyškových protilátok v krvi.
Negatívne výsledok naznačuje absenciu bledého treponému, čo znamená, že pacient je zdravý.
Skúsení lekári našej kliniky diagnostikujú syfilis rýchlo a s vysokou presnosťou odčítania. Preto sme sociálne orientovaní na všetky vrstvy obyvateľstva náklady na analýzu RIF sú lacné. Cena je uvedená v tabuľke na našej stránke.
Pri sérologickej diagnostike syfilisu je veľmi dôležité získať spoľahlivý a presný výsledok.
Na zlepšenie kvality údajov sa prijímajú určité opatrenia:
- Testovacie sérum sa zriedi 200-krát (1:200), aby sa predišlo falošne pozitívnym reakciám. Potom hovoria, že to prebieha analýza na syfilis RIF 200.
- V inej verzii sa pri riedení séra 1:5 dodatočne používa špeciálny absorbent, ktorý na seba zbiera protilátky „navyše“, aby neskresľovali výsledky.
Do karát výskumníkom hrajú aj veľkosti treponém. Veľké mikrobiálne telá spirochét sú jasne viditeľné pod fluorescenčnou mikroskopiou. Ak sú „naviazané“ na fosforom značené proteíny zo séra. Použitie štandardizovaného antigénu a séra umožňuje maximalizovať senzitivitu a špecifickosť RIF pri diagnostike syfilisu.
Možnosti súkromnej analýzy RIF: absorpcia RIF
Jeden z alternatívne spôsoby nazývané RIF-Abs. Od bežnej techniky sa líši nízkym riedením študovaného séra - 1:5 oproti 1:200, ako obvykle.
Koncentrovaná vzorka obsahuje veľa aktívnych proteínových molekúl.
Na zabránenie a zvýšenie citlivosti je sérum ošetrené špeciálnym absorbentom z fragmentov syfilitických spirochét. Sorbent na sebe zbiera nadmerne aktívne protilátky a potom sa vzorka ošetrí priemyselným, fosforom značeným sérom. Vďaka tejto predbežnej príprave sú eliminované všetky nepotrebné molekuly, ktoré by mohli ovplyvniť výsledky testu.
Uviedli to podľa nasledujúcich indikácií:
- Pozitívne na pozadí klinickej pohody a absencie rizík infekcie v anamnéze.
- Pozitívna RV u pacientov s chronickými ochoreniami.
- Negatívna RV, keď sa objavia príznaky podozrivé zo syfilisu.
Prvé pozitívne výsledky sa objavia už 15-16 dní po infekcii. Ak sa pozitívna reakcia stane negatívnou, signalizuje to úplné vyliečenie syfilisu. Pravdepodobnosť falošne pozitívneho výsledku je menšia ako 0,4 %.
Táto situácia môže nastať pri vyšetrovaní onkologických pacientov, alkoholikov, tehotných žien a ľudí trpiacich poruchami imunity.
Určitý podiel pripadá na technické chyby, keďže výroba je pomerne komplikovaná. Existujú prípady, kedy je potrebné odlíšiť vrodenú patológiu od získanej. Môžete to urobiť, ak budete hľadať odlišné typy protilátky v krvi pacienta.
Protilátky proti syfilisu triedy M (IgM) sa objavujú krátko po infekcii a sú oveľa rýchlejšie ako IgG. Umožňuje vám ich identifikovať analýza absorpcie RIF syfilisom IgM. Ak sú výsledky tejto reakcie pozitívne, potom môžeme hovoriť o nedávnej infekcii. Takže prípady reinfekcie možno odlíšiť od relapsu alebo je možné zistiť infekciu dieťaťa po pôrode.
Na základe výsledkov tejto metódy analýzy RIF tiež dospeli k záveru, že liečba včasného syfilisu je účinná.
Ak máte podozrenie na syfilis, obráťte sa na skúseného venerológa.
Syfilis je sprevádzaný mnohými príznakmi a má veľké množstvo klinické formy. Jeho rozpoznanie je založené na komplexnom klinickom a laboratórnom vyšetrení pacienta. Všeobecná analýza krv na syfilis nesie málo informácií, preto sa nepoužíva na diagnostiku ochorenia.
Na analýzu je možné použiť tieto materiály:
- krv z prsta a žily;
- likér - cerebrospinálna tekutina;
- odnímateľný tvrdý chancre (vred);
- oblasti regionálnych lymfatických uzlín.
Výber materiálu a diagnostická metóda závisí od štádia ochorenia. O tom, aké testy sa robia na syfilis, si povieme v ďalšej časti.
Klasifikácia metód laboratórnej diagnostiky ochorenia
V počiatočnom štádiu môžete použiť bakterioskopickú metódu založenú na stanovení patogénu - bledého treponému - pod mikroskopom. V budúcnosti sú široko používané sérologické testy založené na stanovení mikrobiálnych antigénov a protilátok produkovaných telom v biologickom materiáli.
Bakteriologický výskum sa nevykonáva, pretože pôvodca syfilisu rastie na živných pôdach v umelých podmienkach veľmi zle.
Všetky metódy na detekciu treponému, to znamená typy testov na syfilis, sú rozdelené do dvoch veľkých skupín:
1. Priame, ktoré priamo detegujú samotný mikrób:
- mikroskopia v tmavom poli (detekcia treponému na tmavom pozadí);
- RIT-test - infekcia králikov testovaným materiálom;
- polymeráza reťazová reakcia(PCR), ktorá deteguje časti genetického materiálu mikroorganizmu.
2. Nepriame (sérologické), založené na detekcii protilátok proti mikróbom, ktoré telo produkuje ako odpoveď na infekciu.
Sérologické testy sú rozdelené do dvoch skupín
Netreponemálne:
- reakcia fixácie komplementu s kardiolipínovým antigénom (RSKk);
- mikroprecipitačná reakcia (RMP);
- rýchly plazmatický reagin test (RPR);
- test s toluidínovou červenou.
Treponém:
- reakcia fixácie komplementu s treponémovým antigénom (RSKt);
- imobilizačná reakcia treponému (RIT alebo RIBT);
- imunofluorescenčná reakcia (RIF);
- reakciu pasívna hemaglutinácia(RPGA);
- enzýmová imunoanalýza (ELISA);
- imunoblotovanie.
Metódy týchto analýz sú pomerne zložité, preto sa zameriame najmä na to, kedy sa vykonávajú a nakoľko presné informácie poskytujú.
Povedzme hneď, že základom diagnostiky syfilisu sú sérologické metódy. Aký je názov testu na syfilis: v každom prípade môže vyšetrenie zahŕňať rôzne techniky. Nižšie si ich popíšeme podrobnejšie.
Priame testy
Ich detekcia pod mikroskopom presvedčivo dokazuje prítomnosť treponému. Pravdepodobnosť syfilisu v tomto prípade dosahuje 97%. Mikróby sa však dajú zistiť len u 8 pacientov z 10, takže negatívny test ochorenie nevylučuje.
Diagnóza sa vykonáva v obdobiach, keď je tvrdá pálenka alebo kožná vyrážka. Pri vypúšťaní týchto infekčných prvkov hľadajú patogény.
Efektívnejšie, ale aj drahšie a komplexná analýza– detekcia treponémov po ich predbežnom ošetrení fluorescenčnými protilátkami. Sú to látky, ktoré sa „lepia“ na mikróby a vytvárajú ich „žiaru“ v poli mikroskopu.
Citlivosť metód klesá s dlhým trvaním ochorenia, liečbou vredov a vyrážok antiseptikami, ako aj po liečbe.
Biologická metóda diagnostiky RIT je vysoko špecifická, ale nákladná a výsledok sa získa iba prostredníctvom na dlhú dobu keď sa u infikovaného zvieraťa vyvinie choroba. V súčasnosti sa metóda prakticky nepoužíva, aj keď je prakticky najpresnejšia zo všetkých. Vynikajúci krvný test na syfilis na detekciu genetického materiálu treponému - PCR. Jeho jediným obmedzením sú relatívne vysoké náklady na diagnostiku.
Sérologické metódy
Netreponemálne testy
RSKk a RMP
Najznámejším z týchto testov je Wassermanova reakcia. Toto je cesta rýchla diagnostika(rýchla analýza na syfilis), založená na podobnej reakcii protilátok z krvi chorého človeka na samotné treponémy a na kardiolipín získaný z hovädzieho srdca. V dôsledku tejto interakcie protilátok a kardiolipínu sa tvoria vločky.
V Rusku túto analýzu prakticky nepoužívaný. Nahradila ju mikroprecipitačná reakcia. Nevýhodou metódy je jej nízka špecifickosť. Falošne pozitívna analýza krv na syfilis sa nachádza pri tuberkulóze, krvných ochoreniach, systémovom lupus erythematosus, počas tehotenstva, po narodení dieťaťa, pri menštruačnom krvácaní a v mnohých iných prípadoch. Preto pri kladnom RW viac presné metódy diagnostika.
Po infekcii sa reakcia stáva pozitívnou po dvoch mesiacoch. So sekundárnym syfilisom je pozitívny takmer u všetkých pacientov.
Mikroprecipitačná reakcia, ktorá nahradila Wassermannovu reakciu, má podobný mechanizmus. Je to lacné, ľahko sa vykonáva, rýchlo sa hodnotí, ale môže tiež poskytnúť falošne pozitívny výsledok. Tieto dva testy sa používajú ako skríningové testy.
RMP sa stáva pozitívnym jeden mesiac po objavení sa tvrdého škrečka. Na jeho realizáciu sa používa krv z prsta.
Môže byť test na syfilis nesprávny? Určite áno, najmä pri použití netreponémových testov.
Príčiny akútnych falošne pozitívnych testov pri použití RMP:
- akútne infekčné choroby;
- zápal pľúc;
- infarkt myokardu;
- mŕtvica;
- poranenia a otravy.
Chronické falošne pozitívne výsledky sa často vyskytujú pri nasledujúcich ochoreniach:
- tuberkulóza;
- brucelóza;
- leptospiróza;
- sarkoidóza;
- reumatické ochorenia;
- Infekčná mononukleóza;
- zhubné nádory;
- cukrovka;
- cirhóza pečene a iné.
Ak existujú kontroverzné analýzy, na objasnenie diagnózy sa používajú treponemálne sérologické testy.
RPR a test toluidínovej červene
Rýchly plazmatický reagin test (rpr syfilisový test) je ďalším typom reakcie s kardiolipínovým antigénom. Používa sa v nasledujúcich prípadoch:
- skríning populácie;
- podozrenie na syfilis;
- skríning darcov.
Spomíname aj test s toluidínovou červenou. Všetky tieto metódy sa používajú na hodnotenie účinnosti liečby. Sú semikvantitatívne, to znamená, že sa znižujú s zotavením a zvyšujú sa s recidívou infekcie.
Negatívne výsledky netreponemálnych testov s najväčšou pravdepodobnosťou naznačujú, že subjekt nemá syfilis. Preto sa na posúdenie vyliečenia používajú netreponémové testy. Prvá takáto analýza by sa mala vykonať 3 mesiace po ukončení liečby.
Treponemálne testy
Treponemové testy sú založené na použití treponemálnych antigénov, čo výrazne zvyšuje ich diagnostickú hodnotu. Uplatňujú sa v nasledujúcich situáciách:
- pozitívny skríningový test (reakcia mikroprecipitácie);
- rozpoznanie falošne pozitívneho výsledku skríningu;
- podozrenie na syfilis;
- diagnostika latentných foriem;
- retrospektívna diagnóza, keď pacient mal ochorenie skôr.
RIT a RIF
Najkvalitnejšie (vysoko citlivé a vysoko špecifické) sú RIT a RIF. Nevýhodou týchto metód je zložitosť, trvanie, potreba moderného vybavenia a vyškoleného personálu. U väčšiny vyliečených pacientov zostávajú treponémové testy pozitívne po mnoho rokov, a preto ich nemožno použiť ako kritérium na vyliečenie.
RIF sa stáva pozitívnym dva mesiace po infekcii. Ak je negatívny, pacient je zdravý, ak je pozitívny, pravdepodobnosť ochorenia je vysoká.
RIT sa obzvlášť často používa u pacientov s pozitívnym karcinómom močového mechúra na vylúčenie alebo potvrdenie ochorenia. Je vysoko citlivý a umožňuje vám s veľkou presnosťou povedať, či má pacient syfilis alebo nie. Analýza sa však stáva pozitívnou až tri mesiace po infekcii.
Imunoblotting
Imunoblotting je ešte citlivejší ako RIF, ale menej citlivý ako RPHA. Používa sa zriedkavo, hlavne na diagnostiku novorodeneckého syfilisu.
Uvedené metódy nie sú vhodné na skríning, teda rýchle zistenie ochorenia, pretože sa stanú pozitívnymi neskôr ako mikroprecipitačná reakcia.
ELISA a RPHA
Moderné vysoko informatívne štandardizované metódy diagnostiky syfilisu - ELISA a RPHA. Sú lacné, rýchlo sa inštalujú a testujú vo veľkých množstvách. Tieto testy sa môžu použiť na potvrdenie diagnózy.
Analýza RPHA sa stáva pozitívnou s primárnym séropozitívnym syfilisom, to znamená s objavením sa tvrdého škrečka (jeden mesiac po infekcii). Je cenná najmä pri diagnostike neskorých, a vrodené formy choroby. Na presnú diagnózu je však potrebné doplniť RPHA aspoň jedným netreponémovým a jedným treponémovým testom. Takýto trojitý test je najspoľahlivejšou analýzou na syfilis. Nevýhodou RPGA je zachovalosť pozitívna reakcia na dlhú dobu, čo neumožňuje použiť test ako kritérium vyliečenia.
Test ELISA na syfilis sa stáva pozitívnym už tri týždne po ochorení. Nevýhodou ELISA je, že môže byť falošná. Falošne pozitívna reakcia nastáva, keď systémové ochorenia, metabolické poruchy, ako aj u detí narodených chorým matkám.
Nedostatky sérologické metódy viedli k vývoju najpokročilejších metód, ktoré nedávajú chyby, ale zatiaľ sú drahé a zriedka používané - plynová chromatografia a hmotnostná spektrometria.
Algoritmus na diagnostiku syfilitickej infekcie v rôznych štádiách
V primárnom séronegatívnom období (do 2 mesiacov po infekcii) sa hľadá treponém v tmavom poli alebo pomocou fluorescenčných protilátok.
Pri primárnom séropozitívnom, sekundárnom a latentnom syfilise sa používajú RMP a ELISA a ako potvrdzujúci test sa používa RPHA.
U pacientov s recidívami sekundárneho syfilisu sa skúmajú prvky vyrážky, snažiac sa z nich izolovať treponém na mikroskopické vyšetrenie.
V terciárnom období je RMP u tretiny pacientov negatívny. ELISA a RPHA sú pozitívne, ale nemusia naznačovať terciárny syfilis, ale predchádzajúce ochorenie. Slabo pozitívna analýza pravdepodobnejšie indikuje zotavenie ako terciárny syfilis.
Pri stanovení diagnózy „vrodený syfilis“ sa berie do úvahy prítomnosť ochorenia u matky, rozdiel v miere RMP u matky a dieťaťa, pozitívna ELISA a RPHA u novorodenca a imunoblotting.
Tehotné ženy musia byť vyšetrené na syfilis, najmä tie, ktoré už majú za sebou pôrod s mŕtvym plodom, nevyvíjajúce sa tehotenstvo, predčasné potraty. Vykonávajú RMP, ELISA, RPGA. Vyšetrenie na prítomnosť ochorenia a pred ukončením tehotenstva.
Pravidlá na získanie analýzy na syfilis
Ak chcete získať odporúčanie do laboratória, musíte navštíviť svojho obvodného lekára. Ak chcete test vykonať rýchlejšie, môžete to urobiť v súkromnom laboratóriu bez odporúčania (napríklad laboratóriá Invitro robia analýzu na syfilis rýchlo a anonymne).
Ako sa otestovať na syfilis? Krv sa podáva ráno, na prázdny žalúdok. Môžete piť iba čistú vodu.
Príprava: dva dni pred testom treba zo stravy vylúčiť mastné jedlá a najmä alkohol.
Ako prebieha analýza? obvyklým spôsobom z prsta alebo lakťovej žily.
Koľko sa robí test na syfilis? Výsledok testu je zvyčajne pripravený nasledujúci deň. Prepis možno odobrať od lekára alebo v laboratóriu.
Aká je platnosť analýzy? Až tri mesiace.
Analýza cerebrospinálnej tekutiny
V niektorých prípadoch sa na diagnostiku neurosyfilisu vykoná analýza CSF.
Toto vyšetrenie je predpísané pre všetkých pacientov s latentný syfilis ak majú príznaky patológie nervového systému, ako aj s latentným a neskorým neurosyfilisom.
Okrem toho sa analýza vykonáva u všetkých pacientov po zotavení pri zachovaní ich pozitívnych sérologických reakcií. V našom článku sme už písali, že tento jav sa stáva pomerne často.
Analýza CSF na syfilis predpisuje a vykonáva iba lekár.
Cerebrospinálny mok sa získava punkciou medzi dvoma stavcami bedrový. Odoberá sa po 4 ml do dvoch skúmaviek. Potom sa miesto vpichu ošetrí jódom a prekryje sterilným obväzom. Po punkcii by mal pacient ležať na bruchu so zdvihnutým koncom lôžka aspoň 3-4 hodiny, potom môže ležať na boku. Pokoj na lôžku po punkcii sa ukáže do dvoch dní.
Cerebrospinálny mok z prvej skúmavky sa vyšetruje pomocou všeobecne akceptovaných reakcií na obsah bielkovín, buniek a stanovenie príznakov meningitídy (zápal mozgových blán).
Cerebrospinálny mok z druhej skúmavky sa vyšetruje na obsah protilátok proti treponému pomocou Wassermanovej reakcie, RMP, RIF a RIBT, o ktorých sme hovorili vyššie.
Podľa závažnosti porušení existujú štyri typy zmien v cerebrospinálnej tekutine. Pri ich analýze môže lekár dospieť k záveru, že existujú rôzne formy poškodenia nervového systému (vaskulárny neurosyfilis, syfilitická meningitída, meningovaskulárny syfilis, chrbtové kosti, neskorý mezenchymálny neurosyfilis), ako aj uzdravenie pacienta s pozitívnymi sérologickými testami.
veľkosť písma
NARIADENIE Ministerstva zdravotníctva ZSSR zo dňa 02-09-85 1161 O ZLEPŠENÍ SÉROLOGICKEJ DIAGNOSTIKY SYFILISU (spolu s POKYNMI PRE ... Relevantné v roku 2018
Spôsob nastavenia RIF - ABS
Testované krvné sérum
Krv na získanie krvného séra sa odoberie z kubitálnej žily do čistej a suchej skúmavky v objeme 5 ml a spracuje sa rovnakým spôsobom ako pri nastavení Wassermanovej reakcie. Krvné sérum sa inaktivuje raz pri teplote 56° na 30 minút. Vzhľadom na skutočnosť, že RIF-abs je umiestnený nesterilne, nie je potrebné použitie sterilných misiek a dodržiavanie podmienok sterility pri skladovaní krvných sér. Záleží len na dlhšom uchovávaní krvných sér pred štúdiou.
Ako antigén sa používa suspenzia patogénnych bledých treponém kmeňa Nichols zo 7-dňovej orchitídy králika. Zdravé samce králikov s negatívnymi výsledkami Wasserman a RIT sa infikujú intratestikulárne a pri výskyte orchitídy sa zo semenníkov odstránia bledé treponémy rovnakým spôsobom ako v prípade získania antigénu pre RIT. Výsledná suspenzia svetlých treponém sa naleje z kúskov semenníka do sterilných skúmaviek s vatovými zátkami a nechá sa v chladničke pri 4 ° na jeden deň, potom sa oddelí od sedimentu a skladuje sa za rovnakých podmienok po celú dobu. dobu používania.
Získanie a uskladnenie antigénu si vyžaduje dodržanie podmienok sterility, tk. s rovnakým antigénom môže byť reakcia zinscenovaná v priebehu 2-4 mesiacov. Pre antigén by sa mala zvoliť suspenzia, v ktorej nie je pozorovaná aglutinácia treponému a je ich dostatočné množstvo. Antigén je možné získať v ampulkách z iných laboratórií. Pred každou reakciou sa suspenzia dobre premieša a skúma sa pod mikroskopom s tmavým poľným kondenzátorom, aby sa určila jej hustota. Na nastavenie RIF-abs je potrebné mať v tmavom zornom poli suspenziu obsahujúcu 40-60 treponém, v prípade hustejšej suspenzie ju treba zriediť.
Ako sorbent pre RIF-abs možno použiť ultrasonifikovaný treponémový antigén pre RSK, ktorý vyrába podnik Kaunas na výrobu bakteriálnych prípravkov Ministerstva zdravotníctva ZSSR. Ide o ultrazvukom zničenú suspenziu zmesi kultivovaných bledých treponém kmeňov V, VII, VIII, IX a Reiter. Každá séria sorbentu sa musí pred použitím v RIF-ab na diagnostické účely titrovať.
Titrácia sorbentov
Sorbenty sa titrujú v krvných sérach pacientov so syfilisom, pričom poskytujú ostro (4+) a slabo (2+) pozitívny výsledok v RIF pri riedení 1: 5, ako aj v krvných sérach osôb bez syfilitickej infekcia s negatívnym výsledkom v RIF-5 a nešpecifická pozitivita (2+ alebo viac).
Príklad stanovenia titra sorbentu
Celý sorbent sa zriedi fosfátovým pufrom, pH = 7,2, 2, 3, 4 krát alebo viac. Pacientom so syfilisom sa odoberajú 3 krvné séra, z ktorých jedno dáva silne pozitívny (4+) výsledok na RIF-5, 2 - slabo pozitívne (2+) a 5 krvných sér od ľudí bez syfilitickej infekcie, z toho 3 dať nešpecifické výsledky a RIF-5 (2+ a viac). Všetky krvné séra sa zriedia 5-krát sorbentom zriedeným 2, 3, 4 alebo viackrát fosfátovým pufrom. Potom sa v reakcii skúma krvné sérum. Po zohľadnení výsledkov sa zvolí riedenie sorbentu, pri ktorom si sorbované krvné séra pacientov so syfilisom zachovávajú stupeň pozitivity podobnú tej získanej s krvnými sérami zriedenými fosfátovým pufrom a krvné séra osôb bez syfilitická infekcia nežiari. Toto riedenie sorbentu je jeho titrom.
Titer sorbentu bol v tomto prípade riedenie 1:3, pri ktorom si všetky krvné séra pacientov so syfilisom zachovali stupeň pozitivity získanej pri kontrole a zároveň nešpecifickú pozitivitu nesyfilitickej krvi. séra bolo spoľahlivo odstránené.
Protidruhové luminiscenčné sérum
Fluorochrómom značené krvné sérum zo zvierat imunizovaných ľudským sérovým proteínom je potrebné na štúdium ľudských krvných sér v RIF-abs. Lyofilizované luminiscenčné sérum sa rozpustí za sterilných podmienok v destilovanej vode v objeme uvedenom na štítku ampuliek, naleje sa do sterilnej skúmavky s gumenou zátkou a počas používania sa uchováva pri teplote 4°C 1-2 mesiace.
V deň reakcie sa potrebné množstvo tohto séra zriedi podľa titra destilovanou vodou. Pracovné riedenie séra uvedené na štítku nie je vhodné na nastavenie reakcie na účely sérodiagnostiky syfilisu, takže titer každej série sa musí stanoviť nanovo.
Tabuľka č.13
Výsledky titrácie sorbentu
| Testované krvné séra | Výsledky RIF-5 | |||
| Riedenie krvného séra tlmivého roztoku (K) 1:5 | Riedenie krvného séra 1: 5 sorbentu v riedení | |||
| 1: 2 | 1: 3 | 1: 4 | ||
| Krvné sérum pacienta so syfilisom | ||||
| N 1 | 4+ | 3+ | 4+ | 4+ |
| N 2 | 2+ | 1+ | 2+ | 2+ |
| N 3 | 2+ | 2+ | 2+ | |
| Nesyfilitické krvné sérum | ||||
| N 1 | 3+ | 1+ | 2+ | |
| N 2 | 2/3+ | 2+ | ||
| N 3 | 2+ | 2+ | ||
| N 4 | 2+ | 2+ | ||
| N 5 | ||||
Titrácia protidruhového luminiscenčného séra
Odoberajú 5 krvných sér od pacientov so syfilisom a 5 krvných sér od zdravých ľudí, 5-krát ich zriedia sorbentom (s prihliadnutím na jeho titer) a reagujú rôznymi riedeniami luminiscenčného séra vo fáze II proti ľudským sérovým globulínom radu, ktorého určuje sa titer. Malo by sa vziať do úvahy, že titer luminiscenčných sér v súčasnosti vyrábaných IEM. N.F. Gamalei, kolíše, keď je RIF-abs nastavený od 1: 100 do 1: 140. Keď sa vezme do úvahy reakcia, predbežný titer luminiscenčného séra by sa mal brať do úvahy, že zriedenie, keď sa použije s pozitívnym krvným sérom, dobrá žiara treponém a s negatívnou žiarou neprijatého antigénu. Vyššie riedenie luminiscenčného séra ako titer vedie k zníženiu citlivosti reakcie a menšie k zníženiu špecificity. Po určení predbežného titra by sa mal spresniť o viac pozitívne a negatívne krvné séra. Za konečný titer možno považovať ten, ktorý sa testuje na 100 krvných sérach, pričom aspoň 20 z nich by malo byť od pacientov so syfilisom.
Aby sa zabránilo klíčeniu po zriedení suchého luminiscenčného séra destilovanou vodou, je potrebné k nemu pridať mortiolát v pomere 1 objem jeho roztoku 1: 1000 na 9 objemov luminiscenčného séra. Pri užívaní nových ampuliek z tej istej série by sa mal titer skontrolovať a vyjasniť len pre 10 známych pozitívnych a negatívnych krvných sér.
Príklad stanovenia predbežného titra luminiscenčného protidruhového séra
Pripravte si 60 liekov, očíslujte ich od 1 do 60. Vezmite 10 krvných sér - 5 od pacientov so syfilisom, 5 od zdravých ľudí. Všetky krvné séra sa zriedia 5-krát zriedeným, ale titrovým sorbentom.
Na očíslované 1-10, 11-20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60 liečiv sa aplikuje v prvej fáze reakcie s rovnakými 10 krvnými sérami, zriedenými 5-krát sorbentom. Vo fáze II reakcie sa na 1-10 prípravkov aplikuje luminiscenčné sérum zriedené v pomere 1:100, 1:110 až 11-20, 1:120 až 21-30, 1:130 až 31-40, 1:130 až 41-50 : 140, na 51-60 - 1: 150.
Technika nastavenia RIF-abs
Prípravky sa pripravujú z antigénu na tenkých, dobre odtučnených podložných sklíčkach, na opačná strana ktoré kruhy s priemerom 0,7 cm sú označené sklenenou rezačkou (10 kruhov na 1 podložnom sklíčku). V rámci kruhu sa na sklo aplikuje antigénová suspenzia bledých treponém. Uzavretý koniec Pasteurovej pipety krúživým pohybom suspenzia sa rozdelí do kruhu, vysuší sa na vzduchu a fixuje sa 10 minút v chemicky čistom acetóne. Potom sú lieky očíslované. Inaktivované testovacie krvné séra sa zriedia 5-krát sorbentom zriedeným v titre s tlmivým roztokom. Do stojana sa umiestni niekoľko skúmaviek, ktorých počet a počet zodpovedá počtu a počtu testovaných krvných sér. Sorbent zriedený titrom sa naleje do skúmaviek s pipetou v 0,2 ml, potom sa pridá 0,05 ml celého testovacieho krvného séra a dobre sa premieša. Riedenie krvného séra sa môže uskutočniť pomocou Florinskyho prístroja. Krvné sérum zriedené sorbentom sa nanesie na antigén tak, aby rovnomerne pokrylo náter, a prípravky sa umiestnia do vlhkej komory, ktorá sa uzavrie vekom a umiestni sa na 30 minút do termostatu pri 37° (I reakčná fáza ). Po prvej fáze sa preparáty opatrne premyjú v 2 dávkach fosfátového tlmivého roztoku a preparáty sa umiestnia na 10 minút do druhej dávky, vysušia sa, potom sa opäť umiestnia do vlhkej komory, aplikuje sa luminiscenčné sérum zriedené v titre a nechá sa 30 minút pri teplote miestnosti (reakcie fázy II). Na konci druhej fázy sa prípravky premyjú fosfátovým pufrom, ako je opísané vyššie, vysušia sa a po kvapkách sa nanesú na povrch náterov neluminiscenčný imerzný olej (dimetylftalát).
Vyšetrenie preparátov sa vykonáva vo fluorescenčnom mikroskope s ortuťovo-kremennou výbojkou DRSh-250 s imerzným systémom, okulárom 4X alebo 5X, filtrami SZS-7 alebo 14, FS-1. BS-8 a ZhS-18 alebo T-2N. Reakcia sa zohľadňuje hodnotením žiary svetlého treponému. V RIF-abs sa krvné séra považujú za pozitívne, ktoré dávajú žiaru na 4+, 3+ a 2+. Brilantná zeleno-žltá žiara je hodnotená 4+, jasná - 3+, slabá žiara 2+. Krvné séra sa považujú za negatívne, ak dávajú žiaru 1+ (treponémy v prípravku sú zafarbené intenzívnejšie ako pozadie) alebo ju nedávajú.
V každej formulácii RIF-abs sa musia použiť nasledujúce kontroly:
Ostrá pozitívna kontrola. Krvné sérum pacienta so syfilisom, ktoré pri 5-násobnom zriedení pufrom poskytuje žiaru 4+. Pri 5-násobnom zriedení sorbentom by krvné sérum nemalo stratiť stupeň pozitivity o viac ako 1+.
Slabá pozitívna kontrola. Plné alebo zriedené krvné sérum pacienta so syfilisom so slabým stupňom luminiscencie antigénu 2+ pri 5-násobnom zriedení pufrom. Pri zriedení sorbentom by sa mala zachovať jeho pozitivita.
nešpecifická kontrola. Nesyfilitické krvné sérum, ktoré po zriedení pufrom poskytuje fluorescenciu aspoň 2+. Pri zriedení sorbentom treba eliminovať jeho pozitivitu.
Kontroly antigénu, sorbentu, luminiscenčného séra je možné nastaviť len pri použití novej série týchto zložiek.
Spôsob nastavenia RIF-abs kapilárnou krvou
Nastavenie RIF-abs je možné nielen pomocou krvného séra, ale aj krvi odobranej z prsta. Táto modifikácia RIF-ab sa môže použiť pri vyšetrovaní detí na syfilis, keď je ťažké získať krv zo žily u dospelých a pri hromadnom skríningu rôznych kontingentov na syfilis.
Pri nastavovaní RIF-abs krvou sa používajú rovnaké reakčné zložky ako pri nastavovaní RIF-abs krvným sérom (antigén, sorbent, luminiscenčné sérum). Titer luminiscenčného séra sa určuje podľa vyššie uvedenej schémy, ale pri nastavení reakcie s krvou. Po prepichnutí prsta pacienta sa krv na vyšetrenie odoberie mikropipetou po značku 0,1 ml, rýchlo sa vfúkne do skúmavky s 0,3 ml destilovanej vody, dôkladne sa premieša pipetou a prefiltruje sa cez papierový filter navlhčený destilovanou vodou. . Nastavenie reakcie so zriedenou krvou je možné v deň odberu a po 1-2 dňoch za predpokladu, že sa uchováva pri 4 °.
Bezprostredne pred nastavením reakcie sa ku všetkým vzorkám krvi zahrnutým do nastavenia reakcie pridá 0,1 ml celého sorbentu, premieša sa pipetou a pretrepe sa a umiestni sa do termostatu pri 37° na 30 minút. Potom sa krv ošetrená sorbentom aplikuje na antigénové nátery a umiestni sa do vlhkej komory pri 37° (fáza 1 reakcie). Po uplynutí doby expozície sa prípravky premyjú v prvej dávke fosfátového pufra tak, aby na podložných sklíčkach nezostali žiadne stopy krvi, a umiestnia sa na 10 minút do druhej dávky pufra. Po vysušení náterov sa uskutoční druhá fáza reakcie. Súčasne sa na prípravky aplikuje luminiscenčné sérum proti ľudským globulínom zriedené podľa titra stanoveného pre túto modifikáciu RIF. Sklíčka vo vlhkej komore sú opäť umiestnené v termostate na 37°.
Po 30 minútach sa preparáty opäť premyjú v 2 dávkach fosfátového pufra počas 10 minút, vysušia sa a namontujú na fluorescenčnú mikroskopiu. Štúdium liekov a zaznamenávanie výsledkov reakcie sa uskutočňuje rovnakým spôsobom ako pri nastavení RIF-abs krvným sérom.
Spôsob nastavenia RIF-200
Spôsob nastavenia RIF-abs a RIF-200 sú si blízke. Pri nastavovaní RIF-200 sa spracovanie testovacieho krvného séra, príprava antigénu, príprava protidruhového luminiscenčného séra a jeho titrácia vykonáva rovnakým spôsobom ako pri nastavovaní RIF-abs. Malo by sa vziať do úvahy len to, že titre luminiscenčného séra v súčasnosti vyrábaného v RIF-200 sa pohybujú od 1:20 do 1:50.
Technika nastavenia RIF-200
Testované krvné séra sa zriedia 200-krát fosfátovým pufrom. Na tento účel sa do stojana umiestnia 3 rady skúmaviek, ktorých počet a číslovanie v každom rade zodpovedá počtu a číslovaniu testovaných krvných sér v pracovnom denníku. V prvom rade sa nalejú do skúmaviek celé testovacie krvné séra, v druhom rade sa do skúmaviek naleje 0,45 ml tlmivého roztoku, v treťom rade 0,95 ml tlmivého roztoku. V druhom rade sa pripraví 10-násobné riedenie krvných sér, na ktoré sa odoberie 0,05 ml testovaného krvného séra z každej skúmavky prvého radu samostatnou 1 ml odmernou pipetou a prenesie sa do zodpovedajúcej skúmavky druhého radu. riadok a zmiešaný s tam dostupným pufrom. Z každej skúmavky druhého radu sa pomocou tej istej pipety prenesie 0,05 ml testovacieho krvného séra zriedeného 10-krát do zodpovedajúcej skúmavky tretieho radu a získa sa 200-násobné zriedenie.
Pri príprave reakcie na prípravky umiestnené vo vlhkej komore sa aplikuje testovacie krvné sérum zriedené 200-krát tak, aby ich čísla uvedené na skúmavkách zodpovedali číslam na podložných sklíčkach. Po aplikácii na prípravky krvného séra sa vlhká komora umiestni na 30 minút do termostatu s teplotou 37° (I fáza reakcie). Potom sa prípravky premývajú 10 minút v 2 dávkach pufra a sušia sa. Potom sa opäť umiestnia do vlhkej komory a na všetko sa aplikuje luminiscenčné sérum zriedené v titre (fáza II reakcie). Druhá fáza sa uskutočňuje 30 minút pri teplote miestnosti, potom sa preparáty 10 minút premývajú, sušia a namontujú na fluorescenčnú mikroskopiu.
Účtovanie výsledkov RIF-200 sa vykonáva rovnakým spôsobom ako RIF-abs.
V prípade, že sa lekári zaujímajú o titer fluorescenčných protilátok v krvnom sére pacienta, mali by sa použiť RIF-abs a RIF-200 so sériovým riedením testovaného krvného séra a titer fluorescenčných protilátok by sa mal považovať za najvyššie riedenie krvné sérum, ktoré stále dáva pozitívny výsledok reakcie. Je zvykom označovať titer ako číslo charakterizujúce stupeň zriedenia testovaného krvného séra, napríklad 5, 10, 20, 40 atď. (RIF-abs) alebo 200, 400, 800 atď. (RIF-200).
Pri nastavovaní oboch modifikácií reakcie na riedenie testovaných krvných sér a na premývanie prípravkov po fázach I a II je potrebné použiť fosfátový pufor zloženia: 1 l destilovanej vody, 6,8 g chloridu sodného, 1,48 g disubstituovaného fosforečnanu sodného, 0,43 g monosubstituovaného fosforečnanu draselného (PH = 7,2). Pripravený roztok sa uchováva pri izbovej teplote nie dlhšie ako týždeň.
Kvôli možnosti získania negatívnych výsledkov v prítomnosti fluorescenčných protilátok by sa krv a krvné sérum nemali vyšetrovať v RIF-abs a RIF-200 počas liečby pacientov penicilínom.
Technika nastavenia RIF-c
Naliehavým problémom v boji proti tejto chorobe je včasná diagnostika lézií nervového systému pri syfilise. Vzhľadom na to, že RIF-c je citlivejší ako všetky ostatné testy používané na diagnostiku syfilisu v CSF, možno túto modifikáciu RIF odporučiť na diagnostiku syfilitických lézií centrálneho nervového systému pri všetkých formách syfilisu.
Na stanovenie štádia RIF-c sa používa rovnaký antigén, luminiscenčné sérum, ako na stanovenie štádia RIF-abs a RIF-200 s krvným sérom. Stanovenie fluorescenčných protilátok v likvore a krvnom sére a registrácia reakcie sú tiež podobné.
Cerebrospinálny mok sa zavádza do reakcie neinaktivovaný a neporušený. Pred nastavením reakcie sa môže uchovávať v mraziacom priestore chladničky v skúmavkách pod gumenými zátkami až 2 týždne. Rozmrazovanie sa uskutočňuje pri izbovej teplote.
Technika nastavenia RIF-c
Vo fáze I reakcie sa na antigén aplikuje 0,05 ml nezriedeného testovaného cerebrospinálneho moku, prípravky sa umiestnia do vlhkej komory na 30 minút pri teplote miestnosti. Potom sa premývajú fosfátovým pufrom, pH = 7,2, počas 10 minút, sušia sa. Vo fáze II sa na preparáty aplikuje luminiscenčné sérum zriedené v titre, ktoré sa titruje pri nastavení reakcie s mozgovomiechovým mokom. Prípravky sa udržiavajú pri teplote miestnosti počas 30 minút vo vlhkej komore, premyjú sa, sušia a namontujú sa na fluorescenčnú mikroskopiu.
Zdroje chýb
1. Nedodržanie podmienok na prípravu, skladovanie činidiel a nastavenie reakcie.
2. Nízka kvalita luminiscenčného séra a nepresné stanovenie jeho titra.
3. Aplikácia testovaného materiálu alebo luminiscenčného séra pri nastavení reakcie nie na liek, ale na druhú stranu podložného sklíčka.
4. Nesprávne nastavenie osvetlenia vo fluorescenčnom mikroskope.
5. Nízka kvalita antigénu.
