PGR analizė (PGR diagnostika) prasideda nuo medžiagos rinkimo ginekologo, urologo ar dermatovenerologo apžiūrai. Vėliau gautų rezultatų kokybę, patikimumą užtikrina aukščiausia Euromedprestige medicinos centro gydytojų kvalifikacija ir didžiulė patirtis, kurie laikosi visų reikiamų taisyklių. PGR-analizė: visiškas sterilumas, vienkartinių medžiagų naudojimas.

Surinkta medžiaga iš teptuko dedama į indą su fiziologiniu tirpalu. Paėmus mėginius, mėginius reikia kuo greičiau pristatyti į PGR laboratoriją.

PGR analizė laboratorijoje vyksta trimis etapais:

1. DNR izoliacija
2. DNR fragmentų amplifikacija
3. DNR amplifikacijos produktų aptikimas

DNR išskyrimas yra pradinis PGR diagnostikos etapas, kurio esmė tokia: gydytojas paima iš paciento medžiagą tyrimams ir ją specialiai apdoroja. Apdorojimo metu DNR dviguba spiralė suskaidoma į atskiras grandines. Į paciento medžiagą įpilamas specialus skystis, kuris ištirpdo organines medžiagas, kurios trukdo reakcijos „grynumui“. Taip pašalinami lipidai, aminorūgštys, peptidai, angliavandeniai, baltymai ir polisacharidus. Rezultatas yra DNR arba RNR.

PGR metodo principas – „sukurti“ naujas DNR arba RNR infekcijas. To negalima padaryti nepašalinus ląstelinės medžiagos.

Laikas, praleistas DNR ekstrahavimui, priklauso nuo infekcijos sukėlėjo ir nuo PGR tyrimui naudojamos medžiagos tipo. Pavyzdžiui, paruošti kraują kitam žingsniui užtrunka 1,5–2 valandas.

0 Masyvas ( => Analizės) Masyvas ( => 2) Masyvas ( =>.html) 2

DNR amplifikacija

Atlikdami kitą DNR diagnostikos etapą – DNR amplifikaciją – gydytojai naudoja vadinamąsias DNR matricas – infekcijų DNR molekules, ant kurių vėliau vyks DNR „klonavimas“. Jau minėta, kad visos infekcijos DNR buvimas nebūtinas, šiai stadijai pakanka mažo DNR molekulės gabalėlio, būdingo tik šiam mikrobui (infekcijai).

DNR amplifikacijos ir atitinkamai viso PGR reakcijos principo esmė yra natūralus visų gyvų daiktų DNR užbaigimo procesas – DNR replikacija, kuri atliekama padvigubinant vieną DNR grandinę.

Pradėdamas nuo vieno DNR fragmento, laboratorijos gydytojas jį kopijuoja ir grandininės reakcijos metu padidina kopijų skaičių: po pirmo ciklo jau turite 2 fragmentus, po antro ciklo - 4, po trečio - 8, po ketvirto. - 16, tada 32 , 64, 128, 256... Su kiekvienu ciklu kopijų skaičius padvigubėja, o po dvidešimties ciklų skaičius išeina į milijonus, o po trisdešimties - į milijardus. Ciklas trunka keletą minučių ir sumažinamas iki tam tikro temperatūros režimo pokyčio labai mažame cheminiame reaktoriuje. Čia pakankamais kiekiais tirpale yra visi reikalingi sintezei komponentai, visų pirma nukleotidai A, G, T ir C, taip pat buvo atliktos smulkios paruošiamos cheminės operacijos, kad iš karto būtų padaryta tiksli kopija. kiekvienas baigtas DNR segmentas, tada iš šios kopijos - vėl kopija, tai yra šakotoji grandininė reakcija.

Prie DNR grandinės prijungus pradmenis – dirbtinai susintetintus DNR „gabalėlius“ (nukleotidų poras), panašius į mikrobų DNR (infekcija) – susidaro dvi trumpos, susidedančios iš dviejų DNR sekcijų grandinių, spiralės, kurios būtinos sintezei. ateities DNR.

Naujos grandinės sintezė vyksta užbaigiant kiekvieną iš dviejų DNR grandinių. Amplifikacijos procesas vyksta naudojant tam tikrą vietą - DNR polimerazę, kuri davė pavadinimą laboratoriniam metodui. Polimerazė veikia kaip reakcijos katalizatorius ir stebi nuoseklų nukleotidų bazių prisijungimą prie augančios naujos DNR grandinės.

Taigi DNR amplifikacija yra daugkartinis DNR kopijų, kurios yra specifinės, t.y. būdingos tik konkrečiam organizmui, skaičiaus padidėjimas. Norint pamatyti infekcijos sukėlėją, nereikia užbaigti visos DNR grandinės. Reikalinga tik ta sritis, kuri būdinga šiai bakterijai kaip individui.

5360 rub. Išsamios programos su gastroenterologu kaina

25% NUOLAIDA KARDIOLOGĖS PRIIMAME

- 25%pirminis
Gydytojo vizitas
savaitgalio terapeutas

5160 rub. vietoj 5 420 rublių. Vyrų tyrimas dėl urologinių infekcijų

ALERGOLOGIJA 5120 rub. vietoj 5590 rublių.

Visi daug kartų pasikartojantys stiprinimo etapai vyksta esant skirtingoms temperatūroms. PGR analizei naudojama specialiai programuojama įranga – PGR – termostatas arba stiprintuvas, kuris automatiškai keičia temperatūras. Amplifikacija atliekama pagal iš anksto nustatytą programą, atitinkančią aptiktos infekcijos tipą. Priklausomai nuo programos ir aptinkamos infekcijos tipo, automatinio PGR procesas trunka nuo 2 iki 3 valandų.

PGR diagnostikoje svarbų vaidmenį atlieka analizę atliekančio laboranto kvalifikacija, nuo to priklauso teisingas PGR įrangos nustatymas ir rezultatų interpretacija. Medicinos centro Euromedprestige gydytojai turi didelę DNR diagnostikos atlikimo patirtį, kuri užtikrina tyrimo rezultatų patikimumą ir teigiamą gydymo sėkmę. užkrečiamos ligos. Atlikti PGR testus ir atlikti pilna diagnostika ir mūsų infekcinių ligų gydymas medicinos centras Euromedprestige.

Amplifikacijos produktų aptikimo metu atskiriamas gautas amplifikacijos produktų mišinys. Į mišinį pridedami specialūs tirpalai, kurie suteikia DNR fragmentams galimybę fluorescuoti - atspindi oranžinės-raudonos šviečiančias juosteles. Gautas švytėjimas rodo, kad medžiagoje, paimtoje iš paciento PGR analizei, yra virusų, mikrobų ar bakterijų DNR.

SEI HPE „Krasnojarsko valstybinė medicinos akademija

pavadintas Yasenetsky federalinės sveikatos ir socialinės plėtros agentūros vardu »

IPO Medicininės genetikos ir klinikinės neurofiziologijos katedra

PAGRINDINIAI METODO PRINCIPAI

POLIMERAZĖS GRANDINĖ REAKCIJA

įrankių rinkinys 3-4 kursų studentams

bendrosios medicinos specialybėse (060101) ir

Krasnojarskas – 2007 m

Shnaider, N. A., Butyanov, R. A. Pagrindiniai polimerazės grandininės reakcijos metodo principai. Bendrosios medicinos (060101) ir pediatrijos (060103) specialybių 3-4 kursų studentų popamokinio darbo metodinis vadovas. - Krasnojarskas: GOU VPO leidykla KrasGMA, 2007. - 42p.

Metodinis vadovas visiškai atitinka Valstybinio standarto (2000) reikalavimus ir atspindi pagrindinius aspektus modernus metodas diagnostika paveldimos ligosžmogus – polimerazės grandininės reakcijos metodas, pritaikyta mokomoji medžiaga švietimo technologijos atsižvelgiant į mokymo specifiką 3-4 medicinos ir pediatrijos fakultetų kursuose.

Recenzentai: Valstybinės aukštosios mokyklos Medicininės genetikos katedros vedėjas

„Federalinės sveikatos agentūros Novosibirsko valstybinis medicinos universitetas ir Socialinis vystymasis“, medicinos mokslų daktaras, profesorius;

DNR replikacija

Šio metodo tyrimo objektas yra dezoksiribonukleino rūgštis (DNR). DNR yra universalus genetinės informacijos nešėjas visuose Žemėje egzistuojančiuose organizmuose (išskyrus RNR turinčius mikroorganizmus). DNR yra dviguba grandinė, susukta į spiralę. Kiekviena grandinė susideda iš nuosekliai sujungtų nukleotidų. DNR grandinės turi priešingą kryptį: vienos grandinės 5' galas atitinka antrosios grandinės 3' galą. Unikali nuosavybė DNR yra jos gebėjimas dubliuotis. Šis procesas vadinamas replikacija. DNR molekulės replikacija vyksta sintetiniu tarpfazės periodu. Kiekviena iš dviejų „motinos“ molekulės grandinių tarnauja kaip „dukters“ šablonas. Po replikacijos naujai susintetintoje DNR molekulėje yra viena „motiniška“ grandinė, o antroji – „dukra“, naujai susintetinta (pusiau konservatyvus metodas). Dėl matricos sintezė naujai DNR molekulei reikia despiralizuoti senąją molekulę ir ištempti. Replikacija prasideda keliose DNR molekulės vietose. DNR molekulės atkarpa nuo vienos replikacijos pradžios iki kitos pradžios vadinama replikonas.

Suaktyvinama replikacijos pradžia gruntai(sėklos), susidedančios iš 100-200 bazinių porų. DNR helikazės fermentas išsivynioja ir atskiria pirminę DNR spiralę į dvi grandines, ant kurių pagal komplementarumo principą, dalyvaujant DNR polimerazės fermentui, surenkamos „dukterinės“ DNR grandinės. Kad fermentas pradėtų veikti, reikalingas pradinis blokas – nedidelis pradinis dvigrandė fragmentas. Pradinis blokas susidaro pradmeniui sąveikaujant su atitinkamos pirminės DNR grandinės komplementaria sritimi. Kiekviename replikone DNR polimerazė gali judėti palei "motininę" grandinę tik viena kryptimi (5`=>3`).

Pirmojoje sruogoje, replikonui išsivyniojus, palaipsniui nuolat auga „dukterinė“ sruogelė. Atsiliekančioje grandinėje dukterinė grandinė taip pat sintetina kryptimi (5`=>3`), bet atskirais fragmentais, kai replikonas išsivynioja.

Taigi „dukterinių“ gijų komplementarių nukleotidų prijungimas vyksta priešingomis kryptimis (antilygiagrečiai). Replikacija visuose replikonuose vyksta vienu metu. Skirtinguose replikonuose susintetinti „dukterinių“ gijų fragmentai ir dalys fermento ligazės surišamos į vieną grandinę. Replikacijai būdingas pusiau konservavimas, antiparaleliškumas ir nenuoseklumas. Visas ląstelės genomas replikuojamas vieną kartą per laikotarpį, atitinkantį vieną mitozinį ciklą. Replikacijos proceso rezultate iš vienos DNR molekulės susidaro dvi DNR molekulės, kurių viena grandinė yra iš pirminės DNR molekulės, o antroji – dukterinė – naujai susintetinama (1 pav.).

Ryžiai. 1. DNR molekulės replikacijos diagrama.

Taigi, DNR replikacijos ciklas apima trys pagrindiniai etapai:

1. DNR spiralės išsivyniojimas ir sruogų divergencija (denatūracija);

2. gruntų tvirtinimas;

3. vaiko gijos grandinės užbaigimas.

PGR metodo principas

Būtent DNR replikacija sudarė PGR pagrindą. Atliekant PGR, pirmiau išvardyti procesai atliekami mėgintuvėlyje cikliniu režimu. Perėjimas iš vienos reakcijos stadijos į kitą pasiekiamas keičiant inkubacinio mišinio temperatūrą. Kai tirpalas pašildomas iki 93-95°C, įvyksta DNR denatūracija. Norėdami pereiti prie kito žingsnio – pradmenų pridėjimo arba „atkaitinimo“ – inkubacinis mišinys atšaldomas iki 50-65°C. Tada mišinys pašildomas iki 70-72°C – optimalus taq-DNR polimerazės veikimas – šiame etape baigiama kurti nauja DNR grandinė. Tada ciklas kartojasi dar kartą. Kitaip tariant PGR metodas yra daugkartinis kopijų skaičiaus padidinimas (stiprinimas) specifinė DNR dalis, katalizuojama fermento DNR polimerazės.

Dukterinės DNR grandinės pratęsimas turi vykti vienu metu abiejose motininės DNR grandinėse, todėl antrosios grandinės replikacijai taip pat reikalingas atskiras pradmuo. Taigi į reakcijos mišinį įvedami du pradmenys: vienas „+“ grandinei, antrasis „-“ grandinei. Sujungę priešingas DNR molekulės grandines, pradmenys apsiriboja ta jos dalimi, kuri vėliau bus pakartotinai padvigubinta arba amplifikuojama. Tokio fragmento, kuris vadinamas amplikonu, ilgis paprastai yra keli šimtai nukleotidų.

PGR žingsniai

Kiekvienas stiprinimo ciklas apima 3 etapus, vykstančius skirtingomis temperatūros sąlygomis (2 pav.).

· 1 etapas: DNR denatūracija . Jis teka 93-95° kampu 30-40 sekundžių.

· 2 etapas: grunto atkaitinimas . Pradmenų prijungimas vyksta papildant atitinkamas sekas priešingose ​​DNR grandinėse tam tikros srities ribose. Kiekviena gruntų pora turi savo atkaitinimo temperatūrą, kurios reikšmės yra 50-65°C diapazone. Atkaitinimo laikas 20-60 sek.

· 3 etapas: DNR grandinių pratęsimas.. Komplementarus DNR grandinių pratęsimas vyksta nuo grandinės 5" galo iki 3" galo priešingomis kryptimis, pradedant nuo pradmenų prisijungimo vietų. Medžiaga naujų DNR grandinių sintezei yra dezoksiribonukleozido trifosfatai, pridedami prie tirpalo. Sintezės procesą katalizuoja fermentas taq-polimerazė ir jis vyksta 70-72°C temperatūroje. Sintezės laikas - 20-40 sek.

Pirmajame amplifikacijos cikle susidariusios naujos DNR grandinės tarnauja kaip šablonai antrajam amplifikacijos ciklui, kuriame susidaro specifinis amplikono DNR fragmentas (3 pav.). Vėlesniuose amplifikacijos cikluose amplikonai tarnauja kaip šablonas naujų grandinių sintezei.

Taigi tirpale susikaupia amplikonai pagal formulę 2", kur n yra amplifikacijos ciklų skaičius. Todėl net jei pradiniame tirpale iš pradžių buvo tik viena dvigrandė DNR molekulė, tada apie 108 amplikonų molekulės. kaupiasi tirpale per 30-40 ciklų, kurių pakanka patikimam vizualiniam šio fragmento aptikimui agarozės gelio elektroforezės būdu.

Stiprinimo procesas atliekamas specialiame programuojamame termostate ( dviratininkas), kuri pagal nurodytą programą automatiškai keičia temperatūrą pagal stiprinimo ciklų skaičių.

Stiprinimui reikalingi šie komponentai:

· DNR šablonas(DNR arba jos dalis, kurioje yra norimas specifinis fragmentas);

· Gruntai(sintetiniai oligonukleotidai (20-30 nukleotidų porų), papildantys DNR sekas ties konkretaus nustatomo fragmento ribomis). Konkretaus fragmento pasirinkimas ir pradmenų parinkimas vaidina didelį vaidmenį amplifikacijos specifiškumui, o tai turi įtakos analizės kokybei.

· Deoksinukleotido trifosfatų (dNTP) mišinys(keturių dNTP mišinys, kuris yra medžiaga naujų komplementarių DNR grandinių sintezei, kurių lygiavertė koncentracija yra 200–500 mikronų)

· FermentasTaq- polimerazė(termostabili DNR polimerazė, katalizuojanti pradmenų grandinių pailgėjimą nuosekliai pridedant nukleotidų bazes į augančią susintetintos DNR grandinę, 2-3 mm).

· buferinis tirpalas(reakcijos terpė, kurioje yra Mg2+ jonų, būtinų fermentų aktyvumui palaikyti, PH 6,8-7,8).

Norint nustatyti konkrečias RNR virusų genomo sritis, pirmiausia iš RNR šablono gaunama DNR kopija, naudojant atvirkštinės transkripcijos (RT) reakciją, katalizuojamą fermento atvirkštinės transkriptazės (atvirkštinės transkriptazės).

Ryžiai. 2. Stiprinimas (1 ciklas).

Ryžiai. 3. Stiprinimas (2 ciklas).

Pagrindinės PGR taikymo sritys

klinikinė medicina:

o infekcijų diagnostika,

o mutacijų nustatymas, įskaitant paveldimų ligų diagnozę,

o genotipų nustatymas, įskaitant ŽLA genotipą,

o korinio ryšio technologijos

ekologija (kaip būdas stebėti aplinkos objektų ir maisto būklę bei kokybę)

transgeninių organizmų (GMO) apibrėžimas

Asmens tapatybė, tėvystė, teismo ekspertizė

bendroji ir specialioji biologija,

Pagrindiniai principai

diagnostinių laboratorijų organizavimas

Darbas PGR laboratorijoje vykdomas laikantis „Sveikatos priežiūros sistemos sanitarinių ir epidemiologinių įstaigų projektavimo, saugos, pramoninės sanitarijos, antiepideminio režimo ir asmens higienos taisyklių dirbant laboratorijose (skyriuose, skyriuose).

DNR mėginių užteršimas

PGR diagnostikos atlikimas yra susijęs su problema, kurią sukelia didelis metodo jautrumas - galimybė užteršimas. Jei į reakcijos mėgintuvėlį patenka nedidelis teigiamos DNR kiekis (specifiniai DNR amplifikacijos produktai – amplikonai; DNR standartas naudojamas kaip teigiama kontrolė; teigiama klinikinio mėginio DNR), PGR metu amplifikuojamas specifinis DNR fragmentas ir dėl to klaidingai teigiamų rezultatų atsiradimas.

Darbo metu galite susitikti dviejų tipų tarša:

1. kryžminis užteršimas nuo mėginio iki mėginio (apdorojant klinikinius mėginius arba iškasant reakcijos mišinį), todėl atsitiktiniai klaidingai teigiami rezultatai;

2. amplifikacijos produkto užterštumas(amplikonai), turintys didžiausia vertė, nes PGR proceso metu amplikonai susikaupia didžiuliais kiekiais ir yra idealūs produktai reamplifikacijai.

Dėl indų, automatinių pipečių ir laboratorinės įrangos, laboratorinių lentelių paviršiaus ar net laboratorijos darbuotojų odos paviršiaus užteršimo amplikonais atsiranda sistemingų klaidingų teigiamų rezultatų. Nustatyti užteršimo šaltinį gali būti labai sunku ir tam reikia didelių laiko ir pinigų investicijų. Patirtis, sukaupta iki šiol dirbant PGR metodą diagnostikai naudojančiose laboratorijose, leidžia suformuluoti pagrindinius tokių laboratorijų organizavimo ir pačių tyrimų atlikimo reikalavimus. Šių reikalavimų laikymasis pašalina užteršimo ir klaidingų teigiamų rezultatų gavimo galimybę.

PGR analizės etapai

Geografiškai atskirti, patalpinti į atskiras patalpas (4.5 pav.):

· Prieš PGR kambarys, kur atliekamas klinikinių mėginių apdorojimas, DNR išskyrimas, reakcijos mišinio paruošimas PGR ir PGR (jei yra sąlygos, paskutinius du veiksmus taip pat rekomenduojama atlikti papildomoje atskiroje patalpoje). Šiose patalpose draudžiama atlikti visus kitus darbus su tiriamomis medžiagomis, kurių PGR diagnostika atliekama šioje laboratorijoje.

· Kambarys po PGR, kur atliekamas amplifikacijos produktų nustatymas. Šioje patalpoje gali būti naudojami kiti aptikimo metodai. Pageidautina, kad patalpa amplifikacijos produktams aptikti būtų kuo toliau nuo patalpų prieš PGR.

Darbo patalpose yra įrengtos ultravioletinės lempos, kurių maksimali spinduliuotė yra 260 nm (DB-60 tipas), kurių greitis yra 2,5 W / 1 m3. Lempos išdėstytos taip, kad darbo stalų, įrangos ir medžiagų paviršiai, su kuriais operatorius liečiasi atliekant PGR analizę, būtų veikiami tiesioginės spinduliuotės. Švitinimas atliekamas per 1 valandą iki darbo pradžios ir per 1 valandą po darbo pabaigos.

Laboratorijos gydytojai dirba su specialiais laboratoriniais drabužiais, kurie keičiami pereinant iš vienos patalpos į kitą, ir su vienkartinėmis pirštinėmis. Drabužių iš skirtingų patalpų apdirbimas atliekamas atskirai. Skirtingi darbuotojai dirba skirtinguose PGR analizės etapuose.

Darbui naudojami atskiri dozatorių komplektai, plastikiniai ir stikliniai indai, laboratorinė įranga, chalatai ir pirštinės, skirti įvairiems analizės etapams ir nenešami iš vienos patalpos į kitą. Kiekviename kambaryje esanti įranga, medžiagos ir inventorius yra atitinkamai paženklinti.

Visi darbo etapai atliekami tik naudojant vienkartines eksploatacines medžiagas: automatinių pipečių antgalius, mėgintuvėlius, pirštines ir t.t. Perkeldami nuo mėginio prie mėginio, būtinai pakeiskite antgalius. Būtina naudoti antgalius su aerozoliniu barjeriniu filtru, kad į pipetę nepatektų tirpalo mikrolašeliai. Panaudoti vamzdeliai ir antgaliai išmetami į specialius konteinerius arba talpyklas, kuriose yra dezinfekcinis tirpalas. Klinikiniai mėginiai laikomi atskirai nuo reagentų.

Darbo vietos apdirbimui ir valymui kiekviename kambaryje yra vatos-marlės tamponai (servetėlės), pincetai, dezinfekciniai ir inaktyvuojantys tirpalai.

PGR diagnostikos laboratorijoje darbai, susiję su rekombinantinių plazmidžių, turinčių šioje laboratorijoje diagnozuojamų patogenų DNR sekas ar genų fragmentus, gamyba (klonavimu) ir išskyrimu.

Klinikinės medžiagos rinkimas

Tiriama medžiaga PGR gali būti epitelio ląstelių, kraujo, plazmos, serumo, pleuros ir smegenų skysčio, šlapimo, skreplių, gleivių ir kitų biologinių išskyrų, biopsijos mėginiai.

Medžiagos mėginių ėmimas atliekamas atitinkamo profilio gydymo kambario sąlygomis. Paėmus mėginius, mėginius reikia kuo greičiau nuvežti į PGR diagnostikos laboratoriją.

Mėginiai turi būti imami naudojant sterilius, pageidautina vienkartinius instrumentus tik vienkartiniuose steriliuose plastikiniuose arba stikliniuose vamzdeliuose, iš anksto valandą apdorotus chromo mišiniu, kruopščiai nuplauti distiliuotu vandeniu ir kaitinti orkaitėje 150 ° C temperatūroje. 1 valandai.

Aptikimo zona (kitas aukštas ar kitas pastatas).

Ryžiai. 4. PGR laboratorinis prietaisas su aptikimu elektroforezės būdu.

Aptikimo zona (skirtingame aukšte ar pastate)

Ryžiai. 5. PGR laboratorinis prietaisas su fluorescenciniu detektavimu (kiekybinė analizė).

Ryžiai. 6. DNR išgavimo kambarys. Parodyta stalinė dėžutė su baktericidine lempa.

Ryžiai. 7. stiprinimo kambarys.

Ryžiai. 8. Aptikimo kambarys.

Ryžiai. 9. Kraujo mėginiai paveldimų ligų DNR diagnostikai.

Mėginių laikymas ir transportavimas

Paveldimų ligų diagnostikai kraujo mėginiai ilgą laiką laikomi ant specialių popierinių formų arba epindorfuose (plastikiniuose mėgintuvėliuose) sušaldyti (9 pav.).

Infekcinėms ligoms diagnozuoti mėginiai laikomi kambario temperatūroje ne ilgiau kaip 2 valandas. Jei reikia ilgiau laikyti, mėginius galima įdėti į šaldytuvą 2-8°C temperatūroje ne ilgesniam kaip 24 valandų laikotarpiui. Ilgesnis saugojimas (iki 2 savaičių) yra priimtinas užšaldžius šaldiklyje minus 20°C temperatūroje. Pakartotinis mėginių užšaldymas-atšildymas neleidžiamas.

Jeigu PGR diagnostikos laboratorija ir procedūrų patalpa mėginiams paimti yra teritoriškai atskirtos, tai mėginiai turi būti vežami termosuose arba termose, laikantis mėginių laikymo taisyklių ir infekcinių medžiagų gabenimo taisyklių.

DNR išskyrimas iš mėginių

Plačiai paplitęs kietosios fazės sorbcijos metodas, kurį sudaro lizuojančio agento, kuriame yra guanidino tirpalo, pridėjimas, DNR sorbcija ant sorbento, pakartotinis plovimas ir DNR rezorbcija buferiniu tirpalu. Serumo, plazmos ar viso kraujo apdorojimo atveju dažniausiai naudojamas fenolio ekstrahavimo metodas. Metodas apima deproteinizaciją fenoliu/chloroformu, po to DNR (arba RNR) nusodinimą etanoliu arba izopropanoliu. Apdorojimas atliekamas Eppendor P tipo mikrocentrifuginiuose mėgintuvėliuose, kurių tūris yra 1,5 ml. Apdorojimo laikas 1,5-2 valandos (10 pav.).

Ryžiai. 10. DNR išskyrimas.

PGR atlikimas

Tam tikras kiekis mėginio iš apdoroto klinikinio mėginio perkeliamas į specialų Eppendorf tipo mikrocentrifugos mėgintuvėlį, kurio tūris yra 0,2 arba 0,5 ml, į kurį įpilamas amplifikacinis mišinys, susidedantis iš vandens, PGR buferio, dNTP tirpalo, pradmenų tirpalo ir tirpalo. Taq-polimerazė (į mišinį dedama paskutinė) Paprastai reakcijos mišinio tūris yra 25 µl Tada į kiekvieną mėgintuvėlį įlašinamas vienas lašas mineralinės alyvos, kad reakcijos mišinys neišgaruotų amplifikacijos metu. programuojamas termostatas (stiprintuvas), kur stiprinimas atliekamas automatiniu režimu pagal duotą programą (11 pav.).

Ryžiai. vienuolika. stiprintuvas" Termocikleris ».

Reakcijos laikas, priklausomai nuo nurodytos programos, yra 2-3 valandos. Lygiagrečiai su eksperimentiniais mėginiais dedami kontroliniai mėginiai: teigiama kontrolė apima visus reakcijos komponentus, tačiau vietoj klinikinio mėginio medžiagos įvedamas kontrolinis tiriamo geno DNR preparatas. Neigiama kontrolė apima visus reakcijos komponentus, tačiau vietoj klinikinės medžiagos ar DNR preparato pridedamas atitinkamas kiekis dejonizuoto vandens arba ekstrakto, kuriame nėra tiriamos DNR. Neigiama kontrolė yra būtina norint patikrinti reakcijos komponentus, ar juose nėra DNR dėl užteršimo, ir pašalinti klaidingai teigiamus rezultatus.

Rezultatų registracija

Amplifikuotas specifinis DNR fragmentas aptinkamas agarozės gelio elektroforeze, dalyvaujant etidžio bromidui. Etidžio bromidas sudaro stabilų intersticinį junginį su DNR fragmentais, kurie pasirodo kaip šviečiančios juostos, kai gelis apšvitinamas UV spinduliuote, kurio bangos ilgis yra 290-330 nm. Priklausomai nuo gautų PGR amplikonų dydžio, naudojamas gelis, kuriame yra 1,5–2,5 % agarozės. Agarozės geliui paruošti agarozės, buferio ir vandens mišinys ištirpinamas mikrobangų krosnelėje arba vandens vonioje ir įpilamas etidžio bromido tirpalas. Atvėsintas iki 50-60°C, mišinys pilamas į formą 4-6 mm storio sluoksniu ir specialiomis šukomis į gelį padaromos kišenės mėginiui uždėti. Šukos nustatomos taip, kad tarp šulinių dugno ir gelio pagrindo liktų 0,5-1 mm agarozės sluoksnis. Geliui sukietėjus, ant kišenių užtepamas 5-15 µl amplifikatas. DNR fragmentų ilgio žymenų mišinio elektroforezę rekomenduojama atlikti lygiagrečiai su kontroliniais ir eksperimentiniais mėginiais. Paprastai tokiame mišinyje yra dešimt DNR fragmentų 100, 200, 300 ir tt ilgų bazių porų.

Tokio mėginio nustatymas leidžia patikrinti amplikonų ilgį kontroliniuose ir eksperimentiniuose mėginiuose. Gelis su uždėtu mėginiu perkeliamas į elektroforezės kamerą, užpildytą buferiu, kamera prijungiama prie maitinimo šaltinio ir elektroforetinis stiprinimo produktų atskyrimas atliekamas 30-45 minutes, esant 10-15 elektrinio lauko stipriui. V/cm. Šiuo atveju dažų priekinė dalis, kuri yra reakcijos mišinio dalis, turi praeiti mažiausiai 3 cm.

Pasibaigus elektroforezei, gelis perkeliamas į transiliuminatoriaus stiklą ir apžiūrimas ultravioletinėje šviesoje. Dokumentacijai gelis fotografuojamas ant Mikrat 300 plėvelės arba įrašomas naudojant vaizdo sistemą, prijungtą prie kompiuterio.

Pirmiausia įvertinami kontroliniai mėginiai. Elektroforezės juostoje, atitinkančioje teigiamą kontrolę, turėtų būti oranžinė šviečianti juosta. Jo elektroforezinis mobilumas turi atitikti instrukcijose nurodytą amplikono ilgį.

Elektroforezės takelyje, atitinkančiame neigiamą kontrolę, tokios juostos neturėtų būti. Tokios juostos buvimas neigiamoje kontrolėje rodo užteršimą – naudojamų reagentų užterštumą tiriama DNR arba amplikonu. Tiriamieji mėginiai vertinami pagal juostos buvimą atitinkamoje juostoje, kuri yra tame pačiame lygyje kaip juosta teigiamame kontroliniame mėginyje. Juostos švytėjimo intensyvumas atitinka tiriamos DNR kiekį mėginyje, todėl galima pusiau kiekybiškai įvertinti PGR. Paprastai teigiami rezultatai vertinami keturių balų skalėje. Jei juostos švytėjimas bandomajame mėginyje yra labai silpnas, tuomet tokį mėginį reikia pertvarkyti (12 pav.).

Ryžiai. 12. Elektroforezė agarozės gelyje.

PGR programos, skirtostaškinių mutacijų ir genų polimorfizmų diagnostika

Viena iš pirmaujančių PGR taikymo sričių praktinėje sveikatos priežiūros srityje yra taškinių mutacijų ir genų polimorfizmų diagnostika. . Yra tiesioginiai ir netiesioginiai DNR diagnostikos metodai. Tais atvejais, kai yra žinomas genas, kurio pažeidimas lemia paveldimos ligos išsivystymą, šį pažeidimą galima nustatyti molekulinės genetikos metodais. Tokie metodai vadinami tiesioginiais. Taikant tiesioginius metodus, nustatomi pirminės DNR nukleotidų sekos sutrikimai (mutacijos ir jų tipai). Tiesioginiai metodai pasižymi tikslumu, siekiančiu beveik 100%.

Tačiau praktiškai šie metodai gali būti taikomi tam tikromis sąlygomis.:

su žinoma citogenetine geno, atsakingo už paveldimos ligos vystymąsi, lokalizacija;

Ligos genas turi būti klonuotas ir žinoma jo nukleotidų seka.

Tiesioginės DNR diagnostikos tikslas – nustatyti mutantinius alelius.

Taigi tais atvejais, kai yra žinoma, koks DNR pažeidimas sukelia paveldimą ligą, DNR fragmentas, kuriame yra pažeidimas, tiriamas tiesiogiai, t. y. naudojamas tiesioginis DNR diagnostikos metodas.

Tačiau iki šiol daugelio ligų genai nebuvo nustatyti, jų egzon-intronų struktūra nežinoma ir daugelis paveldimos ligos būdingas ryškus genetinis heterogeniškumas, neleidžiantis visapusiškai panaudoti tiesioginių DNR diagnostikos metodų. Todėl tais atvejais, kai žalos lokalizacija nežinoma, taikomas kitoks požiūris, siejamas su geno, atsakingo už genų ligą, apylinkių tyrimu, kartu su šeimos analize, tai yra netiesioginiais molekulinės genetinės diagnostikos metodais. vartojamos paveldimos ligos.

Gali būti naudojamas aptikti taškų mutacijas ir mažas delecijas įvairių būdų tačiau visi jie pagrįsti PGR metodo naudojimu. Ši reakcija leidžia pakartotinai padauginti DNR nukleotidų seką ir tada ieškoti mutacijų. DNR fragmentų, turinčių mutacijas, paieškos metodai yra pagrįsti lyginamoji analizė mutantines ir normalias DNR nukleotidų sekas.

PGR produktų analizė

tiesioginės DNR diagnostikos procese

Tai apima specifinių geno amplifikuoto regiono savybių tyrimą. Taigi, sergant ligomis, kurias sukelia trinukleotidų pasikartojimų išsiplėtimas, amplifikacijos produktai skiriasi savo ilgiu (atspindi skirtingą tripletų skaičių tiriamoje geno srityje) ir dėl to judėjimo greičiu gelyje. Dėl to pasiekiamas aiškus normalių ir mutantinių alelių elektroforetinis atskyrimas ir tikslus patologiškai pailgėjusio fragmento nustatymas, t.y. ligos DNR diagnozė (13 pav.).

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width="417" height="110 src=">

Ryžiai. 14. Ištrynimo diagnozė GAG gene DYT 1 pacientams, sergantiems nuo dopa nepriklausoma distonija (poliakrilamido gelio elektroforezė). Trasos 2,3,6 - serga; juostos 1,4,5 - kontrolė. Plona rodyklė rodo normalų alelį, paryškinta rodyklė rodo trumpesnį mutantinį alelį (trijų nukleotidų ištrynimas).

Jei tiriama DNR sritis yra visiškai įtraukta į išplėstinę deleciją, tada DNR PGR amplifikacija iš šio pašalinto alelio nebus atlikta, nes trūksta vietų pradmenų hibridizacijai. Tokiu atveju homozigotinė delecija bus diagnozuota remiantis visišku reakcijos PGR produkto nebuvimu (DNR sintezė neįmanoma iš abiejų geno kopijų). Esant heterozigotinei delecijai, galima aptikti PGR produktą, susintetintą iš normalaus (saugaus) alelio, tačiau norint patikimai diagnozuoti tokią mutaciją, būtina naudoti sudėtingesnius DNR vizualizacijos metodus, leidžiančius įvertinti galutinės dozės dozę. PGR produktas.

Norint nustatyti taškines mutacijas (dažniausiai nukleotidų pakaitalus) tam tikrose vietose, PGR metodas naudojamas kartu su kitais molekulinės genetinės analizės metodais. Jei siūlomos taškinės mutacijos vieta ir pobūdis yra tiksliai žinomi, norint tikslingai aptikti tokią mutaciją, restrikcijos endonukleazės (riboja) yra specialūs ląstelių fermentai, išskirti iš įvairių bakterijų padermių.

Šie fermentai atpažįsta specifines nukleotidų sekas, kurių ilgis yra nuo keturių iki dešimties nukleotidų. Tada jie atlieka šių sekų restrikciją (lot. (pjovimą) kaip dvigrandės DNR molekulės dalį. Kiekvienas restrikcijos fermentas atpažįsta ir fiksuotoje vietoje perpjauna griežtai apibrėžtą, specifinę nukleotidų seką) apribojimo vieta (atpažinimo vieta).

Tais atvejais, kai taškinė mutacija pakeičia natūralią konkretaus restrikcijos fermento atpažinimo vietą, tas fermentas negalės suskaldyti mutantinio PGR amplifikuoto fragmento. Kai kuriais atvejais dėl mutacijos atsiranda nauja tam tikro restrikcijos fermento atpažinimo vieta, kurios normoje nėra.

Abiem atvejais mutantiniai ir normalūs PGR produktai, apdoroti pasirinktu restrikcijos fermentu, duos skirtingo ilgio restrikcijos fragmentus, kuriuos galima nesunkiai aptikti elektroforezės būdu (15 pav.).

Taigi, jei reikia greitai aptikti kokią nors konkrečią taškinę mutaciją, užduotis sumažinama iki atitinkamo restrikcijos fermento, kurio atpažinimo vieta yra lokalizuota sutrikusios nukleotidų sekos vietoje, paieška. PGR produktų apdorojimas šiuo restrikcijos fermentu leis lengvai atskirti normalius ir mutantinius alelius. Restrikcijos analizė labai supaprastina žinomų taškinių mutacijų nustatymą ir šiuo metu plačiai naudojama tiesioginei paveldimų ligų DNR diagnostikai.

paskutinis etapas mutacijų molekulinė genetinė analizė yra tiriamo DNR fragmento nukleotidų sekos nustatymas (sekvenavimas), kuris lyginamas su norma ir suformuluojama galutinė genetinė diagnozė. Dėl molekulinės genetikos pažangos DNR diagnostikos metodai dabar sukurti daugiau nei 400 paveldimų ligų.

Ryžiai. 15. Taškinės mutacijos aptikimas naudojant restrikcijos analizę: A – amplifikuojama geno sritis, turinti restrikcijos vietąAGCTdėl restrikcijos endonukleazėsAlu aš. MutacijaG→ Apakeičia šią nukleotidų seką, todėl susidaro restrikcijos fermentasAluiužblokuotas; B - restrikcijos produktų elektroferograma: 1 juosta - homozigotiškumas normaliam aleliui; 2 juosta, homozigotiškumas mutacijai; 3 juosta – heterozigotinė būsena (normalus alelis + mutacija).

Paveldimų ligų diagnostika, pagrįsta tiesioginiu pacientų, jų šeimos narių ar numanomų heterozigotinių patologinių mutacijų nešiotojų mutantinių alelių ištyrimu, tinka presimptominei ir prenatalinei diagnostikai, kuri gali būti taikoma ankstyviausiose vaisiaus vystymosi stadijose, dar nepasireiškus vaisiaus vystymuisi. bet kokie klinikiniai ar biocheminiai simptomai.ligą.

Nepriklausomai nuo mutacijų aptikimo metodo, tikslią kiekvienos mutacijos molekulinę apibūdinimą galima gauti tik tiesiogiai nustatant seką. Šiam procesui automatizuoti pastaraisiais metais plačiai naudojami specialūs įrenginiai – sekvenatoriai, leidžiantys žymiai pagreitinti DNR informacijos nuskaitymo procesą.

Kelias platesniam molekulinių biologinių tyrimų pritaikymui klinikinės diagnostikos laboratorijose atveriamas paspartinus analizės procesą, visas procedūras atliekant vienu kontinuumu, neperkeliant mėginių, sudarant sąlygas išvengti užteršimo lygiagrečiai tiriant daugybę analičių ir objektyviai registruojant. kiekvieno ciklo rezultatų.

Pagrindinės PGR metodo modifikacijos

Naudojamas greitai nuskaityti ir ieškoti žinomų genų mutacijų.

Multipleksinė (multipramerinė) PGR

Šis metodas pagrįstas kelių tiriamo geno egzonų amplifikavimu vienu metu vienoje reakcijoje. Tai leidžia ekonomiškai greitai patikrinti dažniausiai pasitaikančias mutacijas. Pavyzdžiui, norint greitai diagnozuoti distrofino geno delecijų pernešimą pacientams, sergantiems progresuojančia Duchenne/Becker raumenų distrofija, vienu metu atliekama dažniausiai mutuojančių šio geno egzonų rinkinio amplifikacija. Kadangi šios ligos yra paveldimos su X susietu recesyviniu tipu ir yra susijusios su vienintelės X chromosomos pažeidimu berniukams, ilgalaikės delecijos atveju reakcijos produktų elektroforezė parodys, kad nėra vieno ar daugiau DNR fragmentų (egzonų). ), kuris gali būti molekulinis diagnozės patvirtinimas. Be to, parenkant specifines genų sritis PGR amplifikacijai, galima gana tiksliai įvertinti bendrą delecijos ir genų lūžio taškų ilgį (iki egzono).

Kombinuotas kelių daugialypių reakcijų naudojimas leidžia diagnozuoti iki 98 % visų ištrynimų, atsirandančių pacientams, sergantiems progresuojančia Duchenne/Becker raumenų distrofija. Tai yra maždaug 60% visų žinomų distrofino geno mutacijų skaičiaus ir rodo labai didelį šio atrankos metodo veiksmingumą diagnozuojant DNR distrofinopatiją (16 pav.).

Ryžiai. 16. Tiesioginė Diušeno raumenų distrofijos DNR diagnostika naudojant multipleksinę PGR (agarozės gelio elektroforezę). Kiekviename iš tirtų asmenų vienu metu buvo amplifikuoti keturi distrofino geno egzonai (17, 19, 44 ir 45 egzonai; rodyklės rodo atitinkamus amplifikacijos produktus). 1 juosta - kontrolinė, 2-5 juostos - pacientai, sergantys Diušeno raumenų distrofija su įvairiomis distrofino geno delecijomis (2 ir 5 juostos - 45 egzono delecija, 3 juosta - 44 egzono delecija, 4 juosta - 17 ir 19 egzonų delecija ).

Aleliui būdingas amplifikavimas

Metodas pagrįstas dviejų nepriklausomų pradmenų porų naudojimu konkrečiam geno regionui: vienas pradmuo abiejose porose yra bendras, o antrasis kiekvienos poros pradmuo turi skirtingą struktūrą ir yra papildantis normalią arba mutantinę DNR. seka. Dėl tokios reakcijos tirpale vienu metu gali būti susintetinti dviejų tipų PGR produktai – normalūs ir mutantiniai. Be to, naudojamų pradmenų konstrukcija leidžia aiškiai atskirti normalius ir mutantus amplifikacijos produktus pagal jų molekulinį dydį. Šis metodas yra labai aiškus ir leidžia patikrinti tiek homo-, tiek heterozigotinį mutantinio alelio nešimą.

Amplifikuotos DNR modifikavimo vietoje metodas

Metodas pagrįstas vadinamojo neatitikimo pradmens (ne visiškai papildančio šabloną) naudojimu PGR, kuris skiriasi nuo šabloninės DNR sekos vienu nukleotidu. Įtraukus nurodytą pradmenį į mutantinio PGR produkto sudėtį, jame susidaro dirbtinai sukurta restrikcijos vieta vienai iš restrikcijos endonukleazių, leidžianti tiesiogiai DNR diagnozuoti tam tikrą žinomą mutaciją naudojant restrikcijos analizę. Sukurti tokią dirbtinę restrikcijos vietą gali prireikti, jei paieška neatskleidė žinomo ir prieinamo fermento, kurio „natūrali“ restrikcijos vieta yra paveikta dėl tiriamos mutacijos atsiradimo DNR molekulėje. .

Atvirkštinės transkriptazės PGR metodas (RT- PGR)

Šis metodas taikomas tais atvejais, kai tyrimo objektu patogiau naudoti ne genominę DNR, o kompaktiškesnę ir informatyvesnę cDNR, gautą tinkamai apdorojus audinių mėginius, pvz., biopsijos medžiagą ar limfocitų, fibroblastų ląstelių linijas. tt Svarbi sąlyga yra norimo geno ekspresija (bent jau minimali) tiriamame audinyje.

Pirmajame etape atliekama atvirkštinė mRNR transkripcija, o gautos cDNR molekulės yra PGR šablonas. Vėliau pakankamu kiekiu amplifikuotai kritinei cDNR sričiai atliekami sekvenavimo ir kiti mutacijų atrankos metodai, tiesioginis elektroforezinis tyrimas (delecijos, intarpų nustatymas ir kt.) arba integravimas į ekspresijos sistemą, kad būtų gautas baltyminis produktas ir jo tiesioginė analizė. .

Šis metodas yra ypač efektyvus nustatant mutacijas, vedančias į „sutrumpinto“ baltymo sintezę (nesąmonių mutacijos, sujungimo mutacijos, didelės delecijos) – tai vadinamoji PTT analizė (Protein Truncation Test). PTT analizė dažniausiai naudojama tiriant išplėstinius kelių egzonų genus, tokius kaip Duchenne/Becker raumenų distrofijos, ataksijos-telangiektazijos arba 1 tipo neurofibromatozės genas.

realaus laiko PGR(realiojo laiko PGR)

Kiekvienais metais praktinėje sveikatos priežiūros srityje realaus laiko PGR tampa vis populiaresniu diagnostikos metodu. Pagrindinis jo bruožas yra polimerazės grandininės reakcijos produktų kaupimosi stebėjimas ir kiekybinė analizė bei automatinis rezultatų registravimas ir interpretavimas. Šis metodas nereikalauja elektroforezės pakopos, todėl sumažėja PGR laboratorijos reikalavimai. Sutaupius gamybos plotą, sumažėjus darbuotojų skaičiui ir DNR/RNR kiekybinio įvertinimo poreikiui, šis metodas pastaraisiais metais sėkmingai naudojamas didžiausiuose išsivysčiusių pasaulio šalių sanitarinės epidemijos, diagnostikos ir tyrimų centruose, pakeičiant PGR dabartinį ("klasikinį") formatą.

Realaus laiko PGR naudoja fluorescenciniu būdu pažymėtus oligonukleotidinius zondus, kad aptiktų DNR amplifikacijos metu. Realaus laiko PGR leidžia atlikti visą mėginio analizę per 20-60 minučių ir teoriškai gali aptikti net vieną DNR ar RNR molekulę mėginyje.

Ryžiai. 17. PCR realiu laiku.

Realaus laiko PGR naudoja TaqMan sistemą, kad kontroliuotų PGR kinetiką tiesiogiai amplifikacijos metu, naudojant rezonansinį fluorescencinį gesinimą. Aptikimui naudojamas zondas, turintis fluoroforą ir gesintuvą, papildantį amplifikuoto fragmento vidurinę dalį. Kai fluoroforas ir gesintuvas yra prijungti prie oligonukleotido zondo, pastebima tik nedidelė fluorescencinė emisija. Amplifikacijos proceso metu dėl Taq polimerazės 5'-egzonukleazės aktyvumo fluorescencinė etiketė pereina į tirpalą, išleidžiama iš gesintuvo ir sukuria fluorescencinį signalą, kuris realiu laiku didėja proporcingai kaupimuisi. amplifikuoti (17 pav.).

Pagrindiniai PGR-realiojo laiko pranašumai, palyginti su PGR su gelio elektroforeze:

Visas metodas vyksta viename mėgintuvėlyje;

· Metodas trunka 1 valandą;

Pakanka 1-2 darbo kambarių;

Kartu su kokybiniu rezultato įvertinimu tampa įmanoma jį kiekybiškai įvertinti (pavyzdžiui, skiriant AIDS ar virusinio hepatito antivirusinį gydymą, būtina žinoti viruso kiekį, t.y. viruso kiekį 1 vnt., kuris suteikia realų). -laikinis PGR);

· Dramatiškai sumažina užteršimo riziką.

Išvada

PGR metodas yra vienas iš labiausiai paplitusių molekulinių biologinių tyrimų metodų. Šį metodą gydytojai turėtų naudoti prasmingai, o gydytojas, nusprendęs savo darbe naudoti PGR, turi turėti tam tikrų žinių apie šio metodo ypatybes ir galimybes. Antra, tarp gydytojo ir PGR laboratorijos turi būti glaudus grįžtamasis ryšys, būtinas sudėtingų atvejų analizei ir teisingos diagnostikos strategijos sukūrimui. Trečia, PGR analizė nėra panacėja diagnozuojant (pirmiausia infekcines ligas) ir nepakeičia esamų tyrimo metodų, o tik juos papildo. O svarbiausia – PGR negali pakeisti intuicijos ir analitinio mąstymo, kurį turėtų turėti gydytojas, kuris tikisi sėkmės.

P . S . Molekuliniai-biologiniai tyrimai – diagnostikos ir gydymo atskaitos taškų kaita. Molekulinių biologinių metodų naudojimas yra susijęs su radikalaus laboratorinės diagnostikos akcentų pasikeitimo perspektyva. Galime kalbėti ne tik apie savalaikę informaciją, bet ir apie išankstinį jos gavimą. Jei dabar laboratoriniai tyrimai daugeliu atvejų atliekami jau pažengusiai ligai ir pradėtas gydymas, tai tikimasi, kad iš molekulinės biologinės laboratorinės informacijos bus galima nustatyti žmogaus polinkį į tam tikros rūšies patologijas ir jautrumo tam tikriems vaistams laipsnį, leis pagrįsti prognozuojamą, prevencinį ir personalizuotą ateities medicinos pobūdį.

DIAGNOZĖS IR GYDYMO DĖMESIO KEITIMAS

PAVELDIMOS LIGOS

Šiandien Ateityje

Diagnozė Genetinis pasas

8. Kiek darbo patalpų reikia PGR laboratorijai su fluorescencijos nustatymu (kiekybinė analizė, realaus laiko PGR)?

9. Kas yra aptikimas?

10. Kokie išskiriami DNR diagnostikos metodai?

11. Kuris fermentas veikia PGR pagrindu?

12. Kodėl aptikimo zona turi būti atskirta nuo kitų darbo zonų?

13. Kas yra apribojimų svetainė?

14. Kuo skiriasi tiesioginis DNR diagnostikos metodas nuo netiesioginio?

15. Kas yra sekvenavimas?

16. Kas yra multipleksinė PGR?

17. Kokių tipų mutacijos nustatomos PGR?

18. Kas yra tarša?

19. Kokia yra aleliui specifinio amplifikacijos metodo esmė?

20. PGR medžiagos laikymo sąlygos?

21. Koks įrenginys naudojamas stiprinimui?

22. Koks yra atvirkštinės transkriptazės PGR (RT-PGR) metodas?

23. Kokia medžiaga PGR diagnostikai?

24. Išvardykite užterštumo tipus?

Testai savarankiškam mokymuisi

1. Restrikcijos endonukleazės:

a) fermentai, „sulaužantys“ DNR griežtai tam tikrose vietose;

b) fermentai, kurie susiuva DNR molekulės plyšius;

c) fermentai, suteikiantys junginių, kurie atlieka DNR taisymą.

2. Genų amplifikacija:

3. Kuris iš molekulinės genetikos metodų naudojamas diagnozuojant ligas, kurias sukelia žinomos sekos mutantinis genas?

a) konkretaus apribojimo naudojimas;

b) tiesioginis aptikimas naudojant specifinius molekulinius zondus;

V) šeimos analizė normalaus restrikcijos fragmento ilgio polimorfizmo pasiskirstymas.

4. DNR sekos nustatymas:

a) DNR bazinės sekos identifikavimas;

b) pakartotinis bet kurio DNR segmento pasikartojimas;

c) DNR fragmento, kuriame yra tiriamas genas, išskyrimas.

5. DNR mėginius galima gauti naudojant :

b) choriono gaureliai;

c) vaisiaus vandenys;

d) vaisiaus vandenų ląstelės;

e) odos, raumenų, kepenų biopsijos,

e) viskas teisinga, išskyrus "c" punktą,

g) viskas teisinga, išskyrus "d" punktą,

h) Visa tai, kas išdėstyta pirmiau, yra teisinga.

6. Kokios mutacijos diagnozuojamos PGR?

a) genominis;

b) chromosomų;

c) genas (taškas).

7. Gruntas yra:

a) papildoma DNR dalis;

b) sintetinį oligonukleotidą, pažymėtą (radioaktyviai arba fluorescenciškai) seką, komplementarią mutantui arba normaliam genui;

c) oligonukleotidas, veikiantis kaip "sėkla" ir inicijuojantis polinukleotidinės grandinės sintezę DNR arba RNR šablone.

8. Kas sukūrė PGR metodo principą?

b) K. Mullis

9. Ar PGR metodas naudojamas trinukleotidų pasikartojimų (dinaminio tipo mutacijų) išsiplėtimui diagnozuoti?

10. Kokiose srityse naudojamas PGR?

a) klinikinė medicina;

b) transgeninių organizmų (GMO) apibrėžimas

c) asmens identifikavimas, tėvystės nustatymas, kriminalistika

d) visa tai, kas išdėstyta pirmiau

d) nė vienas iš aukščiau išvardytų dalykų.

Atsakymų pavyzdžiai: 1 - a; 2 - b; 3 - b; 4 - a; 5 - e; 6 - in; 7 - į; 8 - b; 9 – a, 10 – d.

Pagrindinis

1. Bočkovo genetika. Maskva. GEOTAR, 2002 m.

Papildomas

1., Bakharevas ir įgimtų bei paveldimų vaikų ligų gydymas. - Maskva, 2004 m.

2. DNR diagnostika ir medicininis genetinis konsultavimas. - Maskva, 2004 m.

3. Ginter genetika. - Maskva, 2003 m.

4. Gorbunov medicinos genetikos pagrindai. – Sankt Peterburgas: Intermedica, 1999 m.

5. J. McGee. Molekulinė klinikinė diagnostika. – Pasaulis, 1999 m.

6. Menšikovas - biologiniai tyrimai klinikinėje laboratorinėje diagnostikoje: problemos galimybės (paskaitos). Klinikinė laboratorinė diagnostika, 2006 Nr.3.

7. Kornienko apie PGR laboratorijos darbą atliekant tiesioginę biologinės medžiagos analizę. Klinikinė laboratorinė diagnostika, 2006 Nr.10.

8. PGR laboratorijos darbo organizavimas. Metodinės instrukcijos. MU 1.3.1794-03. Rusijos Federacijos vyriausiasis sanitaras, 2003 m.

9. Erlicho H. A. PGR technologija. – Percin-Elmer Cetus, 1993 m.

10. Heid C. A., Stevens J. Realaus laiko kiekybinė PGR. Genome Res. - 1996 Nr.6.

PAGRINDINIAI METODO PRINCIPAI

POLIMERAZĖS GRANDINĖ REAKCIJA

Bendrosios medicinos (060101) ir pediatrijos (060103) specialybių 3-4 kursų studentų popamokinio darbo metodinis vadovas.

SEI HPE "Federalinės sveikatos ir socialinės plėtros agentūros Krasnojarsko valstybinė medicinos akademija"

Rusija, Krasnojarskas,

Federalinė švietimo agentūra

valstybė švietimo įstaiga

Aukščiausias profesinis išsilavinimas

„Karelijos valstybinė pedagoginė akademija“

Kursinis darbas šia tema:

Polimerazės grandininė reakcija (PGR) ir jos taikymas

Baigė: studentė Koryagina Valeria Aleksandrovna

Patikrino: Karpikova Natalija Michailovna

Petrozavodskas 2013 m

Įvadas

1 skyrius Literatūros apžvalga

1.5.4 Plokštumos efektas

1.5.6 Stiprinimas

Išvada

Įvadas

Pastarieji dvidešimt metų buvo pažymėti plačiai paplitusiu molekulinių genetinių metodų diegimu biologijos, medicinos ir žemės ūkio moksluose.

Aštuntojo dešimtmečio pradžioje atrodė, kad molekulinė biologija pasiekė tam tikrą tobulumo laipsnį. Šiuo laikotarpiu mikroorganizmai buvo pagrindinis molekulinių genetinių tyrimų objektas. Perėjimas prie eukariotų tyrėjams iškėlė visiškai naujas problemas, kurių nepavyko išspręsti taikant tuo metu egzistavusius genetinės analizės metodus. Proveržis molekulinės genetikos raidoje tapo įmanomas atsiradus naujai eksperimentinei priemonei – restrikcijos endonukleazėms. Vėlesniais metais ėmė sparčiai daugėti tiesioginių DNR analizės metodų, pagrįstų kokybiškai skirtingais metodais.

Daugeliu atvejų šiuolaikinės technologijos leido pradėti giliau tirti įvairių organizmų branduolinio ir ekstrabranduolinio genomo smulkią struktūrinę ir funkcinę organizaciją. Tai buvo ypač svarbu kuriant naujus diagnostikos ir gydymo metodus. įvairių ligų. Ne mažiau svarbi buvo galimybė panaudoti molekulinės genetikos pasiekimus populiacijų biologijoje ir selekcijoje populiacijų, veislių ir padermių genetiniam kintamumui nustatyti ir analizuoti, ekonomiškai vertingiems individams identifikuoti ir sertifikuoti, genetiškai modifikuotiems organizmams kurti, kitiems klausimams spręsti.

Kiekvienas metodas turi savo privalumų ir trūkumų. Nėra universalaus metodo, kuris galėtų išspręsti visas kylančias problemas. Todėl konkretaus metodo pasirinkimas vykdomam tyrimui yra vienas iš svarbiausių bet kokio mokslinio darbo etapų.

1 skyrius Literatūros apžvalga

1.1 Polimerazės grandininės reakcijos (PGR) atradimo istorija

1983 metais K.B. Mullis ir kt. paskelbė ir užpatentavo polimerazės grandininės reakcijos (PGR) metodą, kuriam buvo lemta turėti didelę įtaką visoms nukleorūgščių tyrimų ir taikymo sritims. Šio metodo vertė molekulinė biologija o genetika pasirodė tokia puiki ir akivaizdi, kad po septynerių metų autorius buvo apdovanotas Nobelio premija chemijoje.

Metodo naudojimo pradžioje, po kiekvieno šildymo-aušinimo ciklo, į reakcijos mišinį turėjo būti pridėta DNR polimerazės, nes ji buvo inaktyvuota aukštoje temperatūroje, reikalinga atskirti DNR spiralės grandines. Reakcijos procedūra buvo palyginti neefektyvi, reikalaujanti daug laiko ir fermentų. 1986 metais buvo žymiai patobulintas polimerazės grandininės reakcijos metodas. Buvo pasiūlyta naudoti termofilinių bakterijų DNR polimerazes. Šie fermentai pasirodė esantys termostabilūs ir gali atlaikyti daugybę reakcijos ciklų. Jų naudojimas leido supaprastinti ir automatizuoti PGR. Viena pirmųjų termostabilių DNR polimerazių buvo išskirta iš bakterijų Thermus aquaticusir pavadintas Taq- polimerazė.

Galimybė amplifikuoti bet kurį DNR segmentą, kurio nukleotidų seka yra žinoma, ir gauti jį po PGR homogenine forma ir preparatiniu kiekiu, daro PGR alternatyviu trumpų DNR fragmentų molekulinio klonavimo metodu. Nereikia taikyti sudėtingų metodinių metodų, kurie naudojami genetinė inžinerija su įprastiniu klonavimu. PGR metodo sukūrimas labai išplėtė molekulinės genetikos, o ypač genų inžinerijos metodologines galimybes, tiek, kad kardinaliai pakeitė ir sustiprino daugelio savo sričių mokslinį potencialą.

1.2 Polimerazės grandininės reakcijos (PGR) rūšys

· Įdėtas PGR- naudojamas šalutinių reakcijos produktų skaičiui sumažinti. Naudokite dvi poras pradmenų ir atlikite dvi reakcijas iš eilės. Antroji pradmenų pora amplifikuoja DNR sritį pirmosios reakcijos produkte.

· Apverstas PGR- naudojamas, kai žinomas tik nedidelis norimos sekos plotas. Šis metodas ypač naudingas, kai reikia nustatyti gretimas sekas po DNR įterpimo į genomą. Norint įgyvendinti apverstą PGR, restrikcijos fermentais atliekama DNR pjūvių serija<#"justify">polimerazės grandininės reakcijos pradmenys

· Konkrečios grupės PGR- PGR artimiesiems<#"center">1.3 Polimerazės grandininė reakcija

Devintojo dešimtmečio viduryje atrasta polimerazės grandininė reakcija (PGR) per kelias valandas gali milijonus kartų padidinti originalaus mėginio kopijų skaičių. Per kiekvieną reakcijos ciklą iš pradinės molekulės susidaro dvi kopijos. Kiekviena susintetinta DNR kopija gali būti kaip šablonas naujų DNR kopijų sintezei kitame cikle. Taigi pakartotinis ciklų kartojimas padidina kopijų skaičių geometrinė progresija. Iš skaičiavimų matyti, kad net jei yra 30 ciklų, originalios molekulės kopijų skaičius bus didesnis nei 1 mlrd. Net jei atsižvelgsime į tai, kad ne visi amplikonai yra dubliuojami per kiekvieną ciklą, bendras kopijų skaičius, nepaisant to, yra gana didelis skaičius.

Kiekvienas polimerazės grandininės reakcijos (PGR) ciklas susideda iš šių etapų:

· Denatūracija – temperatūrai padidėjus, dvigrandė DNR molekulė išsivynioja ir suskaidoma į dvi viengrandes;

· Atkaitinimas – temperatūros sumažinimas leidžia pradmenims prisijungti prie komplementarių DNR molekulės sričių;

· Pailgėjimas – fermentas DNR polimerazė užbaigia komplementarią grandinę.

Pasirinktam fragmentui amplifikuoti naudojami du oligonukleotidiniai pradmenys (sėklos), besiribojantys su tam tikra DNR sritimi. Į gruntus orientuotas 3 - baigiasi vienas kito link ir seka, kurią reikia sustiprinti, kryptimi. DNR polimerazė atlieka vienas kitą papildančių DNR grandinių sintezę (užbaigimą), pradedant pradmenimis. DNR sintezės metu pradmenys fiziškai įterpiami į naujai susintetintų DNR molekulių grandinę. Kiekviena DNR molekulės grandinė, suformuota naudojant vieną iš pradmenų, gali būti kaip šablonas papildomos DNR grandinės sintezei naudojant kitą pradmenį.

1.4 Polimerazės grandininės reakcijos (PGR) vykdymas

Polimerazės grandininė reakcija atliekama specialiuose plonasieniuose polipropileno mėgintuvėliuose, kurių dydis suderinamas su naudojamu terminiu cikleriu (stiprintuvu) - prietaisu, kuris kontroliuoja polimerazės grandininės reakcijos (PGR) etapų temperatūrą ir laiko charakteristikas. .

1.5 Polimerazės grandininės reakcijos metodo principas

Polimerazės grandininė reakcija (PGR) yra in vitro DNR amplifikacijos metodas, leidžiantis išskirti ir padauginti specifinę DNR seką milijardus kartų per kelias valandas. Griežtai galimybė gauti daugybę vieno egzempliorių tam tikra sritis genomas labai supaprastina esamo DNR mėginio tyrimą.

Norint atlikti polimerazės grandininę reakciją, turi būti įvykdytos kelios sąlygos:

1.5.1 Kai kurių komponentų buvimas reakcijos mišinyje

Pagrindiniai reakcijos (PGR) mišinio komponentai yra: Tris-HCl, KCl, MgCl 2, nukleotidų trifosfatų mišinys (ATP, GTP, CTP, TTP), pradmenys (oligonukleotidai), analizuotas DNR preparatas, termostabili DNR polimerazė. Kiekvienas reakcijos mišinio komponentas tiesiogiai dalyvauja polimerazės grandininėje reakcijoje (PGR), o reagentų koncentracija tiesiogiai veikia amplifikacijos eigą.

· Tris-HCl – nustato reakcijos mišinio pH, sukuria buferinę talpą. DNR polimerazės aktyvumas priklauso nuo terpės pH, todėl pH reikšmė tiesiogiai veikia polimerazės grandininės reakcijos eigą. Paprastai pH vertė yra 8–9,5 intervale. Aukštas pH yra dėl to, kad kylant temperatūrai Tril-HCl buferio pH krenta.

· KCl - kalio chlorido koncentracija iki 50 mm veikia denatūravimo ir atkaitinimo procesų eigą, didesnė nei 50 mm koncentracija slopina DNR polimerazę.

· MgCl 2- nes DNR polimerazė yra Mg 2+- priklausomas fermentas, tada magnio jonų koncentracija veikia fermento aktyvumą (Mg 2+sudaro kompleksus su NTP – būtent šie kompleksai yra polimerazės substratas). Didelė koncentracija padidina nespecifinę amplifikaciją, o maža - reakcijos slopinimą, optimalus (įvairioms polimerazėms) yra 0,5-5 mM. Be to, magnio druskų koncentracija turi įtakos denatūravimo ir atkaitinimo procesų eigai – padidėja Mg koncentracija. 2+sukelia DNR lydymosi temperatūros padidėjimą (t. y. temperatūrą, kuriai esant 50 % dvigrandžių DNR grandžių suskaidoma į viengrandes).

· NTP – nukleotidų trifosfatai yra tiesioginiai nukleorūgščių monomerai. Norint išvengti grandinės nutraukimo, rekomenduojamas vienodas visų keturių nukleotidų trifosfatų santykis. Maža šių komponentų koncentracija reakcijos mišinyje padidina komplementarios DNR grandinės konstravimo klaidų tikimybę.

· Gruntai – optimaliausias yra gruntų, kurių lydymosi temperatūros skirtumas ne didesnis kaip 2–4, naudojimas. o C. Kartais ilgai laikant 4 laipsnių temperatūroje o Su arba po daugelio užšaldymo – atšildymo, pradmenys sudaro antrines struktūras – dimerus, mažinančius PGR efektyvumą. Šios problemos pašalinimas sumažinamas iki inkubavimo vandens vonioje (T = 95 o C) 3 minutes ir po to greitai atvėsinama iki 0° SU.

· DNR preparatai – DNR preparato (matricos) kiekis ir kokybė tiesiogiai veikia polimerazės grandininės reakcijos eigą ir parametrus. DNR mėginio perteklius slopina polimerazės grandininę reakciją (PGR). priemaišų įvairių medžiagų, kurie yra DNR preparate, taip pat gali sumažinti polimerazės grandininės reakcijos (PGR) efektyvumą: natrio acetatas, natrio chloridas, izopropanolis, etanolis, heparinas, fenolis, karbamidas, hemoglobinas ir kt.

· DNR polimerazė – naudojant nedidelį kiekį DNR polimerazės, pastebimas galutinio produkto sintezės sumažėjimas, tiesiogiai proporcingas fragmentų dydžiui. Polimerazės perteklius 2–4 kartus lemia difuzinių spektrų atsiradimą, o 4–16 kartų – mažos molekulinės masės nespecifinius spektrus. Naudojamų koncentracijų diapazonas yra 0,5–1,5 aktyvumo vienetų 25 µl PGR mišinio.

Be pagrindinių PGR mišinio komponentų, naudojama nemažai papildomų medžiagų, gerinančių kokybinius ir kiekybinius PGR rodiklius: acetamidas (5%) – pagrindinių komponentų tirpumo padidėjimas; betainas ( natrio druska) - DNR polimerazės stabilizavimas, DNR lydymosi temperatūros mažinimas, lydymosi temperatūros išlyginimas; galvijų albuminas (10-100 μg / ml) - DNR polimerazės stabilizavimas; dimetilsulfoksidas (1-10%) - didinant pagrindinių komponentų tirpumą; formamidas (2-10%) - atkaitinimo specifiškumo padidėjimas; glicerolis (15-20%) - fermento terminio stabilumo padidėjimas, DNR mėginio denatūravimo temperatūros sumažėjimas; amonio sulfatas – sumažina denatūravimo ir atkaitinimo temperatūrą.

1.5.2 Ciklas ir temperatūra

Bendras polimerazės grandininės reakcijos (PGR) programos vaizdas yra toks:

etapas. Užsitęsusi pirminė DNR preparato denatūracija.1 ciklas

etapas. Greitas DNR preparato denatūravimas. Grunto atkaitinimas. Pailgėjimas.30 - 45 ciklai.

etapas. Ilgalaikis pailgėjimas. Reakcijos mišinio aušinimas 1 ciklas.

Kiekvienas stadijos elementas – denatūravimas, atkaitinimas, pailgėjimas – turi individualias temperatūros ir laiko charakteristikas. Kiekvieno elemento temperatūros ir tekėjimo laiko parametrai parenkami empiriškai, atsižvelgiant į stiprinimo produktų kokybinius ir kiekybinius rodiklius.

Denatūravimas. Šio polimerazės grandininės reakcijos elemento metu dvigrandė DNR molekulė suskaidoma į dvi viengrandes. Denatūravimo temperatūros parametrai yra 90–95 laipsnių diapazone o C, bet jei DNR mėginyje yra daug guanino ir citozino, temperatūrą reikia padidinti iki 98 o C. Denatūravimo temperatūra turi būti pakankama visiškai denatūruoti – suskaldyti DNR grandines ir išvengti „staigaus atšalimo“ ar greito atkaitinimo, tačiau termostabili DNR polimerazė yra mažiau stabili aukštoje temperatūroje. Taigi optimalių denatūravimo temperatūros parametrų parinkimas pradmenų ir mėginio santykiui (DNR paruošimui) yra svarbi amplifikacijos sąlyga. Jei denatūravimo temperatūra pirmajame etape viršija 95 o C, rekomenduojama į reakcijos mišinį po pirminės denatūracijos pridėti DNR polimerazės. Šio etapo elemento trukmė polimerazės grandininės reakcijos (PGR) metu turėtų būti pakankama visiškam DNR denatūravimui, tačiau tuo pačiu metu neturėtų reikšmingai paveikti DNR polimerazės aktyvumo tam tikroje temperatūroje.

Atkaitinimas. Atkaitinimo temperatūra (T A ) yra vienas iš svarbiausių polimerazės grandininės reakcijos parametrų. Atkaitinimo temperatūra kiekvienam konkrečiam gruntui parenkama atskirai. Tai priklauso nuo pradmens ilgio ir nukleotidų sudėties. Paprastai jis yra mažesnis 2–4 o Nuo lydymosi temperatūros vertės (T m ) gruntas. Jei sistemos atkaitinimo temperatūra yra žemesnė už optimalią, padidėja nespecifinių amplifikuotų fragmentų skaičius ir, atvirkščiai, daugiau karštis sumažina amplifikuotų produktų kiekį. Tokiu atveju specifinių amplikonų koncentracija gali smarkiai sumažėti iki polimerazės grandininės reakcijos (PGR) slopinimo. Padidėjus atkaitinimo laikui, taip pat padidėja nespecifinių amplikonų skaičius.

Pailgėjimas. Paprastai kiekvienas termostabilios DNR polimerazės tipas turi individualų aktyvumo temperatūros optimalumą. Fermento komplementarios DNR grandinės sintezės greitis taip pat yra kiekvienai polimerazei būdinga reikšmė (vidutiniškai 30–60 nukleotidų per sekundę arba 1–2 tūkst. bazių per minutę), todėl pailgėjimo laikas parenkamas priklausomai nuo. apie DNR polimerazės tipą ir amplifikuotos srities ilgį.

1.5.3 Pagrindiniai grunto parinkimo principai

Kuriant PGR testavimo sistemą, viena iš pagrindinių užduočių yra teisingas pradmenų pasirinkimas, kuris turi atitikti keletą kriterijų:

Gruntai turi būti konkretūs. Ypatingas dėmesys mokėti 3 - pradmenų galai, nes būtent nuo jų Taq polimerazė pradeda užbaigti papildomą DNR grandinę. Jei jų specifiškumas yra nepakankamas, tikėtina, kad mėgintuvėlyje su reakcijos mišiniu įvyks nepageidaujami procesai, būtent nespecifinės DNR (trumpų ar ilgų fragmentų) sintezė. Jis matomas elektroforezės metu sunkių arba lengvų papildomų juostų pavidalu. Tai apsunkina reakcijos rezultatų įvertinimą, nes konkretų amplifikacijos produktą lengva supainioti su susintetinta svetima DNR. Dalis pradmenų ir dNTP sunaudojama nespecifinės DNR sintezei, todėl labai prarandamas jautrumas.

Gruntai neturi formuoti dimerų ir kilpų, t.y. nereikėtų formuoti stabilių dvigubų sruogų, atkaitinant gruntus prie savęs ar vienas su kitu.

1.5.4 Plokštumos efektas

Reikėtų pažymėti, kad specifinių stiprinimo produktų kaupimosi procesas eksponentiškai trunka tik ribotą laiką, o tada jo efektyvumas kritiškai krenta. Taip yra dėl vadinamojo „plato“ efekto.

termino efektas plokščiakalnis naudojamas apibūdinti PGR produktų kaupimosi procesą paskutiniuose amplifikacijos ciklus.

Priklausomai nuo sąlygų ir amplifikacijos reakcijos ciklų skaičiaus, tuo metu, kai pasiekiamas efektas plokščiakalnis substratų (dNTP ir pradmenų) panaudojimas, reagentų (dNTP ir fermento) stabilumas, inhibitorių, įskaitant pirofosfatus ir DNR dupleksus, kiekis, konkurencija dėl reagentų su nespecifiniais produktais arba pradmenimis-dimerais, konkretaus produkto koncentracija , ir nepilna denatūracija esant didelėms amplifikacijos produktų koncentracijoms.

Kuo mažesnė pradinė tikslinės DNR koncentracija, tuo didesnė reakcijos rizika plokščiakalnis". Šis taškas gali atsirasti anksčiau nei pakanka konkrečių amplifikacijos produktų skaičiaus analizei. Tik gerai optimizuotos bandymų sistemos gali to išvengti.

1.5.5 Biologinės medžiagos mėginių paruošimas

Priklausomai nuo užduočių, DNR išskyrimui naudojami skirtingi metodai. Jų esmė yra DNR išskyrimas (ekstrahavimas) iš biologinio produkto ir pašalinių priemaišų pašalinimas arba neutralizavimas, siekiant gauti PGR tinkamo grynumo DNR preparatą.

Marmur aprašytas gryno DNR preparato gavimo būdas laikomas standartiniu ir jau tapo klasikiniu. Tai apima fermentinę proteolizę, po kurios seka deproteinizacija ir DNR nusodinimas alkoholiu. Šis metodas leidžia gauti gryną DNR preparatą. Tačiau tai yra gana sudėtinga ir apima darbą su tokiomis agresyviomis ir aštriomis medžiagomis kaip fenolis ir chloroformas.

Vienas iš šiuo metu populiarių metodų yra DNR ekstrahavimo metodas, kurį pasiūlė Boom ir kt. Šis metodas pagrįstas stiprios chaotropinės medžiagos, guanidino tiocianato (GuSCN) naudojimu ląstelių lizei ir vėlesnei DNR sorbcijai ant nešiklio (stiklo karoliukų, diatomito, stiklinio pieno ir kt.). Po plovimo DNR lieka mėginyje, adsorbuotame ant nešiklio, iš kurio ją galima lengvai pašalinti naudojant eliuavimo buferį. Metodas patogus, technologiškai pažangus ir tinkamas mėginių paruošimui amplifikacijai. Tačiau DNR nuostoliai galimi dėl negrįžtamos sorbcijos ant nešiklio, taip pat daugelio plovimų metu. Tai ypač svarbu dirbant su nedideliu DNR kiekiu mėginyje. Be to, net nedideli GuSCN kiekiai gali slopinti PGR. Todėl taikant šį metodą labai svarbu teisingas pasirinkimas sorbentas ir kruopštus technologinių niuansų laikymasis.

Kita mėginių paruošimo metodų grupė paremta Chilex tipo jonų mainų naudojimu, kurie, skirtingai nei stiklas, adsorbuoja ne DNR, o atvirkščiai – priemaišas, trukdančias reakcijai. Paprastai šią technologiją sudaro du etapai: mėginio virinimas ir priemaišų adsorbcija ant jonų keitiklio. Metodas itin patrauklus dėl jo vykdymo paprastumo. Daugeliu atvejų jis tinkamas darbui su klinikine medžiaga. Deja, kartais yra mėginių su priemaišomis, kurių negalima pašalinti naudojant jonų mainus. Be to, kai kurių mikroorganizmų negalima sunaikinti paprastu virimu. Tokiais atvejais būtina įvesti papildomus mėginių apdorojimo etapus.

Taigi mėginio paruošimo metodo pasirinkimas turėtų būti vertinamas atsižvelgiant į numatomų tyrimų tikslus.

1.5.6 Stiprinimas

Norint atlikti amplifikacijos reakciją, reikia paruošti reakcijos mišinį ir į jį įpilti analizuotą DNR mėginį. Šiuo atveju svarbu atsižvelgti į kai kurias grunto atkaitinimo ypatybes. Faktas yra tas, kad analizuojamame biologiniame mėginyje paprastai yra įvairių DNR molekulių, su kuriomis reakcijoje naudojami pradmenys turi dalinę, o kai kuriais atvejais reikšmingą homologiją. Be to, pradmenys gali susijungti vienas su kitu, kad susidarytų pradmenys-dimeriai. Abu jie sukelia daug pradmenų, skirtų šalutinių (nespecifinių) reakcijos produktų sintezei, ir dėl to žymiai sumažina sistemos jautrumą. Dėl to elektroforezės metu sunku arba neįmanoma nuskaityti reakcijos rezultatų.

1.6 Standartinio PGR reakcijos mišinio sudėtis

x PGR buferis (100 mM Tris-HCl tirpalas, pH 9,0, 500 mM KCl tirpalas, 25 mM MgCl2 tirpalas ) …….2,5 µl

Vanduo (MilliQ) ………………………………………………………….18,8 µl

Nukleotidų trifosfatų (dNTP) mišinys

mM kiekvieno………………………………………….……….0,5 µl

Gruntas 1 (10 mM tirpalas) …………………………………………….….1 µl

Gruntas 2 (10 mM tirpalas) …………………………………………….….1 µl

DNR polimerazė (5 vienetai / µl) ……………………………………………… 0,2 µl

DNR mėginys (20 ng/µl) ……………………………………………..1 µl

1.7 Reakcijos rezultatų įvertinimas

Norint teisingai įvertinti PGR rezultatus, svarbu suprasti, kad šis metodas nėra kiekybinis. Teoriškai pavienių tikslinių DNR molekulių amplifikacijos produktus elektroforezės būdu galima aptikti jau po 30-35 ciklų. Tačiau praktikoje tai daroma tik tais atvejais, kai reakcija vyksta idealioms artimomis sąlygomis, su kuo nedažnai susiduriama gyvenime. Ypač didelę įtaką amplifikacijos efektyvumui turi DNR preparato grynumo laipsnis; tam tikrų inhibitorių buvimas reakcijos mišinyje, kurių kai kuriais atvejais gali būti labai sunku atsikratyti. Kartais dėl jų buvimo neįmanoma amplifikuoti net dešimčių tūkstančių tikslinių DNR molekulių. Taigi dažnai nėra tiesioginio ryšio tarp pradinio tikslinės DNR kiekio ir galutinio amplifikacijos produktų kiekio.

2 skyrius: Polimerazės grandininės reakcijos taikymas

PGR naudojamas daugelyje sričių analizei ir moksliniams eksperimentams.

Kriminalistika

PGR naudojama vadinamiesiems „genetiniams pirštų atspaudams“ palyginti. Mums reikia genetinės medžiagos mėginio iš nusikaltimo vietos – kraujo, seilių, spermos, plaukų ir kt. Jis lyginamas su įtariamojo genetine medžiaga. Užtenka labai mažo DNR kiekio, teoriškai – vienos kopijos. DNR supjaustoma į fragmentus, tada amplifikuojama PGR. Fragmentai atskiriami DNR elektroforezės būdu. Gautas DNR juostų vietos vaizdas vadinamas genetiniu pirštų atspaudu.

Tėvystės nustatymas

DNR fragmentų, amplifikuotų PGR, elektroforezės rezultatai. tėvas. Vaikas. Motina. Vaikas paveldėjo kai kurias abiejų tėvų genetinio atspaudo ypatybes, kurios suteikė naują, unikalų įspaudą.

Nors „genetiniai pirštų atspaudai“ yra unikalūs, šeimos ryšius vis tiek galima užmegzti padarius kelis tokius pirštų atspaudus. Tas pats metodas su nedideliais pakeitimais gali būti taikomas evoliuciniams ryšiams tarp organizmų nustatyti.

Medicininė diagnostika

PGR leidžia žymiai pagreitinti ir palengvinti paveldimų ir virusinių ligų diagnostiką. Dominantis genas amplifikuojamas PGR, naudojant tinkamus pradmenis, o tada sekvenuojamas, kad būtų nustatytos mutacijos. Virusinės infekcijos gali būti aptiktos iškart po užsikrėtimo, likus savaitėms ar mėnesiams iki ligos simptomų atsiradimo.

Personalizuota medicina

Kartais vaistai kai kuriems pacientams yra toksiški arba sukelia alergiją. To priežastys iš dalies yra individualūs vaistų ir jų darinių jautrumo ir metabolizmo skirtumai. Šie skirtumai nustatomi genetiniame lygmenyje. Pavyzdžiui, vienam ligoniui tam tikras citochromas gali būti aktyvesnis, kitam – mažiau. Norint nustatyti, kokio tipo citochromą turi konkretus pacientas, prieš vartojant vaistą, siūloma atlikti PGR analizę. Ši analizė vadinama preliminariu genotipo nustatymu.

Genų klonavimas

Genų klonavimas – tai genų išskyrimo ir dėl genų inžinerijos manipuliacijų didelio kiekio tam tikro geno produkto gavimo procesas. PGR naudojamas amplifikuoti geną, kuris vėliau įterpiamas į vektorių, DNR gabalėlį, pernešantį svetimą geną į tą patį organizmą arba į kitą organizmą, kurį lengva auginti. Kaip vektoriai, pavyzdžiui, naudojamos plazmidės arba virusinė DNR. Genų įterpimas į svetimą organizmą dažniausiai naudojamas šio geno produktui – RNR arba dažniausiai baltymui gauti. Tokiu būdu pramoniniais kiekiais gaunama daug baltymų, skirtų naudoti Žemdirbystė, medicina ir kt.

DNR sekos nustatymas

Atliekant sekos nustatymo metodą, naudojant fluorescenciniu arba radioaktyviu būdu žymėtus dideoksinukleotidus, PGR yra neatsiejama dalis, nes būtent polimerizacijos metu į DNR grandinę įterpiami nukleotidų dariniai, pažymėti fluorescencine arba radioaktyvia žyme. Tai sustabdo reakciją, leidžiančią nustatyti konkrečių nukleotidų padėtis po sintezuotų sruogų atskyrimo gelyje.

Mutagenezė

Šiuo metu PGR tapo pagrindiniu mutagenezės metodu. PGR naudojimas leido supaprastinti ir pagreitinti mutagenezės procedūrą, taip pat padaryti ją patikimesnę ir atkuriamą.

PGR metodas leido išanalizuoti žmogaus papilomos viruso sekų buvimą žmogaus gimdos kaklelio navikų, įterptų į parafiną, biopsijos skyriuose likus 40 metų iki šio tyrimo. Be to, PGR pagalba buvo galima amplifikuoti ir klonuoti mitochondrijų DNR fragmentus iš 7 tūkstančių metų amžiaus žmogaus smegenų fosilinių liekanų!

Atskirų žmogaus spermatozoidų lizatuose buvo parodyta galimybė vienu metu analizuoti du lokusus, esančius skirtingose ​​nehomologinėse chromosomose. Šis metodas suteikia unikalią galimybę atlikti smulkią genetinę analizę ir tirti chromosomų rekombinaciją, DNR polimorfizmą ir kt. Atskirų spermatozoidų analizės metodas buvo nedelsiant rastas praktinis naudojimas teismo medicinoje, nes haploidinių ląstelių HLA tipo nustatymas leidžia nustatyti tėvystę arba identifikuoti nusikaltėlį (HLA kompleksas yra žmogaus pagrindinių histokompatibilumo komplekso genų rinkinys; HLA komplekso lokusai yra polimorfiškiausi iš visų žinomų aukštesniųjų stuburinių gyvūnų: rūšių, kiekviename lokuse yra neįprastai daug skirtingų alelių – alternatyvių to paties geno formų).

Naudojant PGR, galima nustatyti svetimų genetinių struktūrų integracijos teisingumą iš anksto nustatytame tiriamų ląstelių genomo regione. Visa ląstelinė DNR yra sujungta su dviem oligonukleotidiniais pradmenimis, iš kurių vienas yra komplementarus šeimininko DNR vietai netoli įterpimo taško, o kitas - integruoto fragmento seka antilygiagrečioje DNR grandinėje. Polimerazės grandininė reakcija, kai siūlomoje įterpimo vietoje nepakitusi chromosomų DNR struktūra, lemia neriboto dydžio viengrandžių DNR fragmentų susidarymą, o planuojamo įterpimo atveju – žinomos dvigrandės DNR fragmentų susidarymą. dydis, nustatomas pagal atstumą tarp dviejų pradmenų atkaitinimo vietų. Be to, analizuojamo genomo regiono amplifikacijos laipsnis pirmuoju atveju priklausys tiesiškai nuo ciklų skaičiaus, o antruoju - eksponentiškai. Eksponentinis iš anksto nustatyto dydžio amplifikuoto fragmento kaupimasis PGR metu leidžia vizualiai jį stebėti po DNR preparato elektroforetinio frakcionavimo ir padaryti nedviprasmišką išvadą apie svetimos sekos įterpimą į tam tikrą chromosomų DNR sritį.

Išvada

Šiuo metu PGR metodas yra plačiausiai naudojamas kaip įvairių infekcinių ligų diagnostikos metodas. PGR leidžia nustatyti infekcijos etiologiją, net jei analizei paimtame mėginyje yra tik kelios patogeno DNR molekulės. PGR plačiai taikoma ankstyvai ŽIV infekcijų, virusinio hepatito ir kt. Iki šiol beveik nėra infekcinių ligų sukėlėjų, kurių nebūtų galima aptikti naudojant PGR.

Naudotos literatūros sąrašas

1.Padutov V.E., Baranovas O.Yu., Voropaev E.V. Molekulinės – genetinės analizės metodai. - Minskas: Unipolas, 2007. - 176 p.

2.PGR „realiu laiku“ / Rebrikovas D.V., Samatovas G.A., Trofimovas D.Yu. ir kt.; red. b. n. D.V. Rebrikovas; pratarmė L.A. Ostermanas ir akad. RAS ir RAAS E.D. Sverdlovas; 2 leidimas, red. ir papildomas - M.: BINOM. Žinių laboratorija, 2009. - 223 p.

.Patruševas L.I. Dirbtinės genetinės sistemos. - M.: Nauka, 2005. - Po 2 tonas

.B. Glick, J. Pasternak Molekulinė biotechnologija. Principai ir taikymas 589 psl., 2002 m

5.Shchelkunovas S.N. genetinė inžinerija. - Novosibirskas: Sib. univ. leidykla, 2004. - 496 p.

Redagavo A.A. Vorbjeva „Polimerazės grandininė reakcija ir jos taikymas diagnostikai dermatovenerologijoje“; Medicinos naujienų agentūra – 72 puslapiai

http://ru. wikipedia.org

http://mokslininkas. google.ru

.

.

http://www.med2000.ru/n1/n12. htm

12.http://prizvanie. su/ - medicinos žurnalas

Mokymas

Reikia pagalbos mokantis temos?

Mūsų ekspertai patars arba teiks kuravimo paslaugas jus dominančiomis temomis.
Pateikite paraišką nurodydami temą dabar, kad sužinotumėte apie galimybę gauti konsultaciją.

Už pakankamą ir efektyvus gydymas daugelį infekcinių ligų reikia nustatyti laiku tiksli diagnozė. Šiandien sprendžiant šią problemą pasitelkiami aukštųjų technologijų diagnostikos metodai, pagrįsti molekulinės biologijos metodais. Šiuo metu polimerazės grandininė reakcija (PGR) jau plačiai naudojama praktinėje medicinoje kaip patikimiausia laboratorinės diagnostikos priemonė.

Kas paaiškina PGR populiarumą šiuo metu?

Pirma, šis metodas naudojamas labai tiksliai nustatyti įvairių infekcinių ligų sukėlėjus.

Antra, stebėti gydymo veiksmingumą.

Įvairiuose žinynuose, prospektuose, straipsniuose, taip pat gydytojų specialistų paaiškinimuose dažnai susiduriame su nesuprantamų terminų ir žodžių vartojimu. Iš tiesų sunku paprastais žodžiais kalbėti apie aukštųjų technologijų mokslo produktus.

Kokia yra PGR diagnostikos esmė ir mechanika?

Kiekvienas gyvas organizmas turi savo unikalius genus. Genai yra DNR molekulėje, kuri iš tikrųjų yra kiekvieno konkretaus organizmo „vizitinė kortelė“. DNR (genetinė medžiaga) yra labai ilga molekulė, sudaryta iš statybinių blokų, vadinamų nukleotidais. Kiekvienam infekcinių ligų sukėlėjui jie yra griežtai specifiniai, tai yra, tam tikra seka ir deriniu. Kai reikia suprasti, ar žmogus turi tam tikrą ligos sukėlėją, paimama biologinė medžiaga (kraujas, šlapimas, seilės, tepinėlis), kurioje yra mikrobo DNR arba DNR fragmentai. Tačiau patogeno genetinės medžiagos kiekis yra labai mažas, ir neįmanoma pasakyti, kuriam mikroorganizmui jis priklauso. Norėdami išspręsti šią problemą, naudojamas PGR. Polimerazės grandininės reakcijos esmė ta, kad tyrimams paimamas nedidelis kiekis medžiagos, kurioje yra DNR, o PGR proceso metu padidėja tam tikram patogenui priklausančios genetinės medžiagos kiekis, todėl jį galima identifikuoti.

PGR diagnostika yra genetinis biomedžiagos tyrimas.

PGR metodo idėja priklauso amerikiečių mokslininkui K. Mullinsui, kurią jis pasiūlė 1983 m. Tačiau jis buvo plačiai naudojamas klinikoje tik XX amžiaus 90-ųjų viduryje.

Panagrinėkime terminologiją, kas tai yra – DNR ir t.t. Kiekviena gyvos būtybės (gyvūno, augalo, žmogaus, bakterijos, viruso) ląstelė turi chromosomas. Chromosomos yra genetinės informacijos, kurioje yra visa kiekvienos konkrečios gyvos būtybės genų seka, saugotojai.

Kiekviena chromosoma sudaryta iš dviejų DNR grandinių, kurios viena kitos atžvilgiu yra susuktos į spiralę. DNR yra chemiškai dezoksiribonukleino rūgštis, susidedanti iš struktūrinių komponentų – nukleotidų. Yra 5 nukleotidų tipai – timinas (T), adenozinas (A), guaninas (G), citozinas (C) ir uracilas (U). Nukleotidai išsidėstę vienas po kito griežta individualia seka, formuodami genus. Vieną geną gali sudaryti 20-200 tokių nukleotidų. Pavyzdžiui, insulino gamybą koduojantis genas yra 60 bazinių porų ilgio.

Nukleotidai turi komplementarumo savybę. Tai reiškia, kad priešingas adeninas (A) vienoje DNR grandinėje visada yra timinas (T) kitoje grandinėje, o priešingas guaninas (G) - citozinas (C). Schematiškai atrodo taip:
G-C
T-A
A-T
Ši komplementarumo savybė yra pagrindinė PGR.

Be DNR, RNR turi tą pačią struktūrą – ribonukleino rūgštį, kuri nuo DNR skiriasi tuo, kad vietoj timino naudojamas uracilas. RNR yra kai kurių virusų, vadinamų retrovirusais (pavyzdžiui, ŽIV), genetinės informacijos saugotoja.

DNR ir RNR molekulės gali „daugintis“ (ši savybė naudojama PGR). Tai vyksta taip: dvi DNR arba RNR grandinės nutolsta viena nuo kitos į šonus, ant kiekvieno gijos sėdi specialus fermentas, kuris sintetina naują grandinę. Sintezė vyksta pagal komplementarumo principą, tai yra, jei nukleotidas A yra pradinėje DNR grandinėje, tai T bus naujai susintetintoje, jei G - tada C ir kt. Šiam ypatingam „statybiniam“ fermentui sintezei pradėti reikia „sėklos“ – 5-15 nukleotidų sekos. Ši „sėkla“ apibrėžiama kiekvienam genui (chlamidijos genui, mikoplazmos, virusai) eksperimentiškai.

Taigi, kiekvienas PGR ciklas susideda iš trijų etapų. Pirmajame etape įvyksta vadinamasis DNR išsivyniojimas – tai yra dviejų tarpusavyje sujungtų DNR grandinių atskyrimas. Antrajame „sėkla“ pritvirtinama prie DNR grandinės dalies. Ir, galiausiai, šių DNR grandžių pailgėjimas, kurį gamina fermentas „statybininkas“. Šiuo metu visa tai sunkus procesas vyksta viename mėgintuvėlyje ir susideda iš kartotinių nustatytos DNR dauginimo ciklų, siekiant gauti daug kopijų, kurias vėliau galima aptikti įprastais metodais. Tai yra, iš vienos DNR grandinės gauname šimtus ar tūkstančius.

PGR tyrimo etapai

Biologinės medžiagos rinkimas tyrimams

Mėginys yra įvairios biologinės medžiagos: kraujas ir jo komponentai, šlapimas, seilės, gleivinės, smegenų skystis, išskyros žaizdų paviršiai, kūno ertmių turinys. Visi biologiniai mėginiai renkami vienkartiniais instrumentais, o surinkta medžiaga dedama į sterilius plastikinius mėgintuvėlius arba dedama ant auginimo terpės, po to transportuojama į laboratoriją.

Į paimtus mėginius pridedami reikalingi reagentai ir dedami į programuojamą termostatą – termociklerį (stiprintuvą). Cikleryje PGR ciklas kartojamas 30-50 kartų, susidedantis iš trijų etapų (denatūravimo, atkaitinimo ir pailginimo). Ką tai reiškia? Apsvarstykime išsamiau.

Neatidėliotinos PGR reakcijos etapai, genetinės medžiagos kopijavimas

ašPGR etapas – genetinės medžiagos paruošimas kopijavimui.
Atsiranda 95 ° C temperatūroje, o DNR grandinės yra atjungtos ir ant jų gali sėdėti „sėklos“.

„Sėklas“ pramoniniu būdu gamina įvairios tyrimų ir gamybos asociacijos, o laboratorijos perka jau paruoštas. Tuo pačiu metu „sėkla“, skirta, pavyzdžiui, chlamidijoms aptikti, veikia tik chlamidijoms ir kt. Taigi, jei biomedžiaga tiriama, ar nėra chlamidinės infekcijos, tada į reakcijos mišinį dedama chlamidijų „sėkla“; jei tiriama biomedžiaga dėl Epstein-Barr viruso, tada Epstein-Barr viruso "sėkla".

IIstadija – infekcinio sukėlėjo ir „sėklos“ genetinės medžiagos sujungimas.
Jei reikia nustatyti viruso ar bakterijos DNR, „sėkla“ yra ant šios DNR. Šis pradmenų pridėjimo procesas yra antrasis PGR žingsnis. Šis etapas vyksta 75°C temperatūroje.

IIIetapas – Infekcinio sukėlėjo genetinės medžiagos kopijavimas.
Tai faktinio genetinės medžiagos pailgėjimo arba dauginimosi procesas, vykstantis 72°C temperatūroje. Fermentų kūrėjas priartėja prie „sėklų“ ir susintetina naują DNR grandinę. Pasibaigus naujos DNR grandinės sintezei, baigiasi ir PGR ciklas. Tai yra, per vieną PGR ciklą genetinės medžiagos kiekis padvigubėja. Pavyzdžiui, pradiniame mėginyje buvo 100 viruso DNR molekulių, po pirmojo PGR ciklo mėginyje jau bus 200 tiriamo viruso DNR molekulių. Vienas ciklas trunka 2-3 minutes.

Norint sugeneruoti pakankamai genetinės medžiagos identifikavimui, dažniausiai atliekama 30-50 PGR ciklų, kurie trunka 2-3 valandas.

Dauginamos genetinės medžiagos identifikavimo etapas

Pats PGR čia baigiasi ir ateina toks pat svarbus identifikavimo etapas. Identifikavimui naudojama elektroforezė arba pažymėtos „sėklos“. Taikant elektroforezę, gautos DNR grandinės yra atskiriamos pagal dydį, o skirtingo ilgio DNR fragmentų buvimas rodo teigiamą analizės rezultatą (tai yra, tam tikro viruso, bakterijos ir kt. buvimą). Naudojant pažymėtas „sėklas“, į galutinį reakcijos produktą pridedamas chromogenas (dažiklis), dėl kurio fermentinę reakciją lydi spalvos susidarymas. Spalvos atsiradimas tiesiogiai rodo, kad pradiniame mėginyje yra virusas ar kitas aptinkamas agentas.

Šiandien naudojant pažymėtas „sėklas“, taip pat atitinkamą programinę įrangą, galima iš karto „perskaityti“ PGR rezultatus. Tai yra vadinamasis realaus laiko PGR.

Kodėl PGR diagnostika tokia vertinga?

Vienas iš reikšmingų PGR metodo privalumų yra didelis jo jautrumas – nuo ​​95 iki 100%. Tačiau šie pranašumai turi būti pagrįsti būtinais šių sąlygų laikymusi:

1. teisingas mėginių ėmimas, biologinės medžiagos transportavimas;
2. sterilių, vienkartinių instrumentų, specialių laboratorijų ir apmokyto personalo prieinamumas;
3. griežtas metodikos laikymasis ir sterilumas atliekant analizę

Įvairių aptiktų mikrobų jautrumas skiriasi. Taigi, pavyzdžiui, PGR metodo jautrumas hepatito C virusui aptikti yra 97–98%, ureaplazmos aptikimo jautrumas yra 99–100%.

PGR analizei būdingos galimybės leidžia pasiekti neprilygstamą analitinį specifiškumą. Tai reiškia, kad reikia tiksliai nustatyti mikroorganizmą, kurio buvo ieškoma, o ne panašų ar glaudžiai susijusį.
Diagnostinis jautrumas ir PGR metodo specifiškumas dažnai pranoksta kultivavimo metodą, vadinamą „auksiniu standartu“ infekcinių ligų nustatymui. Atsižvelgiant į kultūros augimo trukmę (nuo kelių dienų iki kelių savaičių), PGR metodo pranašumas tampa akivaizdus.

PGR diagnozuojant infekcijas
PGR metodo privalumai (jautrumas ir specifiškumas) lemia platų pritaikymo spektrą šiuolaikinėje medicinoje.
Pagrindinės PGR diagnostikos taikymo sritys:

1. įvairios lokalizacijos ūminių ir lėtinių infekcinių ligų diagnostika
2. stebėti gydymo veiksmingumą
3. patogeno tipo išaiškinimas

PGR naudojamas akušerijoje, ginekologijoje, neonatologijoje, pediatrijoje, urologijoje, venerologijoje, nefrologijoje, infekcinių ligų klinikoje, oftalmologijoje, neurologijoje, ftiziopulmonologijoje ir kt.

PGR diagnostika naudojama kartu su kitais tyrimo metodais (ELISA, PIF, RIF ir kt.). Jų derinį ir tikslingumą nustato gydantis gydytojas.

Infekciniai sukėlėjai, nustatyti PGR

Virusai:

1. ŽIV-1 ir ŽIV-2 retrovirusai
2. herpetiforminiai virusai
3. virusas herpes simplex 1 ir 2 tipai

Pastaruoju metu patikimas, itin jautrus ir greitas metodasįvairių žmonių infekcinių ligų diagnostika. Šis metodas vadinamas „PGR analize“. Kas tai yra, kokia jo esmė, kokius mikroorganizmus jis gali atskleisti ir kaip teisingai jį vartoti, pasakysime mūsų straipsnyje.

Atradimų istorija

Taip pat PGR metodai naudojami diagnozuojant vėžį.

Metodo privalumai

PGR diagnostika turi keletą privalumų:

1. Didelis jautrumas. Net ir esant tik kelioms mikroorganizmo DNR molekulėms, PGR analizė nustato infekcijos buvimą. Metodas padės sergant lėtinėmis ir latentinėmis ligomis. Dažnai tokiais atvejais mikroorganizmas yra kitaip nekultūringas.
2. Tyrimui tinka bet kokia medžiaga, pavyzdžiui, seilės, kraujas, lytinių organų išskyros, plaukai, epitelio ląstelės. Dažniausias yra kraujo tyrimas ir urogenitalinės sistemos tepinėlis PGR.

   

3. Ilgalaikis pasėlių auginimas nereikalingas. Automatizuotas diagnostikos procesas leidžia gauti tyrimo rezultatus po 4-5 valandų.
4. Metodas yra beveik 100% patikimas. Užregistruoti tik pavieniai klaidingai neigiami rezultatai.
5. Galimybė iš vieno medžiagos mėginio identifikuoti kelių rūšių patogenus. Tai ne tik pagreitina ligos diagnozavimo procesą, bet ir žymiai sumažina materialines išlaidas. Dažnai gydytojas skiria išsamią PGR analizę. Tyrimo, susidedančio iš šešių ligų sukėlėjų nustatymo, kaina yra apie 1500 rublių.

Kad PGR tyrimo rezultatai būtų patikimi, būtina atlikti analizę, laikantis rekomendacijų dėl išankstinio pasirengimo diagnozei:

1. Prieš dovanojant seiles, likus 4 valandoms iki medžiagos vartojimo reikia nevalgyti ir nevartoti vaistų. Prieš pat procedūrą praskalaukite burną virintu vandeniu.
2. Aukščiau pateiktų taisyklių reikėtų laikytis ir imant mėginį iš vidinio skruosto paviršiaus. Po skalavimo rekomenduojama atlikti lengvą odos masažą, kad būtų išryškinta liaukos paslaptis.
3. Šlapimas dažniausiai renkamas namuose. Norėdami tai padaryti, turite atlikti išsamų lytinių organų tualetą. Surinkite 50-60 ml šlapimo į sterilų plastikinį indą. Siekiant užtikrinti medžiagos grynumą, moterims rekomenduojama į makštį įkišti tamponą, o vyrams kuo toliau traukti odos raukšlę. Jūs negalite vartoti medžiagos menstruacijų metu.
4. Norėdami paaukoti spermą, turite susilaikyti nuo lytinių santykių 3 dienas prieš rinkdami medžiagą. Medikai taip pat pataria nesilankyti pirtyje ir maudytis karštoje vonioje, gerti alkoholį ir aštrų maistą. Likus 3 valandoms iki analizės, turite susilaikyti nuo šlapinimosi.
5. Pavyzdžiui, gimdant, jei PGR tyrimas atliekamas dėl chlamidijų, tiek moterims, tiek vyrams rekomenduojama 3 dienas lytiškai pailsėti. Prieš 2 savaites iki analizės negalima vartoti antibakterinių vaistų. Savaitę reikia nustoti naudoti intymius gelius, tepalus, makšties žvakutes, plovimą. Likus 3 valandoms iki tyrimo, turite susilaikyti nuo šlapinimosi. Menstruacijų metu medžiagos mėginiai nėra imami, tik praėjus 3 dienoms po kraujo nutekėjimo nutraukimo galima paimti urogenitalinį tepinėlį.

PGR nėštumo metu

Kūdikio laukimo laikotarpiu daugelis infekcinių ligų, perduodamų lytiniu keliu, yra ypač pavojingos normalus vystymasis vaisius. LPL gali išprovokuoti intrauterinį augimo sulėtėjimą, persileidimą ar priešlaikinį gimdymą, įgimtus vaiko apsigimimus. Todėl labai svarbu nuvykti į ankstyvos datos nėštumo tyrimas PGR. Registruojantis būtina išlaikyti analizę - iki 12 savaičių.



Medžiaga paimama iš gimdos kaklelio kanalo naudojant specialų šepetėlį. Procedūra neskausminga ir nekelia pavojaus kūdikiui. Paprastai nėštumo metu PGR metodu atliekama chlamidijų analizė, taip pat ureaplazmozė, mikoplazmozė, citomegalovirusas, herpesas, papilomos virusas. Toks tyrimų kompleksas vadinamas PGR-6.

PGR ŽIV diagnozei

Dėl to, kad metodas yra labai jautrus organizmo pokyčiams ir diagnozės sąlygoms, rezultatui įtakos gali turėti daug veiksnių. Todėl PGR analizė ŽIV infekcijai nustatyti nėra patikimas metodas, jos efektyvumas siekia 96-98%. Likusiais 2–4% atvejų testas duoda klaidingai teigiamus rezultatus.

Tačiau kai kuriose situacijose negalima išsiversti be PGR ŽIV diagnostikos. Paprastai jis skiriamas žmonėms, kurių ELISA rezultatas yra klaidingai neigiamas. Tokie rodikliai rodo, kad žmogus dar nesusikūrė antikūnų prieš virusą ir jų negalima aptikti daugkartiniam jų skaičiaus padidėjimui. Būtent tai galima pasiekti atliekant kraujo tyrimą PGR metodu.

Tokia diagnostika būtina ir pirmųjų gyvenimo metų vaikams, gimusiems iš ŽIV užsikrėtusios motinos. Metodas yra vienintelis kelias patikimas vaiko statuso nustatymas.

PGR hepatitui diagnozuoti

Polimerazės grandininės reakcijos metodas leidžia aptikti hepatito A, B, C viruso DNR dar gerokai prieš susiformuojant antikūnams prieš infekciją ar pasireiškus ligos simptomams. Hepatito C PGR analizė yra ypač efektyvi, nes 85% atvejų ši liga yra besimptomė ir, laiku negydant, pereina į lėtinę stadiją.



Laiku aptiktas patogenas padės išvengti komplikacijų ir ilgalaikio gydymo.

Išsamus PGR tyrimas

Išsami PGR analizė: tyrimas polimerinės grandininės reakcijos metodu, kuris apima kelių tipų infekcijų nustatymą vienu metu: mycoplasma genitalium, mycoplasma hominis, gardnerella vaginalis, candida, Trichomonas, citomegalovirusas, 1 ir 2 tipo herpes, gonorėja, papilomos virusas. Tokios diagnostikos kaina svyruoja nuo 2000 iki 3500 rublių. priklausomai nuo klinikos, naudojamų medžiagų ir įrangos, taip pat nuo analizės tipo: kokybinė ar kiekybinė. Ko reikia Jūsų atveju – nuspręs gydytojas. Kai kuriais atvejais pakanka tik nustatyti patogeno buvimą, kitais, pavyzdžiui, užsikrėtus ŽIV, svarbų vaidmenį atlieka kiekybinis titras. Diagnozuojant visus minėtus patogenus, tyrimas vadinamas „PGR-12 analize“.

Analizės rezultatų iššifravimas

Iššifruoti PGR analizę nėra sunku. Yra tik 2 indikatoriaus skalės - " teigiamas rezultatas“ ir „neigiamas rezultatas“. Nustačius patogeną, gydytojai gali 99% tikrumu patvirtinti ligos buvimą ir pradėti gydyti pacientą. Taikant kiekybinį infekcijos nustatymo metodą, atitinkamame stulpelyje bus nurodytas skaitinis aptiktų bakterijų rodiklis. Tik gydytojas gali nustatyti ligos laipsnį ir paskirti reikiamą gydymą.



Kai kuriais atvejais, pavyzdžiui, nustatant ŽIV infekciją PGR, esant neigiamam rezultatui, norint patvirtinti gautus rodiklius, reikia atlikti papildomus tyrimus.

Kur atlikti analizę?

Kur atlikti PGR analizę: valstybinėje klinikoje ar privačioje laboratorijoje? Deja, savivaldybių gydymo įstaigose įranga ir metodai dažnai yra pasenę. Todėl geriau teikti pirmenybę privačioms laboratorijoms su modernia įranga ir aukštos kvalifikacijos personalu. Be to, privačioje klinikoje rezultatų pasieksite daug greičiau.

Maskvoje daugelis privačių laboratorijų siūlo įvairių infekcijų PGR analizę. Pavyzdžiui, tokiose klinikose kaip Vita, Complex Clinic, Happy Family, Uro-Pro, atliekama PGR analizė. Tyrimo kaina nuo 200 rublių. vieno patogeno identifikavimui.

Galima daryti išvadą, kad infekcinių ligų diagnostika PGR metodu daugeliu atvejų yra greitas ir patikimas būdas aptikti patogeną organizme ankstyvose infekcijos stadijose. Tačiau vis tiek tam tikrais atvejais verta rinktis kitus diagnostikos metodus. Tik specialistas gali nustatyti tokio tyrimo poreikį. PGR analizės iššifravimas taip pat reikalauja profesionalaus požiūrio. Laikykitės gydytojo nurodymų ir nedarykite jums nereikalingų tyrimų.