Reakcija fiksacije komplementa(RSK) je kompleksna dvostopenjska serološka reakcija. Uporablja pet sestavin, ki sestavljajo dva sistema: antigen, protitelo, komplement (prvi sistem); ovčji eritrociti, senzibilizirani (obdelani) s hemolitičnim serumom, ki vsebuje zanje specifična protitelesa (drugi ali indikatorski sistem hema). V tem primeru interakcija protitelesa z antigenom na prvi stopnji reakcije povzroči nastanek imunskega kompleksa, ki adsorbira komplement, vendar tega ni mogoče vizualno zaznati. Na drugi stopnji se hemski sistem uporablja kot indikator vezave komplementa na kompleks antigen-protitelo, ki ga je kot imunski kompleks sposoben tudi adsorbirati. Navsezadnje sta možna dva izida reakcije. Če protitelo in antigen ustrezata drug drugemu in komplement adsorbira nastali kompleks, ne pride do lize eritrocitov hemskega sistema. Če se protitelo ne ujema z antigenom in obratno, se komplement, ki ostane prost, pridruži sistemu hema in povzroči hemolizo.

Tako kot drugi serološki testi se RSK lahko uporablja za odkrivanje specifičnih protiteles proti znanemu antigenu ali za odkrivanje antigena proti znanim protitelesom.

splošne značilnosti Sestavine RSC.

1. PREISKUSNI SERUM se pred pripravo reakcije segreva v vodni kopeli 30 minut, da inaktivira lastni komplement, in se razredči od 1:5.

2. ANTIGEN so lahko kulture bakterij, njihovi lizati, virusi in materiali, ki vsebujejo viruse, izvlečki patološko spremenjenih organov in tkivni lipidi.

3. DOPOLNILO - serum morskega prašička pridobljen na dan poskusa. Trenutno se uporablja industrijsko suho dopolnilo.

4. HEMOLITIČNI SISTEM je sestavljen iz enakih volumnov zmešanega hemolitičnega seruma in 3% suspenzije ovčjih eritrocitov z usedlino. Za senzibilizacijo eritrocitov s hemolizini zmes hranimo v termostatu pri temperaturi 37 °C 30 minut.

Izjava o glavnem poskusu RSC. V 1 epruveto dodamo SERUM, ANTIGEN IN KOMPLEMENT, v tretjo epruveto dodamo serum, komplement in izotonično raztopino natrijevega klorida namesto antigena (KONTROLA SERUMA), v tretjo epruveto dodamo antigen, komplement in enako raztopino natrijevega klorida (KONTROLA ANTIGENA). Epruvete za 1 uro postavimo v termostat pri temperaturi 37°C. Hkrati se pripravi hemolitični sistem, ki se nato po odstranitvi stojala iz termostata doda v vse tri epruvete. Po mešanju hemskega sistema s sestavinami treh epruvet se le-te ponovno postavi v termostat za 1 uro, po tem času pa se upoštevajo rezultati RSC.

Pri upoštevanju RSC je intenzivnost reakcije označena s plusi: "++++" - ostro pozitivna reakcija s popolno zamudo pri hemolizi je tekočina v epruveti brezbarvna, vsi eritrociti so se usedli na dno; "+++", "++" - pozitivna reakcija, za katero je značilno povečanje barve tekočine zaradi hemolize in zmanjšanje števila eritrocitov v usedlini; "+" - šibko pozitivna reakcija, tekočina je intenzivno obarvana, na dnu epruvete je majhna količina rdečih krvničk. Negativna reakcija je označen z znakom "-", medtem ko opazimo popolno hemolizo, ima tekočina v epruveti intenzivno rožnato barvo ("lakasta kri").

RSK je zelo kompleksna, a zelo občutljiva specifična reakcija. Pogosto se uporablja pri diagnozi sifilisa, kronična oblika gonoreja, oslovski kašelj, aktinomikoza, vse rikecioze in virusne okužbe.

Povezani imunosorbentni test.

Metodo so v začetku 70. let neodvisno razvile tri skupine znanstvenikov. Metoda je podobna RIA, vendar temelji na označevanju Ag ali Ab, ki vstopi v reakcijo z encimom. Vzd oznak s podlago običajno spremlja sprememba barve medija. Trenutno so bile ustvarjene številne modifikacije te metode, vendar je najbolj razširjena heterogena ELISA na trdni fazi (trdna faza). Razlikovati:

1) NEPOSREDNA ELISA TRDNE FAZE. V tem primeru:

1. Serum z Ab inkubiramo z Ag fiksiranim na trden substrat (največkrat je to plastična mikroplošča).

2. Ab, ki ga Ag ne veže, se odstrani z večkratnim pranjem.

3. Z encimom označen serum se doda Ag, vezanemu na Ab.

4. Določite število markerskega encima, vezanega na At.

2) KONKURENČNA ELISA TRDNE FAZE.

1. Dodan je serum. Če vsebuje specifične Abs, potem se vežejo na Ag, fiksiran na trden substrat. Če ni specifičnih Abs, potem Ag ni vezan.

2. Pri dodajanju protiteles, specifičnih za fiksni Ag, v prvem primeru ne bodo imela ničesar za interakcijo (večina Ag je že vezanih) Þ vsebnost markerja je nizka. V drugem primeru se bodo specifični Abs vezali na Ag in se med pranjem ne bodo izprali Þ visoka vsebnost markerja.

Podobno, morda. PROTITELESA so fiksirana, različna podjetja pa proizvajajo ravno tablete z že fiksiranimi At.

V primerjavi s klasične metode odkrivanje antigena vam ta metoda omogoča neposredno registracijo njihove interakcije s protitelesi in ne sekundarnih manifestacij (aglutinacija, precipitacija ali hemoliza). Metoda je zelo OBČUTLJIVA (zadostuje koncentracija 1ng/ml).

Določite: klamidijo, klostridijo, HIV itd.

8. Reakcija fagocitoze.

Fagocitozo izvajajo mikrofagi in makrofagi. Stopnje fagocitoze: pristop, lepljenje, potopitev, prebava.

Vrednotenje funkcionalne aktivnosti fagocitnih celic.

Količina fagocitno aktivnost granulocitov in monocitov ocenjujemo v polni krvi, v suspenziji levkocitov ali v obogatenih frakcijah fagocitnih celic. Kot standardni predmeti fagocitoze se uporabljajo monodisperzni delci lateksa s premerom 1,0-2,0 μm, suspenzija toplotno ubitih bakterij ali kvasovkam podobnih gliv.

Fagocite zmešamo s fagocitiranim materialom v razmerju 1:10 ali 1:100 in inkubiramo pri 37°C 30 minut ob stalnem mešanju. Epruvete nato centrifugiramo in pelet resuspendiramo v kapljici krvnega seruma, da pripravimo razmaz. V brisih, fiksiranih z barvo May-Chryunwald in obarvanih po Romanovsky-Giemsi, se izračuna odstotek fagocitnih celic (FP - fagocitni indeks) in število absorbiranih delcev na 1 celico (PF - fagocitno število).

pri zdrava oseba FP=40-80%, PF=1-5.

9. Diagnostikumi.

Diagnostikumi so suspenzija določenih mikrobnih celic, ubitih s segrevanjem ali formalinom, z znano vsebnostjo celic na prostorninsko enoto. Kot antigen lahko uporabimo tudi suspenzije živih bakterij. Reakcijski fenomen se pojavi vnaprej po dveh urah (pri 37 0 C), končni rezultat se upošteva pri sobni temperaturi po 18-20 urah. Za diagnostiko je pozitivna reakcija zanimiva le v določenem serumskem titru, ki služi kot diagnostika. Torej, z brucelozo je diagnostični titer 1: 200, s tula-remijo -1: 100. Za odkrivanje protiteles lahko izvedemo ekspresne reakcije aglutinacije (obračunski čas je nekaj minut). Na primer: 1. Kapljična reakcija pri tularemiji. Na kapljico bolnikove polne krvi na posebnem kozarcu kanemo kapljico destilirane vode (za hemolizo) in kapljico tularemia diagnosticuma. Reakcija se pojavi v 1-2 minutah, aglutinati so jasno vidni v obliki belkastih grudic. 2. Na steklu za brucelozo izvedemo ekspresno reakcijo aglutinacije po Heddelsonu.

Te reakcije ne omogočajo določitve količine protiteles v serumu b) za identifikacijo čiste kulture povzročiteljev nalezljivih bolezni. V ta namen imunodiagnostični

aglutinacijski serumi, ki jih proizvajajo inštituti za cepiva in serume z imunizacijo živali s celimi mikrobnimi celicami. Za zanesljivost je bolje uporabiti adsorbirane serume, tako da vsebujejo samo protitelesa, ki ustrezajo določeni vrsti ali vrsti mikroorganizma.

Načela pridobivanja imunskih serumov.

Imunski serum (antiserum) je krvni serum, ki vsebuje protitelesa proti določenemu antigenu. V večini primerov se imunski (diagnostični) serumi na mikrobne, tkivne in druge antigene pridobivajo eksperimentalno z imunizacijo živali z ustreznimi antigeni.

Med glavnimi zahtevami za antiserume sta njihova visoka specifičnost in zadostna vsebnost protiteles. Po specifičnosti ločimo polivalentne (polispecifične) in monovalentne (monospecifične) antiserume. Polivalentni serumi vsebujejo protitelesa proti številnim antigenom, monospecifični - proti enemu specifičnemu antigenu. Monospecifične serume lahko dobite:

1) z uporabo visoko prečiščenih antigenov za imunizacijo živali,

2) čiščenje nativnih serumov od protiteles neželene specifičnosti.

Za to uporabo:

1) imunoafinitetna metoda, ki temelji na vezavi protiteles določene specifičnosti na ustrezne antigene, imobilizirane na trdnofaznem nosilcu, čemur sledi ločevanje nastalih kompleksov AG-AT in izolacija protiteles;

2) metoda adsorpcije po Castellaniju. V ta namen mikroorganizme, ki vsebujejo vse skupinski antigeni in tako adsorbira homologne anti-

telo. Takšni adsorbirani monospecifični antiserumi vsebujejo protitelesa proti različnim determinantam molekule antigena, ki so v razredu (podrazredu) heterogeni.

Reakcija fiksacije komplementa (RCC) je sestavljena iz dejstva, da ko antigeni in protitelesa ustrezajo drug drugemu, tvorijo imunski kompleks, na katerega je komplement (C) pritrjen preko Fc fragmenta protiteles, tj. Komplement veže antigen- kompleks protiteles. Če kompleks antigen-protitelo ne nastane, ostane komplement prost.

Specifično interakcijo AG in AT spremlja adsorpcija (vezava) komplementa. Ker se proces fiksacije komplementa ne vidi vizualno, sta J. Bordet in O. Zhangu predlagala uporabo hemolitičnega sistema (ovčji eritrociti + hemolitični serum) kot indikator, ki kaže, ali je komplement fiksiran s kompleksom AG-AT. Če AG in AT ustrezata drug drugemu, tj. nastal je imunski kompleks, potem se komplement veže na ta kompleks in hemoliza ne pride. Če AT ne ustreza AG, potem kompleks ne nastane in komplement, ki ostane prost, se poveže z drugim sistemom in povzroči hemolizo.

Napredek reakcije

Reakcija poteka v dveh fazah, ki vključujeta dva sistema; bakterijske in hemolitične. Prva reakcija (specifična) vključuje antigen 4-+ protitelo + komplement. Za pozitiven rezultat reakcije, ki se pojavi, ko protitelesa ustrezajo antigenu, je značilna tvorba specifičnega bakterijskega kompleksa antigen-protitelo z adsorbiranim ali, kot pravijo, "vezanim" komplementom. Ker ostaja neviden, kompleks ne povzroča nobenega zunanje spremembe okolje, v katerem je nastala. Negativen rezultat CSC se pojavi, ko ni specifične afinitete med antigenom in serumskim protitelesom in je zanj značilno zadrževanje prostega aktivnega komplementa. Prvo fazo RSK lahko izvajamo v termostatu pri 37°C (1-2 uri) ali v hladilniku pri 3-4°C (18-20 ur). Pri dolgotrajni tvorbi imunskega kompleksa antigen-protitelo na mrazu pride do popolnejše vezave komplementa in posledično se poveča občutljivost reakcije. Pri postavitvi primerjalnih poskusov sovjetskega imunologa akad. V. I. Ioffe in njegovi učenci so pokazali, da lahko v pogojih dolgotrajne fiksacije komplementa na mrazu ujamejo 100-500-krat manjše količine antigena in dobijo pozitivne rezultate pri visokih razredčinah imunskega seruma kot v poskusu fiksacije komplementa pri temperaturi 37 ° C v 1-2 urah Druga faza reakcije (indikator) se pojavi med reagenti hemolitičnega sistema (mešanica 3% suspenzije eritrocitov in hemolitičnega seruma v enakih količinah) pri temperaturi 37 ° C samo v prisotnosti komplementa, ki ostane prost iz prve faze reakcije (negativna reakcija). V odsotnosti prostega aktivnega komplementa ne pride do hemolize eritrocitov pod delovanjem specifičnih hemolizinov (reakcija je pozitivna).

Komponente

Test vezave komplementa (RCC) je kompleksen serološki test. Za izvedbo je potrebnih 5 sestavin, in sicer: AG, AT in komplement (prvi sistem), ovčji eritrociti in hemolitični serum (drugi sistem).

Antigen za CSC so lahko kulture različnih ubitih mikroorganizmov, njihovi lizati, sestavine bakterij, patološko spremenjeni in normalni organi, tkivni lipidi, virusi in materiali, ki vsebujejo virus.

Kot dopolnilo se uporablja sveža ali suha sirotka. morski prašiček.

reakcijski mehanizem

RSK poteka v dveh fazah: 1. faza - inkubacija mešanice, ki vsebuje tri komponente antigen + protitelo + komplement; 2. faza (indikator) - odkrivanje prostega komplementa v mešanici z dodajanjem hemolitičnega sistema, ki ga sestavljajo ovčji eritrociti, in hemolitični serum, ki vsebuje protitelesa proti njim. V 1. fazi reakcije med tvorbo kompleksa antigen-protitelo pride do vezave komplementa, nato pa v 2. fazi ne bo prišlo do hemolize eritrocitov, senzibiliziranih s protitelesi; reakcija je pozitivna. Če se antigen in protitelo ne ujemata (v testnem vzorcu ni antigena ali protitelesa), ostane komplement prost in se v 2. fazi pridruži kompleksu eritrocit-antieritrocitno protitelo, kar povzroči hemolizo; reakcija je negativna.

Aplikacija

Fiksacijo komplementa lahko uporabimo za:
1) odkrivanje specifičnih protiteles v neznanem serumu na podlagi njihove interakcije z antigenom znane narave;
2) preučevanje lastnosti antigena v reakciji z znanim specifičnim serumom. Priprava sestavin za nastavitev RSK.

1. Krvni serum, pridobljen za študijo, na predvečer nastavitve reakcije segrevamo v vodni kopeli pri 56 ° C 30 minut, da inaktiviramo lastni komplement. Inaktiviran serum lahko hranite pri 3-4°C 5-6 dni. Na dan poskusa serum razredčimo z izotonično raztopino natrijevega klorida v razmerju 1:5 (0,1 ml testnega seruma + 0,4 ml izotonične raztopine natrijevega klorida).

2. Antigen za uprizoritev RSK so lahko kulture različnih mikrobov, bakterijski proteini in izvlečki, pridobljeni iz mikrobnih kultur, patološko spremenjenih in normalnih organov in tkiv. Značilnosti priprave antigena so določene z naravo infekcijski proces in značilnosti njegovega povzročitelja.

3. Komplement je mešanica seruma, pridobljena iz 3-5 zdravih morskih prašičkov, ali suh komplement v ampulah.

Tik pred uporabo razredčimo serum morskega prašička z izotonično raztopino atrijevega klorida v razmerju 1:10 in tako dobimo osnovno raztopino.

4. Hemolitični serum se inaktivira s segrevanjem pri temperaturi 56 °C 30 minut pred začetkom poskusa. Za ugotavljanje osnovnega izkustva RSK ter za titracijo komplementa in antigena uporabljamo trojni titrski hemolitični serum. Na primer, če je titer hemolitičnega seruma 1:1800, se v reakciji uporabi serum, razredčen 1:600.

5. Eritrociti so pridobljeni iz defibrinirane ovčje krvi. Kri za odstranitev fibrinskih filmov filtriramo skozi troslojni filter iz gaze. Nastali filtrat centrifugiramo, serum aspiriramo in odcedimo, eritrocite pa 3-4 krat speremo s centrifugiranjem z izotično raztopino natrijevega klorida. Pri zadnjem izpiranju eritrocitov mora biti supernatantna plast tekočine popolnoma prozorna. Iz opranih eritrocitov pripravimo 3% suspenzijo v izotonični raztopini natrijevega klorida. Po pripravi sestavin, vključenih v CSC na zgornji način, začnejo titrirati hemolitični serum, komplement in antigen.



reakcija hemolize.

Reakcija hemolize (RG) - To je uničenje rdečih krvnih celic z delovanjem protiteles s sodelovanjem komplementa.

RG komponente.

1. Antigen- 3% suspenzija eritrocitov v izotonični raztopini natrijevega klorida;

2. Protitelesa - hemolitični serum- serum, ki vsebuje protitelesa proti eritrocitom (hemolizini); serum se pridobiva z imunizacijo kuncev z ovnovimi eritrociti;

3. Dopolnjujejo- sistem krvnih proteinov, ki se adsorbirajo na kompleks antigen-protitelo in tvorijo membranski napadalni kompleks, ki uniči antigen, t.j. uniči eritrocite ali kako drugače povzroči lizo eritrocitov ( hemoliza). Kot dopolnilo, sveže pripravljeno krvni serum morskih prašičkov.

Če v epruveto damo eritrocite, hemolitični serum in komplement v določenih količinah, bo v nekaj minutah prišlo do uničenja (hemolize) eritrocitov, zaradi česar bo temno rdeča zmes postala rožnata ("lakirana kri") .

Reakcija hemolize se uporablja kot indikator pri postavljanju reakcije fiksacije komplementa.

Test vezave komplementa (CFR) je kompleksna serološka reakcija, ki vključuje 2 sistema antigen-protitelo in komplement. 1. sistem - specifična, 2. - hemolitična sistem.

To reakcijo sta razvila J. Bordet in O. Zhangu, ki sta ugotovila, da se med tvorbo kompleksa antigen-protitelo na ta kompleks veže komplement. Vidni učinek pri čemer ni vidno, torej za odkrivanje vezave komplementa (in posledično za odkrivanje tvorbe kompleksa antigen-protitelo, ko ustrezata drug drugemu), tj. kot indikator 2. - uporablja se hemolitični sistem.

RSK se pogosteje uporablja za serodiagnostiko (odkrivanje protiteles proti povzročitelju bolezni v krvnem serumu bolnika). ) gonoreja, sifilis, oslovski kašelj, tifus in druge rikecioze ter številne virusne bolezni. RSK se uporablja tudi za identifikacijo seroidov.

komponente RSK.

1. Antigen- izvlečki mikrobov, hapteni, manj pogosto - suspenzija mikrobov, tj. antigen je lahko korpuskularen (netopen) ali molekularni (topen).

2 . Protitelesa- krvni serum bolne osebe (za serodiagnostiko) ali imunski diagnostični serum, ki vsebuje znana protitelesa (za seroididentifikacijo).

3. Ovčji eritrociti – antigeni hemolitična reakcija.

4. Hemolitični serum- serum, ki vsebuje protitelesa na ovčje eritrocite. Serum prejeti z imunizacijo zajca z ovnovimi eritrociti.

5. Dopolnjujejo– sveže pripravljen serum morskega prašička (tekoči ali liofiliziran).

6. elektrolit- izotonična raztopina natrijevega klorida.

nastavitev RSK.

Pred postavitvijo poskusa titriramo antigen, bolnikov serum, hemolitični serum in komplement (določimo njihov titer). Pacientov serum 30 minut segrevamo pri 56°C.

RSC se izvaja v 2 faza.

I faza - specifična: v eni epruveti pripravimo določen sistem - zmešamo enake količine znanega antigena, bolnikovega seruma in komplementa, v drugi epruveti pripravimo hemolitični sistem - mešanico ovčjih eritrocitov in hemolitičnega seruma, epruvete postavimo v termostatu pri 37 °C 30 minut. Hkrati se pripravijo kontrole za antigen, komplement in hemosistem, kontrolni vzorci s serumom znano bolne osebe (pozitiven serum) in znano zdrave osebe (negativni serum) ter se prav tako postavijo v termostat za 30 minut.

II faza - indikator: enaka količina hemolitičnega sistema se doda začetni mešanici in vsem kontrolnim epruvetam, rezultati reakcije pa se upoštevajo po 30-minutnem držanju v termostatu.

Obračunavanje rezultatov RSC izvedeno z odličnimi rezultati pri kontrolah .

pozitivna reakcija(človek je bolan in njegov serum vsebuje ustrezna protitelesa proti povzročitelju bolezni - antigen): v I. fazi nastanejo kompleksi antigen-protitelo v specifičnem sistemu, na katerega se veže komplement, po dodajanju hemolitičnega sistema v fazi. II, hemolize ni opaziti, ker je komplement vezan na 1. specifični sistem. Vidni učinek- izobraževanje eritrocitni sediment.

Negativna reakcija(oseba je zdrava in v njenem serumu ni protiteles proti povzročitelju bolezni): kompleksi antigen-protitelo se ne tvorijo in komplement v I. fazi ostane prost, po dodatku hemolitičnega sistema v II. komplement se veže na tu nujno prisotne komplekse antigen-protitelo (to so eritrocit- antieritrocitna protitelesa) in povzroči hemolizo eritrocitov. Vidni učinek- hemoliza eritrocitov, "lak krvi".

Uporabljajo se tudi pri diagnozi nalezljivih bolezni reakcija nevtralizacije (RN) toksina z antitoksičnim serumom, imunofluorescenčna reakcija (RIF), radioimunski test (RIA), encimski imunski test (ELISA).

IN Reakcija temelji na dveh pojavih - bakteriolizi in hemolizi. Komplement je vključen v njihovo manifestacijo. Zato se v RSC uporabljata dva sistema komponent: 1) zagotavlja pojav bakteriolize in se uporablja v diagnostične namene; 2) hemolitično, indikatorsko, pomožno; vam omogoča, da ugotovite, ali je bil komplement vezan ali ne vezan v prvem sistemu (glejte barvno shemo na sliki I). Prej so kot antigen uporabljali suspenzijo bakterij, zato so prvi sistem imenovali bakteriolitični (v pozitivnih primerih je prišlo do lize bakterije).

Nastavitev RSC poteka v dveh fazah. Na prvi stopnji pripravimo bakteriolitični sistem: 0,5 ml testnega seruma zmešamo z antigenom v epruvetah, dodamo komplement v strogo določenem odmerku (titru). Mešanica antigen - serum-komplement (bakteriolitični sistem) hranimo v vodni kopeli (ali termostatu) 20 ... 40 minut pri 37 ... 38 "C. Rezultat interakcije komponent v epruveti je neviden, tekočina ostane prozorna in brezbarvna.Za določitev, kontakt Če je komplement v bakteriolitičnem sistemu, se izvede druga faza reakcije: v epruvete dodamo sestavine hemolitičnega sistema - oprane ovčje eritrocite in inaktivirani hemolitični serum, kot je prikazano na shemi. Vse komponente bakteriolitičnega sistema stresamo, da se premešajo v epruveti, postavimo v vodno kopel pri 37 ... 38 "C za 20 ... 40 min. Nato dodamo komponente gemološkega sistema, vse skupaj še enkrat pretresemo in ponovno postavimo v vodno kopel za 10–15 minut.

Preliminarni rezultat. Če je serum pridobljen od bolne živali, potem vsebuje protitelesa, ki se kombinirajo s specifičnim antigenom. Na ta kompleks (antigen – protitelo) se veže komplement – ​​do hemolize ne pride, rezultat je pozitiven.

V serumu zdrave živali ni protiteles: kompleks antigen-protitelo se ne tvori, komplement v bakteriološkem sistemu se ne veže. Ko dodamo eritrocite in hemolizin (to je antigen in protitelo), komplement reagira s tem kompleksom - pride do hemolize, rezultat je negativen (glej barvno sliko II).

Končni obračun rezultata. Epruvete pustimo na sobni temperaturi 15...20 ur.Če je bil serum v bakteriolitičnem sistemu od bolne živali, se v epruveti tvori specifičen kompleks antigen-protitelo, ki adsorbira (veže) ves dodani komplement. Posledično v drugem, hemolitičnem, sistemu hemolize ne bo prišlo, eritrociti se bodo usedli na dno epruvete, supernatant je prozoren. Izvid RSC je pozitiven.

Če v testnem serumu ni specifičnih protiteles proti uporabljenemu antigenu (v primerih, ko je serum zdrave živali), se v bakteriolitičnem sistemu ne tvori kompleks antigen-protitelo in zato komplement v tem sistemu ni adsorbira, vendar ostane prost. Pri dodajanju komponent hemolitičnega sistema (v drugi fazi reakcije) pride do interakcije komplementa z drugim kompleksom (hemolizin – eritrociti), pride do hemolize eritrocitov – oborina ne nastane, tekočina v epruveti je lakasto rdeča. . Rezultat RSK je negativen.

RSK. uporaba: 1) za odkrivanje specifičnih protiteles v serumu bolne živali (pri diagnozi bruceloze, peripnevmonije, smrkavosti, leptospiroze, tripanosomiaze itd.); 2) za odkrivanje specifičnega antigena (bakterijskega ali virusnega) v testnem materialu v prisotnosti specifičnega imunskega seruma.

Za nastavitev RSK morate imeti: vzorce seruma, prejete za raziskave; dva seruma, znano pozitivna (standard, ki daje pozitiven rezultat), in dva normalna seruma. Vsi serumi v razredčini 1:10 se inaktivirajo pri 56 do 58 °C 30 minut; antigen v razredčitvi glede na titer; komplement, razredčen v skladu z ugotovljenim titrom med titracijo v bakteriolitičnem sistemu; hemolizin v delovnem titru; ovčji eritrociti (I: 40); fiziološka raztopina, graduirane pipete, epruvete, stojala, vodna kopel pri 37...38 °C.

Pred postavitvijo RSK ovčjo kri defibriniramo, eritrocite speremo fiziološka raztopina s centrifugiranjem do popolne prozornosti supernatanta, ki ga odsesamo, oborjene eritrocite pa razredčimo v fiziološki raztopini 1:40 (2,5%). Antigen razredčimo glede na titer, ki ga na etiketi navede biotovarna. Hemolizin in komplement titriramo pred nastavitvijo RSK.

Antigen za CSC pripravljajo v biotovarnah. Običajno so to izvlečki uničenih mikrobnih suspenzij (ali tkiv, ki vsebujejo virus). Antigeni ne smejo imeti hemolitičnega učinka, ki ga nadzorujemo med reakcijo (v epruveto vlijemo 1 ... 2 odmerka antigena in 0,5 ml suspenzije eritrocitov: hemolize ne sme biti). Na ampuli z antigenom biotovarna navaja, da je namenjen za RSK (sapni, bruceloza ali drugo). Na embalažni škatli je navedena številka serije, datum izdelave, rok uporabnosti, aktivnost antigena, to je, v kakšni razredčitvi je treba uporabiti pri nastavitvi RSK (1: 100, 1: 150 itd.). Pri nekaterih boleznih drugi materiali služijo kot antigeni; na primer za diagnozo peripnevmonije velikega govedo antigen za CSC je limfa teleta, eksperimentalno okuženega subkutano ali intraplevralno. Pri dolgotrajnem shranjevanju antigenov se njihov titer ponovno preveri v laboratoriju po posebni shemi titracije.

Testne serume, prejete za študijo, razredčimo s fiziološko raztopino 1: 5 ali 1: 10, inaktiviramo s segrevanjem v vodni kopeli, da uničimo lasten komplement 30 minut pri 56 ... 58 "C (serumi oslov, mul, mezgov). - pri 61 °C).

Hemolizin pripravljajo v biotovarnah s hiperimunizacijo kuncev s spranimi ovnovimi eritrociti. Da bi to naredili, kunce intravensko injiciramo 4-5-krat v 2-3-dnevnih intervalih s 40-50% suspenzijo eritrocitov. Teden dni po zadnji injekciji kuncem vzamemo kri, serum sterilno aspiriramo, inaktiviramo, konzerviramo z glicerolom 1: 1 ali 0,5% fenola, titriramo, vlijemo v ampule. V laboratorijih jih pred nastavitvijo RSK ponovno titriramo.

Shema titracije hemolizina. Pripravite: i) razredčino komplementa 1:20; 2) hemolizin 1:100 (0,2 ml hemolizina + 9,8 ml fiziološke raztopine); 3) suspenzija ovčjih eritrocitov 1:40; 4) fiziološka raztopina NaCl.

Za postavitev titracijske reakcije se v stojalo postavita dve vrsti epruvet - ena pomožna samo za pripravo razredčin hemolizina, druga pa za samo titracijo. Začetno razredčino hemolizina 1: 100 dodamo v prvo epruveto vsake vrste, nato pa naredimo serijsko redčenje. Vse epruvete pretresemo in postavimo v vodno kopel pri 37 do 38 °C za 10 do 15 minut. Upoštevanje rezultata: v tem primeru je najmanjša količina (ali njena največja razredčitev), ki je dala popolno hemolizo, 1: 2000, tj. to je njen dejanski titer. Delovni titer je 2-krat bolj koncentriran - 1:1000.

0,5 ml (označeno s puščicami) vsake razredčine iz epruvet prve vrste se prenese v ločene epruvete druge vrste. V vse epruvete druge vrste dodamo 0,5 ml komplementa (1: 20), 0,5 ml ovčjih eritrocitov (2,5 % suspenzija ali 1: 40) in 1 ml fiziološke raztopine, tako da je volumen tekočine v vsaki viali 2,5 ml

Opomba. Glede na to, da bo pri končnem strjevanju RSC sodelovalo 5 komponent po 0,5 ml, ki bodo tvorile prostornino 2,5 ml, se ta prostornina upošteva skozi celotno delo.

Epruvete pretresemo in postavimo v vodno kopel za 10-15 minut. Do hemolize bo prišlo predvsem v epruvetah z visoko vsebnostjo hemolizina (njegova najmanjša razredčina je 1:500, 1:1000 ...). Najmanjšo količino hemolizina (njegovo največjo razredčitev), ki je v teh pogojih povzročila popolno hemolizo eritrocitov, imenujemo mejni (dejanski) titer hemolizin. Za nadaljnje delo se hemolizin uporablja 2-krat bolj koncentriran, to je v dvojni količini, dvojni titer, ki se imenuje delovni naslov. Na primer, če je dejanski titer I:2500 (ali 1:2000), potem delovni titer ustreza razredčitvi 1:1250 (ali 1:W00).

K o m p l e m e n t je komponento svež serum, limfa, tkivne tekočine različni tipiživali (in ljudje); odkril Buchner (1889). Pri žuželkah je komplement odsoten. Komplement je snov beljakovinske narave, kompleksne zgradbe, ki se hitro inaktivira s segrevanjem, dolgotrajnim skladiščenjem, izpostavljenostjo ultravijoličnemu sevanju, močnim stresanjem, filtracijo skozi keramične filtre, dodatkom kaolina, kislin, alkalij, alkohola, acetona, kloroforma, destil. voda, suspenzija bakterij itd. Komplement lahko ohranimo z dodatkom 5 g natrijevega sulfata, 4 g na 100 ml seruma morskega prašička. Borova kislina. Delovanje komplementa se ohranja do šest mesecev. Najboljši način konzerviranje - sušenje pod vakuumom pri nizki temperaturi (liofilizacija). V zaprtih ampulah v tem stanju se hrani dve leti. Pred vsako proizvodnjo RSK se aktivnost komplementa preveri s titracijo, to je, da se določi njegov titer - optimalna količina, potrebna za to reakcijo. Komplement dvakrat titriramo: v hemolitičnem in bakteriolitičnem sistemu.

Za titracija komplementa v hemolitičnem sistemu pripravimo komponente: komplement v razredčini 1: 20 (1 ml komplementa + 19 ml fiziološke raztopine); hemolizin, razredčen glede na delovni titer; suspenzija opranih ovčjih eritrocitov (1: 40), fiziološka raztopina. Epruvete postavimo v stojalo in vanje z graduirano pipeto vlijemo različne količine komplementa z intervalom 0,03 ml (0,13; 0,16; 0,19; 0,22 ..: do 0,43 ml). Nato dodajte preostale komponente (slika 57). Vse epruvete pretresemo in postavimo v vodno kopel pri 37...38 °C za 10...15 minut in rezultat zabeležimo.

Upoštevanje rezultata: kot titer komplementa se vzame najmanjša količina komplementa, ki je zagotovila popolno hemolizo (v tem primeru 0,25 ml).

Rezultat titracije upoštevamo v epruvetah z največ odlična vsebina komplementa, kjer se najprej pričakuje hemoliza. Najmanjša količina komplementa, ki v teh pogojih zagotavlja popolno hemolizo eritrocitov, se imenuje titer komplementa v hemolitičnem sistemu.

Za titracijo komplementa v bakteriolitičnem sistemu imeti je treba vse sestavine reakcije: komplement (1:20), eritrocite (1:40), hemolizin v delovnem titru, dva pozitivna in dva normalna seruma, specifičen antigen. Serume razredčimo s fiziološko raztopino 1:10, inaktiviramo 30 minut pri 56...58 X. Vsak serum vlijemo v dve vrsti 0,5 ml epruvet. Komplement dodajamo v naraščajočih količinah v epruvete vsake vrste, kot pri titraciji v hemolitičnem sistemu; začnemo s količino, vzeto kot titer v hemolitičnem sistemu, nato pa v vsaki naslednji epruveti odmerek povečamo za 0,03 ml, tako da volumen izravnamo na 0,5 ml s fiziološko raztopino.

Nato v eno vrsto epruvet s pozitivnimi in normalnimi serumi dodamo 0,5 ml antigena, v drugo vrsto vsakega seruma pa dodamo 0,5 ml fiziološke raztopine. Vse epruvete pretresemo in postavimo v vodno kopel za 30–40 minut. Nato v vse epruvete dodamo 0,5 ml hemolizina in 0,5 ml eritrocitov, pretresemo in postavimo v vodno kopel za 10-15 minut. Najmanjša količina komplementa, ki je zagotovila popolno lizo eritrocitov v obeh vrstah epruvet (z antigenom in brez antigena) dveh normalnih serumov, v eni vrsti (brez antigena) vsakega pozitivnega seruma in s popolno zakasnitvijo (odsotnostjo) hemolize v vrste pozitivnih serumov z antigenom (v tistih enakih odmerkih komplementa), imenujemo titer komplementa, ki se uporablja pri oblikovanju glavne izkušnje RSC v diagnostičnih študijah.

Glavna izkušnja RSC (pravzaprav diagnostična študija). Dve vrsti epruvet sta postavljeni v stojala glede na število preiskovanih vzorcev seruma. 0,5 ml vsakega inaktiviranega seruma vlijemo v dve epruveti: v eno dodamo antigen - 0,5 ml, v drugo dodamo 0,5 ml fiziološke raztopine (brez antigena) in z dodatkom komplementa tvorimo bakternolitični sistem, in nato dodamo hemolitični sistem.

Zahtevane sestavine: 1) testni serum, inaktiviran, razredčen s fiziološko raztopino 1: 10; 2) specifični antigen, razredčen glede na titer, ki ga biotovarna navede na etiketi embalaže; 3) komplement v ugotovljenem titru; 4) hemolizin v delovnem titru; 5) suspenzija opranih ovčjih eritrocitov 1: 40; 6) fiziološka raztopina NaCl. Testne serume vlijemo v dve vrsti epruvet. Za poljubno število testiranih serumov se kot kontrole uporabijo znani pozitivni serumi (ki dajejo pozitiven rezultat) in normalni serumi (zdrave živali, ki dajejo negativen rezultat).

Epruvete s komponentami bakteriolitičnega sistema stresamo, postavimo v vodno kopel 20 do 40 minut pri 37 do 38 ° C. Epruvete bakteriolitičnega sistema druge vrste brez antigena stresamo, postavimo v vodno kopel pod enakimi pogoji.

Nato v vse epruvete prve in druge vrste dodamo komponente hemolitičnega sistema in jih drugič postavimo v vodno kopel za 10..15 minut. V vseh epruvetah druge vrste brez antigena pride do popolne hemolize.

Do končnega rezultata pustimo epruvete pri sobni temperaturi 18 ... .

Indikacije reakcije v epruvetah s testnimi serumi veljajo za zanesljive, če v epruvetah s pozitivnimi serumi in antigenom ni hemolize, s popolno hemolizo v epruvetah s pozitivnim serumom brez antigena in v vseh epruvetah z znanim normalnim serumom (slika 2). 61).

To reakcijo morajo spremljati kontrole antigena, komplementa, hemolizina, eritrocitov. Da bi to naredili, se antigen z ovčjimi eritrociti vlije v ločene epruvete; komplement z eritrociti brez hemolizina; hemolizin z eritrociti brez komplementa; eritrocitov in fiziološke raztopine. Volumen v vsaki epruveti se prilagodi s fiziološko raztopino na 2,5 ml. Epruvete pretresemo in postavimo v vodno kopel pri 37 °C za 20 minut. V vseh kontrolnih epruvetah ne sme biti hemolize.

rezultat RSC običajno izraženo v križih. Indikatorji pozitivnega rezultata reakcije: + + + + (///) - popolna sedimentacija eritrocitov (brez hemolize), tekočina nad usedlino je brezbarvna, + + + (///) - tekočina nad usedlino je komaj zaznavno obarvana rumenkasto. Dvomljiv rezultat reakcije: prisotnost usedlih eritrocitov na dnu in delno obarvanje supernatantne tekočine zaradi lize dela eritrocitov je označeno z + + - (++), to je dva in dva in a pol križi. Izrazita hemoliza (brez sedimenta) ali z majhnim sedimentom (+) je negativen rezultat.

Dolgotrajna reakcija vezave komplementa (RDSC). Bolj učinkovit pri občutljivosti, v nasprotju z običajnim klasičnim RSC. Bistvo reakcije je, da se bakteriolitični sistem vzdržuje na treh različnih temperaturni pogoji: po mešanju komponent pri sobni temperaturi 15 minut, nato pri nizki temperaturi (4 ° C) v hladilniku 18 ... 20 ur in v vodni kopeli 15 minut. Nato dodamo hemolitični sistem, pretresemo, ponovno postavimo v vodno kopel in zabeležimo reakcijo, kot pri RSC. Potrjena je bila učinkovitost RDSC pri diagnostiki številnih nalezljivih bolezni (tuberkuloza, vibrioza, bruceloza itd.).

Reakcija supresije vezave komplementa (RPSK) ali reakcija inhibicije, posredna RSK. V to reakcijo je vključena še ena komponenta - standardni imunski serum, ki vsebuje protitelesa proti antigenu, ki se običajno uporablja za diagnostiko in zato pozitivno reagira pri klasičnem CSC.

Testni serum zmešamo z antigenom in nekaj časa hranimo brez komplementa. Nato dodamo komplement in standardni serum, epruvete pretresemo in postavimo v vodno kopel za 20...30 minut, nakar dodamo hemolitični sistem in ponovno postavimo v vodno kopel. Če hemolize ni, je rezultat negativen, ker testni serum ni reagiral z antigenom, slednji pa z standardni serum z vezavo komplementa. Če je testni serum bolne živali, vsebuje specifična protitelesa glede na antigen, to pomeni, da pride do reakcije med antigenom in protitelesi brez vezave komplementa. Antigen, ki medsebojno deluje s protitelesi testnega seruma, ne reagira (se potisne) s standardnim (očitno znanim specifičnim) serumom, komplement ostane prost in reagira v hemolitičnem sistemu - pride do hemolize, rezultat reakcije je pozitiven. glede na testni serum.

Metoda fluorescenčna protitelesa (MFA). Možnosti te metode so posledica specifičnosti prve faze seroloških reakcij z visoko občutljivostjo luminiscentne analize. Za izvedbo MFA so potrebni visokospecifični imunski luminiscenčni serumi. Znano je, da različni serološki testi, ki se uporabljajo v mikrobiološki praksi, vključujejo predvsem tri komponente: bakterijski antigen, protitelo in komplement. Vse tri komponente so pravzaprav antigeni in proti vsakemu od njih lahko dobimo imunske serume in s tem luminescentna protitelesa. Glede na vrsto uporabljenega luminiscenčnega seruma (proti bakterijskemu antigenu, protibakterijskim protitelesom, komplementu) obstajajo tri glavne različice metode fluorescenčnih protiteles: direktna (1) in indirektna (2) različica ter modifikacija posredne variante z uporabo komplementa. Imunološka reakcija med antigenom in protitelesom poteka v teh modifikacijah neposredno na stekelcu. Za fiksiranje mikroorganizmov se uporabljajo organska topila: aceton, etanol, metanol, dioksan, pa tudi običajna fiksativa, ki se uporabljajo v mikrobiološki praksi: formalin, Nikiforova mešanica, Carnoyeva tekočina itd.

Neposredna možnost. Na končni izdelek se nanese poseben svetleči serum določen čas, nato odvečni serum odcedimo, zdravilo speremo in pregledamo pod fluorescentnim mikroskopom. Ta metoda se uporablja za odkrivanje bakterij v patološkem materialu, predmetih zunanje okolje, kot tudi za identifikacijo patogenov v kulturah.

Posredna (dvostopenjska) možnost. Na prvi stopnji pride do specifične povezave antigena z ustreznim protitelesom neoznačenega seruma. V drugi fazi se specifično neoznačeno protitelo veže na protivrstno luminiscenčno protitelo, ki ga vsebuje serum živali, imunizirane z globulini (ali polnim krvnim serumom) živalske vrste, iz katere je bil uporabljen imunski serum.

Posredna antikomplementarna (tristopenjska) varianta. Prva faza: tvorba kompleksa antigen-neoznačeno protitelo. Drugi korak: plastenje normalnega seruma, ki vsebuje komplement. Tretja stopnja: kompleks antigen-protitelo-komplement obdelamo z luminiscenčnim antikomplementarnim serumom, pripravljenim med imunizacijo kuncev s serumom živalske vrste, ki je služila kot vir komplementa.

Posredne različice MFA se lahko uporabljajo za odkrivanje antigena in protiteles. Poleg tega morate za postavitev dvostopenjske variante imeti omejen nabor luminiscenčnih serumov proti vrsti (proti globulinom bika, ovce, konja, prašiča itd.), za antikomplementarno varianto pa dovolj je samo en luminescentni serum proti globulinom morskih prašičkov.

Tehnika in imunoluminiscenca ter mikroskopija. V praksi veterinarskih bakterioloških laboratorijev se uporabljajo luminiscentni serumi biotovarniške proizvodnje. Odvisno od vrste fluorokroma luminiscenčni serumi zagotavljajo bodisi zelen sijaj predmeta (barvilo na osnovi fluorescence) ali rdeč (barvilo na osnovi rodamina).

Za izvajanje imunoluminiscenčne mikroskopije je treba preskusni material nanesti na razmaščeno, tanko stekelce brez prask. Pri preučevanju organov in tkiv živali se preparati-odtisi pripravijo v tankem sloju. Preparate sušimo na zraku in damo v fiksirno tekočino (etanol - 15 min, metanol - 5 min, aceton - 5 min). Po potrebi lahko pripravke po fiksiranju nekaj časa shranite v hladilniku. Zaporedje in nadaljnji postopki so odvisni od vrste uporabljene MFA (enostopenjska, dvostopenjska, tristopenjska). Obdelavo preparatov z luminiscenčnimi serumi, kot tudi neoznačenimi serumi prve stopnje in komplementom izvajamo pri 37 X v vlažni komori (petrijevke z navlaženim filtrirnim papirjem).

Enostopenjska možnost. Luminescentni serum nanesemo na predmetno stekelce s fiksiranim testnim materialom (v razredčitvi, navedeni na ampuli). Zdravilo se postavi v vlažno komoro za 15 do 20 minut pri 37 "C. Nato se v posodi spere s pufrano fiziološko raztopino (pH 7,4), raztopina se po 5 do 10 minutah večkrat spremeni ali pod vodo iz pipe za 3...5 minut. Voda mora biti nevtralna in brez železa. Nato se pripravek (na enem kozarcu je lahko več madežev) posuši na zraku ali filtrirnem papirju, nato pa se doda kapljica pufranega glicerola z Nanesemo pH 8,0 in pokrijemo s pokrovnim stekelcem. Potopno nefluorescenčno tekočino nanesemo na pokrovno stekelce in mikroskopiramo.

Dvostopenjska možnost. Kapljico imunskega neoznačenega seruma prve stopnje nanesemo na predmetno stekelce s testnim materialom. Zdravilo se postavi v termostat v vlažno komoro 15 do 20 minut. Nato ga operemo, kot je opisano zgoraj, posušimo in nanesemo kapljico svetlečega seruma proti vrstam. Zdravilo ponovno postavimo v termostat v vlažno komoro za 15-20 minut. Postopek pranja ponovimo in osušimo s filtrirnim papirjem. Nanese se pufrani glicerol, prekrije s pokrovom, nanese se nefluorescenčna potopna tekočina in se mikroskopira.

Tristopenjska varianta (anti-komplementarna). Kapljico imunskega neoznačenega seruma prve stopnje nanesemo na predmetno stekelce s testnim materialom. Zdravilo damo v termostat, kot je opisano zgoraj, posušimo in na bris nanesemo kapljico komplementa. Zdravilo ponovno postavimo v vlažno komoro in v termostat za 15 do 20 minut, nato ga speremo in nanesemo luminiscenčni antikomplementarni serum. Nadaljnji postopki so podobni enostopenjski možnosti.

Priprava in obdelava kontrolnih pripravkov. 1. Za neposredno možnost je treba za določitev specifičnosti reakcije med antigenom in luminescentnim serumom z istim serumom obdelati brise heterolognih mikrobnih vrst. Te vrste bi morale biti antigensko podobne, vendar se po morfologiji razlikujejo od proučevanih mikroorganizmov; oddaljeni v antigenskem odnosu do proučevanih mikroorganizmov, vendar podobni po morfologiji in porazdelitvi z njimi. Preparate za odtise obdelamo z luminiscenčnim normalnim serumom.

2. Za indirektno varianto so potrebni trije kontrolni preparati tretirani z normalnim serumom, luminiscentni antispecies serum brez imunskega neoznačenega seruma in luminiscentni antispecies serum z znanim imunskim serumom prve stopnje.

3. Za posredno možnost z dopolnilom potrebni so kontrolni pripravki, pri katerih se imunski serum nadomesti z običajnim serumom iste vrste in v enakih razredčinah, ter pripravki, tretirani z vsemi sestavinami razen imunskega seruma.

Vrednotenje rezultatov. Upoštevajo se svetlost, barva, lokalizacija in struktura sijaja. Bakterije, obarvane z luminiscenčnim serumom, označenim s fluorescein izotiocianatom, imajo na obodu svetlo zelen sij v obliki roba ali haloja, osrednji del sveti šibko. Tak sij imenujemo specifičen, za razliko od nespecifičnega, ko celotno telo celice sveti enakomerno. Bolj konveksno leži bakterijska celica v preparatu, ostrejši je rob. Ta sij je mogoče razložiti z dejstvom, da se na mrežnico opazovalca projicira nekajkrat več protiteles iz enote površine "obrobja" celice kot iz osrednjega dela mikrobne celice. Upoštevati je treba, da plastične celice (leptospire, vibriosi) nimajo konture ali pa je komaj opazna. V celicah, potopljenih v tkivno tekočino in v mladih bacilih antraks kontura je običajno izražena neostro.

Intenzivnost luminescence se oceni po sistemu štirih križev: + + + + - zelo svetla fluorescenca vzdolž periferije mikrobne celice, ki je v jasnem kontrastu s temnim telesom celice; + + + - svetla fluorescenca periferije celice; + + - šibek sijaj periferije celice; + - brez kontrastnega sijaja obrobja telesa mikrobne celice. Odsotnost specifičnega sijaja je označena z "-" (vidne so sence mikroorganizmov). Pri diagnosticiranju različnih patogenov pozitiven rezultat najpogosteje se šteje, da specifična luminiscenca bakterijskih celic ni nižja od štirih ali treh križev.