immuunireaktiot. Immuunivasteiden soveltaminen diagnostiikassa tarttuvat taudit.
SUUNNITELMA:
Immuunireaktioiden tyypit.
Serologisten reaktioiden suorittamisen edellytykset.
Seerumin vaatimukset.
Positiivisten ja negatiivisten tulosten käsite.
PÄÄSISÄLTÖ:
Immuunireaktioiden tyypit.
Immunologinen reaktio – tämä on antigeenin vuorovaikutusta vasta-aineen kanssa, joka määräytyy vasta-aineen (paratoopin) aktiivisten keskusten spesifisen vuorovaikutuksen perusteella antigeeniepitooppien kanssa.
Immunologisten reaktioiden yleinen luokitus:
serologiset reaktiot - antigeenien (Ag) ja vasta-aineiden (Ig) väliset reaktiot
in vitro ;
solureaktiot immunokompetenttien solujen osallistumisen kanssa;
allergiset testit - yliherkkyyden havaitseminen.
Serologiset reaktiot: 1) määritelmä, 2) vaiheet, 3) tavoitteiden asettaminen, 4) yleinen luokittelu.
1) Määritelmä
Serologiset menetelmät tutkimus (lat. Serum - seerumi ja logot - opetus) käyttämällä antigeeni-vasta-ainereaktiota.
2) Vaiheet
2 vuorovaikutuksen vaihetta:
minä erityisiä (näkyvä) - tulee nopeasti, vasta-aineet yhdistyvät vastaaviin antigeeneihinsä. Determinanttiryhmät antigeenit (AG) ja aktiiviset vasta-ainekeskukset (AT) ovat vuorovaikutuksessa tässä vaiheessa.
AG + AT -kompleksin muodostumiseen osallistuvat voimat ovat:
Coulomb;
Van der Waals
Vetysidokset.
Tässä vaiheessa ei ole näkyviä muutoksia. Elektronimikroskopiassa kompleksi AG + AT hilan muodossa.
II. Epäspesifinen - tulee hitaasti, muodostunut antigeeni-vasta-ainekompleksi reagoi ympäristön, jossa reaktio tapahtuu, epäspesifisen lisätekijän kanssa, ja tämä näkyy silmällä - liimautuminen, liukeneminen, hiutaleiden saostuminen jne. elektrolyytti, varaus laskee, liukoisuus heikkenee, muodostuu näkyviä konglomeraatteja saostuneena (agglutinaattina).
3) Tavoitteiden asettaminen :
a) tunnistaa antigeeni (vasta-ainetunnettu diagnostinen seerumi):
serologinen tunnistus (lajin tunnistaminen);
serotyypitys (serovarren määritys) - kannan määritys;
patologisessa materiaalissa (pikadiagnostiikka);
puhtaassa kulttuurissa:
b) vasta-aineiden (Ig) havaitsemiseen (antigeeni tunnettu-diagnosticum):
läsnäolo (laadulliset reaktiot);
määrä (tiitterin nousu - "parillisten seerumien" menetelmä).
4) Yleinen luokitus serologiset reaktiot :
a) yksinkertainen (2-komponenttinen: Ag + Ig):
RA-agglutinaatioreaktiot (korpuskulaarisen antigeenin kanssa);
RP-saostusreaktiot (liukoisen antigeenin kanssa);
b) kompleksi (3-komponentti: Ag + Ig + C);
c) käyttämällä etikettiä.
Muunnelmia agglutinaation ja saostumisen reaktiosta
Agglutinaatioreaktio :
Agglutinaatioreaktio (RA) - immuunivaste AG:n (erytrosyytit, bakteerit) suspension vuorovaikutus AT:n kanssa fysiologinen suolaliuos.
Agglutinaation aikana AT-hiukkaset tarttuvat yhteen muodostaen flokkuloivan sakan.
Reaktio passiivinen hemagglutinaatio(RPHA) on eräänlainen agglutinaatioreaktio, jossa käytetään vasta-ainetta tai antigeenistä punasoludiagnostiikkaa (erytrosyytit, joiden pinnalle on adsorboitunut AT tai AG).
Punasolut toimivat tässä reaktiossa passiivisina kantajina.
RPGA:n tulosten arviointi suoritetaan seuraavasti:
- klo positiivinen reaktio passiivisesti liimatut punasolut peittävät U- tai V-muotoisen reiän pohjan tasaisella kerroksella, jossa on uurretut reunat ("sateenvarjo");
- klo takaisku (agglutinaation puute), erytrosyytit kerääntyvät reiän keskisyvennykseen muodostaen kompaktin "painikkeen", jolla on terävästi rajatut reunat.
Diagnoosissa käytetään hemagglutinaation estotestiä (RTGA). virusinfektiot. Jotkut virukset sisältävät pinnallaan hemagglutiniiniproteiinia, joka liimaa punasoluja yhteen. Spesifisten virusvastaisten vasta-aineiden lisääminen estää viruksen hemagglutiniinin - hemagglutinaatiota ei tapahdu.
Epätäydellisten vasta-aineiden määrittämiseen käytetään epäsuoran hemagglutinaation (RIHA) reaktiota tai Coombsin reaktiota. Antiglobuliiniseerumin (AT vastaan ihmisen Ig) lisääminen parantaa reaktion tuloksia. RNGA:ta käytetään Rh-tekijän määrittämiseen.
Agglutinaatioreaktion (RA) muodostamiseen tarvitaan kolme komponenttia:
1) antigeeni (agglutinogeeni) AG;
2) vasta-aine(agglutiniini) AT;
3)
elektrolyyttiä
(isotoninen natriumkloridiliuos).
Ag + AT + elektrolyytti = agglutinaatti
Agglutinaatio (latinasta agglutinatio - liimaus) - verisolujen (bakteerit, punasolut jne.) liimaus vasta-aineilla elektrolyyttien - natriumkloridin - läsnä ollessa.
RA ilmenee hiutaleina tai sedimentteinä, jotka koostuvat vasta-aineiden "liimatuista" verisoluista (esimerkiksi bakteereista, punasoluista).
RA:ta käytetään:
Mikrobien suoran agglutinaation reaktio (RA).
Tässä reaktiossa vasta-aineet (agglutiniinit) agglutinoivat suoraan korpuskulaariset antigeenit (agglutinogeenit).
Yleensä niitä edustaa inaktivoitujen mikro-organismien suspensio (mikrobien agglutinaatioreaktio).
käytetään mikro-organismin tyypin määrittämiseenstandardi diagnostinen agglutinaatio seerumi ( tunnettu AT ).
Yleisimmät ovat lamellaarinen (ohjeellinen) ja käyttöön otettu RA.
Lamellar RA asetetaan lasille. Sitä käytetään nopeutettuna menetelmänä vasta-aineiden havaitsemiseen tai mikro-organismien tunnistamiseen.
Komponentit:
1. tavanomaiset diagnostiset agglutinaatioseerumit (AT);
2. testaa puhdas viljelmä potilaalta;
3. suolaliuos.
Tutkitussa puhdasviljelmässä antigeenit (AG) ovat partikkelien muodossa (mikrobisolut, punasolut ja muut korpuskulaariset antigeenit), jotka tarttuvat yhteen vasta-aineiden avulla ja saostuvat.
Esimerkki:
lavastus suuntaa antava agglutinaatioreaktiot (RA ) lasin päällä suolistoryhmän bakteerien tunnistamiseksi.
Lasille levitetään tippoja:
1
punatauti
;
2
-th drop: - agglutinoi seerumin patogeeneihinlavantauti
;
(1-2 diagnostista seerumia)
3
- pisara: - suolaliuos (kontrolli).
Testattu puhdas bakteeriviljelmä lisätään jokaiseen tippaan. Sekoita.
Tulos
:
positiivinen
- agglutinaattihiutaleiden läsnäolo,
negatiivinen
- ei agglutinaattihiutaleita
Johtopäätös:Tutkitut bakteerit ovat lavantautien aiheuttajia (antigeenit määritettiin).
Potilaan seerumin vasta-aineiden määrittäminen (serologinen diagnoosi), tavallinen mikrobidiagnostinen sisältää suspensiotakuuluisa mikrobit tai niiden antigeenitAG .
ABO-järjestelmän veriryhmien määritys (hemagglutinaatioreaktio (RHA)) - agglutinoida erytrosyytit.
Reaktion komponentit:
1. AG (punasolut) testaa verta
2. AT (erytrotestit - tsoliclones)
Zoliclone setti:
Reagenssi Tsoliklon anti-A (vaaleanpunainen)
Reagenssi Tsoliklon anti-B (sininen)
Zoliclone anti-AB -reagenssi (väritön)
3. elektrolyytti (suolaliuos)
Määritelmätekniikka:
1
.
Yksi tippa (0,1 ml) anti-A-, anti-B- ja anti-AB-tsoliklonia (kontrollia varten) laitetaan tabletin kuoppiin.
2.
Jokaisen reagenssipisaran viereen laitetaan pieni (0,05-0,01 ml) pisara testiverta.
Sitten pisara tsoliklonia sekoitetaan veripisaran kanssa yksittäisellä puhtaalla lasisauvalla.
3.
Agglutinaatioreaktio kehittyy ensimmäisten 3-5 sekunnin aikana, kun levyä heilutetaan kevyesti.
Reaktion tulokset otetaan huomioon 2,5 - 3 minuuttia pisaroiden sekoittamisen jälkeen. Vasemmalta oikealle anti-A-, anti-B- ja anti-AB-kuopissa.
Positiivinen tulos on rakeisen sakan (agglutinaatin) ilmaantuminen.
positiivinen RA (+)
Negatiivinen - ei sedimenttiä.
negatiivinen RA(-)
4.
Tulosten analyysi.
O(minä) α β – ei agglutinaatiota
A(II) β – agglutinaatio anti-A:lla
B(III) α – agglutinaatio anti-B:llä
AB(IV)O - agglutinaatio anti-A:lla, anti-B:llä
Kaaviomainen esitys agglutinaatiosta.
AH-antigeenit erytrosyyteissä (havaittu) + vasta-aineAT(tsoliclone) diagnostinen seerumi
Levyjen agglutinaation huomioon ottaminen
Sateen reaktio:
Saostumisreaktio on immuunireaktio AG:n vuorovaikutuksesta liukoisessa tilassa AT:n kanssa suolaliuoksessa.
Saostuksen aikana tapahtuu makromolekyylisen immuunikompleksin muodostumista, mikä ilmenee läpinäkyvän kolloidisen liuoksen muuttuessa läpinäkymättömäksi suspensioksi tai sakaksi.
Molempien reagenssien määrän on oltava tiukasti määritellyissä suhteissa, koska toisen reagenssien ylimäärä heikentää tulosta.
Olla olemassa eri tavoilla saostumisreaktion asettaminen.
1. Rengassaostumisreaktio laitetaan halkaisijaltaan pieniin saostusputkiin. Immuuniseerumi lisätään koeputkeen ja liukoinen antigeeni kerrostetaan huolellisesti. AG ja AT sekoittuvat molekyylien lämpöliikkeen vuoksi, ja ne ovat vuorovaikutuksessa. klo positiivinen tulos läpinäkymättömän sakan rengas muodostuu kahden liuoksen rajalle.
2. Ouchterlonyn kaksoisimmunodiffuusioreaktio suoritetaan agargeelissä, jonka kuoppiin lisätään kaavion mukaisesti joko AG-liuosta tai AT-liuosta. AG ja AT diffundoituvat geeliin toisiaan kohti ja, jos reaktio on positiivinen, muodostavat immuunikomplekseja, jotka näkyvät saostumisviivoina.
Sadereaktio -tämä muodostuminenja liukoisen molekyyliantigeenin kompleksin saostaminen vasta-aineiden kanssa sameuden muodossa, jota kutsutaan sakaksi. Se muodostuu sekoittamalla antigeenejä ja vasta-aineita vastaavina määrinä.
RA-komponentit:
saostava seerumi (tunnetaan nimellä AT-presipitiini);
testiseerumi (tuntematon AG-saostusgeeni);
fyysistä Ratkaisu.
Saostusreaktio sijoitetaan erityisiin kapeisiin koeputkiin tai niihin (rengassaostusreaktio), tai petrimaljoihin geeleissä, ravintoaineissa jne.
Rengassaostumisreaktio
Selvitys ja selvitys reaktion tuloksistarengassadepatogeenin havaitsemiseksi pernarutto(Ascolin reaktio).
lavastus .
1. Testimateriaalia (nahka, villa, huopa, harjakset, kangas, liha, maa, eläinten ulosteet jne.) keitetään suolaliuoksessa 5-45 minuuttia. isotonisen uutteen (uutteen) saamiseksi. Suodattaa.
2. Kaada saostuva pernaruttoseerumi koeputkeen.
3. Kerrostele testimateriaali (uute) varovasti sen päälle.
Kirjanpito .
Seuraavien 10 minuutin aikana. seerumin ja uutteen väliselle rajalle positiivisissa tapauksissa ilmestyy sameusrengas (renkaan saostuminen). Ascoli-reaktio on erittäin herkkä ja spesifinen
Sen avulla on mahdollista tunnistaa nopeasti pernaruttotartunnan saaneet materiaalit.
Saostumisreaktio agarissa
Tulosselostus ja kirjanpitoagar-saostumisreaktiotmäärittää korynebakteerien (kurkkumätäsairauden aiheuttajien) toksisuus
lavastus
Laitettiin fosfaatti-peptoni-agarille petrimaljassa.
1. Suikale steriiliä suodatinpaperia, joka on kostutettuantitoksinen seerumi.
2. Kuivauksen jälkeen kylvetään 1 cm:n etäisyydelle nauhan reunasta laattoja, joiden halkaisija on 10 mm.yksittäisiä satoja.
Yhdessä kupissa voit kylvää 3–10 satoa, joista yksiohjata, täytyy olla tiedossamyrkyllinen.
Viljelykasvit asetetaan termostaattiin.
Kirjanpito
Analyysi suoritetaan 24-48-72 tunnin kuluttua.
Positiivinen tulos - (kulttuurimyrkyllinen) - nousevat jonkin matkan päässä paperinauhastasaostusviivoja, « lonkkanuolia”, jotka näkyvät selvästi läpivalossa.
Kuvassa on saostumisreaktio agarissa kurkkumätäbasillien toksisuuden määrittämiseksi. Elatusaineviljelmät eivät muodostaneet "nuoliantenneja", ne eivät ole toksikogeenisia patogeenejä.
Kurkkumätäten aiheuttajan kannat voivat olla toksisia (tuottaa eksotoksiinia) ja ei-toksisia. Eksotoksiinin muodostuminen riippuu siitä, onko bakteereissa profaagi, joka kantaa eksotoksiinin muodostumista koodaavan tox-geenin.
Sairauden sattuessa kaikkien kurkkumätäpatogeenien toksisuus testataan - kurkkumätäeksotoksiinin tuotanto käyttäen saostusreaktiota agarissa
Monimutkaiset serologiset reaktiot ( 3-komponentti: Ag + Ig + C):
Komplementin kiinnitysreaktio (RSC).
Reaktio suoritetaan kahdessa vaiheessa.
Ensimmäisessä vaiheessa vasta-aineet ovat vuorovaikutuksessa AG:n ja komplementin kanssa; toisessa vaiheessa lisätään indikaattori - hemolyyttinen järjestelmä (erytrosyyttien ja anti-erytrosyyttiseerumin seos).
Positiivisella tuloksella AT muodostavat ensimmäisessä vaiheessa immuunikompleksin AG:n kanssa, joka sitoo reaktioseoksen komplementin.
Tässä tapauksessa toisessa vaiheessa lisätyt hemolyyttisen järjestelmän punasolut eivät tuhoudu.
Muutoin sitoutumaton komplementti aiheuttaa indikaattoripunasolujen hajoamisen.
Se vaatii viisi ainesosaa: AG, AT ja komplementti (ensimmäinen järjestelmä), pässin erytrosyytit ja hemolyyttinen seerumi (toinen järjestelmä) (kuva 1).
Reaktio etenee kahdessa vaiheessa (kuvio 3).
Ensimmäinen vaihe - antigeenin ja vasta-aineiden vuorovaikutus komplementin pakollisen osallistumisen kanssa.
Toinen - reaktion tulosten tunnistaminen hemolyyttisen indikaattorijärjestelmän avulla (lampaiden punasolut ja hemolyyttinen seerumi). Hemolyyttisen seerumin aiheuttama punasolujen tuhoutuminen tapahtuu vain, jos komplementti kiinnittyy hemolyyttiseen järjestelmään. Jos komplementti adsorboitui aikaisemmin antigeeni-vasta-ainekompleksiin, punasolujen hemolyysiä ei tapahdu (kuvio).
Kokemuksen tulos
arvioida (kuvio 2) ja huomioi hemolyysin läsnäolon tai puuttumisen kaikissa putkissa. Reaktiota pidetään positiivisena, kun hemolyysi viivästyy täydellisesti, kun koeputkessa oleva neste on väritöntä ja punasolut asettuvat pohjalle, negatiivinen - punasolujen täydellisen hajoamisen kanssa, kun neste on voimakkaan värinen ("lakkaveri") .
Hemolyysiviiveen aste arvioidaan riippuen nesteen värin intensiteetistä ja erytrosyyttisedimentin määrästä pohjassa (++++, +++, ++, +).
Riisi. 4. RSC:n lausunto ja tulos.
Johtopäätös:Tutkitusta seerumista havaittiin vasta-aineita.
RSK:n avulla voit havaita vasta-aineita mille tahansa saman viruksen serotyypin kannalle.
Diagnostinen arvo on:
vasta-ainetiitterin nelinkertainen nousu pariisissa seerumeissa (influenssaepidemian aikana);
kaksinkertainen veren seerumin nousu potilailla, joilla on tyypillinen kliininen kuva.
Merkitse reaktiot :
Nämä menetelmät ovat erittäin herkkiä. Väriaineita, radioaktiivisia isotooppeja, entsyymejä jne. käytetään antigeenien tai vasta-aineiden leimoina.
RIF - immunofluoresenssireaktio
Immunofluoresenssireaktio perustuu antigeeni-vasta-ainekompleksin valoindikaatioon
Yhdistetty immunosorbenttimääritys.
Nykyaikainen laboratoriotutkimus, jonka aikana verestä etsitään spesifisiä vasta-aineita tai tiettyjen sairauksien antigeenejä, jotta voidaan tunnistaa sairauden etiologian lisäksi myös taudin vaihe.
ELISA-tulokset voidaan antaa laadullisesti ja kvantitatiivisesti.
Tällä hetkellä ELISAa käytetään seuraavissa tilanteissa:
1) etsiä spesifisiä vasta-aineita mille tahansa tartuntataudille;
2) kaikkien sairauksien (tartuntataudit, sukupuolitaudit) antigeenien etsiminen;
3) potilaan hormonaalisen tilan tutkimus;
4) kasvainmerkkiaineiden tutkimus;
5) tutkimus autoimmuunisairauksien varalta.
Kuvassa kiinteän faasin ELISA - tunnetut antigeenit (vasemmalla) adsorboituvat levyn kuoppaan, (oikealla) levyn kuoppiin tunnetut vasta-aineet
ELISA-menetelmän edut:
1) ELISA-menetelmän korkea spesifisyys ja herkkyys (yli 90 %).
2) Kyky määrittää sairaus ja seurata prosessin dynamiikkaa, eli vertailla vasta-aineiden määrää eri aikaväleillä.
3) ELISA-diagnostiikan saatavuus missä tahansa lääketieteellisessä laitoksessa.
Suhteellinen puutos: Immuunivasteen (vasta-aineet), mutta ei itse patogeenin havaitseminen, konjugoituna entsyymileimalla.
ELISA-asetus (yleinen mekanismi):
Entsyymi-immunosorbenttimäärityksen perustana on antigeenin ja vasta-aineen immuunireaktio, jossa muodostuu immuunikompleksi: antigeeni-vasta-aine, jonka seurauksena tapahtuu muutos entsymaattinen aktiivisuus spesifisiä leimoja vasta-aineiden pinnalla.
Reaktion komponentit:
1. AG(AT) tunnetaan - tabletin syvennyksessä.
2. AT (AG) tutkittu.
3. AT AT(AG)-AG(AT)-kompleksille spesifisellä entsyymillä
4. entsyymin kanssa vuorovaikutuksessa oleva kromogeeninen substraatti
5. lopeta ratkaisu
ELISA:n päävaiheet
1. Tabletin kuoppien pinnalla on tietyn patogeenin puhdistettu antigeeni. Ne lisätään biologista materiaalia Tämän antigeenin ja halutun vasta-aineen (immunoglobuliinin) välillä tapahtuu spesifinen reaktio. Muodostuu kompleksi.
2. Lisätään konjugaatti - AT entsyymin kanssa. Konjugantti on spesifinen ensimmäisen vaiheen AT-AG-kompleksille. Entsyymi aktivoituu.
3. Lisätään substraatti ja aktiivinen entsyymi on vuorovaikutuksessa sen kanssa muuttaen liuoksen väritöntä väriä.
4. Stop-liuos lisätään pysäyttämään entsyymi-substraatti-vuorovaikutus.
Kirjanpito.
Positiivinen tulos on värin muutos, kuvassa - keltainen.
Immunokromatografinen analyysi
Immunokromatografinen analyysimenetelmä (ICA, pikatestit) on kvalitatiivinen seulonnan esimenetelmä, jonka avulla voit nopeasti, muutamassa minuutissa analysoida missä tahansa olosuhteissa, mukaan lukien. "ala".
ICA:n etuja ovat:
Nopeus ja helppokäyttöisyys;
Pienet näytemäärät, ei näytteen valmistelua;
Edullisuus tuottajalle ja kuluttajalle;
Kyky tuottaa suuria määriä testejä;
Tuloksen lukemisen ja tulkinnan helppous;
Korkea herkkyys ja toistettavuus;
Mahdollisuus kvantitatiiviseen määritykseen;
Mahdollisuus käyttää tietokoneen kanssa yhteensopivia kannettavia lukulaitteita;
Monianalyysin mahdollisuus.
Komponentit (testiliuskaan):
1. Kolloidisella kullalla leimattu konjugaatti - spesifinen määritetylle AG:lle.
2. Testilinjan AT - spesifinen AT-AG-kompleksille
3. Kontrollilinjan Ab:t ovat spesifisiä konjugaatille.
IHA-asetus:
1. Näytteen levittäminen nauhan määrätylle aloitusalueelle.
2. Tulosten saaminen värillisten juovien muodossa testi- ja kontrolliviivojen tilalle.
Kirjanpito
Positiivinen - testiviivaa värjättäessä.
Negatiivinen - testilinjan värjäytymisen puuttuessa.
Virheellinen - kontrolliviivan värjäytymisen puuttuessa.
Yleinen mekanismi MINÄ HA:
1. Näyte asetetaan aloituskentälle (näytealustalle) ja sidotaan konjugaattiin (erityinen runko värimerkillä), joka sijaitsee konjugaattityynyllä. Tämän seurauksena muodostuu värillinen kompleksi.
2. Tuloksena oleva värillinen immuunikompleksi liikkuu kapillaarivoimien vaikutuksesta nitroselluloosakalvoa pitkin Ja vuorovaikutuksessaAT-testilinjalla.Tuloksena on yksivärinen vaaleanpunainen-punainen raita.
3. Abs ei ole sidottu testinauhaan (konjugaatti)siirtyy eteenpäin ja saavuttaa ohjauslinjan, sitoutuu ohjauslinjan AT:hen.Tämän seurauksena näkyviin tulee toinen värillinen nauha.Jos analyysi suoritetaan oikein, kontrolliviivan tulee aina näkyä, riippumatta tutkitun antigeenin (vasta-aineen) läsnäolosta biologisen nesteen näytteessä.
2. Serologisten reaktioiden suorittamisen edellytykset.
1. Homologisten - toisiaan vastaavien antigeenien ja vasta-aineiden esiintyminen.
2. Puhtaat, kuivat astiat.
3. Tietty suhde huumeita (useimmiten yhtä suuri).
4. Pakollinen elektrolyytin läsnäolo (isotoninen NaCl-liuos).
5. pH neutraali tai lähes lievästi emäksinen.
6. Lämpötila + 37 ° С tai huoneen lämpötila (välttämättä positiivinen).
7. Suoritetaan antigeenikontrolli ja seerumin (vasta-aine) kontrolli.
3 Seerumivaatimukset
Seerumin on oltava täysin kirkas ilman solujen sekoittumista.
Yleensä saadaan sairauden viikolla 2, kun vasta-aineita on jo olemassa.
Verta otetaan 3-5 ml tyhjään mahaan tai 6 tuntia aterian jälkeen.
Seerumin saamiseksi veri jätetään 1 tunniksi huoneenlämpötilaan tai sentrifugoidaan. Seerumi imetään pois erittäin huolellisesti, jotta muodostuneet elementit eivät jää kiinni.
Immuuniseerumit saadaan ihmisten tai eläinten (yleensä kanien ja hevosten) verestä, jotka on immunisoitu tietyn järjestelmän mukaisesti vastaavalla antigeenillä (rokotteella). Hera valmistetaan yleensä tuotannossa.
4. Positiivisten ja negatiivisten tulosten käsite.
RA.
Positiivisella reaktiolla passiivisesti liimatut erytrosyytit peittävät kuopan pohjan tasaisella kerroksella, jossa on hilseilevät reunat ("sateenvarjo"); agglutinaation puuttuessa erytrosyytit kerääntyvät kuopan keskisyvennykseen muodostaen kompaktin "painikkeen", jolla on terävästi rajatut reunat (katso yllä olevat kuvat).
RP.
Positiivisella tuloksella muodostuu maitomainen rengas kahden liuoksen rajalle (katso yllä olevat kuvat).
ELISA.
Liuoksen värin muutos tapahtuu positiivisella reaktiolla.
RSK.
Hemolyysin viive - reaktio on positiivinen; jos komplementti on vapaa, havaitaan hemolyysi - reaktio on negatiivinen(katso kuvat yllä).
Wassermanin reaktion tulokset:
a - hemolyysin täydellinen viivästyminen (+ + ++);
b - selvä viive hemolyysissä (+ ++);
c - hemolyysin osittainen viivästyminen (++);
d - hemolyysin heikko viive (+);
e - täydellinen hemolyysi (-).
Reaktio on positiivinen ja hemolyysin osittainen, selvä ja täydellinen viive, joka määräytyy koeputkien sisällön värjäytymisasteella vaaleanpunaisesta kirkkaan punaiseen, hemolysoimattomat punasolut muodostavat myöhemmin punaisen sakan.
Kotitehtävät:
1. Tutki materiaalia
Tee 3 muistiinpanoa videoon
Nro 29 Agglutinaatioreaktio. Komponentit, mekanismi, asetusmenetelmät. Sovellus.
Agglutinaatioreaktio- yksinkertainen reaktio, jossa vasta-aineet sitovat korpuskulaarisia antigeenejä (bakteerit, erytrosyytit tai muut solut, liukenemattomat hiukkaset, joihin on adsorboitunut antigeeneja, sekä makromolekyyliset aggregaatit). Se tapahtuu elektrolyyttien läsnä ollessa, esimerkiksi kun lisätään isotonista natriumkloridiliuosta.
Agglutinaatioreaktiosta käytetään erilaisia muunnelmia: laajennettu, likimääräinen, epäsuora jne. Agglutinaatioreaktio ilmenee hiutaleiden tai sedimentin muodostumisena (solut, jotka ovat "liimattuja" vasta-aineilla, joissa on kaksi tai useampia antigeeniä sitovia keskuksia - kuva 13.1). . RA:ta käytetään:
1) vasta-aineiden havaitseminen potilaiden veren seerumissa, esimerkiksi luomistaudista (Wrightin, Heddelsonin reaktiot), lavantauti ja sivutauti (Vidal-reaktio) ja muut tartuntataudit;
2) patogeenien määritelmät eristetty potilaasta;
3) veriryhmien määrittäminen käyttämällä monoklonaalisia vasta-aineita erytrosyyttien alloantigeenejä vastaan.
Potilaan vasta-aineiden määrittämiseen laita yksityiskohtainen agglutinaatioreaktio: potilaan veriseerumin laimennoksiin lisätään diagnostiikkaa (tapattujen mikrobien suspensio) ja useiden tuntien 37 °C:ssa inkuboinnin jälkeen todetaan seerumin korkein laimennus (seerumin tiitteri), jossa agglutinaatio tapahtui, eli muodostunut sakka.
Agglutinaation luonne ja nopeus riippuvat antigeenin ja vasta-aineiden tyypistä. Esimerkkinä ovat diagnostisten aineiden (O- ja H-antigeenit) vuorovaikutuksen piirteet spesifisten vasta-aineiden kanssa. Agglutinaatioreaktio O-diagnosticumin kanssa (bakteerit, jotka tapetaan kuumentamalla, säilyttäen lämpöstabiilin O-antigeenin) tapahtuu hienorakeisena agglutinaationa. Agglutinaatioreaktio H-diagnosticumilla (formaliinin tappamat bakteerit, jotka säilyttävät lämpölabiilin flagellaarisen H-antigeenin) on karkearakeinen ja etenee nopeammin. Jos on tarpeen määrittää potilaasta eristetty taudinaiheuttaja, aseta se orientoiva agglutinaatioreaktio, käyttämällä diagnostisia vasta-aineita (agglutinoivaa seerumia), eli suoritetaan patogeenin serotyypitys. Likimääräinen reaktio suoritetaan lasilevyllä. Lisää pisara diagnostista agglutinoivaa seerumia laimennuksessa 1:10 tai 1:20 potilaasta eristettyä patogeenin puhdasta viljelmää. Kontrolli asetetaan lähelle: seerumin sijaan laitetaan pisara natriumkloridiliuosta. Kun flokkuloitunut sedimentti ilmestyy pisaraan seerumin ja mikrobien kanssa, suoritetaan yksityiskohtainen agglutinaatioreaktio koeputkissa agglutinoivan seerumin kasvavilla laimennoksilla, joihin lisätään 2-3 tippaa patogeenisuspensiota. Agglutinaatio otetaan huomioon sedimentin määrän ja nesteen kirkastumisasteen mukaan. Reaktion katsotaan olevan positiivinen, jos agglutinaatio havaitaan laimennuksessa, joka on lähellä diagnostisen seerumin tiitteriä. Samalla otetaan huomioon kontrollit: isotonisella natriumkloridiliuoksella laimennetun seerumin tulee olla läpinäkyvää, samassa liuoksessa olevan mikrobisuspension tulee olla tasaisen sameaa, ilman sedimenttiä.
Sama diagnostinen agglutinoiva seerumi voi agglutinoida eri sukulaisia bakteereita, jotka
tekee niiden tunnistamisen vaikeaksi. Siksi käytetään adsorboituja agglutinoituvia seerumeita, joista
ristireagoivat vasta-aineet adsorboitumalla niihin sukulaisiin bakteereihin. Nämä seerumit sisältävät vasta-aineita
ominaista tälle bakteerille.
Agglutinaatiota kutsutaan bakteerien agglutinaatioksi, joka johtuu spesifisen AT:n vuorovaikutuksesta niiden kanssa. RA vaatii kolme komponenttia: 1) AG (agglutinogeeni); 2) AT (agglutiniini); 3) elektrolyyttiliuos (isotoninen natriumkloridiliuos). Agglutinaatioreaktioon osallistuvat vain korpuskulaariset antigeenit (bakteerit, punasolut, antigeenillä ladatut lateksihiukkaset).
Agglutinaatioreaktio lasilla. Tippa diagnostista seerumia (seerumin laimennus 1:10 - 1:20) levitetään rasvattomalle lasilevylle pipetillä. Tutkittavan mikro-organismin puhdasviljelmä otetaan vinoagarin pinnalta bakteriologisella silmukalla, siirretään seerumipisaraan ja sekoitetaan. Reaktion tulos otetaan huomioon paljaalla silmällä 3-5 minuutin kuluttua. Positiivinen reaktio seerumipisarassa havaitsee hiutaleita (suuria tai pieniä), jotka näkyvät selvästi tummaa taustaa vasten, kun lasilevyä ravistetaan. Negatiivisen reaktion tapauksessa neste pysyy tasaisen sameana.
Agglutinaatioreaktio koeputkissa. Lisää 1 ml fysiologista suolaliuosta useisiin koeputkiin. Lisää sama määrä testiseerumia ensimmäiseen koeputkeen. Valmistetaan peräkkäiset kaksinkertaiset seerumilaimennokset (seerumititraus), minkä jälkeen kuhunkin koeputkeen lisätään 2 tippaa inaktivoitujen bakteerien suspensiota (diagnosticum). Koeputket asetetaan 2 tunniksi termostaattiin 37 °C:seen. Reaktio etenee pienten, paljaalla silmällä näkymättömien hiutaleiden muodostumisella, joten tulokset kirjataan pienellä lisäyksellä erityisessä laitteessa - agglutinoskoopissa. Agglutinaation intensiteetti otetaan huomioon "neljän plussan" järjestelmän mukaisesti: täydellinen agglutinaatio - 4+, osittainen agglutinaatio - 3+ tai 2+, epäilyttävä tulos - +. Viimeinen laimennos, jossa havaitaan agglutinaatio 2+:ssa, otetaan vasta-ainetiitteriksi testiseerumissa.
Agglutinaatioreaktio koeputkissa (pidennetty agglutinaatioreaktio) suoritetaan vasta-aineiden tiitterin määrittämiseksi lavantaudin ja paratyfoidin (Vidal-reaktio), luomistaudin (Wright-reaktio), lavantaudin (Weigl-reaktio) patogeenejä vastaan.
Agglutinaatio (latinan sanasta agglutinatio - sidos) - antigeenia sisältävien korpuskulaaristen hiukkasten (kokosolut, lateksihiukkaset jne.) sitoutuminen (yhteys) spesifisiin vasta-ainemolekyyleihin elektrolyyttien läsnä ollessa, mikä päättyy hiutaleiden tai sedimentin muodostumiseen (agglutinaatti). ) näkyy paljaalla silmällä. Sedimentin luonne riippuu antigeenin luonteesta: siimabakteerit antavat suurihiutaleisen sedimentin, siima- ja kapselittoman - hienorakeisen, kapselimaisen - sitkeän. Erottele suora agglutinaatio, jossa vuorovaikutus spesifisten vasta-aineiden kanssa osallistui suoraan bakteerin tai minkä tahansa muun solun omia antigeenejä, kuten erytrosyyttejä; ja epäsuorat tai passiiviset, joissa bakteerisolut tai erytrosyytit tai lateksipartikkelit eivät ole omia kantajiaan vaan niihin adsorboituneita vieraita antigeenejä (tai vasta-aineita) niille spesifisten vasta-aineiden (tai antigeenien) havaitsemiseksi. Agglutinaatioreaktioon liittyy pääasiassa IgG- ja IgM-luokkiin kuuluvia vasta-aineita. Se etenee kahdessa vaiheessa: ensinnäkin vasta-aineiden aktiivisella keskuksella on spesifinen vuorovaikutus antigeenideterminantin kanssa, tämä vaihe voi tapahtua elektrolyyttien puuttuessa, eikä siihen liity näkyviä muutoksia reagoivassa järjestelmässä. Toisessa vaiheessa - agglutinaatin muodostumisessa - tarvitaan elektrolyyttien läsnäoloa, jotka vähentävät sähkövaraus kompleksoi antigeeni + vasta-aine ja nopeuttaa niiden sitoutumisprosessia. Tämä vaihe päättyy agglutinaatin muodostumiseen.
Agglutinaatioreaktiot asetetaan joko lasille tai sileille pahvilevyille tai steriileihin agglutinaatioputkiin. Agglutinaatioreaktioita (suoraa ja passiivista) lasilla käytetään yleisesti mm nopeutettu menetelmä spesifisten vasta-aineiden havaitseminen potilaan seerumista (esimerkiksi luomistaudin) tai patogeenin serologinen tunnistaminen. Jälkimmäisessä tapauksessa käytetään yleensä hyvin puhdistettuja (adsorboituja) diagnostisia seerumeita, jotka sisältävät vain monoreseptorivasta-aineita tai niiden eri antigeenejä vastaan. Lasin agglutinaatioreaktion kiistaton etu on sen formuloinnin yksinkertaisuus ja se, että se kestää useita minuutteja tai jopa sekunteja, koska molempia komponentteja käytetään siinä tiivistetyssä muodossa. Sillä on kuitenkin vain laadullinen arvo ja se on vähemmän herkkä kuin koeputki. Laajennettu agglutinaatiotesti koeputkissa antaa tarkempia tuloksia, koska sen avulla voit määrittää seerumin vasta-aineiden kvantitatiivisen sisällön (asettaa sen tiitterin) ja tarvittaessa rekisteröidä vasta-ainetiitterin nousun, joka on diagnostista arvo. Aseta reaktio agglutinaatioputkiin lisäämällä tietyllä tavalla 0,85 %:lla laimennettuna NaCl-liuos seerumi ja yhtä suuri tilavuus (yleensä 0,5 ml) suspensiota standardista diagnostiikkaa (tai testiviljelmää), joka sisältää 1 miljardia bakteeria 1 ml:ssa. Agglutinaatioreaktion tulosten huomioon ottaminen suoritetaan alustavasti 2 tunnin putkien inkuboinnin jälkeen 37 °C:ssa ja lopuksi 20–24 tunnin kuluttua kahden kriteerin mukaan: sakan läsnäolo ja koko sekä putken läpinäkyvyysaste. supernatantti. Arviointi suoritetaan neljän ristin järjestelmän mukaisesti. Reaktioon liittyy välttämättä seerumin ja antigeenin valvonta. Niissä tapauksissa, joissa taudinaiheuttajan serologiseen tunnistamiseen käytetään yksityiskohtaista agglutinaatiotestiä koeputkessa, sillä on diagnostista arvoa, jos reaktio arvioidaan positiiviseksi, kun diagnostista seerumia laimennetaan vähintään puolella sen tiitteristä.
On otettava huomioon, että homologisten antigeenien ja vasta-aineiden liuoksia sekoitettaessa ei aina havaita agglutinaatioreaktion näkyviä ilmentymiä. Sakka muodostuu vain tietyissä molempien reaktiokomponenttien optimaalisissa suhteissa. Näiden rajojen ulkopuolella, kun antigeeniä tai vasta-aineita on merkittävä ylimäärä, ei havaita mitään reaktiota. Tätä ilmiötä kutsutaan "prozone-ilmiöksi". Se havaitaan sekä agglutinaatioreaktiossa että saostumisreaktiossa. Prozonin esiintyminen immuunireaktioissa selittyy sillä, että niihin osallistuvat antigeenit ovat pääsääntöisesti polydeterminantteja ja molekyylit IgG-vasta-aineet on kaksi aktiivista keskustaa. Kun vasta-aineita on ylimäärä, jokaisen antigeenipartikkelin pinta peitetään vasta-ainemolekyylillä niin, ettei vapaita determinanttiryhmiä jää jäljelle, jolloin vasta-aineiden toinen, sitoutumaton aktiivinen keskus ei voi olla vuorovaikutuksessa toisen antigeenisen partikkelin kanssa ja sitoa niitä toisiinsa. Näkyvän agglutinaatin tai sakan muodostuminen estyy myös silloin, kun antigeeniä on ylimäärä, kun vasta-aineista ei ole enää yhtään vapaata aktiivista kohtaa, jolloin antigeeni + vasta-aine + antigeenikomplekseja ei voida enää suurentaa.
Vaihtoehdot nopeutettuihin agglutinaatioreaktioihin. Passiivinen hemagglutinaatioreaktio ja sen muunnelmat
Klassiseen agglutinaatioreaktioon kuuluu korpuskulaaristen antigeenien käyttö. Liukoiset antigeenit voivat kuitenkin myös olla mukana. Tämän mahdollistamiseksi sellaiset antigeenit adsorboidaan immunologisesti inertteihin partikkeleihin. Kantaja-aineena voidaan käyttää lateksi- tai bentoniittipartikkeleita, mutta nykyisin käytetään useimmiten eläinten tai ihmisten punasoluja, jotka parantavat niiden adsorbointiominaisuuksia käsittelemällä tanniini-, formaliini- tai bentsidiiniliuoksilla. Antigeeniä itseensä adsorboivia punasoluja kutsutaan tämän antigeenin herkistyneiksi, ja immuunireaktio, johon ne osallistuvat, on epäsuora tai passiivinen hemagglutinaatioreaktio (RNHA tai RPHA), koska erytrosyytit osallistuvat siihen passiivisesti.
RPGA sijoitetaan erityisiin polystyreenilevyihin, joissa on puolipallon muotoisia reikiä. Käytettäessä sitä serologiseen diagnostiikkaan, näihin reikiin valmistetaan kaksinkertaiset laimennokset testiseerumin fysiologiseen liuokseen, jonka jälkeen siihen lisätään herkistettyjen punasolujen suspensiota diagnostisena aineena. Tulokset kirjataan 2 tunnin inkuboinnin jälkeen 37 °C:ssa neliristijärjestelmän mukaisesti. Positiivisella reaktiolla agglutinoidut erytrosyytit asettuvat reiän pohjalle ja peittävät sen tasaisesti käänteisen sateenvarjon muodossa. Negatiivinen reaktio myös erytrosyytit asettuvat, neste muuttuu läpinäkyväksi, sakka näyttää pieneltä "levyltä" reiän keskellä. RPHA:n seerumin tiitterin katsotaan olevan sen viimeinen laimennos, joka antaa silti selvän hemagglutinaation ilman merkittäviä merkkejä jolla on levy.
RPHA:ta voidaan käyttää myös nopeutettuna bakteriologisen diagnostiikan menetelmänä tunnistamattomien bakteerien, virusten, toksiinien, kuten ruttopatogeenien, stafylokokkien enterotoksiinien jne. havaitsemiseksi suoraan testimateriaalista vasta-aineet - vasta-aine erythrocyte diagnosticum. Jos testimateriaali sisältää riittävän määrän tunnettua antigeeniä, TPHA on positiivinen.
Vaihtoehtoja RPGA:n käyttöön ovat: antigeenin neutralointireaktio (RNAg), vasta-aineneutralointireaktio (RNAt), passiivinen hemagglutinaation estoreaktio (RPHA). Näihin reaktioihin käytetään antigeenisiä ja vasta-aineerytrosyyttidiagnostiikkaa. Samanaikaisesti voidaan käyttää kahta toisiaan säätelevää yksisuuntaista reaktiota, esimerkiksi RPHA:ta antigeenisen diagnostiikan kanssa ja RNAg:tä vasta-aineerytrosyyttidiagnostiikan kanssa.
Vasta-aineen neutralointireaktio (RNAt) koostuu siitä, että halutun antigeenin sisältävä suspensio sekoitetaan spesifisen immuuniseerumin kanssa, joka sisältää tunnettuja vasta-aineita sopivina tilavuuksina, ja inkuboidaan 37 °C:ssa kaksi tuntia. Sen jälkeen lisätään antigeeninen punasoludiagnostiikka. Seosta ravistellaan ja jätetään huoneenlämpötilaan. Tulokset huomioidaan 3-4 tunnin kuluttua ja lopuksi - 18-24 tunnin kuluttua Jos testimateriaalissa on antigeeniä, se sitoo vasta-aineita (neutralisoi ne), eikä hemagglutinaatiota tapahdu.
Saman periaatteen mukaisesti suoritetaan antigeenin neutralointireaktio (RNAg). Vain tässä tapauksessa testimateriaalista havaitaan vasta-aineita. Tällaiseen testimateriaaliin lisätty spesifinen antigeeni sitoutuu sen sisältämiin vasta-aineisiin, eli vasta-aineet neutraloivat antigeenin, ja siksi hemagglutinaatiota ei tapahdu, kun vasta-aine erythrocyte diagnosticum lisätään.
Koagglutinaatioreaktio. Se on yksi vaihtoehdoista passiiviselle, eli soluvälitteiselle vasta-ainekantaja-ainekiihdytetylle agglutinaatioreaktiolle lasilla. Tämä reaktio perustuu ainutlaatuinen omaisuus Staphylococcus aureus, jonka soluseinämässä on proteiini A, sitoutuvat IgG:n ja IgM:n Fc-fragmentteihin. Samanaikaisesti vasta-aineiden aktiiviset keskukset pysyvät vapaina ja voivat olla vuorovaikutuksessa spesifisten antigeenideterminanttien kanssa. Tippa 2-prosenttista vastaavilla vasta-aineilla herkistettyä stafylokokkisuspensiota levitetään lasilevylle ja lisätään pisara tutkittujen bakteerien suspensiota. Kun antigeeni vastaa vasta-aineita, tapahtuu 30-60 sekunnin kuluttua vasta-aineilla ladattujen stafylokokkien selkeä agglutinaatio.
Lateksiagglutinaatioreaktio (LAH). Vasta-aineiden kantaja tässä diagnostisessa järjestelmässä ovat pieniä standardihiukkasia lateksia. Reaktio suoritetaan mikromenetelmällä lasin kaivoissa. Pääehto PAH:n onnistumiselle on järjestelmän komponenttien kvantitatiivisten suhteiden tarkka noudattaminen: 10 µl vasta-aineilla herkistettyä lateksivalmistetta lisätään 50 µl:aan testimateriaalia. PAH:n spesifisyyttä kontrolloidaan käyttämällä kolmea kaupallisiin testijärjestelmiin sisältyvää kontrollitestiä: tiedossa positiivinen reaktio, ilmeisesti takaisku ja lateksisuspension laadunvalvonta PAH-herkittämättömille (ei-vasta-aineita sisältäville) latekseille testimateriaalin kanssa. Maassamme käytetään monodisperssiä polystyreenilatekseja, joilla on eri hiukkashalkaisijat (0,3; 0,66; 0,75; 0,8 μm) spesifisten vasta-aineiden kantajina. PAH:ta käytetään mikro-organismien tai niiden antigeenien nopeaan havaitsemiseen testimateriaalista.
Antigeenien immunomagneettinen havaitseminen. Yksi lasin kiihdytetyn agglutinaatioreaktion vaihtoehdoista liittyy erityisillä vasta-aineilla päällystettyjen supermagneettisten polymeerihiukkasten käyttöön. Yksi tällainen hiukkanen sitoo jopa 107-108 mikro-organismisolua, minkä vuoksi herkkyys tätä menetelmää saavuttaa 5 CFU / ml. Mikro-organismien immunomagneettista havaitsemista voidaan käyttää yhdessä elvyttämisen kanssa.
Aggregaatti-hemagglutinaatioreaktio (RAGA). Sen avulla voit nopeasti havaita potilaiden verestä sekä vapaasti kiertävät antigeenit (antigenemia) että vasta-aineisiin liittyvät antigeenit - kiertävät immuunikompleksit (CIC). RAGA:ssa käytetään sopivilla vasta-aineilla herkistettyjä punasoluja. Antigeenejä sisältävän potilaan veriseerumin lisääminen herkistyneisiin punasoluihin, joihin on kiinnittynyt vasta-aineita, johtaa punasolujen ja immuunikompleksien liimautumiseen (agglutinaatioon).
Antiglobuliini Coombsin testi (R. Coombsin reaktio). Suorien ja passiivisten agglutinaatioreaktioiden avulla määritetään täydelliset (kaksiarvoiset) vasta-aineet. Epätäydellisiä (yksiarvoisia, estäviä) vasta-aineita ei havaita näillä menetelmillä, koska yhdistettynä antigeeniin ne estävät sen, mutta eivät voi aiheuttaa antigeenin aggregaatiota suuriksi konglomeraatteiksi. Epätäydelliset (salpaavat) vasta-aineet ovat sellaisia, joissa vain yksi aktiivinen keskus toimii; toinen aktiivinen keskus ei toimi tuntemattomasta syystä. Epätäydellisten vasta-aineiden tunnistamiseen käytetään erityistä Coombsin reaktiota (kuva 72). Reaktioon kuuluu: potilaan seerumi, jossa he määrittävät epätäydelliset vasta-aineet, corpuscular antigen diagnosticum, antiglobuliiniseerumi, joka sisältää vasta-aineita ihmisen globuliinille. Reaktio etenee kahdessa vaiheessa:
Antigeenin vuorovaikutus epätäydellisten vasta-aineiden kanssa. Näkyviä ilmentymiä ei ole. Ensimmäinen vaihe suoritetaan pesemällä antigeeni potilaan seerumin jäännöksistä.
Eläimen ihmisen globuliinilla immunisoinnin tuloksena saadun antiglobuliiniseerumin vuorovaikutus antigeeniin adsorboituneiden epätäydellisten vasta-aineiden kanssa. Koska antiglobuliinivasta-aineet ovat kaksiarvoisia, ne sitovat kaksi erillisten antigeenikompleksien monovalenttista vasta-ainetta + epätäydellistä vasta-ainetta, mikä johtaa niiden tarttumiseen yhteen ja näkyvän sakan ilmaantumiseen.
13.1. Antigeeni-vasta-ainereaktiot ja niiden käyttötarkoitukset
Kun antigeeniä ruiskutetaan, kehossa muodostuu vasta-aineita. Vasta-aineet ovat komplementaarisia antigeenille, joka aiheutti niiden synteesin, ja pystyvät sitoutumaan siihen. Antigeenien sitoutuminen vasta-aineisiin koostuu kahdesta vaiheesta. Ensimmäinen vaihe on spesifinen, jossa antigeenideterminantti sitoutuu nopeasti vasta-aineiden Fab-fragmentin aktiiviseen keskustaan. On huomattava, että sitoutuminen johtuu van der Waalsin voimista, vedystä ja hydrofobisista vuorovaikutuksista. Sidoslujuus määräytyy vasta-aineen aktiivisen kohdan ja antigeenin epitoopin välisen avaruudellisen vastaavuuden asteella. Tietyn vaiheen jälkeen alkaa hitaampi - epäspesifinen, joka ilmenee näkyvänä fysikaalisena ilmiönä (esimerkiksi hiutaleiden muodostuminen agglutinaation aikana jne.).
Immuunireaktiot ovat vasta-aineiden ja antigeenien välisiä vuorovaikutuksia, ja nämä reaktiot ovat spesifisiä ja erittäin herkkiä. Niitä käytetään laajasti lääkärin käytäntö. Immuunireaktioiden avulla voidaan ratkaista seuraavat tehtävät:
Tuntemattomien vasta-aineiden määritys tunnetuilla antigeeneillä (antigeeninen diagnostiikka). Tällainen tehtävä on silloin, kun on tarpeen määrittää patogeenin vasta-aineet potilaan veren seerumista (serodiagnoosi). Vasta-aineiden löytäminen mahdollistaa diagnoosin vahvistamisen;
Tuntemattomien antigeenien määritys tunnetuilla vasta-aineilla (diagnostinen seerumi). Tämä tutkimus suoritetaan, kun tunnistetaan potilaan materiaalista eristettyä taudinaiheuttajaviljelyä (serotyypitys) sekä havaittaessa
mikrobien antigeenit ja niiden toksiinit veressä ja muissa biologisissa nesteissä. On olemassa monenlaisia immuunireaktioita, jotka eroavat asetustekniikan ja tallennetun vaikutuksen suhteen. Näitä ovat agglutinaatioreaktiot (RA), saostus (RP), komplementtireaktiot (RCC), reaktiot, joissa käytetään leimattuja komponentteja (RIF, ELISA, RIA).
13.2. Agglutinaatioreaktio
Agglutinaatioreaktio (RA) on immuunireaktio antigeenin ja vasta-aineiden vuorovaikutuksesta elektrolyyttien läsnä ollessa, ja antigeeni on korpuskulaarisessa tilassa (erytrosyytit, bakteerit, lateksihiukkaset adsorboituneiden antigeenien kanssa). Agglutinaation aikana korpuskulaariset antigeenit liimautuvat yhteen vasta-aineilla, mikä ilmenee flokkuloivan sakan muodostumisena. Hiutaleiden muodostuminen johtuu siitä, että vasta-aineissa on kaksi aktiivista keskustaa ja antigeenit ovat moniarvoisia, ts. niillä on useita antigeenideterminantteja. RA:ta käytetään tunnistamaan potilaan materiaalista eristetty taudinaiheuttaja sekä havaitsemaan taudinaiheuttajalle vasta-aineita potilaan veren seerumissa (esimerkiksi Wrightin ja Huddlesonin reaktiot luomistautissa, Vidal-reaktio lavantautissa ja paratyfoidissa ).
Helpoin tapa määrittää RA on reaktio lasille, tämä on likimääräinen RA, jota käytetään potilaasta eristettyjen patogeenien määrittämiseen. Kun reaktio asetetaan lasilevylle, levitetään diagnostista agglutinoivaa seerumia (laimennoksena 1:10 tai 1:20), sitten viedään potilaalta viljelmä. Reaktio on positiivinen, jos tippaan ilmestyy flokkuloiva sakka. Kontrolli asetetaan lähelle: seerumin sijaan laitetaan pisara natriumkloridiliuosta. Jos diagnostinen agglutinoiva seerumi on adsorboitumaton 1, se laimennetaan (tiitteriin - laimennokseen, johon agglutinaation tulisi tapahtua), ts. laita laajennettu RA koeputkiin kasvaen
1 Adsorboitumaton agglutinoiva seerumi voi agglutinoida samankaltaisia bakteereja, joilla on yhteisiä (ristireagoivia) antigeenejä. Siksi nautiadsorboituja agglutinoivia seerumeja, joista ristiinreaktiiviset vasta-aineet on poistettu niiden sukulaisten bakteerien adsorptiolla. Tällaisissa seerumeissa jää vain tälle bakteerille spesifisiä vasta-aineita.
agglutinoivan seerumin laimennokset, joihin lisätään 2-3 tippaa potilaasta eristettyä patogeenin suspensiota. Agglutinaatio otetaan huomioon sedimentin määrän ja nesteen kirkastumisasteen perusteella koeputkissa. Reaktion katsotaan olevan positiivinen, jos agglutinaatio havaitaan laimennuksessa, joka on lähellä diagnostisen seerumin tiitteriä. Reaktioon liittyy kontrollit: isotonisella natriumkloridiliuoksella laimennetun seerumin tulee olla läpinäkyvää, samassa liuoksessa olevan mikrobisuspension tulee olla tasaisen sameaa, ilman sedimenttiä.
Patogeenin vasta-aineiden määrittämiseksi potilaan veren seerumissa käytetään laajennettua RA:ta. Kun se laitetaan koeputkiin, potilaan veriseerumi laimennetaan ja koeputkiin lisätään vastaava määrä diagnostista suspensiota (tapattujen mikrobien suspensio). Inkuboinnin jälkeen määritetään korkein seerumilaimennus, jossa agglutinaatio tapahtui, ts. muodostui sakka (seerumitiitteri). Tässä tapauksessa agglutinaatioreaktio O-diagnosticumin kanssa (bakteerit, jotka tapetaan kuumentamalla, säilyttäen lämpöstabiilin O-antigeenin) tapahtuu hienorakeisena agglutinaationa. Agglutinaatioreaktio H-diagnosticumilla (formaliinin tappamat bakteerit, jotka säilyttävät lämpölabiilin flagellaarisen H-antigeenin) on karkearakeinen ja etenee nopeammin.
Epäsuoran (passiivisen) hemagglutinaation reaktio(RNGA tai RPGA) on eräänlainen RA. Tämä menetelmä on erittäin herkkä. RNGA:n avulla voidaan ratkaista kaksi tehtävää: määrittää vasta-aineet potilaan veriseerumista, johon on lisätty antigeenista punasoludiagnostiikkaa, eli punasoluja, joihin tunnetut antigeenit adsorboituvat; määrittää antigeenien esiintyminen testimateriaalissa. Tässä tapauksessa reaktiota kutsutaan joskus käänteiseksi epäsuoraksi hemagglutinaatioreaktioksi (RONGA). Asennusvaiheessa testimateriaaliin lisätään erytrosyyttidiagnostiikkaa (erytrosyytit, joiden pinnalle on adsorboitunut vasta-aineita). Punasolut toimivat tässä reaktiossa kantajina ja osallistuvat passiivisesti immuuniaggregaattien muodostukseen. Positiivisella reaktiolla passiivisesti liimatut erytrosyytit peittävät kuopan pohjan tasaisella kerroksella, jossa on hilseilevät reunat ("sateenvarjo"); agglutinaation puuttuessa erytrosyytit kerääntyvät reiän keskisyvennykseen muodostaen kompaktin "painikkeen", jolla on terävästi rajatut reunat.
Koagglutinaatioreaktio käytetään patogeenisolujen (antigeenien) havaitsemiseen käyttämällä adsorboituja vasta-aineita Staphylococcus aureus, Proteiini A:lla on affiniteetti immunoglobuliinien Fc-fragmenttia kohtaan. Tästä johtuen vasta-aineet sitoutuvat stafylokokkiin epäsuorasti Fc-fragmentin kautta, ja Fab-fragmentit ovat ulospäin suuntautuneita ja pystyvät olemaan vuorovaikutuksessa potilaista eristettyjen vastaavien mikrobien kanssa. Tässä tapauksessa muodostuu hiutaleita.
Hemagglutinaation estoreaktio (HITA) käytetään virusinfektioiden diagnosoinnissa ja vain hemagglutinoivien virusten aiheuttamissa infektioissa. Nämä virukset sisältävät pinnallaan proteiinia - hemagglutiniinia, joka on vastuussa hemagglutinaatioreaktiosta (RHA), kun sitä lisätään punasoluviruksiin. RTGA koostuu virusantigeenien estämisestä vasta-aineilla, minkä seurauksena virukset menettävät kykynsä agglutinoida punasoluja.
Coombsin reaktio - RA epätäydellisten vasta-aineiden havaitsemiseen. Joissakin tartuntataudeissa, kuten luomistaudissa, epätäydellisiä vasta-aineita taudinaiheuttajalle kiertää potilaan veressä. Epätäydellisiä vasta-aineita kutsutaan salpauksiksi, koska niillä on yksi antigeeniä sitova kohta, ei kaksi, kuten täydellisissä vasta-aineissa. Siksi, kun antigeenistä diagnostiikkaa lisätään, epätäydelliset vasta-aineet sitoutuvat antigeeneihin, mutta eivät kiinnitä niitä toisiinsa. Reaktion ilmentämiseksi lisätään antiglobuliiniseerumia (vasta-aineita ihmisen immunoglobuliineille), mikä johtaa reaktion ensimmäisessä vaiheessa muodostuneiden immuunikompleksien (antigeeninen diagnostiikka + epätäydelliset vasta-aineet) agglutinaatioon.
Epäsuoraa Coombsin reaktiota käytetään potilailla, joilla on intravaskulaarinen hemolyysi. Joillakin näistä potilaista löytyy epätäydellisiä monovalenttisia anti-Rhesus-vasta-aineita. Ne ovat erityisesti vuorovaikutuksessa Rh-positiivisten erytrosyyttien kanssa, mutta eivät aiheuta niiden agglutinaatiota. Siksi antiglobuliiniseerumia lisätään anti-Rh-vasta-aineiden + Rh-positiivisten punasolujen järjestelmään, mikä aiheuttaa punasolujen agglutinaation. Diagnoosissa käytetään Coombsin reaktiota patologiset tilat liittyy immuuniperäisten erytrosyyttien intravaskulaariseen hajoamiseen, esimerkiksi vastasyntyneen hemolyyttiseen sairauteen, joka johtuu Rhesus-konfliktista.
RA veriryhmien määrittämiseen perustuu erytrosyyttien agglutinaatioon immuuniseerumin vasta-aineilla veriryhmien A (II), B (III) antigeeneille. Kontrolli on seerumi, joka ei sisällä vasta-aineita, ts. seerumin AB (IV) veriryhmät ja ryhmien A (P) ja B (III) punasolujen antigeenit. Ryhmän 0(I) erytrosyyttejä käytetään negatiivisena kontrollina, koska niissä ei ole antigeenejä.
Rh-tekijän määrittämiseen käytetään anti-Rh-seerumia (vähintään kahta eri sarjaa). Rh-antigeenin läsnä ollessa tutkittujen erytrosyyttien kalvolla tapahtuu näiden solujen agglutinaatiota.
13.3. saostumisreaktio
RP on immuunireaktio vasta-aineiden ja antigeenien vuorovaikutuksesta elektrolyyttien läsnä ollessa, ja antigeeni on liukoisessa tilassa. Saostuksen aikana liukoiset antigeenit saostuvat vasta-aineilla, mikä ilmenee sameana saostumisjuovien muodossa. Näkyvän sakan muodostumista havaitaan, kun molemmat reagenssit sekoitetaan vastaavissa suhteissa. Yhden niistä ylimäärä vähentää saostuneiden immuunikompleksien määrää. Saostumisreaktio voidaan asettaa useilla eri tavoilla.
Rengassaostumisreaktio sijoitetaan halkaisijaltaan pieniin saostusputkiin. Immuuniseerumi lisätään koeputkeen ja liukoinen antigeeni kerrostetaan huolellisesti. Positiivisella tuloksella muodostuu maitomainen rengas kahden liuoksen rajalle. Rengassaostumisreaktiota, joka määrittää antigeenien esiintymisen elimissä ja kudoksissa, joiden uutteet keitetään ja suodatetaan, kutsutaan lämpösaostumisreaktioksi (Ascoli-reaktio lämpöstabiilin pernaruttoantigeenin määrittämiseksi).
Ouchterlonyn kaksois-immunodiffuusioreaktio. Tämä reaktio suoritetaan agargeelillä. Kuopat leikataan tasapaksuiseksi geelikerrokseksi tietyllä etäisyydellä toisistaan ja täytetään vastaavasti antigeenillä ja immuuniseerumilla. Sen jälkeen antigeenit ja vasta-aineet diffundoituvat geeliin, kohtaavat toisensa ja muodostavat immuunikomplekseja, jotka saostuvat geelissä ja tulevat näkyviin saostumisviivoina.
ravitsemus. Tätä reaktiota voidaan käyttää tuntemattomien antigeenien tai vasta-aineiden havaitsemiseen sekä eri antigeenien samankaltaisuuden tarkistamiseen: jos antigeenit ovat identtisiä, saostumisviivat sulautuvat, jos antigeenit eivät ole identtisiä, saostumisviivat leikkaavat, jos antigeenit ovat osittain identtinen, muodostuu kannu.
Radiaalinen immunodiffuusioreaktio. Sulaan agar-geeliä lisää vasta-aineita ja levitä geeli tasaiseksi kerrokseksi lasille. Geeliin leikataan kuoppia ja niihin syötetään standarditilavuus eri pitoisuuksilla olevia antigeeniliuoksia. Inkuboinnin aikana antigeenit diffundoituvat säteittäisesti ulos kuopasta ja, kun ne kohtaavat vasta-aineita, muodostavat saostusrenkaan. Niin kauan kuin kuopassa on ylimäärä antigeeniä, saostusrenkaan halkaisija kasvaa asteittain. Tätä menetelmää käytetään antigeenien tai vasta-aineiden määrittämiseen testiliuoksessa (esimerkiksi eri luokkien immunoglobuliinien pitoisuuden määrittämiseen veren seerumissa).
Immunoelektroforeesi. Antigeeniseos erotetaan alustavasti elektroforeesilla, sitten saostava antiseerumi viedään uraan proteiinin liikesuuntaa pitkin. Antigeenit ja vasta-aineet diffundoituvat geeliin toisiaan kohti; vuorovaikutuksessa ne muodostavat kaarevia sadeviivoja.
flokkulaatioreaktio(Ramonin mukaan) - eräänlainen saostumisreaktio, jota käytetään antitoksisen seerumin tai toksoidin aktiivisuuden määrittämiseen. Reaktio suoritetaan koeputkissa. Koeputkessa, jossa toksoidi ja antitoksiini ovat samassa suhteessa, havaitaan sameutta.
13.4. Komplementin kiinnitysreaktio
Vasta-aineet, jotka ovat vuorovaikutuksessa vastaavan antigeenin kanssa, sitovat lisätyn komplementin (1. järjestelmä). Komplementin kiinnittymisen indikaattorina ovat hemolyyttisellä seerumilla herkistetyt punasolut, ts. erytrosyyttien vasta-aineet (2. järjestelmä). Jos komplementti ei ole kiinteä 1. järjestelmässä, ts. antigeeni-vasta-ainereaktiota ei tapahdu, silloin herkistyneet punasolut hajoavat kokonaan (negatiivinen reaktio). Kun komplementti sitoutuu 1. järjestelmän immuunikompleksiin, herkistettyjen punasolujen lisäämisen jälkeen hemolyysi
poissa (positiivinen reaktio). Komplementin sitoutumisreaktiota käytetään tartuntatautien (tipuri, kuppa, influenssa jne.) diagnosointiin.
13.5. Neutralisaatioreaktio
Mikrobeilla ja niiden myrkkyillä on haitallinen vaikutus ihmiskehon elimiin ja kudoksiin. Vasta-aineet pystyvät sitoutumaan näihin haitallisiin aineisiin ja estämään ne, ts. neutraloida. Tämä vasta-aineiden ominaisuus perustuu diagnostinen reaktio neutralointi. Se suoritetaan viemällä antigeeni-vasta-aineseosta eläimiin tai herkkiin testikohteisiin (soluviljelmään, alkioihin). Esimerkiksi toksiinien havaitsemiseksi potilaan materiaalista 1. ryhmän eläimille ruiskutetaan potilaan materiaalia. Toisen ryhmän eläimiin injektoidaan samanlaista materiaalia, joka on esikäsitelty sopivalla antiseerumilla. Ensimmäisen ryhmän eläimet kuolevat toksiinin läsnä ollessa materiaalissa. Toinen eläinten ryhmä selviää, toksiinin vahingollinen vaikutus ei ilmene, koska se neutraloituu.
13.6. Reaktiot, joissa käytetään leimattuja vasta-aineita tai antigeenejä
13.6.1. Immunofluoresenssireaktio (RIF, Koonsin menetelmä)
Tätä menetelmää käytetään pikadiagnostiikassa. Se voi havaita sekä mikrobiantigeenejä että vasta-aineita.
Suora RIF-menetelmä- immuunireaktio vasta-aineiden vuorovaikutuksesta antigeenien kanssa, ja vasta-aineet on leimattu fluorokromilla - aineella, joka pystyy emittoimaan tietyn aallonpituuden valokvanttia, kun siihen osuu tietyn aallonpituuden valo. Tämän menetelmän asettamisen erikoisuus on tarve poistaa reagoimattomat komponentit epäspesifisen luminesenssin havaitsemisen poissulkemiseksi. Tätä varten pese reagoimattomat vasta-aineet. Tulokset arvioidaan fluoresoivalla mikroskoopilla. Tällaisella luminesoivalla seerumilla käsitellyssä sivelyssä olevat bakteerit hehkuvat tummalla taustalla solun reunaa pitkin.
Epäsuora RIF-menetelmä käytetty enemmän kuin edellinen. Tämä reaktio suoritetaan kahdessa vaiheessa. Ensimmäisessä vaiheessa antigeenit keskenään
vuorovaikutuksessa vastaavien vasta-aineiden kanssa muodostaen immuunikomplekseja. Kaikki komponentit, jotka eivät ole reagoineet (eli jotka eivät ole osa immuunikomplekseja), on poistettava pesemällä. Toisessa vaiheessa muodostunut antigeeni-vasta-ainekompleksi havaitaan käyttämälläa. Tuloksena muodostuu monimutkainen mikrobi + antimikrobiset kanin vasta-aineet + vasta-aineet kanin immunoglobuliineille, jotka on leimattu fluorokromilla. Tulokset arvioidaan fluoresoivalla mikroskoopilla.
13.6.2. Immunomääritys tai määritys
ELISA on yleisin moderni menetelmä käytetään virus-, bakteeri- ja alkueläininfektioiden diagnosointiin, erityisesti HIV-infektion diagnosointiin, virushepatiitti jne.
ELISA-muunnoksia on paljon. Kiinteän faasin ei-kilpailevaa ELISAa käytetään laajalti. Se suoritetaan 96-kuoppaisilla polystyreenilevyillä (kiinteä faasi). Reaktion aikana on välttämätöntä pestä pois reagoimattomat komponentit kussakin vaiheessa. Vasta-aineita määritettäessä kuopat, joihin antigeenit adsorboituvat, täytetään tutkittavalla veriseerumilla ja sitten entsyymillä leimatulla antiglobuliiniseerumilla. Näytä reaktio lisäämällä substraatti entsyymille. Entsyymin läsnä ollessa substraatti muuttuu ja entsyymi-substraattikompleksi valitaan siten, että reaktiossa muodostunut tuote värjäytyy. Siten positiivisella reaktiolla havaitaan liuoksen värin muutos. Antigeenien määrittämiseksi kiinteän faasin kantaja herkistetään vasta-aineilla, sitten testimateriaali (antigeenit) ja entsyymileimattu antigeeniseerumi lisätään peräkkäin. Reaktion ilmenemistä varten lisätään substraatti entsyymille. Liuoksen värin muutos tapahtuu positiivisella reaktiolla.
13.6.3. Immunoblottaus
Tämä menetelmä perustuu elektroforeesin ja ELISA:n yhdistelmään. Immunoblottaus suoritettaessa (blottaus englannista. blot- spot) monimutkaiselle antigeeniseokselle suoritetaan ensin elektroforeesi polyakryyliamidigeelissä. Tuloksena oleva fraktioitu anti-
geenipeptidit siirretään nitroselluloosakalvolle. Sitten blotit käsitellään entsyymileimatuilla vasta-aineilla spesifiselle antigeenille, so. suorittaa ELISA-blotti. Immunoblottausta käytetään infektioiden, kuten HIV:n, diagnosoinnissa.
13.6.4. Immuunielektronimikroskooppi
Menetelmä koostuu viruksia (harvemmin muita mikrobeja) mikroskopiasta elektronimikroskoopilla, jotka on aiemmin käsitelty sopivalla immuuniseerumilla, joka on leimattu elektronioptisesti tiheillä valmisteilla, esimerkiksi ferritiinillä, rautaa sisältävällä proteiinilla.
13.7. virtaussytometria
Verisolut erilaistuvat lasersytofluorometrian perusteella. Tätä varten halutut solut värjätään fluoresoivilla monoklonaalisilla vasta-aineilla CD-antigeeneja vastaan. Leimatuilla vasta-aineilla käsittelyn jälkeen otettu verinäyte johdetaan ohuen putken läpi ja sen läpi johdetaan lasersäde, joka kiihdyttää fluorokromin luminesenssia. Fluoresenssin intensiteetti korreloi solun pinnalla olevien antigeenien tiheyden kanssa, ja se voidaan määrittää kvantitatiivisesti käyttämällä valokerrosta. Saadut tulokset muunnetaan histogrammiksi.
Määrittämiseen käytetään virtaussytometriaa immuunitilanne(lymfosyyttien pääpopulaatioiden sisältö, solunsisäisten ja ekstrasellulaaristen sytokiinien pitoisuus, NK-solujen toiminnallinen aktiivisuus, fagosytoosiaktiivisuus jne.).
Laajentunut agglutinaatioreaktio (RA). Aseta AT potilaan veren seerumissa pidennetty agglutinaatioreaktio (RA). Tätä varten veriseerumilaimennosten sarjaan lisätään diagnostiikkaa - tapettujen mikro-organismien tai hiukkasten suspensiota, jossa on adsorboitunut Ag. Suurin laimennus antaa agglutinaatio Ag, jota kutsutaan veren seerumin tiitteriksi.
Agglutinaatioreaktion lajikkeet (RA) toteamaan AT - veripisarakoe tularemiaa varten (diagnostiikan levittäminen veripisaralle ja näkyvien valkeiden agglutinaattien ilmaantuminen) ja Huddlesonin reaktio luomistaudin toteamiseksi (tisaralle levitettynä gentianvioletilla värjätty diagnostiikka). veriseerumista).
Likimääräinen agglutinaatioreaktio (RA)
Eristettyjen mikro-organismien tunnistamiseksi likimääräinen RA asetetaan lasilevyille. Tätä varten patogeeniviljelmä lisätään pisaraan standardidiagnostista antiseerumia (laimennoksena 1:10, 1:20). Jos tulos on positiivinen, he antavat yksityiskohtaisen reaktion kasvavilla antiseerumin laimennuksilla.
reaktio pidetään positiivisena, jos agglutinaatiota havaitaan laimennoksissa, jotka ovat lähellä diagnostisen seerumin tiitteriä.
OAS. Somaattinen O-Ag ne ovat lämpöstabiileja ja kestävät kiehumista 2 h. Vuorovaikutuksessa AT:n kanssa ne muodostavat hienojakoisia aggregaatteja.
N-Ag. H-Ag (flagellate) lämpölabiili ja tuhoutuu nopeasti 100 °C:ssa sekä etanolin vaikutuksesta. Reaktioissa H-antiseerumin kanssa muodostuu 2 tunnin inkuboinnin jälkeen irtonaisia suuria hiutaleita (muodostuvat bakteerien tarttumisesta yhteen flagellan kanssa).
Vi Ar lavantautibakteerit ovat suhteellisen lämpöstabiileja (kestävät lämpötilan 60-62 ° C 2 tuntia); Vi-antiseerumin kanssa inkuboitaessa muodostuu hienojakoista agglutinaattia.
Suorat hemagglutinaatioreaktiot
Yksinkertaisin näistä reaktiot - agglutinaatio erytrosyytit tai hemagglutinaatio, jota käytetään veriryhmien määrittämiseen AB0-järjestelmässä. Määrittämistä varten agglutinaatio(tai sen puuttumista) käytetään standardeja antiseerumeja, joissa on anti-A- ja anti-B-agglutiniinia. Reaktiota kutsutaan suoraksi, koska tutkitut antigeenit ovat erytrosyyttien luonnollisia komponentteja.
Jaettu suora hemagglutinaatio mekanismeissa on viruksen hemagglutinaatio. Monet virukset pystyvät spontaanisti agglutinoimaan lintujen ja nisäkkäiden punasoluja, ja niiden lisääminen erytrosyyttien suspensioon aiheuttaa aggregaattien muodostumista niistä.
