Kohde: Hallita agglutinaatioreaktion ja saostumisreaktion vaiheistustekniikka infektiotautien diagnosoimiseksi.

Moduuli 1 Mikro-organismien morfologia ja fysiologia. Infektio. Immuniteetti.

Aihe 16: Agglutinaatioreaktio. saostumisreaktio.

Aiheen relevanssi. Alla immuniteetti tarkoittaa kehon immuniteettia tartunta- ja ei-tartunnanaiheuttajia vastaan ​​( patogeeniset mikro-organismit, vieraat proteiinit jne. aineet). Näitä aineita kutsutaan antigeeneiksi. Immuniteetti on joko synnynnäistä tai hankittua. Synnynnäinen- kun muodostuu kudoksia ja humoraalisia suojalaitteita, jotka aiheuttavat immuniteetin tartuntataudeille, jotka ovat periytyviä.

Hankittu- elimistön immuunijärjestelmä suorittaa sen vasta-aineiden tuotannon tai herkistyneiden lymfosyyttien kerääntymisen muodossa. Se on jaettu luonnollinen ja keinotekoinen. Toimintamekanismin mukaan se jaetaan aktiivinen ja passiivinen. Kaikissa immunologisissa reaktioissa pääkomponentti on antigeeni.

päätoiminto immuunijärjestelmä, joka koostuu lymfoidikudoksesta, on vieraiden aineiden (antigeenien) tunnistaminen ja niiden neutralointi.

Antigeenit voivat päästä kehoon sen kautta Airways, Ruoansulatuskanava ihon ja limakalvojen läpi. Jokainen antigeeni stimuloi spesifisten proteiiniaineiden - vasta-aineiden - muodostumista.

Antigeenit jaettu täydellisiin ja huonompiin (hapteeneihin). Täydelliset antigeenit aiheuttaa täydellisen immuunivasteen. Vialliset antigeenit eivät aiheuta itsenäisesti immuunivastetta, mutta joskus saavat tämän kyvyn konjugoituna korkean molekyylipainon proteiinikantaja-aineiden kanssa. Lisäksi on antigeenejä: puolihapteeneja, proantigeenejä, heteroantigeenejä ja isoantigeenejä.

Vasta-aineet ovat ihmisen tai eläimen seerumin immunoglobuliineja. Vasta-aineita muodostuu infektion jälkeen sekä heikennetyillä tai tapetuilla bakteereilla, riketsioilla, viruksilla, toksiineilla ja muilla aineilla tehdyn immunisoinnin seurauksena. Vasta-aineet- immunoglobuliiniproteiinit kemiallinen koostumus kuuluvat glykoproteiineihin. Immunoglobuliinit jaetaan rakenteen ja immunobiologisten ominaisuuksien mukaan 5 luokkaa: IgM, IgG, IgA, IgE, IgD.

Normaalit vasta-aineet löytyy ihmisistä ja eläimistä, joita ei ole immunisoitu. Spesifiset vasta-aineet muodostuvat infektion tai immunisaation seurauksena.

Vasta-aineen ja antigeenin välistä reaktiota kutsutaan serologinen. Serologiset reaktiot ovat erittäin spesifisiä ja niitä käytetään monien tartuntatautien diagnosoinnissa. On olemassa agglutinaatio- ja saostumisreaktioita.

1. Agglutinaatioreaktio (RA) perustuu antigeenin (agglutinogeeni) ja vasta-aineen (agglutiniini) vuorovaikutukseen, jossa tapahtuu agglutinaatiota ja mikrobikappaleiden saostumista elektrolyytin läsnä ollessa. Agglutinaatioreaktion formulaatiossa on useita muunnelmia.

Korkein arvo omistaa:

- Makroskooppinen (sijoitettu) agglutinaatio koeputkissa. Mikrobisuspensio (diagnosticum) lisätään potilaan seerumiin ja 1 tunnin termostaatissa 37 asteen lämpötilassa olon jälkeen kirjataan seerumin laimennus (tiitteri), jossa reaktio tapahtui. Agglutinaatioreaktion katsotaan olevan positiivinen, kun putken pohjalle muodostuu sakka, jossa supernatantti kirkastuu selvästi. Tätä sakkaa kutsutaan agglutinaatiksi.

Agglutinaatin luonteen mukaan erotetaan hienorakeinen (O) ja karkearakeinen (H) agglutinaatio. Hienojakoisen agglutinaatin havaitsemiseen käytetään agglutinoskooppia. Tulosten laskeminen alkaa ohjausputkista. Seerumin viimeistä laimennusta, jossa havaitaan agglutinaatiota, pidetään sen tiitterinä.

Reaktion tarkoitus: vasta-aineiden havaitseminen potilaan seerumista.

- mikroskooppinen (kiihdytetty) ) likimääräinen agglutinaatio lasilla. Tippa bakteeriviljelmää lisätään pisaralle diagnostista immuuniseerumia ja sekoitetaan tasaisesti. Reaktio etenee huoneenlämpötilassa 5-10 minuutin kuluttua. Sitten tili tehdään. Positiivisella reaktiolla seerumipisarassa havaitaan bakteerien kerääntymistä jyvien tai hiutaleiden muodossa. Reaktion tarkoitus: määrittää patogeenin tyyppi tunnetun diagnostisen seerumin perusteella.

- Epäsuoran (passiivisen) hemagglutinaation (RNGA) reaktio. Tämän reaktion ydin on se, että pässin erytrosyytit pystyvät adsorboimaan antigeenejä pinnalle. Spesifisten vasta-aineiden vaikutuksesta punasolut tarttuvat yhteen ja saostuvat muodostaen hemagglutinaattia pohjaan. Reaktio on erittäin herkkä ja spesifinen. RNGA:n avulla voit havaita vähimmäismäärän polysakkaridityyppisiä vasta-aineita ja viallisia antigeenejä. Tätä reaktiota käytetään monien tartuntatautien (lavantauti ja lavantauti, sivutauti, tuberkuloosi jne.) diagnosoinnissa.

2. Saostusreaktio (RP ) – antigeeni-vasta-ainekompleksin saostaminen. Suurin ero RP:n ja RA:n välillä on, että RA:ssa käytetään korpuskulaarista antigeeniä, kun taas RP:ssä antigeeni on proteiini- tai polysakkaridiluonteinen kolloidinen aine. Tässä reaktiossa antigeeniä kutsutaan saostusgeeniksi ja vasta-aineita kutsutaan saostumaksi. Reaktio pannaan koeputkiin kerrostamalla antigeeniliuos immuuniseerumin päälle. Antigeenin ja vasta-aineiden optimaalinen suhde rajalla

nämä liuokset muodostavat sakkarenkaan. Jos antigeeninä käytetään keitettyjä ja suodatettuja elinten ja kudosten uutteita, reaktiota kutsutaan lämpösaostumisreaktioksi (Ascoli-reaktio, joka sisällytetään diagnoosiin pernarutto, rutto, tularemia jne.).

Saostumisreaktioita agarissa käytetään laajalti: yksinkertainen diffuusiomenetelmä, kaksoisdiffuusiomenetelmä.

Eräs sadetyyppi on flokkulaatioreaktio- toksoidin tai antitoksisen seerumin aktiivisuuden määrittämiseen. Lisäksi tätä reaktiota voidaan käyttää määrittämään Corynebacterium diphtheriae -kantojen toksisuus.

Erityiset tavoitteet:

· Selitä antigeenien rooli immuunivasteen indusoijina;

· Kuvaile antigeenien rakennetta, mukaan lukien mikro-organismien antigeenit;

· Kuvaa agglutinaatioreaktion mekanismi;

· Kuvaile saostumisreaktion mekanismia.

Pystyä:

· Selitä antigeenien rooli immuunivasteen indusoijina;

Kuvaile vasta-aineiden rakennetta (eri immunoglobuliiniluokat);

· Analysoida vasta-aineiden ja antigeenien vuorovaikutusmekanismia;

· Tulkitse agglutinaatioreaktion tulokset;

· Tulkitse saostumisreaktion tulokset;

· Analysoi tulokset.

Teoreettisia kysymyksiä:

1. Käsitteiden "antigeenit" ja "vasta-aineet" määritelmä.

2. Antigeenien rooli immuunivasteen indusoijina.

3. Vasta-aineiden rakenne (eri immunoglobuliiniluokat).

4. Vasta-aineiden ja antigeenien vuorovaikutuksen mekanismi.

5. Immuniteettireaktiot, niiden rooli immuunivasteessa ja tartuntatautien diagnosoinnissa.

6. Agglutinaatioreaktion mekanismi.

7. Saostumisreaktion mekanismi.

Käytännön tehtävät, jotka suoritetaan luokkahuoneessa:

1. Agglutinaatioreaktion määrittäminen vasta-aineiden havaitsemiseksi potilaan seerumista.

2. Mikroagglutinaatioreaktion asettaminen lasille diagnostisilla seerumeilla puhtaan bakteeriviljelmän tunnistamiseksi.

3. Agglutinaatioreaktion tulosten arviointi.

4. Saostusreaktion asettaminen bakteeriantigeenin havaitsemiseksi.

5. Saostusreaktion tulosten arviointi.

6. Epäsuoran hemagglutinaation reaktion tulosten arviointi.

7. Protokollan rekisteröinti.

Kirjallisuus:

1. Pyatkin K.D., Krivoshein Yu.S. Mikrobiologia virologian ja immunologian kanssa - Kiova: Higher School, 1992.- 431s.

2. Vorobjov A.V., Bykov A.S., Pashkov E.P., Rybakova A.M. Microbiology.- M.: Medicine, 1998.- 336s.

3. Lääketieteellinen mikrobiologia /Toimittaja V.P. Pokrovsky. - M .: GEOTAR-MED, 2001. - 768s.

4. Korotyaev A.I., Babichev S.A. Lääketieteellinen mikrobiologia, immunologia ja virologia / Oppikirja lääketieteelliset yliopistot, Pietari: "Erikoiskirjallisuus", 1998.- 592s.

5. Timakov V.D., Levashev V.S., Borisov L.B. Mikrobiologia / Oppikirja - 2. painos, tarkistettu. ja lisää - M .: Lääketiede, 1983.- 512s.

6. Luentomuistiinpanot.

lisäkirjallisuutta:

1. Titov M.V. tarttuvat taudit.- K., 1995.- 321s.

2. Shuvalova E.P. Tartuntataudit. - M .: Lääketiede, 1990. - 559s.

Agglutinaatioreaktio perustuu vasta-aineiden (agglutiniinien) spesifiseen vuorovaikutukseen kokonaisten mikrobi- tai muiden solujen kanssa. Tämän vuorovaikutuksen seurauksena muodostuu hiukkasagglomeraatteja, jotka saostuvat (agglutinoituvat). Bakteerit, alkueläimet, sienet, hiivat, riketsiat, punasolut ja muut solut, sekä elävät että kuolleet, voivat osallistua agglutinaatioreaktioon. Reaktio etenee kahdessa vaiheessa: ensimmäinen on antigeenin ja vasta-aineen spesifinen yhdistelmä, toinen on epäspesifinen, eli näkyvän agglutinaatin muodostuminen. Agglutinaatin saostumista tapahtuu elektrolyyttien, kuten natriumkloridin, läsnä ollessa. Agglutinaatissa olevat mikro-organismit pysyvät elossa, mutta menettävät liikkuvuutensa.

Agglutinaatioreaktiota käytetään laajalti tartuntatautien serologisessa diagnoosissa ja eristettyjen mikrobien antigeenisen rakenteen määrittämisessä. Potilaan tai kantajan kehosta eristetyn patogeenin antigeenisen rakenteen määrittämiseksi käytetään spesifistä immuuniseerumia, joka saadaan immunisoimalla eläimiä (kani, aasi, pässi) tietyillä mikro-organismeilla. Mikrobin tunnistus suoritetaan agglutinaatioreaktiossa lasilla adsorboituneiden tai monoreseptoriseerumien kanssa tai koeputkissa, joissa on spesifisiä agglutinoituvia seerumeita. Adsorboidut seerumit sisältävät vasta-aineita vain tietylle mikrobille spesifisille antigeeneille, ja monoreseptoriseerumit sisältävät vasta-aineita vain yhdelle spesifiselle patogeenin antigeenille.

Lajien seerumit sisältävät vasta-aineita tietyn mikrobin kaikille antigeeneille.

Mikro-organismin eristetyn viljelmän kuuluminen tätä lajia määritetään agglutinaatiolla tunnetun seerumin kanssa seerumiampullin etiketissä ilmoitettuun vasta-ainetiitteriin. Seerumin vasta-ainetiitterin katsotaan olevan sen viimeinen laimennos, jossa eläimen immunisointiin käytetyn mikrobiviljelmän agglutinaatiota vielä havaitaan. Adsorboituja ja monoreseptoriseerumeja käytetään yleensä laimentamattomina lasin agglutinaatioreaktiossa.

Kun määritetään vasta-aineiden esiintyminen potilaan veren seerumissa, se laimennetaan isotonisella natriumkloridiliuoksella alkaen laimennuksesta 1:50 - 1:800 tai enemmän. Jokaiseen laimennokseen lisätään elävien tai tapettujen mikrobien suspensio. Lämmöllä tai formaliinilla tapettuja mikrobeja sisältäviä valmisteita kutsutaan diagnosoiksi. Mikro-organismiviljelmiä kuumentamalla saadut diagnoosit sisältävät vain somaattisia antigeenejä. Kun käytetään vain formaliinia, myös siimaantigeenit säilyvät mikrobeissa.

Kun potilaan veressä on vasta-aineita, reaktiossa otettu diagnostiikka tarttuu yhteen ja sakka (agglutinaatti) muodostuu kahdeksi koeputkeksi. Tässä tapauksessa agglutinaatioreaktion tuloksia pidetään positiivisina. Kontrolliputkessa, johon on lisätty isotonista natriumkloridiliuosta ja diagnostiikkaa, mikrobisuspension tulee olla homogeeninen ( takaisku agglutinaatio).

Agglutinaatioreaktion tulosten huomioiminen joissakin sairauksissa, kuten leptospiroosissa, suoritetaan vain mikroskooppisesti mikroskoopin pimeässä näkökentässä (mikroagglutinaatio). Taudin serologisen diagnoosin tekemiseksi diagnostinen sairaus otetaan huomioon. Se vastaa yleensä seerumilaimennoitetta 1:100 tai 1:200.

Potilaan veren seerumissa agglutinaatioreaktiota käyttämällä voidaan havaita vasta-aineita lavantauti- ja paratyfoidikuumeessa (Vidal-reaktio), luomistaudissa (Wright-reaktio), tularemiassa jne.
Castellanin reaktio. Joillekin tarttuvat taudit tai immunisointi mikro-organismeilla, jotka sisältävät ryhmän antigeenejä, veriseerumissa, tälle tyypille spesifisten vasta-aineiden lisäksi esiintyy myös ryhmävasta-aineita. Tässä tapauksessa syntyneet seerumit agglutinoituvat sukulaisbakteerilajeihin.

Castellani ehdotti menetelmää ryhmävasta-aineiden adsorptioon immuuniseerumeista, joka perustuu niiden poistamiseen sukulaislajien mikro-organismien avulla, joilla on ryhmäantigeenejä, mutta joista puuttuu spesifisiä. Tällaisten mikro-organismien viljelmä, lisättynä seerumiin, adsorboi epäspesifisten ryhmien vasta-aineita, ja antigeeni-vasta-ainekompleksin poistamisen jälkeen seerumiin jää vain spesifisiä immunoglobuliinia. Castellanin menetelmällä käsiteltyjä seerumeja voidaan käyttää agglutinaatioreaktiossa erittäin spesifisinä.

immunodiagnostiset reaktiot. Antigeeni-vasta-ainereaktiot ja reaktiot leimattujen komponenttien kanssa. Käyttö mikro-organismien tunnistamiseen ja tartuntatautien diagnosointiin.

Immuunireaktioita käytetään diagnostisissa ja immunologisissa tutkimuksissa potilailla ja terveitä ihmisiä. Käytä tätä tarkoitusta varten serologiset menetelmät (alkaen lat. seerumi - seerumi ja logot - doktriini), eli menetelmiä vasta-aineiden ja antigeenien tutkimiseksi käyttämällä antigeeni-vasta-aine-reaktioita, jotka on määritetty veren seerumissa ja muissa nesteissä sekä kehon kudoksissa.

Patogeenin antigeenejä vastaan ​​olevien vasta-aineiden havaitseminen potilaan veriseerumista mahdollistaa taudin diagnosoinnin. Serologisia tutkimuksia käytetään myös mikrobiantigeenien, erilaisten biologisesti aktiivisten aineiden, veriryhmien, kudos- ja kasvainantigeenien, immuunikompleksien, solureseptorien jne. tunnistamiseen.

Kun mikrobi eristetään potilaasta, patogeeni tunnistetaan sitä tutkimalla. antigeeniset ominaisuudet käyttämällä immuunidiagnostisia seerumeita, eli hyperimmunisoitujen eläinten veriseerumeita, jotka sisältävät spesifisiä vasta-aineita. Tämä ns serologinen tunnistaminen mikro-organismeja.

Mikrobiologiassa ja immunologiassa käytetään laajalti agglutinaatiota, saostumista, neutralointireaktiota, komplementtia sisältäviä reaktioita, joissa käytetään leimattuja vasta-aineita ja antigeenejä (radioimmunologiset, entsyymi-immunomääritys, immunofluoresenssimenetelmät). Luetteloidut reaktiot eroavat rekisteröidyn vaikutuksen ja kovettumistekniikan suhteen, mutta ne kaikki ovat emäksisiä. vans antigeenin ja vasta-aineen vuorovaikutuksen reaktiosta, ja niitä käytetään sekä vasta-aineiden että antigeenien havaitsemiseen. Immuniteettireaktiolle on ominaista korkea herkkyys ja spesifisyys.

Tärkeimpien immunodiagnostisten reaktioiden periaatteet ja kaaviot on annettu alla. Yksityiskohtainen tekniikka reaktioiden asettamiseen on annettu. käytännön ohjeita immunodiagnostiikasta.

Agglutinaatioreaktio - RA(alkaen lat. aggluti- natio- sitoutuminen) - yksinkertainen reaktio, jossa vasta-aineet sitovat korpuskulaarisia antigeenejä (bakteereja, punasoluja tai muita soluja, liukenemattomia hiukkasia, joihin on adsorboitunut antigeeneja, sekä makromolekyyliset aggregaatit). Se tapahtuu elektrolyyttien läsnä ollessa, esimerkiksi kun lisätään isotonista natriumkloridiliuosta.

Agglutinaatioreaktiosta käytetään erilaisia ​​muunnelmia: laajennettu, likimääräinen, epäsuora jne. Agglutinaatioreaktio ilmenee hiutaleiden tai sedimentin muodostumisena

RA:ta käytetään:

vasta-aineiden määritys potilaiden veriseerumista, esimerkiksi joilla on luomistauti (Wright-, Heddelson-reaktiot), lavantauti ja paratyfoidikuume (Vidal-reaktio) ja muut infektiotaudit;

potilaasta eristetyn patogeenin määrittäminen;

veriryhmien määritys käyttämällä monoklonaalisia vasta-aineita punasolujen allogeeneja vastaan.

Potilaan vasta-aineiden määrittämiseen laittaapidennetty agglutinaatioreaktio: lisätä potilaan veriseerumin laimennoksiin diagnostinen(tapettujen mikrobien suspensio) ja useiden tuntien 37 °C:ssa inkuboinnin jälkeen havaitaan korkein seerumin laimennus (seerumin tiitteri), jossa tapahtui agglutinaatio, eli muodostui sakka.

Agglutinaation luonne ja nopeus riippuvat antigeenin ja vasta-aineiden tyypistä. Esimerkkinä ovat diagnostisten antigeenien (O- ja R-antigeenit) vuorovaikutuksen piirteet spesifisten vasta-aineiden kanssa. Agglutinaatioreaktio kanssa O-diagnostiikka(Lämmön vaikutuksesta kuolleet bakteerit säilyttäen lämpöstabiilin O antigeeni) tapahtuu hienorakeisena agglutinaationa. Agglutinaatioreaktio H-diagnosticumilla (formaliinin tappamat bakteerit, jotka säilyttävät lämpölabiilin flagellaarisen H-antigeenin) on karkearakeinen ja etenee nopeammin.

Jos on tarpeen määrittää potilaasta eristetty taudinaiheuttaja, aseta se orientoiva agglutinaatioreaktio, käyttämällä diagnostisia vasta-aineita (agglutinoivaa seerumia), eli suoritetaan patogeenin serotyypitys. Likimääräinen reaktio suoritetaan lasilevyllä. Lisää pisara diagnostista agglutinoivaa seerumia laimennuksessa 1:10 tai 1:20 potilaasta eristettyä patogeenin puhdasta viljelmää. Kontrolli asetetaan lähelle: seerumin sijaan laitetaan pisara natriumkloridiliuosta. Kun flokkuloiva sedimentti ilmestyy pisara seerumin ja mikrobien kanssa, ne laittavat laaja agglutinaatioreaktio koeputkissa agglutinoivan seerumin kasvavilla laimennoksilla, joihin lisätään 2-3 tippaa patogeenisuspensiota. Agglutinaatio otetaan huomioon sedimentin määrän ja nesteen kirkastumisasteen mukaan. Reaktion katsotaan olevan positiivinen, jos agglutinaatio havaitaan laimennuksessa, joka on lähellä diagnostisen seerumin tiitteriä. Samalla otetaan huomioon kontrollit: isotonisella natriumkloridiliuoksella laimennetun seerumin tulee olla läpinäkyvää, samassa liuoksessa olevan mikrobisuspension tulee olla tasaisen sameaa, ilman sedimenttiä.

Sama diagnostinen agglutinoiva seerumi voi agglutinoida eri sukulaisia ​​bakteereita, mikä tekee niiden tunnistamisesta vaikeaa. Siksi nauti adsorboituja agglutinoivia seerumeja, joista ristiinreaktiiviset vasta-aineet on poistettu niiden sukulaisten bakteerien adsorptiolla. Tällaisissa seerumeissa jää vain tälle bakteerille spesifisiä vasta-aineita. A. Castellani (1902) ehdotti monoreseptoridiagnostisten agglutinoituvien seerumien valmistusta tällä tavalla.

Epäsuoran (passiivisen) hemagglutinaation reaktio (RNHA, RPHA) perustuu erytrosyyttien käyttöön pintaan adsorboituneiden antigeenien tai vasta-aineiden kanssa, joiden vuorovaikutus pallon veriseerumin vastaavien vasta-aineiden tai antigeenien kanssa saa punasolut tarttumaan yhteen ja putoamaan koeputkeen tai kennoon V sedimentin muoto (kuva 13.2). Negatiivisella reaktiolla punasolut asettuvat "painikkeen" muodossa. Yleensä vasta-aineet havaitaan RNHA:sta käyttämällä antigeenista punasoludiagnostiikkaa, joka on erytrosyyttejä, joihin on adsorboitunut. päällä ne antigeenejä. Joskus käytämme vasta-aineerytrosyyttidiagnostiikkaa, johon vasta-aineet adsorboidaan. Esimerkiksi botuliinitoksiini voidaan havaita lisäämällä siihen punasoluvasta-ainetta botulinum diagnosticum (tämä reaktio on ns. kääntää epäsuoran hemagglutinaatioreaktion- RONGA). RNHA:ta käytetään tartuntatautien diagnosointiin gonadotrooppinen hormoni V virtsaa, kun raskaus on todettu, havaitsemiseksi yliherkkyys Vastaanottaja lääkkeet, hormonit ja joissakin muissa tapauksissa.

Koagglutinaatioreaktio . Patogeenisolut määritetään käyttämällä stafylokokkeja, jotka on esikäsitelty immuunidiagnostisella seerumilla. Proteiinia sisältävät stafylokokit A, jolla on affiniteettia kohtaan Fc -immunoglobuliinifragmentti, joka adsorboi epäspesifisesti antimikrobisia vasta-aineita, jotka sitten ovat vuorovaikutuksessa aktiivisten keskusten kanssa potilaista eristettyjen vastaavien mikrobien kanssa. Koagglutinaation seurauksena muodostuu hiutaleita, jotka koostuvat stafylokokeista, diagnostisista seerumin vasta-aineista ja määritettävästä mikrobista.

Hemagglutinaation estoreaktio (RTGA) perustuu estoon, virusten antigeenien suppressioon immuuniseerumin vasta-aineilla, minkä seurauksena virukset menettävät kykynsä agglutinoida punasoluja (kuva 13.3). RTHA:ta käytetään diagnosoimaan monia virussairauksia, joiden aiheuttajat (influenssa, tuhkarokko, vihurirokko, puutiaisaivotulehdus jne.) voivat agglutinoida eri eläinten punasoluja.

Agglutinaatioreaktio veriryhmien määrittämiseen käytetään ABO-järjestelmän perustamiseen (katso kohta 10.1.4.1) käyttämällä punasolujen agglutinaatiota immuuniseerumin vasta-aineilla veriryhmien A (II), B (III) antigeeneja vastaan. Kontrollit ovat: vasta-ainevapaa seerumi, eli seerumi AB (GU) veriryhmät; ryhmien A (II), B (III) punasoluissa olevat antigeenit. Negatiivinen kontrolli ei sisällä antigeenejä, eli käytetään ryhmän 0 (I) punasoluja.

SISÄÄN agglutinaatioreaktiot Rh-tekijän määrittämiseksi(katso kohta 10.1.4.1) käytä anti-Rh-seerumia (vähintään kaksi eri sarjaa). Rh-antigeenin läsnä ollessa tutkittujen erytrosyyttien kalvolla tapahtuu näiden solujen agglutinaatiota. Kaikkien veriryhmien normaalit Rh-positiiviset ja Rh-negatiiviset punasolut toimivat kontrollina.

Agglutinaatioreaktio anti-Rhesus-vasta-aineiden määrittämiseen ( epäsuora reaktio Coombs)käytetään potilailla, joilla on intravaskulaarinen hemolyysi. Joillakin näistä potilaista löytyy anti-Rhesus-vasta-aineita, jotka ovat epätäydellisiä, yksiarvoisia. Ne ovat erityisesti vuorovaikutuksessa Rh-positiivisten erytrosyyttien kanssa, mutta eivät aiheuta niiden agglutinaatiota. Tällaisten epätäydellisten vasta-aineiden läsnäolo määritetään epäsuorassa Coombsin reaktiossa. Tätä varten antiglobuliiniseerumia (vasta-aineita ihmisen immunoglobuliineja vastaan) lisätään anti-Rh-vasta-aineiden + Rh-positiivisten punasolujen järjestelmään, mikä aiheuttaa punasolujen agglutinaation (kuva 13.4). Coombsin reaktiolla diagnosoidaan immuuniperäisten punasolujen intravaskulaariseen hajoamiseen liittyviä patologisia tiloja, esimerkiksi vastasyntyneen hemolyyttinen sairaus: Rh-positiivisen sikiön punasolut yhdistyvät epätäydellisiin vasta-aineisiin veressä kiertävälle Rh-tekijälle, joka risteytyy. istukka Rh-negatiiviselta äidiltä.

Saostumisreaktiot

saostumisreaktio - RP (alkaenlat. praeci-pito- sakka,) on liukoisen molekyyliantigeenin kompleksin muodostumista ja saostumista vasta-aineiden kanssa sameuden muodossa, ns. saostua. Se muodostuu sekoittamalla antigeenejä ja vasta-aineita vastaavina määrinä; yhden niistä ylimäärä alentaa immuunikompleksin muodostumistasoa.

Saostumisreaktiot laitetaan koeputkiin (rengassaostumisreaktio), geeleissä, ravintoväliaineissa jne. Saostusreaktion lajikkeita puolinestemäisessä agar- tai agaroosigeelissä käytetään laajalti: kaksoisimmunodiffuusio Ouchterlonyn mukaan. radiaalinen immunodiffuusio, immunoelektroforeesi jne.

Rengassaostumisreaktio . Reaktio suoritetaan kapeissa saostusputkissa immuuniseerumilla, joille kerrostetaan liukoinen antigeeni. Kun antigeenin ja vasta-aineiden suhde on optimaalinen, näiden kahden liuoksen rajalle muodostuu läpinäkymätön sakkarengas (kuva 13.5). Antigeeniylimäärä ei vaikuta renkaan saostumisreaktion tulokseen johtuen reagenssien asteittaisesta diffuusiosta nesterajalle. Jos rengassaostumisreaktiossa käytetään antigeeneinä keitettyjä ja suodatettuja elinten tai kudosten vesiuutteita, niin tällaista reaktiota kutsutaan ns. lämpösaostusreaktio-iii (Ascoli-reaktio, pernaruttoa sairastavan /

Oukhterunin kaksois-immunodiffuusioreaktio . Reaktion aikaansaamiseksi sulatettiin agar-geeliä ohut kerros kaadetaan lasilevylle ja sen kovettumisen jälkeen leikataan siihen 2-3 mm:n reiät. Näihin kuoppiin sijoitetaan erikseen antigeenit ja immuuniseerumit, jotka leviävät toisiaan kohti. Kohtauskohdassa ne muodostavat vastaavassa suhteessa sakkaa valkoisen nauhan muodossa. Monikomponenttijärjestelmissä eri antigeenejä ja seerumin vasta-aineita sisältävien kuoppien väliin ilmestyy useita sakkaviivoja; identtisillä antigeeneillä sakkaviivat sulautuvat yhteen; ei-identtisille ne leikkaavat (kuva 13.6).

Radiaalinen immunodiffuusioreaktio . Immuuniseerumi, jossa on sulaa agargeeliä, kaadetaan tasaisesti lasille. Geeliin jähmettymisen jälkeen tehdään kuoppia, joihin antigeeni asetetaan erilaisia ​​laimennuksia. Antigeeni diffundoituessaan geeliin muodostaa renkaan saostumisvyöhykkeitä kuoppien ympärille vasta-aineiden kanssa (kuva 13.7). Saostusrenkaan halkaisija on verrannollinen antigeenikonsentraatioon. Reaktiota käytetään eri luokkien immunoglobuliinien, komplementtijärjestelmän komponenttien jne. määrittämiseen veressä.

Immunoelektroforeesi- elektroforeesi- ja immunosaostusmenetelmän yhdistelmä: antigeenien seos viedään geelin kuoppiin ja erotetaan geelissä elektroforeesilla. Sitten elektroforeesivyöhykkeiden rinnalle syötetään uraan immuuniseerumi, jonka vasta-aineet diffundoituessaan geeliin muodostuvat kohtaamiskohtaan saostuslinjan antigeenin kanssa.

flokkulaatioreaktio(Ramonin mukaan) (lat. floccus- villahiutaleet) - opalesenssin tai flokkuloivan massan (immunosaostumisen) ilmaantuminen koeputkeen toksiini-antitoksiini- tai anatoksiini-antitoksiinireaktion aikana. Sitä käytetään antitoksisen seerumin tai toksoidin aktiivisuuden määrittämiseen.

immuuni elektronimikroskopia - sopivilla vasta-aineilla käsiteltyjen mikrobien, useammin virusten, elektronimikroskopia. Immuuniseerumilla käsitellyt virukset muodostavat immuuniaggregaatteja (mikrosaostumia). Virionien ympärille muodostuu vasta-aineiden "korolla", joka eroaa fosfovolframihaposta tai muista elektronioptisesti tiheistä valmisteista.

Reaktiot, joihin liittyy komplementti

Reaktiot, joihin liittyy komplementtiperustuu komplementin aktivaatioon antigeeni-vasta-ainekompleksilla (komplementin kiinnitysreaktio, radiaalinen hemolyysi jne.).

Komplementin kiinnitysreaktio (RSK) perustuu siihen, että toisiaan vastaavissa antigeenit ja vasta-aineet muodostavat immuunikompleksin, jolle Fc -vasta-ainefragmentti liittyy komplementtiin (C), eli komplementin sitoutuminen tapahtuu antigeeni-vasta-ainekompleksin kanssa. Jos antigeeni-vasta-ainekompleksi ei muodostu, komplementti pysyy vapaana (kuva 13.8). RSK suoritetaan kahdessa vaiheessa: 1. vaihe - antigeenin + vasta-aineen + komplementin kolme komponenttia sisältävän seoksen inkubointi; 2. vaihe (indikaattori) - vapaan komplementin havaitseminen seoksessa lisäämällä siihen hemolyyttinen järjestelmä, joka koostuu lampaiden punasoluista ja hemolyyttisestä seerumista, joka sisältää vasta-aineita niille. Reaktion ensimmäisessä vaiheessa, antigeeni-vasta-ainekompleksin muodostumisen aikana, tapahtuu komplementin sitoutuminen, ja sitten 2. vaiheessa vasta-aineilla herkistettyjen erytrosyyttien hemolyysiä ei tapahdu; reaktio on positiivinen. Jos antigeeni ja vasta-aine eivät vastaa toisiaan (testinäytteessä ei ole antigeeniä tai vasta-ainetta), komplementti pysyy vapaana ja 2. vaiheessa liittyy punasolu-antierytrosyytti-vasta-ainekompleksiin aiheuttaen hemolyysin; reaktio on negatiivinen.

RSK:ta käytetään monien tartuntatautien, erityisesti kupan (Wasserman-reaktio) diagnosointiin.

Radiaalisen hemolyysin reaktio (RRH ) sijoitetaan agargeelin kuoppiin, jotka sisältävät pässin erytrosyyttejä ja komplementtia. Kun hemolyyttistä seerumia (vasta-aineita pässin punasoluja vastaan) on lisätty geelin kuoppiin, niiden ympärille muodostuu hemolyysivyöhyke (vasta-aineiden radiaalisen diffuusion seurauksena). Siten on mahdollista määrittää komplementin ja hemolyyttisen seerumin aktiivisuus sekä vasta-aineet influenssaa, vihurirokkoa, puutiaisaivotulehdus. Tätä varten viruksen vastaavat antigeenit adsorboidaan punasoluihin ja potilaan veriseerumi lisätään näitä punasoluja sisältävän geelin kuoppiin. Viruksenvastaiset vasta-aineet ovat vuorovaikutuksessa erytrosyytteihin adsorboituneiden virusantigeenien kanssa

Komplementtikomponentit kiinnittyvät tähän kompleksiin aiheuttaen hemolyysin.

Immuuniadheesioreaktio (RIP ) perustuu komplementtijärjestelmän aktivointiin immuuniseerumilla käsiteltyjen korpuskulaaristen antigeenien (bakteerit, virukset) toimesta. Tämän seurauksena muodostuu aktivoitu kolmas komplementtikomponentti (C3b), joka kiinnittyy korpuskulaariseen antigeeniin osana immuunikompleksia. Punasoluissa, verihiutaleissa, makrofageissa on C3b-reseptoreita, joiden ansiosta, kun nämä solut sekoitetaan C3b:tä sisältävien immuunikompleksien kanssa, ne yhdistyvät ja agglutinoituvat.

Neutralisaatioreaktio

Immuuniseerumin vasta-aineet pystyvät neutraloimaan mikrobien tai niiden toksiinien vahingollisen vaikutuksen herkille soluille ja kudoksille, mikä liittyy vasta-aineiden aiheuttamaan mikrobiantigeenien estoon eli niiden neutralointi. Neutralisaatioreaktio(RN) suoritetaan viemällä antigeeni-vasta-aineseosta eläimiin tai herkkiin testikohteisiin (soluviljelmään, alkioihin). Mikro-organismien tai niiden antigeenien, toksiinien eläimissä ja testikohteissa haitallisen vaikutuksen puuttuessa ne puhuvat immuuniseerumin neutraloivasta vaikutuksesta ja siten antigeeni-vasta-ainekompleksin vuorovaikutuksen spesifisyydestä (kuva 13.9).

Immunofluoresenssireaktio - RIF (Koonsin menetelmä)

Menetelmässä on kolme päätyyppiä: suora, epäsuora (kuva 13.10), jossa on komplementti. Koonsin reaktio on nopea diagnostinen menetelmä mikrobiantigeenien tai vasta-aineiden havaitsemiseen.

Suora RIF-menetelmä perustuu siihen, että kudosantigeenit tai mikrobit, jotka on käsitelty immuuniseerumeilla, joissa on fluorokromeilla leimattuja vasta-aineita, pystyvät hehkumaan fluoresoivan mikroskoopin UV-säteissä.

Tällaisella luminoivalla seerumilla käsitellyt bakteerit hohtavat solun reunaa pitkin vihreän reunan muodossa.

Epäsuora RIF-menetelmä on tunnistaa antigeeni-vasta-ainekompleksi käyttämällä fluorokromilla leimattua antiglobuliini- (anti-vasta-aine) -seerumia. Tätä varten mikrobisuspensiosta otetut sivelynäytteet käsitellään kanin antimikrobisen diagnostisen seerumin vasta-aineilla. Sitten mikrobiantigeenien sitomattomat vasta-aineet pestään pois ja mikrobien pinnalle jääneet vasta-aineet havaitaan käsittelemällä näytteestä fluorokromeilla leimatulla antiglobuliiniseerumilla (anti-kani). Tuloksena muodostuu monimutkainen mikrobi + antimikrobiset kanin vasta-aineet + anti-kanin vasta-aineet, jotka on leimattu fluorokromilla. Tämä kompleksi havaitaan fluoresoivassa mikroskoopissa, kuten suorassa menetelmässä.

ELISA-menetelmä tai analyysi (ELISA)

ELISA -antigeenien havaitseminen käyttämällä niitä vastaavia vasta-aineita, jotka on konjugoitu leimaentsyymiin (piparjuuriperoksidaasi, beeta-galaktosidaasi tai alkalinen fosfataasi). Kun antigeeni on yhdistetty entsyymileimattujen immuuniseerumien kanssa, substraatti/kromogeeni lisätään seokseen. Entsyymi pilkkoo substraatin ja reaktiotuotteen väri muuttuu - värin intensiteetti on suoraan verrannollinen sitoutuneiden antigeenien ja vasta-ainemolekyylien lukumäärään.

Kiinteän faasin ELISA - immunologisen testin yleisin variantti, kun jokin immuunivasteen komponenteista (antigeeni tai vasta-aineet) adsorboituu kiinteälle kantajalle, esimerkiksi polystyreenilevyjen kuoppiin

Vasta-aineita määritettäessä potilaan veriseerumi, entsyymillä leimattu antiglobuliiniseerumi ja entsyymin substraatti (kromogeeni) lisätään peräkkäin levyjen kuoppiin adsorboituneen antigeenin kanssa.

Joka kerta seuraavan komponentin lisäämisen jälkeen sitoutumattomat reagenssit poistetaan kuopista perusteellisella pesulla. klo positiivinen tulos kromogeeniliuoksen väri muuttuu. Kiinteän faasin kantaja voidaan herkistää paitsi antigeenillä myös vasta-aineilla. Sitten haluttu antigeeni viedään kuoppiin adsorboitujen vasta-aineiden kanssa, lisätään immuuniseerumi entsyymillä leimattua antigeeniä vastaan ​​ja sitten lisätään entsyymin substraatti.

Kilpaileva ELISA . kohdeantigeeni ja entsyymileimattu antigeeni kilpailevat toistensa kanssa rajoitetun määrän immuuniseerumin vasta-aineita sitoutumisesta. Toinen testi on etsimäsi vasta-aineet

ja leimatut vasta-aineet kilpailevat keskenään antigeeneistä.

Radioimmunologinen menetelmä tai analyysi (RIA)

Erittäin herkkä menetelmä, joka perustuu antigeeni-vasta-ainereaktioon, jossa käytetään antigeenejä tai radionuklidilla leimattuja vasta-aineita (125 J, 14 C, 3 H, 51 Cr jne.). Niiden vuorovaikutuksen jälkeen muodostunut radioaktiivinen immuunikompleksi erotetaan ja sen radioaktiivisuus määritetään sopivalla laskurilla (beeta- tai gammasäteily):

säteilyn intensiteetti on suoraan verrannollinen sitoutuneiden antigeeni- ja vasta-ainemolekyylien lukumäärään.

klo RIA:n solid-phase-versio yksi reaktiokomponenteista (antigeeni tai vasta-aineet) adsorboidaan kiinteälle kantajalle, esimerkiksi polystyreenimikrosirujen kuoppiin. Toinen menetelmän versio on kilpailukykyinen RIA. kohdeantigeeni ja radionuklidilla leimattu antigeeni kilpailevat toistensa kanssa rajoitetun määrän immuuniseerumin vasta-aineita sitomisesta. Tätä vaihtoehtoa käytetään määrittämään antigeenin määrä testimateriaalissa.

RIA:ta käytetään mikrobiantigeenien havaitsemiseen, hormonien, entsyymien, lääkeaineita ja immunoglobuliinit sekä muut testimateriaalin sisältämät aineet pieninä pitoisuuksina - 10 ~ 0 -I0 ~ 12 g / l. Menetelmään liittyy tietty ympäristövaara.

Immunoblottaus

Immunoblottaus (IB)- erittäin herkkä menetelmä, joka perustuu elektroforeesin ja ELISA:n tai RIA:n yhdistelmään.

Antigeeni eristetäänesilla, sitten se siirretään (blottaus - englanniksi. blot, spot) geelistä aktivoidulle paperille tai nitroselluloosakalvolle ja kehitetty ELISA:lla. Yritykset tuottavat tällaisia ​​nauhoja "bloteilla"

antigeenit. Näille liuskoille levitetään potilaan seerumia. Sitten inkubaation jälkeen potilas pestään potilaan sitoutumattomista vasta-aineista ja levitetään entsyymillä leimattua seerumia ihmisen immunoglobuliineja vastaan. Liuskaan muodostunut kompleksinen antigeeni + potilaan vasta-aine + vasta-aine ihmisen Ig:tä vastaan ​​havaitaan lisäämällä substraattia/kromogeenia, joka muuttaa väriä entsyymin vaikutuksesta (kuva 13.12).

IB:tä käytetään HIV-infektion diagnostisena menetelmänä jne.

Agglutinaatiota kutsutaan bakteerien agglutinaatioksi, joka johtuu spesifisen AT:n vuorovaikutuksesta niiden kanssa. RA vaatii kolme komponenttia: 1) AG (agglutinogeeni); 2) AT (agglutiniini); 3) elektrolyyttiliuos (isotoninen natriumkloridiliuos). Agglutinaatioreaktioon osallistuvat vain korpuskulaariset antigeenit (bakteerit, punasolut, antigeenillä ladatut lateksihiukkaset).

Agglutinaatioreaktio lasilla. Tippa diagnostista seerumia (seerumin laimennus 1:10 - 1:20) levitetään rasvattomalle lasilevylle pipetillä. Tutkittavan mikro-organismin puhdasviljelmä otetaan vinoagarin pinnalta bakteriologisella silmukalla, siirretään seerumipisaraan ja sekoitetaan. Reaktion tulos otetaan huomioon paljaalla silmällä 3-5 minuutin kuluttua. Positiivinen reaktio seerumipisarassa havaitsee hiutaleita (suuria tai pieniä), jotka näkyvät selvästi tummaa taustaa vasten, kun lasilevyä ravistetaan. Negatiivisen reaktion tapauksessa neste pysyy tasaisen sameana.

Agglutinaatioreaktio koeputkissa. Lisää 1 ml fysiologista suolaliuosta useisiin koeputkiin. Lisää sama määrä testiseerumia ensimmäiseen koeputkeen. Valmistetaan peräkkäiset kaksinkertaiset seerumilaimennokset (seerumititraus), minkä jälkeen kuhunkin koeputkeen lisätään 2 tippaa inaktivoitujen bakteerien suspensiota (diagnosticum). Koeputket asetetaan 2 tunniksi termostaattiin 37 °C:seen. Reaktio etenee pienten, paljaalla silmällä näkymättömien hiutaleiden muodostumisella, joten tulokset kirjataan pienellä lisäyksellä erityisessä laitteessa - agglutinoskoopissa. Agglutinaation intensiteetti otetaan huomioon "neljän plussan" järjestelmän mukaisesti: täydellinen agglutinaatio - 4+, osittainen agglutinaatio - 3+ tai 2+, epäilyttävä tulos - +. Viimeinen laimennos, jossa havaitaan agglutinaatio 2+:ssa, otetaan vasta-ainetiitteriksi testiseerumissa.

Agglutinaatioreaktio koeputkissa (pidennetty agglutinaatioreaktio) suoritetaan patogeenien vasta-aineiden tiitterin määrittämiseksi lavantauti ja paratyfoidi (Vidal-reaktio), luomistauti (Wrightin reaktio), lavantauti (Weiglin reaktio).

Agglutinaatio (latinan sanasta agglutinatio - sidos) - antigeenia sisältävien korpuskulaaristen hiukkasten (kokosolut, lateksihiukkaset jne.) sitoutuminen (yhteys) spesifisiin vasta-ainemolekyyleihin elektrolyyttien läsnä ollessa, mikä päättyy hiutaleiden tai sedimentin muodostumiseen (agglutinaatti). ) näkyy paljaalla silmällä. Sedimentin luonne riippuu antigeenin luonteesta: siimabakteerit antavat suurihiutaleisen sedimentin, siima- ja kapselittoman - hienorakeisen, kapselimaisen - sitkeän. Erottele suora agglutinaatio, jossa vuorovaikutus spesifisten vasta-aineiden kanssa osallistui suoraan bakteerin tai minkä tahansa muun solun omia antigeenejä, kuten erytrosyyttejä; ja epäsuorat tai passiiviset, joissa bakteerisolut tai erytrosyytit tai lateksipartikkelit eivät ole omia kantajiaan vaan niihin adsorboituneita vieraita antigeenejä (tai vasta-aineita) niille spesifisten vasta-aineiden (tai antigeenien) havaitsemiseksi. Agglutinaatioreaktioon liittyy pääasiassa IgG- ja IgM-luokkiin kuuluvia vasta-aineita. Se etenee kahdessa vaiheessa: ensinnäkin vasta-aineiden aktiivisella keskuksella on spesifinen vuorovaikutus antigeenideterminantin kanssa, tämä vaihe voi tapahtua elektrolyyttien puuttuessa, eikä siihen liity näkyviä muutoksia reagoivassa järjestelmässä. Toisessa vaiheessa - agglutinaatin muodostumisessa - tarvitaan elektrolyyttien läsnäoloa, jotka vähentävät sähkövaraus kompleksoi antigeeni + vasta-aine ja nopeuttaa niiden sitoutumisprosessia. Tämä vaihe päättyy agglutinaatin muodostumiseen.

Agglutinaatioreaktiot asetetaan joko lasille tai sileille pahvilevyille tai steriileihin agglutinaatioputkiin. Agglutinaatioreaktioita (suoraa ja passiivista) lasilla käytetään yleisesti mm nopeutettu menetelmä spesifisten vasta-aineiden havaitseminen potilaan seerumista (esimerkiksi luomistaudin) tai patogeenin serologinen tunnistaminen. Jälkimmäisessä tapauksessa käytetään yleensä hyvin puhdistettuja (adsorboituja) diagnostisia seerumeita, jotka sisältävät vain monoreseptorivasta-aineita tai niiden eri antigeenejä vastaan. Lasin agglutinaatioreaktion kiistaton etu on sen formuloinnin yksinkertaisuus ja se, että se kestää useita minuutteja tai jopa sekunteja, koska molempia komponentteja käytetään siinä tiivistetyssä muodossa. Sillä on kuitenkin vain laadullinen arvo ja se on vähemmän herkkä kuin koeputki. Laajennettu agglutinaatiotesti koeputkissa antaa tarkempia tuloksia, koska sen avulla voit määrittää seerumin vasta-aineiden kvantitatiivisen sisällön (asettaa sen tiitterin) ja tarvittaessa rekisteröidä vasta-ainetiitterin nousun, joka on diagnostista arvo. Aseta reaktio agglutinaatioputkiin lisäämällä tietyllä tavalla 0,85 %:lla laimennettuna NaCl-liuos seerumi ja yhtä suuri tilavuus (yleensä 0,5 ml) suspensiota standardista diagnostiikkaa (tai testiviljelmää), joka sisältää 1 miljardia bakteeria 1 ml:ssa. Agglutinaatioreaktion tulosten huomioon ottaminen suoritetaan alustavasti 2 tunnin putkien inkuboinnin jälkeen 37 °C:ssa ja lopuksi 20–24 tunnin kuluttua kahden kriteerin mukaan: sakan läsnäolo ja koko sekä putken läpinäkyvyysaste. supernatantti. Arviointi suoritetaan neljän ristin järjestelmän mukaisesti. Reaktioon liittyy välttämättä seerumin ja antigeenin valvonta. Niissä tapauksissa, joissa taudinaiheuttajan serologiseen tunnistamiseen käytetään yksityiskohtaista agglutinaatiotestiä koeputkessa, sillä on diagnostista arvoa, jos reaktio arvioidaan positiiviseksi, kun diagnostista seerumia laimennetaan vähintään puolella sen tiitteristä.

On otettava huomioon, että homologisten antigeenien ja vasta-aineiden liuoksia sekoitettaessa ei aina havaita agglutinaatioreaktion näkyviä ilmentymiä. Sakka muodostuu vain tietyissä molempien reaktiokomponenttien optimaalisissa suhteissa. Näiden rajojen ulkopuolella, kun antigeeniä tai vasta-aineita on merkittävä ylimäärä, ei havaita mitään reaktiota. Tätä ilmiötä kutsutaan "prozone-ilmiöksi". Se havaitaan sekä agglutinaatioreaktiossa että saostumisreaktiossa. Prozonin esiintyminen immuunireaktioissa selittyy sillä, että niihin osallistuvat antigeenit ovat pääsääntöisesti polydeterminantteja ja molekyylit IgG-vasta-aineet on kaksi aktiivista keskustaa. Kun vasta-aineita on ylimäärä, jokaisen antigeenipartikkelin pinta peitetään vasta-ainemolekyylillä niin, ettei vapaita determinanttiryhmiä jää jäljelle, jolloin vasta-aineiden toinen, sitoutumaton aktiivinen keskus ei voi olla vuorovaikutuksessa toisen antigeenisen partikkelin kanssa ja sitoa niitä toisiinsa. Näkyvän agglutinaatin tai sakan muodostuminen estyy myös silloin, kun antigeeniä on ylimäärä, kun vasta-aineista ei ole enää yhtään vapaata aktiivista kohtaa, jolloin antigeeni + vasta-aine + antigeenikomplekseja ei voida enää suurentaa.

Vaihtoehdot nopeutettuihin agglutinaatioreaktioihin. Reaktio passiivinen hemagglutinaatio ja sen muunnelmat

Klassiseen agglutinaatioreaktioon kuuluu korpuskulaaristen antigeenien käyttö. Liukoiset antigeenit voivat kuitenkin myös olla mukana. Tämän mahdollistamiseksi sellaiset antigeenit adsorboidaan immunologisesti inertteihin partikkeleihin. Kantaja-aineena voidaan käyttää lateksi- tai bentoniittipartikkeleita, mutta nykyisin käytetään useimmiten eläinten tai ihmisten punasoluja, jotka parantavat niiden adsorbointiominaisuuksia käsittelemällä tanniini-, formaliini- tai bentsidiiniliuoksilla. Punasoluja, jotka adsorboivat antigeeniä itseensä, kutsutaan tämän antigeenin herkistyneiksi immuunivaste, johon ne osallistuvat, - epäsuoran eli passiivisen hemagglutinaation (RNHA tai RPHA) reaktio, koska erytrosyytit osallistuvat siihen passiivisesti.

RPGA sijoitetaan erityisiin polystyreenilevyihin, joissa on puolipallon muotoisia reikiä. Kun sitä käytetään serologiseen diagnoosiin, näihin kuoppiin valmistetaan kaksinkertaiset laimennokset fysiologinen suolaliuos Tutkitusta seerumista, ja sitten siihen lisätään herkistetyn punasolujen suspensio diagnostisena pakkauksena. Tulokset kirjataan 2 tunnin inkuboinnin jälkeen 37 °C:ssa neliristijärjestelmän mukaisesti. Positiivisella reaktiolla agglutinoidut erytrosyytit asettuvat reiän pohjalle ja peittävät sen tasaisesti käänteisen sateenvarjon muodossa. Negatiivinen reaktio myös erytrosyytit asettuvat, neste muuttuu läpinäkyväksi, sakka näyttää pieneltä "levyltä" reiän keskellä. RPHA:n seerumin tiitterin katsotaan olevan sen viimeinen laimennos, joka antaa silti selvän hemagglutinaation ilman merkittäviä merkkejä jolla on levy.

RPHA:ta voidaan käyttää myös nopeutettuna bakteriologisen diagnostiikan menetelmänä tunnistamattomien bakteerien, virusten, toksiinien, kuten ruttopatogeenien, stafylokokkien enterotoksiinien jne. havaitsemiseksi suoraan testimateriaalista vasta-aineet - vasta-aine erythrocyte diagnosticum. Jos testimateriaali sisältää riittävän määrän tunnettua antigeeniä, TPHA on positiivinen.

Vaihtoehtoja RPGA:n käyttöön ovat: antigeenin neutralointireaktio (RNAg), vasta-aineneutralointireaktio (RNAt), passiivinen hemagglutinaation estoreaktio (RPHA). Näihin reaktioihin käytetään antigeenisiä ja vasta-aineerytrosyyttidiagnostiikkaa. Samanaikaisesti voidaan käyttää kahta toisiaan säätelevää yksisuuntaista reaktiota, esimerkiksi RPHA:ta antigeenisen diagnostiikan kanssa ja RNAg:tä vasta-aineerytrosyyttidiagnostiikan kanssa.

Vasta-aineen neutralointireaktio (RNAt) koostuu siitä, että halutun antigeenin sisältävä suspensio sekoitetaan spesifisen immuuniseerumin kanssa, joka sisältää tunnettuja vasta-aineita sopivina tilavuuksina, ja inkuboidaan 37 °C:ssa kaksi tuntia. Sen jälkeen lisätään antigeeninen punasoludiagnostiikka. Seosta ravistellaan ja jätetään huoneenlämpötilaan. Tulokset huomioidaan 3-4 tunnin kuluttua ja lopuksi - 18-24 tunnin kuluttua Jos testimateriaalissa on antigeeniä, se sitoo vasta-aineita (neutralisoi ne), eikä hemagglutinaatiota tapahdu.

Saman periaatteen mukaisesti suoritetaan antigeenin neutralointireaktio (RNAg). Vain tässä tapauksessa testimateriaalista havaitaan vasta-aineita. Tällaiseen testimateriaaliin lisätty spesifinen antigeeni sitoutuu sen sisältämiin vasta-aineisiin, eli vasta-aineet neutraloivat antigeenin, ja siksi hemagglutinaatiota ei tapahdu, kun vasta-aine erythrocyte diagnosticum lisätään.

Koagglutinaatioreaktio. Se on yksi vaihtoehdoista passiiviselle, eli soluvälitteiselle vasta-ainekantaja-ainekiihdytetylle agglutinaatioreaktiolle lasilla. Tämä reaktio perustuu ainutlaatuinen omaisuus Staphylococcus aureus, jonka soluseinämässä on proteiini A, sitoutuvat IgG:n ja IgM:n Fc-fragmentteihin. Samanaikaisesti vasta-aineiden aktiiviset keskukset pysyvät vapaina ja voivat olla vuorovaikutuksessa spesifisten antigeenideterminanttien kanssa. Tippa 2-prosenttista vastaavilla vasta-aineilla herkistettyä stafylokokkisuspensiota levitetään lasilevylle ja lisätään pisara tutkittujen bakteerien suspensiota. Kun antigeeni vastaa vasta-aineita, tapahtuu 30-60 sekunnin kuluttua vasta-aineilla ladattujen stafylokokkien selkeä agglutinaatio.

Lateksiagglutinaatioreaktio (LAH). Vasta-aineiden kantaja tässä diagnostisessa järjestelmässä ovat pieniä standardihiukkasia lateksia. Reaktio suoritetaan mikromenetelmällä lasin kaivoissa. Pääehto PAH:n onnistumiselle on järjestelmän komponenttien kvantitatiivisten suhteiden tarkka noudattaminen: 10 µl vasta-aineilla herkistettyä lateksivalmistetta lisätään 50 µl:aan testimateriaalia. PAH:n spesifisyyttä valvotaan kolmella kaupallisiin testijärjestelmiin sisältyvällä kontrollitestillä: tunnettu positiivinen reaktio, tunnettu negatiivinen reaktio ja PAH-herkittämättömien (ei-vasta-aineita sisältävien) lateksien lateksisuspension laadunvalvonta testillä. materiaalia. Maassamme käytetään monodisperssiä polystyreenilatekseja, joilla on eri hiukkashalkaisijat (0,3; 0,66; 0,75; 0,8 μm) spesifisten vasta-aineiden kantajina. PAH:ta käytetään mikro-organismien tai niiden antigeenien nopeaan havaitsemiseen testimateriaalista.

Antigeenien immunomagneettinen havaitseminen. Yksi lasin kiihdytetyn agglutinaatioreaktion vaihtoehdoista liittyy erityisillä vasta-aineilla päällystettyjen supermagneettisten polymeerihiukkasten käyttöön. Yksi tällainen hiukkanen sitoo jopa 107-108 mikro-organismisolua, minkä vuoksi herkkyys tätä menetelmää saavuttaa 5 CFU / ml. Mikro-organismien immunomagneettista havaitsemista voidaan käyttää yhdessä elvyttämisen kanssa.

Aggregaatti-hemagglutinaatioreaktio (RAGA). Sen avulla voit nopeasti havaita potilaiden verestä sekä vapaasti kiertävät antigeenit (antigenemia) että vasta-aineisiin liittyvät antigeenit - kiertävät immuunikompleksit (CIC). RAGA:ssa käytetään sopivilla vasta-aineilla herkistettyjä punasoluja. Antigeenejä sisältävän potilaan veriseerumin lisääminen herkistyneisiin punasoluihin, joihin on kiinnittynyt vasta-aineita, johtaa punasolujen ja immuunikompleksien liimautumiseen (agglutinaatioon).

Antiglobuliini Coombsin testi (R. Coombsin reaktio). Suorien ja passiivisten agglutinaatioreaktioiden avulla määritetään täydelliset (kaksiarvoiset) vasta-aineet. Epätäydellisiä (yksiarvoisia, estäviä) vasta-aineita ei havaita näillä menetelmillä, koska yhdistettynä antigeeniin ne estävät sen, mutta eivät voi aiheuttaa antigeenin aggregaatiota suuriksi konglomeraatteiksi. Epätäydelliset (salpaavat) vasta-aineet ovat sellaisia, joissa vain yksi aktiivinen keskus toimii; toinen aktiivinen keskus ei toimi tuntemattomasta syystä. Epätäydellisten vasta-aineiden tunnistamiseen käytetään erityistä Coombsin reaktiota (kuva 72). Reaktiossa ovat mukana: potilaan seerumi, josta määritetään epätäydellisiä vasta-aineita, corpuscular antigen-diagnosticum, antiglobuliiniseerumi, joka sisältää vasta-aineita ihmisen globuliinille. Reaktio etenee kahdessa vaiheessa:

Antigeenin vuorovaikutus epätäydellisten vasta-aineiden kanssa. Näkyviä ilmentymiä ei ole. Ensimmäinen vaihe suoritetaan pesemällä antigeeni potilaan seerumin jäännöksistä.

Eläimen ihmisen globuliinilla immunisoinnin tuloksena saadun antiglobuliiniseerumin vuorovaikutus antigeeniin adsorboituneiden epätäydellisten vasta-aineiden kanssa. Koska antiglobuliinivasta-aineet ovat kaksiarvoisia, ne sitovat kaksi monovalenttista vasta-ainetta erillisistä antigeeni + komplekseista. epätäydellinen vasta-aine, mikä johtaa niiden tarttumiseen yhteen ja näkyvän sakan ilmestymiseen.

Aiheen "Immunomodulaattorit. Tartuntatautien immunodiagnostiikka" sisällysluettelo:

Laajentunut agglutinaatioreaktio (RA). Aseta AT potilaan veren seerumissa pidennetty agglutinaatioreaktio (RA). Tätä varten veriseerumilaimennosten sarjaan lisätään diagnostiikkaa - tapettujen mikro-organismien tai hiukkasten suspensiota, jossa on adsorboitunut Ag. Suurin laimennus antaa agglutinaatio Ag, jota kutsutaan veren seerumin tiitteriksi.

Agglutinaatioreaktion lajikkeet (RA) toteamaan AT - veripisarakoe tularemiaa varten (diagnostiikan levittäminen veripisaralle ja näkyvien valkeiden agglutinaattien ilmaantuminen) ja Huddlesonin reaktio luomistaudin toteamiseksi (tisaralle levitettynä gentianvioletilla värjätty diagnostiikka). veriseerumista).

Likimääräinen agglutinaatioreaktio (RA)

Eristettyjen mikro-organismien tunnistamiseksi likimääräinen RA asetetaan lasilevyille. Tätä varten patogeeniviljelmä lisätään pisaraan standardidiagnostista antiseerumia (laimennoksena 1:10, 1:20). Jos tulos on positiivinen, he antavat yksityiskohtaisen reaktion kasvavilla antiseerumin laimennuksilla.

reaktio pidetään positiivisena, jos agglutinaatiota havaitaan laimennoksissa, jotka ovat lähellä diagnostisen seerumin tiitteriä.

OAS. Somaattinen O-Ag ne ovat lämpöstabiileja ja kestävät kiehumista 2 h. Vuorovaikutuksessa AT:n kanssa ne muodostavat hienojakoisia aggregaatteja.

N-Ag. H-Ag (flagellate) lämpölabiili ja tuhoutuu nopeasti 100 °C:ssa sekä etanolin vaikutuksesta. Reaktioissa H-antiseerumin kanssa muodostuu 2 tunnin inkuboinnin jälkeen irtonaisia ​​suuria hiutaleita (muodostuvat bakteerien tarttumisesta yhteen flagellan kanssa).

Vi Ar lavantautibakteerit ovat suhteellisen lämpöstabiileja (kestävät lämpötilan 60-62 ° C 2 tuntia); Vi-antiseerumin kanssa inkuboitaessa muodostuu hienojakoista agglutinaattia.

Suorat hemagglutinaatioreaktiot

Yksinkertaisin näistä reaktiot - agglutinaatio erytrosyytit tai hemagglutinaatio, jota käytetään veriryhmien määrittämiseen AB0-järjestelmässä. Määrittämistä varten agglutinaatio(tai sen puuttumista) käytetään standardeja antiseerumeja, joissa on anti-A- ja anti-B-agglutiniinia. Reaktiota kutsutaan suoraksi, koska tutkitut antigeenit ovat erytrosyyttien luonnollisia komponentteja.

Jaettu suora hemagglutinaatio mekanismeissa on viruksen hemagglutinaatio. Monet virukset pystyvät spontaanisti agglutinoimaan lintujen ja nisäkkäiden punasoluja, ja niiden lisääminen erytrosyyttien suspensioon aiheuttaa aggregaattien muodostumista niistä.