Provođenje PCR analize (PCR dijagnostika) započinje prikupljanjem materijala za pregled kod ginekologa, urologa ili dermatovenerologa. Kvaliteta i pouzdanost naknadno dobivenih rezultata osigurana je najvišom stručnošću i bogatim iskustvom liječnika medicinskog centra Euromedprestige, koji se pridržavaju svih potrebnih pravila provođenje PCR-a- analiza: potpuna sterilnost, korištenje samo jednokratnog materijala.

Sakupljeni materijal s kista stavlja se u posudu s fiziološkom otopinom. Nakon prikupljanja uzorke je potrebno što prije dostaviti u PCR laboratorij.

PCR analiza se provodi u laboratoriju u tri faze:

1. ekstrakcija DNK
2. Amplifikacija fragmenata DNA
3. Detekcija produkata amplifikacije DNA

Ekstrakcija DNK početna je faza PCR dijagnostike, čija je bit sljedeća: liječnik uzima materijal za istraživanje od pacijenta i podvrgava ga posebnoj obradi. Tijekom obrade, dvostruka spirala DNK se dijeli na pojedinačne niti. U materijal pacijenta dodaje se posebna tekućina koja otapa organske tvari koje ometaju "čistoću" reakcije. Time se uklanjaju lipidi, aminokiseline, peptidi, ugljikohidrati, proteini i polisaharidi. Kao rezultat toga nastaje DNA ili RNA.

Princip PCR metode je “konstrukcija” novih DNA ili RNA infekcija. To se ne može učiniti bez uklanjanja staničnog materijala.

Količina vremena utrošena na ekstrakciju DNA ovisi o uzročniku infekcije i vrsti materijala koji se koristi za PCR istraživanje. Na primjer, potrebno je 1,5-2 sata da se krv pripremi za sljedeću fazu.

0 Niz ( => Analize) Niz ( => 2) Niz ( =>.html) 2

amplifikacija DNA

Za provođenje sljedeće faze DNK dijagnostike - DNK amplifikacije - liječnici koriste takozvane DNK matrice - DNK molekule infekcija, na koje će se naknadno dogoditi "kloniranje" DNK. Već je spomenuto da nije potrebna prisutnost kompletne DNA infekcije, za provođenje ove faze dovoljan je mali komadić molekule DNA koji je karakterističan samo za određeni mikrob (infekcija).

Osnova amplifikacije DNA i, sukladno tome, temelj cjelokupnog principa PCR reakcije je prirodni proces kompletiranja DNA za sva živa bića - replikacija DNA, koja se provodi udvostručenjem jednog lanca DNA.

Počevši od jednog fragmenta DNK, laboratorijski liječnik ga kopira i povećava broj kopija u načinu lančane reakcije: nakon prvog ciklusa već imate 2 fragmenta, nakon drugog ciklusa - 4, nakon trećeg - 8, nakon četvrti - 16, zatim 32, 64, 128, 256... Sa svakim ciklusom broj kopija se udvostručuje, a nakon dvadeset ciklusa brojka već ide u milijune, a nakon trideset - u milijarde. Ciklus traje nekoliko minuta i svodi se na određenu promjenu temperature u vrlo malom kemijskom reaktoru. Ovdje su u otopini sve potrebne komponente sinteze prisutne u dovoljnim količinama, prije svega nukleotidi A, G, T i C, a također se provode delikatne pripremne kemijske operacije tako da se odmah uzima točna kopija iz svakog gotov segment DNK, zatim iz ove kopije - opet kopija, ovo je razgranata lančana reakcija.

Pričvršćivanjem početnica na lanac DNA - umjetno sintetiziranih "komadića" DNA (parova nukleotida) sličnih DNA mikroba (infekcija) - formiraju se dvije kratke spirale koje se sastoje od dva lanca DNA dijelova, koji su potrebni za sintezu budućih DNK.

Sinteza novog lanca događa se kompletiranjem svakog od dva lanca DNA. Proces amplifikacije odvija se uz pomoć specifične regije - DNA polimeraze, koja daje naziv laboratorijskoj metodi. Polimeraza djeluje kao katalizator za reakciju i prati sekvencijalno pričvršćivanje nukleotidnih baza na rastući novi lanac DNA.

Dakle, amplifikacija DNA je višestruko povećanje broja kopija DNA koje su specifične, tj. svojstvene samo određenom organizmu. Nema potrebe dovršavati cijeli lanac DNK da bi se vidio uzročnik infekcije. Potrebno je samo područje koje je karakteristično za datu bakteriju kao jedinku.

5360 rub. Cijena sveobuhvatnog programa s gastroenterologom

POPUST 25% NA DOGOVORU KOD KARDIOLOGA

- 25%primarni
Posjet liječniku
terapeut vikendom

5160 RUB umjesto 5.420 rub. Probir muškaraca na urološke infekcije

ALERGOLOGIJA 5120 RUB umjesto 5.590 rub.

Svi visoko ponavljajući koraci pojačanja odvijaju se na različitim temperaturama. Za provođenje PCR analize koristi se posebno programabilna oprema - PCR - termostat ili pojačivač, koji automatski mijenja temperature. Amplifikacija se provodi prema zadanom programu koji odgovara vrsti infekcije koja se otkriva. Ovisno o programu i vrsti infekcije koja se otkriva, automatizirani PCR proces traje od 2 do 3 sata.

Važnu ulogu u PCR dijagnostici igraju kvalifikacije laboratorijskog liječnika koji provodi analizu, o njemu ovise pravilne postavke PCR opreme i interpretacija rezultata. Liječnici Medicinskog centra Euromedprestige imaju bogato iskustvo u provođenju DNK dijagnostike, što osigurava pouzdanost rezultata istraživanja i jamči pozitivan uspjeh u liječenju. zarazne bolesti. Testirati se PCR metodom i provesti kompletna dijagnostika i liječenje zaraznih bolesti u našem medicinski centar"Euromedprestige".

Tijekom detekcije produkata amplifikacije odvaja se nastala smjesa produkata amplifikacije. Smjesi se dodaju posebne otopine koje fragmentima DNA daju mogućnost fluoresciranja – reflektiranog u narančasto-crvenim svjetlećim prugama. Dobiveni sjaj ukazuje na prisutnost DNA virusa, mikroba ili bakterija u materijalu uzetom od pacijenta za PCR analizu.

GOU VPO "Krasnoyarsk State Medical Academy"

nazvan po Yasenetsky Savezna agencija za zdravstveni i socijalni razvoj »

Zavod za medicinsku genetiku i kliničku neurofiziologiju IPO

OSNOVNI PRINCIPI METODE

LANČANA REAKCIJA POLIMERAZE

Alati za studente 3-4 godine

u specijalnosti opće medicine (060101) i

Krasnojarsk - 2007

Schneider, N. A., Butyanov, R. A. Osnovna načela metode lančane reakcije polimerazom. Metodički priručnik za izvannastavni rad studenata 3-4 godine studija opće medicine (060101) i pedijatrije (060103). – Krasnojarsk: Izdavačka kuća Državne obrazovne ustanove visokog stručnog obrazovanja KrasSMA, 2007. – 42 str.

Metodološki priručnik u potpunosti je u skladu sa zahtjevima Državnog standarda (2000) i odražava glavne aspekte moderna metoda dijagnostika nasljedne bolesti ljudski – metoda lančane reakcije polimerazom, edukativni materijal prilagođen obrazovne tehnologije uzimajući u obzir specifičnosti obuke u 3-4 godine medicinskih i pedijatrijskih fakulteta.

Recenzenti: Voditelj Odsjeka za medicinsku genetiku Državne obrazovne ustanove visokog stručnog obrazovanja

"Novosibirsko državno medicinsko sveučilište Savezne agencije za zdravstvo i društveni razvoj“, doktor medicinskih znanosti, prof.;

replikacija DNK

Predmet proučavanja ove metode je deoksiribonukleinska kiselina (DNK). DNK je univerzalni nositelj genetske informacije u svim organizmima koji postoje na Zemlji (s iznimkom mikroorganizama koji sadrže RNA). DNK je dvostruki lanac upleten u spiralu. Svaki lanac se sastoji od nukleotida povezanih u nizu. DNA lanci imaju suprotne smjerove: 5" kraj jednog lanca odgovara 3" kraju drugog lanca. Jedinstvena nekretnina DNK je njegova sposobnost da se udvostruči. Ovaj proces se zove replikacija. Replikacija molekule DNA događa se tijekom sintetskog razdoblja interfaze. Svaki od dva lanca "majčine" molekule služi kao predložak za "kćer". Nakon replikacije, novosintetizirana molekula DNA sadrži jedan "majčin" lanac, a drugi je novosintetizirani "kćeri" lanac (polukonzervativna metoda). Za matrična sinteza Da bi se formirala nova molekula DNK, stara se molekula mora razmotati i rastegnuti. Replikacija počinje na nekoliko mjesta u molekuli DNA. Odsjek molekule DNA od početne točke jedne replikacije do početne točke druge naziva se replikon.

Početak replikacije je aktiviran početnice(primeri) koji se sastoje od 100-200 parova nukleotida. Enzim DNA helikaza odmotava i dijeli matičnu DNA spiralu u dvije niti, na koje se, prema principu komplementarnosti, uz sudjelovanje enzima DNA polimeraze, sklapaju "kćeri" DNA niti. Da bi enzim započeo s radom, potrebna je prisutnost početnog bloka - malog početnog dvolančanog fragmenta. Početni blok nastaje interakcijom početnice s komplementarnom regijom odgovarajućeg lanca roditeljske DNA. U svakom replikonu, DNA polimeraza se može kretati duž "majčinskog" lanca samo u jednom smjeru (5`=>3`).

Na vodećoj niti, kako se replikon odmotava, lanac "kćer" postupno kontinuirano raste. Na lancu koji zaostaje, lanac kćer također se sintetizira u smjeru (5`=>3`), ali u zasebnim fragmentima kako se replikon odmotava.

Stoga se dodavanje komplementarnih nukleotida "kćeri" niti događa u suprotnim smjerovima (antiparalelno). Replikacija u svim replikonima događa se istovremeno. Fragmenti i dijelovi lanaca "kćeri" sintetizirani u različitim replikonima spojeni su u jedan lanac pomoću enzima ligaze. Replikaciju karakterizira polukonzervativnost, antiparalelnost i diskontinuitet. Cijeli genom stanice replicira se jednom tijekom vremenskog razdoblja koje odgovara jednom mitotskom ciklusu. Kao rezultat procesa replikacije, dvije molekule DNA nastaju iz jedne molekule DNA, u kojoj je jedan lanac iz matične molekule DNA, a drugi, kći, novosintetiziran (slika 1).

Riža. 1. Shema replikacije molekule DNA.

Dakle, ciklus replikacije DNK uključuje tri glavne faze:

1. odmotavanje spirale DNA i divergencija lanaca (denaturacija);

2. pričvršćivanje temeljnih premaza;

3. dovršavanje lanca dječje niti.

Princip PCR metode

Osnovu PCR-a čini replikacija DNA. U PCR-u, gore navedeni procesi se provode u epruveti u cikličkom načinu rada. Prijelaz iz jednog reakcijskog stupnja u drugi postiže se promjenom temperature inkubacijske smjese. Kada se otopina zagrije na 93-95°C, dolazi do denaturacije DNA. Za prelazak na sljedeću fazu - dodavanje ili "žarenje" primera - inkubacijska smjesa se ohladi na 50-65°C. Zatim se smjesa zagrijava na 70-72°C - optimalno za taq-DNA polimerazu - u ovoj fazi dolazi do izgradnje novog DNA lanca. Zatim se ciklus ponovno ponavlja. Drugim riječima metoda PCR je višestruko povećanje broja kopija (pojačanje) specifični dio DNK kataliziran enzimom DNK polimeraza.

Rast lanaca kćeri DNK mora se odvijati istovremeno na oba lanca majčine DNK, tako da replikacija drugog lanca također zahtijeva vlastiti početni. Stoga se u reakcijsku smjesu dodaju dva primera: jedan za lanac "+", drugi za lanac "-". Nakon što su se pričvrstili za suprotne niti molekule DNA, početnice se ograničavaju na njezin dio koji će se naknadno višestruko duplicirati ili pojačati. Duljina takvog fragmenta, nazvanog amplikon, obično je nekoliko stotina nukleotida.

PCR faze

Svaki ciklus pojačanja uključuje 3 faze, koje se odvijaju pri različitim temperaturnim uvjetima (slika 2).

· Faza 1: denaturacija DNK . Javlja se na 93-95° 30-40 sekundi.

· Faza 2: temeljno žarenje . Pričvršćivanje početnica događa se komplementarno odgovarajućim sekvencama na suprotnim lancima DNA na granicama specifične regije. Svaki par primera ima svoju temperaturu žarenja, čije su vrijednosti u rasponu od 50-65°C. Vrijeme žarenja 20-60 sek.

· Faza 3: završetak DNA lanaca. Komplementarni završetak DNA lanaca događa se od 5" kraja do 3" kraja lanca u suprotnim smjerovima, počevši od mjesta vezanja početnica. Materijal za sintezu novih lanaca DNA su deoksiribonukleozid trifosfati dodani otopini. Proces sinteze katalizira enzim taq polimeraza i odvija se na temperaturi od 70-72°C. Vrijeme sinteze je 20-40 sekundi.

Novi lanci DNA nastali u prvom ciklusu umnožavanja služe kao predlošci za drugi ciklus umnožavanja, u kojem nastaje specifični fragment umnožavanja DNA (slika 3). U sljedećim ciklusima amplifikacije, amplikoni služe kao predložak za sintezu novih lanaca.

Dakle, nakupljanje amplikona u otopini događa se prema formuli 2", gdje je n broj ciklusa amplifikacije. Stoga, čak i ako je početna otopina u početku sadržavala samo jednu dvolančanu molekulu DNA, tada u 30-40 ciklusa oko U otopini se nakuplja 108 molekula amplikona, što je dovoljno za pouzdanu vizualnu detekciju ovog fragmenta elektroforezom u agaroznom gelu.

Proces pojačanja provodi se u posebnom programabilnom termostatu ( termalni cikler), koji prema zadanom programu automatski mijenja temperature prema broju ciklusa pojačanja.

Za provođenje amplifikacije potrebne su sljedeće komponente:

· DNK matrica(DNA ili njezin dio koji sadrži željeni specifični fragment);

· Primeri(sintetski oligonukleotidi (20-30 parova nukleotida), komplementarni DNA sekvencama na granicama specifičnog fragmenta koji se određuje). Odabir specifičnog fragmenta i odabir početnica ima ključnu ulogu u specifičnosti amplifikacije, što utječe na kvalitetu analize.

· Mješavina deoksinukleotid trifosfata (dNTP)(mješavina četiri dNTP-a, koji su materijal za sintezu novih komplementarnih lanaca DNA u ekvivalentnim koncentracijama od 200-500 µM)

· EnzimTaq-polimeraza(termostabilna DNA polimeraza koja katalizira produljenje početnih lanaca sekvencijalnim dodavanjem nukleotidnih baza rastućem lancu sintetizirane DNA, 2-3 mM).

· Puferska otopina(reakcijski medij koji sadrži ione Mg2+ potrebne za održavanje aktivnosti enzima, pH 6,8-7,8).

Kako bi se identificirale specifične regije genoma RNA virusa, kopija DNA prvo se dobije iz RNA predloška pomoću reakcije obrnute transkripcije (RT) koju katalizira enzim revertaza (reverzna transkriptaza).

Riža. 2. Amplifikacija (1. ciklus).

Riža. 3. Amplifikacija (2. ciklus).

Glavne primjene PCR-a

· klinička medicina:

o dijagnoza infekcija,

o prepoznavanje mutacija, uključujući dijagnozu nasljednih bolesti,

o genotipizacija, uključujući HLA genotipizaciju,

o stanične tehnologije

· ekologija (kao način praćenja stanja i kvalitete okolišnih objekata i prehrambenih proizvoda)

· određivanje transgenih organizama (GMO)

Osobna identifikacija, utvrđivanje očinstva, forenzika

· opća i specifična biologija,

Osnovni principi

organizacija dijagnostičkih laboratorija

Rad u PCR laboratoriju provodi se u skladu s „Pravilima dizajna, sigurnosnih mjera opreza, industrijske sanitarije, protuepidemijskog režima i osobne higijene pri radu u laboratorijima (odjelima, odjelima) sanitarnih i epidemioloških ustanova zdravstvenog sustava.

Kontaminacija DNK uzoraka

Provođenje PCR dijagnostike povezano je s problemom zbog visoke osjetljivosti metode – mogućnosti kontaminacija. Ulazak u tragovima pozitivne DNA u reakcijsku epruvetu (specifični produkti amplifikacije DNA – amplikoni; DNA standard koji se koristi kao pozitivna kontrola; pozitivna DNA iz kliničkog uzorka) dovodi do amplifikacije specifičnog fragmenta DNA tijekom PCR-a i kao rezultat , do pojave lažno pozitivnih rezultata.

U procesu rada možete se susresti dvije vrste kontaminacije:

1. unakrsne kontaminacije od uzorka do uzorka (tijekom obrade kliničkih uzoraka ili prilikom otapanja reakcijske smjese), što dovodi do sporadičnih lažno pozitivnih rezultata;

2. kontaminacija produktima amplifikacije(amplikoni) imajući najveća vrijednost, jer se tijekom PCR procesa amplikoni nakupljaju u ogromnim količinama i idealni su produkti za reamplifikaciju.

Kontaminacija staklenog posuđa, automatskih pipeta i laboratorijske opreme, površine laboratorijskih stolova ili čak površine kože laboratorijskih radnika količinama amplikona u tragovima dovodi do sustavnih lažno pozitivnih rezultata. Utvrđivanje izvora kontaminacije može biti vrlo teško i zahtijeva značajno ulaganje vremena i novca. Dosadašnja iskustva u laboratorijima koji koriste PCR metodu za dijagnostiku omogućuju nam da formuliramo osnovne zahtjeve za organizaciju takvih laboratorija i provođenje samih analiza. Usklađenost s ovim zahtjevima eliminira mogućnost kontaminacije i lažno pozitivnih rezultata.

Faze PCR analize

Zemljopisno su odvojeni postavljanjem u zasebne prostorije (sl. 4, 5):

· Pre-PCR soba, gdje se vrši obrada kliničkih uzoraka, izolacija DNK, priprema reakcijske smjese za PCR i izvođenje PCR-a (ukoliko postoje uvjeti, zadnje dvije faze također se preporuča provesti u dodatnoj zasebnoj prostoriji). U ovim prostorima zabranjeno je obavljanje svih drugih vrsta radova s ​​ispitivanim tvarima čija se PCR dijagnostika provodi u ovom laboratoriju.

· Post-PCR soba, gdje se provodi detekcija proizvoda amplifikacije. Druge metode detekcije mogu se koristiti u ovoj sobi. Preporučljivo je locirati prostoriju za detekciju proizvoda umnožavanja što je dalje moguće od prostorija prije PCR-a.

Radne prostorije su opremljene ultraljubičastim svjetiljkama s maksimalnim zračenjem u području od 260 nm (tip DB-60) pri omjeru od 2,5 W po 1 m3. Lampe su postavljene tako da su površine radnih stolova, opreme i materijala s kojima operater ima kontakt tijekom PCR analize izložene izravnom zračenju. Zračenje se provodi 1 sat prije početka rada i 1 sat nakon završetka rada.

Laboratorijski liječnici rade u posebnoj laboratorijskoj odjeći koja se mijenja pri prelasku iz jedne prostorije u drugu i u jednokratnim rukavicama. Odjeća iz različitih prostorija obrađuje se odvojeno. Različiti zaposlenici rade u različitim fazama PCR analize.

Za rad se koriste zasebni setovi dozatora, plastičnog i staklenog posuđa, laboratorijske opreme, ogrtača i rukavica, koji su namijenjeni za različite faze analize i nisu prenosivi iz jedne prostorije u drugu. Oprema, materijal i pribor u svakoj prostoriji su odgovarajuće označeni.

Sve faze rada provode se samo s potrošnim materijalom za jednokratnu upotrebu: vrhovima za automatske pipete, epruvetama, rukavicama itd. Obavezno mijenjajte vrhove kada prelazite s uzorka na uzorak. Potrebno je koristiti vrhove s filterom - aerosolnom barijerom kako bi se spriječilo ulazak mikrokapljica otopine u pipetu. Iskorištene cijevi i nastavci odlažu se u posebne spremnike ili spremnike koji sadrže otopina za dezinfekciju. Klinički uzorci pohranjuju se odvojeno od reagensa.

Za obradu i čišćenje radnog mjesta svaka prostorija je opremljena štapićima od pamučne gaze (maramicama), pincetom, dezinfekcijskim i inaktivirajućim otopinama.

Laboratorij za PCR dijagnostiku isključuje poslove vezane uz proizvodnju (kloniranje) i izolaciju rekombinantnih plazmida koji sadrže DNA sekvence ili fragmente gena patogena koji se dijagnosticiraju u ovom laboratoriju.

Prikupljanje kliničkog materijala

Materijal koji se proučava za PCR može biti strugotina epitelnih stanica, krvi, plazme, seruma, pleuralne i cerebrospinalne tekućine, urina, sputuma, sluzi i drugih bioloških izlučevina, biopsija.

Materijal se prikuplja u sobi za liječenje odgovarajućeg profila. Nakon uzimanja uzorke je potrebno što prije dostaviti u PCR dijagnostički laboratorij.

Uzorci se moraju uzimati sterilnim, po mogućnosti jednokratnim, instrumentima samo u jednokratnim sterilnim plastičnim epruvetama ili staklenim epruvetama, prethodno tretiranim jedan sat smjesom kroma, temeljito ispranim destiliranom vodom i kalciniranim u sušionici na temperaturi od 150°C. za 1 sat.

Zona detekcije (drugi kat ili druga zgrada).

Riža. 4. PCR laboratorijski uređaj s detekcijom elektroforezom.

Zona detekcije (drugi kat ili druga zgrada)

Riža. 5. PCR laboratorijski uređaj s fluorescentnom detekcijom (kvantitativna analiza).

Riža. 6. Soba za ekstrakciju DNK. Prikazana je stolna kutija s baktericidnom lampom.

Riža. 7. Soba za pojačanje.

Riža. 8. Soba za detekciju.

Riža. 9. Uzorci krvi za DNA dijagnostiku nasljednih bolesti.

Skladištenje i transport uzoraka

Za dijagnosticiranje nasljednih bolesti uzorci krvi čuvaju se na posebnim papirnatim obrascima ili u epindorfima (plastičnim epruvetama) u smrznutom stanju dulje vrijeme (slika 9).

Za dijagnosticiranje zaraznih bolesti, uzorci se drže na sobnoj temperaturi ne više od 2 sata. Ako je potrebno dulje skladištenje, uzorci se mogu staviti u hladnjak na temperaturu od 2-8°C na razdoblje ne dulje od jednog dana. Dulje skladištenje (do 2 tjedna) dopušteno je zamrznuti u zamrzivaču na temperaturi od minus 20°C. Ponovljeno zamrzavanje i odmrzavanje uzoraka nije dopušteno.

Ako su PCR dijagnostički laboratorij i prostorija za uzimanje uzoraka geografski odvojeni, tada se prijevoz uzoraka treba obavljati u termosicama ili termospremnicima u skladu s pravilima za čuvanje uzoraka i pravilima za prijevoz zaraznih materijala.

Ekstrakcija DNK iz uzoraka

Rasprostranjena je metoda sorpcije na čvrstoj fazi, koja se sastoji od dodavanja sredstva za lizu koje sadrži otopinu gvanidina, sorpcije DNA na sorbentu, ponovljenog ispiranja i resorpcije DNA puferskom otopinom. Pri obradi seruma, plazme ili cijele krvi obično se koristi metoda ekstrakcije fenolom. Metoda uključuje deproteinizaciju s fenolom/kloroformom nakon čega slijedi taloženje DNA (ili RNA) s etanolom ili izopropanolom. Obrada se provodi u Eppendor P mikrocentrifugalnim epruvetama volumena 1,5 ml. Vrijeme obrade je 1,5-2 sata (slika 10).

Riža. 10. ekstrakcija DNK.

Provođenje PCR-a

Određena količina uzorka iz obrađenog kliničkog uzorka prenosi se u specijalnu mikrocentrifugiranu epruvetu tipa Eppendorf volumena 0,2 ili 0,5 ml te se dodaje smjesa za amplificiranje koja se sastoji od vode, PCR pufera, otopine dNTP, otopine primera i otopine. ista epruveta. Taq polimeraza (dodana u smjesu zadnja). Tipično, volumen reakcijske smjese je 25 µl. Zatim se u svaku epruvetu doda jedna kap mineralnog ulja kako bi se spriječilo isparavanje reakcijske smjese tijekom procesa umnožavanja. cijevi se prenose u programabilni termostat (pojačalo), gdje se pojačanje provodi automatski prema zadanom programu (slika 11).

Riža. jedanaest. pojačalo" Termocikler ».

Vrijeme reakcije, ovisno o navedenom programu, je 2-3 sata. Paralelno s eksperimentalnim uzorcima stavljaju se kontrolni uzorci: pozitivna kontrola uključuje sve komponente reakcije, ali se umjesto materijala kliničkog uzorka dodaje kontrolni DNA preparat proučavanog gena. Negativna kontrola uključuje sve komponente reakcije, ali se umjesto kliničkog materijala ili DNK preparata dodaje odgovarajuća količina deionizirane vode ili ekstrakta koji ne sadrži DNK koji se ispituje. Negativna kontrola je neophodna kako bi se provjerilo da reakcijske komponente ne sadrže DNK zbog kontaminacije i da bi se isključili lažno pozitivni rezultati.

Prijava rezultata

Umnoženi specifični fragment DNA detektira se elektroforezom u agaroznom gelu u prisutnosti etidijevog bromida. Etidijev bromid tvori stabilan intersticijski spoj s fragmentima DNA, koji se pojavljuje u obliku svjetlećih traka kada se gel ozrači UV zračenjem valne duljine 290-330 nm. Ovisno o veličini amplikona nastalih kao rezultat PCR-a, koristi se gel s udjelom agaroze od 1,5% do 2,5%. Za pripremu agaroznog gela smjesa agaroze, pufera i vode se otopi u mikrovalnoj pećnici ili u vodenoj kupelji te se doda otopina etidijevog bromida. Smjesa ohlađena na 50-60°C izlije se u kalup u sloju debljine 4-6 mm i posebnim češljevima se u gelu naprave džepovi za nanošenje uzorka. Češljevi se postavljaju na način da između dna jažica i baze gela ostane sloj agaroze od 0,5-1 mm. Nakon što se gel stvrdne, pojačivač se nanosi na džepove u količini od 5-15 μl. Preporuča se provoditi elektroforezu mješavine markera duljine fragmenata DNA paralelno s kontrolnim i eksperimentalnim uzorcima. Tipično, takva mješavina sadrži deset fragmenata DNA duljine 100, 200, 300 itd. parova baza.

Korištenjem takvog testa moguće je provjeriti duljinu amplikona u kontrolnim i pokusnim uzorcima. Gel s nanesenim uzorkom se prenosi u komoru za elektroforezu ispunjenu puferom, komora se spaja na izvor napajanja i provodi se elektroforetska separacija produkata amplifikacije 30-45 minuta pri jakosti električnog polja od 10-15 V/ cm. U tom slučaju prednji dio boje uključene u reakcijsku smjesu mora putovati najmanje 3 cm.

Nakon završetka elektroforeze, gel se prenosi u stakleni transiluminator i promatra pod ultraljubičastim svjetlom. Za dokumentaciju gel se fotografira na filmu Micrat 300 ili snima pomoću video sustava spojenog na računalo.

Prije svega se ocjenjuju kontrolni uzorci. Narančasta svjetleća traka trebala bi biti prisutna u elektroforetskoj stazi koja odgovara pozitivnoj kontroli. Njegova elektroforetska pokretljivost mora odgovarati duljini amplikona navedenoj u uputama.

U elektroforetskoj stazi koja odgovara negativnoj kontroli takva traka ne bi trebala biti prisutna. Prisutnost takve vrpce u negativnoj kontroli ukazuje na kontaminaciju - kontaminaciju reagensa korištenog s testnom DNK ili amplikonom. Ispitni uzorci ocjenjuju se prisutnošću trake u odgovarajućoj stazi, koja se nalazi na istoj razini kao i traka u uzorku pozitivne kontrole. Intenzitet trake odgovara količini DNA koja se testira u uzorku, što omogućuje polukvantitativnu procjenu PCR-a. Obično se pozitivni rezultati ocjenjuju na ljestvici od četiri točke. Ako je sjaj trake u ispitnom uzorku vrlo slab, tada takav uzorak treba preurediti (slika 12).

Riža. 12. Elektroforeza u agaroznom gelu.

Primjene PCR zadijagnostika točkastih mutacija i polimorfizama gena

Jedno od vodećih područja primjene PCR-a u praktičnom zdravstvu je dijagnostika točkastih mutacija i polimorfizama gena. . Postoje izravne i neizravne metode DNA dijagnostike. U situacijama kada je poznat gen čije oštećenje dovodi do razvoja nasljedne bolesti, to se oštećenje može otkriti molekularno-genetičkim metodama. Takve se metode nazivaju izravnim. Izravnim metodama otkrivaju se nepravilnosti u primarnom nukleotidnom slijedu DNA (mutacije i njihove vrste). Izravne metode karakteriziraju točnost koja doseže gotovo 100%.

Međutim, u praksi se ove metode mogu koristiti pod određenim uvjetima:

· s poznatom citogenetskom lokalizacijom gena odgovornog za nastanak nasljedne bolesti;

· gen bolesti mora biti kloniran i njegova nukleotidna sekvenca poznata.

Svrha izravne DNA dijagnostike je identificirati mutirane alele.

Dakle, u situacijama kada se zna kakvo oštećenje DNK dovodi do nasljedne bolesti, izravno se ispituje fragment DNK koji sadrži oštećenje, odnosno koristi se metoda izravne DNK dijagnostike.

Međutim, do danas geni mnogih bolesti nisu mapirani, njihova egzon-intron organizacija je nepoznata, a mnoge nasljedne bolesti karakterizirani su izraženom genetskom heterogenošću, što ne dopušta potpunu upotrebu izravnih DNA dijagnostičkih metoda. Stoga se u slučajevima kada je lokalizacija oštećenja nepoznata koristi drugi pristup, vezan uz proučavanje blizine gena odgovornog za gensku bolest, u kombinaciji s obiteljskom analizom, odnosno indirektnim metodama molekularno-genetske dijagnostike koriste se nasljedne bolesti.

Može se koristiti za otkrivanje točkastih mutacija i malih delecija razne načine, no svi se temelje na korištenju PCR metode. Ova reakcija vam omogućuje višestruko umnožavanje sekvence nukleotida DNA i zatim traženje mutacija. Metode traženja fragmenata DNA koji nose mutacije temelje se na komparativna analiza mutantnih i normalnih sekvenci nukleotida DNA.

Analiza PCR proizvoda

u procesu izravne DNA dijagnostike

Uključuje proučavanje specifičnih značajki amplificirane genske regije. Dakle, u bolestima uzrokovanim ekspanzijom trinukleotidnih ponavljanja, produkti amplifikacije razlikuju se po svojoj duljini (što odražava različit broj tripleta u proučavanoj genskoj regiji) i, kao posljedica toga, po brzini kretanja u gelu. Zahvaljujući tome postiže se jasno elektroforetsko razdvajanje normalnih i mutantnih alela i točna determinacija patološki izduženog fragmenta, odnosno DNK dijagnostika bolesti (slika 13).

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width="417" height="110 src=">

Riža. 14. Dijagnoza brisanja GEG u genu DYT 1 u bolesnika s distonijom neovisnom o dopi (elektroforeza u poliakrilamidnom gelu). Staze 2,3,6 – bolesni; staze 1,4,5 – kontrola. Tanka strelica označava normalni alel, debela strelica označava mutirani kraći alel (delecija tri nukleotida).

Ako je cijela regija DNA koja se proučava dio proširene delecije, tada PCR amplifikacija DNA iz ovog izbrisanog alela neće biti provedena zbog nedostatka mjesta za hibridizaciju početnica. U tom slučaju, homozigotna delecija će se dijagnosticirati na temelju potpunog odsustva produkta PCR reakcije (sinteza DNA je nemoguća iz obje kopije gena). S heterozigotnom delecijom moguće je detektirati PCR produkt sintetiziran iz normalnog (zadržanog) alela; međutim, za pouzdano dijagnosticiranje takve mutacije potrebno je koristiti složenije metode snimanja DNA koje omogućuju procjenu doze konačnog PCR-a. proizvod.

Za utvrđivanje točkastih mutacija (najčešće nukleotidnih supstitucija) na određenim mjestima koristi se PCR metoda u kombinaciji s drugim metodama molekularne genetičke analize. Ako su mjesto i priroda navodne točkaste mutacije točno poznati, tada restrikcijske endonukleaze (restrikcijskih enzima) su posebni stanični enzimi izolirani iz različitih sojeva bakterija.

Ovi enzimi prepoznaju specifične nukleotidne sekvence u rasponu duljine od četiri do deset nukleotida. Nakon toga se provodi restrikcija (lat. (rezanje)) ovih sekvenci kao dijela dvolančane molekule DNA.Svaki restrikcijski enzim prepoznaje i reže na fiksnom mjestu strogo definiran, specifičan slijed nukleotida - restrikcijsko mjesto (mjesto prepoznavanja).

U slučajevima kada točkasta mutacija mijenja prirodno mjesto prepoznavanja za određeni restrikcijski enzim, ovaj enzim neće moći odcijepiti mutirani PCR-amplificirani fragment. U nekim slučajevima, mutacija dovodi do pojave novog mjesta prepoznavanja za određeni restrikcijski enzim kojeg inače nema.

U obje situacije, mutirani i normalni PCR produkti tretirani odabranim restrikcijskim enzimom proizvest će restrikcijske fragmente različitih duljina, koji se mogu lako detektirati elektroforezom (slika 15).

Dakle, ako je potrebno brzo otkriti bilo koju specifičnu točkastu mutaciju, zadatak se svodi na traženje odgovarajućeg restrikcijskog enzima, čije je mjesto prepoznavanja lokalizirano na mjestu poremećene sekvence nukleotida. Obrada PCR produkata takvim restrikcijskim enzimom omogućit će lako razlikovanje normalnih i mutantnih alela. Restrikcijska analiza uvelike pojednostavljuje detekciju poznatih točkastih mutacija i sada se naširoko koristi za izravnu DNK dijagnostiku nasljednih bolesti.

Završna faza molekularno genetička analiza mutacija je odrediti nukleotidnu sekvencu DNA fragmenta koji se proučava (sekvenciranje), koji se uspoređuje s normom i formulira se konačna genetska dijagnoza. Zahvaljujući uspjesima molekularne genetike, danas su razvijene DNK dijagnostičke metode za više od 400 nasljednih bolesti.

Riža. 15. Detekcija točkaste mutacije korištenjem restrikcijske analize: A – pojačana genska regija koja sadrži restrikcijsko mjestoAGCTza restrikcijsku endonukleazuAlu ja. MutacijaG→ Amijenja ovu nukleotidnu sekvencu, što rezultira restrikcijskim enzimomAluIblokiran; B – elektroferogram restrikcijskih produkata: trag 1 – homozigotnost za normalni alel; trag 2 – homozigotnost za mutaciju; trag 3 – heterozigotno stanje (normalni alel + mutacija).

Dijagnostika nasljednih bolesti, temeljena na izravnom ispitivanju mutantnih alela kod pacijenata, članova njihovih obitelji ili suspektnih heterozigotnih nositelja patoloških mutacija, prikladna je za presimptomatsku i prenatalnu dijagnostiku, koja se može primijeniti u najranijim fazama fetalnog razvoja, prije pojava bilo kakvih kliničkih ili biokemijskih simptoma bolesti.

Bez obzira na metodu otkrivanja mutacije, točne molekularne karakteristike svake mutacije mogu se dobiti samo izravnim sekvenciranjem. Kako bi se automatizirao ovaj proces, posljednjih godina naširoko se koriste posebni uređaji - sekvenceri, koji omogućuju značajno ubrzanje procesa čitanja DNK informacija.

Put ka široj primjeni molekularno-bioloških istraživanja u kliničkim dijagnostičkim laboratorijima otvara se ubrzavanjem analitičkog procesa izvođenjem svih postupaka u jednom kontinuumu, bez prijenosa uzorka, stvaranjem uvjeta za sprječavanje kontaminacije tijekom paralelnog ispitivanja većeg broja analita te objektivnim bilježenjem rezultate u svakom ciklusu.

Glavne modifikacije PCR metode

Koristi se za brzo skeniranje i traženje poznatih genskih mutacija.

Multiplex (multi-primer) PCR

Ova se metoda temelji na istovremenom pojačavanju nekoliko egzona gena koji se proučava u jednoj reakciji. To omogućuje troškovno učinkovit brzi probir najčešćih mutacija. Na primjer, kako bi se brzo dijagnosticirala nosivost delecija u genu za distrofin kod pacijenata s progresivnom Duchenne/Beckerovom mišićnom distrofijom, provodi se simultana amplifikacija skupa najčešće mutiranih egzona ovog gena. Budući da se ove bolesti nasljeđuju recesivno vezano za X i povezane su s oštećenjem jedinog X kromosoma kod dječaka, u slučaju produljene delecije, elektroforeza produkata reakcije otkrit će odsutnost jednog ili više fragmenata DNA (egzona). ), što može poslužiti kao molekularna potvrda dijagnoze. Osim toga, odabirom specifičnih genskih odjeljaka za PCR amplificiranje, moguća je prilično točna procjena ukupne duljine delecije i prijelomnih točaka gena (do egzona).

Kombinirana uporaba nekoliko multipleksnih reakcija omogućuje dijagnosticiranje do 98% svih delecija koje se javljaju u bolesnika s progresivnom Duchenne/Beckerovom mišićnom distrofijom. To predstavlja približno 60% od ukupnog broja poznatih mutacija u genu za distrofin i ukazuje na vrlo visoku učinkovitost ove metode probira za DNA dijagnostiku distrofinopatija (slika 16).

Riža. 16. Izravna DNA dijagnostika Duchenneove mišićne distrofije primjenom multipleksne PCR (elektroforeza u agaroznom gelu). U svakoj od ispitivanih osoba istodobno su amplificirana četiri egzona gena za distrofin (egzoni 17, 19, 44 i 45; strelicama su označeni odgovarajući produkti amplifikacije). Traka 1 – kontrola, staze 2-5 – pacijenti s Duchenneovom mišićnom distrofijom s različitim delecijama gena za distrofin (linije 2 i 5 – delecija egzona 45, staza 3 – delecija egzona 44, staza 4 – delecija egzona 17 i 19 ).

Alel-specifična amplifikacija

Metoda se temelji na korištenju dva neovisna para početnica za određenu gensku regiju: jedna početnica u oba para je zajednička, a druga početnica u svakom paru ima drugačiju strukturu i komplementarna je normalnoj ili mutantnoj sekvenci DNA. Kao rezultat takve reakcije, u otopini se mogu sintetizirati dvije vrste PCR proizvoda - normalni i mutant. Štoviše, dizajn upotrijebljenih primera omogućuje jasno razlikovanje normalnih i mutantnih proizvoda pojačanja prema njihovoj molekularnoj veličini. Ova metoda je vrlo vizualna i omogućuje vam provjeru homo- i heterozigotnog nosioca mutantnog alela.

Metoda za mjesto usmjerenu modifikaciju amplificirane DNA

Metoda se temelji na korištenju tzv. mismatch primera u PCR-u (koji nije u potpunosti komplementaran s predloškom), koji se razlikuje od slijeda DNA predloška za jedan nukleotid. Kao rezultat uključivanja navedene početnice u mutirani PCR produkt, u njemu se formira umjetno stvoreno restrikcijsko mjesto za jednu od restrikcijskih endonukleaza, što omogućuje izravnu DNA dijagnostiku određene poznate mutacije pomoću restrikcijske analize. Stvaranje takvog umjetnog restrikcijskog mjesta potrebno je ako pretraga nije otkrila postojanje poznatog i dostupnog enzima, čije je "prirodno" restrikcijsko mjesto pogođeno pojavom mutacije koja se proučava u molekuli DNA .

PCR metoda reverzne transkriptaze (RT- PCR)

Ova se metoda koristi u slučajevima kada je prikladnije koristiti ne genomsku DNA kao predmet proučavanja, već kompaktniju i informacijski bogatiju cDNA dobivenu nakon odgovarajuće obrade uzoraka tkiva, na primjer, biopsijski materijal ili stanične linije limfocita, fibroblasti, itd. Ovdje je važan uvjet ekspresija (barem minimalna) željenog gena u tkivu koje se proučava.

U prvoj fazi provodi se reverzna transkripcija mRNA, a rezultirajuće molekule cDNA služe kao predložak za PCR. Nakon toga, kritična regija cDNA, umnožena u dovoljnoj količini, podvrgava se sekvencioniranju i drugim metodama probira mutacije, izravnoj elektroforetskoj studiji (otkrivanje delecija, insercija itd.) ili integraciji u sustav ekspresije kako bi se dobio proteinski produkt i njegovu izravnu analizu.

Ova metoda je posebno učinkovita za otkrivanje mutacija koje dovode do sinteze “skraćenog” proteina (besmislene mutacije, splacing mutacije, velike delecije) - takozvana PTT analiza (Protein Truncation Test). PTT analiza se obično koristi u proučavanju dugih multi-egzonskih gena, kao što je Duchenne/Beckerova mišićna distrofija, ataksija-telangiektazija ili neurofibromatoza tipa 1.

PCR u stvarnom vremenu(PCR u stvarnom vremenu, engleski)

Svake godine PCR u realnom vremenu postaje sve popularnija dijagnostička metoda u praktičnom zdravstvu. Njegova temeljna značajka je praćenje i kvantitativna analiza nakupljanja produkata lančane reakcije polimeraze te automatska registracija i interpretacija dobivenih rezultata. Ova metoda ne zahtijeva stupanj elektroforeze, što smanjuje zahtjeve za PCR laboratorij. Zahvaljujući uštedi proizvodnog prostora, smanjenju broja osoblja i potražnji za kvantitativnim određivanjem DNA/RNA, ova se metoda posljednjih godina uspješno primjenjuje u najvećim sanitarno-epidemiološkim, dijagnostičkim i istraživačkim centrima u razvijenim zemljama svijeta, zamjenjujući PCR u sadašnjem ("klasičnom") formatu.

PCR u stvarnom vremenu koristi fluorescentno obilježene oligonukleotidne sonde za otkrivanje DNK dok se umnožava. PCR u stvarnom vremenu omogućuje potpunu analizu uzorka unutar 20-60 minuta i teoretski je sposoban otkriti čak i jednu DNA ili RNA molekulu u uzorku.

Riža. 17. PCR u stvarnom vremenu.

PCR u stvarnom vremenu koristi TaqMan sustav koji kontrolira kinetiku PCR-a izravno tijekom pojačanja pomoću rezonantnog gašenja fluorescencije. Za detekciju se koristi sonda koja nosi fluorofor i prigušivač komplementaran srednjem dijelu amplificiranog fragmenta. Kada su fluorofor i gasitelj vezani za oligonukleotidnu sondu, opaža se samo manja fluorescentna emisija. Tijekom procesa pojačanja, zbog 5" egzonukleazne aktivnosti Taq polimeraze, fluorescentna oznaka odlazi u otopinu, oslobođena svoje blizine gasitelju, i stvara fluorescentni signal koji se povećava u stvarnom vremenu proporcionalno nakupljanju pojačala ( Slika 17).

Glavne prednosti PCR-a u stvarnom vremenu u odnosu na PCR s gel elektroforezom:

· Cijela metoda se odvija u jednoj epruveti;

· Metoda traje 1 sat;

· Dovoljne su 1-2 radne sobe;

· Uz kvalitativnu procjenu rezultata postoji mogućnost kvantitativne procjene (npr. kod propisivanja antivirusne terapije za AIDS ili virusni hepatitis potrebno je znati virusno opterećenje, tj. količinu virusa po jedinici koja pruža PCR u stvarnom vremenu);

· Rizik od kontaminacije naglo je smanjen.

Zaključak

PCR metoda jedna je od najčešćih metoda molekularno bioloških istraživanja. Ovu metodu kliničari trebaju razumno koristiti, a liječnik koji se odluči koristiti PCR u svom radu mora imati određena znanja o značajkama i mogućnostima ove metode. Drugo, mora postojati bliska povratna informacija između kliničara i PCR laboratorija, što je neophodno za analizu složenih slučajeva i razvoj ispravne dijagnostičke strategije. Treće, PCR analiza nije panaceja u dijagnostici (prije svega zaraznih bolesti) i ne zamjenjuje postojeće metode istraživanja, već ih samo nadopunjuje. I što je najvažnije, PCR ne može zamijeniti intuiciju i analitičko razmišljanje koje liječnik koji očekuje uspjeh mora imati.

P . S . Molekularno biološka istraživanja - mijenjanje smjernica za dijagnostiku i liječenje. Primjena molekularno bioloških metoda povezana je s perspektivom radikalne promjene naglaska u laboratorijskoj dijagnostici. Možda se ne radi samo o pravovremenoj informaciji, već o njezinom primanju unaprijed. Ako se sada laboratorijski testovi u većini slučajeva provode već kada se bolest razvila i kada je počelo liječenje, onda se očekuje da će molekularno-biološki laboratorijski podaci omogućiti prepoznavanje sklonosti osobe određenim vrstama patologije i stupanj osjetljivosti na određene lijekove. , što će opravdati prediktivnu, preventivnu i personaliziranu prirodu buduće medicine.

PROMJENA DIJAGNOZA I ORIJENTACIJA LIJEČENJA

NASLJEDNE BOLESTI

Danas U budućnosti

Dijagnoza Genetska putovnica

8. Koliko je radnih prostorija potrebno za rad PCR laboratorija s fluorescentnom detekcijom (kvantitativna analiza, Real-Time PCR)?

9. Što je detekcija?

10. Koje metode DNA dijagnostike postoje?

11. Rad kojeg enzima je u osnovi PCR-a?

12. Zašto se zona detekcije mora ukloniti iz ostalih radnih područja?

13. Što je restrikcijsko mjesto?

14. Koje su razlike između izravne i neizravne DNA dijagnostičke metode?

15. Što je sekvenciranje?

16. Što je multipleks PCR?

17. Koje se vrste mutacija određuju pomoću PCR-a?

18. Što je kontaminacija?

19. Što je bit metode alel-specifične amplifikacije?

20. Uvjeti čuvanja PCR materijala?

21. U kojem uređaju se događa pojačanje?

22. Što je metoda PCR reverzne transkriptaze (RT-PCR)?

23. Što služi kao materijal za PCR dijagnostiku?

24. Nabrojite vrste kontaminacije?

Testovi za samopripremu

1. Restrikcijski enzimi endonukleaze:

a) enzimi koji "razbijaju" DNK na strogo određenim mjestima;

b) enzimi koji spajaju lomove u molekuli DNA;

c) enzimi koji osiguravaju spojeve koji obavljaju popravak DNA.

2. Amplifikacija gena:

3. Koja se metoda molekularne genetike koristi za dijagnosticiranje bolesti uzrokovanih mutiranim genom poznatog niza?

a) korištenje specifičnog restrikcijskog enzima;

b) izravna detekcija korištenjem specifičnih molekularnih sondi;

V) analiza obitelji distribucije normalnih polimorfizama dužine restrikcijskih fragmenata.

4. Sekvenciranje DNK:

a) identifikacija sekvence baze DNA;

b) višestruko ponavljanje bilo kojeg dijela DNA;

c) izolacija fragmenta DNA koji sadrži gen koji se proučava.

5. Za dobivanje uzoraka DNK možete koristiti :

b) korionske resice;

c) amnionska tekućina;

d) stanice amnionske tekućine;

e) uzorci biopsije kože, mišića, jetre,

e) sve je točno osim točke “c”,

g) sve je točno osim točke “d”,

h) sve navedeno je točno.

6. Za dijagnosticiranje koje se mutacije koristi PCR metoda:

a) genomski;

b) kromosomski;

c) gen (točka).

7. Primer je:

a) komplementarni dio DNK;

b) sintetski oligonukleotid označen (radioaktivno ili fluorescentno) slijed komplementaran mutantnom ili normalnom genu;

c) oligonukleotid koji djeluje kao "primer" i inicira sintezu polinukleotidnog lanca na matrici DNA ili RNA.

8. Tko je razvio princip PCR metode?

b) K. Mullis

9. Koristi li se PCR metoda za dijagnosticiranje ekspanzije trinukleotidnih ponavljanja (dinamički tip mutacije)?

10. U kojim područjima se koristi PCR?

a) klinička medicina;

b) određivanje transgenih organizama (GMO)

c) osobna identifikacija, utvrđivanje očinstva, forenzika

d) sve navedeno,

e) ništa od navedenog..

Primjeri odgovora: 1 – a; 2 – b; 3 – b; 4 – a; 5 – e; 6 – u; 7 – u; 8 – b; 9 – a, 10 – g.

Glavni

1.Bočkovljeva genetika. Moskva. GEOTAR, 2002. (enciklopedijska natuknica).

Dodatni

1., Bakharev i liječenje kongenitalnih i nasljednih bolesti u djece. – Moskva, 2004.

2. DNA dijagnostika i medicinsko genetsko savjetovanje. – Moskva, 2004.

3. Ginterova genetika. – Moskva, 2003.

4. Gorbunovljeve osnove medicinske genetike. – St. Petersburg: Intermedica, 1999.

5. J. McGee. Molekularni klinička dijagnoza. – Svijet, 1999.

6. Menjšikov - biološka istraživanja u kliničkoj laboratorijskoj dijagnostici: mogućnosti problema (predavanja). Kliničko-laboratorijska dijagnostika, broj 3, 2006.

7. Rad Kornienka u PCR laboratoriju tijekom in-line analize biološkog materijala. Kliničko-laboratorijska dijagnostika, broj 10, 2006.

8. Organizacija rada PCR laboratorija. Metodičke upute. MU 1.3.1794-03. Glavni sanitarni liječnik Ruske Federacije, 2003.

9. Erlich H. A. PCR tehnologija. – Percin-Elmer Cetus, 1993.

10. Heid C. A., Stevens J. Kvantitativni PCR u stvarnom vremenu. Genome Res. – broj 6, 1996.

OSNOVNI PRINCIPI METODE

LANČANA REAKCIJA POLIMERAZE

Metodički priručnik za izvannastavni rad studenata 3-4 godine studija opće medicine (060101) i pedijatrije (060103).

GOU VPO "Krasnojarska državna medicinska akademija Savezne agencije za zdravstveni i socijalni razvoj"

Rusija, Krasnojarsk,

Federalna agencija za obrazovanje

država obrazovna ustanova

viši strukovno obrazovanje

"Karelijska državna pedagoška akademija"

Nastavni rad na temu:

Lančana reakcija polimerazom (PCR) i njezina primjena

Izvršila: studentica Koryagina Valeria Aleksandrovna

Provjerila: Karpikova Natalya Mikhailovna

Petrozavodsk 2013

Uvod

Poglavlje 1. Pregled literature

1.5.4 Efekt platoa

1.5.6 Pojačavanje

Zaključak

Uvod

Posljednjih dvadesetak godina obilježeno je širokim uvođenjem molekularno-genetičkih metoda u biološke, medicinske i poljoprivredne znanosti.

Do ranih 1970-ih činilo se da je molekularna biologija dosegla određeni stupanj zrelosti. U tom su razdoblju glavni predmet molekularno-genetičkih istraživanja bili mikroorganizmi. Prijelaz na eukariote stavio je pred istraživače potpuno nove probleme koji se nisu mogli riješiti metodama genetske analize koje su postojale u to vrijeme. Proboj u razvoju molekularne genetike postao je moguć zahvaljujući pojavi novog eksperimentalnog alata - restrikcijskih endonukleaza. Sljedećih godina broj metoda za izravnu analizu DNA, temeljenih na kvalitativno drugačijim pristupima, počeo je brzo rasti.

Suvremene tehnologije u mnogim su slučajevima omogućile dublje proučavanje fine strukturne i funkcionalne organizacije nuklearnih i ekstranuklearnih genoma različitih organizama. To je bilo od posebne važnosti za razvoj novih metoda dijagnostike i liječenja razne bolesti. Ne manje važna bila je i mogućnost korištenja dostignuća molekularne genetike u populacijskoj biologiji i oplemenjivanju za identifikaciju i analizu genetske varijabilnosti populacija, sorti i sojeva, identifikaciju i certificiranje ekonomski vrijednih jedinki, stvaranje genetski modificiranih organizama i rješavanje drugih problema.

Svaka metoda ima svoje prednosti i nedostatke. Ne postoji univerzalna metoda koja bi riješila sve probleme koji se pojave. Stoga je odabir određene metode za istraživanje koje se provodi jedna od najvažnijih faza svakog znanstvenog rada.

Poglavlje 1. Pregled literature

1.1 Povijest otkrića lančane reakcije polimerazom (PCR)

Godine 1983. K.B. Mullis i dr. objavili su i patentirali metodu lančane reakcije polimerazom (PCR), kojoj je suđeno da ima dubok utjecaj na sva područja istraživanja i primjene nukleinskih kiselina. Vrijednost ove metode za molekularna biologija a genetika se pokazala toliko velikom i očitom da je nakon sedam godina autor nagrađen Nobelova nagrada u kemiji.

Na početku primjene metode, nakon svakog ciklusa zagrijavanja-hlađenja, u reakcijsku smjesu bilo je potrebno dodati DNA polimerazu, budući da je bila inaktivirana na visokoj temperaturi potrebnoj za odvajanje lanaca spirale DNA. Postupak reakcije bio je relativno neučinkovit i zahtijevao je puno vremena i enzima. Godine 1986. metoda lančane reakcije polimerazom značajno je unaprijeđena. Predloženo je korištenje DNA polimeraza iz termofilnih bakterija. Pokazalo se da su ti enzimi termostabilni i sposobni su izdržati mnoge reakcijske cikluse. Njihova uporaba omogućila je pojednostavljenje i automatizaciju PCR-a. Jedna od prvih termostabilnih DNA polimeraza izolirana je iz bakterija Thermus aquaticusi imenovani Taq-polimeraza.

Mogućnost umnožavanja bilo kojeg segmenta DNA čiji je slijed nukleotida poznat, te dobivanja istog u homogenom obliku i preparativnoj količini nakon završetka PCR-a, čini PCR alternativnom metodom za molekularno kloniranje kratkih fragmenata DNA. U ovom slučaju nema potrebe koristiti složene metodološke tehnike koje se koriste u genetski inženjering s konvencionalnim kloniranjem. Razvoj PCR metode uvelike je proširio metodološke mogućnosti molekularne genetike, a posebice genetskog inženjerstva, toliko da je radikalno promijenio i ojačao znanstveni potencijal mnogih njezinih područja.

1.2 Vrste lančane reakcije polimerazom (PCR)

· Ugniježđeni PCR- koristi se za smanjenje broja nusproizvoda reakcije. Koriste se dva para primera i provode se dvije sekvencijalne reakcije. Drugi par početnica pojačava regiju DNA unutar produkta prve reakcije.

· Invertirani PCR- koristi se kada je poznato samo malo područje unutar željenog niza. Ova metoda je posebno korisna kada se radi o određivanju susjednih sekvenci nakon što je DNK umetnuta u genom. Za izvođenje invertirane PCR, niz DNA rezova se izvodi pomoću restrikcijskih enzima<#"justify">početnica lančane reakcije polimeraze

· Grupno specifična PCR- PCR za rodbinu<#"center">1.3 Lančana reakcija polimerazom

Otkrivena sredinom 1980-ih, lančana reakcija polimerazom (PCR) može umnožiti broj kopija originalnog uzorka milijune puta unutar nekoliko sati. Tijekom svakog reakcijskog ciklusa iz originalne molekule nastaju dvije kopije. Svaka od sintetiziranih kopija DNK može poslužiti kao predložak za sintezu novih kopija DNK u sljedećem ciklusu. Dakle, opetovano ponavljanje ciklusa dovodi do povećanja broja kopija u geometrijska progresija. Iz izračuna proizlazi da će čak i uz 30 ciklusa broj kopija izvorne molekule biti veći od 1 milijarde. Čak i ako uzmemo u obzir da se svi amplikoni ne dupliciraju tijekom svakog ciklusa, ukupan broj kopija, unatoč tome, prilično je velika brojka.

Svaki ciklus lančane reakcije polimerazom (PCR) sastoji se od sljedećih koraka:

· Denaturacija - Povećanje temperature uzrokuje odmotavanje dvolančane molekule DNA i cijepanje na dvije jednolančane;

· Žarenje - Smanjenje temperature omogućuje vezivanje početnica na komplementarne regije molekule DNA;

· Elongacija – enzim DNA polimeraza dovršava komplementarni lanac.

Za umnožavanje odabranog fragmenta koriste se dva oligonukleotidna početnica (primera) koja okružuju specifičnu regiju DNA. Primeri usmjereni 3 - krajevi jedan prema drugom i prema nizu koji treba pojačati. DNA polimeraza provodi sintezu (dovršavanje) međusobno komplementarnih lanaca DNA, počevši od početnica. Tijekom sinteze DNA, početnice su fizički integrirane u lanac novosintetiziranih molekula DNA. Svaki lanac molekule DNA formiran korištenjem jednog od početnica može poslužiti kao predložak za sintezu komplementarnog lanca DNA korištenjem drugog početnica.

1.4 Provođenje lančane reakcije polimerazom (PCR)

Lančana reakcija polimeraze provodi se u posebnim polipropilenskim cijevima s tankim stijenkama, kompatibilnim u veličini s korištenim termičkim ciklerom (pojačivačem) - uređajem koji kontrolira temperaturne i vremenske karakteristike faza lančane reakcije polimeraze (PCR).

1.5 Princip metode lančane reakcije polimerazom

Lančana reakcija polimerazom (PCR) in vitro je metoda umnožavanja DNK koja se može koristiti za izolaciju i umnožavanje specifične sekvence DNK milijarde puta unutar nekoliko sati. Sposobnost dobivanja ogromnog broja kopija jednog striktno određeno područje genoma uvelike pojednostavljuje proučavanje postojećeg uzorka DNK.

Za izvođenje lančane reakcije polimerazom potrebno je ispuniti nekoliko uvjeta:

1.5.1 Prisutnost niza komponenata u reakcijskoj smjesi

Glavne komponente reakcijske (PCR) smjese su: Tris-HCl, KCl, MgCl 2, mješavina nukleotid trifosfata (ATP, GTP, CTP, TTP), početnice (oligonukleotidi), preparat DNA, termostabilna DNA polimeraza. Svaka od komponenti reakcijske smjese izravno je uključena u lančanu reakciju polimeraze (PCR), a koncentracija reagensa izravno utječe na tijek amplifikacije.

· Tris-HCl - određuje pH reakcijske smjese, stvara puferski kapacitet. Aktivnost DNA polimeraze ovisi o pH okoline, pa pH vrijednost izravno utječe na tijek lančane reakcije polimeraze. Obično je pH vrijednost između 8 i 9,5. Uzeta je visoka pH vrijednost jer pH Tril-HCl pufera pada kako temperatura raste.

· KCl - koncentracija kalijevog klorida do 50 mM utječe na tijek procesa denaturacije i žarenja, koncentracije iznad 50 mM inhibiraju DNA polimerazu.

· MgCl 2- budući da je DNA polimeraza Mg 2+- ovisan enzim, tada koncentracija magnezijevih iona utječe na aktivnost enzima (Mg 2+stvara komplekse s NTP - ti kompleksi su supstrat za polimerazu). Visoka koncentracija dovodi do povećanja nespecifične amplifikacije, a niska koncentracija dovodi do inhibicije reakcije; optimum (za različite polimeraze) je u rasponu od 0,5 - 5 mM. Osim toga, koncentracija magnezijevih soli utječe na tijek procesa denaturacije i žarenja – povećanje koncentracije Mg 2+uzrokuje povećanje temperature taljenja DNA (tj. temperature pri kojoj se 50% dvolančanih DNA lanaca razdvaja u jednolančane).

· NTP - nukleotidni trifosfati su izravni monomeri nukleinskih kiselina. Kako bi se spriječio prekid lanca, preporučuje se jednaki omjer sva četiri nukleotidna trifosfata. Niska koncentracija ovih komponenti u reakcijskoj smjesi povećava vjerojatnost pogrešaka pri izgradnji komplementarnog lanca DNA.

· Primeri - Najoptimalnije je koristiti temeljne premaze s temperaturnom razlikom topljenja ne većom od 2 - 4 o C. Ponekad tijekom dugotrajnog skladištenja na temperaturi od 4 o C, ili nakon velikog broja smrzavanja i odmrzavanja, primeri stvaraju sekundarne strukture - dimere, smanjujući učinkovitost PCR-a. Otklanjanje ovog problema svodi se na inkubaciju u vodenoj kupelji (T=95 o C) 3 minute i zatim brzo hlađenje na 0° S.

· DNA preparati - količina i kvaliteta DNA preparata (matrice) izravno utječe na tijek i parametre lančane reakcije polimeraze. Prevelike količine uzorka DNK inhibiraju lančanu reakciju polimeraze (PCR). Nečistoće razne tvari sadržani u pripravku DNA također mogu smanjiti učinkovitost lančane reakcije polimeraze (PCR): natrijev acetat, natrijev klorid, izopropanol, etanol, heparin, fenol, urea, hemoglobin itd.

· DNA polimeraza - kada se koristi mala količina DNA polimeraze, uočava se smanjenje sinteze konačnog proizvoda izravno proporcionalno veličini fragmenata. Višak polimeraze 2-4 puta dovodi do pojave difuznih spektara, a 4-16 puta - niskomolekularnih nespecifičnih spektara. Raspon korištenih koncentracija je 0,5 - 1,5 jedinica aktivnosti po 25 μl PCR smjese.

Uz glavne komponente PCR smjese, koriste se brojne dodatne tvari koje poboljšavaju kvalitativne i kvantitativne pokazatelje PCR: acetamid (5%) - povećava topljivost glavnih komponenti; betain ( natrijeva sol) - stabilizacija DNA polimeraze, snižavanje temperature taljenja DNA, izjednačavanje temperature taljenja; goveđi albumin (10-100 μg/ml) - stabilizacija DNA polimeraze; dimetil sulfoksid (1-10%) - povećanje topljivosti glavnih komponenti; formamid (2-10%) - povećanje specifičnosti žarenja; glicerol (15-20%) - povećanje toplinske stabilnosti enzima, snižavanje temperature denaturacije DNA uzorka; amonijev sulfat - snižavanje temperature denaturacije i žarenja.

1.5.2 Ciklični i temperaturni način rada

Opći izgled programa lančane reakcije polimerazom (PCR) je sljedeći:

pozornici. Dugotrajna primarna denaturacija DNA preparata 1. ciklus

pozornici. Brza denaturacija preparata DNA. Žarenje primera. Elongacija.30 - 45 ciklusa.

pozornici. Dugo istezanje. Hlađenje reakcijske smjese 1. ciklus.

Svaki element faze - denaturacija, žarenje, elongacija - ima individualne karakteristike temperature i vremena. Parametri temperature i vremena za svaki element odabrani su empirijski, u skladu s kvalitativnim i kvantitativnim pokazateljima proizvoda pojačanja.

Denaturacija. Tijekom ovog elementa lančane reakcije polimeraze, dvolančana molekula DNA se dijeli na dvije jednolančane. Parametri temperature denaturacije su u rasponu od 90 - 95 o C, ali u slučaju uzorka DNA s visokim sadržajem gvanina i citozina, temperaturu treba povećati na 98 o C. Temperatura denaturacije mora biti dovoljna za potpunu denaturaciju DNA lanaca i izbjegavanje "flash cooling" ili brzog žarenja, međutim, termostabilna DNA polimeraza manje je stabilna na visokim temperaturama. Stoga je odabir optimalnih parametara temperature denaturacije za omjer primer/uzorak (priprema DNA) važan uvjet pri provođenju amplifikacije. Ako je temperatura denaturacije u prvoj fazi iznad 95 o C, preporuča se dodavanje DNA polimeraze u reakcijsku smjesu nakon početne denaturacije. Trajanje ovog elementa faze tijekom lančane reakcije polimeraze (PCR) trebalo bi biti dovoljno za potpunu denaturaciju DNK, ali u isto vrijeme ne bi imalo značajan učinak na aktivnost DNK polimeraze na danoj temperaturi.

Žarenje. Temperatura žarenja (T A ) jedan je od najvažnijih parametara lančane reakcije polimeraze. Temperatura žarenja za svaki specifični temeljni premaz odabire se pojedinačno. Ovisi o duljini i nukleotidnom sastavu početnice. Obično je niža za 2 - 4 o Od vrijednosti tališta (T m ) temeljni premaz. Ako je temperatura žarenja sustava niža od optimalne, tada se povećava broj nespecifičnih amplificiranih fragmenata i, obrnuto, više toplina smanjuje količinu pojačanih proizvoda. U tom slučaju, koncentracija specifičnih amplikona može se naglo smanjiti, sve do inhibicije lančane reakcije polimeraze (PCR). Povećanje vremena žarenja također dovodi do povećanja broja nespecifičnih amplikona.

Elongacija. Tipično, svaka vrsta termostabilne DNA polimeraze ima individualni temperaturni optimum za aktivnost. Brzina sinteze komplementarnog lanca DNA pomoću enzima također je specifična za svaku polimerazu (u prosjeku je 30 - 60 nukleotida u sekundi, odnosno 1 - 2 tisuće baza u minuti), stoga se vrijeme elongacije odabire ovisno o vrsti DNA polimeraze i duljine umnožene regije.

1.5.3 Osnovna načela za odabir temeljnih premaza

Prilikom izrade PCR test sustava, jedan od glavnih zadataka je pravilan odabir primera koji moraju zadovoljiti niz kriterija:

Primeri moraju biti specifični. Posebna pažnja platiti 3 - krajevi početnica, jer upravo od njih Taq polimeraza počinje dovršavati komplementarni lanac DNA. Ako je njihova specifičnost nedovoljna, tada će se vjerojatno dogoditi neželjeni procesi u epruveti s reakcijskom smjesom, naime sinteza nespecifične DNA (kratki ili dugi fragmenti). Vidljivo je na elektroforezi u obliku teških ili laganih dodatnih traka. To ometa procjenu rezultata reakcije, budući da je lako zamijeniti određeni produkt pojačanja sa sintetiziranom stranom DNA. Neki primeri i dNTP troše se za sintezu nespecifične DNA, što dovodi do značajnog gubitka osjetljivosti.

Primeri ne bi trebali stvarati dimere i petlje, t.j. stabilne dvostruke niti ne bi trebale biti formirane kao rezultat žarenja primera za sebe ili međusobno.

1.5.4 Efekt platoa

Valja napomenuti da proces nakupljanja specifičnih proizvoda pojačanja u geometrijskoj progresiji traje samo ograničeno vrijeme, a zatim njegova učinkovitost kritično opada. To je zbog takozvanog efekta platoa.

Učinak termina plato koristi se za opisivanje procesa nakupljanja PCR produkata u zadnjim ciklusima umnožavanja.

Ovisno o uvjetima i broju ciklusa reakcije pojačanja, u trenutku kada je učinak postignut plato na koje utječu iskorištenje supstrata (dNTP i primeri), stabilnost reaktanata (dNTP i enzim), količina inhibitora, uključujući pirofosfate i DNA duplekse, kompeticija za reaktante nespecifičnim produktima ili dimerima primera, koncentracija specifičnog proizvoda i nepotpuna denaturacija pri visokim koncentracijama proizvoda amplifikacije.

Što je niža početna koncentracija ciljne DNK, to je veći rizik da reakcija neće uspjeti. plato." Ova se točka može dogoditi prije nego što postoji dovoljno specifičnih produkata pojačanja za analizu. Samo dobro optimizirani testni sustavi to mogu izbjeći.

1.5.5. Priprema biološkog uzorka

Za izolaciju DNK koriste se različite tehnike ovisno o zadacima koji se postavljaju. Njihova bit leži u ekstrakciji (ekstrakciji) DNA iz biološkog pripravka i uklanjanju ili neutralizaciji stranih nečistoća kako bi se dobio DNA pripravak čistoće prikladne za PCR.

Metoda dobivanja pripravka čiste DNA koju je opisao Marmur smatra se standardnom i već je postala klasična. Uključuje enzimatsku proteolizu nakon koje slijedi deproteinizacija i ponovno taloženje DNA alkoholom. Ova metoda omogućuje dobivanje čistog DNK pripravka. Međutim, to je prilično radno intenzivno i uključuje rad s tako agresivnim i jakim mirisnim tvarima kao što su fenol i kloroform.

Jedna od trenutno popularnih metoda je metoda ekstrakcije DNK koju su predložili Boom i sur. Ova se metoda temelji na upotrebi jakog kaotropnog agensa, gvanidin tiocijanata (GuSCN), za lizu stanica i naknadnu sorpciju DNA na nosaču (staklene kuglice, dijatomejska zemlja, stakleno mlijeko, itd.). Nakon ispiranja, DNA ostaje u uzorku, sorbirana na nosaču, s kojeg se lako uklanja puferom za ispiranje. Metoda je praktična, tehnološki napredna i prikladna za pripremu uzorka za amplificiranje. Međutim, moguć je gubitak DNA zbog ireverzibilne sorpcije na nosaču, kao i tijekom brojnih ispiranja. Ovo je osobito važno kada se radi s malim količinama DNK u uzorku. Osim toga, čak i tragovi GuSCN-a mogu inhibirati PCR. Stoga je pri korištenju ove metode vrlo važno pravi izbor sorbent i pažljivo pridržavanje tehnoloških nijansi.

Druga skupina metoda pripreme uzoraka temelji se na korištenju ionskih izmjenjivača tipa Chilex, koji za razliku od stakla ne apsorbiraju DNA, već nečistoće koje ometaju reakciju. Ova tehnologija u pravilu uključuje dvije faze: prokuhavanje uzorka i sorpciju nečistoća na ionskom izmjenjivaču. Metoda je izuzetno atraktivna zbog svoje jednostavnosti izvedbe. U većini slučajeva pogodan je za rad s kliničkim materijalom. Nažalost, ponekad postoje uzorci s nečistoćama koje se ne mogu ukloniti pomoću ionskih izmjenjivača. Osim toga, neki se mikroorganizmi ne mogu uništiti jednostavnim kuhanjem. U tim slučajevima potrebno je uvesti dodatne faze obrade uzorka.

Stoga bi izbor metode pripreme uzorka trebao biti uzet u obzir uz razumijevanje svrhe namjeravane analize.

1.5.6 Pojačavanje

Za provođenje reakcije amplifikacije potrebno je pripremiti reakcijsku smjesu i dodati joj analizirani uzorak DNK. Važno je uzeti u obzir neke značajke žarenja temeljnog premaza. Činjenica je da, u pravilu, analizirani biološki uzorak sadrži različite molekule DNA, s kojima početnice korištene u reakciji imaju djelomičnu, au nekim slučajevima i značajnu homologiju. Osim toga, primeri se mogu međusobno žariti, tvoreći dimere primera. Oba dovode do značajne potrošnje početnica za sintezu nusproizvoda (nespecifičnih) produkata reakcije i, kao rezultat toga, značajno smanjuju osjetljivost sustava. Zbog toga je teško ili nemoguće očitati rezultate reakcije tijekom elektroforeze.

1.6 Sastav standardne PCR reakcijske smjese

x PCR pufer (100 mM otopina Tris-HCl, pH 9,0, 500 mM otopina KCl, 25 mM otopina MgCl2 ) …….2,5 µl

Voda (MilliQ)………………………………………………………….18,8 µl

Mješavina nukleotidnih trifosfata (dNTP)

mM otopina svakog……………………………………….……….0,5 µl

Primer 1 (10 mM otopina) ……………………………………………………….….1 µl

Primer 2 (10 mM otopina) ………………………………………………………..1 µl

DNA polimeraza (5 jedinica/µl) ………………………………………0,2 µl

DNK uzorak (20 ng/µl) …………………………………………..1 µl

1.7 Procjena rezultata reakcije

Za ispravnu procjenu rezultata PCR-a, važno je razumjeti da ova metoda nije kvantitativna. Teoretski, proizvodi amplifikacije pojedinačnih ciljnih molekula DNA mogu se detektirati pomoću elektroforeze nakon 30-35 ciklusa. Međutim, u praksi se to radi samo u slučajevima kada se reakcija odvija u uvjetima bliskim idealnim, što u životu nije čest slučaj. Posebno velik utjecaj na učinkovitost amplifikacije ima stupanj čistoće preparata DNA, tj. prisutnost u reakcijskoj smjesi određenih inhibitora, kojih se u nekim slučajevima može vrlo teško riješiti. Ponekad se zbog njihove prisutnosti čak i deseci tisuća ciljnih molekula DNA ne mogu umnožiti. Stoga često ne postoji izravan odnos između početne količine ciljne DNA i konačne količine proizvoda amplifikacije.

Poglavlje 2: Primjena lančane reakcije polimerazom

PCR se koristi u mnogim područjima za testiranje i znanstvene eksperimente.

Forenzika

PCR se koristi za usporedbu takozvanih "genetskih otisaka prstiju". Potreban je uzorak genetskog materijala s mjesta zločina - krv, slina, sjeme, kosa itd. Uspoređuje se s genetskim materijalom osumnjičenika. Dovoljna je vrlo mala količina DNK, teoretski jedna kopija. DNK se rastavlja na fragmente i zatim umnožava pomoću PCR-a. Fragmenti se odvajaju DNA elektroforezom. Rezultirajući obrazac rasporeda DNK traka naziva se genetski otisak prsta.

Utvrđivanje očinstva

Rezultati elektroforeze fragmenata DNA umnoženih PCR-om. Otac. Dijete. Majka. Dijete je naslijedilo neke značajke genetskog otiska oba roditelja, što je rezultiralo novim, jedinstvenim otiskom.

Iako su genetski otisci prstiju jedinstveni, obiteljski odnosi ipak se mogu uspostaviti pravljenjem nekoliko otisaka prstiju. Ista se metoda može primijeniti, malo modificirana, za utvrđivanje evolucijske povezanosti među organizmima.

Medicinska dijagnostika

PCR omogućuje znatno ubrzanje i olakšavanje dijagnostike nasljednih i virusnih bolesti. Gen od interesa umnožava se PCR-om pomoću odgovarajućih početnica, a zatim se sekvencira kako bi se identificirale mutacije. Virusne infekcije mogu se otkriti odmah nakon infekcije, tjednima ili mjesecima prije pojave simptoma.

Personalizirana medicina

Ponekad se pokažu da su lijekovi toksični ili alergeni za neke pacijente. Razlozi za to djelomice su individualne razlike u osjetljivosti i metabolizmu lijekova i njihovih derivata. Te su razlike određene na genetskoj razini. Na primjer, kod jednog pacijenta određeni citokrom može biti aktivniji, kod drugog manje. Kako bi se utvrdilo koju vrstu citokroma ima određeni pacijent, predlaže se provesti PCR analizu prije primjene lijeka. Ova analiza se naziva preliminarna genotipizacija.

Kloniranje gena

Kloniranje gena je proces izolacije gena i, kao rezultat manipulacija genetskog inženjeringa, dobivanje velike količine produkta određenog gena. PCR se koristi za umnožavanje gena, koji se zatim umeće u vektor - dio DNK koji prenosi strani gen u isti ili drugi organizam pogodan za uzgoj. Na primjer, plazmidi ili virusna DNA koriste se kao vektori. Umetanje gena u strani organizam obično se koristi za proizvodnju produkta tog gena - RNK ili, najčešće, proteina. Na taj se način mnogi proteini dobivaju u industrijskim količinama za upotrebu u poljoprivreda, lijek, itd.

Sekvenciranje DNA

U metodi sekvenciranja dideoksinukleotida obilježenih fluorescentnim ili radioaktivnim izotopom PCR je sastavni dio, budući da se upravo tijekom polimerizacije derivati ​​nukleotida obilježeni fluorescentnim ili radioaktivnim biljegom umeću u lanac DNA. Ovo zaustavlja reakciju, omogućujući određivanje položaja specifičnih nukleotida nakon što se sintetizirani lanci odvoje u gelu.

Mutageneza

Trenutno je PCR postao glavna metoda za provođenje mutageneze. Korištenje PCR-a omogućilo je pojednostavljenje i ubrzanje postupka mutageneze, te ga učinilo pouzdanijim i ponovljivijim.

Metoda PCR omogućila je analizu prisutnosti sekvenci humanog papiloma virusa u parafinskim biopsijskim dijelovima tumora grlića maternice kod ljudi 40 godina prije ove studije. Štoviše, pomoću PCR-a bilo je moguće umnožiti i klonirati fragmente mitohondrijske DNA iz fosilnih ostataka 7 tisuća godina starog ljudskog mozga!

Korištenjem lizata pojedinačnih ljudskih spermija dokazana je mogućnost istovremene analize dvaju lokusa koji se nalaze na različitim nehomolognim kromosomima. Ovaj pristup pruža jedinstvenu priliku za finu genetsku analizu i proučavanje kromosomske rekombinacije, DNA polimorfizma itd. Metoda za analizu pojedinačnih spermija odmah je pronađena praktičnu upotrebu u sudskoj medicini, budući da HLA tipizacija haploidnih stanica omogućuje određivanje očinstva ili identifikaciju kriminalca (HLA kompleks je skup gena ljudskog glavnog histokompatibilnog kompleksa; lokusi HLA kompleksa su najpolimorfniji od svih poznatih u viši kralješnjaci: unutar vrste, u svakom lokusu postoji neobično veliki broj različitih alela – alternativnih oblika istog gena).

Pomoću PCR-a moguće je utvrditi točnu integraciju stranih genetskih struktura u unaprijed određeno područje genoma stanica koje se proučavaju. Ukupna stanična DNA žari se na dva oligonukleotidna početnica, od kojih je jedan komplementaran dijelu DNA domaćina u blizini točke umetanja, a drugi sekvenci integriranog fragmenta u antiparalelnom lancu DNA. Lančana reakcija polimerazom, u slučaju nepromijenjene strukture kromosomske DNA na predviđenom mjestu insercije, dovodi do stvaranja fragmenata jednolančane DNA nepoznate veličine, a u slučaju planirane insercije, fragmenata dvolančane DNA poznata veličina, određena udaljenošću između mjesta žarenja dvaju primera. Štoviše, stupanj amplifikacije analizirane regije genoma u prvom će slučaju biti linearno ovisan o broju ciklusa, au drugom će slučaju biti eksponencijalan. Eksponencijalno nakupljanje amplificiranog fragmenta unaprijed određene veličine tijekom PCR-a omogućuje nam da ga vizualno promatramo nakon elektroforetske frakcioniranja DNA preparata i donesemo nedvosmislen zaključak o umetanju strane sekvence u određeno područje kromosomske DNA.

Zaključak

PCR metoda trenutno je najraširenija metoda za dijagnosticiranje raznih zaraznih bolesti. PCR vam omogućuje da identificirate etiologiju infekcije čak i ako uzorak uzet za analizu sadrži samo nekoliko molekula DNA patogena. PCR se široko koristi u ranoj dijagnostici HIV infekcija, virusnog hepatitisa itd. Danas gotovo da ne postoji infektivni uzročnik koji se ne može otkriti pomoću PCR-a.

Popis korištene literature

1.Padutov V.E., Baranov O.Yu., Voropaev E.V. Metode molekularne genetičke analize. - Mn.: Unipol, 2007. - 176 str.

2.PCR "u stvarnom vremenu" / Rebrikov D.V., Samatov G.A., Trofimov D.Yu. i tako dalje.; uredio d.b. n. D.V. Rebrikova; predgovor LA. Osterman i akademik RAS i RAAS E.D. Sverdlov; 2. izdanje, rev. i dodatni - M.: BINOM. Laboratorij znanja, 2009. - 223 str.

.Patrushev L.I. Umjetni genetski sustavi. - M.: Nauka, 2005. - U 2 sv.

.B. Glick, J. Pasternak Molekularna biotehnologija. Načela i primjene 589 str., 2002

5.Ščelkunov S.N. Genetski inženjering. - Novosibirsk: Sib. sveuč. izdavačka kuća, 2004. - 496 str.

Uredio A.A. Vorbjeva "Lančana reakcija polimerazom i njezina primjena u dijagnostici u dermatovenerologiji"; Medicinska novinska agencija - 72 stranice

http://ru. wikipedia.org

http://znanstvenik. google.ru

.

.

http://www.med2000.ru/n1/n12. htm

12.http://prizvanie. su/ - medicinski časopis

Podučavanje

Trebate pomoć u proučavanju teme?

Naši stručnjaci savjetovat će vam ili pružiti usluge podučavanja o temama koje vas zanimaju.
Pošaljite svoju prijavu naznačite temu upravo sada kako biste saznali o mogućnosti dobivanja konzultacija.

Za odgovarajuće i učinkovito liječenje Mnoge zarazne bolesti zahtijevaju pravovremenu identifikaciju točna dijagnoza. U rješavanju ovog problema danas se koriste visokotehnološke dijagnostičke metode temeljene na metodama molekularne biologije. Trenutno se lančana reakcija polimerazom (PCR) već dosta koristi u praktičnoj medicini kao najpouzdanije laboratorijsko dijagnostičko sredstvo.

Što objašnjava trenutnu popularnost PCR-a?

Prvo, ova metoda se koristi za identifikaciju uzročnika raznih zaraznih bolesti s visokom točnošću.

Drugo, pratiti učinkovitost liječenja.

U raznim priručnicima, brošurama, člancima, kao i objašnjenjima liječnika specijalista, često se susrećemo s korištenjem nerazumljivih pojmova i riječi. Doista je teško govoriti o visokotehnološkim proizvodima znanosti svakodnevnim riječima.

Što je bit i mehanika PCR dijagnostike?

Svaki živi organizam ima svoje jedinstvene gene. Geni se nalaze u molekuli DNK, koja je zapravo “vizit karta” svakog pojedinog organizma. DNK (genetski materijal) je vrlo dugačka molekula koja se sastoji od građevnih blokova koji se nazivaju nukleotidi. Za svaki uzročnik zaraznih bolesti locirani su strogo specifično, odnosno u određenom slijedu i kombinaciji. Kada je potrebno razumjeti ima li osoba određeni patogen, uzima se biološki materijal (krv, urin, slina, razmaz), koji sadrži DNK ili fragmente DNK mikroba. Ali količina genetskog materijala patogena je vrlo mala, i nemoguće je reći kojem mikroorganizmu pripada. Za rješavanje ovog problema koristi se PCR. Suština lančane reakcije polimeraze je u tome što se uzima mala količina materijala za istraživanje koji sadrži DNK, a tijekom PCR procesa povećava se količina genetskog materijala koji pripada određenom patogenu i na taj način se može identificirati.

PCR dijagnostika - genetsko istraživanje biomaterijala.

Ideja o PCR metodi pripada američkom znanstveniku K. Mullinsu, koju je predložio 1983. godine. Međutim, široku kliničku primjenu dobio je tek sredinom 90-ih godina 20. stoljeća.

Razumimo terminologiju, što je to - DNK, itd. Svaka stanica bilo kojeg živog bića (životinja, biljka, čovjek, bakterija, virus) ima kromosome. Kromosomi su čuvari genetskih informacija koje sadrže cijeli genski niz svakog pojedinog živog bića.

Svaki se kromosom sastoji od dva lanca DNA uvijena u spiralu jedan u odnosu na drugi. DNK je po kemijskom sastavu dezoksiribonukleinska kiselina koja se sastoji od strukturnih komponenti – nukleotida. Postoji 5 vrsta nukleotida - timin (T), adenozin (A), gvanin (G), citozin (C) i uracil (U). Nukleotidi su poredani jedan za drugim u strogom individualnom nizu, tvoreći gene. Jedan gen se može sastojati od 20-200 takvih nukleotida. Na primjer, gen koji kodira proizvodnju inzulina sastoji se od 60 parova nukleotida.

Nukleotidi imaju svojstvo komplementarnosti. To znači da se nasuprot adenina (A) u jednom lancu DNK nužno nalazi timin (T) u drugom lancu, a nasuprot gvaninu (G) nalazi se citozin (C). Shematski to izgleda ovako:
G - C
T - A
A - T
Ovo svojstvo komplementarnosti je ključno za PCR.

Osim DNK, istu strukturu ima i RNK – ribonukleinska kiselina, koja se od DNK razlikuje po tome što umjesto timina koristi uracil. RNA je čuvar genetske informacije u nekim virusima koji se nazivaju retrovirusi (na primjer, HIV).

Molekule DNA i RNA mogu se "množiti" (ovo se svojstvo koristi za PCR). To se događa na sljedeći način: dva lanca DNA ili RNA odmiču jedan od drugoga, a na svakom lancu sjedi poseban enzim koji sintetizira novi lanac. Sinteza se odvija prema principu komplementarnosti, odnosno ako izvorni lanac DNA sadrži nukleotid A, tada će novosintetizirani sadržavati T, ako G, onda C itd. Za početak sinteze, ovom posebnom "graditeljskom" enzimu potrebno je "sjeme" - niz od 5-15 nukleotida. Ovaj "primer" definiran je za svaki gen (gen za klamidiju, mikoplazma, virusi) eksperimentalno.

Dakle, svaki PCR ciklus se sastoji od tri faze. U prvoj fazi dolazi do takozvanog odmotavanja DNK – odnosno odvajanja dva međusobno povezana lanca DNK. U drugom, "sjeme" je pričvršćeno na dio DNK lanca. I na kraju, produljenje ovih DNK lanaca, koje proizvodi enzim "graditelj". Trenutno sve ovo težak proces odvija se u jednoj epruveti i sastoji se od ponovljenih ciklusa umnožavanja detektabilne DNA kako bi se dobio veliki broj kopija, koje se zatim mogu detektirati konvencionalnim metodama. Odnosno, iz jednog lanca DNK dobijemo stotine ili tisuće.

Faze PCR istraživanja

Prikupljanje biološkog materijala za istraživanje

Kao uzorak koristi se razni biološki materijal: krv i njeni sastojci, urin, slina, iscjedak sluznice, cerebrospinalna tekućina, iscjedak površine rane, sadržaj tjelesnih šupljina. Svi biouzorci se skupljaju jednokratnim instrumentima, a prikupljeni materijal se stavlja u plastične sterilne epruvete ili stavlja na podloge za kulture, te se potom transportira u laboratorij.

Potrebni reagensi dodaju se prikupljenim uzorcima i stavljaju u programabilni termostat – termalni cikler (pojačivač). U pojačivaču se PCR ciklus koji se sastoji od tri faze (denaturacija, žarenje i ekstenzija) ponavlja 30-50 puta. Što to znači? Pogledajmo pobliže.

Faze izravne PCR reakcije, kopiranje genetskog materijala

jaPCR faza - Priprema genetskog materijala za kopiranje.
Nastaje na temperaturi od 95 °C, dok su DNK niti razdvojene, a “sjemenke” mogu sletjeti na njih.

„Sjemenke“ industrijski proizvode razne istraživačke i proizvodne udruge, a laboratoriji kupuju već gotove. U isto vrijeme, "primer" za identifikaciju, na primjer, klamidije, radi samo za klamidiju itd. Dakle, ako se biomaterijal testira na prisutnost klamidijske infekcije, tada se u reakcijsku smjesu stavlja "primer" za klamidiju; ako se biomaterijal testira na Epstein-Barr virus, onda je to također "sjeme" za Epstein-Barr virus.

IIstadij – Kombinacija genetskog materijala uzročnika infekcije i "sjemena".
Ako postoji DNK detektabilnog virusa ili bakterije, "primer" se nalazi na toj DNK. Ovaj proces dodavanja "primera" je druga faza PCR-a. Ova faza odvija se na temperaturi od 75°C.

IIIstadij - Kopiranje genetskog materijala uzročnika infekcije.
Ovo je proces stvarnog produljivanja ili umnožavanja genetskog materijala, koji se odvija na 72°C. Enzim "graditelj" približava se "sjemenu" i sintetizira novi lanac DNK. Završetkom sinteze novog lanca DNA završava PCR ciklus. Odnosno, u jednom PCR ciklusu količina genetskog materijala se udvostruči. Primjerice, početni uzorak sadržavao je 100 molekula DNA virusa, nakon prvog PCR ciklusa uzorak će sadržavati već 200 molekula DNA virusa koji se testira. Jedan ciklus traje 2-3 minute.

Za stvaranje dovoljne količine genetskog materijala za identifikaciju obično se provodi 30-50 PCR ciklusa, što traje 2-3 sata.

Faza identifikacije razmnoženog genetskog materijala

Zapravo, PCR ovdje završava i onda dolazi ništa manje značajna faza identifikacije. Za identifikaciju se koristi metoda elektroforeze ili označeno "sjeme". Kod elektroforeze dobivene DNA niti se odvajaju po veličini, a prisutnost fragmenata DNA različitih duljina ukazuje na pozitivan rezultat testa (odnosno prisutnost određenog virusa, bakterije itd.). Kada se koriste označene "sjemenke", konačnom proizvodu reakcije dodaje se kromogen (boja), zbog čega je enzimska reakcija popraćena stvaranjem boje. Razvoj boje izravno ukazuje da je virus ili drugi detektabilni agens prisutan u izvornom uzorku.

Danas je pomoću označenog “seeda”, kao i odgovarajućeg softvera, moguće odmah “očitati” PCR rezultate. Ovo je takozvani PCR u realnom vremenu.

Zašto je PCR dijagnostika toliko vrijedna?

Jedna od značajnih prednosti PCR metode je njena visoka osjetljivost - od 95 do 100%. Međutim, te se pogodnosti moraju temeljiti na strogom poštivanju sljedećih uvjeta:

1. ispravno prikupljanje i transport biološkog materijala;
2. dostupnost sterilnih, jednokratnih instrumenata, posebnih laboratorija i obučenog osoblja;
3. strogo pridržavanje metodologije i sterilnost tijekom analize

Osjetljivost se razlikuje među različitim otkrivenim mikrobima. Na primjer, osjetljivost PCR metode za otkrivanje virusa hepatitisa C je 97-98%, osjetljivost za otkrivanje ureaplazme je 99-100%.

Mogućnosti svojstvene PCR analizi omogućuju nenadmašnu analitičku specifičnost. To znači identificirati točno onaj mikroorganizam koji se traži, a ne sličan ili blisko srodan.
Dijagnostička osjetljivost i specifičnost PCR metode često su superiorniji od onih metode kulture, koja se naziva "zlatnim standardom" za otkrivanje zaraznih bolesti. S obzirom na trajanje uzgoja kulture (od nekoliko dana do nekoliko tjedana), prednost PCR metode postaje očita.

PCR u dijagnostici infekcija
Prednosti PCR metode (osjetljivost i specifičnost) određuju široku primjenu u suvremenoj medicini.
Glavna područja primjene PCR dijagnostike:

1. dijagnostika akutnih i kroničnih zaraznih bolesti različitih lokalizacija
2. praćenje učinkovitosti terapije
3. pojašnjenje vrste patogena

PCR se koristi u opstetriciji, ginekologiji, neonatologiji, pedijatriji, urologiji, venerologiji, nefrologiji, klinici za infektivne bolesti, oftalmologiji, neurologiji, ftiziopulmologiji itd.

Korištenje PCR dijagnostike provodi se zajedno s drugim metodama istraživanja (ELISA, PIF, RIF, itd.). Njihovu kombinaciju i prikladnost određuje liječnik.

Uzročnici infekcije otkriveni PCR-om

Virusi:

1. retrovirusi HIV-1 i HIV-2
2. herpetiformni virusi
3. virus herpes simplex 1 i 2 vrste

Nedavno je pouzdan, vrlo osjetljiv i brza metoda dijagnoza raznih ljudskih zaraznih bolesti. Ova metoda se naziva "PCR analiza". Što je to, koja je njegova suština, koje mikroorganizme može identificirati i kako ga pravilno uzeti, reći ćemo vam u našem članku.

Povijest otkrića

PCR metode također se koriste u dijagnostici raka.

Prednosti metode

PCR dijagnostika ima niz prednosti:

1. Visoka osjetljivost. Čak i ako je prisutno samo nekoliko molekula DNA mikroorganizma, PCR analiza utvrđuje prisutnost infekcije. Metoda će pomoći kod kroničnih i latentnih bolesti. Često se u takvim slučajevima mikroorganizam inače ne može kultivirati.
2. Bilo koji materijal je prikladan za istraživanje, na primjer slina, krv, genitalni sekret, kosa, epitelne stanice. Najčešći je PCR test krvi i urogenitalni bris.

   

3. Nije potrebno dugotrajno uzgajanje usjeva. Automatizirani dijagnostički proces omogućuje dobivanje rezultata istraživanja nakon 4-5 sati.
4. Metoda je gotovo stopostotno pouzdana. Zabilježeni su samo izolirani slučajevi lažno negativnih rezultata.
5. Sposobnost identificiranja nekoliko vrsta patogena iz jednog uzorka materijala. To ne samo da ubrzava proces dijagnosticiranja bolesti, već i značajno smanjuje materijalne troškove. Često liječnik propisuje složeni PCR test. Trošak pregleda koji se sastoji od identifikacije šest patogena je oko 1500 rubalja.

Da bi rezultati bili pouzdani prilikom provođenja PCR studije, morate uzeti test, slijedeći preporuke za preliminarnu pripremu za dijagnozu:

1. Prije doniranja sline, trebate se suzdržati od jela i uzimanja lijekova 4 sata prije prikupljanja materijala. Neposredno prije postupka isperite usta prokuhanom vodom.
2. Gornja pravila treba se pridržavati i prilikom uzimanja uzorka s unutarnje površine obraza. Nakon ispiranja preporučuje se lagana masaža kože kako bi se oslobodio sekret žlijezde.
3. Urin se obično prikuplja kod kuće. Da biste to učinili, morate temeljito očistiti genitalije. U sterilnu plastičnu posudu treba sakupiti 50-60 ml urina. Kako bi se osigurala čistoća materijala, ženama se preporuča staviti tampon u rodnicu, a muškarcima povući kožni nabor što je više moguće. Materijal ne možete donirati tijekom menstruacije.
4. Da biste donirali spermu, morate se suzdržati od spolnog odnosa 3 dana prije prikupljanja materijala. Liječnici također savjetuju izbjegavanje odlaska u saunu i vruće kupke, pijenje alkohola i začinjene hrane. Trebali biste se suzdržati od mokrenja 3 sata prije testa.
5. Na primjer, ako se provodi PCR test na klamidiju, i ženama i muškarcima preporučuje se seksualni odmor 3 dana. 2 tjedna prije testa ne smijete uzimati antibakterijske lijekove. Tjedan dana morate prestati koristiti intimne gelove, masti, vaginalne čepiće i ispiranje. 3 sata prije testa trebate se suzdržati od mokrenja. Za vrijeme menstruacije materijal se ne uzima, tek 3 dana nakon prestanka krvarenja može se uzeti urogenitalni bris.

PCR tijekom trudnoće

Dok čekate bebu, mnoge spolno prenosive zarazne bolesti su izuzetno opasne normalan razvoj fetus Spolno prenosive bolesti mogu uzrokovati intrauterini zastoj u rastu, pobačaj ili prijevremeni porod te urođene mane djeteta. Stoga je izuzetno važno otići na rani stadiji pregled trudnoće PCR metodom. Test se mora polagati prilikom prijave - do 12 tjedana.



Materijal se prikuplja iz cervikalnog kanala posebnom četkom. Postupak je bezbolan i ne predstavlja opasnost za bebu. Obično se tijekom trudnoće provodi analiza na klamidiju metodom PCR, kao i na ureaplazmozu, mikoplazmozu, citomegalovirus, herpes i papiloma virus. Ovaj set pretraga naziva se PCR-6.

PCR za dijagnostiku HIV-a

Zbog činjenice da je metoda vrlo osjetljiva na promjene u tijelu i dijagnostičke uvjete, mnogi čimbenici mogu utjecati na rezultat. Stoga PCR analiza za HIV infekciju nije pouzdana metoda, njezina je učinkovitost 96-98%. U preostalih 2-4% slučajeva test daje lažno pozitivne rezultate.

Ali u nekim situacijama ne možete bez PCR dijagnostike HIV-a. Obično se provodi na osobama s lažno negativnim ELISA rezultatom. Takvi pokazatelji pokazuju da osoba još nije razvila antitijela na virus i ne mogu se otkriti bez višestrukog povećanja broja. Upravo se to može postići analizom krvi PCR metodom.

Takva dijagnostika je također neophodna za djecu u prvoj godini života rođenu od HIV pozitivne majke. Metoda je jedini način pouzdano utvrđivanje statusa djeteta.

PCR za dijagnosticiranje hepatitisa

Metoda lančane reakcije polimeraze omogućuje otkrivanje DNK virusa hepatitisa A, B, C mnogo prije stvaranja protutijela na infekciju ili pojave simptoma bolesti. Posebno je učinkovit PCR test za hepatitis C, budući da je u 85% slučajeva ova bolest asimptomatska i bez pravodobnog liječenja postaje kronična.



Pravovremeno otkrivanje patogena pomoći će u izbjegavanju komplikacija i dugotrajnom liječenju.

Sveobuhvatni PCR pregled

Sveobuhvatna PCR analiza: pretraga metodom polimezičke lančane reakcije koja uključuje istovremeno određivanje više vrsta infekcija: mycoplasma genitalium, mycoplasma hominis, Gardnerella vaginalis, candida, trichomonas, citomegalovirus, herpes tipa 1 i 2, gonoreja, papiloma virus. Cijena takve dijagnostike kreće se od 2000 do 3500 rubalja. ovisno o klinici, korištenim materijalima i opremi, kao i vrsti analize: kvalitativnoj ili kvantitativnoj. Liječnik će odlučiti koja je potrebna u vašem slučaju. U nekim slučajevima dovoljno je jednostavno odrediti prisutnost patogena, u drugima, na primjer, s HIV infekcijom, kvantitativni titar igra važnu ulogu. Kod dijagnosticiranja svih gore navedenih uzročnika, pregled se naziva "PCR-12 analiza".

Dekodiranje rezultata analize

Dešifriranje PCR analize nije teško. Postoje samo 2 indikatorske skale - “ pozitivan rezultat" i "negativan rezultat". Ako se otkrije patogen, liječnici mogu potvrditi prisutnost bolesti s 99% pouzdanosti i započeti liječenje pacijenta. Kod kvantitativne metode određivanja infekcije, brojčani pokazatelj otkrivenih bakterija bit će naznačen u odgovarajućem stupcu. Samo liječnik može odrediti stupanj bolesti i propisati potrebno liječenje.



U nekim slučajevima, na primjer, pri određivanju HIV infekcije metodom PCR, ako je rezultat negativan, postaje potrebno provesti dodatna ispitivanja kako bi se potvrdili dobiveni pokazatelji.

Gdje se mogu testirati?

Gdje napraviti PCR test: u javnoj klinici ili u privatnom laboratoriju? Nažalost, u općinskim zdravstvenim ustanovama oprema i metode često su zastarjeli. Stoga je bolje dati prednost privatnim laboratorijima s modernom opremom i visokokvalificiranim osobljem. Osim toga, u privatnoj klinici rezultate ćete dobiti mnogo brže.

U Moskvi mnogi privatni laboratoriji nude PCR testiranje na razne infekcije. Na primjer, u takvim klinikama kao što su "Vita", "Complex Clinic", "Happy Family", "Uro-Pro" provodi se PCR analiza. Cijena pregleda je od 200 rubalja. za identifikaciju jednog patogena.

Može se zaključiti da je dijagnoza zaraznih bolesti metodom PCR u većini slučajeva brz i pouzdan način otkrivanja uzročnika u tijelu u ranim fazama infekcije. Ali ipak, u određenim slučajevima vrijedi odabrati druge dijagnostičke metode. Samo stručnjak može odrediti potrebu za takvom studijom. Dešifriranje PCR analize također zahtijeva profesionalni pristup. Slijedite preporuke liječnika i nemojte sami uzimati nepotrebne pretrage.