Tradicionalna citogenetika kada se proučavao kariotip, uvijek je bio ograničen na razinu rezolucije trake. Čak i kada smo koristili metode visoke razlučivosti za diferencijalno bojenje kromosoma, samo smo otkrivali više vrpci na kromosomu, ali nismo bili sigurni da dolazimo do molekularne razine razlučivosti. Najnovija postignuća DNA tehnologija i citogenetika omogućile su korištenje FISH tehnika za analizu promjena u kromosomskoj DNA na molekularnoj razini. Molekularna citogenetika omogućila je revolucionarni napredak u citogenetici, omogućivši:

Analizirati strukturu DNA kromosoma u rasponu od 10-100 kilobaza;
dijagnosticirati interfazne stanice koje se ne dijele, što je imalo veliki utjecaj na prenatalnu dijagnostiku i preimplantacijsku genetičku dijagnostiku (PGD).

FISH tehnologija koristi DNA sondu koja veže ili žari specifične sekvence DNA unutar kromosoma. Denaturirana sonda se inkubira s nativnom DNA stanice, također denaturiranom u jednolančano stanje. Sonda zamjenjuje biotin deoksiuridin trifosfat ili digoksigenin uridin trifosfat timidinom. Nakon renaturacije izvorne DNA pomoću sonde, kompleks sonda-DNA može se detektirati dodatkom fluorokromom obilježenog biotin-vezujućeg avidina ili fluorokromom obilježenog anti-digoksigenina. Dodatno pojačanje signala može se postići dodavanjem antiavidina i proučavanjem dobivenog kompleksa pomoću fluorescentne mikroskopije. Označavanjem različitih DNA sondi s nekoliko različitih fluorokroma, moguće je istovremeno vizualizirati više kromosoma ili kromosomskih segmenata unutar jedne stanice kao raznobojne signale.

Mogućnost definiranja specifične genske segmente, prisutni ili odsutni na kromosomima, omogućili su dijagnosticiranje sindroma genske sekvence na razini DNA, kao i translokacije u interfaznim jezgrama, često u pojedinačnim stanicama.

Materijal za RIBA može poslužiti ili metafazni kromosomi jezgre dobivene iz stanica koje se dijele, ili interfazne jezgre iz stanica koje nisu u fazi diobe. Sekcije su prethodno tretirane RNazom i proteinazom kako bi se uklonila RNK koja bi mogla križno hibridizirati sa sondom i kromatinom. Zatim se zagrijavaju u formamidu kako bi se denaturirala DNK i fiksiraju ledeno hladnim alkoholom. Sonda se zatim priprema za hibridizaciju zagrijavanjem. Sonda i pripravak kromosoma se zatim pomiješaju i zatvore pokrovnim stakalcem na 37°C za hibridizaciju. Variranjem temperature inkubacije ili sastava soli hibridizacijske otopine može se povećati specifičnost vezanja i smanjiti pozadinsko označavanje.

Primjena fluorescentne in situ hibridizacije - FISH tehnologija

Učinkovitost FISH tehnologije je prvi put dokazano lokaliziranjem gena na . Uvođenjem fluorescentnog označavanja, hibridizacija in situ pokazala se nezamjenjivom za dijagnosticiranje kromosomskih abnormalnosti koje se ne mogu otkriti tradicionalne metode vezivanje. RIBE su također odigrale ključnu ulogu u jednom od najneobičnijih svjetskih otkrića. moderna genetika- genomski otisak.

Njegova razvojna tehnologija RIBA primljeni u tri oblika. Centromere ili alfa satelitske sonde karakterizira relativna kromosomska specifičnost i najčešće se koriste u genetici interfaznih stanica. Ove sonde generiraju donekle difuzne signale odgovarajuće snage u regiji centromera, ali ne hibridiziraju s kromosomima koji imaju slične sekvence centromera. Trenutno su razvijene sonde s jednom kopijom koje daju diskretni signal iz specifične vrpce kromosoma i izbjegavaju fenomen križne hibridizacije. Ove se sonde također mogu koristiti za određivanje broja kopija i specifičnih regija kromosoma za koje se sumnja da su povezani s određenim sindromom. Za prenatalnu dijagnostiku koriste se pojedinačne kopije i centromerne sonde dizajnirane za kromosome 13, 18, 21, X i Y.

Također je moguće "obojiti" cijele kromosome pomoću RIBA. Zahvaljujući tehnologiji spektralne kariotipizacije, koja koristi mješavinu različitih fluorokroma, sada je moguće stvoriti jedinstveni fluorescentni uzorak za svaki pojedinačni kromosom s 24 zasebne boje. Ova tehnologija omogućuje otkrivanje složenih kromosomskih preraspodjela koje nisu vidljive korištenjem tradicionalnih citogenetskih tehnika.

metoda RIBA u prenatalnoj dijagnostici. Za žene u poodmakloj reproduktivnoj dobi trudnoća može biti razlog ne toliko za radost koliko za zabrinutost. Dob žene povezana je s rizikom razvoja fetalnih kromosomskih abnormalnosti. Amniocenteza, koja se izvodi u 16. tjednu trudnoće, praćena analizom kariotipa traje 10-14 dana. Korištenje FISH-a u preliminarnom pregledu može ubrzati dijagnozu i smanjiti vrijeme čekanja. Većina genetičara i laboratorija mišljenja je da se FISH ne bi trebao koristiti izolirano za donošenje odluka o daljnjem vođenju trudnoće. FISH metoda mora biti dopunjena kariotipskom analizom, a njezini rezultati moraju barem korelirati s patološkom slikom ultrazvučni pregled(ultrazvuk) ili biokemijski probir pomoću krvi majke.

Genski sindromi sekvence također poznati kao sindromi mikrodelecije ili segmentalne aneuzomije. To su brisanja susjednih fragmenata kromosoma, koja obično uključuju mnoge gene. Sindromi slijeda gena prvi su put opisani 1986. godine klasičnim citogenetskim tehnikama. Sada je, zahvaljujući FISH-u, moguće identificirati submikroskopske delecije na razini DNK, što je omogućilo identificiranje najmanje izbrisane regije povezane s razvojem određenog sindroma, nazvane kritična regija. Nakon što se identificira kritična regija za sindrom, često je moguće identificirati specifične gene čija se odsutnost prepoznaje kao povezana sa sindromom. Nedavni priručnik o sindromima sekvenci gena navodi 18 sindroma brisanja i mikrodelecija povezanih s 14 kromosoma. Neki od najčešćih sindroma slijeda gena i njihovi kliničke manifestacije dati su u tablici. 5-2.

Telomeri- tvorbe koje prekrivaju krajeve dugih i kratkih krakova kromosoma. Sastoje se od ponavljajućih sekvenci TTAGGG i sprječavaju međusobno spajanje krajeva kromosoma. Telomerne sonde igraju važnu ulogu u prepoznavanju složenih translokacija koje se ne mogu otkriti tradicionalnim citogenetskim metodama. Osim toga, jedno od otkrića Projekta ljudskog genoma bila je činjenica da su regije kromosoma uz telomere bogate genima. Sada je pokazano da su submikroskopske subtelomerne delecije odgovorne za pojavu mnogih genetski uvjetovanih bolesti.

Određivanje statusa HER-2 tumora pomoću FISH-a- proučavanje predispozicije za razvoj tumora i odabir pravodobnog adekvatnog liječenja raka dojke (BC) ili raka želuca (GC).

HER-2 (HER-2/neu)- ljudski epidermalni faktor rasta receptor-2 je protein koji može utjecati na rast stanice raka. Stvara ga poseban gen koji se naziva HER-2/neu gen. HER-2 je receptor za određeni čimbenik rasta koji se zove ljudski epidermalni faktor rasta koji se prirodno pojavljuje kod ljudi. Kada se ljudski epidermalni faktor rasta veže za HER-2 receptore na stanicama raka dojke, može potaknuti te stanice na rast i dijeljenje. U zdravom tkivu HER-2 prenosi signale koji reguliraju staničnu proliferaciju i preživljavanje, ali prekomjerna ekspresija HER-2 može uzrokovati malignu transformaciju stanica.

Prekomjerna ekspresija HER-2 u nekim podtipovima raka dojke dovodi do povećane proliferacije i angiogeneze, disregulacije apoptoze (genetski programirano samouništenje stanica). Pokazalo se da je kod raka dojke prekomjerna ekspresija ovog receptora u tumorskom tkivu povezana s agresivnijim tijekom bolesti, povećanim metastatskim potencijalom tumora i manje povoljna prognoza. Otkriće veze između prekomjerne ekspresije HER-2 i nepovoljne prognoze za rak dojke dovelo je do potrage za pristupima liječenju koji su usmjereni na specifično blokiranje onkogena HER-2/neu (ciljana anti-HER2 terapija).

Rak dojke (BC) - maligni tumor žljezdano tkivo mliječna žlijezda. Rak dojke zauzima prvo mjesto među svim zloćudnim bolestima u žena.

Ovisno o prisutnosti bioloških markera tumora - izraženosti hormonskih receptora (estrogena i/ili progesterona), razlikuju se izraženost HER-2 - hormonski receptor-pozitivan, HER-2-pozitivan i trostruko negativan rak dojke.

HER-2/neu-pozitivne (HER-2+) tipove raka dojke karakterizira visoka ekspresija HER-2/neu proteina.
HER=2/neu-negativne (HER-2-) tipove raka dojke karakterizira niska ekspresija ili odsutnost HER-2/neu proteina.
Smatra se da jedna od pet žena s rakom dojke ima HER-2 pozitivan tumor. Većina karcinoma dojke je hormonski ovisna: estrogeni i progesteron na njih djeluju stimulativno (proliferativno i neoplastično). Kod HER-2 pozitivnog raka dojke postoji višak HER-2 receptora na površini tumorskih stanica. Ovaj fenomen naziva se "pozitivan HER-2 status" i dijagnosticira se u 15-20% žena koje boluju od raka dojke.

NJENA-2- receptor za ljudski epidermalni faktor rasta tipa 2, koji je normalno prisutan u tkivima, sudjeluje u regulaciji diobe i diferencijacije stanica. Njegov višak na površini tumorskih stanica (prekomjerna ekspresija) određuje brzi nekontrolirani rast tumora, visok rizik od metastaza i nisku učinkovitost nekih vrsta liječenja. HER-2 pozitivan rak dojke posebno je agresivan oblik ove bolesti, Zato precizna definicija HER-2 status je od ključne važnosti za izbor taktike liječenja.

Rak želuca (GC)- zloćudni tumor koji potječe iz epitela želučane sluznice.

GC zauzima 4. mjesto u strukturi incidencije raka i 2. mjesto u strukturi smrtnosti od raka u svijetu. Učestalost raka želuca kod muškaraca je 2 puta veća nego kod žena. Rusija je jedna od regija s visokom učestalošću raka želuca i smrtnosti od ove bolesti. Dijagnoza raka želuca na rani stadiji teško zbog dugog asimptomatskog tijeka bolesti. GC se često otkriva u kasnim fazama, kada petogodišnja stopa preživljavanja ne prelazi 5-10%, a kemoterapija ostaje jedina metoda liječenja.

Glavna metoda liječenja raka želuca je operacija. Međutim, kod većine bolesnika u trenutku postavljanja dijagnoze utvrđuje se raširen tumorski proces koji onemogućuje radikalnu operaciju i zahtijeva sustavnu terapija lijekovima. Kemoterapija statistički značajno povećava ukupno preživljenje bolesnika s metastatskim karcinomom, poboljšavajući njihovu kvalitetu života.

Onkogen HER-2 (erbB-2) prvobitno je identificiran u tumorima dojke. Amplifikacija i prekomjerna ekspresija ovog gena je relativno specifičan događaj za karcinome dojke i praktički se ne događa u tumorima drugih lokalizacija. Čini se da je rak želuca jedna od rijetkih iznimaka, s aktivacijom HER-2 opaženom u otprilike 10-15% maligne neoplazme ovog organa i korelira s agresivnim tijekom bolesti.

Prekomjerna ekspresija HER-2 faktor je loše prognoze. Prema različitim studijama, amplifikacija gena HER-2 kod bolesnika s rakom korelira s niskim ukupnim stopama preživljenja.

Za procjenu HER-2 statusa kod raka i raka dojke koristi se FISH metoda.

RIBA- istraživanja omogućuju određivanje kvalitativnih i kvantitativnih promjena kromosoma za dijagnostiku malignih bolesti krvi i solidnih tumora.

Danas se FISH studije široko koriste diljem svijeta.

FISH metoda (fluorescentna in situ hibridizacija) je studija broja HER-2/neu gena unutar stanica raka.

Indikacije:

• rak dojke - u svrhu prognoze i odabira terapije;
• rak želuca - u svrhu prognoze i odabira terapije.

Priprema
Određuje liječnik koji je pohađao.

Potreban je histološki protokol i imunohistokemijski protokol, IHC staklo.

Interpretacija rezultata
Rezultati FISH testa izražavaju se kako slijedi:

1. Pozitivan (povećan sadržaj, postoji amplifikacija HER-2 gena):

• HER-2 pozitivan rak dojke;

2. Negativno (nema amplifikacije gena HER-2):

• HER-2 negativan rak dojke.

Rak dojke - opasna bolest, koja je prema statistikama na prvom mjestu među karcinomskim bolestima kod žena. Rizik od razvoja ove bolesti povećava se kod svih žena starijih od 40 godina i može biti posljedica nekoliko drugih čimbenika. Najvjerojatniji uzroci raka dojke su pretilost, genetska ili nasljedna predispozicija, rani početak menstruacija i njen kasni završetak, hormonska ili zračna terapija.

Osim toga, rizik od morbiditeta je povećan kod prvorotkinja i žena koje su već imale rak. Muškarci također mogu dobiti rak dojke.

Vrste i metode dijagnoze

Prva faza dijagnosticiranja raka dojke je rutinski pregled kod mamologa. Žene starije od 40 godina trebale bi se podvrgnuti takvim pregledima najmanje jednom u dvije godine. Liječnik obavlja vizualni pregled, palpaciju i mamografiju mliječnih žlijezda. Vizualni znakovi razvoja bolesti mogu uključivati:

opće informacije

X-zraka dojke (mamografija) omogućuje određivanje prisutnosti, veličine i položaja tumora. Kako bi se povećala točnost dobivenih rezultata, koristi se tehnologija uvođenja kontrastnog sredstva. Ako je tumor već otkriven, tada se koristi metoda pneumocistografije - uklanjanje tumorske tekućine i uvođenje zraka u šupljinu. Ako prisutnost tumora nije navedena, tada se koristi duktografija - uvođenje kontrastnog sredstva u mliječne kanale.

Ove metode omogućuju vizualizaciju prisutnosti formacija u tkivu dojke.

Ako se mamografijom utvrdi i postojanje tumora, pacijentica dobiva uputnicu za niz dijagnostičkih mjera:

Koristeći ultrazvuk, liječnik može razlikovati tumor od ciste i razjasniti mjesto formacije. Nakon toga se iz njega uzima uzorak tkiva za biopsiju. Biopsija vam omogućuje da saznate vrstu tumora: benigni ili maligni, kao i da utvrdite je li tumor ovisan o hormonima. Ovi podaci omogućuju liječniku da odluči o strategiji liječenja, ali ne omogućuje uvijek određivanje stadija. Često, čak i sa svim potrebnim dijagnostičke aktivnosti može se utvrditi tek nakon operacije.

Mehanizam histoloških studija

Biopsija tkiva izvodi se prije i poslije operacije. Postupak se provodi nakon razjašnjenja lokalizacije formacije.

Biopsija je postupak uklanjanja dijela tkiva, a njezina se studija naziva "histološki pregled" ili jednostavno "histologija".

Medicinski radnik posebnom iglom uklanja malu količinu tkiva iz tumora ili se tumor koji je već izvađen iz tijela pacijenta šalje na histološki pregled. Zatim se fragment tkiva posebno boji i obrađuje kako bi se povećao kontrast i olakšalo proučavanje. Specijalist pregledava rez pod mikroskopom i daje mišljenje o kvaliteti tumorske formacije. Mnogo toga u ovoj studiji ovisi o pažljivosti i kvalifikacijama laboratorijskog tehničara koji daje zaključak.

Slična studija je imunohistokemija. Općenito, može se nazvati i "histologija", jer metoda se temelji na proučavanju tkiva, no imunohistokemija je naprednija metoda analize. U ovoj studiji tkivo se također boji posebnim reagensima, koji ne samo da pojačavaju vizualni kontrast, već se na poseban način spajaju („označuju“) s antitijelima, što omogućuje razjašnjavanje više karakteristika tumora. U ovom slučaju, reakcija se događa puno brže, što vam omogućuje brzo dobivanje rezultata analize.

Imunohistokemija omogućuje ne samo razjašnjavanje vrste tumora, već i planiranje strategije liječenja bolesnika na temelju utvrđivanja osjetljivosti tumorskog tkiva na različite vrste terapijski učinci. Osim toga, ova je studija što je više moguće automatizirana, što nam omogućuje da minimiziramo vjerojatnost dijagnostičke pogreške zbog ljudskog faktora.

Postoje i moderne dijagnostičke mjere koje omogućuju otkrivanje prisutnosti tumora u tijelu: ovo je spektralni test krvi, imunološka (biokemijska) analiza, FISH test tumorskog tkiva. Genetski test krvi omogućava svakoj ženi da provjeri ima li ili nema preduvjete za rak dojke. CT i MRI omogućuju točno određivanje lokacije tumora i praćenje dinamike njegovog razvoja, procjenu strukture tumora.

Kako pomoću testa krvi otkriti rak?

Krvnu pretragu obično propisuje liječnik nakon ultrazvučnog pregleda. Postoje situacije kada pacijent vlastitu inicijativu daruje krv za markere prozora ili genetsku analizu za prepoznavanje predispozicije za rak dojke. U nekim slučajevima opća analiza krv može biti razlog za kontaktiranje onkološke klinike (zajedno s palpacijom kvržice ili vizualnim znakovima raka).

Biokemijska analiza

Krv kao materijal za istraživanje omogućuje provođenje sljedećih dijagnostičkih mjera:

Istodobno, samo prve dvije analize mogu se nazvati specijaliziranim metodama za određivanje raka, od kojih je druga više preventivna nego operativna mjera. Dva druga krvna testa provode se uglavnom prije operacije kako bi se utvrdilo stanje tijela i opseg procesa. Međutim, kao što je već spomenuto, ako se u prsima osjeti kvržica, a opći test krvi pokazuje više od dva negativna dijagnostička koeficijenta, to je razlog da se obratite stručnjaku. Negativni koeficijenti su pokazatelji izvan norme u određenim parametrima sastava krvi.

Biokemijski test krvi može otkriti prisutnost protutijela na tumorske stanice. Takva se tijela nazivaju tumorski markeri. Broj i vrsta tumorskih markera ovisi o specifičnosti (lokalizaciji) kancerogen tumor i stupanj njegovog razvoja. Tumorski markeri uključuju:

U slučaju raka dojke, liječnika će prvenstveno zanimati prisutnost tumorskog markera CA-15-3, jer njegova prisutnost u krvi jasno ukazuje na rak dojke. Dekodiranje rezultata traje u prosjeku jedan dan. Biokemijska analiza provodi se nekoliko puta tijekom bolesti. Krv za to se uzima iz vene u prvoj polovici dana na prazan želudac. Dva tjedna prije testa pacijent prestaje uzimati sve lijekovi(treba potvrditi s liječnikom). Dva dana prije davanja krvi ne smijete piti alkohol, masnu i prženu hranu.

Jedan sat prije postupka ne smijete pušiti i poželjno je smanjiti emocionalni stres. Krv na biokemijska analiza Obično se ne uzimaju odmah nakon zračenja i fizioterapeutskog tretmana.

Određivanje genetskih čimbenika

Prije nego što govorimo o genetskom testiranju krvi, vrijedi naglasiti razliku između pojmova "genetski" i "nasljedno". Genetski faktor pojava raka je širi pojam koji ne podrazumijeva samo prisutnost srodnika s rakom dojke, već i specifičnu mutaciju gena koja povećava rizik od ove bolesti.

Nasljedstvo implicira potencijalni rizik od raka dojke na temelju obiteljske povijesti. U isto vrijeme, ne samo žene, već i muškarci mogu dobiti mutirani gen, ali njegov nositelj neće nužno oboljeti.

Svaka se žena može podvrgnuti genetskom testiranju. Ovo se posebno preporučuje osobama čiji su rođaci u izravnoj vezi bolovali od raka dojke. Prije davanja krvi za analizu, pacijent treba razgovarati sa stručnjakom iz područja genetike, koji će objasniti nijanse dešifriranja rezultata. Od pacijenta prije davanja krvi nije potrebna posebna priprema.

U slučaju primanja pozitivan rezultat Mutacije BRCA gena, ali u nedostatku drugih simptomi anksioznosti, nema mjesta panici. Ženama s mutacijama u ovim genima može se savjetovati da se podvrgnu redovitom samopregledu i fizičkim pregledima kao preventivnim mjerama. Nakon 40 godina ima smisla razmišljati o uklanjanju jajnika i dojki; mlađim ženama koje u budućnosti ne planiraju imati djecu ponekad se preporučuje uzimanje kontracepcijskih sredstava. Odluka o ovim mjerama u potpunosti je na plećima same žene i zahtijeva promišljen pristup i konzultacije s liječnicima.

Najnovije dijagnostičke metode

Spektralna analiza krv otkriva prisutnost tumora u tijelu s vjerojatnošću do 93%. Ovo je relativno jeftina dijagnostička metoda koja se temelji na ozračivanju krvnog seruma infracrvenim spektrom i analizi njegovog molekularnog sastava.

Zaključak o spektralnom testu krvi daje se prema principu "prisutnost-odsutnost" i usmjeren je na identifikaciju većine vrsta malignih tumora. Ovom pretragom se može odrediti i stadij razvoja raka dojke. Rezultati se dešifriraju u laboratoriju i ne zahtijevaju dodatno mišljenje liječnika.

Za davanje krvi za spektralnu analizu potrebno je prestati uzimati lijekove 2 mjeseca prije zahvata. Od trenutka rendgenskog ili drugog zračenja, kao i kemoterapije, mora proći najmanje 3 mjeseca. Osim toga, žena ne smije biti trudna ili imati menstruaciju u vrijeme uzimanja krvi. Uzimanje krvi vrši se na prazan želudac u prvoj polovici dana. Spektralni test krvi u prosjeku traje 12 radnih dana.

Jedan od najnovije metode Dijagnostika raka je takozvani “fish test” (FISH, fluorescentna hibridizacija). O njegovoj učinkovitosti još uvijek se raspravlja; glavno pitanje njegove izvedivosti je skupa istraživačka procedura. Bit metode je označavanje staničnih fragmenata fluorescentnim sastavom i daljnje mikroskopsko ispitivanje stanica. Na temelju toga s kojim su dijelovima genetskog materijala označeni fragmenti povezani, može se razumjeti ima li pacijent predispoziciju za rak i koje će metode liječenja biti relevantne u pojedinom slučaju.

FISH test ne zahtijeva potpuno zrele stanice, stoga je ovaj test mnogo brži od ostalih laboratorijskih testova. Osim toga, FISH metoda omogućuje jasnije promatranje genetskih oštećenja, što je nemoguće učiniti drugim vrstama analize. FISH test se najčešće koristi za otkrivanje raka dojke, ali također djeluje na otkrivanje nekoliko drugih vrsta raka.

Nedostaci FISH testa uključuju, osim visoke cijene, njegovu nemogućnost rada na nekim regijama kromosoma zbog specifičnosti oznaka. Osim toga, FISH test zanemaruje neke vrste mutacija i kvarova genetski kod, što može biti važan dijagnostički propust. Usporedna FISH studije s jeftinijim IHC testom nije pokazao nikakvu značajnu korist u određivanju osjetljivosti stanica raka na Herceptin. Ipak, FISH test trenutno je najbrža među vrlo preciznim metodama za dijagnosticiranje raka.

RIBA je jedan od najčudesnijih "alata" molekularna biologija XXI stoljeće. U predimplantacijskoj dijagnostici tehnika istraživanja FISH koristi se za otkrivanje kromosomskih abnormalnosti ili poremećaja sparivanja kromosoma u stanicama embrija tek dobivenog in vitro oplodnjom (IVF). Ako se ne otkriju anomalije ili znakovi aneuploidije (poremećaj sparivanja, nedostatak parova kromosoma), tada se "umjetni" embrij smatra održivim. Može se ugraditi u maternicu trudnice.

FISH također omogućuje praćenje spolnih karakteristika u nizu kromosoma embrija. To omogućuje određivanje spola nerođenog djeteta i prije stvarnog početka trudnoće (ako smatramo da ona počinje implantacijom izvantjelesno začetog embrija u maternicu).

Što je RIBA?

Skraćenica je skraćenica za: Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, ili fluorescentna in-situ hibridizacija. Prijepis najvjerojatnije neukom čitatelju ništa ne govori. Dakle, pogledajmo to složen koncept u dijelovima, ostavljajući neprevedeni "in-situ" za kraj.

Hibridizacija

U molekularnoj biologiji ovaj izraz ima vrlo posebno značenje koje nema nikakve veze s križanjem vrsta u "običnoj" biologiji.

Hibridizacija je molekularna genetička tehnika koja se koristi za procjenu stanja DNA i RNA stanica koje se proučavaju. Temelji se na povezivanju pojedinih lanaca nukleinskih kiselina u jednu molekulu. Na taj se način provjerava komplementarnost (međusobna podudarnost) molekula ili njihovih fragmenata međusobno. Uz potpunu komplementarnost, lanci se lako i brzo spajaju u zajedničku molekulu. Sporo unificiranje ukazuje na nedovoljnu komplementarnost. Nekomplementarnost lanaca je upravo zbog kromosomskih abnormalnosti (kršenja u redoslijedu kromosoma u određenim područjima), nesparenih kromosoma ili nepostojanja nekih parova.

"Alat" za mjerenje komplementarnosti je temperatura na kojoj se DNK lanci hibridiziraju u zajedničku molekulu. Da biste to učinili, prvo je potrebno zagrijati pripravak nukleinske kiseline, a zatim ga, nakon miješanja s drugim zagrijanim pripravkom, ohladiti. Zagrijavanjem nestaju vodikove veze između lanaca DNA ili RNA i nastaju jednolančani fragmenti molekula. Mješoviti pripravci dviju DNA ili RNA (ili DNA - RNA) se ohlade. Kada se ohladi, vodikove veze između komplementarnih baza brzo se obnavljaju i nastaje jedna, hibridna molekula DNA (RNA ili DNA - RNA). S nedostatkom komplementarnosti, proces traje dulje, nekomplementarni fragmenti ostaju nevezani. Posljedično, što je viša temperatura hibridizacije, to je harmoničnija i ispravnija kromosomska struktura stanica. Što je niža temperatura, više je abnormalnosti u kromosomima. Na temelju analize nekomplementarnih ostataka mogu se identificirati specifične anomalije ili područja aneuploidije.

Fluorescentno označavanje

Za analizu komplementarnosti hibridizirajuće molekule DNA (ili RNA) koriste se posebne genetske sonde (ili DNA sonde), koje, naravno, također nemaju mnogo zajedničkog sa svojim imenjacima koji se koriste, primjerice, u kirurgiji.

Genetske sonde su sintetizirane i posebno označene jednolančane DNA (rjeđe RNA) s unaprijed određenim svojstvima komplementarnosti. Kod hibridizacije se stapaju s određenim genetskim fragmentima, čime se potvrđuje njihova komplementarnost. Položaj sondi u hibridiziranoj molekuli ukazuje na normalnu ili neispravnu strukturu izvornog kromosomskog materijala od kojeg je ta "umjetna struktura" sastavljena.

Genetske sonde posebno su označene svjetlećim (fluorescentnim) tvarima, što ih čini vidljivima pod lećom posebnog fluorescentnog mikroskopa.

Korištenje različitih boja za nekoliko sondi omogućuje istodobnu analizu različitih genetskih struktura, na primjer, identificiranje regija kromosoma s dva gena koja su postavljena jedan na drugi i drugih anomalija.

Trenutno se u jednoj analizi genetske sonde označavaju s pet do šest različitih boja, ponekad čak i sa sedam.

In-situ znači "kod kuće"

Izvorna tehnika hibridizacije bila je glomazna. Ekstrahirana DNA je denaturirana u posebnim toplinskim puferima i pomiješana u centrifugi s ostalim denaturiranim fragmentima. Hibridizacija je također provedena u laboratoriju, "u kemijskoj posudi".

Suvremena tehnologija omogućuje provođenje analiza in situ, odnosno „na licu mjesta“, „kod kuće“, u izvornim genetskim strukturama, a ne u laboratorijskim pripravcima. Objekti istraživanja bile su same stanične jezgre (ekstrahirane tijekom biopsije polarnih tijela, blastomera i površinskih stanica blastociste).

Promatranje genetskog materijala izravno u staničnoj jezgri ubrzava proces, čini ga „čišćim“, oslobođenim vanjskih utjecaja i oštećenja, što nije isključeno u proizvodnji laboratorijskih lijekova.

Postoje, međutim, problemi koji ukazuju na nepremostive granice ovu metodu. Jedna hibridizacija ne može "pokriti" cijeli set kromosoma u stanicama. Obično su potrebne dvije ili tri sekvencijalne hibridizacije, koje omogućuju proučavanje 12-15 parova kromosoma (a kod ljudi ih ima 23). Sposobnost daljnje hibridizacije lanaca DNA postupno se smanjuje nakon svake rehibridizacije. To ne dopušta da se hibridizacija provodi "onoliko puta koliko se želi" za iscrpnu analizu istog genetskog materijala.

Invazivne metode prenatalne dijagnostike omogućuju ne samo gledanje u budućnost i pouzdano predviđanje hoće li se nerođeno dijete suočiti s bolestima povezanim s intrauterinim malformacijama, već i otkrivanje prirode i uzroka kongenitalnih patologija.

No svaka informacija je vrijedna samo ako je pravovremena. Ako govorimo o o stanju razvoja fetusa, brzina dobivanja rezultata ispitivanja postaje od vitalne važnosti.

Stoga je FISH metoda, koja nam omogućuje da što je više moguće procijenimo prisutnost najčešćih razvojnih anomalija u embriju. kratko vrijeme, vrlo je tražen u genetskoj dijagnostici.

FISH je skraćenica koja dešifrira bit tehnologije za detekciju kromosomskih abnormalnosti - fluorescence in situ hybridization - fluorescentna hibridizacija u “kućnom” okruženju.

Ova tehnika, koju su krajem 70-ih godina prošlog stoljeća predložili J. Goll i M.-L. Pardew, temelji se na mogućnosti vraćanja sekvence fragmenata nukleinske kiseline (DNA ili RNA) nakon njihove denaturacije.

Autori su razvili metodu koja omogućuje, koristeći in situ hibridizaciju umjetno stvorenih obilježenih DNA sondi (sondi) i citogenetskog materijala uzetog za analizu, identificirati kvantitativne i kvalitativna odstupanja kromosoma od interesa.

Krajem prošlog stoljeća, nakon uspješne primjene fluorescentnih boja za bojenje DNA sondi, FISH metoda je dobila ime i od tada se intenzivno usavršavala i varirala.

Suvremene tehnike analize FISH nastoje osigurati da je u jednom postupku hibridizacije moguće dobiti što cjelovitiju informaciju za analizu odabranog genetskog materijala.

Činjenica je da se jednom nakon hibridizacije može procijeniti samo ograničeni broj kromosoma istog citogenetskog materijala. Sposobnost re-hibridizacije DNA lanaca se s vremena na vrijeme smanjuje.

Stoga se trenutno u genetskoj dijagnostici najčešće koristi metoda in situ hibridizacije kako bi se brzo odgovorilo na pitanja o postojećim, najčešćim aneuploidijama na kromosomima 21, 13, 18, kao i na spolnim kromosomima X, Y.

Svi uzorci tkiva ili stanica prikladni su za FISH analizu.

U prenatalnoj dijagnostici to mogu biti uzorci krvi, ejakulata ili.

Brzina dobivanja rezultata je osigurana činjenicom da stanice dobivene iz materijala uzetog za analizu nije potrebno uzgajati u hranjivim medijima, postižući njihovu podjelu na potreban broj, kao u klasičan način kariotipizacija.

Odabrani materijal prolazi posebnu pripremu kako bi se dobila koncentrirana suspenzija čistih stanica. Zatim se provodi proces denaturacije DNK uzorka i nativne DNK uzorka koji se proučava do jednolančanog stanja i proces hibridizacije, tijekom kojeg se obojene DNK sonde inkubiraju s DNK uzorka.

Tako se vizualiziraju željeni (obojeni) kromosomi u stanici, procjenjuje se njihov broj, struktura genetskih struktura itd. Okular posebnog fluorescentnog mikroskopa omogućuje pregled svjetlećih lanaca DNK.

Trenutno se FISH metoda široko koristi u dijagnostičke svrhe za identifikaciju genetske bolesti, kromosomske aberacije u reproduktivnoj medicini, onkologiji, hematologiji, biološkoj dozimetriji itd.

Kako se koristi FISH dijagnostika fetusa?

U području reproduktivne medicine FISH metoda, kao jedna od metoda molekularne citogenetičke dijagnostike, koristi se u svim fazama.

• par.

Da bi se odredio kariotip budućih roditelja, provodi se jednom, budući da ljudski genom ostaje nepromijenjen tijekom života.

Kariotipizacija para prije začeća djeteta pomoći će utvrditi jesu li roditelji nositelji genetskih patologija koje su naslijeđene, uključujući skrivene. I opće stanje genom buduće majke i oca, što može utjecati na uspješnost začeća djeteta i iznošenja trudnoće do termina.

Dijagnostika pomoću metode FISH u ovom slučaju često djeluje kao dodatni pregled na klasičnu kariotipizaciju, pri identificiranju kromosomskih patologija u ispitivanom materijalu (venska krv roditelja), ako postoji sumnja na mozaicizam.

Dodatni pregled metodom FISH pouzdano će potvrditi ili opovrgnuti postojanje sumnje na anomaliju u stanicama budućeg roditelja.

• Studija ejakulata.

Indiciran kod poteškoća s reprodukcijom u paru zbog "muškog faktora". Analiza sjemena pomoću metode FISH omogućit će vam procjenu razine abnormalnosti kromosomski set sperme, te također utvrditi je li muškarac nositelj genetskih bolesti povezanih sa spolom.

Ako par naknadno pribjegne začeću IVF-om, FISH analiza ejakulata omogućit će odabir najkvalitetnije sperme za oplodnju jajašca.

• Uz IVF.

Za predimplantacijsku genetsku dijagnostiku (PGD). Na temelju rezultata istraživanja kariotipa roditelja utvrđuju se moguće kromosomske i genetske aberacije koje se mogu prenijeti na embrij.

Zahvaljujući mogućnostima FISH dijagnostike, istraživanje genetskog zdravlja nastalih embrija može se provesti u roku od nekoliko sati prije prijenosa u šupljinu maternice kako bi se osigurala trudnoća s poznatim zdravim fetusom.

Osim toga, mogućnosti PGD-a omogućuju određivanje spola embrija, a time i "naručivanje" spola nerođenog djeteta, ako je potrebno.

• Tijekom trudnoće.

U prenatalnoj dijagnostici: analiza fetalnih stanica dobivenih biopsijom korionskih resica, amniocentezom ili kordocentezom metodom FISH obično se nudi u medicinskim centrima uz klasičnu genetsko istraživanje fetalne stanice (kariotipizacija).

Ova metoda je nezamjenjiva kada je potrebno brzo dobiti odgovor o prisutnosti najčešćih kromosomskih grešaka u fetusa: trisomija na kromosomima 21, 18, 13, aberacije na kromosomima X i Y, ponekad i aneuploidije na kromosomima 14 (ili 17), 15, 16.

Prednosti FISH analize

Provođenje genetske analize metodom FISH, iako je danas ostala pomoćna metoda za dijagnosticiranje kromosomskih patologija, izvedivost njezine provedbe određena je neospornim prednostima:

• brzina dobivanja rezultata za testirane kromosome je unutar nekoliko sati - ne više od 72.

To može biti važno ako sudbina trudnoće ovisi o dijagnozi genetičara;

• visoka osjetljivost i pouzdanost metode FISH - uspješna analiza moguća je na zanemarivoj količini biomaterijala - dovoljna je jedna stanica, pogreška rezultata nije veća od 0,5%.

Ovo može biti važno kada je broj stanica u izvornom uzorku ograničen, na primjer, kada je njihova dioba loša.

• mogućnost provođenja dijagnostike metodom FISH u bilo kojoj fazi trudnoće (od 7. tjedna) i korištenjem bilo kojeg biološkog uzorka: fragmenti koriona, amnionska tekućina, fetalna krv itd.

Gdje mogu postaviti dijagnozu metodom FISH?

U Moskvi se FISH metoda za prenatalnu dijagnostiku kromosomskih abnormalnosti fetusa koristi u sljedećim medicinskim centrima:

Poliklinike u pravilu uz nadoplatu nude usluge FISH dijagnostike u sklopu kompletne kariotipizacije fetusa invazivnom intervencijom. I u pravilu budući roditelji pristaju na nadoplatu jer zahvaljujući FISH metodi u samo nekoliko dana možete saznati najvažnije o svojoj bebi