Imuninės reakcijos. Imuninių reakcijų taikymas diagnostikoje užkrečiamos ligos.
PLANAS:
Imuninių reakcijų tipai.
Serologinių reakcijų atlikimo sąlygos.
Serumo reikalavimai.
Teigiamų ir neigiamų rezultatų samprata.
PAGRINDINIS TURINYS:
Imuninių reakcijų tipai.
Imunologinė reakcija – Tai antigeno sąveika su antikūnu, kurią lemia specifinė antikūno (paratopo) aktyviųjų centrų sąveika su antigenų epitopais.
Bendra imunologinių reakcijų klasifikacija:
serologinės reakcijos - reakcijos tarp antigenų (Ag) ir antikūnų (Ig)
in vitro ;
ląstelių reakcijos dalyvaujant imunokompetentingoms ląstelėms;
alergijos testai – padidėjusio jautrumo nustatymas.
Serologinės reakcijos: 1) apibrėžimas, 2) fazės, 3) tikslai, 4) bendra klasifikacija.
1) Apibrėžimas
Serologiniai metodai tyrimai (iš lot. Serum – serumas ir logotipai – mokymas), naudojant antigeno-antikūno reakciją.
2) Fazės
2 sąveikos fazės:
aš. Specifinis (matomas) – atsiranda greitai, antikūnai susijungia su atitinkamais antigenais. Šios fazės metu determinantinės antigenų grupės (AG) ir aktyvieji antikūnų centrai (AT) sąveikauja.
Jėgos, susijusios su AG + AT komplekso formavimu, yra šios:
pakabukas;
van der Waalsas
Vandenilinės jungtys.
Šiame etape jokių matomų pokyčių nėra. Elektroninė mikroskopija parodo AG+AT kompleksą gardelės pavidalu.
II. Nespecifinis – vyksta lėtai, susidaręs antigeno-antikūno kompleksas reaguoja su papildomu nespecifiniu aplinkos veiksniu, kuriame vyksta reakcija, ir tai matoma akiai – klijavimas, tirpimas, kritulių dribsniai ir pan.. Esant elektrolitui, krūvis mažėja , tirpumas mažėja, susidaro matomi konglomeratai, nusodinami (agliutinatai).
3) Tikslų nustatymas :
a) nustatyti antigeną (žinomas antikūnų diagnostinis serumas):
serologinis identifikavimas (rūšies identifikavimas);
serotipavimas (serovaro nustatymas) – padermės nustatymas;
patologinėje medžiagoje (greita diagnostika);
grynojoje kultūroje:
b) aptikti antikūnus (Ig) (antigenas žinomas – diagnostinis):
buvimas (kokybinės reakcijos);
kiekiai (titro padidėjimas – „suporuoto serumo“ metodas).
4) Bendroji klasifikacija serologinės reakcijos :
a) paprastas (dviejų komponentų: Ag+Ig):
RA agliutinacijos reakcijos (su korpuskuliniu antigenu);
PR nusodinimo reakcijos (su tirpiu antigenu);
b) kompleksas (3 komponentų: Ag+Ig+C);
c) naudojant žymą.
Agliutinacijos ir kritulių reakcijų variantai
Agliutinacijos reakcija :
Agliutinacijos reakcija (RA) - imuninė reakcija antigenų (eritrocitų, bakterijų) suspensijos sąveika su antigenais druskos tirpalas.
Agliutinacijos metu AT dalelės sulimpa, sudarydamos flokuliuojančias nuosėdas.
Reakcija pasyvi hemagliutinacija(RPGA) yra agliutinacijos reakcijos tipas, kai naudojamas antikūnas arba antigenas eritrocitų diagnostika (eritrocitai, kurių paviršiuje yra adsorbuota AT arba AG).
Raudonieji kraujo kūneliai šioje reakcijoje veikia kaip pasyvūs nešėjai.
RPGA rezultatų vertinimas atliekamas taip:
- adresu teigiama reakcija pasyviai prilipę raudonieji kraujo kūneliai padengia U arba V formos skylės dugną lygiu sluoksniu su šukuotais kraštais („skėtis“);
- adresu neigiama reakcija (nesant agliutinacijos), raudonieji kraujo kūneliai kaupiasi centrinėje skylės įduboje, sudarydami kompaktišką „mygtuką“ su aiškiai apibrėžtais kraštais.
Diagnozei atlikti naudojamas hemagliutinacijos slopinimo testas (HIT). virusinės infekcijos. Kai kurių virusų paviršiuje yra baltymo, vadinamo hemagliutininu, kuris sujungia raudonuosius kraujo kūnelius. Pridėjus specifinių antivirusinių antikūnų, virusinis hemagliutininas blokuojamas – hemagliutinacijos nėra.
Netiesioginė hemagliutinacijos reakcija (IRHA) arba Kumbso reakcija naudojama nepilniems antikūnams nustatyti. Antiglobulino serumo (AT prieš žmogaus Ig) pridėjimas sustiprina reakcijos rezultatus. Rh faktoriui nustatyti naudojamas RNGA.
Norint atlikti agliutinacijos reakciją (RA), reikalingi trys komponentai:
1) antigenas (agliutinogenas) AG;
2) antikūnas(agliutininas) AT;
3)
elektrolitas
(izotoninis natrio chlorido tirpalas).
Ag + AT + elektrolitas = agliutinatas
Agliutinacija (iš lot. agglutinatio – klijavimas) – kraujo kūnelių (bakterijų, raudonųjų kraujo kūnelių ir kt.) klijavimas antikūnais, esant elektrolitams – natrio chloridui.
RA pasireiškia dribsnių arba nuosėdų pavidalu, susidedančių iš kūnelių (pavyzdžiui, bakterijų, raudonųjų kraujo kūnelių), „sulipdytų“ antikūnais.
RA naudojamas:
Tiesioginė mikrobų agliutinacijos reakcija (RA).
Šios reakcijos metu antikūnai (agliutininai) tiesiogiai agliutinuoja korpuskulinius antigenus (agliutinogenus).
Paprastai juos vaizduoja inaktyvuotų mikroorganizmų suspensija (mikrobinė agliutinacijos reakcija).
Norėdami nustatyti mikroorganizmų tipą, naudokitestandartinė diagnostinė agliutinacija serumas ( garsus AT ).
Labiausiai paplitęs yra sluoksninis (apytikslis) ir išplėstas RA.
Plokštelė RA dedama ant stiklo. Jis naudojamas kaip pagreitintas antikūnų nustatymo arba mikroorganizmų nustatymo metodas.
Komponentai:
1. standartiniai diagnostiniai agliutinuojantys serumai (AT);
2. grynoji kultūra, tiriama iš paciento;
3. druskos tirpalas.
Tiriamoje grynojoje kultūroje antigenai (AG) yra dalelių (mikrobinių ląstelių, eritrocitų ir kitų korpuskulinių antigenų) pavidalo, kurios antikūnais suklijuojamos ir susidaro nuosėdos.
Pavyzdys:
Inscenizacija orientacinis agliutinacijos reakcijos (RA ) ant stiklo siekiant nustatyti koliformines bakterijas.
Užlašinkite lašus ant stiklelio:
1
dizenterija
;
2
-tas lašas: - agliutinuojantis serumas prieš patogenusvidurių šiltinės
;
(1–2 diagnostiniai serumai)
3
-tas lašas: - druskos tirpalas (kontrolė).
Į kiekvieną lašą įlašinkite išbandytos grynos bakterijų kultūros. Išmaišykite.
Rezultatas
:
teigiamas
- agliutinato dribsnių buvimas,
neigiamas
- agliutinato dribsnių nebuvimas
Išvada:Tirtos bakterijos yra vidurių šiltinės sukėlėjai (nustatyti antigenai).
Norint nustatyti AT paciento serume (serologinė diagnozė), standartinis mikrobasdiagnostika , kurių sudėtyje yra suspensijosgarsus mikrobai ar jų antigenaiAG .
ABO kraujo grupių nustatymas (hemagliutinacijos reakcija (HRA)) – agliutinuoja raudonuosius kraujo kūnelius.
Reakcijos komponentai:
1. AG (raudonieji kraujo kūneliai) tiria kraują
2. AT (eritrotestai – zoliklonai)
Zoliclonų rinkinys:
Coliclone anti-A reagentas (rožinis)
Coliclone anti-B reagentas (mėlynas)
Reagentas Tsoliklon anti-AV (bespalvis)
3. elektrolitas (fiziologinis tirpalas)
Nustatymo technika:
1
.
Ant tabletės šulinėlių (kontrolei) užlašinamas vienas lašas (0,1 ml) anti-A, anti-B ir anti-AB zolikono.
2.
Šalia kiekvieno reagento lašelio užlašinamas nedidelis (0,05-0,01 ml) lašelis tiriamo kraujo.
Tada zoliklono lašas sumaišomas su kraujo lašeliu, naudojant atskirą švarų stiklinį strypą.
3.
Agliutinacijos reakcija išsivysto per pirmąsias 3-5 sekundes, kai lėkštė švelniai siūbuojama.
Į reakcijos rezultatus atsižvelgiama praėjus 2,5–3 minutėms po lašų sumaišymo. Iš kairės į dešinę šuliniuose yra anti-A, anti-B, anti-AB.
Teigiamas rezultatas yra granuliuotų nuosėdų (agliutinato) atsiradimas.
teigiamas RA (+)
Neigiamas – nėra nuosėdų.
neigiamas RA(-)
4.
Rezultatų analizė.
O(aš) α β – nėra agliutinacijos
A(II) β – agliutinacija su anti-A
B(III) α – agliutinacija su anti-B
AB(IV)O – agliutinacija su anti-A, su anti-B
Scheminis agliutinacijos vaizdas.
Ag antigenai ant eritrocitų (aptinkami) + antikūnasAT(zoliklonas) diagnostinis serumas
Agliutinacijos tabletėse apskaita
Kritulių reakcija:
Nusodinimo reakcija yra imuninė reakcija, kai sąveikauja tirpus antigenas su antigenu fiziologiniame tirpale.
Kritulių metu susidaro stambiamolekulinis imuninis kompleksas, pasireiškiantis skaidraus koloidinio tirpalo perėjimu į nepermatomą suspensiją arba nuosėdas.
Abiejų reagentų kiekis turi būti griežtai apibrėžtas, nes vieno iš jų perteklius sumažina rezultatą.
Egzistuoti įvairių būdų nusodinimo reakcijos inscenizavimas.
1. Žiedo nusodinimo reakcija vykdoma mažo skersmens nusodinimo vamzdeliuose. Į mėgintuvėlį įpilamas imuninis serumas, o tirpus antigenas atsargiai sluoksniuojamas. AG ir AT susimaišo dėl šiluminio molekulių judėjimo ir sąveikauja. At teigiamas rezultatas ties dviejų tirpalų riba susidaro nepermatomų nuosėdų žiedas.
2. Ouchterlony dvigubos imunodifuzijos reakcija atliekama agaro gelyje, į kurio šulinėlius pagal schemą pilamas arba AG tirpalas, arba AT tirpalas. AG ir AT difunduoja į gelį vienas kito link ir, jei reakcija yra teigiama, sudaro imuninius kompleksus, matomus kaip kritulių linijos.
Kritulių reakcija -tai formavimasir tirpaus molekulinio antigeno-antikūno komplekso nusodinimas kaip debesis, vadinamas nuosėdomis. Jis susidaro sumaišius antigenus ir antikūnus lygiaverčiais kiekiais.
RA komponentai:
nusodinantis serumas (žinomas AT-precipitinas);
tiriamasis serumas (nežinomas precipitinogeno antigenas);
fizinis Sprendimas.
Nusodinimo reakcija atliekama specialiuose siauruose mėgintuvėliuose (žiedo nusodinimo reakcija), arba Petri lėkštelėse gelyje, maistinėse terpėse ir kt.
Žiedo-kritimo reakcija
Reakcijos rezultatų pareiškimas ir užrašymasžiediniai krituliaipatogenų aptikimui juodligė(Ascoli reakcija).
Inscenizacija .
1. Tiriama medžiaga (oda, vilna, veltinis, šeriai, audinys, mėsa, dirvožemis, gyvūnų išmatos ir kt.) virinama druskos tirpale 5-45 minutes. izotoniniam ekstraktui (ekstraktui) gauti. Filtruojama.
2. Nusodinamas serumas nuo juodligės supilamas į mėgintuvėlį.
3. Atsargiai uždėkite ant jo tiriamąją medžiagą (ekstraktą).
Apskaita .
Per kitas 10 minučių. Teigiamais atvejais serumo ir ekstrakto sąsajoje atsiranda drumstumo žiedas (žiedo nusodinimas). Ascoli reakcija yra labai jautri ir specifinė
Su jo pagalba galima greitai atpažinti juodlige užkrėstas medžiagas.
Nusodinimo reakcija agare
Rezultatų pareiškimas ir registravimasnusodinimo reakcijos agarekorinebakterijų (difterijos sukėlėjų) toksiškumui nustatyti
Inscenizacija
Dedamas ant fosfato peptono agaro Petri lėkštelėje.
1. Išilgai puodelio vidurio uždėkite sterilaus filtravimo popieriaus juostelę, sudrėkintą.antitoksinis serumas.
2. Po džiovinimo 1 cm atstumu nuo juostelės krašto sėjamos 10 mm skersmens plokštelėspasirinktos kultūros.
Viename puodelyje galite pasėti nuo 3 iki 10 pasėlių, iš kurių vienąkontrolė, turi būti žinomatoksiškas.
Pasėliai dedami į termostatą.
Apskaita
Analizė atliekama po 24-48-72 valandų.
Teigiamas rezultatas – (kultūratoksiškas) - pasirodo tam tikru atstumu nuo popieriaus juostelėsnuosėdų linijos, « ūselių strėlės“, kurie aiškiai matomi sklindančioje šviesoje.
Paveiksle parodyta nusodinimo reakcija agare, siekiant nustatyti difterijos bacilų toksiškumą. Vidutinės kultūros nesudarė „strėlių ūselių“, tai nėra toksikogeniniai patogenai.
Difterijos sukėlėjo padermės gali būti toksinės (gamina egzotoksiną) ir netoksigeninės. Egzotoksino susidarymas priklauso nuo to, ar bakterijose yra profago, turinčio toksinio geną, koduojantį egzotoksino susidarymą.
Susirgus visų difterijos sukėlėjų toksiškumas yra tiriamas – difterijos egzotoksino gamyba naudojant nusodinimo reakciją agare.
Sudėtingos serologinės reakcijos ( 3 komponentai: Ag+Ig+C):
Komplemento fiksavimo reakcija (CFR).
Reakcija vykdoma dviem etapais.
Pirmajame etape AT sąveikauja su antigenu ir komplementu, antrajame etape pridedamas indikatorius - hemolizinė sistema (eritrocitų ir antieritrocitų serumo mišinys).
Jei rezultatas yra teigiamas, pirmajame etape antikūnai sudaro imuninį kompleksą su antigenais, kurie sujungia reakcijos mišinio komplementą.
Tokiu atveju hemolizinės sistemos raudonieji kraujo kūneliai, įtraukti į antrąjį etapą, nesunaikinami.
Priešingu atveju nesurištas komplementas sukelia raudonųjų kraujo kūnelių indikatorių lizę.
Jai atlikti reikalingi penki ingredientai: AG, AT ir komplementas (pirmoji sistema), avies eritrocitai ir hemolizinis serumas (antroji sistema) (1 pav.).
Reakcija vyksta dviem fazėmis (3 pav.).
Pirma fazė - antigeno ir antikūnų sąveika su privalomu komplemento dalyvavimu.
Antra - reakcijos rezultatų nustatymas naudojant indikatorinę hemolizinę sistemą (avies raudonuosius kraujo kūnelius ir hemolizinį serumą). Raudonieji kraujo kūneliai sunaikinami hemoliziniu serumu tik tada, kai į hemolizinę sistemą pridedamas komplementas. Jei komplementas anksčiau buvo adsorbuotas ant antigeno-antikūno komplekso, tada eritrocitų hemolizė nevyksta (pav.).
Patirties rezultatas
įvertintas (2 pav.), atkreipiant dėmesį į hemolizės buvimą ar nebuvimą visuose mėgintuvėliuose. Reakcija laikoma teigiama, kai hemolizė visiškai uždelsta, kai skystis mėgintuvėlyje yra bespalvis ir raudonieji kraujo kūneliai nusėda į dugną, neigiama - kai raudonieji kraujo kūneliai visiškai lizuojami, kai skystis yra intensyvios spalvos („lakuoja“ kraują). ).
Hemolizės uždelsimo laipsnis vertinamas atsižvelgiant į skysčio spalvos intensyvumą ir raudonųjų kraujo kūnelių nuosėdų dydį apačioje (++++, +++, ++, +).
Ryžiai. 4. RSC pareiškimas ir rezultatas.
Išvada:Tiriamame serume buvo aptikta antikūnų.
RSK leidžia aptikti bet kurio to paties viruso serotipo padermės antikūnus.
Diagnostinė vertė turi:
keturis kartus padidėjęs antikūnų titras suporuotuose serumuose (gripo epidemijos metu);
pacientų, kuriems būdingas klinikinis vaizdas, kraujo serumo padidėjimas dvigubai.
Reakcijos naudojant žymą :
Šie metodai yra labai jautrūs. Antigenams ar antikūnams žymėti naudojami dažai, radioaktyvieji izotopai, fermentai ir kt.
RIF – imunofluorescencinė reakcija
Imunofluorescencinė reakcija pagrįsta šviesa antigeno-antikūno komplekso indikacija
Susietas imunosorbento tyrimas.
Modernus laboratorinis tyrimas, kurios metu atliekama specifinių antikūnų kraujyje ar specifinių ligų antigenų paieška, siekiant nustatyti ne tik etiologiją, bet ir ligos stadiją.
ELISA rezultatai gali būti pateikti kokybiškai ir kiekybiškai.
Šiuo metu ELISA yra naudojamas šiose situacijose:
1) ieškoti specifinių antikūnų prieš bet kurią infekcinę ligą;
2) bet kokių ligų (infekcinių, venerologinių) antigenų paieška;
3) paciento hormoninės būklės tyrimas;
4) naviko žymenų tyrimas;
5) tyrimas dėl autoimuninių ligų buvimo.
Paveikslėlyje kietosios fazės ELISA rodo žinomus antigenus (kairėje), adsorbuotus plokštelės duobutėje, (dešinėje) plokštelės šulinėliuose žinomus antigenus.
ELISA metodo pranašumai:
1) Didelis ELISA metodo specifiškumas ir jautrumas (daugiau nei 90%).
2) Gebėjimas nustatyti ligą ir sekti proceso dinamiką, tai yra lyginti antikūnų skaičių skirtingais laikotarpiais.
3) ELISA diagnostikos prieinamumas bet kurioje gydymo įstaigoje.
Santykinis trūkumas: imuninio atsako (antikūnų), bet ne paties patogeno, konjuguoto su žymės fermentu, aptikimas.
ELISA testas (bendras mechanizmas):
Fermentinio imunologinio tyrimo pagrindas yra antigeno ir antikūno imuninė reakcija, susidarant imuniniam kompleksui: antigenui-antikūnui, dėl kurio atsiranda pokytis. fermentinis aktyvumas specifinių žymių antikūnų paviršiuje.
Reakcijos komponentai:
1. AG(AT) žinomas - ant tabletės šulinėlio.
2. AT (AG) studijuojama.
3. AT su fermentu, būdingu AT(AG)-AG(AT) kompleksui
4. chromogeninis substratas, kuris sąveikauja su fermentu
5. stabdymo sprendimas
Pagrindiniai ELISA etapai
1. Plokštelės šulinėlių paviršiuje yra išgrynintas konkretaus patogeno antigenas. Jie priduria biologinė medžiaga tarp šio antigeno ir norimo antikūno (imunoglobulino) įvyksta specifinė reakcija. Susidaro kompleksas.
2. Pridedamas konjugantas – AT su fermentu. Konjugantas būdingas pirmosios pakopos AT-AG kompleksui. Fermentas aktyvuojamas.
3. Pridedamas substratas ir su juo reaguoja aktyvus fermentas, pakeisdamas bespalvę tirpalo spalvą.
4. Siekiant sustabdyti fermento ir substrato sąveiką, pridedamas stabdymo tirpalas.
Apskaita.
Teigiamas rezultatas yra spalvos pasikeitimas, paveikslėlyje geltona.
Imunochromatografinė analizė
Imunochromatografinės analizės metodas (ICA, greitieji testai) yra aukštos kokybės preliminarus atrankos metodas, leidžiantis greitai, per kelias minutes, atlikti analizę bet kokiomis sąlygomis, įskaitant. "laukas".
ICA pranašumai yra šie:
Greitis ir naudojimo paprastumas;
Maži mėginių kiekiai, mėginio paruošimo trūkumas;
Pigumas gamintojui ir vartotojui;
Galimybė gaminti bandymus dideliais kiekiais;
Lengvas rezultato skaitymas ir interpretavimas;
Didelis jautrumas ir atkuriamumas;
Kiekybinio nustatymo galimybė;
Galimybė naudoti nešiojamus skaitytuvus, suderinamus su kompiuteriu;
Daugialypės analizės galimybė.
Komponentai (taikomi ant bandymo juostelės):
1. Konjugatas su koloidine aukso etikete yra specifinis aptiktam antigenui.
2. AT bandymo linija – būdinga AT-AG kompleksui
3. Kontrolinės linijos abs yra būdingos konjugatui.
ICA nustatymas:
1. Užtepkite mėginį ant nurodytos juostelės pradžios vietos.
2. Gauti rezultatą kaip spalvotas juosteles vietoje bandymo ir kontrolinių linijų.
Apskaita
Teigiamas – kai bandymo linija nudažyta.
Neigiamas – jei nėra tyrimo linijos dėmių.
Neteisinga – jei kontrolinė linija nėra nudažyta.
Bendras mechanizmas IHA:
1. Mėginys įvedamas į pradinį lauką (mėginio padėklas) ir susiejamas su konjugatu (konjuguotu korpusu su spalvota etikete), esančiu ant konjugato padėklo. Dėl to susidaro spalvotas kompleksas.
2. Gautas spalvotas imuninis kompleksas, veikiamas kapiliarinių jėgų, juda išilgai nitroceliuliozės membranos Ir sąveikaujasu AT bandymo linija.Rezultatas yra vienos spalvos rožinė-raudona juostelė.
3. AT (konjugatas) nesurištas su išbandyta juostajuda toliau ir pasiekia valdymo liniją, bendrauja su valdymo linijos AT.Dėl to atsiranda antroji spalvota juostelė.Jei analizė atlikta teisingai, kontrolinė eilutė turi būti rodoma visada, nepaisant to, ar biologinio skysčio mėginyje yra tiriamojo antigeno (antikūno).
2. Serologinių reakcijų atlikimo sąlygos.
1. Homologinių – atitinkančių vienas kitą antigeną ir antikūną buvimas.
2. Švarūs, sausi indai.
3. Tam tikras narkotikų santykis (dažniausiai lygus).
4. Privalomas elektrolito (izotoninio NaCl tirpalo) buvimas.
5. pH neutralus arba artimas silpnai šarminiam.
6. Temperatūra +37°C arba kambario temperatūra (būtinai teigiama).
7. Atliekama antigeno kontrolė ir serumo (antikūnų) kontrolė.
3 Serumo reikalavimai
Serumas turi būti visiškai skaidrus, be jokių ląstelių priemaišų.
Paprastai jie jį gauna 2-ąją ligos savaitę, kai jau yra antikūnų.
Kraujo imama 3-5 ml tuščiu skrandžiu arba praėjus 6 valandoms po valgio.
Serumui gauti kraujas paliekamas 1 valandai kambario temperatūroje arba centrifuguojamas. Serumas išsiurbiamas labai atsargiai, kad neužfiksuotų susidariusių elementų.
Imuniniai serumai gaunami iš žmonių ar gyvūnų (dažniausiai triušių ir arklių) kraujo, imunizuoto pagal tam tikrą schemą atitinkamu antigenu (vakcina). Serumai dažniausiai ruošiami gamyboje.
4. Teigiamų ir neigiamų rezultatų samprata.
RA.
Esant teigiamai reakcijai, pasyviai suklijuoti raudonieji kraujo kūneliai uždengia skylės dugną lygiu sluoksniu su šukuotais kraštais („skėtis“); nesant agliutinacijos, raudonieji kraujo kūneliai kaupiasi centrinėje skylės įduboje, sudarydami kompaktišką „mygtuką“ su aiškiai apibrėžtais kraštais (žr. paveikslėlius aukščiau).
RP.
Jei rezultatas teigiamas, dviejų tirpalų sąsajoje susidaro pieno žiedas (žr. paveikslėlius aukščiau).
ELISA.
Teigiama reakcija pasikeičia tirpalo spalva.
RSK.
Uždelsta hemolizė – reakcija teigiama; jei komplementas laisvas, stebima hemolizė – reakcija neigiama(žr. paveikslėlius aukščiau).
Wassermano reakcijos rezultatai:
a - visiškas hemolizės uždelsimas (+ + ++);
b - ryškus hemolizės vėlavimas (+ ++);
c - dalinis hemolizės uždelsimas (++);
d - nedidelis hemolizės vėlavimas (+);
d – pilna hemolizė (-).
Reakcija yra teigiama su daliniu, ryškiu ir visišku hemolizės uždelsimu, nulemtu vamzdelių turinio dažymo laipsniu nuo šviesiai rausvos iki ryškiai raudonos; nehemolizuoti eritrocitai vėliau sudaro raudonas nuosėdas.
Namų darbai:
1. Išstudijuokite medžiagą
Padarykite 3 pastabas vaizdo įraše
Nr. 29 Agliutinacijos reakcija. Komponentai, mechanizmas, montavimo būdai. Taikymas.
Agliutinacijos reakcija- paprasta reakcija, kurios metu antikūnai suriša korpuskulinius antigenus (bakterijas, eritrocitus ar kitas ląsteles, netirpias daleles su ant jų adsorbuotais antigenais, taip pat stambiamolekulinius agregatus). Jis atsiranda esant elektrolitams, pavyzdžiui, kai pridedamas izotoninis natrio chlorido tirpalas.
Naudojami įvairūs agliutinacijos reakcijos variantai: ekstensyvi, orientacinė, netiesioginė ir kt. Agliutinacijos reakcija pasireiškia dribsnių ar nuosėdų susidarymu (ląstelės „sulipusios“ su antikūnais, turinčiais du ar daugiau antigenų surišimo centrų – 13.1 pav.). RA naudojamas:
1) antikūnų nustatymas pacientų, sergančių brucelioze (Wright, Heddelson reakcijos), kraujo serume, vidurių šiltinės ir paratifido karštligė (Vidal reakcija) ir kitos infekcinės ligos;
2) patogeno nustatymas, izoliuotas nuo paciento;
3) kraujo grupių nustatymas naudojant monokloninius antikūnus prieš eritrocitų aloantigenus.
Paciento antikūnams nustatyti atlikti išsamią agliutinacijos reakciją: Diagnosticum (žuvusių mikrobų suspensija) dedama į paciento kraujo serumo skiedimus ir po kelių valandų inkubavimo 37 °C temperatūroje pažymimas didžiausias serumo praskiedimas (serumo titras), kuriam esant įvyko agliutinacija, t.y. susidarė nuosėdos. susiformavo.
Agliutinacijos pobūdis ir greitis priklauso nuo antigeno ir antikūnų tipo. Pavyzdys – diagnostinių (O- ir H-antigenų) sąveikos su specifiniais antikūnais ypatumai. Agliutinacijos reakcija su O-diagnosticum (bakterijos, žūvančios karščiu, išlaikančios termostabilų O-antigeną) vyksta smulkiagrūdės agliutinacijos forma. Agliutinacijos reakcija su H-diagnosticum (bakterijos, naikinamos formaldehidu, išlaikančios termolabų žiuželinį H-antigeną) yra šiurkšti ir vyksta greičiau. Jei reikia nustatyti iš paciento išskirtą sukėlėją, įdėti orientacinė agliutinacijos reakcija, naudojant diagnostinius antikūnus (agliutinuojantį serumą), t.y. atliekamas patogeno serotipų nustatymas. Orientacinė reakcija atliekama ant stiklelio. Iš paciento išskirta grynoji patogeno kultūra įlašinama į lašą diagnostinio agliutinuojančio serumo, praskiedus santykiu 1:10 arba 1:20. Šalia dedama kontrolė: vietoj serumo užlašinamas lašas natrio chlorido tirpalo. Kai laše su serumu ir mikrobais atsiranda flokuliuojančios nuosėdos, mėgintuvėliuose atliekama išsami agliutinacijos reakcija su didėjančiais agliutinuojančio serumo skiedimais, į kuriuos įlašinami 2-3 lašai patogeno suspensijos. Į agliutinaciją atsižvelgiama pagal nuosėdų kiekį ir skysčio skaidrumo laipsnį. Reakcija laikoma teigiama, jei agliutinacija stebima praskiedimu, artimu diagnostinio serumo titrui. Tuo pačiu metu atsižvelgiama į kontrolę: izotoniniu natrio chlorido tirpalu praskiestas serumas turi būti skaidrus, mikrobų suspensija tame pačiame tirpale turi būti tolygiai drumsta, be nuosėdų.
Skirtingas susijusias bakterijas gali agliutinuoti tas pats diagnostinis agliutinuojantis serumas, kuris
apsunkina jų tapatybę. Todėl jie naudoja adsorbuotus agliutinuojančius serumus, iš kurių
kryžmiškai reaguojantys antikūnai adsorbuojant giminingoms bakterijoms. Antikūnai išsaugomi tokiuose serumuose,
būdingas tik tam tikrai bakterijai.
Agliutinacija yra bakterijų sulipimas dėl specifinių AT sąveikos su jomis. Norint atlikti RA, reikalingi trys komponentai: 1) AG (agliutinogenas); 2) AT (agliutininas); 3) elektrolito tirpalas (izotoninis natrio chlorido tirpalas). Agliutinacijos reakcijoje dalyvauja tik korpuskuliniai antigenai (bakterijos, raudonieji kraujo kūneliai, antigenu prikrautos latekso dalelės).
Agliutinacijos reakcija ant stiklo. Diagnostinio serumo lašelis pipete užlašinamas ant neriebaus stiklelio (serumo praskiedimas 1:10 – 1:20). Naudojant bakteriologinę kilpą, nuo pasvirusio agaro paviršiaus paimama gryna tiriamo mikroorganizmo kultūra, perkeliama į serumo lašą ir sumaišoma. Į reakcijos rezultatą atsižvelgiama plika akimi po 3-5 minučių. Jei reakcija teigiama, serumo laše pastebimi dribsniai (dideli arba maži), aiškiai matomi tamsiame fone, kai stiklelis pakratomas. Neigiamos reakcijos atveju skystis išlieka tolygiai drumstas.
Agliutinacijos reakcija mėgintuvėliuose. Į mėgintuvėlių eilę įpilama 1 ml fiziologinio tirpalo. Į pirmąjį mėgintuvėlį įpilamas toks pat kiekis tiriamo kraujo serumo. Paruošiami serijiniai dvigubi serumo skiedimai (serumo titravimas), po to į kiekvieną mėgintuvėlį įlašinami 2 lašai inaktyvuotų bakterijų suspensijos (diagnosticum). Vamzdžiai 2 valandoms dedami į 37 °C temperatūros termostatą. Reakcija vyksta, kai susidaro maži dribsniai, nematomi plika akimi, todėl rezultatai registruojami šiek tiek padidinus specialiu prietaisu - agliutinoskopu. Į agliutinacijos intensyvumą atsižvelgiama pagal „keturių pliusų“ sistemą: visiška agliutinacija - 4+, dalinė agliutinacija - 3+ arba 2+, abejotinas rezultatas - +. Paskutinis skiedimas, kuriame stebima 2+ agliutinacija, laikomas antikūnų titru tiriamajame serume.
Agliutinacijos reakcija mėgintuvėliuose (plačia agliutinacijos reakcija) atliekama siekiant nustatyti antikūnų titrą prieš vidurių šiltinės ir paratifos (Vidal reakcija), bruceliozės (Wright reakcija) ir šiltinės (Weigl reakcija) sukėlėjus.
Agliutinacija (iš lot. agglutinatio – klijavimas) – tai antigeną turinčių korpuskulinių dalelių (visų ląstelių, latekso dalelių ir kt.) sulipimas (sujungimas) su specifinių antikūnų molekulėmis, esant elektrolitams, kuris baigiasi dribsnių ar nuosėdų susidarymu. (agliutinatas), matomas plika akimi. Nuosėdų pobūdis priklauso nuo antigeno pobūdžio: žiuželinės bakterijos gamina stambias flokuliuojančias nuosėdas, žiuželinės ir nekapsulinės bakterijos gamina smulkiagrūdes nuosėdas, o kapsulinės bakterijos gamina stygas nuosėdas. Skiriama tiesioginė agliutinacija, kurios metu savi bakterijos ar bet kurios kitos ląstelės, pavyzdžiui, eritrocitų, antigenai tiesiogiai dalyvauja sąveikoje su specifiniais antikūnais; ir netiesioginis, arba pasyvus, kai bakterijų ląstelės ar eritrocitai, arba latekso dalelės yra ne savo, o ant jų sorbuotų svetimų antigenų (ar antikūnų) nešiotojai, siekiant nustatyti jiems specifinius antikūnus (ar antigenus). Agliutinacijos reakcija daugiausia apima antikūnus, priklausančius IgG ir IgM klasėms. Jis vyksta dviem etapais: pirma, atsiranda specifinė sąveika tarp aktyvaus antikūnų centro ir antigeną lemiančio faktoriaus; ši stadija gali įvykti ir nesant elektrolitų, be matomų pokyčių reaguojančioje sistemoje. Antrajam etapui – agliutinato susidarymui – būtinas elektrolitų buvimas, kurie mažina elektros krūvis antigeno + antikūnų kompleksus ir pagreitina jų klijavimo procesą. Ši fazė baigiasi agliutinato susidarymu.
Agliutinacijos reakcijos atliekamos ant stiklinių arba lygių kartoninių plokštelių arba steriliuose agliutinacijos mėgintuvėliuose. Agliutinacijos reakcijos (tiesioginės ir pasyviosios) ant stiklo dažniausiai naudojamos kaip pagreitintas metodas specifinių antikūnų nustatymas paciento serume (pavyzdžiui, sergant brucelioze) arba serologiniam patogeno identifikavimui. Pastaruoju atveju dažniausiai naudojami gerai išgryninti (adsorbuoti) diagnostiniai serumai, kuriuose yra tik monoreceptorių antikūnų arba jų rinkinys prieš įvairius antigenus. Neabejotinas agliutinacijos reakcijos ant stiklo pranašumas yra jos įgyvendinimo paprastumas ir tai, kad tai trunka kelias minutes ar net sekundes, nes abu komponentai naudojami koncentruota forma. Tačiau jis turi tik kokybinę vertę ir yra mažiau jautrus nei mėgintuvėlis. Išsami agliutinacijos reakcija mėgintuvėliuose suteikia tikslesnius rezultatus, nes leidžia nustatyti kiekybinį antikūnų kiekį serume (nustatyti jo titrą) ir, jei reikia, užregistruoti antikūnų titro padidėjimo faktą, kuris turi diagnostinę reikšmę. . Reakcijai nustatyti į agliutinacijos mėgintuvėlius tam tikru būdu pilamas praskiestas 0,85 % tirpalas. NaCl tirpalas serumo ir vienodo tūrio (dažniausiai 0,5 ml) standartinės diagnostikos (arba tiriamosios kultūros), kurios 1 ml yra 1 milijardas bakterijų, suspensijos. Agliutinacijos reakcijos rezultatai pirmiausia registruojami po 2 valandų inkubavimo mėgintuvėliuose 37 °C temperatūroje ir galiausiai po 20-24 valandų pagal du kriterijus: nuosėdų buvimą ir dydį bei supernatanto skysčio skaidrumo laipsnį. Vertinimas atliekamas pagal keturių kryžių sistemą. Reakciją būtinai lydi serumo ir antigeno kontrolė. Tais atvejais, kai serologiniam sukėlėjo nustatymui atliekama detali agliutinacijos reakcija mėgintuvėlyje, ji turi diagnostinę vertę, jei reakcija vertinama teigiama, kai diagnostinis serumas praskiedžiamas ne mažiau kaip iki pusės titro.
Reikia atsižvelgti į tai, kad maišant homologinių antigenų ir antikūnų tirpalus ne visada pastebimi matomi agliutinacijos reakcijos pasireiškimai. Nuosėdos susidaro tik esant tam tikram optimaliam abiejų reakcijos komponentų santykiui. Už šių ribų, esant dideliam antigeno ar antikūnų pertekliui, reakcijos nepastebima. Šis reiškinys vadinamas „prozono reiškiniu“. Jis stebimas tiek agliutinacijos, tiek kritulių reakcijos metu. Prozono atsiradimas imuninėse reakcijose paaiškinamas tuo, kad jose dalyvaujantys antigenai, kaip taisyklė, yra polideterminantiniai, o molekulės IgG antikūnai turi du aktyvius centrus. Esant antikūnų pertekliui, kiekvienos antigeno dalelės paviršius pasidengia antikūnų molekulėmis, kad neliktų laisvų determinantų grupių, todėl antrasis, nesurištas aktyvusis antikūnų centras negali sąveikauti su kita antigeno dalele ir surišti jų vienas su kitu. Matomo agliutinato ar nuosėdų susidarymas taip pat slopinamas, kai yra antigeno perteklius, kai nelieka nei vieno laisvo aktyvaus antikūnų centro, todėl antigeno + antikūno + antigeno kompleksai nebegali padidėti.
Pagreitintos agliutinacijos reakcijų parinktys. Pasyvioji hemagliutinacijos reakcija ir jos variantai
Klasikinė agliutinacijos reakcija apima korpuskulinių antigenų naudojimą. Tačiau gali būti įtraukti ir tirpūs antigenai. Kad tai būtų įmanoma, tokie antigenai adsorbuojami ant imunologiškai inertiškų dalelių. Latekso ar bentonito dalelės gali būti naudojamos kaip nešiklis, tačiau šiuo metu dažniausiai naudojami gyvūnų ar žmogaus eritrocitai, pagerinantys jų adsorbcines savybes apdorojant tanino, formalino ar benzidino tirpalais. Raudonieji kraujo kūneliai, kurie adsorbavo ant savęs antigeną, vadinami įjautrintais šio antigeno, o imuninė reakcija, kurioje jie dalyvauja, vadinama netiesiogine arba pasyvia hemagliutinacijos reakcija (IRHA arba RPHA), nes raudonieji kraujo kūneliai joje dalyvauja pasyviai.
RPGA dedama į specialias polistireno plokštes su skylutėmis, turinčiomis pusrutulio formos dugną. Naudojant serologinei diagnostikai, šiose duobutėse fiziologiniame tirpale paruošiami dvigubi tiriamojo serumo skiedimai, o į jį kaip diagnostinė medžiaga įdedama įjautrintų eritrocitų suspensija. Rezultatai registruojami po 2 valandų inkubacijos 37 °C temperatūroje, naudojant keturių kryžminę sistemą. Esant teigiamai reakcijai, agliutinuoti raudonieji kraujo kūneliai nusėda skylės apačioje ir tolygiai uždengia ją apversto skėčio pavidalu. Jei reakcija neigiama, raudonieji kraujo kūneliai taip pat nusėda, skystis tampa skaidrus, o nuosėdos atrodo kaip mažas „diskas“ šulinio centre. Serumo titras RPHA laikomas paskutiniu jo praskiedimu, kuris vis dar sukelia ryškią hemagliutinaciją be reikšmingų ženklų„disko“ buvimas.
RPGA taip pat gali būti naudojamas kaip pagreitintas bakteriologinės diagnostikos metodas, skirtas tiesiogiai tiriamojoje medžiagoje aptikti nežinomas bakterijas, virusus, toksinus, pavyzdžiui, maro sukėlėjus, stafilokokų enterotoksinus ir kt. Naudojant šią RPGA versiją, adsorbuoti eritrocitai žinomi dėl savo specifiškumas yra naudojami kaip žinomas reakcijos komponentas antikūnai - eritrocitų diagnostikos antikūnai. Jei tiriamojoje medžiagoje yra pakankamai žinomo antigeno, RPGA bus teigiama.
RPHA naudojimo galimybės yra šios: antigeno neutralizacijos reakcija (RNAg), antikūnų neutralizavimo reakcija (RNAb), pasyvioji hemagliutinacijos slopinimo reakcija (PHA). Šioms reakcijoms taikoma antigenų ir antikūnų eritrocitų diagnostika. Vienu metu gali būti naudojamos dvi viena kitą kontroliuojančios vienakryptės reakcijos, pavyzdžiui, RPHA su diagnostine antigenu ir RNAg su antikūnų eritrocitų diagnostika.
Antikūnų neutralizavimo reakcija (RNRb) susideda iš suspensijos, kurioje yra norimo antigeno, sumaišymo su specifiniu imuniniu serumu, kuriame yra žinomų antikūnų, ir inkubavimo 37 °C temperatūroje dvi valandas. Po to pridedama antigeninė eritrocitų diagnostika. Mišinys suplakamas ir paliekamas kambario temperatūroje. Į rezultatus atsižvelgiama po 3-4 valandų ir galiausiai po 18-24 val.Jei tiriamojoje medžiagoje yra antigeno, ji suriš antikūnus (juos neutralizuos), todėl hemagliutinacija neįvyks.
Antigeno neutralizavimo reakcija (RNAg) atliekama tuo pačiu principu. Tik šiuo atveju tiriamojoje medžiagoje aptinkami antikūnai. Specifinis antigenas, pridėtas prie tokios tiriamosios medžiagos, prisijungs prie joje esančių antikūnų, t. y. įvyks antigeno neutralizavimas antikūnais, todėl pridedant eritrocitų diagnostinį antikūną neįvyks hemagliutinacija.
Koagliutinacijos reakcija. Tai vienas iš pasyvios, t.y., pagreitintos agliutinacijos reakcijos ant stiklo, kurią skatina antikūnus pernešančios ląstelės, variantų. Ši reakcija pagrįsta unikalus turtas Staphylococcus aureus, kurio ląstelės sienelėje yra baltymo A, jungiasi su IgG ir IgM Fc fragmentais. Tokiu atveju aktyvūs antikūnų centrai lieka laisvi ir gali sąveikauti su specifiniais antigenų determinantais. Lašelis 2 % stafilokokų suspensijos, įjautrintos atitinkamais antikūnais, užlašinamas ant stiklelio ir įlašinamas lašelis tiriamų bakterijų suspensijos. Jei antigenas sutampa su antikūnais, per 30-60 s įvyksta aiški stafilokokų, prikrautų antikūnais, agliutinacija.
Latekso agliutinacijos reakcija (LAR). Antikūnų nešiklis šioje diagnostikos sistemoje yra mažos standartinės latekso dalelės. Reakcija atliekama naudojant mikrometodą stiklo duobutėse. Pagrindinė sėkmingo PAH stadijos sąlyga – griežtas sistemos komponentų kiekybinių santykių laikymasis: 10 μl latekso preparato, įjautrinto antikūnais, įpilama į 50 μl tiriamosios medžiagos. PAH specifiškumas kontroliuojamas naudojant tris kontrolinius testus, esančius komercinėse bandymų sistemose: žinoma teigiama reakcija, aišku neigiama reakcija ir latekso suspensijos kokybės kontrolė naudojant PAH nejautrintus (antikūnų neturinčius) lateksus su tiriamąja medžiaga. Mūsų šalyje kaip specifinių antikūnų nešikliai naudojami polistireno monodispersiniai lateksai, kurių dalelių skersmuo skiriasi (0,3; 0,66; 0,75; 0,8 μm). VVG naudojamas greitai aptikti mikroorganizmus arba jų antigenus tiriamojoje medžiagoje.
Imunomagnetinis antigenų nustatymas. Viena iš pagreitintos agliutinacijos reakcijos ant stiklo variantų yra susijusi su supermagnetinių polimero dalelių, padengtų specifiniais antikūnais, naudojimu. Viena tokia dalelė suriša iki 107-108 mikroorganizmų ląstelių, dėl kurių atsiranda jautrumas šis metodas pasiekia 5 KSV/ml. Imunomagnetinis mikroorganizmų aptikimas gali būti naudojamas kartu su CPR.
Agregacinė hemagliutinacijos reakcija (AHA). Leidžia greitai aptikti pacientų kraujyje tiek laisvai cirkuliuojančius antigenus (antigenemiją), tiek su antikūnais susijusius antigenus – cirkuliuojančius imuninius kompleksus (CIC). RAHA atveju naudojami raudonieji kraujo kūneliai, įjautrinti atitinkamais antikūnais. Paciento kraujo serumo, kuriame yra antigenų, pridėjimas į įjautrintus eritrocitus, ant kurių fiksuojami antikūnai, sukelia eritrocitų ir imuninių kompleksų sulipimą (agliutinaciją).
Antiglobulino Kumbso testas (R. Coombs reakcija). Pilni (dvivalenčiai) antikūnai nustatomi naudojant tiesiogines ir pasyvias agliutinacijos reakcijas. Neišsamių (vienovalentinių, blokuojančių) antikūnų šiais metodais neaptinkama, nes susijungę su antigenu jie jį blokuoja, bet negali sukelti antigeno agregacijos į didelius konglomeratus. Neišsamūs (blokuojantys) antikūnai yra tie, kuriuose veikia tik vienas aktyvus centras; antrasis aktyvus centras neveikia dėl neaiškios priežasties. Nepilniems antikūnams aptikti naudojama speciali Kumbso reakcija (72 pav.). Reakcija apima: paciento serumą, kuriame nepilni antikūnai, korpuskulinis antigenas-diagnostikas, antiglobulino serumas, kuriame yra antikūnų prieš žmogaus globuliną. Reakcija vyksta dviem etapais:
Antigeno sąveika su nepilnais antikūnais. Nėra matomų apraiškų. Pirmasis etapas baigiamas nuplaunant antigeną iš likusio paciento serumo.
Antiglobulino serumo, gauto imunizavus gyvūną žmogaus globulinu, sąveika su nepilnais antikūnais, adsorbuotais ant antigeno. Dėl to, kad antiglobulino antikūnai yra dvivalenčiai, jie sujungia du monovalentinius antikūnus iš atskirų antigeno + nepilno antikūno kompleksų, dėl ko jie sulipdo ir atsiranda matomų nuosėdų.
13.1. Antigenų-antikūnų reakcijos ir jų pritaikymas
Kai įvedamas antigenas, organizme susidaro antikūnai. Antikūnai papildo antigeną, sukėlusį jų sintezę, ir gali prie jo prisijungti. Antigenų prisijungimas prie antikūnų susideda iš dviejų fazių. Pirmoji fazė yra specifinė, kurioje greitai įvyksta antigeninio determinanto prisijungimas prie antikūnų Fab fragmento aktyvaus centro. Reikėtų pažymėti, kad surišimas atsiranda dėl van der Waals jėgų, vandenilio ir hidrofobinės sąveikos. Ryšio stiprumą lemia antikūno aktyvios vietos ir antigeno epitopo erdvinio atitikimo laipsnis. Po specifinės fazės prasideda lėtesnė fazė – nespecifinė, kuri pasireiškia matomu fiziniu reiškiniu (pvz., dribsnių susidarymu agliutinacijos metu ir pan.).
Imuninės reakcijos yra antikūnų ir antigenų sąveika, šios reakcijos yra specifinės ir labai jautrios. Jie plačiai naudojami Medicininė praktika. Imuninių reakcijų pagalba galima išspręsti šias problemas:
Nežinomų antikūnų nustatymas žinomais antigenais (antigeninė diagnostika). Ši užduotis atliekama, kai reikia nustatyti antikūnus prieš patogeną paciento kraujo serume (serodiagnostika). Antikūnų radimas leidžia patvirtinti diagnozę;
Nežinomų antigenų nustatymas naudojant žinomus antikūnus (diagnostinį serumą). Šis tyrimas atliekamas identifikuojant patogeno kultūrą, išskirtą iš paciento medžiagos (serotipų nustatymas), taip pat nustatant
mikrobų antigenai ir jų toksinai kraujyje ir kituose biologiniuose skysčiuose. Egzistuoja daugybė imuninių reakcijų tipų, kurios skiriasi inscenizacijos technika ir užfiksuotu poveikiu. Tai agliutinacijos reakcijos (RA), nusodinimo reakcijos (RP), reakcijos su komplementu (RSC), reakcijos naudojant žymėtus komponentus (RIF, ELISA, RIA).
13.2. Agliutinacijos reakcija
Agliutinacijos reakcija (RA) – tai imuninė antigeno sąveikos su antikūnais reakcija esant elektrolitams, o antigenas yra korpuskulinės būsenos (eritrocitai, bakterijos, latekso dalelės su adsorbuotais antigenais). Agliutinacijos metu korpuskuliniai antigenai yra suklijuojami antikūnais, o tai pasireiškia flokuliuojančių nuosėdų susidarymu. Dribsnių susidarymas atsiranda dėl to, kad antikūnai turi du aktyvius centrus, o antigenai yra daugiavalenčiai, t.y. turi keletą antigeninių determinantų. RA naudojamas siekiant nustatyti patogeną, išskirtą iš paciento medžiagos, taip pat nustatyti antikūnus prieš patogeną paciento kraujo serume (pavyzdžiui, Wright ir Heddleson reakcijas dėl bruceliozės, Widal reakcijos dėl vidurių šiltinės ir paratifos).
Paprasčiausias RA diagnozavimo būdas yra reakcija į stiklą; tai apytikslis RA, kuris naudojamas nustatant iš paciento išskirtą patogeną. Nustačius reakciją, ant stiklelio užtepamas diagnostinis agliutinuojantis serumas (atskiedus 1:10 arba 1:20), tada pridedama paciento kultūra. Reakcija teigiama, jei laše atsiranda flokuliuojančių nuosėdų. Šalia dedama kontrolė: vietoj serumo užlašinamas lašas natrio chlorido tirpalo. Jei diagnostinis agliutinuojantis serumas nėra adsorbuotas 1, tada jis skiedžiamas (iki titro – skiedimo iki kurio turėtų įvykti agliutinacija), t.y. dėkite išplėstą RA į mėgintuvėlius didėjant
1 Neadsorbuotas agliutinuojantis serumas gali agliutinuoti susijusias bakterijas, kurios turi bendrų (kryžmiškai reaguojančių) antigenų. Todėl jie naudojaadsorbuoti agliutinuojantys serumai, iš kurių kryžmiškai reaguojantys antikūnai buvo pašalinti adsorbuojant giminingoms bakterijoms. Tokie serumai išlaiko antikūnus, būdingus tik tam tikrai bakterijai.
agliutinuojančio serumo skiedimai, į kuriuos įlašinami 2-3 lašai iš paciento išskirto sukėlėjo suspensijos. Į agliutinaciją atsižvelgiama pagal nuosėdų kiekį ir skysčio išvalymo laipsnį mėgintuvėliuose. Reakcija laikoma teigiama, jei agliutinacija stebima praskiedimu, artimu diagnostinio serumo titrui. Reakciją lydi kontrolinės medžiagos: izotoniniu natrio chlorido tirpalu praskiestas serumas turi būti skaidrus, mikrobų suspensija tame pačiame tirpale turi būti tolygiai drumsta, be nuosėdų.
Norint nustatyti antikūnus prieš patogeną paciento kraujo serume, taikomas pilno masto RA. Jį nustatant, paciento kraujo serumas praskiedžiamas mėgintuvėliuose ir į mėgintuvėlius įpilama tiek pat diagnostinės suspensijos (žuvusių mikrobų suspensijos). Po inkubacijos nustatomas didžiausias serumo praskiedimas, kuriam esant įvyko agliutinacija, t.y. susidarė nuosėdos (serumo titras). Šiuo atveju agliutinacijos reakcija su O-diagnosticum (bakterijos žūsta kaitinant, išlaiko termostabilų O-antigeną) vyksta smulkiagrūdės agliutinacijos forma. Agliutinacijos reakcija su H-diagnosticum (bakterijos, naikinamos formaldehidu, išlaikančios termolabų žiuželinį H-antigeną) yra šiurkšti ir vyksta greičiau.
Netiesioginė (pasyvi) hemagliutinacijos reakcija(RNGA arba RPGA) yra RA tipas. Šis metodas yra labai jautrus. RNGA pagalba gali būti išspręstos dvi problemos: nustatyti antikūnus paciento kraujo serume, prie kurio pridedama antigeninė eritrocitų diagnostika, tai yra eritrocitai, ant kurių adsorbuojami žinomi antigenai; nustatyti antigenų buvimą tiriamojoje medžiagoje. Šiuo atveju reakcija kartais vadinama atvirkštine netiesiogine hemagliutinacijos reakcija (RONHA). Procedūros metu į tiriamąją medžiagą pridedama antikūnų eritrocitų diagnostinė medžiaga (eritrocitai, kurių paviršiuje yra adsorbuoti antikūnai). Šioje reakcijoje raudonieji kraujo kūneliai veikia kaip nešiotojai ir pasyviai dalyvauja formuojant imuninius agregatus. Esant teigiamai reakcijai, pasyviai suklijuoti raudonieji kraujo kūneliai uždengia skylės dugną lygiu sluoksniu su šukuotais kraštais („skėtis“); nesant agliutinacijos, raudonieji kraujo kūneliai kaupiasi centrinėje skylės įduboje, sudarydami kompaktišką „mygtuką“ su aiškiai apibrėžtais kraštais.
Koagliutinacijos reakcija naudojamas patogeninėms ląstelėms (antigenams) nustatyti naudojant adsorbuotus antikūnus Staphylococcus aureus, turintis baltymo A. Baltymas A turi afinitetą imunoglobulinų Fc fragmentui. Dėl šios priežasties antikūnai prie stafilokoko jungiasi netiesiogiai per Fc fragmentą, o Fab fragmentai yra orientuoti į išorę ir gali sąveikauti su atitinkamais iš pacientų išskirtais mikrobais. Tokiu atveju susidaro dribsniai.
Hemagliutinacijos slopinimo reakcija (HAI) naudojami diagnozuojant virusines infekcijas ir tik hemagliutinuojančių virusų sukeltas infekcijas. Šių virusų paviršiuje yra baltymo – hemagliutinino, kuris yra atsakingas už hemagliutinacijos reakciją (HRA), kai prie virusų pridedama raudonųjų kraujo kūnelių. RTGA apima virusų antigenų blokavimą antikūnais, dėl kurių virusai praranda gebėjimą agliutinuoti raudonuosius kraujo kūnelius.
Kumbso reakcija - RA nepilniems antikūnams nustatyti. Sergant kai kuriomis infekcinėmis ligomis, pavyzdžiui, brucelioze, paciento kraujo serume cirkuliuoja nepilni patogeno antikūnai. Neužbaigti antikūnai vadinami blokuojančiais antikūnais, nes jie turi vieną antigeno surišimo vietą, o ne dvi, kaip pilni antikūnai. Todėl, pridėjus antigeninį diagnostiką, nepilni antikūnai jungiasi su antigenais, bet jų nesuklijuoja. Reakcijai pasireikšti pridedamas antiglobulino serumas (antikūnai prieš žmogaus imunoglobulinus), kuris sukels pirmajame reakcijos etape susidariusių imuninių kompleksų (antigeninių diagnostinių + nepilnų antikūnų) agliutinaciją.
Netiesioginė Kumbso reakcija naudojama pacientams, sergantiems intravaskulinė hemolizė. Kai kuriems iš šių pacientų aptinkami nepilni monovalentiniai antireuso antikūnai. Jie konkrečiai sąveikauja su Rh teigiamais eritrocitais, bet nesukelia jų agliutinacijos. Todėl į anti-Rh antikūnų + Rh teigiamų eritrocitų sistemą pridedamas antiglobulino serumas, kuris sukelia eritrocitų agliutinaciją. Diagnozei nustatyti naudojamas Kumbso testas patologinės būklės, susijęs su imuninės kilmės eritrocitų intravaskuline lize, pavyzdžiui, naujagimių hemolizine liga, kurią sukelia Rh konfliktas.
RA kraujo grupėms nustatyti yra pagrįstas eritrocitų agliutinacija imuninio serumo antikūnais prieš kraujo grupės antigenus A(II), B(III). Kontrolė – serumas, kuriame nėra antikūnų, t.y. serumo AB(IV) kraujo grupė ir A(P) bei B(III) grupių eritrocitų antigenai. 0 (I) grupės raudonieji kraujo kūneliai naudojami kaip neigiama kontrolė, nes jie neturi antigenų.
Rh faktoriui nustatyti naudojami anti-Rh serumai (bent dvi skirtingos serijos). Jei ant tiriamų eritrocitų membranos yra Rh antigeno, atsiranda šių ląstelių agliutinacija.
13.3. Kritulių reakcija
RP yra imuninė antikūnų sąveikos su antigenais reakcija esant elektrolitams, o antigenas yra tirpios būsenos. Kritulių metu tirpūs antigenai nusodinami antikūnais, o tai pasireiškia drumstumu kritulių juostų pavidalu. Matomų nuosėdų susidarymas stebimas, kai abu reagentai sumaišomi lygiaverčiais santykiais. Vieno iš jų perteklius sumažina nusodintų imuninių kompleksų skaičių. Yra įvairių būdų, kaip atlikti kritulių reakciją.
Žiedo kritulių reakcija dedamas į mažo skersmens nusodinimo vamzdelius. Į mėgintuvėlį įpilamas imuninis serumas, o tirpus antigenas atsargiai sluoksniuojamas. Jei rezultatas teigiamas, dviejų tirpalų sąsajoje susidaro pieno žiedas. Žiedo nusodinimo reakcija, kuri naudojama nustatyti antigenų buvimą organuose ir audiniuose, kurių ekstraktai verdami ir filtruojami, vadinama termoprecipitacijos reakcija (Ascoli reakcija, skirta termostabilaus juodligės antigeno nustatymui).
Ouchterlony dviguba imunodifuzijos reakcija.Ši reakcija vykdoma agaro gelyje. Vienodo storio gelio sluoksnyje tam tikru atstumu vienas nuo kito išpjaunamos duobutės ir pripildomos atitinkamai antigeno ir imuninio serumo. Po to antigenai ir antikūnai difunduoja į gelį, susitinka vienas su kitu ir sudaro imuninius kompleksus, kurie nusėda gelyje ir tampa matomi kaip tikslios linijos.
mityba. Šia reakcija galima nustatyti nežinomus antigenus ar antikūnus, taip pat patikrinti skirtingų antigenų panašumą: jei antigenai yra identiški, nusodinimo linijos susilieja, jei antigenai nėra identiški, nusodinimo linijos susikerta, jei antigenai yra iš dalies. identiškas, susidaro spurtas.
Radialinė imunodifuzijos reakcija.Į išlydytą agaro gelis Pridedami antikūnai ir gelis lygiu sluoksniu užtepamas ant stiklo. Gelyje išpjaunami šuliniai ir į juos įpilama standartinio tūrio skirtingų koncentracijų antigenų tirpalų. Inkubacijos metu antigenai difunduoja radialiai iš šulinio ir, susitikę su antikūnais, sudaro kritulių žiedą. Kol šulinyje lieka antigeno perteklius, palaipsniui didėja kritulių žiedo skersmuo. Šis metodas naudojamas antigenams arba antikūnams nustatyti tiriamajame tirpale (pavyzdžiui, skirtingų klasių imunoglobulinų koncentracijai kraujo serume nustatyti).
Imunoelektroforezė. Antigenų mišinys pirmiausia atskiriamas elektroforetiškai, tada į griovelį, einantį išilgai baltymo judėjimo krypties, įpilamas nusodinantis antiserumas. Antigenai ir antikūnai difunduoja į gelį vienas kito link; sąveikaudami jie sudaro lenktas kritulių linijas.
Flokuliacijos reakcija(pagal Ramono) – kritulių reakcijos tipas, naudojamas antitoksinio serumo ar toksoido aktyvumui nustatyti. Reakcija atliekama mėgintuvėliuose. Mėgintuvėlyje, kuriame toksoidas ir antitoksinas yra lygiaverčiu santykiu, stebimas drumstumas.
13.4. Komplemento fiksavimo reakcija
Antikūnai, sąveikaudami su atitinkamu antigenu, jungiasi su papildomu komplementu (1-oji sistema). Komplemento fiksacijos indikatorius – eritrocitai, įjautrinti hemoliziniu serumu, t.y. antikūnai prieš raudonuosius kraujo kūnelius (2-oji sistema). Jeigu 1-oje sistemoje komplementas nefiksuotas, t.y. Jei antigeno ir antikūno reakcija nevyksta, įjautrinti raudonieji kraujo kūneliai visiškai lizuojami (neigiama reakcija). Kai komplementą fiksuoja 1-osios sistemos imuniniai kompleksai, pridėjus jautrintų eritrocitų, hemolizė iš
nėra (teigiama reakcija). Komplemento fiksavimo reakcija naudojama diagnozuojant infekcines ligas (gonorėją, sifilį, gripą ir kt.).
13.5. Neutralizacijos reakcija
Mikrobai ir jų toksinai daro žalingą poveikį žmogaus organizmo organams ir audiniams. Antikūnai sugeba prisijungti prie šių žalojančių agentų ir juos blokuoti, t.y. neutralizuoti. Remiantis šia antikūnų savybe diagnostinis atsakas neutralizavimas. Jis atliekamas įvedant antigeno ir antikūnų mišinį gyvūnams arba jautriems tiriamiesiems objektams (ląstelių kultūrai, embrionams). Pavyzdžiui, norint aptikti toksinus paciento medžiagoje, 1-os grupės gyvūnams suleidžiama medžiaga iš paciento. 2-os grupės gyvūnams suleidžiama panaši medžiaga, iš anksto apdorota atitinkamu antiserumu. 1-os grupės gyvūnai miršta, jei medžiagoje yra toksino. Antroji gyvūnų grupė išgyvena, žalingas toksino poveikis nepasireiškia, nes jis neutralizuojamas.
13.6. Reakcijos naudojant pažymėtus antikūnus arba antigenus
13.6.1. Imunofluorescencinė reakcija (RIF, Koons metodas)
Šis metodas naudojamas greitajai diagnostikai. Jis gali būti naudojamas tiek mikrobų antigenams, tiek antikūnams aptikti.
Tiesioginis RIF metodas- antikūnų sąveikos su antigenais imuninė reakcija, o antikūnai yra paženklinti fluorochromu - medžiaga, galinčia skleisti tam tikro bangos ilgio šviesos kvantus, kai yra veikiama tam tikro bangos ilgio šviesa. Šio metodo ypatumas yra būtinybė pašalinti nesureagavusius komponentus, kad būtų išvengta nespecifinės liuminescencijos aptikimo. Norėdami tai padaryti, nuplaukite nesureagavusius antikūnus. Rezultatai vertinami naudojant fluorescencinį mikroskopą. Bakterijos tepinėlyje, apdorotame tokiu liuminescenciniu serumu, švyti tamsiame fone palei ląstelės periferiją.
Netiesioginis RIF metodas naudojamas dažniau nei ankstesnis. Ši reakcija vykdoma dviem etapais. Pirmajame etape antigenai tarpusavyje
sąveikauja su atitinkamais antikūnais, sudarydami imuninius kompleksus. Visi komponentai, kurie nesureagavo (t. y. nėra imuninių kompleksų dalis), turi būti pašalinti plaunant. Antrame etape gautas antigeno-antikūno kompleksas aptinkamas naudojant fluorochromizuotą antiglobulino serumą. Dėl to susidaro mikrobų + antimikrobinių triušių antikūnų + antikūnų prieš triušio imunoglobulinus kompleksas, paženklintas fluorochromu. Rezultatai vertinami naudojant fluorescencinį mikroskopą.
13.6.2. Fermentinis imunosorbento metodas arba tyrimas
ELISA - labiausiai paplitusi modernus metodas, naudojami virusinėms, bakterinėms, pirmuonių infekcijoms diagnozuoti, ypač ŽIV infekcijai diagnozuoti, virusinis hepatitas ir kt.
Yra daug ELISA modifikacijų. Kietosios fazės nekonkurencinga ELISA yra plačiai naudojama. Jis atliekamas 96 šulinėlių polistireno plokštelėse (kieta fazė). Vykdant reakciją, kiekviename etape būtina nuplauti nesureagavusius komponentus. Nustatant antikūnus, tiriamasis kraujo serumas įpilamas į duobutes, kuriose sorbuojami antigenai, po to antiglobulino serumas paženklinamas fermentu. Reakcija atliekama pridedant fermento substrato. Esant fermentui, substratas pasikeičia, fermento-substrato kompleksas parenkamas taip, kad reakcijos metu susidaręs produktas būtų spalvotas. Taigi, esant teigiamai reakcijai, pastebimas tirpalo spalvos pasikeitimas. Norint nustatyti antigenus, kietosios fazės nešiklis įjautrinamas antikūnais, tada tiriamoji medžiaga (antigenai) ir fermentu pažymėtas serumas paeiliui pridedami prie antigenų. Kad reakcija įvyktų, pridedamas fermento substratas. Teigiama reakcija pasikeičia tirpalo spalva.
13.6.3. Imunoblotingas
Šis metodas pagrįstas elektroforezės ir ELISA deriniu. Atliekant imunoblotavimą (bloting iš anglų k. dėmė- dėmė) sudėtingas antigenų mišinys pirmiausia elektroforezuojamas poliakrilamido gelyje. Gautas frakcionuotas anti-
genų peptidai perkeliami į nitroceliuliozės membraną. Tada blotai apdorojami fermentu pažymėtais antikūnais prieš specifinį antigeną, t.y. atlikti ELISA blotą. Imunoblotingas naudojamas diagnozuojant tokias infekcijas kaip ŽIV.
13.6.4. Imuninė elektroninė mikroskopija
Šis metodas apima virusų (rečiau kitų mikrobų) mikroskopavimą elektroniniu mikroskopu, iš anksto apdorotą atitinkamu imuniniu serumu, pažymėtu elektronų optiškai tankiais preparatais, pavyzdžiui, feritinu, geležies turinčiu baltymu.
13.7. Srauto citometrija
Kraujo ląstelės diferencijuojamos remiantis lazerine citofluorometrija. Tam norimos ląstelės nudažomos fluorescenciniais monokloniniais antikūnais prieš CD antigenus. Kraujo mėginys, apdorotas paženklintais antikūnais, praleidžiamas per ploną vamzdelį ir per jį praleidžiamas lazerio spindulys, kuris sužadina fluorochromą, kad švytėtų. Fluorescencijos intensyvumas koreliuoja su antigenų tankiu ląstelės paviršiuje ir gali būti kiekybiškai išmatuotas naudojant fotodaugintuvo vamzdelį. Gauti rezultatai konvertuojami į histogramą.
Norint nustatyti, naudojama srauto citometrija imuninė būklė(pagrindinių limfocitų populiacijų kiekis, tarpląstelinių ir tarpląstelinių citokinų kiekis, funkcinis NK ląstelių aktyvumas, fagocitozės aktyvumas ir kt.).
Išsami agliutinacijos reakcija (RA). Norint nustatyti AT paciento kraujo serume, a ekstensyvi agliutinacijos reakcija (RA). Norėdami tai padaryti, į kraujo serumo skiedimų seriją pridedama diagnostinė medžiaga - nužudytų mikroorganizmų ar dalelių suspensija su sorbuotu Ag. Maksimalus praskiedimas agliutinacija Ag vadinamas serumo titru.
Agliutinacijos reakcijos tipai (RA) nustatyti AT - kraujo lašo tyrimas dėl tuliaremijos (diagnostika, užtepama ant kraujo lašo ir matomų balkšvų agliutinatų) ir Haddlesono tyrimas dėl bruceliozės (su gencijonų violetine nudažytu diagnostine medžiaga, užtepant ant kraujo lašo serumas).
Apytikslė agliutinacijos reakcija (RA)
Norint nustatyti izoliuotus mikroorganizmus, apytikslis RA dedamas ant stiklelių. Norėdami tai padaryti, į standartinio diagnostinio antiserumo lašą (praskiesto santykiu 1:10, 1:20) įlašinama patogeno kultūra. Jei rezultatas teigiamas, atliekama išsami reakcija didėjant antiserumo praskiedimui.
Reakcija laikomas teigiamu, jei agliutinacija stebima praskiedus, artimus diagnostinio serumo titrui.
OAS. Somatiniai O-Ags yra karščiui stabilūs ir gali atlaikyti virimą 2 valandas.Sąveikaujant su AT susidaro smulkiagrūdžiai agregatai.
N-Ag. N-Ag (užmušimai) yra termolabūs ir greitai suyra 100 °C temperatūroje, taip pat veikiami etanolio. Reakcijoje su H-antiserumu po 2 valandų inkubacijos susidaro birūs dideli dribsniai (susidaro bakterijoms sulipus su žvyneliais).
Vi-Ar vidurių šiltinės bakterijos yra gana atsparios karščiui (atlaiko 60-62 °C temperatūrą 2 valandas); Inkubuojant su Vi antiserumu susidaro smulkiagrūdis agliutinatas.
Tiesioginės hemagliutinacijos reakcijos
Paprasčiausias iš jų reakcijos - agliutinacija raudonieji kraujo kūneliai arba hemagliutinacija, naudojama kraujo grupėms nustatyti ABO sistemoje. Norėdami nustatyti agliutinacija(arba jo nebuvimas) naudokite standartinius antiserumus su anti-A ir anti-B agliutininais. Reakcija vadinama tiesiogine, nes tiriami Ag yra natūralūs raudonųjų kraujo kūnelių komponentai.
Bendra su tiesioginė hemagliutinacija virusinė hemagliutinacija turi mechanizmus. Daugelis virusų gali spontaniškai agliutinuoti paukščių ir žinduolių eritrocitus, jų pridėjimas prie eritrocitų suspensijos sukelia jų agregatų susidarymą.
